JP4317325B2 - ヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）のイムノアッセイ、このアッセイのために使用されるであろう抗体、試薬及びキット - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明の主題は、ヒトクロモグラニンＡのイムノアッセイのための方法であり、該方法を使用して、完全な形態のクロモグラニンＡだけでなく、このクロモグラニンＡの主要な断片をもアッセイすることが特に可能である。
【０００２】
上記アッセイは、例えばクロム親和性細胞腫及び腸カルチノイドのような、病理の診断及び治療のために得に使用できる。
【０００３】
【従来の技術】
クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）は、４８ｋＤａの分子量、４．９のｐＩを有するタンパク質であり、そのヒトでの形態は、参考文献[1]中で、Konecki等, 1987に記載されているように４３９アミノ酸を含む。それは、構造的及び生理学的共通性を有するグラニンのファミリーに属する。ＣｇＡはクロモグラニンＢと同様に、主要な機能を前提とする顕著な種間保存性を示す。ＣｇＡは内分泌細胞及び神経内分泌細胞の分泌促進薬において主に表され、他のグラニンと共に上記細胞の主要な構成成分の一つを形成する。それはまた、副腎におけるカテコールアミンのような他の分子の共分泌の調節エレメントとしてこのレベルで機能する。
【０００４】
ＣｇＡはまた、小球内及びマトリックス外タンパク質溶解性分解に引き続き、活性ペプチドの放出を介して必須のプロホルモン機能を果たす。
【０００５】
添付した図１において、配列番号１は、ヒトクロモグラニンＡに相当する、Konecki等によって記載された４３９アミノ酸を示す。
【０００６】
図２は、単純な様式でこの配列を示し、この図において、ヒトにおいて放出され得るペプチドのいくつか：バソスタチン／βグラニン、クロモスタチン、パンクレアスタチン、パラスタチン、及びプロクロマシンを表す。タンパク質溶解は、図２中で数字で示され星印で表された二塩基部位で作用し、該部位はＣｇＡ配列中に配置され、ヒトＣｇＡ中で全部で１０個存在する。このタンパク質溶解は、タンパク質のそれぞれの末端部位で周期的な現象として記載されており、それは組織特異的で、生産されるペプチドの組織配置の実質的な差異を導くことが示されている。それ故、タンパク質溶解の強度とタイプは、組織、血液循環、及び尿で見出される断片の顕著な可変性に関与する。
【０００７】
参考文献[2]のCorti等による最近の研究により、クロム親和性細胞腫に罹患している患者において、患者によって異なる構造及び異なる割合の循環形態が存在することを示すことによって、この多様性が確認された。同様な方法で、WE-14ペプチドに関する研究を通じて、ＣｇＡが膵臓の腸管の正常組織及び腫瘍性組織において、異なる態様でタンパク質溶解されることが示されている。
【０００８】
正常組織及び相当する腫瘍組織における検出に加えて、数多くの研究により、ＣｇＡのアッセイにおける診断上の利点が見出されている。循環ＣｇＡの濃度は、クロム親和性細胞腫、カルチノイド、及び内分泌膵臓腫瘍の場合に顕著に高い。このデータは、他の病理：神経芽腫、腸管の腫瘍、本態性高血圧症で確認され、拡張されている。ＣｇＡの存在は、アルツハイマー病を含む数多くの神経変性病理において示されている(Munoz, Lab. Invest., 1991, vol.64, 826-832頁[15]を参照）。著者の中には、前立腺のガンにおけるＣｇＡの存在が、腎臓ガンの場合と同様に、好ましくはない発達の徴候として存在し得ることを示してもいる。それ故ＣｇＡのアッセイは、主要な利点を提供する。
【０００９】
文献US-A-4 758 522[3]は、ＣｇＡのイムノアッセイを記載し、その場合抗ヒトＣｇＡ抗体の部位に対するラジオラベルＣｇＡを使用する競合的アッセイによって、ＣｇＡを測定する。
【００１０】
参考文献[4]においてSyversen等は、配列番号１アミノ酸２１０から４３９に相当するＣｇＡのＣ末端断片に対して向けられた抗体を使用するＥＬＩＳＡ法でのクロモグラニンＡのアッセイ、並びにパンクレアスタチンのラジオイムノアッセイを記載している。
【００１１】
参考文献[2]においてCorti等はまた、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸８１から９０及び配列番号１アミノ酸６８から７０に対して向けられたモノクローナル抗体を使用するＣｇＡの二つのアッセイを記載している。
【００１２】
それ故これらのアッセイは、いくつかのＣｇＡ断片を考慮しているが、該アッセイの結果に対する病理型の差異は許容していない。
【００１３】
実際に、分子のタンパク質溶解及び循環断片の多様性は、これらの分子の多様性を検出可能なアッセイ構成を必要とする。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は正に、循環血液中で見出される完全なＣｇＡの濃度及び腫瘍断片の濃度を測定するＣｇＡイムノアッセイの方法である。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明に従って、サンプル中に存在するヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）に対するイムノアッセイ法は、ヒトＣｇＡのＮ末端から（配列番号１）アミノ酸１４５から２８４位に亘る、アミノ酸配列番号２に位置するエピトープに特異的に結合する少なくとも一つのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含む。
【００１６】
本発明に従って、用語、イムノアッセイは、例えば競合的アッセイ、サンドイッチ法を使用するアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡアッセイ、及び抗体−抗体反応を使用するあらゆる他のアッセイのような、同種相または異種相での全てのタイプのイムノアッセイを包含する。
【００１７】
本発明の第一の実施態様に従って、イムノアッセイは、上記抗体の部位に対する、サンプルのクロモグラニンＡと所定の量のラベル化ヒトクロモグラニンＡ（ｈＣｇＡ）との間の競合的アッセイである。
【００１８】
このアッセイを実施するために、アッセイされるサンプルに対し、一定量のラベル化ヒトＣｇＡと、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４に位置するエピトープに対して特異的に結合する抗体を加え、次いでインキュベーションする。この態様において、競合的条件は、この抗体の部位に対するサンプルＣｇＡとラベル化ＣｇＡとの間で規定される。アッセイがラベルとして放射性同位元素を使用する異種相で実施される場合、適切な抗体を使用して免疫沈降によって形成される抗体−ｈＣｇＡ複合体を分離可能である。次いで形成された複合体の放射性活性を測定することによって、周知のＣｇＡ濃度を有するスタンダードサンプルから得られた標準曲線を参考として、サンプルのＣｇＡ濃度を測定可能である。
【００１９】
例えばラベル化ｈＣｇＡ及び該ラベル化ｈＣｇＡによって放射されるシグナルを調節可能な抗体を使用する、同種相でアッセイを実施することもまた可能である。
【００２０】
このアッセイにおいて、使用される抗体は有利には、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４中に位置するエピトープに特異的な抗体、またはヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９７中に位置するエピトープに特異的な抗体である。これらの抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２１】
このアッセイを実施するために、スタンダードサンプル及びラベル化ＣｇＡの調製は、ヒト起源の内分泌細胞または神経内分泌細胞から得た精製ＣｇＡ、または好ましくは組換えヒトＣｇＡを使用してもよい。
【００２２】
本発明の第二の実施態様に従って、イムノアッセイは、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置する第一のエピトープに特異的に結合する第一のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と、並びにヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置する第一のものとは異なる第二のエピトープに特異的に結合する第二のモノクローナルまたはポリクローナル抗体で、二つの抗体の一方がラベルされているものを使用するサンドイッチタイプのアッセイである。
【００２３】
本発明のこの第二の実施態様において、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５か ら１９７中に位置する異なるエピトープに特異的な二つの抗体が使用される。このアッセイは、固相上に第一の抗体を固定し、第二のラベル化抗体を使用することによって異種相で実施されてもよい。
【００２４】
このアッセイはまた、第一のラベル抗体と、該抗体によって放射されるシグナルを調節可能な第二の抗体とを使用する、同種相で実施されてもよい。
【００２５】
例として、第一の抗体は、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９７中に位置するエピトープに特異的であり得、第二の抗体は、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４中に位置するエピトープに特異的であってもよい。
【００２６】
このアッセイにおいて、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４中に位置するエピトープに特異的な第一の抗体と、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９７中に位置するエピトープに特異的な第二の抗体とを使用することも可能である。
【００２７】
本発明の第三の実施態様に従って、イムノアッセイは、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置するエピトープに特異的に結合する第一のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２５０から３０１中に位置する第二のエピトープに特異的に結合する第二のモノクローナルまたはポリクローナル抗体で、二つの抗体の一方がラベル化されているものを使用するサンドイッチアッセイである。
【００２８】
本発明のこの実施態様において、アッセイは、固相に固定した第一の抗体と、第二のラベル化抗体とを使用する、またはその逆である、異種相で実施されてもよい。第一のラベル化抗体と、該抗体によって放射されるシグナルを調節可能な第二の抗体を使用する、またはその逆である、同種相でアッセイを実施することも可能である。
【００２９】
第一の抗体として、有利にはヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９４に特異的な抗体が使用され、またはヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４に特異的な抗体が使用される。
【００３０】
本発明の方法は、クロム親和性細胞腫またはカルチノイド腫瘍に罹患している患者から得た血清と正常な血清との間の陽性の識別が可能であるため、クロム親和性細胞腫またはカルチノイド腫瘍のような病理の診断及び治療に対して特に有利である。
【００３１】
本発明の方法を実施するために、異種相における従来のイムノアッセイ法が使用でき、それは過剰なラベル化抗体からＣｇＡ−抗体複合体の分離が可能である。
【００３２】
本発明の方法において、上記分離を含まない異種相アッセイ法を使用することも可能である。
【００３３】
異種相アッセイ法は、抗体−抗原のペアまたは二つの抗体のペアの使用に基づき、それらが互いに近接する場合、別個に放射するものとは異なるシグナルを放射する。
【００３４】
この目的のために、発光性エネルギーアクセプター化合物に結合された抗体、及び発光性エネルギードナー化合物に結合された抗体が、特に使用可能である。
【００３５】
例として、発光性エネルギーアクセプター化合物は、アロフィコシアニンであり得、発光性エネルギードナー化合物は、EP-A-0 321 353[II]に記載されたもののようなユウロピウムクリプテートであり得る。
【００３６】
特に興味深い一つの同種相アッセイ法は、参考文献[4]に記載されたTRACE（登録商標）法である。
【００３７】
異種相アッセイに関しては、アッセイで使用される非ラベル化抗体が固定されている固相を使用する。
【００３８】
使用可能な固相は、各種のタイプが存在し得る。例えば、ポリマーまたは他の材料より成るチューブ、ビーズまたはフィンを形成する巨視的固相が使用され得る。
【００３９】
使用可能なポリマーは、例えばポリスチレン、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリオキシメチレン、及びスチレンコポリマーである。
【００４０】
例えばポリマー、タンパク質または他の材料より成るパウダー及びアグリゲートといった、均一に分割された微視的な固相を使用することも可能である。
【００４１】
本発明の下で、本発明の第一の実施態様におけるＣｇＡ、及び第二の実施態様における各種の抗体に対して適用される用語、「ラベル化」は、ＣｇＡまたは抗体が、例えば放射性同位元素、蛍光性エレメント、発光性エレメント、酵素、蛍光性クロモフォア、光吸収性クロモフォア、または直接的若しくは間接的に定量的測定が可能であるあらゆる他のリガンドであってもよいラベリングエレメントによって修飾されていることを意味する。
【００４２】
本発明はまた、ヒトクロモグラニンの配列番号１アミノ酸１４５から１９７若しくは配列番号１アミノ酸２１９から２３４のそれぞれに位置するエピトープに特異的なモノクローナル抗体、並びに検出可能なラベルに結合した若しくは固相に固定された抗体の一つを含む免疫学的試薬に関する。
【００４３】
これらの抗体は、全てのタイプのアッセイに適しているため特に興味深い。それらは、従来のラベル（放射性同位元素等）で実施されるアッセイだけでなく、一般的に特定の抗体に関してのみ使用できるクリプテート及びアロフィコシアニンの蛍光ラベルで実施されるアッセイにおいても、良好な結果を与える。
【００４４】
本発明はまた、上述のモノクローナル抗体を含むヒトＣｇＡのためにイムノアッセイキットに関する。
【００４５】
それはまた、
− 第一の抗体、並びに
− 第二の抗体
を含み、二つの抗体の少なくとも一つは、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置するエピトープに特異的な抗体であるものを含む、ヒトＣｇＡのためのイムノアッセイキットに関する。
【００４６】
キットの第一の実施態様に従って、第一の抗体及び第二の抗体は、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸配列１４５から１９７及び／または配列番号１アミノ酸２１９から２３４中に位置するエピトープに特異的な抗体の中から選択される。
【００４７】
キットの第二の実施態様に従って、抗体の一つは、配列番号１アミノ酸１４５から１９７または配列番号１アミノ酸配列２１９から２３４中に位置するエピトープに特異的であり、他の抗体は、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２５０から３０１中に位置するエピトープに特異的である。
【００４８】
好ましくは、キットが異種相アッセイについて企図される場合、抗体の一つは固相に固定化され、他の抗体は検出可能なラベルに結合される。
【００４９】
検出可能なラベルは、例えばヨウ素１２５である。
【００５０】
好ましくは、キットが同種相で企図される場合、抗体の一つは発光性エネルギードナー化合物に結合され、他の抗体は発光性エネルギーアクセプター化合物に結合される。
【００５１】
別法として、発光性エネルギードナー化合物はユウロピウムクリプテートであり、発光性エネルギーアクセプター化合物はアロフィコシアニンである。
【００５２】
それはまた、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置するエピトープに特異的な抗体を含む競合的イムノアッセイキットに関する。
【００５３】
このキットにおいて、抗体は好ましくは、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４、または配列番号１アミノ酸１４３から１９７中に位置するエピトープに特異的である。
【００５４】
本発明に従って、アッセイのために使用される抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。
【００５５】
ポリクローナル抗体は、ヒトＣｇＡのタンパク質溶解またはペプチド合成によって得られたヒトクロモグラニンＡのペプチド断片から、in vivo若しくはin vitro免疫化によって得ることができる。この場合、動物において抗体を得るために、膝靱帯ヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなベクタータンパク質にペプチド断片を結合することが必要である。
【００５６】
モノクローナル抗体は、Nature, 1975, 256, 495-497頁に記載されたK, Kohler及びC. Milsteinによる方法を使用して、ハイブリドーマから生産できる。この場合、一つ以上のマウス免疫化を、全体のクロモグラニンＡ若しくは所望のエピトープに相当するペプチド断片で、キャリアータンパク質と会合させて実施し、次いでその動物の脾臓を摘出し、細胞融合を脾臓細胞とミエローマ細胞の間で実施する。次いで生産されたハイブリドーマをスクリーニングし、ヒトＣｇＡのエピトープに特異的な抗体を生産するクローンを選択する。
【００５７】
好ましくは、本発明に従って、モノクローナル抗体が使用される。
【００５８】
本発明の他の特徴及び利点は、以下に記載の実施態様の例を読むことでより明確となり、これらの実施例は、添付された図面を参考にして、明白に説明の目的で、非制限的な目的を有するものである。
【００５９】
以下の記載は、ヒトＣｇＡの各種の異なるエピトープに対して向けられたモノクローナル抗体の調製、並びにヒトクロモグラニンＡのイムノアッセイに適した抗体の選択を説明する。
【００６０】
【発明の実施の形態】
１）モノクローナル抗体の調製
１．ヒトＣｇＡの単離及び精製
参考文献[6]においてO'Connorによって記載された方法を、クロム親和性細胞腫に罹患している患者のヒト副腎から得たｈＣｇＡを精製するために使用する。該タンパク質の最終分離は、参考文献[7]に記載され、参考文献[8]に記載されたようにBader及びAunisによって修飾されたO7Farrelがオリジナルの方法を使用して、二次元ゲル上での電気泳動によって実施される。ＣｇＡをゲルから電気溶出する。組換えヒトＣｇＡ（ｒｈＣｇＡ）はまた、参考文献[9]においてTaupenot等によって記載された大腸菌BL21 (DE3)のｒｈＣｇＡ発現株を使用して生産される。
【００６１】
２．精製ＣｇＡのラベリング（125Ｉ−ｈＣｇＡ）
天然及び組換えＣｇＡを、１５００ｋＢｑ／μｇの特異的活性で、Hunter及びGreenwoodのクロラミンＴ法を使用して、Ｎａ125Ｉでラベルする。有利ヨウ素を、Sephadex-G25ゲル(Pharmacia Biotech)での濾過によって除去する。ラジオラベルタンパク質の分画を混合し、４５ｎｍｏｌ／ｌのＮａ3Ｎ、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むｐＨ７．２のＰＢＳ中に希釈する。
【００６２】
３．免疫化
６から８週齢のBalb/cマウスを、フロイント完全アジュバント中で事前に得られた精製ｈＣｇＡまたはｒｈＣｇＡの１０ｍｇで腹膜内経路によってそれぞれ免疫化する。引き続き腹膜内投与を、一ヶ月間隔で不完全フロイントアジュバント中で実施する。マウスの免疫化の確認を、事前に得られた125Ｉ−ｈＣｇＡでの免疫沈降での血清滴定によって実施する。
【００６３】
４．ハイブリドーマの生産及びスクリーニング
マウスを引き続き、０．９％ＮａＣｌ溶液中に１０ｍｇのｈＣｇＡで、静脈内経路によって注射し、その三日後に細胞融合を実施する。脾臓細胞を単離し、３７％ポリエチレングリコール（分子量１５４０）の存在下でP3-X63-Ag 8.653ミエローマ細胞と融合する。
【００６４】
陽性クローンを、125Ｉ−ｈＣｇＡでの免疫沈降によって同定する。陽性クローンから由来する抗体を、マウス腹水を使用して生産し、セファロース−プロテインＡゲルを使用して精製する。
【００６５】
ｈＣｇＡに対して免疫化されたマウスで、１１の融合物を生産した。二つのみが成功し、８のクローンを生産した。組換えｈＣｇＡタンパク質に対して免疫化された動物での二つの融合物は、１６の第二世代クローンを生産した。以上より、２から３２３６ｎｇ／ｍｌまで変化する濃度を有する１７のＩｇＧ１、６のＩｇＧ２ａ及び１のＩｇＧ２ｂを、特徴付けのため生産した。
【００６６】
５．モノクローナル抗体の同定
各種のファミリーのＣｇＡエピトープを、製造者の説明書に従って、Biacore（登録商標）装置で抗体の考え得る組み合わせを試験することによって同定した。試験された全ての抗体を、５０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、１５ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０．７５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈し、５０ｍｇ／ｍｌの割合で注射した。同じ緩衝液を、２０ｍｇ／ｍｌに希釈した組換えヒトＣｇＡについて使用した。
【００６７】
Biocoreでのこの分析は、試験された２４の抗体を、表１に示されたような８のエピトープグループに分割されるという結果を導いた。それにも関わらず、グループの一つ（３グループ）は、このグループの抗体の間に存在する部分的阻害のため、さらにサブグループに分割され得る。
【００６８】
固定化抗体−ｒｈＣｇＡ反応の化学量論は、０．１５７から０．６２１抗原のモル／抗体のモルまで変化する（表１参照）。
【００６９】
各グループまたはサブグループ中の抗体は、推測的に同じ配列の認識を示す。
【００７０】
６．組換えヒトＣｇＡ（ｒｈＣｇＡ）から由来するペプチドでの抗体の同定
２ｎｍｏｌのｒｈＣｇＡを、１００ｎｍｏｌｅ／ｌのＴＲＩＳ−ＨＣＬ、ｐＨ８．３中に１０００：１の割合のタンパク質／プロテイナーゼでＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼで３７℃で２時間切断させた。
【００７１】
次いで生産されたｒｈＣｇＡから由来するペプチドを、Machereyゲルカラム、NAGEL 300-5C18 (250mm×4mm)でのＨＰＬＣによって分離する。吸光度を２１４ｎｍで測定し、水中の０．１％トリフルオロ酢酸を溶媒系（溶媒Ａ）として使用し、アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸を溶媒Ｂとして使用する。ペプチドを、溶媒Ａ中の溶媒Ｂの連続的な勾配、０から２５％で１０分、２５から７５％で５０分を使用して０．７ｍｌ／分の速度で溶出する。各ピーク分画を回収し、完全に乾燥させることなく蒸発によって濃縮する。
【００７２】
図３は、１から６まで数字を付された時間の関数としてのカラムから溶出され回収された分画を説明する。
【００７３】
精製ペプチドの配列を、Applied Biosystems社製の４７３Ａミクロシークエンサーでのエドマン自動分解によって決定する。ＨＰＬＣ精製サンプルを、ポリブテンで予備回転され処理されたガラスファイバーフィルターに乗せる。アミノ−フェニルチオヒダントイン酸を、Ｃ−１８カラム(PTH C-18, 2.1mm×200mm)でのクロマトグラフィーによって同定する。マススペクトロメトリーによる分析を、参考文献[10]においてGoumon等によって記載された方法を使用して実施する。
【００７４】
これらの分画を、事前に得られたモノクローナル抗体を同定するために使用する。この目的のため、当量部分の分画を、ニトロセルロースシート上に分割する。メンバーを迅速にＮａＣｌ／Ｐｉ（０．９％ＮａＣｌを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）で洗浄し、ＮａＣｌ／Ｐｉ中に１／１０００に希釈されたモノクローナル抗体で室温で２時間インキュベーションさせる。
【００７５】
第二の抗体は、アルカリホスファターゼを接合した抗マウスＩｇＧである。酵素反応を、０．４ｍｍｏｌ／ｌのテトラゾリウムニトロブルー及び０．３８ｍｍｏｌ／ｌの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスファートを含む、１００ｍｍｏｌ／ｌのＴＲＩＳ−ＨＣＬ、ｐＨ８．５、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2中で生じさせる。
【００７６】
表１の各グループのモノクローナル抗体、即ち、事前に生産された抗体CSG04, CSG06, CSG10, CSG30, CSG17, CSG21及びCSG32を、高速液体クロマトグラフィーによって分離されたｒｈＣｇＡ断片の各当量の分画に対して試験する。
【００７７】
表２は、各種の分画とこれらの分画を認識する抗体との間の相関関係を説明する。表２はまた、各分画において単離された断片の質量、そのクロモグラニンＡのＮ末端からの位置、及びそのＮ末端配列を示す。抗体CSG17及びCSG21は、配列番号１アミノ酸３３９から３５５及び３５６から４００の領域に対して高い特異性を有するタンパク質のＣ末端ドメインを認識する。抗体CSG04及びCSG10をウエスタンブロットによって直接試験し、免疫検出された断片はＣｇＡのＣ末端領域（配列番号１アミノ酸３４０から３９４及び３９５から４３９）に位置する。
【００７８】
抗体CSG06, CSG20及びCSG30はタンパク質の配列番号１アミノ酸１４５から２３４に特異的であり、それぞれ配列番号１の断片アミノ酸１９８から２４５，２４６から３０３及び１４５から１９７に相当する。最後に、抗体CSG32は、配列番号１アミノ酸１０から４００に亘る主要な断片と強力に反応することに注意すべきである。各種のＣｇＡ領域を認識する他の断片と会合するこの抗体の挙動を考慮すると、それは配列番号１アミノ酸１４５から２３４をより特異的に認識するようである。
【００７９】
平行して、抗体CSG06のエピトープの配列を、合成ペプチドによって特定した。配列番号１アミノ酸１９８から２４５は、高い割合のグルタミン酸を示し、部分的に親水性で部分的に免疫原性である領域である。特にそれは、９の連続的なグルタミン酸（配列番号１アミノ酸２１０から２１８）の第一の領域を含み、とりわけ二つのプロリンによって隣接される３のグルタミン酸の配列（配列番号１アミノ酸２２７から２３２）を含む。配列番号１アミノ酸２０７から２３４及び２１９から２４５に相当するＮ末端部分でビオチン化された二つのペプチドを合成した。これらのペプチドを、ストレプタビジンで事前に皮膜されたチューブに固定化した。ラジオラベル抗体CSG30, CSG06及びCSG20（２ｋＢｑ／ｍｌ）を、各ペプチドで振動した条件の下で室温で４時間インキュベーションした。次いでチューブを洗浄し、カウントした。二つの抗体CSG20及びCSG30は、二つのペプチドのそれぞれを認識しない。一方で、CSG06は、両者の配列に対して顕著な固定を示す。それ故、最小の推定される配列は、配列番号１アミノ酸２１９から２３４に相当し、上述のポリグルタミン酸（配列番号１アミノ酸２２７から２３２）部位を包含する。
【００８０】
同様な態様で、CSG20のエピトープを、パンクレアスタチンの配列に関して特定した。この場合、パンクレアスタチンに相当する合成ペプチド（ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２５０から３０１）を、以下の免疫放射線アッセイの第二のインキュベーションにおいて、増大する量で加えた：CSG06/CSG30★及びCSG06/CSG20★。前者の場合、シグナルの阻害は検出されず、CSG06とCSG30の両者が配列 番号１アミノ酸２５０から３０１を認識しない証拠を提供した。一方でCSG06/CSG20★の場合、加えたペプチドの量が増大すると増大する阻害が得られる（チューブ当たり０．５μｇのペプチドに対して８６％の阻害）。それ故、CSG20は、パンクレアスタチンに相当する配列である、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２５０から３０１をよく認識する。
【００８１】
図２は、クロモグラニンＡの全分子に対するこれらの抗体の位置を示し、これらの抗体によって認識される配列も示す。
【００８２】
本発明に従って、抗体CSG06, CSG20及びCSG30（またはCSG33)は、再生産可能で正確な特異的イムノアッセイを実施することを可能にすることが見出された。抗体CSG30（またはCSG)は、競合的イムノアッセイのために使用できるであろう。
【００８３】
抗体CSG06, CSG20及びCSG30（またはCSG33)は、サンドイッチタイプのアッセイを実施するためにペアを形成できるであろう。
【００８４】
以下の実施例は、このタイプのアッセイを説明する。
【００８５】
【実施例】
実施例１：ヒトクロモグラニンＡのラジオイムノアッセイ
この実施例において、アッセイのために使用される抗体は、クロモグラニンＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４に特異的なCSG06である。このアッセイを実施するために、組換えヒトクロモグラニン（ｒｈＣｇＡ）のスタンダードサンプルを調製し、正常ヒト血清中に希釈した。スタンダードサンプルのｒｈＣｇＡ濃度は、０から１６００ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００８６】
さらに、ヨウ素１２５でラベルしたｒｈＣｇＡを、以前に記載されたように使用する。
【００８７】
このアッセイを実施するために、スタンダードサンプル及びアッセイされるサンプルの５０ｍｌチューブに対して、チューブ当たり２ｋＢｑの割合でラジオラベルされた３００μｌのｈＣｇＡ、及び８０ｎｇ／ｍｌに精製されたCSG06抗体の１５０ｍｌ溶液を加える。第一のインキュベーションを、穏やかに攪拌しながら室温で２４時間実施する。次いで結合複合体を、ＰＢＳ及び５０ｍｌの正常ヒト血清中に１−１０に希釈されたヒツジ抗マウスイムノグロブリンの７５μｌを加えることによって、室温で２０分分離する。１ｍｌの６％ポリエチレングリコール（分子量６０００）を加え、沈降した複合体を１５分２０００ｇでの遠心分離により分離する。次いでその放射性活性を、ガンマカウンターで測定する。
【００８８】
スタンダードサンプルから標準曲線が得られ、アッセイされたサンプルのクロモグラニンＡ濃度を、この標準曲線で見出された値に乗せることによって決定する。
【００８９】
スタンダード０での測定再現性によって決定された検出限界（１０回の測定当たりＢｍａｘ−２σ）は、１４ｎｇ／ｍＬで計算された。２４３及び４５０ｎｇ／ｍＬの濃度を有する２種の血清の１０の点でのアッセイにより、二つのサンプルについて０．９％の内挿アッセイの正確性を評価することが可能であった。平行して、３種の異なる実験でのこれらの同じ血清に対するアッセイによって作製された内挿アッセイの正確性試験は、それぞれ４．５及び６．４％のＶＣを示す。
【００９０】
このアッセイを、健康な患者から得た４６のＥＤＴＡ血漿と、クロム親和性細胞腫または他の疾患に罹患している患者から得た２１１の他の血清のシリーズで試験した。
【００９１】
図４は、試験された各種の血漿に対するこのアッセイで得られた結果を示す。この図において、病気の性質と各グループの患者のケースの番号が示される。
【００９２】
正常な集団と各他の集団のペアを比較する分散分析により、各場合においてＣｇＡ濃度が病的な血漿で顕著に高いことが示される（ｐ＜０．００１）。一方で、各種のグループの血漿を、非神経内分泌ガン患者から得た血漿のシリーズと比較すると、分析により小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）または非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）に関するグループは、参考集団と顕著に異なることが示される（それぞれｐ＝０．２８６３及び０．１７９８）。研究された他のグループは、特にカルチノイド及びクロム親和性細胞腫（ｐ＜０．００１）、並びにＡＰＵＤ腫瘍及び神経内分泌腫瘍（ｐ＜０．００１）で顕著により高いＣｇＡ値を示す。
【００９３】
このアッセイにおいて、見出されたＣｇＡ濃度は、以下のものである：
− 健康な患者から得た血漿のプール（ＮＰ）について４０ｎｇ／ｍｌ
− クロム親和性細胞腫に罹患している患者から得た血漿のプール（ＰＰ）について６７５ｎｍ／ｍｌ、並びに
− 腸カルチノイド腫瘍に罹患している患者から得た血漿のプール（ＣＰ）について１６００ｎｇ／ｍｌ。
【００９４】
実施例２：サンドイッチ法（ＴＲＭＡ法）を使用したクロモグラニンＡのアッセイ
このアッセイのために、二つの異なる抗体を使用する。第一の抗体は、配列番号１アミノ酸２１９から２３４に特異的な抗体CSG06であり、第二の抗体は、配列番号１アミノ酸１４５から１９７に特異的な抗体CSG30である。第一の抗体を、ＰＢＳ、ｐＨ７．５中に１０μｇ／ｍｌの濃度で準備し、ポリスチレンチューブをこの抗体で皮膜する。
【００９５】
第二の抗体を、ｒｈＣｇＡのラベリングについて上述したクロラミンＴ法を使用して、４００ｋＢｑ／μｇの特異的活性で、Ｎａ125Ｉを使用してヨウ素１２５でラベルする。スタンダードは、実施例１で上述したものと同様である。
【００９６】
アッセイで使用される緩衝液は、５０ｍｍｏｌ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4／ＫＨ２ＰＯ4、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、１５ｍｍｏｌ／ｌのＮａＮ3、１％ＢＳＡ、ｐＨ７．０より成る。
【００９７】
各アッセイについて、１ｍｌのアッセイ緩衝液、及び５０μｌのスタンダードサンプルまたはアッセイされるサンプルを、CSG06抗体で皮膜されたチューブに加える。それらを室温で１８時間インキュベーションする。次いでチューブを２ｍｌの０．３％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で二度洗浄する。次いで１ｍｌのラベル化CSG30抗体を各チューブに加え、それらを穏やかに振動させながら室温で２時間インキュベーションする。チューブを上述のように再び洗浄し、その放射性活性をガンマカウンターで測定する。
【００９８】
実施例１と同様に、周知の濃度のスタンダードサンプルから較正曲線を得、アッセイされるサンプルのクロモグラニンＡ濃度を、スタンダード曲線を参考にして測定する。
【００９９】
アッセイの特異性をチェックするために、正常のプール（ＮＰ）並びにクロム親和性細胞腫（ＰＰ）または腸カルチノイド（ＣＰ）に罹患している患者からそれぞれ得たＥＤＴＡ由来の二つの病的プールについて実験を実施する。
【０１００】
この特異性は、病的プールＰＰまたはＣＰと正常プールＮＰの間のＣｇＡ濃度の比を測定することによって評価される。
【０１０１】
この実施例の場合、ＣｇＡ濃度比ＰＰ／ＮＰ及びＣＰ／ＮＰは以下のものである：
ＰＰ／ＮＰ＝９．９
ＣＰ／ＮＰ＝１８．２
【０１０２】
実施例１のアッセイについて、比は以下のものであった：
ＰＰ／ＮＰ＝１６．９
ＣＰ／ＮＰ＝４０
【０１０３】
比較のために、１２００ｎｇ／ｍｌでのスタンダードサンプルについて得られた結合パーセンテージは６５．５１である。
【０１０４】
それ故この抗体の組み合わせは、高いシグナルを得ることを可能にし、二つの病的プールの間を識別可能である。
【０１０５】
添付された表３において、各種の抗体のペアで同じサンドイッチアッセイを実施することによって得られた結果が示される。
【０１０６】
これらの結果は、共に関連するまたは抗体CSG20と関連する二つの抗体CSG06及びCSG30が、満足なシグナルを与え、二つの病的プールの間を識別可能であることを示す。
【０１０７】
比較のために、同じアッセイを表2の他の抗体を使用して実施したが、これらは満足な結果を生じなかった。
【０１０８】
それ故、もしCSG21またはCSG10を第二のラベル化抗体として使用するのであれば、ＰＰ／ＮＰ比が２以下であり、さらに１未満であるために、病的プールＰＰとプールＮＰの間を識別することは不可能である。
【０１０９】
CSG21/CSG06★、CSG21/CSG30★またはCSG32/CSG03★のような他の組み合わせは、二つの病的プールを識別できず、ＰＰ／ＮＰ及びＣＰ／ＮＰ比が近接するために、興味深くはない。
【０１１０】
図５は、本発明に従った実施例１及び２のイムノアッセイ、並びにCSG06/ラベル化CSG29★の組み合わせ及びCSG06/ラベル化CSG06★の組み合わせを使用した、実施例2のサンドイッチ法を用いる他のアッセイの結果を示す。二つの抗体CSG29及びCSG04は、ＣｇＡのＣ末端部分を認識する。抗体CSG29は、CSG10と同じエピトープを共有する。
【０１１１】
この図において、結果は、病的な血漿の濃度と正常集団の９５％の値（ｎ＝２０）９５％の値との間の比の形態で示される。直線は、各グループについての平均値を示す。
【０１１２】
この図は、同様な結果が実施例１及び２で得られることを示す。一方で、CSG06/CSG04★のペアに関して、相関関係が低下し、サンプルの特定数でＣｇＡ濃度が顕著に低下した。CSG06/CSG29★に関するアッセイにおいて、この現象はさらに強調され、非常に顕著な減少が測定された濃度で生じ、ＣｇＡ濃度は集団の５０％で検出不可能である。
【０１１３】
それ故、最適な結果は、本発明に従ったＣｇＡのアミノ酸１４５−２３４の配列番号2の抗体で得られる。
【０１１４】
実施例３：同種相サンドイッチ法及び蛍光（ＦＩＡ法）を使用したクロモグラニンＡのアッセイ
このアッセイのために、二つの異なる抗体を使用する。第一の抗体は、配列番号１アミノ酸２１９から２３４に特異的な抗体CSG06であり、第二の抗体は、配列番号１アミノ酸１４５から１９７に特異的な抗体CSG30（またはCSG33)である。第一の抗体CSG06を、エネルギードナー化合物であるユウロピウムクリプテートで接合した。
【０１１５】
第二の抗体CSG30（またはCSG33)を、エネルギーアクセプター化合物であるアロフィコシアニンで接合した。
【０１１６】
使用されるユウロピウムクリプテートは、クリプテートＥｕトリスビピリジンジアミン（ＴＢＰ（Ｅｕ2+）クリプテート）である。それは文献EP-A-321 353[II]に記載され、以下の式を有する：
【化１】
【０１１７】
CSG06-クリプテート接合体を、Clin. Chem., 39, 1993, 196-201頁[12]中のLopez等によって記載された方法を使用して調製する。
【０１１８】
CSG30（またはCSG33)-アロフィコシアニン（ＡＰＣ）接合体を、WO92/01225[13]に記載された方法を使用して調製する。アッセイのために以下の緩衝液を使用する：
− 接合体緩衝液：５０ｍＭ ＰＯ4、ｐＨ７．０、０．１％ＢＳＡ、１．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ正常マウスイムノグロブリン、６００ｍＭ ＨＦ、０．１％Kachon、
− インキュベーション緩衝液：５０ｍＭ ＰＯ4、ｐＨ７．０、１％ＢＳＡ、１．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％正常ヒト血清、０．１％Kathon。
【０１１９】
黒色の９６穴ウェルマルチディッシュの各ウェルに、以下の順序で加える：
− ０．５μｇ／ｍｌの濃度で接合体緩衝液中に希釈された１００μｌのCSG06-クリプテート接合体
− ５μｇ／ｍｌの濃度で接合体緩衝液中に希釈された１００μｌのCSG30（またはCSG33)-ＡＰＣ接合体、並びに
− インキュベーション緩衝液中に希釈された１００μｌのキャリブレーターまたはアッセイされるサンプル。
【０１２０】
それらを３７℃で１時間インキュベーションし、次いで各ウェルの蛍光を、Clin. Chem. 39, 1993, 1953-1959頁[14]中のMathisによって記載されたように測定装置で６２０および６６５ｎｍについて測定する。
【０１２１】
得られた結果が図６に示され、検出されたシグナルに対するＣｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【０１２２】
かくして抗体CSG06及びCSG30（またはCSG33)を使用して実施されたアッセイの感度は１．５ｎｇ／ｍｌであり、イントラアッセイ変数係数は１５．７ｎｇ／ｍｌのＣｇＡ濃度について２．８８％、５０ｎｇ／ｍｌの濃度について１．５％、５０ｎｇ／ｍｌを越えるあらゆる濃度について１％未満である。インターアッセイ変数係数は、７０ｎｇ／ｍｌのＣｇＡ濃度について１．２％（ｎ＝１１アッセイ）、４０９ｎｇ／ｍｌの濃度について１．７％（ｎ＝１０）である。
【０１２３】
混在断片を含まない精製組換えヒトＣｇＡの所定量を有する周知のＣｇＡ濃度の病的な血清サンプルＡからＨをオーバーロードすることによって、リカバリー試験を実施する。リカバリーの速度を、このアッセイで測定されたヒトＣｇＡ濃度と混合物の理論的濃度の間の比を測定することによって計算した。この試験の結果が表４に示される。得られたリカバリーのレベルは、９３．４％から１０６％の間に存し、このアッセイのために選択された抗体が病的サンプルに含まれる一ＣｇＡと、混在断片を含まない精製組換えヒトＣｇＡの間の認識を同定可能であることを示す。
【０１２４】
１００の正常サンプルと、神経内分泌型の腫瘍の病理に罹患している患者から得た９５のサンプルについて、抗体CSG06とCSG33を使用して、実施例２に記載されたＩＲＡＭアッセイと実施例３のＦＩＡアッセイの間の相関関係を調べた。その結果が図７に示される。得られた直線の等式は、ｙ＝０．８９６４ｘ＝４２．０５に一致し、得られた測定値の係数は０．９７７６である。
【０１２５】
１００の正常サンプルと９５の病的サンプルの比較研究の結果が図８及び表５に示され、該結果はこれらの二つのサンプルの型の間で良好な識別を示し、実施例３に記載されたＦＩＡアッセイ(CSG016/CSG33)と実施例2のＩＲＭＡアッセイ(CSG06/CSG30)との間の顕著な一致を示す。この一致は、配列番号１アミノ酸２１９から２３４に対して向けられたCSG06と関連した配列番号１アミノ酸１４５から１９７に対して向けられた抗体を使用する重要性を確認する。
【０１２６】
【参考文献】
【０１２７】
【表１】
【０１２８】
【表２】
１）Ｘａａ＝未決定のアミノ酸
２）配列を合成ペプチドを使用して特定した。認識された配列が実際に配列番号１アミノ酸２１９から２３４に制限されることを示すことができた。
３）また、抗体CSG20が配列番号１アミノ酸２５０から３０１（ヒトパンクレアスタチン）に相当するより制限されたエピトープを認識することは測定できた。
【０１２９】
【表３】
【０１３０】
【表４】
【０１３１】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、成熟ヒトＣｇＡの４３９アミノ酸の配列番号１を説明する。
【図２】 図２は、タンパク質溶解によって得られる断片、及びヒトＣｇＡのタンパク質（配列番号１）上のその位置と共に、ヒトＣｇＡのアミノ酸配列を単純化して説明する。そこに示された星印及び数字は、二塩基性切断部位を示す。いくつかのエピトープに対して向けられた抗体が、その下に挙げられる。
【図３】 図３は、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃによるタンパク質溶解の後の組換えヒトＣｇＡの高速液体クロマトグラフィーの間で得られたスペクトルを示す。
【図４】 図４は、本発明に従った競合的アッセイ（ＲＩＡ）によって試験された各種の集団の配置を示す図である。試験されたケースの数が、各アッセイグループの上部に示される。直線は、各アッセイグループに対する平均値を示す。
【図５】 図５は、各種の抗体を使用した競合的アッセイと比較した、３種のサンドイッチアッセイで得られた結果を説明する図である。その結果は、正常な集団（ｎ＝２０）の９５パーセントの値に対する病的な血漿濃度の比の形態で表される。直線は、各アッセイグループの平均値を示す。
【図６】 図６は、本発明に従った同種相を使用した、検出された蛍光（Ｆ）に対するサンプルのヒトＣｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）に関して得られた曲線を示す。
【図７】 図７は、ＣｇＡのＦＩＡ及びＩＲＭＡアッセイで得られた結果（ｎｇ／ｍｌ）の間の相関関係を説明する図である。
【図８】 図８は、図２及び３のＩＲＭＡ及びＦＩＡを使用した正常サンプル及び病的サンプルで得られたＣｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明の主題は、ヒトクロモグラニンＡのイムノアッセイのための方法であり、該方法を使用して、完全な形態のクロモグラニンＡだけでなく、このクロモグラニンＡの主要な断片をもアッセイすることが特に可能である。
【０００２】
上記アッセイは、例えばクロム親和性細胞腫及び腸カルチノイドのような、病理の診断及び治療のために得に使用できる。
【０００３】
【従来の技術】
クロモグラニンＡ（ＣｇＡ）は、４８ｋＤａの分子量、４．９のｐＩを有するタンパク質であり、そのヒトでの形態は、参考文献[1]中で、Konecki等, 1987に記載されているように４３９アミノ酸を含む。それは、構造的及び生理学的共通性を有するグラニンのファミリーに属する。ＣｇＡはクロモグラニンＢと同様に、主要な機能を前提とする顕著な種間保存性を示す。ＣｇＡは内分泌細胞及び神経内分泌細胞の分泌促進薬において主に表され、他のグラニンと共に上記細胞の主要な構成成分の一つを形成する。それはまた、副腎におけるカテコールアミンのような他の分子の共分泌の調節エレメントとしてこのレベルで機能する。
【０００４】
ＣｇＡはまた、小球内及びマトリックス外タンパク質溶解性分解に引き続き、活性ペプチドの放出を介して必須のプロホルモン機能を果たす。
【０００５】
添付した図１において、配列番号１は、ヒトクロモグラニンＡに相当する、Konecki等によって記載された４３９アミノ酸を示す。
【０００６】
図２は、単純な様式でこの配列を示し、この図において、ヒトにおいて放出され得るペプチドのいくつか：バソスタチン／βグラニン、クロモスタチン、パンクレアスタチン、パラスタチン、及びプロクロマシンを表す。タンパク質溶解は、図２中で数字で示され星印で表された二塩基部位で作用し、該部位はＣｇＡ配列中に配置され、ヒトＣｇＡ中で全部で１０個存在する。このタンパク質溶解は、タンパク質のそれぞれの末端部位で周期的な現象として記載されており、それは組織特異的で、生産されるペプチドの組織配置の実質的な差異を導くことが示されている。それ故、タンパク質溶解の強度とタイプは、組織、血液循環、及び尿で見出される断片の顕著な可変性に関与する。
【０００７】
参考文献[2]のCorti等による最近の研究により、クロム親和性細胞腫に罹患している患者において、患者によって異なる構造及び異なる割合の循環形態が存在することを示すことによって、この多様性が確認された。同様な方法で、WE-14ペプチドに関する研究を通じて、ＣｇＡが膵臓の腸管の正常組織及び腫瘍性組織において、異なる態様でタンパク質溶解されることが示されている。
【０００８】
正常組織及び相当する腫瘍組織における検出に加えて、数多くの研究により、ＣｇＡのアッセイにおける診断上の利点が見出されている。循環ＣｇＡの濃度は、クロム親和性細胞腫、カルチノイド、及び内分泌膵臓腫瘍の場合に顕著に高い。このデータは、他の病理：神経芽腫、腸管の腫瘍、本態性高血圧症で確認され、拡張されている。ＣｇＡの存在は、アルツハイマー病を含む数多くの神経変性病理において示されている(Munoz, Lab. Invest., 1991, vol.64, 826-832頁[15]を参照）。著者の中には、前立腺のガンにおけるＣｇＡの存在が、腎臓ガンの場合と同様に、好ましくはない発達の徴候として存在し得ることを示してもいる。それ故ＣｇＡのアッセイは、主要な利点を提供する。
【０００９】
文献US-A-4 758 522[3]は、ＣｇＡのイムノアッセイを記載し、その場合抗ヒトＣｇＡ抗体の部位に対するラジオラベルＣｇＡを使用する競合的アッセイによって、ＣｇＡを測定する。
【００１０】
参考文献[4]においてSyversen等は、配列番号１アミノ酸２１０から４３９に相当するＣｇＡのＣ末端断片に対して向けられた抗体を使用するＥＬＩＳＡ法でのクロモグラニンＡのアッセイ、並びにパンクレアスタチンのラジオイムノアッセイを記載している。
【００１１】
参考文献[2]においてCorti等はまた、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸８１から９０及び配列番号１アミノ酸６８から７０に対して向けられたモノクローナル抗体を使用するＣｇＡの二つのアッセイを記載している。
【００１２】
それ故これらのアッセイは、いくつかのＣｇＡ断片を考慮しているが、該アッセイの結果に対する病理型の差異は許容していない。
【００１３】
実際に、分子のタンパク質溶解及び循環断片の多様性は、これらの分子の多様性を検出可能なアッセイ構成を必要とする。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は正に、循環血液中で見出される完全なＣｇＡの濃度及び腫瘍断片の濃度を測定するＣｇＡイムノアッセイの方法である。
【００１５】
【課題を解決するための手段】
本発明に従って、サンプル中に存在するヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）に対するイムノアッセイ法は、ヒトＣｇＡのＮ末端から（配列番号１）アミノ酸１４５から２８４位に亘る、アミノ酸配列番号２に位置するエピトープに特異的に結合する少なくとも一つのモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含む。
【００１６】
本発明に従って、用語、イムノアッセイは、例えば競合的アッセイ、サンドイッチ法を使用するアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡアッセイ、及び抗体−抗体反応を使用するあらゆる他のアッセイのような、同種相または異種相での全てのタイプのイムノアッセイを包含する。
【００１７】
本発明の第一の実施態様に従って、イムノアッセイは、上記抗体の部位に対する、サンプルのクロモグラニンＡと所定の量のラベル化ヒトクロモグラニンＡ（ｈＣｇＡ）との間の競合的アッセイである。
【００１８】
このアッセイを実施するために、アッセイされるサンプルに対し、一定量のラベル化ヒトＣｇＡと、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４に位置するエピトープに対して特異的に結合する抗体を加え、次いでインキュベーションする。この態様において、競合的条件は、この抗体の部位に対するサンプルＣｇＡとラベル化ＣｇＡとの間で規定される。アッセイがラベルとして放射性同位元素を使用する異種相で実施される場合、適切な抗体を使用して免疫沈降によって形成される抗体−ｈＣｇＡ複合体を分離可能である。次いで形成された複合体の放射性活性を測定することによって、周知のＣｇＡ濃度を有するスタンダードサンプルから得られた標準曲線を参考として、サンプルのＣｇＡ濃度を測定可能である。
【００１９】
例えばラベル化ｈＣｇＡ及び該ラベル化ｈＣｇＡによって放射されるシグナルを調節可能な抗体を使用する、同種相でアッセイを実施することもまた可能である。
【００２０】
このアッセイにおいて、使用される抗体は有利には、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４中に位置するエピトープに特異的な抗体、またはヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９７中に位置するエピトープに特異的な抗体である。これらの抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
【００２１】
このアッセイを実施するために、スタンダードサンプル及びラベル化ＣｇＡの調製は、ヒト起源の内分泌細胞または神経内分泌細胞から得た精製ＣｇＡ、または好ましくは組換えヒトＣｇＡを使用してもよい。
【００２２】
本発明の第二の実施態様に従って、イムノアッセイは、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置する第一のエピトープに特異的に結合する第一のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と、並びにヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置する第一のものとは異なる第二のエピトープに特異的に結合する第二のモノクローナルまたはポリクローナル抗体で、二つの抗体の一方がラベルされているものを使用するサンドイッチタイプのアッセイである。
【００２３】
本発明のこの第二の実施態様において、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５か ら１９７中に位置する異なるエピトープに特異的な二つの抗体が使用される。このアッセイは、固相上に第一の抗体を固定し、第二のラベル化抗体を使用することによって異種相で実施されてもよい。
【００２４】
このアッセイはまた、第一のラベル抗体と、該抗体によって放射されるシグナルを調節可能な第二の抗体とを使用する、同種相で実施されてもよい。
【００２５】
例として、第一の抗体は、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９７中に位置するエピトープに特異的であり得、第二の抗体は、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４中に位置するエピトープに特異的であってもよい。
【００２６】
このアッセイにおいて、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４中に位置するエピトープに特異的な第一の抗体と、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９７中に位置するエピトープに特異的な第二の抗体とを使用することも可能である。
【００２７】
本発明の第三の実施態様に従って、イムノアッセイは、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置するエピトープに特異的に結合する第一のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２５０から３０１中に位置する第二のエピトープに特異的に結合する第二のモノクローナルまたはポリクローナル抗体で、二つの抗体の一方がラベル化されているものを使用するサンドイッチアッセイである。
【００２８】
本発明のこの実施態様において、アッセイは、固相に固定した第一の抗体と、第二のラベル化抗体とを使用する、またはその逆である、異種相で実施されてもよい。第一のラベル化抗体と、該抗体によって放射されるシグナルを調節可能な第二の抗体を使用する、またはその逆である、同種相でアッセイを実施することも可能である。
【００２９】
第一の抗体として、有利にはヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９４に特異的な抗体が使用され、またはヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４に特異的な抗体が使用される。
【００３０】
本発明の方法は、クロム親和性細胞腫またはカルチノイド腫瘍に罹患している患者から得た血清と正常な血清との間の陽性の識別が可能であるため、クロム親和性細胞腫またはカルチノイド腫瘍のような病理の診断及び治療に対して特に有利である。
【００３１】
本発明の方法を実施するために、異種相における従来のイムノアッセイ法が使用でき、それは過剰なラベル化抗体からＣｇＡ−抗体複合体の分離が可能である。
【００３２】
本発明の方法において、上記分離を含まない異種相アッセイ法を使用することも可能である。
【００３３】
異種相アッセイ法は、抗体−抗原のペアまたは二つの抗体のペアの使用に基づき、それらが互いに近接する場合、別個に放射するものとは異なるシグナルを放射する。
【００３４】
この目的のために、発光性エネルギーアクセプター化合物に結合された抗体、及び発光性エネルギードナー化合物に結合された抗体が、特に使用可能である。
【００３５】
例として、発光性エネルギーアクセプター化合物は、アロフィコシアニンであり得、発光性エネルギードナー化合物は、EP-A-0 321 353[II]に記載されたもののようなユウロピウムクリプテートであり得る。
【００３６】
特に興味深い一つの同種相アッセイ法は、参考文献[4]に記載されたTRACE（登録商標）法である。
【００３７】
異種相アッセイに関しては、アッセイで使用される非ラベル化抗体が固定されている固相を使用する。
【００３８】
使用可能な固相は、各種のタイプが存在し得る。例えば、ポリマーまたは他の材料より成るチューブ、ビーズまたはフィンを形成する巨視的固相が使用され得る。
【００３９】
使用可能なポリマーは、例えばポリスチレン、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリオキシメチレン、及びスチレンコポリマーである。
【００４０】
例えばポリマー、タンパク質または他の材料より成るパウダー及びアグリゲートといった、均一に分割された微視的な固相を使用することも可能である。
【００４１】
本発明の下で、本発明の第一の実施態様におけるＣｇＡ、及び第二の実施態様における各種の抗体に対して適用される用語、「ラベル化」は、ＣｇＡまたは抗体が、例えば放射性同位元素、蛍光性エレメント、発光性エレメント、酵素、蛍光性クロモフォア、光吸収性クロモフォア、または直接的若しくは間接的に定量的測定が可能であるあらゆる他のリガンドであってもよいラベリングエレメントによって修飾されていることを意味する。
【００４２】
本発明はまた、ヒトクロモグラニンの配列番号１アミノ酸１４５から１９７若しくは配列番号１アミノ酸２１９から２３４のそれぞれに位置するエピトープに特異的なモノクローナル抗体、並びに検出可能なラベルに結合した若しくは固相に固定された抗体の一つを含む免疫学的試薬に関する。
【００４３】
これらの抗体は、全てのタイプのアッセイに適しているため特に興味深い。それらは、従来のラベル（放射性同位元素等）で実施されるアッセイだけでなく、一般的に特定の抗体に関してのみ使用できるクリプテート及びアロフィコシアニンの蛍光ラベルで実施されるアッセイにおいても、良好な結果を与える。
【００４４】
本発明はまた、上述のモノクローナル抗体を含むヒトＣｇＡのためにイムノアッセイキットに関する。
【００４５】
それはまた、
− 第一の抗体、並びに
− 第二の抗体
を含み、二つの抗体の少なくとも一つは、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置するエピトープに特異的な抗体であるものを含む、ヒトＣｇＡのためのイムノアッセイキットに関する。
【００４６】
キットの第一の実施態様に従って、第一の抗体及び第二の抗体は、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸配列１４５から１９７及び／または配列番号１アミノ酸２１９から２３４中に位置するエピトープに特異的な抗体の中から選択される。
【００４７】
キットの第二の実施態様に従って、抗体の一つは、配列番号１アミノ酸１４５から１９７または配列番号１アミノ酸配列２１９から２３４中に位置するエピトープに特異的であり、他の抗体は、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２５０から３０１中に位置するエピトープに特異的である。
【００４８】
好ましくは、キットが異種相アッセイについて企図される場合、抗体の一つは固相に固定化され、他の抗体は検出可能なラベルに結合される。
【００４９】
検出可能なラベルは、例えばヨウ素１２５である。
【００５０】
好ましくは、キットが同種相で企図される場合、抗体の一つは発光性エネルギードナー化合物に結合され、他の抗体は発光性エネルギーアクセプター化合物に結合される。
【００５１】
別法として、発光性エネルギードナー化合物はユウロピウムクリプテートであり、発光性エネルギーアクセプター化合物はアロフィコシアニンである。
【００５２】
それはまた、ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置するエピトープに特異的な抗体を含む競合的イムノアッセイキットに関する。
【００５３】
このキットにおいて、抗体は好ましくは、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４、または配列番号１アミノ酸１４３から１９７中に位置するエピトープに特異的である。
【００５４】
本発明に従って、アッセイのために使用される抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。
【００５５】
ポリクローナル抗体は、ヒトＣｇＡのタンパク質溶解またはペプチド合成によって得られたヒトクロモグラニンＡのペプチド断片から、in vivo若しくはin vitro免疫化によって得ることができる。この場合、動物において抗体を得るために、膝靱帯ヘモシアニン（ＫＬＨ）のようなベクタータンパク質にペプチド断片を結合することが必要である。
【００５６】
モノクローナル抗体は、Nature, 1975, 256, 495-497頁に記載されたK, Kohler及びC. Milsteinによる方法を使用して、ハイブリドーマから生産できる。この場合、一つ以上のマウス免疫化を、全体のクロモグラニンＡ若しくは所望のエピトープに相当するペプチド断片で、キャリアータンパク質と会合させて実施し、次いでその動物の脾臓を摘出し、細胞融合を脾臓細胞とミエローマ細胞の間で実施する。次いで生産されたハイブリドーマをスクリーニングし、ヒトＣｇＡのエピトープに特異的な抗体を生産するクローンを選択する。
【００５７】
好ましくは、本発明に従って、モノクローナル抗体が使用される。
【００５８】
本発明の他の特徴及び利点は、以下に記載の実施態様の例を読むことでより明確となり、これらの実施例は、添付された図面を参考にして、明白に説明の目的で、非制限的な目的を有するものである。
【００５９】
以下の記載は、ヒトＣｇＡの各種の異なるエピトープに対して向けられたモノクローナル抗体の調製、並びにヒトクロモグラニンＡのイムノアッセイに適した抗体の選択を説明する。
【００６０】
【発明の実施の形態】
１）モノクローナル抗体の調製
１．ヒトＣｇＡの単離及び精製
参考文献[6]においてO'Connorによって記載された方法を、クロム親和性細胞腫に罹患している患者のヒト副腎から得たｈＣｇＡを精製するために使用する。該タンパク質の最終分離は、参考文献[7]に記載され、参考文献[8]に記載されたようにBader及びAunisによって修飾されたO7Farrelがオリジナルの方法を使用して、二次元ゲル上での電気泳動によって実施される。ＣｇＡをゲルから電気溶出する。組換えヒトＣｇＡ（ｒｈＣｇＡ）はまた、参考文献[9]においてTaupenot等によって記載された大腸菌BL21 (DE3)のｒｈＣｇＡ発現株を使用して生産される。
【００６１】
２．精製ＣｇＡのラベリング（125Ｉ−ｈＣｇＡ）
天然及び組換えＣｇＡを、１５００ｋＢｑ／μｇの特異的活性で、Hunter及びGreenwoodのクロラミンＴ法を使用して、Ｎａ125Ｉでラベルする。有利ヨウ素を、Sephadex-G25ゲル(Pharmacia Biotech)での濾過によって除去する。ラジオラベルタンパク質の分画を混合し、４５ｎｍｏｌ／ｌのＮａ3Ｎ、０．５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むｐＨ７．２のＰＢＳ中に希釈する。
【００６２】
３．免疫化
６から８週齢のBalb/cマウスを、フロイント完全アジュバント中で事前に得られた精製ｈＣｇＡまたはｒｈＣｇＡの１０ｍｇで腹膜内経路によってそれぞれ免疫化する。引き続き腹膜内投与を、一ヶ月間隔で不完全フロイントアジュバント中で実施する。マウスの免疫化の確認を、事前に得られた125Ｉ−ｈＣｇＡでの免疫沈降での血清滴定によって実施する。
【００６３】
４．ハイブリドーマの生産及びスクリーニング
マウスを引き続き、０．９％ＮａＣｌ溶液中に１０ｍｇのｈＣｇＡで、静脈内経路によって注射し、その三日後に細胞融合を実施する。脾臓細胞を単離し、３７％ポリエチレングリコール（分子量１５４０）の存在下でP3-X63-Ag 8.653ミエローマ細胞と融合する。
【００６４】
陽性クローンを、125Ｉ−ｈＣｇＡでの免疫沈降によって同定する。陽性クローンから由来する抗体を、マウス腹水を使用して生産し、セファロース−プロテインＡゲルを使用して精製する。
【００６５】
ｈＣｇＡに対して免疫化されたマウスで、１１の融合物を生産した。二つのみが成功し、８のクローンを生産した。組換えｈＣｇＡタンパク質に対して免疫化された動物での二つの融合物は、１６の第二世代クローンを生産した。以上より、２から３２３６ｎｇ／ｍｌまで変化する濃度を有する１７のＩｇＧ１、６のＩｇＧ２ａ及び１のＩｇＧ２ｂを、特徴付けのため生産した。
【００６６】
５．モノクローナル抗体の同定
各種のファミリーのＣｇＡエピトープを、製造者の説明書に従って、Biacore（登録商標）装置で抗体の考え得る組み合わせを試験することによって同定した。試験された全ての抗体を、５０ｍｍｏｌ／ｌのＨＥＰＥＳ、１５ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、０．７５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４中に希釈し、５０ｍｇ／ｍｌの割合で注射した。同じ緩衝液を、２０ｍｇ／ｍｌに希釈した組換えヒトＣｇＡについて使用した。
【００６７】
Biocoreでのこの分析は、試験された２４の抗体を、表１に示されたような８のエピトープグループに分割されるという結果を導いた。それにも関わらず、グループの一つ（３グループ）は、このグループの抗体の間に存在する部分的阻害のため、さらにサブグループに分割され得る。
【００６８】
固定化抗体−ｒｈＣｇＡ反応の化学量論は、０．１５７から０．６２１抗原のモル／抗体のモルまで変化する（表１参照）。
【００６９】
各グループまたはサブグループ中の抗体は、推測的に同じ配列の認識を示す。
【００７０】
６．組換えヒトＣｇＡ（ｒｈＣｇＡ）から由来するペプチドでの抗体の同定
２ｎｍｏｌのｒｈＣｇＡを、１００ｎｍｏｌｅ／ｌのＴＲＩＳ−ＨＣＬ、ｐＨ８．３中に１０００：１の割合のタンパク質／プロテイナーゼでＬｙｓ−Ｃエンドプロテイナーゼで３７℃で２時間切断させた。
【００７１】
次いで生産されたｒｈＣｇＡから由来するペプチドを、Machereyゲルカラム、NAGEL 300-5C18 (250mm×4mm)でのＨＰＬＣによって分離する。吸光度を２１４ｎｍで測定し、水中の０．１％トリフルオロ酢酸を溶媒系（溶媒Ａ）として使用し、アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸を溶媒Ｂとして使用する。ペプチドを、溶媒Ａ中の溶媒Ｂの連続的な勾配、０から２５％で１０分、２５から７５％で５０分を使用して０．７ｍｌ／分の速度で溶出する。各ピーク分画を回収し、完全に乾燥させることなく蒸発によって濃縮する。
【００７２】
図３は、１から６まで数字を付された時間の関数としてのカラムから溶出され回収された分画を説明する。
【００７３】
精製ペプチドの配列を、Applied Biosystems社製の４７３Ａミクロシークエンサーでのエドマン自動分解によって決定する。ＨＰＬＣ精製サンプルを、ポリブテンで予備回転され処理されたガラスファイバーフィルターに乗せる。アミノ−フェニルチオヒダントイン酸を、Ｃ−１８カラム(PTH C-18, 2.1mm×200mm)でのクロマトグラフィーによって同定する。マススペクトロメトリーによる分析を、参考文献[10]においてGoumon等によって記載された方法を使用して実施する。
【００７４】
これらの分画を、事前に得られたモノクローナル抗体を同定するために使用する。この目的のため、当量部分の分画を、ニトロセルロースシート上に分割する。メンバーを迅速にＮａＣｌ／Ｐｉ（０．９％ＮａＣｌを含む２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５）で洗浄し、ＮａＣｌ／Ｐｉ中に１／１０００に希釈されたモノクローナル抗体で室温で２時間インキュベーションさせる。
【００７５】
第二の抗体は、アルカリホスファターゼを接合した抗マウスＩｇＧである。酵素反応を、０．４ｍｍｏｌ／ｌのテトラゾリウムニトロブルー及び０．３８ｍｍｏｌ／ｌの5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルホスファートを含む、１００ｍｍｏｌ／ｌのＴＲＩＳ−ＨＣＬ、ｐＨ８．５、１００ｍｍｏｌ／ｌのＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2中で生じさせる。
【００７６】
表１の各グループのモノクローナル抗体、即ち、事前に生産された抗体CSG04, CSG06, CSG10, CSG30, CSG17, CSG21及びCSG32を、高速液体クロマトグラフィーによって分離されたｒｈＣｇＡ断片の各当量の分画に対して試験する。
【００７７】
表２は、各種の分画とこれらの分画を認識する抗体との間の相関関係を説明する。表２はまた、各分画において単離された断片の質量、そのクロモグラニンＡのＮ末端からの位置、及びそのＮ末端配列を示す。抗体CSG17及びCSG21は、配列番号１アミノ酸３３９から３５５及び３５６から４００の領域に対して高い特異性を有するタンパク質のＣ末端ドメインを認識する。抗体CSG04及びCSG10をウエスタンブロットによって直接試験し、免疫検出された断片はＣｇＡのＣ末端領域（配列番号１アミノ酸３４０から３９４及び３９５から４３９）に位置する。
【００７８】
抗体CSG06, CSG20及びCSG30はタンパク質の配列番号１アミノ酸１４５から２３４に特異的であり、それぞれ配列番号１の断片アミノ酸１９８から２４５，２４６から３０３及び１４５から１９７に相当する。最後に、抗体CSG32は、配列番号１アミノ酸１０から４００に亘る主要な断片と強力に反応することに注意すべきである。各種のＣｇＡ領域を認識する他の断片と会合するこの抗体の挙動を考慮すると、それは配列番号１アミノ酸１４５から２３４をより特異的に認識するようである。
【００７９】
平行して、抗体CSG06のエピトープの配列を、合成ペプチドによって特定した。配列番号１アミノ酸１９８から２４５は、高い割合のグルタミン酸を示し、部分的に親水性で部分的に免疫原性である領域である。特にそれは、９の連続的なグルタミン酸（配列番号１アミノ酸２１０から２１８）の第一の領域を含み、とりわけ二つのプロリンによって隣接される３のグルタミン酸の配列（配列番号１アミノ酸２２７から２３２）を含む。配列番号１アミノ酸２０７から２３４及び２１９から２４５に相当するＮ末端部分でビオチン化された二つのペプチドを合成した。これらのペプチドを、ストレプタビジンで事前に皮膜されたチューブに固定化した。ラジオラベル抗体CSG30, CSG06及びCSG20（２ｋＢｑ／ｍｌ）を、各ペプチドで振動した条件の下で室温で４時間インキュベーションした。次いでチューブを洗浄し、カウントした。二つの抗体CSG20及びCSG30は、二つのペプチドのそれぞれを認識しない。一方で、CSG06は、両者の配列に対して顕著な固定を示す。それ故、最小の推定される配列は、配列番号１アミノ酸２１９から２３４に相当し、上述のポリグルタミン酸（配列番号１アミノ酸２２７から２３２）部位を包含する。
【００８０】
同様な態様で、CSG20のエピトープを、パンクレアスタチンの配列に関して特定した。この場合、パンクレアスタチンに相当する合成ペプチド（ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２５０から３０１）を、以下の免疫放射線アッセイの第二のインキュベーションにおいて、増大する量で加えた：CSG06/CSG30★及びCSG06/CSG20★。前者の場合、シグナルの阻害は検出されず、CSG06とCSG30の両者が配列 番号１アミノ酸２５０から３０１を認識しない証拠を提供した。一方でCSG06/CSG20★の場合、加えたペプチドの量が増大すると増大する阻害が得られる（チューブ当たり０．５μｇのペプチドに対して８６％の阻害）。それ故、CSG20は、パンクレアスタチンに相当する配列である、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２５０から３０１をよく認識する。
【００８１】
図２は、クロモグラニンＡの全分子に対するこれらの抗体の位置を示し、これらの抗体によって認識される配列も示す。
【００８２】
本発明に従って、抗体CSG06, CSG20及びCSG30（またはCSG33)は、再生産可能で正確な特異的イムノアッセイを実施することを可能にすることが見出された。抗体CSG30（またはCSG)は、競合的イムノアッセイのために使用できるであろう。
【００８３】
抗体CSG06, CSG20及びCSG30（またはCSG33)は、サンドイッチタイプのアッセイを実施するためにペアを形成できるであろう。
【００８４】
以下の実施例は、このタイプのアッセイを説明する。
【００８５】
【実施例】
実施例１：ヒトクロモグラニンＡのラジオイムノアッセイ
この実施例において、アッセイのために使用される抗体は、クロモグラニンＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４に特異的なCSG06である。このアッセイを実施するために、組換えヒトクロモグラニン（ｒｈＣｇＡ）のスタンダードサンプルを調製し、正常ヒト血清中に希釈した。スタンダードサンプルのｒｈＣｇＡ濃度は、０から１６００ｎｇ／ｍｌの範囲である。
【００８６】
さらに、ヨウ素１２５でラベルしたｒｈＣｇＡを、以前に記載されたように使用する。
【００８７】
このアッセイを実施するために、スタンダードサンプル及びアッセイされるサンプルの５０ｍｌチューブに対して、チューブ当たり２ｋＢｑの割合でラジオラベルされた３００μｌのｈＣｇＡ、及び８０ｎｇ／ｍｌに精製されたCSG06抗体の１５０ｍｌ溶液を加える。第一のインキュベーションを、穏やかに攪拌しながら室温で２４時間実施する。次いで結合複合体を、ＰＢＳ及び５０ｍｌの正常ヒト血清中に１−１０に希釈されたヒツジ抗マウスイムノグロブリンの７５μｌを加えることによって、室温で２０分分離する。１ｍｌの６％ポリエチレングリコール（分子量６０００）を加え、沈降した複合体を１５分２０００ｇでの遠心分離により分離する。次いでその放射性活性を、ガンマカウンターで測定する。
【００８８】
スタンダードサンプルから標準曲線が得られ、アッセイされたサンプルのクロモグラニンＡ濃度を、この標準曲線で見出された値に乗せることによって決定する。
【００８９】
スタンダード０での測定再現性によって決定された検出限界（１０回の測定当たりＢｍａｘ−２σ）は、１４ｎｇ／ｍＬで計算された。２４３及び４５０ｎｇ／ｍＬの濃度を有する２種の血清の１０の点でのアッセイにより、二つのサンプルについて０．９％の内挿アッセイの正確性を評価することが可能であった。平行して、３種の異なる実験でのこれらの同じ血清に対するアッセイによって作製された内挿アッセイの正確性試験は、それぞれ４．５及び６．４％のＶＣを示す。
【００９０】
このアッセイを、健康な患者から得た４６のＥＤＴＡ血漿と、クロム親和性細胞腫または他の疾患に罹患している患者から得た２１１の他の血清のシリーズで試験した。
【００９１】
図４は、試験された各種の血漿に対するこのアッセイで得られた結果を示す。この図において、病気の性質と各グループの患者のケースの番号が示される。
【００９２】
正常な集団と各他の集団のペアを比較する分散分析により、各場合においてＣｇＡ濃度が病的な血漿で顕著に高いことが示される（ｐ＜０．００１）。一方で、各種のグループの血漿を、非神経内分泌ガン患者から得た血漿のシリーズと比較すると、分析により小細胞肺ガン（ＳＣＬＣ）または非小細胞肺ガン（ＮＳＣＬＣ）に関するグループは、参考集団と顕著に異なることが示される（それぞれｐ＝０．２８６３及び０．１７９８）。研究された他のグループは、特にカルチノイド及びクロム親和性細胞腫（ｐ＜０．００１）、並びにＡＰＵＤ腫瘍及び神経内分泌腫瘍（ｐ＜０．００１）で顕著により高いＣｇＡ値を示す。
【００９３】
このアッセイにおいて、見出されたＣｇＡ濃度は、以下のものである：
− 健康な患者から得た血漿のプール（ＮＰ）について４０ｎｇ／ｍｌ
− クロム親和性細胞腫に罹患している患者から得た血漿のプール（ＰＰ）について６７５ｎｍ／ｍｌ、並びに
− 腸カルチノイド腫瘍に罹患している患者から得た血漿のプール（ＣＰ）について１６００ｎｇ／ｍｌ。
【００９４】
実施例２：サンドイッチ法（ＴＲＭＡ法）を使用したクロモグラニンＡのアッセイ
このアッセイのために、二つの異なる抗体を使用する。第一の抗体は、配列番号１アミノ酸２１９から２３４に特異的な抗体CSG06であり、第二の抗体は、配列番号１アミノ酸１４５から１９７に特異的な抗体CSG30である。第一の抗体を、ＰＢＳ、ｐＨ７．５中に１０μｇ／ｍｌの濃度で準備し、ポリスチレンチューブをこの抗体で皮膜する。
【００９５】
第二の抗体を、ｒｈＣｇＡのラベリングについて上述したクロラミンＴ法を使用して、４００ｋＢｑ／μｇの特異的活性で、Ｎａ125Ｉを使用してヨウ素１２５でラベルする。スタンダードは、実施例１で上述したものと同様である。
【００９６】
アッセイで使用される緩衝液は、５０ｍｍｏｌ／ｌのＮａ2ＨＰＯ4／ＫＨ２ＰＯ4、１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ、１５ｍｍｏｌ／ｌのＮａＮ3、１％ＢＳＡ、ｐＨ７．０より成る。
【００９７】
各アッセイについて、１ｍｌのアッセイ緩衝液、及び５０μｌのスタンダードサンプルまたはアッセイされるサンプルを、CSG06抗体で皮膜されたチューブに加える。それらを室温で１８時間インキュベーションする。次いでチューブを２ｍｌの０．３％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で二度洗浄する。次いで１ｍｌのラベル化CSG30抗体を各チューブに加え、それらを穏やかに振動させながら室温で２時間インキュベーションする。チューブを上述のように再び洗浄し、その放射性活性をガンマカウンターで測定する。
【００９８】
実施例１と同様に、周知の濃度のスタンダードサンプルから較正曲線を得、アッセイされるサンプルのクロモグラニンＡ濃度を、スタンダード曲線を参考にして測定する。
【００９９】
アッセイの特異性をチェックするために、正常のプール（ＮＰ）並びにクロム親和性細胞腫（ＰＰ）または腸カルチノイド（ＣＰ）に罹患している患者からそれぞれ得たＥＤＴＡ由来の二つの病的プールについて実験を実施する。
【０１００】
この特異性は、病的プールＰＰまたはＣＰと正常プールＮＰの間のＣｇＡ濃度の比を測定することによって評価される。
【０１０１】
この実施例の場合、ＣｇＡ濃度比ＰＰ／ＮＰ及びＣＰ／ＮＰは以下のものである：
ＰＰ／ＮＰ＝９．９
ＣＰ／ＮＰ＝１８．２
【０１０２】
実施例１のアッセイについて、比は以下のものであった：
ＰＰ／ＮＰ＝１６．９
ＣＰ／ＮＰ＝４０
【０１０３】
比較のために、１２００ｎｇ／ｍｌでのスタンダードサンプルについて得られた結合パーセンテージは６５．５１である。
【０１０４】
それ故この抗体の組み合わせは、高いシグナルを得ることを可能にし、二つの病的プールの間を識別可能である。
【０１０５】
添付された表３において、各種の抗体のペアで同じサンドイッチアッセイを実施することによって得られた結果が示される。
【０１０６】
これらの結果は、共に関連するまたは抗体CSG20と関連する二つの抗体CSG06及びCSG30が、満足なシグナルを与え、二つの病的プールの間を識別可能であることを示す。
【０１０７】
比較のために、同じアッセイを表2の他の抗体を使用して実施したが、これらは満足な結果を生じなかった。
【０１０８】
それ故、もしCSG21またはCSG10を第二のラベル化抗体として使用するのであれば、ＰＰ／ＮＰ比が２以下であり、さらに１未満であるために、病的プールＰＰとプールＮＰの間を識別することは不可能である。
【０１０９】
CSG21/CSG06★、CSG21/CSG30★またはCSG32/CSG03★のような他の組み合わせは、二つの病的プールを識別できず、ＰＰ／ＮＰ及びＣＰ／ＮＰ比が近接するために、興味深くはない。
【０１１０】
図５は、本発明に従った実施例１及び２のイムノアッセイ、並びにCSG06/ラベル化CSG29★の組み合わせ及びCSG06/ラベル化CSG06★の組み合わせを使用した、実施例2のサンドイッチ法を用いる他のアッセイの結果を示す。二つの抗体CSG29及びCSG04は、ＣｇＡのＣ末端部分を認識する。抗体CSG29は、CSG10と同じエピトープを共有する。
【０１１１】
この図において、結果は、病的な血漿の濃度と正常集団の９５％の値（ｎ＝２０）９５％の値との間の比の形態で示される。直線は、各グループについての平均値を示す。
【０１１２】
この図は、同様な結果が実施例１及び２で得られることを示す。一方で、CSG06/CSG04★のペアに関して、相関関係が低下し、サンプルの特定数でＣｇＡ濃度が顕著に低下した。CSG06/CSG29★に関するアッセイにおいて、この現象はさらに強調され、非常に顕著な減少が測定された濃度で生じ、ＣｇＡ濃度は集団の５０％で検出不可能である。
【０１１３】
それ故、最適な結果は、本発明に従ったＣｇＡのアミノ酸１４５−２３４の配列番号2の抗体で得られる。
【０１１４】
実施例３：同種相サンドイッチ法及び蛍光（ＦＩＡ法）を使用したクロモグラニンＡのアッセイ
このアッセイのために、二つの異なる抗体を使用する。第一の抗体は、配列番号１アミノ酸２１９から２３４に特異的な抗体CSG06であり、第二の抗体は、配列番号１アミノ酸１４５から１９７に特異的な抗体CSG30（またはCSG33)である。第一の抗体CSG06を、エネルギードナー化合物であるユウロピウムクリプテートで接合した。
【０１１５】
第二の抗体CSG30（またはCSG33)を、エネルギーアクセプター化合物であるアロフィコシアニンで接合した。
【０１１６】
使用されるユウロピウムクリプテートは、クリプテートＥｕトリスビピリジンジアミン（ＴＢＰ（Ｅｕ2+）クリプテート）である。それは文献EP-A-321 353[II]に記載され、以下の式を有する：
【化１】
CSG06-クリプテート接合体を、Clin. Chem., 39, 1993, 196-201頁[12]中のLopez等によって記載された方法を使用して調製する。
【０１１８】
CSG30（またはCSG33)-アロフィコシアニン（ＡＰＣ）接合体を、WO92/01225[13]に記載された方法を使用して調製する。アッセイのために以下の緩衝液を使用する：
− 接合体緩衝液：５０ｍＭ ＰＯ4、ｐＨ７．０、０．１％ＢＳＡ、１．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１．５ｍＭ正常マウスイムノグロブリン、６００ｍＭ ＨＦ、０．１％Kachon、
− インキュベーション緩衝液：５０ｍＭ ＰＯ4、ｐＨ７．０、１％ＢＳＡ、１．５ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％正常ヒト血清、０．１％Kathon。
【０１１９】
黒色の９６穴ウェルマルチディッシュの各ウェルに、以下の順序で加える：
− ０．５μｇ／ｍｌの濃度で接合体緩衝液中に希釈された１００μｌのCSG06-クリプテート接合体
− ５μｇ／ｍｌの濃度で接合体緩衝液中に希釈された１００μｌのCSG30（またはCSG33)-ＡＰＣ接合体、並びに
− インキュベーション緩衝液中に希釈された１００μｌのキャリブレーターまたはアッセイされるサンプル。
【０１２０】
それらを３７℃で１時間インキュベーションし、次いで各ウェルの蛍光を、Clin. Chem. 39, 1993, 1953-1959頁[14]中のMathisによって記載されたように測定装置で６２０および６６５ｎｍについて測定する。
【０１２１】
得られた結果が図６に示され、検出されたシグナルに対するＣｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す。
【０１２２】
かくして抗体CSG06及びCSG30（またはCSG33)を使用して実施されたアッセイの感度は１．５ｎｇ／ｍｌであり、イントラアッセイ変数係数は１５．７ｎｇ／ｍｌのＣｇＡ濃度について２．８８％、５０ｎｇ／ｍｌの濃度について１．５％、５０ｎｇ／ｍｌを越えるあらゆる濃度について１％未満である。インターアッセイ変数係数は、７０ｎｇ／ｍｌのＣｇＡ濃度について１．２％（ｎ＝１１アッセイ）、４０９ｎｇ／ｍｌの濃度について１．７％（ｎ＝１０）である。
【０１２３】
混在断片を含まない精製組換えヒトＣｇＡの所定量を有する周知のＣｇＡ濃度の病的な血清サンプルＡからＨをオーバーロードすることによって、リカバリー試験を実施する。リカバリーの速度を、このアッセイで測定されたヒトＣｇＡ濃度と混合物の理論的濃度の間の比を測定することによって計算した。この試験の結果が表４に示される。得られたリカバリーのレベルは、９３．４％から１０６％の間に存し、このアッセイのために選択された抗体が病的サンプルに含まれる一ＣｇＡと、混在断片を含まない精製組換えヒトＣｇＡの間の認識を同定可能であることを示す。
【０１２４】
１００の正常サンプルと、神経内分泌型の腫瘍の病理に罹患している患者から得た９５のサンプルについて、抗体CSG06とCSG33を使用して、実施例２に記載されたＩＲＡＭアッセイと実施例３のＦＩＡアッセイの間の相関関係を調べた。その結果が図７に示される。得られた直線の等式は、ｙ＝０．８９６４ｘ＝４２．０５に一致し、得られた測定値の係数は０．９７７６である。
【０１２５】
１００の正常サンプルと９５の病的サンプルの比較研究の結果が図８及び表５に示され、該結果はこれらの二つのサンプルの型の間で良好な識別を示し、実施例３に記載されたＦＩＡアッセイ(CSG016/CSG33)と実施例2のＩＲＭＡアッセイ(CSG06/CSG30)との間の顕著な一致を示す。この一致は、配列番号１アミノ酸２１９から２３４に対して向けられたCSG06と関連した配列番号１アミノ酸１４５から１９７に対して向けられた抗体を使用する重要性を確認する。
【０１２６】
【参考文献】
【表１】
【表２】
２）配列を合成ペプチドを使用して特定した。認識された配列が実際に配列番号１アミノ酸２１９から２３４に制限されることを示すことができた。
３）また、抗体CSG20が配列番号１アミノ酸２５０から３０１（ヒトパンクレアスタチン）に相当するより制限されたエピトープを認識することは測定できた。
【０１２９】
【表３】
【表４】
【表５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、成熟ヒトＣｇＡの４３９アミノ酸の配列番号１を説明する。
【図２】 図２は、タンパク質溶解によって得られる断片、及びヒトＣｇＡのタンパク質（配列番号１）上のその位置と共に、ヒトＣｇＡのアミノ酸配列を単純化して説明する。そこに示された星印及び数字は、二塩基性切断部位を示す。いくつかのエピトープに対して向けられた抗体が、その下に挙げられる。
【図３】 図３は、エンドプロテアーゼＬｙｓ−Ｃによるタンパク質溶解の後の組換えヒトＣｇＡの高速液体クロマトグラフィーの間で得られたスペクトルを示す。
【図４】 図４は、本発明に従った競合的アッセイ（ＲＩＡ）によって試験された各種の集団の配置を示す図である。試験されたケースの数が、各アッセイグループの上部に示される。直線は、各アッセイグループに対する平均値を示す。
【図５】 図５は、各種の抗体を使用した競合的アッセイと比較した、３種のサンドイッチアッセイで得られた結果を説明する図である。その結果は、正常な集団（ｎ＝２０）の９５パーセントの値に対する病的な血漿濃度の比の形態で表される。直線は、各アッセイグループの平均値を示す。
【図６】 図６は、本発明に従った同種相を使用した、検出された蛍光（Ｆ）に対するサンプルのヒトＣｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）に関して得られた曲線を示す。
【図７】 図７は、ＣｇＡのＦＩＡ及びＩＲＭＡアッセイで得られた結果（ｎｇ／ｍｌ）の間の相関関係を説明する図である。
【図８】 図８は、図２及び３のＩＲＭＡ及びＦＩＡを使用した正常サンプル及び病的サンプルで得られたＣｇＡ濃度（ｎｇ／ｍｌ）を示す図である。
Claims (21)
- ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置するエピトープに特異的に結合する少なくとも一つのモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用する、サンプル中に存在するヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）に対するイムノアッセイ方法。
- 該アッセイが、同種相または異種相で実施される、請求項１記載の方法。
- 該イムノアッセイが、上記抗体の部位に対する、サンプルのクロモグラニンＡと所定量のラベル化クロモグラニンＡとの間の競合的イムノアッセイである、請求項１または２記載の方法。
- 抗体が、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４、またはヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９７中に位置するエピトープに特異的である、請求項３記載の方法。
- ラベル化クロモグラニンＡが、放射性同位元素、発光性エレメント、酵素、蛍光性クロモフォア、光吸収性クロモフォア、及び直接的または間接的定量的測定が可能なあらゆる他のリガンドでラベルされる、請求項３または４記載の方法。
- 該イムノアッセイが、ヒトＣｇＡの第一のエピトープに特異的に結合する第一のモノクローナルまたはポリクローナル抗体と、第一のものとは異なるヒトＣｇＡの第二のエピトープに特異的に結合する第二のモノクローナルまたはポリクローナル抗体を使用し、少なくとも一つのエピトープが、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置し、二つの抗体の一方がラベルされているサンドイッチ型のイムノアッセイである、請求項１または２記載の方法。
- 第一及び第二の抗体が、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９７、及び／またはヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４中に位置するエピトープに特異的な抗体から選択される、請求項６記載の方法。
- 第一の抗体が、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５からアミノ酸１９７，またはヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９からアミノ酸２３４中に位置するエピトープに特異的であり、並びに第二の抗体が、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２５０から３０１中に位置するエピトープに特異的である、請求項６記載の方法。
- ラベル化抗体が、放射性同位元素、発光性エレメント、酵素、蛍光性クロモフォア、光吸収性クロモフォア、及び直接的または間接的定量的測定が可能なあらゆる他のリガンドでラベルされる、請求項６から８のいずれか一項記載の方法。
- ラベル化抗体が、エネルギードナー発光性化合物でラベルされ、他方の抗体が、エネルギーアクセプター発光性化合物に接合されている、請求項６から８のいずれか一項記載の方法。
- エネルギードナー発光性化合物がユウロピウムクリプテートであり、エネルギーアクセプター発光性化合物がアロフィコシアニンである、請求項１０記載の方法。
- ヒトクロモグラニンＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４中に位置するエピトープに特異的にそれ自体結合することが可能なモノクローナル抗体。
- ヒトクロモグラニンＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９７中に位置するエピトープに特異的にそれ自体結合することが可能なモノクローナル抗体。
- 放射性同位元素、エネルギードナー発光性化合物、エネルギーアクセプター発光性化合物、及び直接的または間接的定量的測定が可能なあらゆる他のリガンドから選択される検出可能なラベルに接合された、請求項１２または１３のモノクローナル抗体を含む免疫学的試薬。
- − 第一の抗体、並びに
− 第二の抗体
を含み、二つの抗体の少なくとも一方が、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置するエピトープに特異的な抗体である、ヒトクロモグラニンＡ（ＣｇＡ）のためのイムノアッセイキット。 - 第一の抗体及び第二の抗体が、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９７，及び／または配列番号１アミノ酸２１９から２３４中に位置するエピトープに特異的な抗体から選択される、請求項１５記載のキット。
- 抗体の一方が、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から１９７，または配列番号１アミノ酸２１９から２３４中に位置するエピトープに特異的であり、並びに他方の抗体が、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２５０から３０１中に位置するエピトープに特異的である、請求項１５記載のキット。
- 抗体の一方が、エネルギードナー発光性化合物に接合され、他方の抗体が、エネルギーアクセプター発光性化合物に接合される、請求項１５から１７のいずれか一項記載のキット。
- エネルギードナー発光性化合物がユウロピウムクリプテートであり、エネルギーアクセプター発光性化合物がアロフィコシアニンである、請求項１８記載のキット。
- ＣｇＡの配列番号１アミノ酸１４５から２３４中に位置するエピトープに特異的な抗体を含む、競合的イムノアッセイキット。
- 抗体が、ヒトＣｇＡの配列番号１アミノ酸２１９から２３４，または配列番号１アミノ酸１４５から１９７中に位置するエピトープに特異的である、請求項２０記載のアッセイキット。
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