JPH0257977A - ヒト酸性グルタチオンs―トランスフェラーゼの測定方法 - Google Patents
ヒト酸性グルタチオンs―トランスフェラーゼの測定方法Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
いることができる、ヒト・酸性グルタチオンS−トラン
スフェラーゼ(酸性GST)を免疫学的に測定する方法
、それに用いる測定試薬及びキットに関する。
じる代謝物質と還元型グルタチオンとの抱合反応を触媒
する解毒酵素として知られている。
などと反応して種々の病変(例えば発癌)の原因になる
ものであるが、これらの物質の反応性はグルタチオン抱
合により中和され、より水溶性の生成物となり肝臓など
で代謝され、最終的には体外に排泄される。
特に肝臓の細胞質に多く、その他牌臓。
胎盤や赤血球からも特殊な分子種が分離されている。一
般にGSTは多種の酵素からなっており、種特異性があ
るだけでなく臓器又は組織特異性も有している。
( J 、 B iol、Chei、、 259 1
2444(1984) )。
ユニットから成り、各サブユニットの分子量は約23,
000である。酸性GSTは等電点(pI)が4〜5で
、2つのサブユニットから成り、各サブユニットの分子
量は約22,000である。
られており、いずれも主として健常な成人の肝臓に存在
し、その他腎臓、阜丸、小腸、脳。
るπ、赤血球に存在するρが知られており、健常な成人
の肺臓には殆んど存在せず、胎児の肝臓、胎盤、肝癌細
胞、胃癌細胞等の増殖性細胞に存在する。そして、これ
ら増殖性細胞が産生ずる酸性GSTは血中に遊離してく
るので、肝癌、胃癌、大腸癌2食道癌、膵臓癌等の消化
器癌等に特異性の高い腫瘍マーカーとして利用できる可
能性がある。
ナル抗体を用いる方法、あるいは2種のモノクローナル
抗体を用いて極めて高い特異性でヒト・酸性GSTを測
定する方法(WO87103377号明細書参照)が行
なわれている。
ポリクローナル抗体を用いたヒト・酸性GSTの測定に
おいては、アイソザイムの多い酵素故に特異性の面で必
ずしも十分に高いとは云い難い場合があり、また2種の
モノクローナル抗体を用いたヒト・酸性GSTの測定方
法においては、抗原の特定部以外とは反応しないと云う
モノクローナル抗体の特性故に抗原と親和性が必ずしも
十分に高くない場合があり、より高い特異性及びより高
い感度でヒト・酸性GSTを測定することができる免疫
学的測定方法が望まれていた。
ヒト・酸性GSTを高特異性かつ高感度で測定し得る測
定方法、測定試薬及びキットを開発するべく鋭意検討し
た結果、抗原との親和性が高いヒト・酸性GSTを特異
的に認識するポリクローナル抗体と、ヒト・酸性GST
を特異的に認識するモノクローナル抗体とを組合わせる
ことにより、高特異性及び高感度でヒト・酸性GSTを
測定し得ることを知見し本発明に到達した。
いてヒト・酸性グルタチオンS−トランスフェラーゼの
免疫学的測定を行なうに際し、いずれか一方の抗体とし
てヒト・酸性グルタチオンS−トランスフェラーゼに対
するポリクローナル抗体を用い、他方の抗体としてヒト
・酸性グルタチオンS−トランスフェラーゼを特異的に
認識するモノクローナル抗体を用いることを特徴とする
ヒト・酸性グルタチオンs−トランスフェラーゼの免疫
学的測定方法、 (2)上記(1)のヒト・酸性グルタチオンs−トラン
スフェラーゼの免疫学的測定方法に使用する、ポリクロ
ーナル抗体とモノクローナル抗体の二種類の抗体を組み
合わせてなる測定試薬、及び(3)上記(2)の二種類
の抗体を組み合わせてなる測定試薬と、これに(a)溶
解剤、市〉洗浄剤及び酵素で標識化した抗体を用いる場
合には、(c)酵素活性を測定するための基質及びその
反応停止剤を組合せてなるヒト・酸性グルタチオンS−
トランスフェラーゼの免疫学的測定用のキットである。
抗原の有無又はその量を測定する方法は、サンドイツチ
法と呼ばれ、例えばワイド(Wide)の[放射線免疫
検定法(Radioi+++munoassayMet
hods) J 199〜206(1970)に記載
されテいる。
は、抗原の2つの異なる部位に結合する2種類の抗体と
して、ヒト・酸性GSTに対するモノクローナル抗体と
ポリクローナル抗体を使用し、そのモノクローナル抗体
としてはヒト・酸性GSTを特異的に認識して結合し得
るモノクローナル抗体を使用し、好ましくはヒト・酸性
GSTのうちヒト胎盤由来グルタチオンS−トランスフ
ェラーゼ(GST−π)分子のN端から44残基までの
シーケンスを有するフラグメントを認識するモノモノク
ローナル抗体、またはGST−π分子のN端176残基
から209残基(c端)までのシーケンスを有するフラ
グメントをmil!するモノクローナル抗体を使用し、
ポリクローナル抗体としてはヒト・酸性GSTに対する
抗ヒト・酸性GST抗血清の抗体成分好ましくはGST
−π分子のN端92残基から209残基(c端)までの
シーケンスを主に認識するポリクローナル抗体を使用す
る。
期待される、゛抗原認識部位の異なる2つの抗体を用い
る′という条件が本測定法において満たされる事になる
。その証明として、GSTπ分子を家兎に免疫して得ら
れる抗体は、実施例1の中で示されるごとく、GST−
πのブロムシアン分解ペプチドの中でl[i92残基か
らN 9W209残基(c端)までのシーケンスを有す
るフラグメントを主に認識することにより、N端からN
端44残基を認識するモノクローナル抗体と、抗原認識
部位が明らかに異なる。
A [/2′Leu−217Glnlを固定化し、固定
化フラグメントAによるポリクローナル抗体吸収実験の
結果、ポリクローナル抗体がほとんど吸収されないこと
から、このポリクローナル抗体は、GST−πのN端1
76残基から209残基を認識するモノクローナル抗体
とも、抗原認識部位が異なる事が示されたことになる。
とにより、さらに高感度な測定系が達成でき、本発明の
目的にさらに近づくこととなる。
、それに用いる測定試薬及びキットを具体的に説明する
。
Tに対するポリクローナル抗体(第1抗体)を適当な不
溶性担体く例えばプラスチック容器)に固定化する(以
下これを“固定化抗体″という)。ついで不溶性担体と
測定しようとする試薬又は検体試料との非特異的結合を
避けるために適当な物質(例えば牛血清アルブミン)で
不溶性担体の表面を被覆する。
担体を検体試料と一定時間及び温度で接触させ反応させ
る。この間に固定化抗体(第1抗体)と検体試料中のヒ
ト・酸性GSTが結合する。
ば酵素)で標識したヒト・酸性GSTに対するモノクロ
ーナル抗体(第2抗体)の溶液(例えば水溶液)を、不
溶性担体における固定化抗体に結合したヒト・酸性GS
Tと一定時間及び温度で接触させ第2抗体と反応させる
。これを適当な洗浄液で洗い、次いで不溶性担体上に存
在する第2抗体に標識された標識物質の量を測定する。
GSTを含有する検体試料を同時に混合し、一定時間及
び温度でこれら三者を同時に接触させて反応させること
もできる。
を算出することができる。
した不溶性担体に結合した抗体と、標識抗体とからなる
。
上記の測定試薬と、これら測定試薬を能率よく且つ簡便
に利用するための補助剤として、例えば固体状の試薬又
は液状の検体を溶解させるための溶解剤、不溶性担体に
非特異的に結合した抗原、抗体を洗浄するために使用さ
れる洗浄剤。
性を測定するための基質及びその反応停止剤。
ものが挙げられる。
される不溶性担体としては、例えばポリスチレン、ポリ
エチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリアクリ
ルニトリル、弗素樹脂、架橋デキストラン、ポリサッカ
ライドなどの高分子、その他紙、ガラス、金属、アガロ
ース及びこれらの組合せなどを例示することができる。
、繊維状、棒状、盤状、容器状、セル。
発光物質及び放射性物質等を使用するのが有利である。
、螢光物質としてはフルオレツセインイソチオシアネー
ト、フィコビリプロティン等、発光物質としてはイソル
シノール、ルシゲニン等、そして放射性物質としてはj
1 、 tj勺 14C,3)(等を用いるとができる
が、これらは例示したものに限らず、免疫学的測定法に
使用し得るものであれば、他のものでも使用できる。
に基質、必要に1り発色剤が用いられる。
してH202を用い、発色剤として2.2′−アジノジ
−[3−エチルベンズチアゾリンスルホン酸]アンモニ
ウム塩(ABTS)、5−アミノサリチル酸、0−フェ
ニレンジアミン、4−アミノアンチピリン、 3.3
’ 、5.5’ −テトラメチルベンジン等、酵素にア
ルカリフォスファターゼを用いる場合は基質としてO−
ニトロフェニルフォスフェート等、酵素にβ−D−ガラ
クトシダーゼを用いる場合は基質としてフルオレセイン
ージ(β−D−ガラクトピラノシド〉、4−メチルウン
ベリフェリル−β−D−ガラクトピラノシド等を用いる
ことができる。
・酸性GSTを抗原として動物に免疫して得られる抗ヒ
ト・酸性GST抗面清の抗体成分として得られるものが
挙げられる。なかでも例えば山羊抗ヒト・酸性GSTS
ポークローナル抗体。
く挙げられる。また好ましくは、抗原のアフィニティ精
製ポリクローナル抗体が挙げられる。
ントを含む)及びその製造方法については、先に出願さ
れた特願昭60−259858号(昭和60年11月2
1日出願:発明の名称“グルタチオンSトランスフェラ
ーゼに対するモノクローナル抗体及びその製造法″)の
特許出願明細書に詳細に説明されている。F(ab′)
zの作成については、ペプシンを用いる従来の方法で良
い。
を高い特異性及び高い感度で容易に測定することができ
ると共に、ヒト・酸性GSTを正確かつ迅速に測定し得
る測定試薬及びキットが提供される。
重量%を意味する。
を0.25 Mシュークロス、 10 mMリンl!l
1ii液(+))−17,4>中で細切りした後、ホモ
ジナイザーでホモナイズした。得られたホモジネートを
、10.OOOxgで4℃において30分間延伸分離し
、上清を採取した。次いで、この上清を、更に100,
000 xgで4℃において1時間延伸分離を行なって
、上清を採取した。この上清を1011Mリン酸緩衝液
(11H6,8)を用いて透析した後、透析内液をこの
緩衝液で平衡化した0Mセルロース充填カラムに通じて
、非吸着分画を採取した。次に、この分画を還元型グル
タチオン固定セファロースを充屓したカラムに通じて、
酸性GSTを吸着させた侵、10 mMリン酸緩衝液(
pH7,4)でカラムを洗浄し、流出液の紫外吸収スペ
クトルにおける280nmの吸収強度が0.02以下に
なった時点で、還元型グルタチオン含有トリス緩衝液(
DH8,0)をカラムに通液して、吸着物を溶出させた
。この溶出液を限外濾過した後、10111MリンM緩
衝生理的食塩水(PBS) (pH7,4)を用いて
、セファデックスG−100<ファルマシア社)カラム
によりゲル濾過することによって、酸性GSTを含有す
る両分を得た。この画分を、再度限外濾過により濃縮し
た後、等電点電気泳動カラム(LKB社製)を用い、濃
度勾配作成にシュークロースを、pH勾配作成にアンフ
オライン(ファルマシア社製: l1l−43,5〜
10)を使用してカラム等電点電気泳動(1)H3,5
〜10)を行ない、精製したGST−πを含有する両分
を得た。
を、フロイント完全アジュバントに乳化し、7週齢のB
ALB/Cマウスの腹腔に11001R/匹の最を投与
した。そして、15日後に、マウスに追加免疫を初回と
同様の方法で行なった。次に、10日後に血中に抗体量
が増大したことを確認して、更に7日後に抗原をioo
IItg/四の置で静注により投与した。
(ギブコ社!lりで、ミエローマ細胞P3−X 63
− A (18−U 1を維持培養しておいた。最終免
疫の3日後、マウスから採取した牌臓細胞とP3tJ1
を、Qi等の方法(S electivemethod
s in cellular immunolooy
1980. 351〜372.参照)によりポリエチ
レングリコール4000を用い細胞融合させ、96穴マ
イクロプレートにまいた。細胞融合後、培地を100μ
Mヒボキサンチン、0.4μMアミノプテリン、16μ
Mチミジンを添加したRPMI培地(HAT培地)に置
き換えた。HAT培地で培養中2〜3週間で牌臓細胞と
ミエローマ細胞のハイブリドーマのみが生育した。ハイ
ブリドーマの培養液中の抗体活性を、以下に述べるEL
ISAで調べた。
1Mリン酸生理食塩水(1)87.4)に3%(W/V
)の牛血清アルブミン(BSA)を添加した液でブロッ
キングを行なった。ブロッキング後、ハイブリドーマ培
養液50dをELISAプレートに添加し、室温で2時
間放置した。その後、ハイブリドーマ培養液を除去して
洗浄した後、ペルオキシダーゼ標識山羊抗マウスIo
G−Fc特異抗体(24/d) 100teを添加し
、3℃で1.5時間反応させた。更に、この酵素標識抗
体溶液を除去した後、洗浄し、0.05%2.2′ −
7ジノジー[2−エチルベンツチアゾリンスルフォネー
ト(6)] (ABTS)。
液(1)84.6)を20011Ii!添加して発色さ
せることにより検出した。
製GST−πに対する抗体を産生ずるハイブリドーマ培
養液を選別し、更に限界希釈法によるクローニングを行
ない、最終的に単一クローンのハイブリドーマ3種を得
た。このハイブリドーマを、夫々、プリンスタン投与B
ALB/Cマウスの腹腔に投与して増殖させ、モノクロ
ーナル抗体を含む腹水を得た。得られた腹水に50%飽
和硫安を加え、抗体を沈澱させ、この沈澱物を0.1M
リン酸生理食塩液(1)H8,0)に溶解させた。そし
て透析後、プロティンA−セファO−スCL4Bカラム
(ファルマシア社製)にかけ、抗体を0.2Mグリシン
−塩酸緩衝液(E)H3,0>で溶出し、中和して精製
した。
体を、夫々5F、2H,6Aと命名した。
nblottin(J)法で3種のモノクローナル抗体
は、GST−πを認識した。また、ELISA用プレー
ト固定したGST−πに対して、ビオチン化した第一の
抗体と非標識の第二の抗体を共存させて反応させるイン
ヒビジョン・アッセイ(I nhibition as
saV )法により、いずれの2つの組み合せにおいて
もビオチン化抗体の反応量に変化がないことより、3種
のモノクローナル抗体はいずれも互に異なるエピトープ
(抗原部位)を認識することが示された。
た健常人の血清とも反応しなかった。
ル抗体に特異的な抗原を、yowb+ng等の方法(P
ro、 N、 A、 3.76 4350〜4354
)によるウェスタンブロッティング法を用いて固定した
。
S−PAGE後電解液バッファーを25 iMり’)
シン、 20% (V/V ) メタノールを用い、電
圧傾斜が7V/cm、2JI間の条件でスラブ(Sla
b)ゲルからニトロセルロースシートへ蛋白を移した。
のシートをアミドブラックで蛋白染色を行ない、他方は
次の様な酵素免疫アッセイを行なった。
1次抗体としてモノクローナル抗体(2Fまたは5F)
を加えた。2次抗体としてペルオキシダーゼ標識山羊抗
マウスIaG−Fc特異抗体加えた後、洗浄、0.04
%3.3′ −ジアミノベンジジン、 0.0034
%H202、0,01M PBSからなる基質溶液を
加えて発色させることにより検出し、固定した。
る抗原(GST−π〉の抗原決定基の決定(1)本実施
例において用いた、GST−πの消化。
ng 、 HPLCによる分離および抗GST−π・P
CAの作成法は以下のとおりである。
消化は、2.5μgGsT−π15ul Tris−
H(J (25mM、 pH7,7)と40μgCN
Br/10μ麦ギ酸と混合し、25℃で終夜反応させた
。
μyGST−π150μpの25 +11M T r
is−HC夕(pH7,7)と、10μ文の固定化トリ
ブシンサスペンジション(20U/μす、シグマ。
GEは、0.1%のSDS含む、17.5%のアクリル
アミド分離ゲルと0.1%のSDSを含む5%のアクリ
ルアミド濃度スラブゲルを用いて行なった。分子量マー
カーとして、97.4に、 66、IK、 45.OK
、 31.OK、 21.5K。
。
マンハイムより得た。2.5μグのGST−π CNB
r digestと5μ9の固定化トリプシン分解物
をそれぞれスラブゲルのル−ンにのせ、40 mAの定
電流にて、電気泳動を行なった。
DS−PAGEによる分解後、タンパクを電気泳動的に
アクリルアミドスラブゲルからニトロセルロース膜に転
写を行なった。(250aΔ。
にてアフタコート(37℃、1hr)反応し、次いでM
CA(40μg)を含む3%BSAで4℃、 16hr
反応を行なった。その侵、ニトロセルロース膜を0.0
5%T ween20を含むPBS (T−PBS)に
て3回洗浄し、酵素標識(ベルオキシターゼ)抗マウス
Ig△(カベル社製)を含む3%BSA溶液にて2時間
反応させ、4回T−PBS洗浄後、4−クロロ−1ナフ
トールを用いて、ニトロセルロースメンブレン上のGS
T−π由来のタンパクの発色を行なった。
用いて行なった。流出は、280L1mと210μmテ
モニターした。iooμ9のGST−πの固定化トリプ
シン分解物はC−18カラムを用いた逆相HP L 5
ystenにおいて、0,1%TEAをベースにしたア
セトニトリルのリニアグラジェント(アセトニトリルO
→80%(160分間))により分取を行なった。それ
ぞれのピークを採取してS peed V aCCo
ncertratoeを用いて濃縮し、western
BIOttinlJ 、 DotBIotting
、ペプチドシーケンサ−に供した。
0μグのGST−πをフロイントのコンブリートアジェ
バンドと混合し、兎の背中の皮下に注射した。次いで2
週間後に 100μびのGST−πをフロイントのイン
コンプリートアジバント1dと混合し、同様に皮下に投
与した。このブーストの投与を合計3回行ない、最終投
与の10日後に、全面採血した。
精製した。
めに、最初にCNBrにより、GSTπを分解した。そ
のCNBr分解フラグメントを5DS−PAGEにかけ
ニトロセルロースに転写しWestern B To
ttingを行なった。その結果を第2図に示す。第2
図より、これらのモノクローナル抗体に対する抗原決定
基は、大きく2種類に別れることが判明した。すなわち
、26K(原料のGST−π) 、 24.2にのフラ
グメント以外に11.4Kを認識する6A、5Fと、9
.8に、 7.8Kを認識する2日である。
、47 : 5626〜5630(1987) )の報
告によるGST−πの全アミノ酸配列からCNBrによ
る切断フラグメントは第3図のごとくになると考えられ
る。メチオニンがN端から19と91番目にあり、以上
を考慮すると切断フラグメントは、190残基(24,
2に、 20→209) 。
i残基(9,8K。
であることが推定される。
1→91のフラグメントを認識し、6A。
識することが推定されたく第4図)。
8−PAGEを行なった(第5図)。次いでWeste
rn 31ottingを行なった結果を第6図に示
す。第6図により、2日はトリプシン分解物の5.6に
の7ラグメントを認識し、6A、5Fは、トリプシン分
解物の7.4にのフラグメントを認識する事がわかった
。
ラグメントの単離を目的として、逆相HPLG(トーソ
ーCCPM、TSKgel 0DS−120T)に
より分離を試みた。そのクロマトグラフの1部を第7図
に示す。NQ37〜順43までの各ビークのdot b
lOttinoを行ない各モノクローナル抗体との反応
性を検討した結果、特にビークNα40と2Hのモノク
ローナル抗体との反応が確認された(第8図)。ビーク
NQ40の分画をS Deed V aCConce
ntratorを用いて延伸乾燥し、TEAに再溶解し
、ABI社製ペプチドシーケンサ−にアプライしたとこ
ろ、このフラグメントのN端20残基は、第9図に示さ
れる配列であることが判明した。
比較した結果、GST−πのN端20残基と完全に一致
した。
とから、5.6にのフラグメントは、GSTπの、N端
から44残基までのフラグメントであり、このフラグメ
ントを2Hのモノクローナル抗体が認識することが確認
された。2HがN端側のフラグメントを認識する事は、
同抗体がGST−πのCNBr分解によるフラグメント
のうちで1→91(’ Pro−”Met)を認識する
実験事実からも支持される。
PLOを用いて検討したが、適当な分離条件をさがし得
す、分取不可能であった。このため、スラブゲルによる
分取を検討した。すなわち、スラブゲル(18x 8
cra )にル−ン当り、200μ9のGST−πトリ
プシン分解物をのせ、5O8−PAGEを行なった。泳
動後PVDF膜(ファルマシア製)に転写しく90V、
300mA、 30分、 r、t、)クマジーブルー
により染色した。目的とするバンドを切り取り直接ペプ
チドシーケンサ−(AB1社製)にかけ、N末アミノ酸
配列の決定を行ない、T hr −P he −1le
−V at −G lyテあることが判明した。
果 /4’/ L VSから/G’7’Qlyの5残基
のシーケンスが、ヒトGST−πのそれと完全に一致し
たことにより、この7.4にのフラグメントが/に/
Thr→”’Glnである事を結論した。すなわち、6
A。
トを認識することがわかり、またこの事実は、GST−
πのCNBr分解物の中で、同抗体が92〜209のフ
ラグメントを認識する実験事実からも裏づけられる。
応性をさらに確認するために 7h/ Th、−ν’Q
lnのC端69残基のペプチドを、2つに分けて、すな
わ、フラグメントA(Leu−17GIn)と7ラグメ
ントB (”’T hr−”L eu)を合成り、 t
c。それぞれのペプチドを精製し、ニトロセルロース膜
に各1100n 、 10ngスポットし、モノクロー
ナル抗体を用いたDat 3 lottingを行な
ったところ、第10図で示すように、6Aはフラグメン
トAと、5FはフラグメントBとそれぞれ特異的に反応
する事が判明した。
。
)7ラグメントのエピトープと反応する。
グメントノエヒトーブと反応する。
メ:zトのエピトープと反応する。
以下の操作により、ポリクローナル抗体、モノクローナ
ル抗体6A、5F、2Hの固相化および標識化を行なっ
た。
浄してから、各種抗GST−π抗体の20μg/−の濃
度を有するPBS (1)H7,4)溶液中に4℃の温
度で1昼夜放置した後、PBSで洗浄し、0.5%BS
A水溶液中に4℃の温度で1昼夜放置してポストコーテ
ィング処理を実施して、抗GST−π抗体固定化ビーズ
を得た。
−(m−マレイミド安息香酸)−N−サクシンイミドエ
ステル(MBS)の10rI#g/dの濃度のジメチル
ホルムアミド溶液50−を添加し、25℃の温度で30
分間反応させた。次いでセファデックスG−25を充填
したカラムを用い、0.1Mリン酸!1ili液(1)
H6,0)でゲル濾過を行ない、マレイミド化抗体と未
反応MBSとを分離した。
シンイミジル−3−(2−ピリジルチオ)プロピオネー
ト(SPDP)の10Rg/ dの濃度のエタノール溶
液を添加し、25℃で30分間反応させた。次いで、セ
ファデックスG−25を充填したカラムを用い、0.0
1 M酢酸緩衝液(1)84.5)でゲル濾過して精製
し、ピリジルジスルフィド化HRPを含有する両分を採
集し、これをコロジオンバック中において水冷下に約1
0倍に濃縮した。次に、これに0,85%NaCjと0
,1Mジチオスレイトールとを含有する0、1M酢酸緩
衝液(1)H4,5> 1 mを添加して、25℃で3
0分間撹拌して)IRP分子中に導入したピリジルジス
フィト基を還元した後、セファデックスG−25カラム
にかけてゲル濾過し、チオール化HRPを含有する画分
を得た。
、コロジオンバックを用いて水冷下に4■/dの蛋白質
濃度まで濃縮し、4℃で1昼夜放置した。その後、ウル
トロゲルACA44(LKB社)を充填したカラムでゲ
ル濾過し、HRP標識抗GST−π抗体を得た。
πの測定(標識抗体としてポリクローナル抗体を用いた
場合) 各種抗体(ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体6
A、5F、21−1>を固定化したビー181個と、精
製したGST−π(標準物質)をOng/ td 〜1
5ng/ d、の節回で含゛有する0、5%BSA含有
PBS溶液(1)H7,4) 200μすとHRP標
識兎抗GST−πポリクローナル抗体を含有する0、5
%BSA含有PBS溶液(pH7,4) 200μ文
とを、各種固相抗体と標識ポリクローナル抗体の組み合
せでそれぞれ試験管に添加して37℃の温度で2時間イ
ンキュベートした。次に、試験管内の溶液を吸引除去し
た侵、PBSで洗浄してから、3.3’ 、 5.5
’ −テトメチルベンジジン塩酸塩0.02 %、 8
202 0.005%を含有す40.1Mリン酸−クエ
ン酸緩衝液(+)H4,0)を0.4−ずつ各試験管内
に加え、37℃の温度で30分間インキュベートした後
、反応停止剤として1N硫酸水溶液を1dずつ加えて酵
素反応を停止させた。
波長の吸収強度を測定し、これを標準物質濃度0および
100Mdに対してプロットすることにより各種同相抗
体組合せによるN/S比(ODAa =O100Ao
=15no/d) 全算出シタ。
リクローナル抗体と、モノクローナル抗体6Aまたは2
Hの固相抗体の組みあわせによる測定系が、N/S比が
低く、すなわちGST−π濃度OnQ/−における吸光
度を低く保ち、しかも1sna/#Il!における吸光
度が十分に高い測定系を達成しえることがわかった。
ローナル抗体を用いた場合〉各種酵素標識抗体(ポリク
ローナル抗体、モノクローナル抗体6A、5F、2H)
と、ポリクローナル抗体固定化ビーズを用い、(aに準
じて実験を行なった。
クローナル抗体と、モノクローナル抗体6Aまたは2H
の酵素標識抗体の組みあわせによる測定系が、N/S比
が低い良好な測定系であることがわかった。
ナル抗体を用いた場合)兎抗GST−πポリクローナル
抗体の中に6Aが認識するフラグメントA [/)(l
e u 、、、”7Gl n]に対する認識部位を有
する抗体が、どの程度含まれているかを確認するために
標記実験を行なった。
ァー (pH9,0) 1mに溶解しCNBr活性化S
epharose4 B <ファルマシア製)11n
iと4℃。
ose4 Bを、3M KSCNにて洗浄後、カラム
に充填し兎抗GST−πポリクローナル抗体2dを反応
させた。100dのPBSにより洗浄後、3M KS
CNにて溶出させた。溶出液!Mの280nlllの吸
光度は0.016であった。
pharose4 Bを用いて同様の吸収実験を行なっ
て得られた溶出液5ai!の280nmの吸光度は、0
.352であった。前値0.016 (11,5Hg/
#liりは、全抗GST−π抗体値0.352(251
μg/d)の4.6%に相当した。
ST−π分子のN端からN端44残基のシーケンスを認
識するモノクローナル抗体(実施例1参照)と抗原認識
部位を共有せず、また、N端176残基からN端209
残基のシーケンスを認識するモノクローナル抗体ともほ
とんど抗原i!謙部位を共有しないことが判明したく実
流例2 (4) )。そして、ポリクローナル抗体と、
抗原認識部位を異にするN端からN端44残基のシーケ
ンスを認識するモノクローナル抗体、または、N端17
6残基からN端209残基のシーケンスを認識するモノ
クローナル抗体を組みあわせた測定系のみがN/S比の
低い高感度な測定系をもたらすことを実験にて証明しえ
た。
する抗体の組合せであるポリクローナル抗体−ポリクロ
ーナル抗体の組みあわせでは、非特異的反応が高いため
に高感度の測定系が達成できなかった事、また、共通の
抗原決定基を有するかもしれないポリクローナル抗体−
5F(Thr/7r16Bがその抗原決定基)の組み合
せでは、特異的反応が低いために高感度の測定系が達成
できなかったことからも裏づけされる。
標識体を用いたGST−πの測定 (1) モノクローナル抗体F(all’)2のHR
Pモノクローナル抗体6Aの2.OIftg/I!l!
のPBS溶液に、1Mの酢酸緩衝液(1)H3,7)
100μ文と、40μシのペプシンを20μ文の同緩
衝液に溶解して37℃、3時間反応させた。反応終了後
、PBSにて平衡化したセファデックスG25カラム(
φ2 (:lI X 45CIR)を用いて分離しF(
ab’)2を採取した。HRP標識6A−F (ab’
)2の調整は、実施例2 (1) +b+に準じて行
なった。
と、HRP標識6A−F (ab’ >2を用いて、濃
度O〜15ng/In1.の精製したGST−π(標準
物質)の免疫測定法を実施例2(2]に準じて行なった
。比較例として、)(RP標識6A−[oGを用いて測
定を行なった。結果を第3表に示す。
(ab’ ) 2とHRP標識6A−IQ G) 第3表のごとく、HRP標識6A F(ab’)2は、6A−1gGに比べて、3〜4倍の
感度上昇を見た。
’のHRP標識体を用いたGST−πの測定兎抗GST
−πポリクローナル抗体の2■/dのPBS溶液に、1
Mの酢酸緩衝液(1)H4,2)100μρと、40μ
びのペプシンを20μρの同緩衝液に溶解して、37℃
、16時間反応させた。反応終了後、5n+MEDTA
含有0.1Mのリン酸緩衝液(p)−16,0)にて平
衡化したセファデックスG−25カラム(φ2 cya
X 45cm)を用いて分離しF(ab’)2を採取
した。次いで、同F(al)’)2を−メルカプトエチ
ルアミンを用いて還元し、トーソーG 3000S W
カラムによるゲル濾過HPLCにてF ab’ を精製
した。
単離した。最後にFab’ とマレイミド化HRPを混
合しながら、フィルトロン〈限外濾過ユニット)を用い
て濃縮し反応させた。4℃で終夜反応させ、HRP標識
6AをトーソーG 30003Wにて単離精製した。
ab’とHRP標1iPCA−1a G) モノクローナル抗体6Aを固定化したビーズと、HRP
標識ポリクローナル抗体F ab’ を用いて、濃度0
〜15ng/ allの精製したGST−πの免疫測定
法を実施例2(21に準じて行なった。比較例として、
トIRP標識ポリクローナル抗体1oGを用いて行なっ
た。結果を第4表に示す。
ローナル抗体Fab’ は、IgGに比べて8〜10倍
の感度上昇を見た。
の5O8−PAGEパターンを示している。レーン■は
原料のGST−π、■→■にいくに従い、GST−πに
対するブロムシアンの反応重量比が増加している。 第2図は、GST−πのCNBI”分解フラグメントに
対する各種抗体の反応性を示すウェスタンブロッティン
グを示す。 以下の抗体を各レーンにて反応させた。 レーン1:PCA、レーン2 : 2H,レーン3;6
A、レーン4;5Fである。 第3図は、GST−πのCNBr分解フラグメントの模
式図を示す。 原料以外4つのフラグメントの出現が予想される。 第4図は、各モノクローナル抗体のGST−π分子上の
反応部位を示す。 第5図は、fa)GST−π分子のトリプシン分解フラ
グメントの5DS−PAGEパターンと(b)同上のデ
ンシトメーターによるスキャニングを示す。 第6図は、GST−πのトリプシン分解フラグメントに
対する各種抗体の反応を示すウェスタンブロッティング
を示す。 以下の抗体を、各レーンにて反応ざUた。 レーン1;PcA、レーン2 ; 2H,レーン3:8
A、レーン4;5Fである。 第7図は、GST−πのトリプシン分解フラグメントの
逆相HPLCによる溶出パターンを示す(溶出4.12
10n−ニr −E ニター) 、 TSKgel O
,DS−ROTカラムを用い、0.1%TEA(トリフ
ルオロ酢酸)にて、アセトニトリルO→80%のグラジ
ェント(160分)にて溶出した。 第8図は、GST−πのトリプシン分解フラグメントの
逆相HPLCによる溶出ピークに対する各抗体の反応性
を示すドツトプロットである。7つのピーク(NQ37
〜43)を、ニトロセルロース膜にドツトスポットし、
以下の抗体を各レーンにて反応させた。 レーン1:PCA、レーン2;2H,レーン3;6A、
レーン4;5Fである。 第9図は、2Hの反応したビークNα40を単離して決
定したピークN040のN末端アミノ酸配列を示す。 第10図は、GST−π分子の合成ペプチド[”L e
u−”7GIn] =フラグメントA、 [”Thr
〜/Fr1−6u]−フラグメントBに対する各モノク
ローナル抗体の反応性を示すドツトプロットである。 以下の抗体を各レーンにて反応させた。 レーン1;5F、レーン2 : 6A、レーン3;2H
である。 第11図は、〈ωGST−π分子のバイトロバジ−プロ
フィルを示し、+b+最終決定された各種モノクローナ
ル抗体のGST−π分子に対する反応部位を示す。 第 図 匣===■二二==蝙 匠[二■===]口 区====図 jl、4に 9、ZK 7.8に (−m’6J6) PcA 2h bA 5F吸光度(
540nm ) 第 す 図 9本〜4 ぷ*司 Q 〜 大X大大X大大 第 図 溶二龜り 第 図 図面の浄書(内容に変更なしン 第10図 1え堆魚 フラグメントA フラグメントBr−m−)(
−一一一) (100ng )(IOng) (100ng ) (IOng) (cL) 5、砿 第 図 7.4に 手 続 補 正 書(方式) %式% 1、事件の表示 特 願 昭 2、発明の名称 ヒト・酸性グルタチオンS−トランスフェラーゼの測定
方法3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 大阪府大阪市中央区南本町1丁目6番7号(3(X))
帝人株式会社 4、代 理 人 東京都千代田区内幸町2丁目1番1@(
飯野 ピ ル) 5、補正命令の日付 平成1年3月14日 6゜ 7゜ 補正の対象 図面 補正の内容 願傷に最初に添付した図面のうち第4図。 第5図及び第10図の浄書
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、不溶性担体に結合した抗体と標識抗体とを用いてヒ
ト・酸性グルタチオンS−トランスフェラーゼの免疫学
的測定を行なうに際し、いずれか一方の抗体としてヒト
・酸性グルタチオンS−トランスフェラーゼに対するポ
リクローナル抗体を用い、他方の抗体としてヒト・酸性
グルタチオンS−トランスフェラーゼを特異的に認識す
るモノクローナル抗体を用いることを特徴とするヒト・
酸性グルタチオンS−トランスフェラーゼの免疫学的測
定方法。 2、ポリクローナル抗体が、ヒト胎盤由来グルタチオン
S−トランスフェラーゼ(GST−π)を認識する抗体
であることを特徴とする、請求項1記載のヒト・酸性グ
ルタチオンS−トランスフェラーゼの免疫学的測定方法
。 3、モノクローナル抗体が、ヒト胎盤由来グルタチオン
S−トランスフェラーゼのN端から44残基までのシー
ケンスを有するフラグメントを認識する抗体であること
を特徴とする、請求項1記載のヒト・酸性グルタチオン
S−フェラーゼの免疫学的測定方法。 4、モノクローナル抗体が、ヒト胎盤由来グルタチオン
S−トランスフェラーゼのN端176残基からN端20
9残基のシーケンスを有するフラグメントを認識する抗
体であることを特徴とする、請求項1記載のヒト・酸性
グルタチオンS−トランスフェラーゼの免疫学的測定方
法。 5、不溶性担体に結合した抗体としてモノクローナル抗
体を用いることを特徴とする、請求項1記載のヒト・酸
性グルタチオンS−トランスフェラーゼの免疫学的測定
方法。 6、標識抗体としてモノクローナル抗体を用いることを
特徴とする、請求項1記載のヒト・酸性グルタチオンS
−トランスフェラーゼの免疫学的測定方法。 7、標識抗体としてモノクローナル抗体の F(ab′)_2分画を用いることを特徴とする、請求
項1記載のヒト・酸性グルタチオンS−トランスフェラ
ーゼの免疫学的測定方法。 8、標識抗体としてポリクローナル抗体の F(ab′)_2またはFab′分画を用いることを特
徴とする、請求項1記載のヒト・酸性グルタチオンS−
トランスフェラーゼの免疫学的測定方法。 9、不溶性担体に結合した抗体と、標識抗体とを検体と
同時に反応させる事を特徴とする請求項1記載のヒト・
酸性グルタチオンS−トランスフェラーゼの免疫学的測
定方法。 10、請求項1記載のヒト・酸性グルタチオンS−トラ
ンスフェラーゼの免疫学的測定方法に使用する、ポリク
ローナル抗体とモノクローナル抗体の二種類の抗体を組
み合わせてなる測定試薬。 11、請求項10記載の二種類の抗体を組み合わせてな
る測定試薬と、これに(a)溶解剤、(b)洗浄剤及び
酵素で標識化した抗体を用いる場合には、(c)酵素活
性を測定するための基質及びその反応停止剤を組合せて
なるヒト・酸性グルタチオンS−トランスフェラーゼの
免疫学的測定用のキット。
Priority Applications (7)
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JP63268292A JPH0750115B2 (ja) | 1988-02-01 | 1988-10-26 | ヒト酸性グルタチオンs―トランスフェラーゼの測定方法 |
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JP63268292A JPH0750115B2 (ja) | 1988-02-01 | 1988-10-26 | ヒト酸性グルタチオンs―トランスフェラーゼの測定方法 |
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Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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JP63268292A Expired - Fee Related JPH0750115B2 (ja) | 1988-02-01 | 1988-10-26 | ヒト酸性グルタチオンs―トランスフェラーゼの測定方法 |
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Country | Link |
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JP (1) | JPH0750115B2 (ja) |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59163565A (ja) * | 1983-03-08 | 1984-09-14 | Toray Ind Inc | 高分子抗原の微量定量法 |
JPS61202162A (ja) * | 1985-03-06 | 1986-09-06 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼの酵素免疫定量法 |
JPS6239772A (ja) * | 1985-08-16 | 1987-02-20 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼの放射性免疫学的測定法による定量法 |
JPS62184353A (ja) * | 1986-02-10 | 1987-08-12 | Wakunaga Pharmaceut Co Ltd | ヒト上皮細胞成長因子の免疫化学的測定法及びそのためのキツト |
-
1988
- 1988-10-26 JP JP63268292A patent/JPH0750115B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS59163565A (ja) * | 1983-03-08 | 1984-09-14 | Toray Ind Inc | 高分子抗原の微量定量法 |
JPS61202162A (ja) * | 1985-03-06 | 1986-09-06 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼの酵素免疫定量法 |
JPS6239772A (ja) * | 1985-08-16 | 1987-02-20 | Fuji Yakuhin Kogyo Kk | ヒト血中のヒトプロリルヒドロキシラーゼの放射性免疫学的測定法による定量法 |
JPS62184353A (ja) * | 1986-02-10 | 1987-08-12 | Wakunaga Pharmaceut Co Ltd | ヒト上皮細胞成長因子の免疫化学的測定法及びそのためのキツト |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0750115B2 (ja) | 1995-05-31 |
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