CN107090439B - 一株分泌抗嗜铬素a单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株分泌抗嗜铬素A单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，还提供了一种分泌的可特异性识别人嗜铬素A的单克隆抗体，用于多种肿瘤免疫学诊断的应用方法。CgA蛋白是人类肾上腺髓质中含量最高的一种可溶性酸性蛋白，分子量为48 kD，广泛存在于神经元及其神经内分泌细胞和肿瘤细胞中。CgA蛋白表达与神经内分泌肿瘤相关，被用于标记神经内分泌肿瘤，从而用于神经内分泌肿瘤的的诊断。制备该抗体的抗原为一段由大肠杆菌表达、具有免疫原性活性的重组蛋白，最终获得的抗体属于IgG_2b亚型，对多种肿瘤组织的免疫组织化学检测发现，该抗体可以很好的鉴别肿瘤的发生，可用于这些肿瘤的免疫学诊断。

Description

一株分泌抗嗜铬素A单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一种可以识别人嗜铬素A的单克隆抗体及可分泌该抗体的杂交瘤细胞系4E5C6-11G6。具体而言，本发明提供了一种抗肿瘤细胞胞浆抗原CgA的单克隆抗体，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测细胞中CgA 的表达水平，从而对这些肿瘤进行诊断，属于生物检测领域。

背景技术

CgA 蛋白是一种酸性亲水蛋白质，是嗜铬家族的一员，位于神经内分泌细胞的嗜铬性颗粒内。研究发现，几乎所有类型的神经内分泌肿瘤均出现CgA 表达上调。因此，CgA被认为是神经内分泌肿瘤的非特异性标志物，用于该类肿瘤的诊断以及肿瘤发展进程的监测和预后判断。

人源CgA 蛋白分子量为48 kD，包括457个氨基酸，其编码基因位于第14号染色体上。CgA 蛋白含有一些公认的结构/功能区域：含有18个氨基酸的信号肽在蛋白成熟过程中被剪切；10对基本氨基酸残基可能是分裂或加工的产物；两个半胱氨酸残基结合形成一个分子内的二硫化物环；含有和胰岛素释放抑制剂相同的氨基酸序列；和已知的钙粘蛋白（如癌调蛋白、S-100 蛋白）拥有同源序列；一个精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）复合物，可能作为细胞膜的组成部分。

CgA 蛋白在神经元和内分泌组织中发现，包括脑下垂体、胰腺、下丘脑、胸腺、甲状腺和甲状旁腺等。此外，神经内分泌肿瘤与CgA 表达水平密切相关，该类肿瘤包括前列腺癌、嗜铬细胞癌、大细胞癌、鳞癌、肺腺癌、胰高血糖素癌和胰岛素癌等。

目前的研究表明CgA 有以下功能：（1）强烈地抑制葡萄糖诱导的胰腺释放胰岛素；（2）通过作为非竞争性烟碱性胆碱能拮抗地抑制儿茶酚胺从嗜铬细胞和去甲肾上腺素神经元的释放；（3）对革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌和黄曲霉以及革兰氏阴性菌如大肠杆菌和假丝酵母菌具有一定的抗菌活性；（4）通过上调cAMP-PKA-SP1途径蛋白酶Nexin 1（SERPINE2）的转录来调控内分泌细胞中的颗粒生物发生。这导致高尔基复合物中颗粒蛋白降解的抑制，反过来促进颗粒形成。（5）诱导肥大细胞迁移和脱粒，细胞因子和趋化因子的产生；（6）作为体外自由基的有效清除剂；（7）可能在调节心脏功能和血压方面发挥作用等。

据报道，CgA 有不同的蛋白酶水解位点，在不同的组织中被分解成具有组织特异性的片段。这些功能肽包括血管抑制因子-1、血管抑制因子-2、胰抑制素、新生心血管活性多肽、儿茶酚抑素和旁腺抑素等。通过不同的剪切方式形成的这些功能肽负调控释放自分泌细胞或旁分泌细胞的神经内分泌功能。

CgA 分子为一分子量为48 kDa 左右的蛋白，选择不同的抗原进行免疫可能制备出不同结合特性的抗体，该分子同时存在多种因可变剪切引起的变异体，最终导致不同抗体对表达抗原细胞的识别能力和模式不同。目前可用于免疫组化诊断的抗CgA 抗体如5H7、DAK-A3和LK2H10 抗体均来自于国外，而在国内尚未有相关抗CgA 抗体申请专利。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种制备CgA重组蛋白的方法，该重组蛋白由CgA分子及用于纯化的组氨酸标签组成。

本发明的第二个目的是提供一种特异性好，亲和力高的CgA单克隆抗体，该抗体能特异结合CgA重组抗原和天然抗原。

本发明的第三个目的是提供一种将本抗体用于肿瘤组织切片免疫组织化学检测的使用方法。

解决技术问题所采用的技术手段

本发明对CgA分子按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达。为促进重组蛋白的可溶表达，优化其表达行为，对片段进行密码子优化，经基因合成后克隆进表达载体pET-28a中重组表达，纯化目的蛋白后作为免疫原，多次免疫BALB/c小鼠。经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗CgA抗体的单克隆细胞系。

利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG_2b型单克隆抗体，亲和常数为9.23×10⁹ L/mol。免疫组化实验显示该抗体能特异识别表达CgA分子的肿瘤细胞。

具体地，本发明涉及以下几个方面：

一株分泌抗嗜铬素A单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为小鼠杂交瘤细胞系4E5C6-11G6，该细胞株已于2017年1月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.13590，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

一种单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞系4E5C6-11G6分泌。

所述单克隆抗体，其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列编码经由大肠杆菌重组表达而获得的重组CgA抗原蛋白。

所述的单克隆抗体，其为小鼠IgG_2b亚型单克隆抗体。

所述的单克隆抗体，其可识别重组和肿瘤细胞胞浆的CgA分子。

所述的单克隆抗体，其用于免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法检测肿瘤及正常组织细胞中的CgA表达水平。

所述的重组CgA抗原蛋白，该重组蛋白由优选的具有抗原性的CgA片段及用于重组蛋白的蛋白标签组成。

所述的重组CgA抗原蛋白，CgA片段包括第19位至第457位氨基酸的片段，用于纯化的标签是由5至7个组氨酸组成的。

所述的单克隆抗体，是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码的，其中包括CgA分子第19位至第457位氨基酸序列的片段在大肠杆菌中表达，且经镍柱亲和纯化而来。

所述的单克隆抗体，在制备免疫组化病理诊断剂上的应用。

获得杂交瘤细胞株所分泌的抗体为一种鼠源IgG_2b亚型单克隆抗体。

所述的单克隆抗体，可独立或与其他抗体组合应用于肿瘤细胞制备物、肿瘤组织切片的免疫印迹或酶联免疫检测方法。

本发明的优点及有益效果

（1）本发明获得的杂交瘤（4E5C6-11G6）分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋白CgA分子和表达CgA的细胞，能够检测高表达CgA的多种正常组织和肿瘤组织。

（2）本发明获得的杂交瘤（4E5C6-11G6）为一种IgG_2b类抗体，与CgA蛋白的结合有极强特异性和敏感性。

（3）本发明获得的杂交瘤（4E5C6-11G6）产生的单克隆抗体可应用于免疫组织化学（IHC）、免疫印记（Western blotting）、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛查，特异性和灵敏度高。CgA在各种正常组织和肿瘤组织定位良好，具有高敏感性和特异性。因此，本发明的CgA单克隆抗体具有广泛的应用范围，可显著提高诊断的准确度。

附图说明

图1：纯化的CgA重组抗原蛋白；M为蛋白Marekr，1为空载表达产物，2为目的蛋白表达产物，3、4分别为细菌破碎离心后上清和沉淀，5为穿透液，6、7为表达产物200 mM咪唑洗脱的结果，表达产物的大小约为80 kDa，使用10% SDS-PAGE凝胶。所纯化的重组CgA蛋白为可溶状态，可以部分保天然构象，浓度为1.1 mg/mL。

图2：4E5C6-11G6抗体的识别特性和实际应用效果；M为分子量标记，1、2为CgA重组蛋白SDS-PAGE电泳后结果，3、4为应用纯化的4E5C6-11G6单克隆抗体可以在免疫印迹杂交中特异地检出CgA重组蛋白。

图3：以CgA单克隆抗体对免疫组织化学芯片检测多种正常和肿瘤组织的结果。以4E5C6-11G6单克隆抗体对正常肾上腺组织、肺小细胞癌进行染色分析，滴度为1:4000，左为对照鼠单克隆抗体LK2H10+PHE5，右为本发明4E5C6-11G6抗体，染色结果显示4E5C6-11G6能特异识别肾上腺组织和肺小细胞癌，特异性良好，敏感性高，未见任何非特异染色。

具体实施方式

下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。

实施例1 重组CgA蛋白片段的制备

一、 基因优化与合成

CgA按照Uniprot数据库中登录号为P10645的蛋白质序列，选择第19位至457位氨基酸的蛋白片段，直接优化成适合在大肠杆菌BL21(DE3)表达的基因片段。在PCR的过程中在基因5’和3’端分别加入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体pET-28a进行EcoRⅠ和HindⅢ酶切，再次电泳回收，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑取平板上的克隆接种，进行菌液PCR鉴定。挑选PCR结果阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆使用。

二、蛋白表达和纯化

按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100mL LB培养基，加入终浓度为10μg/mL的卡那霉素，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6~0.8。加入1 mmol/L的IPTG，16℃ 震荡培养过夜，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化。用200mM咪唑进行洗脱后，进行SDS-PAGE分离检测，图1为融合组氨酸标签的重组CgA蛋白的表达和纯化结果。重组CgA蛋白浓度为1.1 mg/mL，可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。

实施例2 杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中纯化的融合蛋白和快速佐剂（北京博奥龙公司）按说明书要求混合，免疫4-6周龄雌性BALB/c小鼠（购自上海吴氏实验动物中心），后腿小腿肌肉注射，剂量为50µg/只。第21天按照同样放还是加强免疫1针。第35天以间接ELISA（波长450 nm）检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以腹腔注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50 µg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0（中科院上海细胞库）以5:1体积比例混合，离心1500 rpm，5 min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1 mL PEG1450（Sigma公司），并搅动细胞。在温水中静置1 min后，加入10 mL无血清的RPMI-1640培养基，混匀，离心1000 rpm，5 min。弃上清后，加入10 mL HAT培养基小心的将细胞吹打起来，充分混匀后铺到96孔板中，放入37℃ 5% CO₂培养箱中培养。

三、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

10天后，取100 µL上清用纯化的融合蛋白进行ELISA筛选。选取效价高、数量少、状态好的阳性克隆进行亚克隆。7天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基（含饲养细胞和HT）的24孔板培养。五天后取100 µL上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

实施例3 腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000 rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用Protein G （南京金斯瑞公司）亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，BCA法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4 单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用0.05M包被液（pH9.2）按1:1000稀释6种不同的亚类鉴定试剂（IgA、IgM、IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、）(Sigma公司)，每孔加100 µL，37℃孵育1h。弃去孔中液体，用PBS洗3次，每孔加入200 µL PBSM封闭液，37℃孵育1 h。倾空液体，用PBS清洗3次。每孔加入100 µL杂交瘤上清，37℃ 孵育1 h。倾空液体用PBS-T清洗3次，用PBS清洗3次。用封闭液1:8000稀释HRP-IgG酶标二抗，每孔100 µL ，37℃ 孵育1 h。倾空液体，用PBS-T清洗3次，用PBS清洗3次，拍干。每孔加100 µL 显色液，37℃ 孵育10~20 min后加入50 µL 终止液，在450 nm波长下测定OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG_2b型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被重组CgA蛋白，包被浓度分别为100 ng/mL、50 ng/mL、25 ng/mL和12.5 ng/mL，100µL/孔，4℃包被过夜，PBS洗3次。每孔加200 µL封闭液37℃封闭2 h，PBS洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1:500开始2倍梯度稀释，37℃ 孵育1 h，PBS-T洗3次，PBS清洗3次。用封闭液1:8000稀释HRP-IgG酶标二抗，每孔100 µL，37℃ 孵育1 h，PBS-T洗3次，PBS清洗3次。每孔加入100 µL显色液，37℃ 孵育10~20 min后加入50 µL 终止液。用酶标仪测定波长450 nm的吸光值。利用Origin8.0软件绘制拟合曲线，根据各曲线的IC₅₀，按照下列公式计算出亲和常数为9.23×10⁹ L/mol。

式中：[Ab]表示抗原浓度为[Ag]时IC50对应的抗体浓度；

[Ab]_t表示抗原浓度为[Ag]_t时IC50对应的抗体浓度；

n = [Ab]/[Ab]_t

三、单抗反应特异性和应用效果

选择重组的CgA蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，免疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样约5~10 ng，进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上（Millipore公司）。将膜置于含5%脱脂奶粉的TBS封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体4E5C6-11G6（1:4000稀释）37℃孵育1 h。用TBS-T洗膜后，加入1:8000稀释的羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），37℃孵育1 h。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液（武汉三鹰生物技术有限公司），荧光成像系统（Bio-Rad）进行化学发光图像的采集。

实施例5. 组织芯片染色和鉴定

一.芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作空白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡（熔点在56～58℃）倒入模具，冷却至室温后将模具放入- 20℃冰箱6 min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1 mm直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3～4 mm，用另一直径1 mm的打孔针在蜡块的标记部位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0.1 mm左右。将采集到的组织芯直接插入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入60℃烤箱内15 min，使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30 min，再放入-20℃ 冰箱冷冻6 min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4 μm，将连续切片漂在凉水中, 让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2 % APES 丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入- 4℃ 冰箱保存。

二．IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3%H₂O₂孵育10分钟 ，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加封闭液（1%的BSA溶液）室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗（首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例）室温（25℃）孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育20~30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85%（3分钟）-95%（3分钟）-100%（3分钟）-100%（3分钟）的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

三．数据统计

根据各抗体在样本点的着色情况，统计各指标的着色率（着色样本数/样本总数），见表1。

表1

SEQUENCE LISTING

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 一株分泌抗嗜铬素A单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1317

<212> DNA

<213> 序列

<400> 1

atgacgatct accgcacgct ggatgaaggc gacacggaag tgatgaaatg tattgtggaa 60

gtgattagcg acaccctgag caaaccgtca ccgatgccgg tttcgcagga atgctttgaa 120

accctgcgtg gtgatgaacg cattctgtct atcctgcgtc atcagaacct gctgaaagaa 180

ctgcaggacc tggcgctgca aggtgccaaa gaacgcgcac atcagcagaa aaaacacagt 240

ggcttcgaag atgaactgtc cgaagtgctg gaaaatcaga gctctcaagc agaactgaaa 300

gaagctgttg aagaaccgag ttccaaagat gtcatggaaa aacgtgaaga cagcaaagaa 360

gcggaaaaat ctggtgaagc tacggatggt gcacgtccgc aggcactgcc ggaaccgatg 420

caagaaagca aagcagaggg taacaatcag gctccgggtg aagaagaaga agaagaagaa 480

gaagcgacca acacgcaccc gccggcttca ctgccgtcgc agaaatatcc gggtccgcaa 540

gccgaaggcg atagcgaagg tctgtctcag ggcctggtgg accgtgaaaa aggtctgagc 600

gcagaaccgg gttggcaggc aaaacgtgaa gaagaagaag aagaagaaga agaagcggaa 660

gccggtgaag aagcagttcc tgaagaagaa ggcccgaccg tggttctgaa tccgcatccg 720

tcactgggtt acaaagaaat tcgtaaaggc gaaagtcgct ccgaagcact ggctgtcgat 780

ggcgcaggta aaccgggcgc agaagaagct caggacccgg aaggcaaagg tgaacaagaa 840

cacagtcagc aaaaagaaga agaagaagaa atggcggtcg tgccgcaggg tctgtttcgt 900

ggcggtaaat caggcgaact ggaacaggaa gaagaacgtc tgtcgaaaga atgggaagat 960

agtaaacgct ggtccaaaat ggaccagctg gcgaaagaac tgacggccga aaaacgtctg 1020

gagggtcagg aagaagaaga agataaccgc gactcatcga tgaaactgag ttttcgtgca 1080

cgtgcatatg gtttccgtgg tccgggtccg cagctgcgtc gcggctggcg tccgagctct 1140

cgcgaagatt ccctggaagc aggtctgccg ctgcaggttc gcggctaccc ggaagagaaa 1200

aaagaagaag aaggcagcgc caatcgtcgc ccggaagatc aggaactgga atctctgtcg 1260

gcgattgaag cggaactgga aaaagtggca caccaactgc aagccctgcg tcgtggc 1317

Claims (2)

1.一种单克隆抗体，其特征在于：所述抗体由所述的小鼠杂交瘤细胞系4E5C6-11G6分泌；所述小鼠杂交瘤细胞系4E5C6-11G6，该细胞株已于2017年1月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.13590。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测CgA蛋白的免疫组化病理诊断剂上的应用。

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