JPS62184353A - ヒト上皮細胞成長因子の免疫化学的測定法及びそのためのキツト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗
体を用いる免疫化学的測定法によるヒト上皮細胞成長因
子（ｈｕｍａｎ　Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　
Ｆａｃｔｏｒ；ｈＥＧＦ）の測定法およびそのキットに
関する。

〔従来の技術〕

ｈＥＧＦ　（文献１．２〕は、分子量約６０００．５３
個のアミノ酸より構成され、その分子中に３個のジスル
フィド結合を有するポリペプチドである〔文献１５〕。

このｈＥＧＦの生体内における特異的な生理作用は知ら
れていないが、ＥＧＦのりセプター構造が解明〔文献３
〕されて以来、生化学的な研究が進められており、その
ためｈＥＧＦの測定方法の確立が望まれている。

現在までのｈＥＧＦの測定法としては、生物活性を指標
として行う方法が中心であった。例えば開眼活性を利用
したもの〔文献４〕、細胞増殖能を利用した方法〔文献
５）　、ＥＧＦリセプター結合能を利用した方法〔文献
６，７〕等がある。しかしながらこれらの測定法はいず
れも生物学的活性を指標とする間接的な測定法であるこ
とから測定誤差が大きく、再現性にも問題があり、定量
の信顛性に問題を有していた。その上このような測定方
法を行うに際し、その測定操作も一般に複雑であった。

従ってこのような問題点に対処すべく抗原抗体反応を利
用した免疫化学的な測定法が開発されるに至った。

例えばｈＥＧＦに対する抗血清を調製し、この抗血清を
用いたラジオイムノアッセイ法によって被検液中のｈＥ
ＧＦを測定する方法〔文献８〕や、同様にｈＥＧＦに対
する抗血清を調製し、この抗血清を用いたエンザイムイ
ムノアッセイ法〔日本薬学会、第１０５回年余（１９８
５）、講演要旨集４１１−ａｌｌ）等がある。なお、本
発明者ら及び共同研究者らにより、既に、ｈＥＧＦに対
する抗体であって、抗原認識部位の異なる２つのモノク
ローナル抗体を用いたｈＥＧＦの免疫化学的な測定法（
特願昭６０−１８７１７７号明細書）、およびｈＥＧＦ
に特異的な抗血清を用いたｈＥＧＦの免疫化学的測定法
（特願昭６０−１８０７３５号明細書）については既に
提案済みである。しかしながら、抗血清とモノクローナ
ル抗体とを組合せた方法については提案していない。

ところで、免疫化学的測定法にあっては、測定値を標準
曲線と対比して、標準に用いた分析対象の量をもって測
定値を表現するのがふつうであるので、標準品としては
高純度に精製されたものを用いるのが好ましいが、今ま
でに高純度（例えば９９％程度以上）に精製されたｈＥ
ＧＦを得ることはできなかった。従ってこの点からもｈ
ＥＧＦの理想的な測定方法は開発されていなかった。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従って本発明は、標準品としての高純度に精製されたｈ
ＥＧＦ、及び品質の安定した標品を十分量入手すること
が可能であり、そしてそれぞれがｈＥＧＦの異る抗原決
定基と高い特異性をもって結合することができる複数の
抗体を用いることによって、高い感度と精度をもってｈ
ＥＧＦを測定する方法、並びにこの測定方法のためのキ
ットを提供しようとするものである。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明の前記の目的は、遺伝子工学的手法を用いて高純
度に精製されたｈＥＧＦの製造が初めて可能となったこ
と（特願昭６０−２２６３０号明細書）、及びこの高純
度のｈＥＧＦを抗原として用いることによりｈＥＧＦに
特異的な異る抗原決定基に対応する異るモノクローナル
抗体（特願昭６０−１４８２５４号明細書）、及びポリ
クローナル抗体（特願昭６０−１３５４６０号明細書）
を製造することが可能になったことを基礎にして達成可
能となった。

従ってこの発明は、ヒト上皮細胞成長因子を免疫化学的
に測定するためのキットであって、（ａ）ヒト上皮細胞
成長因子の第１の抗原決定基と結合することができる第
１の抗体、（ｂ）　ヒト上皮細胞成長因子の第２の抗原
決定基と結合することができる標識された第２の抗体、
（ｃ）前記第１の抗体を固定化することができる固体支
持体、及び（ｄ）標準品としての高純度に精製されたヒ
ト上皮細胞成長因子を含んで成り、前記第１の抗体及び
第２の抗体の内いずれか一方がモノクローナル抗体であ
り他方がポリクローナル抗体であるキット；ヒト上皮細
胞成長因子を免疫化学的に測定するためのキットであっ
て、（ａ）ヒト上皮細胞成長因子の第１の抗原決定基と
結合することができる第１の抗体を固定化した固体支持
体、（ｂ）ヒト上皮細胞成長因子の第２の抗原決定基と
結合することができる標識された第２の抗体、及び（ｃ
）標準品としての高純度に精製されたヒト上皮細胞成長
因子を含んで成り、前記第１の抗体及び第２の抗体の内
のいずれか一方がモノクローナル抗体であり他方がポリ
クローナル抗体であるキット；並びに、ヒト上皮細胞成
長因子の免疫化学的測定方法であって、（１）ヒト上皮
細胞成長因子の第１の抗原決定基と結合することができ
る第１の抗体を固定化した固体担体と測定対象試料とを
接触せしめる段階、（２）前記段階（１）と同一段階と
して又は異なる段階として、前記固体担体をヒト上皮細
胞成長因子の第２の抗原決定基と結合することができる
標識された第２の抗体と接触せしめる段階、及び（３）
前記固体担体上に固定化された第２の抗体の標識又は固
定化されなかった第２の抗体の標識を測定する段階を含
んで成り、前記第１の抗体及び第２の抗体の内いずれか
一方がモノクローナル抗体であり他方がポリクローナル
抗体である方法を提供しようとするものである。

測定方式 一般に免疫化学的測定法には、抗原抗体反応の段階にお
いて、標識抗原と非標識抗原とを競合させるか否かによ
って競合法と非競合法が存在する。

非競合法は測定が比較的化学量論的であって精度が高い
等の特徴を有するが、測定対象である抗原の異る２つの
抗原決定基のそれぞれに対応して特異的に結合する２種
類の抗体を必要とする。本発明は、前記のごとく、この
ような２種類の抗体の製造が可能になったことにより、
初めて完成されたものである。また、免疫化学的測定法
は、抗原抗体反応の結果抗原と抗体とが結合して生じた
結合型の部分（ｂｏｕｎｄ、　Ｂ）と結合していない遊
離型の部分（ｆｒｅｅ、Ｆ）とを物理的に分離して測定
する方式ＣＢ／Ｆ分離法（ヘテロジニアスな測定法）〕
と、分離せずに測定する方式（Ｂ／Ｆ非分離法（ホモジ
ニアスな測定法）〕とに大別することができる。

この発明の方法は前者の方式に従って実施するのが有利
である。このような方法として、例えば、いわゆるサン
ドインチ法を挙げることができる。

この方法においては、第１図に示すように、ｈＥＧＦの
第１の抗原決定基に特異的に結合する抗ｈＥＧＦモノク
ローナル抗体又は抗ｈＥＧＦ抗血清（第１の抗体）を固
体担体上に固定化する。次に、この固体担体と測定サン
プルとを接触せしめることにより前記第１抗体とｈＥＧ
Ｆの第１抗原決定基とが結合する。次に、この固体担体
と、ｈＥＧの第２抗原決定基に特異的に結合することが
できると標識された抗ｈＥＧポリクローナル抗体又はモ
ノクローナル抗体（第２の抗体）とを接触せしめること
により、第１抗体を介して固体担体に固定化されたｈＥ
ＧＦの第２抗原決定基と第２抗体とを結合せしめる。上
記の方法に代えて、サンプルと第２抗体とを同時に第１
抗体が固定化されている固体担体に接触せしめることも
できる。

次に固体担体と液体の反応媒体とを分離し、固体担体に
結合した標識を測定することによりサンプル中のｈＥＧ
Ｆの量を決定することができる。

ｈＥＧＦ標品 本発明においては、高純度に精製されたｈＥＧＦを、抗
体産生細胞の調製および抗血清生産動物の免疫感作並び
にｈＥＧＦ測定のための標準品として使用する。ここで
「高純度に精製された」とは実質的に単一であるという
意味であり、例えば純度約９０％以上であり、約９５％
以上が好ましく、純度９９％程度以上のものが一層好ま
しい。

このように高純度に精製されたｈＥＧＦを大量に、かつ
従来より低コストで製造するには、遺伝子工学的手法に
よりｈＥＧＦ造成したのち精製する方法、例えば本発明
者らの共同研究者らにより提案された方法〔特願昭６０
−２２６３０号の明細書参照〕に従って行うとよい。こ
の方法は下記の工程Ａ−Ｃよりなることを特徴とする精
製ｈＥＧＦの製造方法である。すなわち（Ａ）（イ）シ
グナルペプチドをコードする遺伝子であってその遺伝子
の下流側末端直後にｈＥＧＦの構造遺伝子を結合させ得
るものを含み、かつ予定した宿主細胞内で増殖可能なヘ
クターに、ｈＥＧＦをコードする遺伝子を組込み、（ロ
）この組換体によってダラム陰性微生物を形質転換させ
、（ハ）得られる形質転換された微生物を、微生物の増
殖過程において対数増殖期の後期から停止期前期にかけ
て蛋白質合成能の誘導がおこるのに必要な量の無機燐を
含有する培地での培養に付したのち、これを集め、（ニ
）ついでこの微生物をオスモティック・ショック法によ
って処理することによりｈＥＧＦを含む画分を回収し；
（Ｂ）回収されたｈＥＧＦを含む両分をイオン交換クロ
マトグラフィーに付したのち、ｈＥＧＦ画分を回収し；
そして（Ｃ）上記で回収されたｈＥＧＦを含む両分をさ
らに高速液体クロマトグラフィーに付したのち、ｈＥＧ
Ｆ画分を回収する。

モノクローナル一 本発明においては、ｈＥＧＦの抗原決定基と特異的に結
合するモノクローナル抗体を必要とする。

このようなモノクローナル抗体の製造方法は次の通りで
ある。まず、■動物を高純度のｈＥＧＦで免疫すること
により抗体産生細胞を調製し、■この細胞と腫瘍細胞と
を融合させることによりハイブリドーマを得、そして■
前記の特徴を有する抗ｈＥＧＦモノクローナル抗体を産
生ずるハイブリドーマを選択する。そして■このハイブ
リドーマを培養して、■培養物から目的とする抗ｈＥＧ
Ｆモノクローナル抗体を得る。なお、上記の一般的方法
それ自体は公知であり、例えば、特公昭５８−４５４０
７　、特開昭５９−１２８３９７号各公報及増車献９に
記載されている。なお、このようなモノクローナル抗体
の具体的な製造方法は参考例１に後記する。

ポリクローナル一 本発明において、ポリクローナル抗体とは、抗原の認識
部位の少しずつ異なる抗体の集合体をいう。そして本発
明では、第１抗体又は第２抗体として用いるモノクロー
ナル抗体と抗原認識部位の異なったものであることが必
要である。このようなポリクローナル抗体の製造法は公
知の常法により調製することができ、例えば下記のよう
な方法に従って行うことができる。

すなわち遺伝子工学的手法（前記）により造成されかつ
純度９９％以上に精製されたｈＥＧＦを生理食塩水に溶
解したのち、等量のフロイントの完全アジュバント（Ｆ
ｒｅｕｎｄ’ｓ　Ｃｏｍｐｌｅｔｅ　Ａｄｊｕｖａｎｔ
）〔文献８の２〕を加えてエマルジョンを得て、ついで
これを家兎（雌）に１週間間隔で数回感作したのち、採
血し、常法に従って血球フィブリンを除く　（本発明の
場合は一例として血清分離剤入りのチューブ〔市販品〕
で処理したのち、遠心を行っている。）ことによって抗
血清を調製する（詳細は、後記参考例を参照のこと）。

そして、このようにして調製された抗ｈＥＧＦ抗血清の
特異性の確認は、定性的沈降反応、ゲル内拡散反応又は
ラジオイムノアッセイ　（ＲＩ　Ａ）法等により行うこ
とができる。

本発明では一例としてゲル内拡散法〔底置「役にたつ免
疫実験法」ｐ６４、（９１８４）講談社刊〕およびＲＩ
Ａ法〔底置「生化学実験講座−ホルモン−Ｊ　ｐ１７３
　（１９７７）、東京化学同人刊〕に従って特異性の確
認を行う（詳細は、本発明者らの発明に係る昭和６０年
６月２１日付で出願された特願昭６０−１３５４６０号
の明細書を参照のこと）。そして、このようにして調製
された抗血清を常法〔例えばプロティンＡ−セファロー
ス９ＣＬ４Ｂ　（ファルマシア社）を用いたカラムクロ
マトグラフィー等〕に従って精製することにより所望の
ポリクローナル抗体を得る。

標識　びその検出方法 本発明においては、第２抗体に標識を付す。この標識と
しては、免疫化学的測定法において常用されている任意
の標識を使用することができ、例えば放射性同位元素、
例えばＩｌｌ　（、５■、ロＣ，’Ｈ等（ラジオイムノ
アッセイ；ＲＩＡ）；酵素、例えばパーオキシダーゼ（
例えば西洋ワサビパーオキシダーゼ）、アルカリホスフ
ァターゼ、β−ガラクトシダーゼ等（エンザイムイムノ
アッセイ；ＥＩＡ）；螢光物質、例えばフルオレフセイ
ンイソシアネート、ローダミン等（フルオロイムノアッ
セイ；　Ｆ　Ｉ　Ａ）等を使用することができる。これ
らの標識を抗体等の蛋白質に付加する一般的方法はすで
に知られており（例えば、文献１０〜１４）、それらの
方法を本発明の第２の抗体に適用すればよい。

また、これらの標識の検出方法としては、これらそれぞ
れの標識について常用されている検出方法を用いること
ができる。

例えば、標識として酵素を用いる場合、その基質として
、例えば西洋ワサビパーオキシダーゼに対しては過酸化
水素、アルカリホスファターゼに対してはパラニトロフ
ェノール・リン酸やフェノール・リン酸、β−Ｄ−ガラ
クトシダーゼに対してはオルトニトロフェノール−β−
Ｄ−Ｘガラクトシド（０−ＮＰ−β−Ｄ−Ｘガラクトシ
ド）か考えられる。

悶体狙止 本発明においては、第１抗体を固体担体に固定化して使
用する。このような固体担体として、免疫化学的測定法
において常用されている任意の材質及び形状の固体担体
を使用することができる。

材質としては例えばポリスチレン、ポリカーボネート、
アミノアルキルシリルガラス、シリコンゴム等があり、
形状としてはマイクロプレート、チューブ、キュベツト
、ビーズ、スティック、ロンド、ディスク等がある。

丈ｐ進の試薬 本発明においては、前記の各種の材料の他に種々の試薬
が使用される。例えば、第１抗体を固体担体にコートす
るためにコーティング緩衝液が使用され、この緩衝液と
しては、例えば炭酸緩衝液（ｐＨ９，７〜１０．０）　
、ＰＢＳ　（−）等を使用することができるが、これに
限定されない。また、分析サンプル中のｈＥＧＦの濃度
を測定可能な範囲内にするために稀釈用緩衝液が使用さ
れ、この緩衝液としてウシ胎児血清アルブミン（ＢＳＡ
）を含有する場合があるＰＢＳ　（−）生理食塩水、ト
リス緩衝液等を使用することができる。さらに、測定実
施の各反応段階において固体担体を洗浄するために洗浄
液が使用され、このために例えばＰＢＳ　（−）　−Ｔ
ｗｅｅｎ　（ＰＢＳ　（−）にＴｗｅｅｎ　２０を０．
０５％濃度に溶解したもの）を使用することができる。

さらに、標識として酵素を使用する場合、使用する酵素
の種類に応じて基質溶液が使用される。この基質として
例えば前記したものを使用することができる。基質溶液
を調製するための緩衝液としては、標識として使用する
酵素の種類により異るが、例えば０．１　Ｍクエン酸緩
衝液、酢酸緩衝液、等を使用することができる。

皿定至大施 第１抗体を固体担体に固定化するためには公知の方法を
用いることができる。例えば、第１抗体がモノクローナ
ル抗体の場合これを前記のコーティング緩衝液に０．１
〜１００μｇ７ｍｌの濃度に溶解し、これを固体担体に
適用し、そしてＯ℃〜３７℃にて０．５〜１６時間イン
キュベートする。次にコーティング溶液を除去し前記の
洗浄液で数回洗浄する。

測定に当っては、必要に応じて測定用サンプルを前記の
稀釈用緩衝液により稀釈する。本発明の方法の測定怒度
は０，０５〜５０ｎｇノｌ１ｌＮであるから、サンプル
中のｈ　Ｅ　Ｇ　Ｆ　ｉＱ度が１〜１０　ｎｇ／ｍｌと
なるように稀釈するのが好ましく、サンプル中のｈＥＧ
Ｆ濃度が予測できない場合には複数段階の稀釈液を調製
し、これらを使用するのが好ましい。

次に、必要に応じて上記のように稀釈されたサンプルと
第１抗体が固定化されている固体担体と接触せしめ、イ
ンキュベートする（第１段階）。

このインキュベーションは０℃〜３７℃にて３０〜１２
０分間行うのが好ましい。次にサンプルを除去し、前記
洗浄用液により固体担体を数回洗浄することにより固体
担体に非特異的に付着しているサンプルを除去する。次
に標識された第２抗体の溶液を前記洗浄された固体担体
と接触せしめることにより、第１段階において固定化さ
れたｈＥＧＦの第１抗体の抗原決定基以外の抗原決定基
と第２抗体とを特異的に結合せしめる。固体担体と接触
せしめる第２抗体の溶液中の第２抗体の量が固体担体に
固定化されたｈＥＧＦの量に比べて過剰となることを条
件として、第２抗体溶液中の第２抗体の濃度及び該溶液
の使用量は任意に選択することができる。

上記の方法に代えて、第１段階と第２段階とを同一段階
として実施することができる。この態様においては必要
に応じて稀釈されている場合があるサンプル溶液と上記
第２抗体溶液とを混合して固体担体に適用するか、又は
これらの溶液のそれぞれを同時に固体担体に適用するこ
とにより行うことができる。

次に、抗原に結合していない第２抗体等を除去するため
、前記の洗浄用液によって固体担体を洗浄する。

次に、固体担体上に固定化された標識を定性的又は定量
的に測定する。この測定方法は標識の種類によって異り
、常法に従って行うことができる。

例えは、標識が放射性同位元素である場合、液体シンチ
レーショカウンター、オートガンマ−カウンター等を用
いて放射能を測定する。また、標識が螢光物質である場
合、螢光量を分光光度計を用いて測定する。さらに、標
識が酵素である場合、その酵素の基質溶液を前記固体担
体と接触せしめる。例えば、標識として西洋ワサビパー
オキシダーゼを用いる場合、基質としての５ｍＭ過酸化
水素及び発色剤としての２，２′−アジノビス（３−エ
チルベンゾチアゾリン）−６−スルホン酸（ＡＢＴＳと
略す）２．５ｍＭを含む０．１Ｍクエン酸暖緩衝を用い
るのが好ましい。

次に、例えば室温で５〜１５分間インキュベートするこ
とにより酵素反応と発色を行い、反応を停止した後発色
の程度を常法に従って測定する。

測定された標識活性から抗原濃度を知るには、常法に従
って予じめ標準抗原と最終段階での標識活性との関係か
ら検量線を作成しておき、この検量線と被検液の吸光度
とを照合すればよい。

貫足里土工上 本発明の測定用キットは、第１の態様において（ａ）ｈ
ＥＧＦの第１の抗原決定基と結合することができる第１
の抗体、（ｂ）ｈＥＧＦの第２の抗原決定基と結合する
ことができる標識された第２の抗体、（ｃ）前記第１の
抗体を固定化することができる固体支持体、及び（ｄ）
標準品としての高純度に精製されたｈＥＧＦを含んで成
り、そして第２の態様においては（ａ）ｈＥＣ，Ｆの第
１の抗原決定基と結合することができる第１の抗体を固
定化した固体支持体、（ｂ）ｈＥＧＦの第１抗体の抗原
決定基以外の抗原決定基と結合することができる標識さ
れた第２の抗体、及び（ｃ）標準品としての高純度に精
製されたｈＥＧＦを含んで成る。この場合、第１抗体と
してモノクローナル抗体を使用する場合には第２抗体と
してポリクローナル抗体を使用し、他方第１抗体として
ポリクローナル抗体を使用する場合には第２抗体として
モノクローナル抗体を使用する。第２の態様のキットは
第１抗体が固定化された固定担体を含むのに対して第１
の態様のキットは固定化されていない第１抗体及び第１
抗体を担持しない固体支持体を含み、第１抗体の固体支
持体への固定化はキットの使用者によって行われる。

前記第１抗体（第１の態様の場合）、第２抗体及び標準
品ｈＥＧＦ標品は、固体標品であってもよく、すぐに使
用することができる溶液の形であってもよく又、測定に
際して適当に稀釈して使用する濃厚溶液の形であっても
よい。キットが、これらを溶液の形で含む場合、この溶
液には測定に悪影響を与えない防腐剤を加えることがで
きる。

この発明のキットは、上記のものを含んで成るが、測定
の便宜のために前に記載した他の試薬、例えば稀釈用溶
液、コーティング緩衝液、洗浄用溶液、標識が酵素であ
る場合には酵素基質及び発色試薬等を含むことができる
。しかしながらこれらは、測定者において常法に従って
容易に調製することができ、又は入手することができる
ものである。従ってこれらを含まないキットも本発明の
範囲内のものである。

〔発明の効果〕

本発明は、上記したように、高純度のｈＥＧＦ精製標品
およびこれを抗原として用いることにより調製した異る
抗原決定基に特異的に結合する２種類の抗ｈＥＣ；Ｆ抗
体（すなわちモノクローナル抗体およびポリクローナル
抗体）を用いるイムノアッセイ法によりｈＥＧＦの測定
法である。本発明者らおよび共同研究者らは以前、モノ
クローナル抗体または抗血清を用いるｈＥＧＦの免疫化
学的測定法（各々前記特別明細古参照）については既に
提案しているが、本発明のように、モノクローナル抗体
と抗血清とを組合せた方法については提案していなかっ
た。そこで本発明の方法を提案することにより、先に提
案した方法ともあいまってより適用範囲の広い、ｈＥＧ
Ｆの免疫化学測定方法を確立することができよう。

また、本発明のｈＥＧＦ測定用キットはこのような測定
法をより簡便に施行するための便利な手段を提供する。

従ってこのような測定法およびキットは、ｈＥＧＦの測
定法を確立するものであるということができ、生物学的
分野へ多大な貢献をなすものであるといえよう。

参者１．１？−の８゜−＋１ ｈＥＧＦとのみ反応する抗ｈＥＧＦモノクローナル抗体
を以下のようにして調製した。

（１）細胞の調製 Ｂａ　Ｉ！　ｂ／ｃマウスに、遺伝子工学的手法によっ
て造成し単離されたｈＥＧＦ　（前記特別６０−２２６
３０号参照）３０℃ｇを腹腔内投与することにより免疫
（初回免疫）を行い、以後は１０日間の間隔で追加免疫
を１回行った。最終免疫終了後３日目にマウスより牌細
胞を無菌的に摘出し、この細胞をほぐしてＩ？ＰＭＩ　
−１６４０培地に懸濁したのち、ナイロンメソシュで濾
過することによりマウス牌細胞懸濁液（２ｘ１０ａ個／
　ｍ　ｌ　）を調製した。

一方、上記細胞と融合させるマウス腫瘍細胞Ｐ：１０１
　（フロー社）の懸濁液（ＲＰＭＩ　−１６４０培地）
を常法に従って調製した。

（２）細胞融合 上記で調製したマウス牌細胞懸濁液とＰ３０１細胞懸′
ＩＡ液とを、牌細胞とＰ３Ｕ１細胞との細胞数の比が１
０：１の割合になるように混合したのち遠心し、上清を
除去した。ついで遠心管底部の細胞に約４０％Ｐ　Ｅ　
Ｇ４０００含有ＰＢＳ　（−）溶液１ｍｌをゆっくり滴
下し°た。これを４分間、３７℃で静置したのち、Ｉ？
ＰＭＩ−１６４０（１０％ＦＣ３含）を添加することに
よりＰＥＧを希釈した。ついで遠心して上清を除去した
のち、尿路的にＰ３旧細胞の濃度が１．０Ｘ１０’個／
ｍｌになるようにＲＰＭＩ　−１６４０（１０％ＦＣ３
含）で希釈後、９６ウエルのプレート１００μ７！／ウ
エルの割合で分注した。なお、このプレートには予めフ
ィーダー細胞として３週齢以内のＢａ　ｌ　ｂ／ｃマウ
スの胸腺細胞を５Ｘ１０’個／ウェルの割合で１００μ
ｌ／ウエルずっ分注しておいた。

（３）ハイプリドーマの選択 上記融合操作の翌日から４日間毎日各ウェルの培地の半
量（１００μりずつをＨＡＴ培地に交換し、さらに、１
日おきにＨＡＴ培地により培地の交換を行いながらｌＯ
日間培養を行ったのち、上清の分析を行い陽性反応を示
すウェルを６種選択し、ついで、これら６種のウェル中
のコロニーよす細胞をとり出し限界希釈法によってクロ
ーニングし、６種類のハイブリドーマを樹立した。

（４）ハイブリドーマの培養および抗体の回収得られた
６種類のハイプリドーマを各々ｌ？ＰＭＩ　−１６４０
（１０％ＦＣ３含）培地中、３７℃、５％炭酸ガスの存
在下、炭酸ガスインキュベータで培養し、ついで培養上
清から硫安分画法により抗体を回収した。一方、同細胞
をマウス腹腔内に投与し抗体を腹水とし得、これを硫安
分画により粗分画しＤＥＡ［Ｅ−セルロースカラムクロ
マトグラフィー法にて精製抗体を回収した。なお、これ
ら抗体の特徴づけを行ったところ、第１表に示すような
結果を得た。表中１ｇＧ＋／にの表現は、サブクラスが
ＩｇＧ１でその軽鎖がにであることを示す。

（５）抗体の特異性の確認 前記のモノクローナル抗体の特異性をエライザ（ＥＬＩ
ＳＡ法）によって確認した。

９６ウエルのプレート（ファルコン社）にｈＥＧＦおよ
びマウスＥＧＦ　（ｍＥＧＦ）を各々コーティング緩衝
液を用いて固定化し、さらに対照として抗原を固定化し
ていないウェルが同一系内に存在するプレートを用意し
た。そしてこのプレートを用いてＥＬＩＳＡ法に従って
本発明で得られた抗体の特異性を確認した。なお、その
ときの抗体（ハイブリドーマｌ−２−１１Ｇ株、２４−
４株、２４−６株、２４−９株、２４−１１株及び７−
２−３−３株由来）の濃度はＰＢＳ　（−）で各々１．
１ＳＩｇ／ｍβに調製して用いた。そのときの各ウェル
の上清の吸光度ＯＤ　４゜５を第２表に示す。なお、本
実験で用いた抗体は、マウス腹水より採取し、硫安分画
を行ったのちＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラ
フィーにより精製したものであり、全てＩｇＧ＋／にで
あり、また抗体濃度も同一である。そして第２表中ＯＤ
４゜。

の値は全て対照の値を差し引いたものである。

以下余白 第２表 （６）抗原決定基の確認 前記のｈＥＧＦとのみ反応する５種類のモノクローナル
抗体の特徴付けを、以下の方法に従ってその抗体が確認
している抗原決定基特異性を調べることによって行った
。

ｒ　）　　ｌ　Ｚ　Ｓ　Ｈによる抗体の標識株ｌ−２−
１１Ｇより産生され得られた抗体（以下抗体は産生株名
で記載する）１０μｇをＰＢＳ（−）５μｌに溶解し、
これに０．４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）　１０　ｐ
ｉにＮａ’　２ＳＩ（０，５ｍＣ１）を溶解したものを
加え、さらにクロラミンＴ（２■７ｍ１１０．４Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，４）　）の溶液５μｌを加えたのち
室温で３０秒混和した。ついで、この混和液にナトリウ
ムメタビサルフェート２■／／！０．４Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７，４）の溶液５０μｌを加え反応を停止した。

ついでこの溶液に０．２％生血清アルブミン（ＢＳＡ）
　４５０μｌを加えたのちセファデックス０２５カラム
クロマトグラフイ（ＮａＩ２Ｊの溶出は０．２％ＢＳΔ
−ＰＢＳ溶液で行った）を行い未反応のＮａ１２ｓＩと
標識化抗体とを分離した。そしてここで得られた標識化
抗体は２５２８　Ｘ　ＬＯ’ｃｐｍ／　ｕ　ｇであった
。

ｉｉ　）競合反応を用いた抗体の特異性の確認ｈＥＧＦ
のみを固定化した各ウェルが切断可能な９６ウエルプレ
ート（グイナテック社）を用意し、各ウェルにＩＺＳＩ
標識化ｌ−２−１１Ｇ抗体２０μ７！（１４６６００ｃ
ｐｍ　、　５．８ｎｇ抗体蛋白量）を加えたのち、各抗
体ｌ−２−１１Ｇ　、　２４−４　、２４−６　、２４
−９および２４−１１を重量比で上記標識化抗体に対し
て０．０１．０．１．０．２．０．５．１．２．５．１
０．２０および１００となるように混和し、各ウェルの
最終容量が５０μととなるように０．２％ＢＳ八−Ｐへ
Ｓ　Ｔ：言Ｉ」整した。ついでこのプレートを室温で１
５時間放置したのち、ＰＢＳ　（−）　−Ｔｗｅｅｎで
２回洗浄を行った。ついで各々のウェル中のＩｔｓ（の
放射活性をオートガンマ−カウンターで測定した。その
結果を第２図及び第３図に示す。なお、これらの図中Ｔ
は反応系に放射性標識抗体のみを添加した時に抗原と結
合している放射性標識抗体のｃｐｍであり、そしてＢは
上記放射性標識抗体を含む系に非放射性抗体を添加（す
なわち、被検液を添加）したときの、抗原と結合してい
る放射性標識抗体のｃｐｍである。

この結果より、上記で得られた５種の抗体は大きく２つ
のグループに分けられた。すなわち１つはｌ−２−１１
Ｇ抗体と性質の似た抗体２４−４とのグループ、もう１
つはｌ−２−１１Ｇ抗体とあまり競合性を示さない抗体
２４−６　、２４−９および２４−１１のグループであ
る。

参者す、２　高純度ｈＥＧＦの調装 本発明で用いる高純度ｈＥＧＦは次の方法により製造し
た。

形質転換された微生物Ｅ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）　Ｋ　
１２ＹＫ５３７（ｐＴＡ１５２２）を培養し、培養菌体
を集めてオスモチ４　ッ／　上？ｎ　ヲ調製シ、ＤＥＡ
Ｅ−ＴＯＹＯＰＥＡＲＬＯ６５０１１（東洋曹達）を用
いるイオン交換クロマトグーｙ−ｙイー、及びＩＩＣＬ
　８０３０システムを用いる高速液体クロマトグラフィ
ーにより精製した。

こうして精製したｈＥＧＦ製品の純度を、常法であるポ
リアクリルアミドゲル電気泳動および逆相高速液体クロ
マトグラフィーにより決定した。

これらの結果より、純度は９９％以上であることがわか
った。そのときの電気泳動の結果は第４図に、示す通り
であった。なお、第４図中（イ）は電気泳動のゲルを模
写したものであり、矢印（６＝）がｈＥＧＦのバンドを
示し、また（口）はデンシトメトリーである。

次番こ、上記の標品をアミノ酸分析機ＨＬＣ−８２５Ａ
Ａ（東洋曹達）を用いてアミノ酸分析を行ったところア
ミノ酸組成が文献値と完全に一致した。また、−次構造
の決定を文献（１６）の方法に従って行い、さらに二次
構造の決定を行った。以上の結果、本発明で使用したｈ
ＥＧＦの一次構造及び二次構造は、１９７５年にグレゴ
リ−が提唱〔文献（２）　）　したもののそれと完全に
一致した。

１考炭−主 本発明に用いるポリクローナル抗体を以下のようにして
調製した。

１、抗血清の調製 上記の高純度（純度９９％以上）に精製されたｈＥＧＦ
を抗原として、以下の手順に従って抗血清を調製した。

ｈＥＧＦ　（０，２ｍｇ）を生理食塩水（０，５ｍｌり
に溶解し、ついで等量のフロイントの完全アジュバント
を加え°ζエマルジョンを作成した〔放置「生化学実験
講座　ホルモンＪ　ｐ１７５　（１９７７）、東京化学
同人刊〕。次に、このエマルジョン１ｍ５を家兎（雌）
の脇の下および背中の皮下に数個所に（約Ｑ、２ｍｌず
つ）分けて注射し、この操作を１週間間隔で図６回行っ
たのち、最後の感作から１週間後に耳静脈より採血した
。そしてこの血液をヘパラビットチューブ（血清分離剤
入りのチューブ：積木化学工業＠）に入れて２０〜３０
分放置したのち、遠心（３０００ｒｐｍ、３０分間）し
て血球・フィブリンを除去して、目的とする抗血清を得
た。

２、抗血清の、　　の確り。

本発明の抗血清の特異性の確認は、以下のオフテロニー
法に従って抗血清と他の物質との交差反応を調べること
により行った。

ガラスシャーレに１．２％の精製寒天液（アジ化ナトリ
ウム（Ｎａｔｌｌ＋）を０．１％添加したもの）７ｍＪ
を入れて寒天をゲル化させたのち、ゲルに直径５ａｍ程
度の穴をあけた。このような穴を第８図に示されるよう
に６個（イ〜へ）あけ、中央の穴に抗血清を２０μｌを
入れ、まわりの穴に各々ｈＥＧＦ、２ｌ−Ｌｅｕ−ｈ−
ＥＧＦ　（ｈＥＧＦの２１番目のアミノ酸がメチオニン
からロイシンに置換されたもの。造成の詳細については
特開昭６０−２８９９４号公報参照）、ウロガストロン
、正常ウサギ血清および抗つサギＩｇＧ抗血清２０μｌ
を各々添加したのち、低温室（４°Ｃ）で−夜インキュ
ベートを行った。そのとき生じた沈降線を第５図に示す
。同図中Ａｂは本発明の抗血清溶液が入った穴を示し、
イ〜へは下記の溶液が入った穴を示す。

（イ）ｈＥＧＦ （ロ）ｈＥＧＦ−ｎ （ｈＥＧＦのＣ末端アミノ酸が二つ欠如したもの） （ハ）２１　　Ｌｅｕ−ＥＧＦ （ニ）ウロガストロン （ホ）正常ウサギ血清 （へ）抗つサギＩｇＧ抗血清 また、Ａｂの穴のまわりの実線は沈降線を示す。

従って本発明の抗ｈＥＧＦ抗血清と、イ、口、ハおよび
二との間にはっきりと沈降線が確認できたこと（第５図
）、および上記と同様の方法で中央に本発明の抗血清を
入れ、まわりの穴にマウスＥＧＦ　（ｍＥＧＦ）　、セ
クレチン、インシュリン、ヒト性腺刺激ホルモン等を入
れてインキュベートを行ったときには沈降線が生じなか
ったことから、本発明の抗血清はｈＥＧＦに対して特異
性が高いことが確認された。

実施例１゜ Ａ０分析用プレートの調製 ９６ウエルのプレート（ヌンク社）の各ウェルごとにコ
ーティング緩衝液（１００ｍ　Ｍ　ＮａＨＣＯ３，５０
ｍＭ　ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９，７〜１０　）に溶解した
抗体（２４−１１）（１０＃ｇ／ｍｊ！　）を５０ｐｌ
ずつ各ウェルに分注し、室温で２時間放置後ＰＢＳ　（
−）−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄を行った。ついでＰＢＳ　
（−）〔１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有〕を加
え２時間放置した後、ＰＢＳ　（）　　Ｔｗｅｅｎでさ
らに洗浄を行うことにより分析用プレートを調製した。

ここでＰＢＳ　（−）は、塩化ナトリウム８．０ｇ、リ
ン酸二水素カリウム（無水）０．２ｇ、リン酸−水素ナ
トリウム（無水）　１．１５ｇ、塩化カリウム０．２ｇ
を混合し１０＜１ＩＪｎ＋＃にしたものである（ｐＨ７
，４）。

また、ＰＢＳ　（）−Ｔｗｅｅｎは、上記ＰＢＳ（−）
にＴｗｅｅｎ　２０　（０，５ｍｊ！　／　ｌ　）を添
加したものである。

ｈＥＧＦ２ｍｇを０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，１）
５ｍ／に溶解した。ついでこれにあらかじめ０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７，１）で洗浄しておいたホルミルセ
ルロファイン（生化学工業）６ｇ（湿重）を加え、さら
に水素化シアノホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＩＩ３）
　　５０　ｅｒｇを加えたのち１２時間攪拌を行った。

反応終了後、ホルミルセルロファインを０．１　Ｍリン
酸緩衝液（ｐＨ７，１）で洗浄し、ついで０．２　Ｍ　
）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，０）１０ｍｌに懸濁させ
、ＮａＣＮＢＨｚ）　２０　ｍｇを加えたのち２５℃で
４時間反応を行った。反応終了後、ホルミルセルロファ
インを０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，１）で洗浄し
、さらに（イ）　Ｑ、　５　Ｍ　ＮａＣ１含有０．０５
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，４）　、（Ｉｆｆ）　　０．
２　Ｍグリシン−塩酸（ｐＨ２，２５）および（ハ）０
．４Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８，０）で順次洗浄したのち
、これをカラムに充填した（ｈＥＧＦ−セルロファイン
、カラム１，０Ｘ１０ａａ）。ついで、前記抗血清（参
考例３）５ｍＩｌを０．１５Ｍ　ＮａＣｌ含有０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で希釈したものを上記カ
ラムに付した。そして、このカラムを０．１５ＭＮａＣ
１含有０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）で洗浄し
たのち、０．２Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐＨ２，２５
）を加えることにより所望画分の溶出を行って、ｈＥＧ
Ｆと強い親和性をもつ特異抗体（抗ｈＥＧＦウサギ抗体
）（蛋白ｆｆ１９．０■）を得た。

２、酵素標識抗体の調製 上記で得られた抗体（蛋白量５■）にＮ、Ｎ’−０−フ
ェニレンジマレイミド（０−ＰＤＭ）飽和溶液２ｍｌを
添加し、３０℃で３０分反応を行ったのち、この反応混
合物をセファデックスＧ−２５のクロマトグラフィーに
供し、マレイミド化抗体を得た。ついでこの抗体にβ−
ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）　？容液（５■／ｍ／
）５０μｌを添加し、５℃で一夜反応を行ったのちセフ
ァロース６Ｂのクロマトグラフィーに供した。所望画分
の溶出は０．１％ＮａＮ、、　、１　ｍＭＭｇＣＩ２お
よび０．１５Ｍ　ＮａＣ１含有０．０１Ｍリン酸緩衝？
（Ｉ（ｐＨ７，２）を用いて行い、酵素活性ならびに抗
体活性をともに有する両分（β−ｇａｌと抗ｈＥＧＦ抗
体との結合物；酵素標識抗体）を分取した。

Ｃ０生体成を中のｈＥＧＦの測 上記分析用プレートにｈＥＧＦの０．２％ＢＳＡ含有Ｐ
ＢＳ　（−）溶液を５０μｌ／ウエルの割合で添加した
（なお、ここで用いたｈＥＧＦ濃度は１２．５　、６．
２５　、３．１３　、１．５６　、０．７８　、０．３
９　、０．１９　。

０．１　．０．０５および０．０２５μｇ／ｍｌであっ
た）。

ついでこのプレートを室温で２時間放置したのちＰＢＳ
　（）−Ｔｗｅｅｎで３回洗浄を行った。そしてこれに
前記酵素標識抗体の２０００倍希釈液（注；溶媒は０．
２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−））を５０μｌ／ウエルで添
加したのち、室温で２時間放置後、ＰＩ３５　（）−Ｔ
ｗｅｅｎで５回洗浄を行った。ついで１曙／　ｍ　Ｉｔ
の０−ＮＰ−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの０．１Ｍリ
ン酸緩衝液（１０’　ｍ　Ｍ　ＭｇＣＩｚ、０、１　Ｍ
　２−メルカプトエタノール含有、ｐ１４７．８）を２
００μｍ／ウェルの割合で添加後３７℃で１６時間放置
した。

ついで０．１ＭのＮａＨＣＯｉ　　１００　μｍ２　／
ウェルの割合で添加後、タイターチック・マルチスキャ
ン（フロー社）によってＯＤ、□０を測定した。そして
そのときの測定値により標準曲線（第６図）を得た。そ
してこれをもとにして被検液（血しょう、血清、尿、唾
液及び精液）中のｈＥＧＦを測定したところ、いずれも
文献値〔底置「細胞成長因子−Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔ
ｏｒｓ−Ｊ　ｐ　２５、日本組織培養学会用、朝倉書店
刊（１９８４）　）とよく一致していた。

実施例２゜ Ａ、八　　プレートのれ−＋１ 分析用プレートの調製は前記実施例１と同様に行った。

但し、プレートに固定化する抗体としてポリクローナル
抗体を使用した。

Ｂ、酵素標識抗体の調製 抗ｈＥＧＦモノクローナル抗体ｌ−２−１１Ｇ　（１，
５ｍｇ）を１ｍ１のＰＢＳ　（−）に溶解し、ついで２
００　ｐ　ｌの１　ｍＭ　５ＰＤＰ　　（Ｎ−サクシン
イジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネート〕の
エタノール溶液を攪拌しながら添加し、室温で３０分間
反応を行った。放置後セファデックス＠Ｇ−２５カラム
クロマトグラフィーを用い未反応のＳＰ叶と抗体とを分
離した。そして所望抗体画分（３ｍｌ）を集めた〔なお
、所望画分の溶出は０．１　Ｍ　ＮａＣ１。

０、ＩＭ　Ｃｌｌ：＋ＣＯＯＮａ　（ｐＨ４，５）で行
った〕。ついでこの両分に最終濃度が５０ｍＭとなるよ
うにＤＴＴ（ジチオスレイトール）を添加し、室温で２
０分間放置後、再度セファデックス＠Ｇ−２５カラムク
ロマトグラフィーによって抗体とＤＴＴとの分離を行い
抗体画分（約３ｍ１）を得た（溶出液は上記と同じ）（
ＤＴＴ処理抗体溶液）。

一方、西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＰＯ）（０，５曙
）を１ｍｌのＰＢＳ　（−）に？８解し、これに２５０
μｌの１　ｍＭ　５ＰＤＩ’エタノール溶液を攪拌しな
がら添加し、室温で３０分間反応後、セファデックス９
Ｇ−２５カラクロマトグラフイーを行い５ｐｏｐと抗体
との分離を行い２０画分を得た（約３ｍ１）。

ついでこれ（３ｒｒｌ）とＤＴＴ処理抗体溶液（３ｒｒ
ｌ）とを混合したのち室温で一夜放置することにより酵
素標識化抗体（第２抗体）を得た。

Ｃ，ヒト「　のｈＥＧＦの測 分析用プレー）Ａに人尿（０，２％牛血清アルブミン含
有ＰＢＳ　（−）で１０倍希釈、２０倍希釈したちの各
々）を２５μ７！／ウエルの割合で添加したのち室温で
２時間放置した。ついでこれをＰ　Ｂ　Ｓ　（＝）−Ｔ
ｗｅｅｎで３回洗浄したのちＰＯ標識抗体を２５μｌ／
ウエルの割合で添加し、室温で２時間放置した。そして
再びＰＢＳ　（−）−Ｔｗｅｅｎで洗浄を行ったのち、
酵素の基質を加え反応後、００４゜、を測定した（前記
実施例１参照）ところ、文献値（前記）とよく一致して
いた。

実施例主 次の要素からなるギフトを作成した。

キットＡ （ａ）ｈＥＧＦの第１モノクローナル抗体５０μｇ：凍
結乾燥物／ｌプレート分。

（ｂ）ｈＥＧＦの抗原決定基と結合することができる抗
体５ｍｇを５ｍｇのβ−ｇａｌで標識した抗体１０μｌ
を凍結乾燥したちの／１プレート分（使用時に０．２％
ＢＳＡ／ＰＢＳ　（−）で溶解し、４ｍｌとする）。

（ｃ）前記第１モノクローナル抗体を固定化することが
できる９６Ｆヌンク一イムノプレート１枚。

（ｄ）標準品としての高純度に精製されたｈＥＧＦ１μ
ｇ／ｍ／　　（１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（−））１００μ
ｌの凍結乾燥物（ｈＥＧＦｏ、１μｇ）〔使用時この全
量を５００μｌの水で溶解しく０．２μｇ／ｍｌこの液
を０．２％ＢＳＡ含有ＰＢＳ　（−）で希釈して標準液
とする〕。

その他の試薬（場合によってはキットに含める）（ｅ）
第１モノクローナル抗体プレートへの固定化液：　０．
　Ｉ　Ｍ　Ｎａ１ｌＣＯ３，５Ｑ　ｍ　Ｍ　ＮａｚＣＯ
＋（ｐＨ９，７〜１０．０）　　５　ｍｌ　。

（ｆ）第２抗体の希釈液及びサンプル希釈液：０．２％
ＢＳＡ含有ＰＢＳ　（−）２０ｍ＋２の凍結乾燥物（使
用時に蒸留水２Ｑｍ（！で溶かして使用）。

（ｇ）発色基質：ｌＯ曙０−ＮＰ−β−Ｄガラクトピラ
ノシド（粉末）／１プレート分 （ｈ）発色基質溶解液：　　（ｐＨ７，８）　１０　ｍ
ｌの凍結乾燥物（使用時に１０ｍｊ＋の蒸留水で溶かし
２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を濃度が０．１
　Ｍになるように添加して使用する）。

（＋）反応停止液：　０．　Ｉ　Ｍ　ＮａＨＣＯ３液１
０ｍ＃。

（Ｄ　ブロッキング液：１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ（）ａｏ
ｍｌを凍結乾燥したもの（使用時に蒸留水３０ｍ１で溶
かして使用）。

（ｋ）洗浄液：　０．０５％Ｔｗｅｅ−２０含有ＰＢＳ
　（−）１４０ｍ／　。

注）２−ＭＥ：現地調達。

キットＢ （ａ）ｈＥＧＦの第１の抗原結定基と結合することがで
きる第１モノクローナル抗体（１０μｇ／ｍｌ！コーテ
ィング緩衝液）を５０μｌづつ９６Ｆヌンクーイムノプ
レートの各ウェルに分注し、室温で２時間反応させた後
、洗浄液で３回洗浄し、１％ＢＡＳ含有ＰＢＳ　（−）
３００μｍ／ウェルで分注して、室温で２時間反応させ
た後、再度洗浄液で３回洗浄したもの。

（ｂ）キットＡの（ｂ）　と同様。

（ｃ）キットＡの（ｄ）と同様。

その他の試薬（場合によってはキットに含める。）（ｄ
）キットＡの（ｅ）　と同様。

（ｅ）キットＡの（ｆ）　　と同様。

（ｆ）キットＡの（８）と同様。

（ｇ）キットＡの（ｈ）と同様。

（ｈ）キットＡの（１）と同様。

（ｉ）キットＡの０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢｓ
（−）８０ｍｊ！注）２−ＭＥ：現地調達。

引用文献 ｌ）プロシーディンゲス・オブ・ザ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシズ・オプ・ザ・ユナイティド
・スティツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　
　八ｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ）、７２．　１３
１７（１９７５）。

２）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、　２５７．３２５（
１９７５）。

３）同上　（〃）、孔４１４　（１９８４）。

４）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　ム汀工１５５５（
１９６２）。

５）ライフ・サイエンシズ（Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅ
ｓ）。

２０２６７（１９７６）。

６）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー
（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、　２５０．４２９
７（１９７５）。

７）同上　、２５７．３０５３（１９８２）。

８）ジャーナル・オブ・クリニカル・エンドクリノロジ
ー・アンド・メタボリズム（Ｊ。

Ｃ１１ｎｉｃ、　Ｅｎｄｏｃｌｉ、　Ｍｅｔａｂ、）、
　４５．１１４４（１９７７）。

８の２）エンドクリノロジー（ハ封虹植１昼戸。

銭、　１２６１（１９７２）。

９）ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソズ（Ｊ、
　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）、３９．２８５
〜３０８（１９８０）。

１０）ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド
・サイトケミストリー（Ｊ、　Ｈｉｓｔｏ。

６．４３（１９６３）。

１２）同上　　、工８７１　（１９７１）。

１３）ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ、　
Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、７８．２３５（１９７５）。

１４）フルオレッセイント　アンティボディ　メソズ（
Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　Ａｎｔｉｂｏｄ　　ｍｅｔｈ
ｏｄｓ）アカデミツク・プレス刊。

１５）代謝、１７．５１（１９８０）。

１６）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー　（Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｍ、）　２５６．７９
９０−７９９７（１９８１）。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のｈＥＧＦ測定法の模式図の１例である
。 第２図及び第３図はこの発明に使用するモノクローナル
抗体の抗原決定基特異性を説明するグラフである。 第４図はこの発明において使用した抗原ｈＥＧＦの純度
を電気泳動により決定した結果であり、図中（イ）は電
気泳動のゲルを模写したものであり、（０）はそのデン
シトメトリーである。 第５図は、抗ｈＥＧＦ抗血清の特異性をオフテロニー法
によって調べたときのゲルを模写した図である。 第６図は、本発明の測定を行ったときの標準曲線である
。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ヒト上皮細胞成長因子を免疫化学的に測定するため
   のキットであって、 （ａ）ヒト上皮細胞成長因子の第１の抗原決定基と結合
   することができる第１の抗体； （ｂ）ヒト上皮細胞成長因子の第２の抗原決定基と結合
   することができる標識された第２ の抗体； （ｃ）前記第１の抗体を固定化することができる固体支
   持体；及び （ｄ）標準品としての高純度に精製されたヒト上皮細胞
   成長因子； を含んで成り、前記第１の抗体及び第２の抗体の内いず
   れか一方がモノクローナル抗体であり他方がポリクロー
   ナル抗体であるキット。 ２、ヒト上皮細胞成長因子を免疫化学的に測定するため
   のキットであって、 （ａ）ヒト上皮細胞成長因子の第１の抗原決定基と結合
   することができる第１の抗体を固 定化した固体支持体； （ｂ）ヒト上皮細胞成長因子の第２の抗原決定基と結合
   することができる標識された第２ の抗体；及び （ｃ）標準品としての高純度に精製されたヒト上皮細胞
   成長因子； を含んで成り、前記第１の抗体及び前記第２の抗体の内
   一方がモノクローナル抗体であり他方がポリクローナル
   抗体であるキット。 ３、ヒト上皮細胞成長因子の免疫化学的測定方法であっ
   て、 （１）ヒト上皮細胞成長因子の第１の抗原決定基と結合
   することができる第１の抗体を固 定化した固体担体と測定対象試料とを接触 せしめる段階； （２）前記段階（１）と同一段階として又は異る段階と
   して、前記固体担体をヒト上皮細胞 成長因子の第２の抗原決定基と結合するこ とができる標識された第２の抗体と接触せ しめる段階；及び （３）前記固定担体上に固定化された第２の抗体の標識
   又は固定化されなかった第２の抗 体の標識を測定する段階； を含んで成り、前記第１の抗体及び第２の抗体の内いず
   れか一方がモノクローナル抗体であり他方がポリクロー
   ナル抗体である方法。