JPH0257977A - ヒト酸性グルタチオンｓ―トランスフェラーゼの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （イ）産業上の利用分野 本発明は、例えば、悪性腫瘍特に消化器系癌の診断に用
いることができる、ヒト・酸性グルタチオンＳ−トラン
スフェラーゼ（酸性ＧＳＴ）を免疫学的に測定する方法
、それに用いる測定試薬及びキットに関する。

（○）従来の技術 ＧＳＴは、生体に侵入する各種物質あるいは生体内で生
じる代謝物質と還元型グルタチオンとの抱合反応を触媒
する解毒酵素として知られている。

すりち、これらの物質の多くは、生体内の蛋白質や核酸
などと反応して種々の病変（例えば発癌）の原因になる
ものであるが、これらの物質の反応性はグルタチオン抱
合により中和され、より水溶性の生成物となり肝臓など
で代謝され、最終的には体外に排泄される。

ＧＳＴは哺乳動物を含む多くの生物種に存在しており、
特に肝臓の細胞質に多く、その他牌臓。

腎臓、肺臓、脳、骨格筋、皐丸２小腸等に広く分布し、
胎盤や赤血球からも特殊な分子種が分離されている。一
般にＧＳＴは多種の酵素からなっており、種特異性があ
るだけでなく臓器又は組織特異性も有している。

ヒトの場合は塩基性ＧＳＴと酸性ＧＳＴが知られている
（　Ｊ　、　Ｂ　ｉｏｌ、Ｃｈｅｉ、、　　２５９　１
２４４４（１９８４）　）。

塩基性ＧＳＴは等電点（ｐｌ）が７〜９で、２つのサブ
ユニットから成り、各サブユニットの分子量は約２３，
０００である。酸性ＧＳＴは等電点（ｐＩ）が４〜５で
、２つのサブユニットから成り、各サブユニットの分子
量は約２２，０００である。

塩基性ＧＳＴはα、β、γ、δ、εの５つの分子種が知
られており、いずれも主として健常な成人の肝臓に存在
し、その他腎臓、阜丸、小腸、脳。

肺臓等にも存在する。一方、酸性ＧＳＴは胎盤に存在す
るπ、赤血球に存在するρが知られており、健常な成人
の肺臓には殆んど存在せず、胎児の肝臓、胎盤、肝癌細
胞、胃癌細胞等の増殖性細胞に存在する。そして、これ
ら増殖性細胞が産生ずる酸性ＧＳＴは血中に遊離してく
るので、肝癌、胃癌、大腸癌２食道癌、膵臓癌等の消化
器癌等に特異性の高い腫瘍マーカーとして利用できる可
能性がある。

従って、酸性ＧＳＴを測定する試みとして、ポリクロー
ナル抗体を用いる方法、あるいは２種のモノクローナル
抗体を用いて極めて高い特異性でヒト・酸性ＧＳＴを測
定する方法（ＷＯ８７１０３３７７号明細書参照）が行
なわれている。

（／リ　　発明が解決しようとする課題しかしながら、
ポリクローナル抗体を用いたヒト・酸性ＧＳＴの測定に
おいては、アイソザイムの多い酵素故に特異性の面で必
ずしも十分に高いとは云い難い場合があり、また２種の
モノクローナル抗体を用いたヒト・酸性ＧＳＴの測定方
法においては、抗原の特定部以外とは反応しないと云う
モノクローナル抗体の特性故に抗原と親和性が必ずしも
十分に高くない場合があり、より高い特異性及びより高
い感度でヒト・酸性ＧＳＴを測定することができる免疫
学的測定方法が望まれていた。

（ニ）課題を解決するための手段 そこで本発明者らは、かかる従来技術の課題に鑑みて、
ヒト・酸性ＧＳＴを高特異性かつ高感度で測定し得る測
定方法、測定試薬及びキットを開発するべく鋭意検討し
た結果、抗原との親和性が高いヒト・酸性ＧＳＴを特異
的に認識するポリクローナル抗体と、ヒト・酸性ＧＳＴ
を特異的に認識するモノクローナル抗体とを組合わせる
ことにより、高特異性及び高感度でヒト・酸性ＧＳＴを
測定し得ることを知見し本発明に到達した。

すなわち本発明は、 （１）　　不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とを用
いてヒト・酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの
免疫学的測定を行なうに際し、いずれか一方の抗体とし
てヒト・酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼに対
するポリクローナル抗体を用い、他方の抗体としてヒト
・酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼを特異的に
認識するモノクローナル抗体を用いることを特徴とする
ヒト・酸性グルタチオンｓ−トランスフェラーゼの免疫
学的測定方法、 （２）上記（１）のヒト・酸性グルタチオンｓ−トラン
スフェラーゼの免疫学的測定方法に使用する、ポリクロ
ーナル抗体とモノクローナル抗体の二種類の抗体を組み
合わせてなる測定試薬、及び（３）上記（２）の二種類
の抗体を組み合わせてなる測定試薬と、これに（ａ）溶
解剤、市〉洗浄剤及び酵素で標識化した抗体を用いる場
合には、（ｃ）酵素活性を測定するための基質及びその
反応停止剤を組合せてなるヒト・酸性グルタチオンＳ−
トランスフェラーゼの免疫学的測定用のキットである。

一般に抗原の２つの異なる部位に結合する抗体を用いて
抗原の有無又はその量を測定する方法は、サンドイツチ
法と呼ばれ、例えばワイド（Ｗｉｄｅ）の［放射線免疫
検定法（Ｒａｄｉｏｉ＋＋＋ｍｕｎｏａｓｓａｙＭｅｔ
ｈｏｄｓ）　Ｊ　　１９９〜２０６（１９７０）に記載
されテいる。

本発明のヒト・酸性ＧＳＴの免疫学的測定方法において
は、抗原の２つの異なる部位に結合する２種類の抗体と
して、ヒト・酸性ＧＳＴに対するモノクローナル抗体と
ポリクローナル抗体を使用し、そのモノクローナル抗体
としてはヒト・酸性ＧＳＴを特異的に認識して結合し得
るモノクローナル抗体を使用し、好ましくはヒト・酸性
ＧＳＴのうちヒト胎盤由来グルタチオンＳ−トランスフ
ェラーゼ（ＧＳＴ−π）分子のＮ端から４４残基までの
シーケンスを有するフラグメントを認識するモノモノク
ローナル抗体、またはＧＳＴ−π分子のＮ端１７６残基
から２０９残基（ｃ端）までのシーケンスを有するフラ
グメントをｍｉｌ！するモノクローナル抗体を使用し、
ポリクローナル抗体としてはヒト・酸性ＧＳＴに対する
抗ヒト・酸性ＧＳＴ抗血清の抗体成分好ましくはＧＳＴ
−π分子のＮ端９２残基から２０９残基（ｃ端）までの
シーケンスを主に認識するポリクローナル抗体を使用す
る。

このことにより、サンドウィッチ免疫測定法で高感度が
期待される、゛抗原認識部位の異なる２つの抗体を用い
る′という条件が本測定法において満たされる事になる
。その証明として、ＧＳＴπ分子を家兎に免疫して得ら
れる抗体は、実施例１の中で示されるごとく、ＧＳＴ−
πのブロムシアン分解ペプチドの中でｌ［ｉ９２残基か
らＮ　９Ｗ２０９残基（ｃ端）までのシーケンスを有す
るフラグメントを主に認識することにより、Ｎ端からＮ
端４４残基を認識するモノクローナル抗体と、抗原認識
部位が明らかに異なる。

また、参考例１で得られた６Ａが認識するフラグメント
Ａ　［／２′Ｌｅｕ−２１７Ｇｌｎｌを固定化し、固定
化フラグメントＡによるポリクローナル抗体吸収実験の
結果、ポリクローナル抗体がほとんど吸収されないこと
から、このポリクローナル抗体は、ＧＳＴ−πのＮ端１
７６残基から２０９残基を認識するモノクローナル抗体
とも、抗原認識部位が異なる事が示されたことになる。

本発明において使用される標識抗体を Ｆ（ａｂ’）ｚ分画またはＦ　ａｂ’　に変換させるこ
とにより、さらに高感度な測定系が達成でき、本発明の
目的にさらに近づくこととなる。

次に本発明によるヒト・酸性ＧＳＴの免疫学的測定方法
、それに用いる測定試薬及びキットを具体的に説明する
。

ヒト・酸性ＧＳＴの免疫学的測定方法：ヒト・酸性ＧＳ
Ｔに対するポリクローナル抗体（第１抗体）を適当な不
溶性担体く例えばプラスチック容器）に固定化する（以
下これを“固定化抗体″という）。ついで不溶性担体と
測定しようとする試薬又は検体試料との非特異的結合を
避けるために適当な物質（例えば牛血清アルブミン）で
不溶性担体の表面を被覆する。

このようにして得られた第１抗体が固定化された不溶性
担体を検体試料と一定時間及び温度で接触させ反応させ
る。この間に固定化抗体（第１抗体）と検体試料中のヒ
ト・酸性ＧＳＴが結合する。

ついで適当な洗浄液で洗った後、適当な標識物質（例え
ば酵素）で標識したヒト・酸性ＧＳＴに対するモノクロ
ーナル抗体（第２抗体）の溶液（例えば水溶液）を、不
溶性担体における固定化抗体に結合したヒト・酸性ＧＳ
Ｔと一定時間及び温度で接触させ第２抗体と反応させる
。これを適当な洗浄液で洗い、次いで不溶性担体上に存
在する第２抗体に標識された標識物質の量を測定する。

なお上記反応は、固定化抗体、標識抗体及びヒト・酸性
ＧＳＴを含有する検体試料を同時に混合し、一定時間及
び温度でこれら三者を同時に接触させて反応させること
もできる。

かくしてその値から検体試料中のヒト・酸性ＧＳＴの量
を算出することができる。

測定試薬　びキットの構 ヒト・酸性ＧＳＴの免疫学的測定用の測定試薬は、上述
した不溶性担体に結合した抗体と、標識抗体とからなる
。

また、ヒト・酸性ＧＳＴの免疫学的測定用のキットは、
上記の測定試薬と、これら測定試薬を能率よく且つ簡便
に利用するための補助剤として、例えば固体状の試薬又
は液状の検体を溶解させるための溶解剤、不溶性担体に
非特異的に結合した抗原、抗体を洗浄するために使用さ
れる洗浄剤。

及び酵素で標識化した抗体を用゛いる場合には、酵素活
性を測定するための基質及びその反応停止剤。

その他の免疫学的測定用のキットとして通常使用される
ものが挙げられる。

本発明のヒト・酸性ＧＳＴの免疫学的測定方法等に使用
される不溶性担体としては、例えばポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリ
ルニトリル、弗素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカ
ライドなどの高分子、その他紙、ガラス、金属、アガロ
ース及びこれらの組合せなどを例示することができる。

また不溶性担体の形状としては、例えばトレイ状１球状
、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル。

試験管などの種々の形状であることができる。

また、標識抗体の標識物質としては、酵素、螢光物質１
発光物質及び放射性物質等を使用するのが有利である。

酵素としては、ペルオキシダーゼ。

アルカリフォスファターゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ
、螢光物質としてはフルオレツセインイソチオシアネー
ト、フィコビリプロティン等、発光物質としてはイソル
シノール、ルシゲニン等、そして放射性物質としてはｊ
１　、　ｔｊ勺　１４Ｃ，３）（等を用いるとができる
が、これらは例示したものに限らず、免疫学的測定法に
使用し得るものであれば、他のものでも使用できる。

標識剤が酵素である場合には、その活性を測定するため
に基質、必要に１り発色剤が用いられる。

酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、基質と
してＨ２０２を用い、発色剤として２．２′−アジノジ
−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］アンモニ
ウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、０−フェ
ニレンジアミン、４−アミノアンチピリン、　　３．３
’　、５．５’　−テトラメチルベンジン等、酵素にア
ルカリフォスファターゼを用いる場合は基質としてＯ−
ニトロフェニルフォスフェート等、酵素にβ−Ｄ−ガラ
クトシダーゼを用いる場合は基質としてフルオレセイン
ージ（β−Ｄ−ガラクトピラノシド〉、４−メチルウン
ベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド等を用いる
ことができる。

本発明のポリクローナル抗体は、従来公知の方法でヒト
・酸性ＧＳＴを抗原として動物に免疫して得られる抗ヒ
ト・酸性ＧＳＴ抗面清の抗体成分として得られるものが
挙げられる。なかでも例えば山羊抗ヒト・酸性ＧＳＴＳ
ポークローナル抗体。

兎抗ヒト・酸性ＧＳＴＳポークローナル抗体等が好まし
く挙げられる。また好ましくは、抗原のアフィニティ精
製ポリクローナル抗体が挙げられる。

本発明に使用されるモノクローナル抗体（そのフラグメ
ントを含む）及びその製造方法については、先に出願さ
れた特願昭６０−２５９８５８号（昭和６０年１１月２
１日出願：発明の名称“グルタチオンＳトランスフェラ
ーゼに対するモノクローナル抗体及びその製造法″）の
特許出願明細書に詳細に説明されている。Ｆ（ａｂ′）
ｚの作成については、ペプシンを用いる従来の方法で良
い。

（ホ）発明の効果 本発明により、血清中などに存在するヒト・酸性ＧＳＴ
を高い特異性及び高い感度で容易に測定することができ
ると共に、ヒト・酸性ＧＳＴを正確かつ迅速に測定し得
る測定試薬及びキットが提供される。

（へ）実施例 以下、実施例により本発明を詳述する。実施例中の％は
重量％を意味する。

参考例１ （１）酸性ＧＳＴ　（ＧＳＴ−π）の分離精製ヒト胎盤
を０．２５　Ｍシュークロス、　１０　ｍＭリンｌ！ｌ
１ｉｉ液（＋））−１７，４＞中で細切りした後、ホモ
ジナイザーでホモナイズした。得られたホモジネートを
、１０．ＯＯＯｘｇで４℃において３０分間延伸分離し
、上清を採取した。次いで、この上清を、更に１００，
０００　ｘｇで４℃において１時間延伸分離を行なって
、上清を採取した。この上清を１０１１Ｍリン酸緩衝液
（１１Ｈ６，８）を用いて透析した後、透析内液をこの
緩衝液で平衡化した０Ｍセルロース充填カラムに通じて
、非吸着分画を採取した。次に、この分画を還元型グル
タチオン固定セファロースを充屓したカラムに通じて、
酸性ＧＳＴを吸着させた侵、１０　ｍＭリン酸緩衝液（
ｐＨ７，４）でカラムを洗浄し、流出液の紫外吸収スペ
クトルにおける２８０ｎｍの吸収強度が０．０２以下に
なった時点で、還元型グルタチオン含有トリス緩衝液（
ＤＨ８，０）をカラムに通液して、吸着物を溶出させた
。この溶出液を限外濾過した後、１０１１１ＭリンＭ緩
衝生理的食塩水（ＰＢＳ）　　（ｐＨ７，４）を用いて
、セファデックスＧ−１００＜ファルマシア社）カラム
によりゲル濾過することによって、酸性ＧＳＴを含有す
る両分を得た。この画分を、再度限外濾過により濃縮し
た後、等電点電気泳動カラム（ＬＫＢ社製）を用い、濃
度勾配作成にシュークロースを、ｐＨ勾配作成にアンフ
オライン（ファルマシア社製：　　ｌ１ｌ−４３，５〜
１０）を使用してカラム等電点電気泳動（１）Ｈ３，５
〜１０）を行ない、精製したＧＳＴ−πを含有する両分
を得た。

（２）　　抗体の作製 前記の如くしてヒト胎盤から抽出、採取したＧＳＴ−π
を、フロイント完全アジュバントに乳化し、７週齢のＢ
ＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に１１００１Ｒ／匹の最を投与
した。そして、１５日後に、マウスに追加免疫を初回と
同様の方法で行なった。次に、１０日後に血中に抗体量
が増大したことを確認して、更に７日後に抗原をｉｏｏ
ＩＩｔｇ／四の置で静注により投与した。

一方、１５％の牛胎児血清を添加したＲＰＭ１１６４０
　（ギブコ社！ｌりで、ミエローマ細胞Ｐ３−Ｘ　６３
−　Ａ　（１８−Ｕ　１を維持培養しておいた。最終免
疫の３日後、マウスから採取した牌臓細胞とＰ３ｔＪ１
を、Ｑｉ等の方法（Ｓ　ｅｌｅｃｔｉｖｅｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｉｍｍｕｎｏｌｏｏｙ　
　１９８０．　３５１〜３７２．参照）によりポリエチ
レングリコール４０００を用い細胞融合させ、９６穴マ
イクロプレートにまいた。細胞融合後、培地を１００μ
Ｍヒボキサンチン、０．４μＭアミノプテリン、１６μ
Ｍチミジンを添加したＲＰＭＩ培地（ＨＡＴ培地）に置
き換えた。ＨＡＴ培地で培養中２〜３週間で牌臓細胞と
ミエローマ細胞のハイブリドーマのみが生育した。ハイ
ブリドーマの培養液中の抗体活性を、以下に述べるＥＬ
ＩＳＡで調べた。

（３）　　抗体のスクリーニング ＧＳＴ−πをＥＬＩＳＡ用のプレートに付着させ、１０
１Ｍリン酸生理食塩水（１）８７．４）に３％（Ｗ／Ｖ
）の牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した液でブロッ
キングを行なった。ブロッキング後、ハイブリドーマ培
養液５０ｄをＥＬＩＳＡプレートに添加し、室温で２時
間放置した。その後、ハイブリドーマ培養液を除去して
洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識山羊抗マウスＩｏ　
Ｇ−Ｆｃ特異抗体（２４／ｄ）　　１００ｔｅを添加し
、３℃で１．５時間反応させた。更に、この酵素標識抗
体溶液を除去した後、洗浄し、０．０５％２．２′　−
７ジノジー［２−エチルベンツチアゾリンスルフォネー
ト（６）］　　（ＡＢＴＳ）。

０．００３４％Ｈ２０ｚ　、　　０．１Ｍクエン酸緩衝
液（１）８４．６）を２００１１Ｉｉ！添加して発色さ
せることにより検出した。

（４）　　クローニング及びモノクローナル抗体の゛作
製ＧＳＴ−πに対する抗体を産生ずるハイブリドーマ培
養液を選別し、更に限界希釈法によるクローニングを行
ない、最終的に単一クローンのハイブリドーマ３種を得
た。このハイブリドーマを、夫々、プリンスタン投与Ｂ
ＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔に投与して増殖させ、モノクロ
ーナル抗体を含む腹水を得た。得られた腹水に５０％飽
和硫安を加え、抗体を沈澱させ、この沈澱物を０．１Ｍ
リン酸生理食塩液（１）Ｈ８，０）に溶解させた。そし
て透析後、プロティンＡ−セファＯ−スＣＬ４Ｂカラム
（ファルマシア社製）にかけ、抗体を０．２Ｍグリシン
−塩酸緩衝液（Ｅ）Ｈ３，０＞で溶出し、中和して精製
した。

３種類のハイブリドーマから得られたモノクローナル抗
体を、夫々５Ｆ、２Ｈ，６Ａと命名した。

（５）モノクローナル抗体の性質 後述の如きウェスタンプロ・ツティング（Ｗｅｓｔｅｒ
ｎｂｌｏｔｔｉｎ（Ｊ）法で３種のモノクローナル抗体
は、ＧＳＴ−πを認識した。また、ＥＬＩＳＡ用プレー
ト固定したＧＳＴ−πに対して、ビオチン化した第一の
抗体と非標識の第二の抗体を共存させて反応させるイン
ヒビジョン・アッセイ（Ｉ　ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｓ
ｓａＶ　）法により、いずれの２つの組み合せにおいて
もビオチン化抗体の反応量に変化がないことより、３種
のモノクローナル抗体はいずれも互に異なるエピトープ
（抗原部位）を認識することが示された。

これらの抗体は、ヒトの塩基性ＧＳＴとは反応せず、ま
た健常人の血清とも反応しなかった。

（６）　　ウェスタンブロッティング、法モノクローナ
ル抗体に特異的な抗原を、ｙｏｗｂ＋ｎｇ等の方法（Ｐ
ｒｏ、　Ｎ、　Ａ、　３．７６　４３５０〜４３５４　
）によるウェスタンブロッティング法を用いて固定した
。

最初にＧＳＴ−πを、５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけた。５Ｄ
Ｓ−ＰＡＧＥ後電解液バッファーを２５　ｉＭり’）　
シン、　２０％　（Ｖ／Ｖ　）　メタノールを用い、電
圧傾斜が７Ｖ／ｃｍ、２ＪＩ間の条件でスラブ（Ｓｌａ
ｂ）ゲルからニトロセルロースシートへ蛋白を移した。

ニトロセルロースシートの各レーンを切り離し、片一方
のシートをアミドブラックで蛋白染色を行ない、他方は
次の様な酵素免疫アッセイを行なった。

３％　（Ｗ／Ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳＦ７０ツーｔング後、
１次抗体としてモノクローナル抗体（２Ｆまたは５Ｆ）
を加えた。２次抗体としてペルオキシダーゼ標識山羊抗
マウスＩａＧ−Ｆｃ特異抗体加えた後、洗浄、０．０４
％３．３′　−ジアミノベンジジン、　　０．００３４
％Ｈ２０２、０，０１Ｍ　　ＰＢＳからなる基質溶液を
加えて発色させることにより検出し、固定した。

実施例１　モノクローナル抗体（抗ＧＳＴ−π〉に対す
る抗原（ＧＳＴ−π〉の抗原決定基の決定（１）本実施
例において用いた、ＧＳＴ−πの消化。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ、　Ｗｅｓｔｅｒｎ　　３１ｏｔｔｉ
ｎｇ　、　ＨＰＬＣによる分離および抗ＧＳＴ−π・Ｐ
ＣＡの作成法は以下のとおりである。

（ａ）　ＣＮＢｒによるＧＳＴ−πの消化ＧＳＴ−πの
消化は、２．５μｇＧｓＴ−π１５ｕｌ　　Ｔｒｉｓ−
Ｈ（Ｊ　（２５ｍＭ、　　ｐＨ７，７）と４０μｇＣＮ
Ｂｒ／１０μ麦ギ酸と混合し、２５℃で終夜反応させた
。

（ｂ）　固定化トリプシンによるＧＳＴ−πの消化２５
μｙＧＳＴ−π１５０μｐの２５　＋１１Ｍ　　Ｔ　ｒ
ｉｓ−ＨＣ夕（ｐＨ７，７）と、１０μ文の固定化トリ
ブシンサスペンジション（２０Ｕ／μす、シグマ。

Ｕ、Ｓ、Ａ）と混合し３７℃、１０分間反応させた。

（ｃ）　　Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　ＥＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥは、０．１％のＳＤＳ含む、１７．５％のアクリル
アミド分離ゲルと０．１％のＳＤＳを含む５％のアクリ
ルアミド濃度スラブゲルを用いて行なった。分子量マー
カーとして、９７．４に、　６６、ＩＫ、　４５．ＯＫ
、　３１．ＯＫ、　２１．５Ｋ。

１４．４にはバイオラッドＬａｂから、また２１．５Ｋ
　。

１２．５Ｋ　、　　６．５にのマーカーはベーリンガー
マンハイムより得た。２．５μグのＧＳＴ−π　ＣＮＢ
　ｒ　ｄｉｇｅｓｔと５μ９の固定化トリプシン分解物
をそれぞれスラブゲルのル−ンにのせ、４０　ｍＡの定
電流にて、電気泳動を行なった。

〈小　　Ｗｅｓｔｅｒｎ　　　３　　ｌｏｔｔｉｎｇＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥによる分解後、タンパクを電気泳動的に
アクリルアミドスラブゲルからニトロセルロース膜に転
写を行なった。（２５０ａΔ。

２．５ｈｒ）この転写において、バイオラッド社製。

電気転写装置を用いた。

転写後、ニトロセルロース膜を３％ＢＳＡを含むＰＢＳ
にてアフタコート（３７℃、１ｈｒ）反応し、次いでＭ
ＣＡ（４０μｇ）を含む３％ＢＳＡで４℃、　１６ｈｒ
反応を行なった。その侵、ニトロセルロース膜を０．０
５％Ｔ　ｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ　（Ｔ−ＰＢＳ）に
て３回洗浄し、酵素標識（ベルオキシターゼ）抗マウス
Ｉｇ△（カベル社製）を含む３％ＢＳＡ溶液にて２時間
反応させ、４回Ｔ−ＰＢＳ洗浄後、４−クロロ−１ナフ
トールを用いて、ニトロセルロースメンブレン上のＧＳ
Ｔ−π由来のタンパクの発色を行なった。

すべてのクロマトグラフィーは、トーソーＭｏｄｅ＋を
用いて行なった。流出は、２８０Ｌ１ｍと２１０μｍテ
モニターした。ｉｏｏμ９のＧＳＴ−πの固定化トリプ
シン分解物はＣ−１８カラムを用いた逆相ＨＰ　Ｌ　５
ｙｓｔｅｎにおいて、０，１％ＴＥＡをベースにしたア
セトニトリルのリニアグラジェント（アセトニトリルＯ
→８０％（１６０分間））により分取を行なった。それ
ぞれのピークを採取してＳ　ｐｅｅｄ　　Ｖ　ａＣＣｏ
ｎｃｅｒｔｒａｔｏｅを用いて濃縮し、ｗｅｓｔｅｒｎ
　　ＢＩＯｔｔｉｎｌＪ　、　ＤｏｔＢＩｏｔｔｉｎｇ
　、ペプチドシーケンサ−に供した。

＋４）　　抗ＧＳＴ−πポリクローナル抗体の作成２０
０μグのＧＳＴ−πをフロイントのコンブリートアジェ
バンドと混合し、兎の背中の皮下に注射した。次いで２
週間後に　１００μびのＧＳＴ−πをフロイントのイン
コンプリートアジバント１ｄと混合し、同様に皮下に投
与した。このブーストの投与を合計３回行ない、最終投
与の１０日後に、全面採血した。

抗体は、プロティンＡ固定化セファロース４Ｂを用いて
精製した。

各モノクローナル抗体に対する抗原決定基を決定するた
めに、最初にＣＮＢｒにより、ＧＳＴπを分解した。そ
のＣＮＢｒ分解フラグメントを５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけ
ニトロセルロースに転写しＷｅｓｔｅｒｎ　　Ｂ　Ｔｏ
ｔｔｉｎｇを行なった。その結果を第２図に示す。第２
図より、これらのモノクローナル抗体に対する抗原決定
基は、大きく２種類に別れることが判明した。すなわち
、２６Ｋ（原料のＧＳＴ−π）　、　２４．２にのフラ
グメント以外に１１．４Ｋを認識する６Ａ、５Ｆと、９
．８に、　　７．８Ｋを認識する２日である。

Ｍ　ＩＪｒａｌａｔＳＬＩら（ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、
、４７　：　５６２６〜５６３０（１９８７）　）の報
告によるＧＳＴ−πの全アミノ酸配列からＣＮＢｒによ
る切断フラグメントは第３図のごとくになると考えられ
る。メチオニンがＮ端から１９と９１番目にあり、以上
を考慮すると切断フラグメントは、１９０残基（２４，
２に、　２０→２０９）　。

１１８残基（１１，４に、　９２→　２０９）　、　９
ｉ残基（９，８Ｋ。

１→９１）　、　７２残基（７，８に、　２０→９１）
であることが推定される。

以上により、２Ｈのモノクローナル抗体はＧＳＴ−πの
１→９１のフラグメントを認識し、６Ａ。

５ＦおよびＰＣＡは、９２→２０９のフラグメントを認
識することが推定されたく第４図）。

次にＧＥＴ−πを固定化トリプシンにより分解し、５Ｏ
８−ＰＡＧＥを行なった（第５図）。次いでＷｅｓｔｅ
ｒｎ　　３１ｏｔｔｉｎｇを行なった結果を第６図に示
す。第６図により、２日はトリプシン分解物の５．６に
の７ラグメントを認識し、６Ａ、５Ｆは、トリプシン分
解物の７．４にのフラグメントを認識する事がわかった
。

以上のトリプシン分解物の５．６に、　　７．４にのフ
ラグメントの単離を目的として、逆相ＨＰＬＧ（トーソ
ーＣＣＰＭ、ＴＳＫｇｅｌ　　　０ＤＳ−１２０Ｔ）に
より分離を試みた。そのクロマトグラフの１部を第７図
に示す。ＮＱ３７〜順４３までの各ビークのｄｏｔ　ｂ
ｌＯｔｔｉｎｏを行ない各モノクローナル抗体との反応
性を検討した結果、特にビークＮα４０と２Ｈのモノク
ローナル抗体との反応が確認された（第８図）。ビーク
ＮＱ４０の分画をＳ　Ｄｅｅｄ　　Ｖ　ａＣＣｏｎｃｅ
ｎｔｒａｔｏｒを用いて延伸乾燥し、ＴＥＡに再溶解し
、ＡＢＩ社製ペプチドシーケンサ−にアプライしたとこ
ろ、このフラグメントのＮ端２０残基は、第９図に示さ
れる配列であることが判明した。

Ｍ　ｕｒａｓａｔｓｕらのＧＳＴ−πのアミノ酸配列と
比較した結果、ＧＳＴ−πのＮ端２０残基と完全に一致
した。

またＧＳＴ−πのＮ端４４残基目にＬｙＳが存在するこ
とから、５．６にのフラグメントは、ＧＳＴπの、Ｎ端
から４４残基までのフラグメントであり、このフラグメ
ントを２Ｈのモノクローナル抗体が認識することが確認
された。２ＨがＮ端側のフラグメントを認識する事は、
同抗体がＧＳＴ−πのＣＮＢｒ分解によるフラグメント
のうちで１→９１（’　Ｐｒｏ−”Ｍｅｔ）を認識する
実験事実からも支持される。

続いて、７．４にのフラグメントの分取を、逆相１−（
ＰＬＯを用いて検討したが、適当な分離条件をさがし得
す、分取不可能であった。このため、スラブゲルによる
分取を検討した。すなわち、スラブゲル（１８ｘ　８　
ｃｒａ　）にル−ン当り、２００μ９のＧＳＴ−πトリ
プシン分解物をのせ、５Ｏ８−ＰＡＧＥを行なった。泳
動後ＰＶＤＦ膜（ファルマシア製）に転写しく９０Ｖ、
　３００ｍＡ、　３０分、　ｒ、ｔ、）クマジーブルー
により染色した。目的とするバンドを切り取り直接ペプ
チドシーケンサ−（ＡＢ１社製）にかけ、Ｎ末アミノ酸
配列の決定を行ない、Ｔ　ｈｒ　−Ｐ　ｈｅ　−１ｌｅ
　−Ｖ　ａｔ　−Ｇ　ｌｙテあることが判明した。

前述の村松らのＧＳＴ−πのアミノ酸配列と比較した結
果　／４’／　Ｌ　ＶＳから／Ｇ’７’Ｑｌｙの５残基
のシーケンスが、ヒトＧＳＴ−πのそれと完全に一致し
たことにより、この７．４にのフラグメントが／に／　
Ｔｈｒ→”’Ｇｌｎである事を結論した。すなわち、６
Ａ。

５ＦがＣ端側の”’Ｔｈｒ−＋ジグＧＩｎの７ラグメン
トを認識することがわかり、またこの事実は、ＧＳＴ−
πのＣＮＢｒ分解物の中で、同抗体が９２〜２０９のフ
ラグメントを認識する実験事実からも裏づけられる。

ＩＡ）合成ペプチドに対する各種七ツマー抗体の反応性 次いで、これらの６Ａ、５Ｆのモノクローナル抗体の反
応性をさらに確認するために　７ｈ／　Ｔｈ、−ν’Ｑ
ｌｎのＣ端６９残基のペプチドを、２つに分けて、すな
わ、フラグメントＡ（Ｌｅｕ−１７ＧＩｎ）と７ラグメ
ントＢ　（”’Ｔ　ｈｒ−”Ｌ　ｅｕ）を合成り、　ｔ
ｃ。それぞれのペプチドを精製し、ニトロセルロース膜
に各１１００ｎ　、　１０ｎｇスポットし、モノクロー
ナル抗体を用いたＤａｔ　　３　ｌｏｔｔｉｎｇを行な
ったところ、第１０図で示すように、６Ａはフラグメン
トＡと、５ＦはフラグメントＢとそれぞれ特異的に反応
する事が判明した。

以上の結果から、抗原決定基は以下のように結論される
。

［１］６Ａは、Ｃ端の／り１Ｌｅｕ〜ユｐノＧｈ　（７
）７ラグメントのエピトープと反応する。

＋２１５Ｆは　／９Ｌ／　Ｔ１１ｒ〜’り’Ｌｅｕ７ラ
グメントノエヒトーブと反応する。

Ｔ３）２Ｈは、Ｎ端の’　Ｐｒｏ　〜”％Ｌｙｓ７ラク
メ：ｚトのエピトープと反応する。

これらの結論を第１１図に示した。

実施例２　各種ＧＳＴ−π測定法の感度比較（１）　　
以下の操作により、ポリクローナル抗体、モノクローナ
ル抗体６Ａ、５Ｆ、２Ｈの固相化および標識化を行なっ
た。

（１）抗体固　化ビーズの１１ ポリスチレン製ビーズ（直径６　ｒｒｒｍ　）をよく洗
浄してから、各種抗ＧＳＴ−π抗体の２０μｇ／−の濃
度を有するＰＢＳ　（１）Ｈ７，４）溶液中に４℃の温
度で１昼夜放置した後、ＰＢＳで洗浄し、０．５％ＢＳ
Ａ水溶液中に４℃の温度で１昼夜放置してポストコーテ
ィング処理を実施して、抗ＧＳＴ−π抗体固定化ビーズ
を得た。

抗ＧＳＴ−π抗体の１．ＯＲｇ／威のＰＢＳ溶液に、Ｎ
−（ｍ−マレイミド安息香酸）−Ｎ−サクシンイミドエ
ステル（ＭＢＳ）の１０ｒＩ＃ｇ／ｄの濃度のジメチル
ホルムアミド溶液５０−を添加し、２５℃の温度で３０
分間反応させた。次いでセファデックスＧ−２５を充填
したカラムを用い、０．１Ｍリン酸！１ｉｌｉ液（１）
Ｈ６，０）でゲル濾過を行ない、マレイミド化抗体と未
反応ＭＢＳとを分離した。

一方、ＨＲＰの１．０■／−のＰＢＳ溶液に、Ｎ−サク
シンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオネー
ト（ＳＰＤＰ）の１０Ｒｇ／　ｄの濃度のエタノール溶
液を添加し、２５℃で３０分間反応させた。次いで、セ
ファデックスＧ−２５を充填したカラムを用い、０．０
１　Ｍ酢酸緩衝液（１）８４．５）でゲル濾過して精製
し、ピリジルジスルフィド化ＨＲＰを含有する両分を採
集し、これをコロジオンバック中において水冷下に約１
０倍に濃縮した。次に、これに０，８５％ＮａＣｊと０
，１Ｍジチオスレイトールとを含有する０、１Ｍ酢酸緩
衝液（１）Ｈ４，５＞　１　ｍを添加して、２５℃で３
０分間撹拌して）ＩＲＰ分子中に導入したピリジルジス
フィト基を還元した後、セファデックスＧ−２５カラム
にかけてゲル濾過し、チオール化ＨＲＰを含有する画分
を得た。

次に、マレイミド化抗体とチオール化ＨＲＰとを混合し
、コロジオンバックを用いて水冷下に４■／ｄの蛋白質
濃度まで濃縮し、４℃で１昼夜放置した。その後、ウル
トロゲルＡＣＡ４４（ＬＫＢ社）を充填したカラムでゲ
ル濾過し、ＨＲＰ標識抗ＧＳＴ−π抗体を得た。

（２）同時サンドインチ酵素免疫測定法によるＧＳＴ−
πの測定（標識抗体としてポリクローナル抗体を用いた
場合） 各種抗体（ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体６
Ａ、５Ｆ、２１−１＞を固定化したビー１８１個と、精
製したＧＳＴ−π（標準物質）をＯｎｇ／　ｔｄ　〜１
５ｎｇ／　ｄ、の節回で含゛有する０、５％ＢＳＡ含有
ＰＢＳ溶液（１）Ｈ７，４）　　２００μすとＨＲＰ標
識兎抗ＧＳＴ−πポリクローナル抗体を含有する０、５
％ＢＳＡ含有ＰＢＳ溶液（ｐＨ７，４）　　２００μ文
とを、各種固相抗体と標識ポリクローナル抗体の組み合
せでそれぞれ試験管に添加して３７℃の温度で２時間イ
ンキュベートした。次に、試験管内の溶液を吸引除去し
た侵、ＰＢＳで洗浄してから、３．３’　、　　５．５
’　−テトメチルベンジジン塩酸塩０．０２　％、　８
２０２　０．００５％を含有す４０．１Ｍリン酸−クエ
ン酸緩衝液（＋）Ｈ４，０）を０．４−ずつ各試験管内
に加え、３７℃の温度で３０分間インキュベートした後
、反応停止剤として１Ｎ硫酸水溶液を１ｄずつ加えて酵
素反応を停止させた。

次いで、この溶液を分光光度計を用いて４５０ｎｎ＋の
波長の吸収強度を測定し、これを標準物質濃度０および
１００Ｍｄに対してプロットすることにより各種同相抗
体組合せによるＮ／Ｓ比（ＯＤＡａ　＝Ｏ１００Ａｏ　
＝１５ｎｏ／ｄ）　全算出シタ。

結果を第１表に示す。

第１表に示すごとく、）−ＩＲＰ標識兎抗ＧＳＴ−πポ
リクローナル抗体と、モノクローナル抗体６Ａまたは２
Ｈの固相抗体の組みあわせによる測定系が、Ｎ／Ｓ比が
低く、すなわちＧＳＴ−π濃度ＯｎＱ／−における吸光
度を低く保ち、しかも１ｓｎａ／＃Ｉｌ！における吸光
度が十分に高い測定系を達成しえることがわかった。

第１表　ＧＳＴ−πの測定〈酵素標識抗体としてポリク
ローナル抗体を用いた場合〉各種酵素標識抗体（ポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体６Ａ、５Ｆ、２Ｈ）
と、ポリクローナル抗体固定化ビーズを用い、（ａに準
じて実験を行なった。

結果を第２表に示すが、第２表に示すごとく、固相ポリ
クローナル抗体と、モノクローナル抗体６Ａまたは２Ｈ
の酵素標識抗体の組みあわせによる測定系が、Ｎ／Ｓ比
が低い良好な測定系であることがわかった。

第２表　ＧＳＴ−πの測定（固相抗体としてポリクロー
ナル抗体を用いた場合）兎抗ＧＳＴ−πポリクローナル
抗体の中に６Ａが認識するフラグメントＡ　［／）（ｌ
　ｅ　ｕ　、、、”７Ｇｌ　ｎ］に対する認識部位を有
する抗体が、どの程度含まれているかを確認するために
標記実験を行なった。

すなわち、フラグメントＡ２０■を０．１Ｍ炭酸バッフ
ァー　（ｐＨ９，０）　１ｍに溶解しＣＮＢｒ活性化Ｓ
　ｅｐｈａｒｏｓｅ４　Ｂ　＜ファルマシア製）１１ｎ
ｉと４℃。

終夜反応させた。フラグメントＡ固定化３　ｅｐｈａｒ
ｏｓｅ４　Ｂを、３Ｍ　　ＫＳＣＮにて洗浄後、カラム
に充填し兎抗ＧＳＴ−πポリクローナル抗体２ｄを反応
させた。１００ｄのＰＢＳにより洗浄後、３Ｍ　　ＫＳ
ＣＮにて溶出させた。溶出液！Ｍの２８０ｎｌｌｌの吸
光度は０．０１６であった。

比較実験として、ＧＳＴ−π１１Ｒｇを固定したＳ　ｅ
ｐｈａｒｏｓｅ４　Ｂを用いて同様の吸収実験を行なっ
て得られた溶出液５ａｉ！の２８０ｎｍの吸光度は、０
．３５２であった。前値０．０１６　（１１，５Ｈｇ／
＃ｌｉりは、全抗ＧＳＴ−π抗体値０．３５２（２５１
μｇ／ｄ）の４．６％に相当した。

以上により、兎抗ＧＳＴ−πポリクローナル抗体は、Ｇ
ＳＴ−π分子のＮ端からＮ端４４残基のシーケンスを認
識するモノクローナル抗体（実施例１参照）と抗原認識
部位を共有せず、また、Ｎ端１７６残基からＮ端２０９
残基のシーケンスを認識するモノクローナル抗体ともほ
とんど抗原ｉ！謙部位を共有しないことが判明したく実
流例２　（４）　）。そして、ポリクローナル抗体と、
抗原認識部位を異にするＮ端からＮ端４４残基のシーケ
ンスを認識するモノクローナル抗体、または、Ｎ端１７
６残基からＮ端２０９残基のシーケンスを認識するモノ
クローナル抗体を組みあわせた測定系のみがＮ／Ｓ比の
低い高感度な測定系をもたらすことを実験にて証明しえ
た。

それは、化較実験として採用した同一の抗原決定基を有
する抗体の組合せであるポリクローナル抗体−ポリクロ
ーナル抗体の組みあわせでは、非特異的反応が高いため
に高感度の測定系が達成できなかった事、また、共通の
抗原決定基を有するかもしれないポリクローナル抗体−
５Ｆ（Ｔｈｒ／７ｒ１６Ｂがその抗原決定基）の組み合
せでは、特異的反応が低いために高感度の測定系が達成
できなかったことからも裏づけされる。

実施例３　モノクローナル抗体Ｆ（ａｂ’）２のＨＲＰ
標識体を用いたＧＳＴ−πの測定 （１）　　モノクローナル抗体Ｆ（ａｌｌ’）２のＨＲ
Ｐモノクローナル抗体６Ａの２．ＯＩｆｔｇ／Ｉ！ｌ！
のＰＢＳ溶液に、１Ｍの酢酸緩衝液（１）Ｈ３，７）　
　１００μ文と、４０μシのペプシンを２０μ文の同緩
衝液に溶解して３７℃、３時間反応させた。反応終了後
、ＰＢＳにて平衡化したセファデックスＧ２５カラム（
φ２　（：ｌＩ　Ｘ　４５ＣＩＲ）を用いて分離しＦ（
ａｂ’）２を採取した。ＨＲＰ標識６Ａ−Ｆ　（ａｂ’
　）２の調整は、実施例２　（１）　＋ｂ＋に準じて行
なった。

兎抗ＧＳＴ−πポリクＯ−ナル抗体を固定化したビーズ
と、ＨＲＰ標識６Ａ−Ｆ　（ａｂ’　＞２を用いて、濃
度Ｏ〜１５ｎｇ／Ｉｎ１．の精製したＧＳＴ−π（標準
物質）の免疫測定法を実施例２（２］に準じて行なった
。比較例として、）（ＲＰ標識６Ａ−［ｏＧを用いて測
定を行なった。結果を第３表に示す。

第３表　ＧＳＴ−πの測定（）−ＩＲＰ標識６Ａ−Ｆ　
（ａｂ’　）　２とＨＲＰ標識６Ａ−ＩＱ　Ｇ） 第３表のごとく、ＨＲＰ標識６Ａ Ｆ（ａｂ’）２は、６Ａ−１ｇＧに比べて、３〜４倍の
感度上昇を見た。

実施例４　兎抗ＧＳＴ−πポリクローナル抗体Ｆ　ａｂ
’のＨＲＰ標識体を用いたＧＳＴ−πの測定兎抗ＧＳＴ
−πポリクローナル抗体の２■／ｄのＰＢＳ溶液に、１
Ｍの酢酸緩衝液（１）Ｈ４，２）１００μρと、４０μ
びのペプシンを２０μρの同緩衝液に溶解して、３７℃
、１６時間反応させた。反応終了後、５ｎ＋ＭＥＤＴＡ
含有０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐ）−１６，０）にて平
衡化したセファデックスＧ−２５カラム（φ２　ｃｙａ
　Ｘ　４５ｃｍ）を用いて分離しＦ（ａｂ’）２を採取
した。次いで、同Ｆ（ａｌ）’）２を−メルカプトエチ
ルアミンを用いて還元し、トーソーＧ　３０００Ｓ　Ｗ
カラムによるゲル濾過ＨＰＬＣにてＦ　ａｂ’　を精製
した。

一方、ＨＲＰは、ＭＢＳを用いてマレイミド化ＨＲＰを
単離した。最後にＦａｂ’　とマレイミド化ＨＲＰを混
合しながら、フィルトロン〈限外濾過ユニット）を用い
て濃縮し反応させた。４℃で終夜反応させ、ＨＲＰ標識
６ＡをトーソーＧ　３０００３Ｗにて単離精製した。

第４表　ＧＳＴ−ｙｒの測定（）ＩＲＰ標識ＰＣＡ−Ｆ
ａｂ’とＨＲＰ標１ｉＰＣＡ−１ａ　Ｇ） モノクローナル抗体６Ａを固定化したビーズと、ＨＲＰ
標識ポリクローナル抗体Ｆ　ａｂ’　を用いて、濃度０
〜１５ｎｇ／　ａｌｌの精製したＧＳＴ−πの免疫測定
法を実施例２（２１に準じて行なった。比較例として、
トＩＲＰ標識ポリクローナル抗体１ｏＧを用いて行なっ
た。結果を第４表に示す。

第４表に示すごとく、ＨＲＰ標識兎抗ＧＳＴ−πポリク
ローナル抗体Ｆａｂ’　は、ＩｇＧに比べて８〜１０倍
の感度上昇を見た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＧＳＴ−π分子のＣＮＢｒ分解フラグメント
の５Ｏ８−ＰＡＧＥパターンを示している。レーン■は
原料のＧＳＴ−π、■→■にいくに従い、ＧＳＴ−πに
対するブロムシアンの反応重量比が増加している。 第２図は、ＧＳＴ−πのＣＮＢＩ”分解フラグメントに
対する各種抗体の反応性を示すウェスタンブロッティン
グを示す。 以下の抗体を各レーンにて反応させた。 レーン１：ＰＣＡ、レーン２　：　２Ｈ，レーン３；６
Ａ、レーン４；５Ｆである。 第３図は、ＧＳＴ−πのＣＮＢｒ分解フラグメントの模
式図を示す。 原料以外４つのフラグメントの出現が予想される。 第４図は、各モノクローナル抗体のＧＳＴ−π分子上の
反応部位を示す。 第５図は、ｆａ）ＧＳＴ−π分子のトリプシン分解フラ
グメントの５ＤＳ−ＰＡＧＥパターンと（ｂ）同上のデ
ンシトメーターによるスキャニングを示す。 第６図は、ＧＳＴ−πのトリプシン分解フラグメントに
対する各種抗体の反応を示すウェスタンブロッティング
を示す。 以下の抗体を、各レーンにて反応ざＵた。 レーン１；ＰｃＡ、レーン２　；　２Ｈ，レーン３：８
Ａ、レーン４；５Ｆである。 第７図は、ＧＳＴ−πのトリプシン分解フラグメントの
逆相ＨＰＬＣによる溶出パターンを示す（溶出４．１２
１０ｎ−ニｒ　−Ｅ　ニター）　、　ＴＳＫｇｅｌ　Ｏ
，ＤＳ−ＲＯＴカラムを用い、０．１％ＴＥＡ（トリフ
ルオロ酢酸）にて、アセトニトリルＯ→８０％のグラジ
ェント（１６０分）にて溶出した。 第８図は、ＧＳＴ−πのトリプシン分解フラグメントの
逆相ＨＰＬＣによる溶出ピークに対する各抗体の反応性
を示すドツトプロットである。７つのピーク（ＮＱ３７
〜４３）を、ニトロセルロース膜にドツトスポットし、
以下の抗体を各レーンにて反応させた。 レーン１：ＰＣＡ、レーン２；２Ｈ，レーン３；６Ａ、
レーン４；５Ｆである。 第９図は、２Ｈの反応したビークＮα４０を単離して決
定したピークＮ０４０のＮ末端アミノ酸配列を示す。 第１０図は、ＧＳＴ−π分子の合成ペプチド［”Ｌ　ｅ
ｕ−”７ＧＩｎ］　＝フラグメントＡ、　　［”Ｔｈｒ
〜／Ｆｒ１−６ｕ］−フラグメントＢに対する各モノク
ローナル抗体の反応性を示すドツトプロットである。 以下の抗体を各レーンにて反応させた。 レーン１；５Ｆ、レーン２　：　６Ａ、レーン３；２Ｈ
である。 第１１図は、〈ωＧＳＴ−π分子のバイトロバジ−プロ
フィルを示し、＋ｂ＋最終決定された各種モノクローナ
ル抗体のＧＳＴ−π分子に対する反応部位を示す。 第 図 匣＝＝＝■二二＝＝蝙 匠［二■＝＝＝］口 区＝＝＝＝図 ｊｌ、４に ９、ＺＫ ７．８に （−ｍ’６Ｊ６）　ＰｃＡ　２ｈ　ｂＡ　５Ｆ吸光度（
５４０ｎｍ　） 第 す 図 ９本〜４　ぷ＊司 Ｑ　　　〜 大Ｘ大大Ｘ大大 第 図 溶二龜り 第 図 図面の浄書（内容に変更なしン 第１０図 １え堆魚 フラグメントＡ　　　　　フラグメントＢｒ−ｍ−）（
−一一一） （１００ｎｇ ）（ＩＯｎｇ） （１００ｎｇ　） （ＩＯｎｇ） （ｃＬ） ５、砿 第 図 ７．４に 手 続 補 正 書（方式） ％式％ １、事件の表示 特 願 昭 ２、発明の名称 ヒト・酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの測定
方法３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 大阪府大阪市中央区南本町１丁目６番７号（３（Ｘ））
帝人株式会社 ４、代 理　人　　　　東京都千代田区内幸町２丁目１番１＠（
飯野　ピ　ル） ５、補正命令の日付 平成１年３月１４日 ６゜ ７゜ 補正の対象 図面 補正の内容 願傷に最初に添付した図面のうち第４図。 第５図及び第１０図の浄書

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とを用いてヒ
   ト・酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの免疫学
   的測定を行なうに際し、いずれか一方の抗体としてヒト
   ・酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼに対するポ
   リクローナル抗体を用い、他方の抗体としてヒト・酸性
   グルタチオンＳ−トランスフェラーゼを特異的に認識す
   るモノクローナル抗体を用いることを特徴とするヒト・
   酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの免疫学的測
   定方法。 ２、ポリクローナル抗体が、ヒト胎盤由来グルタチオン
   Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ−π）を認識する抗体
   であることを特徴とする、請求項１記載のヒト・酸性グ
   ルタチオンＳ−トランスフェラーゼの免疫学的測定方法
   。 ３、モノクローナル抗体が、ヒト胎盤由来グルタチオン
   Ｓ−トランスフェラーゼのＮ端から４４残基までのシー
   ケンスを有するフラグメントを認識する抗体であること
   を特徴とする、請求項１記載のヒト・酸性グルタチオン
   Ｓ−フェラーゼの免疫学的測定方法。 ４、モノクローナル抗体が、ヒト胎盤由来グルタチオン
   Ｓ−トランスフェラーゼのＮ端１７６残基からＮ端２０
   ９残基のシーケンスを有するフラグメントを認識する抗
   体であることを特徴とする、請求項１記載のヒト・酸性
   グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの免疫学的測定方
   法。 ５、不溶性担体に結合した抗体としてモノクローナル抗
   体を用いることを特徴とする、請求項１記載のヒト・酸
   性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの免疫学的測定
   方法。 ６、標識抗体としてモノクローナル抗体を用いることを
   特徴とする、請求項１記載のヒト・酸性グルタチオンＳ
   −トランスフェラーゼの免疫学的測定方法。 ７、標識抗体としてモノクローナル抗体の Ｆ（ａｂ′）＿２分画を用いることを特徴とする、請求
   項１記載のヒト・酸性グルタチオンＳ−トランスフェラ
   ーゼの免疫学的測定方法。 ８、標識抗体としてポリクローナル抗体の Ｆ（ａｂ′）＿２またはＦａｂ′分画を用いることを特
   徴とする、請求項１記載のヒト・酸性グルタチオンＳ−
   トランスフェラーゼの免疫学的測定方法。 ９、不溶性担体に結合した抗体と、標識抗体とを検体と
   同時に反応させる事を特徴とする請求項１記載のヒト・
   酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの免疫学的測
   定方法。 １０、請求項１記載のヒト・酸性グルタチオンＳ−トラ
   ンスフェラーゼの免疫学的測定方法に使用する、ポリク
   ローナル抗体とモノクローナル抗体の二種類の抗体を組
   み合わせてなる測定試薬。 １１、請求項１０記載の二種類の抗体を組み合わせてな
   る測定試薬と、これに（ａ）溶解剤、（ｂ）洗浄剤及び
   酵素で標識化した抗体を用いる場合には、（ｃ）酵素活
   性を測定するための基質及びその反応停止剤を組合せて
   なるヒト・酸性グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの
   免疫学的測定用のキット。