CN106947744B - 一株分泌抗平足蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株分泌抗平足蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，还提供了一种分泌的可特异性识别人平足蛋白（Podoplanin，PDPN）的单克隆抗体，目的是提供一种将该抗体用于多种肿瘤免疫学诊断的应用方法。PDPN蛋白是一个38 kD O‑链接的横跨膜唾液酸糖蛋白，通常用于标记组织中的淋巴管内皮，制备该抗体的抗原为一段优选的、由大肠杆菌表达、具有免疫原性活性的重组蛋白，最终获得的抗体属于IgG2b亚型，对多种肿瘤组织的免疫组织化学检测发现，该抗体可以很好的鉴别肿瘤的发生，可用于这些肿瘤的免疫学诊断。

Description

一株分泌抗平足蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及一种可以识别人平足蛋白的单克隆抗体及可分泌该抗体的杂交瘤细胞系。具体而言，本发明提供了一种抗肿瘤细胞表面抗原PDPN的单克隆抗体，该抗体可以用于通过人工或自动化方式，以免疫组织化学染色（IHC）、酶联免疫吸附（ELISA）或免疫印迹（Western Blot）方式检测细胞中PDPN的表达水平，从而对这些肿瘤进行诊断，属于生物检测领域。

背景技术

PDPN蛋白又称肾小球上皮细胞整合膜蛋白，1996年由Wetterwald首次发现并报道，而后Breiteneder等发现其还存在于小鼠的肾小球足状突细胞膜表面蛋白，与维持肾小球通透性及足状突细胞突起的形成有关。在Breiteneder等的进一步研究中发现，PDPN特异性表达于淋巴管，而不表达于血管，可作为淋巴管内皮标记物。

PDPN蛋白是一种相对分子量为38 kDa的Ⅰ型跨膜唾液酸糖蛋白，由162个氨基酸组成，可分为4个部分：第一部分为第1位至第22位氨基酸组成的信号肽片段，第二部分为第23位至第131位氨基酸编码的胞外片段，第三部分为第132位至第152位氨基酸编码的跨膜片段，第四部分为第153位至第162位氨基酸组成的胞浆片段。

PDPN蛋白不只在淋巴管内皮表达，也在人体很多组织细胞表达，如肾足突细胞、骨骼肌、肺、心脏和乳腺的肌成纤维细胞、唾液腺、成骨细胞、卵巢粒层细胞、滤泡树突状细胞和间皮细胞等。近年来，越来越多研究发现在多种人类肿瘤中PDPN表达由无到有或表达上调，包括口腔鳞癌、喉癌、肺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、膀肤癌、食管癌、结直肠癌、皮肤癌、淋巴瘤、牙源性细胞瘤、卵巢无性生殖细胞瘤及粒层细胞癌、间皮瘤等，另外在一些中枢神经系统肿瘤中的表达也上调。

自从发现PDPN以来，针对它在淋巴管形成，炎症的发生以及肿瘤的发生发展中的作用的研究越来越多，随之产生各种抗PDPN的单克隆抗体。D2-40是最早制备的抗PDPN抗原的单克隆抗体，现在已用于病理诊断，诊断肿瘤患者的淋巴管转移；NZ-1抗体能够抑制PDPN诱导的血小板聚集；18H5现在已经商品化用于ELISA，western blot，FCM 等技术。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种制备PDPN重组蛋白的方法，该重组蛋白由PDPN分子的胞外区片段及用于纯化的组氨酸标签组成。

本发明的第二个目的是提供一种特异性好，亲和力高的PDPN单克隆抗体，该抗体能特异结合PDPN重组抗原和天然抗原。

本发明的第三个目的是提供一种将本抗体用于肿瘤组织切片免疫组织化学检测的使用方法。

解决技术问题所采用的技术手段

本发明对PDPN分子按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达。为促进重组蛋白的可溶表达，优化其表达行为，对片段进行密码子优化，经基因合成后克隆进表达载体pET-28a中重组表达，纯化目的蛋白后作为免疫原，多次免疫Balb/c小鼠。经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗PDPN抗体的单克隆细胞系。

利用该杂交瘤细胞系用小鼠进行腹水制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得鼠单克隆抗体。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG2b型单克隆抗体，亲和常数为2.94×10⁸ L/mol。免疫组化实验显示该抗体能特异识别表达PDPN分子的肿瘤细胞。

具体地，本发明涉及以下几个方面：

一株分泌抗平足蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为小鼠杂交瘤细胞系5B3D4，该细胞系已于2017年1月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.13589，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

一种单克隆抗体，由小鼠杂交瘤细胞系5B3D4分泌。

所述单克隆抗体，其免疫小鼠用的抗原是将具有序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列编码经由大肠杆菌重组表达而获得的重组PDPN抗原蛋白。

所述的单克隆抗体，其为小鼠IgG2b亚型单克隆抗体。

所述的单克隆抗体，其可识别重组和肿瘤细胞表面的PDPN分子。

所述的单克隆抗体，其用于免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法检测肿瘤及正常组织细胞中的PDPN表达水平。

所述的单克隆抗体，在制备免疫组化病理诊断剂上的应用。

所述的重组PDPN抗原蛋白，该重组蛋白由优选的具有抗原性的PDPN片段及用于重组蛋白的蛋白标签组成。

所述的重组PDPN抗原蛋白，PDPN片段包括第23位至第131位氨基酸的片段，用于纯化的标签是由5至7个组氨酸组成的。

所述的单克隆抗体，是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码的，其中包括PDPN分子第23位至第131位氨基酸序列的片段在大肠杆菌中表达，且经镍柱亲和纯化而来。

获得杂交瘤细胞株所分泌的抗体为一种鼠源IgG2b亚型单克隆抗体。

所述的单克隆抗体，可独立或与其他抗体组合应用于肿瘤细胞制备物、肿瘤组织切片的免疫印迹或酶联免疫检测方法。

据报道正常组织中，PDPN存在于淋巴管内皮（血管内皮没有）、成纤维细胞、骨细胞、滤泡树突细胞、平滑肌和横纹肌细胞、Cajal细胞、扁桃体鳞状上皮基底细胞、胃隐窝细胞、前列腺基底细胞、不成熟的基底细胞、胎儿生殖母细胞（但不是对应成人睾丸细胞、肾小球足细胞、间皮（特别是反应性）、淋巴细胞的亚群、Schwann细胞、神经胶质和室管膜细胞。

据报道肿瘤组织中，PDPN存在于几乎所有情况下的精原细胞瘤/无性细胞瘤（但不是精母细胞性精原细胞瘤）和浸润前的睾丸生殖细胞瘤（原位癌或导管内生殖细胞肿瘤IGCN）。胚胎性癌可能是有限的胞膜反应。PDPN在大量的上皮样和两相恶性间皮瘤（~90%）、腺瘤样肿瘤和滑膜肉瘤中（上皮样部分）中。PDPN也在几乎所有的Kaposi肉瘤，此外在血管肉瘤的一个亚群及血管母细胞瘤的泡状细胞（分化的血管母细胞肿瘤的内皮细胞通常都是阴性的），大多数鳞状细胞癌（头颈部、肺、子宫颈），成纤维细胞肿瘤，平滑肌肉瘤和胃肠道间质肿瘤，几乎所有的软骨瘤（但不是脊索瘤），滤泡树突网状细胞瘤、大部分原发性脑肿瘤（星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、室管膜瘤、脉络丛肿瘤、PNET、脑膜瘤），腺癌通常是阴性。浆液性癌中，蛋白检出率为13-65%。胸腔积液中，腺癌PDPN阳性率达到50%。

本发明的优点及有益效果

（1）本发明获得的杂交瘤（5B3D4）分泌产生的单克隆抗体，能识别重组蛋白PDPN分子和表达PDPN的细胞，能够检测高表达PDPN的多种正常组织和肿瘤组织。

（2）本发明获得的杂交瘤（5B3D4）为一种IgG2b类抗体，与PDPN蛋白的结合有极强特异性和敏感性。

（3）本发明获得的杂交瘤（5B3D4）产生的单克隆抗体可应用于免疫组织化学（IHC）、免疫印记（Western blotting）、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛查，特异性和灵敏度高。PDPN在各种正常组织和肿瘤组织定位良好，具有高敏感性和特异性。因此，本发明的PDPN单克隆抗体具有广泛的应用范围，可显著提高诊断的准确度。

附图说明

图1：纯化的PDPN重组抗原蛋白；M为蛋白Marekr，1为空载表达产物，2为目的蛋白表达产物，3、4为表达产物200mM咪唑洗脱的结果，表达产物的大小约为24kDa，使用15%SDS-PAGE凝胶。所纯化的重组PDPN蛋白为可溶状态，可以部分保天然构象，浓度为1.7mg/mL。

图2：5B3D4抗体的识别特性和实际应用效果；1为分子量标记。应用纯化的5B3D4单克隆抗体可以在免疫印迹杂交中特异地检出PDPN重组蛋白。

图3：以PDPN单克隆抗体对免疫组织化学芯片检测多种正常和肿瘤组织的结果。以5B3D4单克隆抗体对甲状腺、间皮瘤进行染色分析，滴度为1:4000，左为对照抗体D2-40，右为本发明5B3D4抗体，染色结果显示5B3D4能特异识别淋巴管而不识别血管，特异性良好，敏感性高，未见任何非特异染色。

具体实施方式

下面结合图表和具体实施的方式对本发明做进一步阐述，以使本领域技术人员可以更清楚地得知本发明的技术方案，并非对本发明的限制。

实施例1 重组PDPN蛋白片段的制备

一、 基因优化与合成

PDPN按照Uniprot数据库中登录号为Q86YL7-1的蛋白质序列，选择在胞外表达的第23位至131位氨基酸的蛋白片段，直接优化成适合在大肠杆菌Transetta(DE3)表达的基因片段。在PCR的过程中在基因5’和3’端分别加入NcoI和XhoI酶切位点。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体pET-28a进行NcoI和XhoI酶切，再次电泳回收，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Transetta(DE3)，挑取平板上的克隆接种，进行菌液PCR鉴定。挑选PCR结果阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆使用。

二、蛋白表达和纯化

按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100mL LB培养基，加入终浓度为10μg/mL的卡那霉素，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.6~0.8。加入1 mmol/L的IPTG，16℃震荡培养过夜，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化。用200mM咪唑进行洗脱后，进行SDS-PAGE分离检测，图1为融合组氨酸标签的重组PDPN蛋白的表达和纯化结果。重组PDPN蛋白浓度为1.7 mg/mL，可以满足免疫动物和抗体筛选与鉴定的要求。

实施例2 杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中交联的多肽和快速佐剂（北京博奥龙公司）按说明书要求混合，免疫4-6周龄雌性Balb/c小鼠（购自上海吴氏实验动物中心），后腿小腿肌肉注射，剂量为50 µg/只。第21天按照同样放还是加强免疫1针。第35天以间接ELISA（波长450nm）检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以腹腔注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50µg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0（中科院上海细胞库）以5:1比例混合，离心1500 rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1450（Sigma公司），并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10mL无血清的RPMI-1640培养基，混匀，离心1000 rpm，5min。弃上清后，加入10mL HAT培养基小心的将细胞吹打起来，充分混匀后铺到96孔板中，放入37℃ 5%CO₂培养箱中培养。

三、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

10天后，取100µL上清用纯化的融合蛋白进行ELISA筛选。选取效价高、数量少、状态好的阳性克隆进行亚克隆。7天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基（含饲养细胞和HT）的24孔板培养。五天后取100µL上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

实施例3 腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000 rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用Protein G （南京金斯瑞公司）亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，BCA法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4 单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用0.05M包被液（pH9.2）按1:1000稀释6种不同的亚类鉴定试剂（IgA、IgM、IgG₁、IgG_2a、IgG_2b、IgG₃、）(Sigma公司)，每孔加100µL，37℃孵育1h。弃去孔中液体，用PBS洗3次，每孔加入200µL PBSM封闭液，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS清洗3次。每孔加入100µL杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次，用PBS清洗3次。用封闭液1:8000稀释HRP-IgG酶标二抗，每孔100µL ，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次，用PBS清洗3次，拍干。每孔加100µL 显色液，37℃孵育10-20min后加入50µL 终止液，在450nm波长下测定OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG_2b型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被重组PDPN蛋白，包被浓度分别为4µg/mL，1.5µg/mL，0.5µg/mL，100µl/孔，4℃包被过夜，PBS洗3次。每孔加200µl封闭液37℃封闭2h，PBS洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1:1000开始2倍梯度稀释，37℃孵育1h，PBS-T洗3次，PBS清洗3次。用封闭液1:8000稀释HRP-IgG酶标二抗，每孔100µL，37℃孵育1h，PBS-T洗3次，PBS清洗3次。每孔加入100µL显色液，37℃孵育10-20min后加入50µL 终止液。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。利用Origin8.0软件绘制拟合曲线，根据各曲线的IC₅₀，按照下列公式计算出亲和常数为2.94×10⁸ L/mol。

亲和常数

式中：[Ab]表示抗原浓度为[Ag]时IC50对应的抗体浓度；

[Ab]_t表示抗原浓度为[Ag]_t时IC50对应的抗体浓度；

n = [Ab]/[Ab]_t

三、单抗反应特异性和应用效果

选择重组的PDPN蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，免疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样约5-10ng，进行15%聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上（Millipore 公司）。将膜置于含5%脱脂奶粉的TBS封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体5B3（1:4000稀释）37℃孵育1h。用TBS-T洗膜后，加入1:8000稀释的羊抗鼠二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），37℃孵育1h。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液（武汉三鹰生物技术有限公司），荧光成像系统（Bio-Rad）进行化学发光图像的采集。

实施例5. 组织芯片染色和鉴定

一.芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作空白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡（熔点在56～58 ℃）倒入模具，冷却至室温后将模具放入- 20 ℃冰箱6 min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1mm直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3～4 mm，用另一直径1mm的打孔针在蜡块的标记部位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0.1mm左右。将采集到的组织芯直接插入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入60 ℃烤箱内15min，使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30 min，再放入-20 ℃ 冰箱冷冻6 min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4 ℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂在凉水中, 让其自然展开，再将分开的切片转移到45 ℃的温水中展片30秒，用经2 % APES 丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入- 4℃ 冰箱保存。

二．IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100%、100%、95%、85%梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3%H₂O₂孵育10分钟 ，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加封闭液（1%的BSA溶液）室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗（首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例）室温（25℃）孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育20-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。 苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85%（3分钟）-95%（3分钟）-100%（3分钟）-100%（3分钟）的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

三．数据统计

根据各抗体在样本点的着色情况，统计各指标的着色率（着色样本数/样本总数），见表1。

表1

SEQUENCE LISTING

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 一株分泌抗平足蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 327

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgagcaccg gccaaccgga ggatgatacc gaaaccaccg gactggaagg cggcgtggcg 60

atgcccggtg cggaagatga tgtggtgact ccgggcacct ccgaagatcg gtataaaagc 120

ggcctgacca ccctggtggc taccagcgtg aatagcgtga ccggcattcg tattgaagat 180

ctgccgacca gcgaaagcac tgtgcatgcg caggaacaga gcccgagcgc gaccgcgagc 240

aatgtggcga cctcgcatag caccgaaaaa gtggatggcg atacccagac caccgtggaa 300

aaagatggct tgagtaccgt aaccctg 327

Claims (2)

1.一种单克隆抗体，其特征在于：所述抗体由小鼠杂交瘤细胞系5B3D4分泌；所述小鼠杂交瘤细胞系5B3D4，该细胞系已于2017年1月9日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.13589。

2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备检测PDPN蛋白的免疫组化病理诊断剂上的应用。

Images