CN110903389B

CN110903389B - 抗gfap蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110903389B
Application number: CN201911279576.5A
Authority: CN
Inventors: 李恢波; 王小亚; 李玲玲; 吴茂; 黄信超
Original assignee: Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Current assignee: Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2039-12-13
Also published as: CN110903389A

Abstract

本发明涉及一种抗GFAP蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。本发明选取GFAP蛋白第292位至第432位氨基酸对应的核苷酸片段，通过大肠杆菌进行重组表达。纯化后的重组蛋白作为免疫原，对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗GFAP蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系10G1G11H7,以及由该细胞系所分泌的抗GFAP蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达GFAP蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

Description

抗GFAP蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗GFAP蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。

背景技术

胶质纤维酸性蛋白GFAP(glial fibrillary acidic protein)是一种分子量为55kDa的胞浆蛋白，以单体形式存在。研究发现其至少含有氨基端“头部”、羧基端“尾部”和中部螺旋杆状区三个功能域，是一种Ⅲ型中间丝状蛋白。人的GFAP基因定位于染色体17q21区域。GFAP基因含有9个外显子和8个内含子，还有4个可选择的外显子和2个可选择的内含子。

星形胶质细胞(astrocyte，AS)广泛分布于中枢神经系统各个部位，约占正常成年人脑细胞总数的40％。GFAP则是星形胶质细胞和星形胶质细胞源性肿瘤的标志蛋白，对神经元起支撑和营养作用，参与星形胶质细胞的许多生物学功能，包括细胞的增殖与分裂、维护血脑屏障的正常生理功能、自噬、维持神经递质的平衡等。GFAP是星形胶质细胞特有的中间丝蛋白，是胶质瘤的标志蛋白。在正常情况下，细胞胞质内的GFAP循环降解，血液中GFAP水平较稳定；而病理条件下，如病人的中枢神经系统受到损伤，其星形胶质细胞遭受破伤或坏死时，GFAP从胶质细胞中流出，穿过血脑屏障进入血液中，使GFAP浓度上调，因此GFAP在恶性胶质瘤中表现出异常过度表达。GFAP表达水平异常与多种遗传病和精神病相关，如亚历山大病、唐氏综合征、精神分裂症、情感型双极性疾患和抑郁症。目前，GFAP表达水平已经作为中风、脑外损伤、星型细胞源性胶质瘤等多种疾病的诊断标志之一。另外GFAP主要用于星型胶质瘤，包括星型细胞瘤，星型母细胞瘤，混合胶质瘤，多形性胶质母细胞瘤和非星型细胞瘤，包括部分少数胶质细胞瘤，多数室管膜瘤等中枢神经系统肿瘤的诊断和鉴别诊断。

发明内容

为此，需要提供一种用于人体GFAP蛋白检测的抗体。为实现上述目的，发明人提供了一种抗GFAP蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列所编码。

进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.17407的小鼠杂交瘤细胞系分泌。所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系10G1G11H7，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2019年03月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别GFAP蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。

发明人还提供了一种抗GFAP蛋白单克隆抗体的制备方法，选取GFAP蛋白第292位至第432位氨基酸片段作为免疫原并进行蛋白重组，所述重组蛋白经由大肠杆菌重组表达。

进一步地，所述GFAP蛋白的第292位至第432位氨基酸片段，其氨基酸序列为SEQID NO.1所示的氨基酸序列。

发明人还提供一株分泌抗GFAP蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系10G1G11H7，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2019年03月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

发明人还提供上述任一所述的抗GFAP蛋白单克隆抗体，在GFAP蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

区别于现有技术，上述技术方案选取GFAP蛋白第292位至第432位氨基酸(SEQ IDNo.1)对应的核苷酸片段(SEQ ID No.6)，通过大肠杆菌进行重组表达，重组蛋白由GFAP第292位至第432位氨基酸片段以及组氨酸标签组成。纯化后的重组蛋白作为免疫原，对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗GFAP蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系10G1G11H7,以及由该细胞系所分泌的抗GFAP蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达GFAP蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1：GFAP蛋白表达鉴定的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图2：GFAP纯化后单抗的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3：GFAP单抗检测人GFAP蛋白的免疫印迹图。

图4：星形细胞瘤免疫组化染色对比图；左侧为抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7),右侧为GFAP(6F2)。

图5：脑胶质瘤免疫组化染色对比图；左侧为抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7),右侧为GFAP(6F2)。

图6：垂体免疫组化染色对比图；左侧为抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7),右侧为GFAP(6F2)。

图7：脑组织免疫组化染色对比图；左侧为抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7),右侧为GFAP(6F2)。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1重组GFAP蛋白片段的制备

一、基因克隆

本发明选取人GFAP(h GFAP)蛋白第292位至第432位氨基酸片段作为抗原(SEQ IDNO.1)，根据其对应碱基序列(SEQ ID NO.6)利用软件Primer5.0设计GFAP蛋白的特异性上游引物5’(SEQ ID NO.7)：TGAATTCCATATGCCCCCCACCTTCTCCCCAG3’(酶切位点，EcoR I)和下游引物(SEQ ID NO.8)：5’GTACTCGAG TTCTGCCCTTCTCTCTGTCACC3’(酶切位点，HindⅢ)，进行PCR扩增。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的目的基因和用于表达的质粒载体pET28a进行Nde I和Xho I双酶切，再次电泳回收，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta，挑取平板上的克隆接种扩培，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。将PCR显示目的基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆用于进行下一步实验。

二、蛋白表达与纯化

测序正确的重组质粒pET28a(+)-GFAP 200ug/ul取5ul加入100ul的转化至宿主菌Rosetta感受态细胞中转化制备GFAP-pET28a(+)-Rosetta表达菌并保种。(具体步骤如下：1.将5μL溶解的0.2μg/μL的重组质粒GFAP-pET28a(+)加入制备好100μL的Rosetta细菌感受态细胞中，冰上放置30min；2.将此混合液于42℃水浴中热击45s；3.再放在冰上2min；4.往此混合液中加入700μL不含抗生素的LB培养基；5.将混合液置于37℃、200rpm恒温培养振荡器中培养1h；6.取培养好的混合液200μL涂布于50μg/mL卡那霉素抗性LB固体平板培养基上，37℃恒温培养箱正置培养30min后，倒置平板培养12-16h。)挑取阳性单克隆菌落，接种于4mL含50mg/L氨苄抗性的试管LB培养基中，37℃培养过夜后将此培养液接种于200ml含有50mg/L氨苄抗性的三角瓶LB培养基中扩培，37℃，200rpm/min培养至菌液OD值达到0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃继续培养21h，离心收集菌体并进行超声破碎。将破碎溶液离心后沉淀溶于适量含有8M尿素的PBS缓冲液中，逐滴加入复性缓冲液(10mM Tris-HCl pH 8.0，400mM L-Arghydrochloride，2mM EDTA，0.5mM Cysteamine)中进行复性，最后再利用Ni-NTA柱对复性后GFAP蛋白溶液进一步纯化，获得高纯度，构象均一性的抗原蛋白溶液。图1为GFAP蛋白表达鉴定的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

实施例2 10G1G11H7杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

1、常规腹腔免疫：

将实施例1中获得的GFAP蛋白用PBS缓冲液稀释至1mg/mL，然后与等体积的完全弗氏佐剂(CFA,Sigma公司)混合乳化，对18-20g的Balb/c小鼠(购自福州吴氏实验动物)进行腹部注射免疫，注射剂量为200μg/只。此后每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(IFA,Sigma公司)乳化，剂量为50μg/只。第3次加强免疫后14天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

2、快速免疫：

取80μL 1.0mg/mL抗原溶液加入等体积160μL的博奥龙免疫佐剂混合,对18-20g的Balb/c小鼠(购自福州吴氏实验动物)进行后大腿肌肉注射，注射剂量为100μg/只。每隔21天免疫一次，第14天眼眶采血进行ELISA和IHC检测，血清效价是否达到融合条件。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例混合，1000rpm离心10min，弃上清后，在1分钟内由慢到快加入1mL预热至37℃的PEG(Sigma公司)溶液，加入过程中需轻轻转动离心管，使细胞与PEG充分接触。室温静置90s后，2min内由慢到快加入4mL预热至37℃的无血清DMEM(Hyclone公司)培养基，随后的2min内再加入10mL预热无血清DMEM培养基，最后2min内加完剩余的预热无血清DMEM培养基，定容至50mL，整个加入过程需要缓慢摇动离心管，确保混合均匀，减轻对细胞的伤害。室温静置10min后离心(1000rpm，5min)，弃上清，用10～20mL HAT(Sigma公司)培养基重悬细胞，并用HAT培养基稀释至终浓度为0.5×10⁶cells/mL，所有溶液转移至96孔板中，200μL/孔，并做好标记。将96孔培养板小心转移至37℃，5％CO2培养箱中培养。定期检查细胞的生长状态及潜在的污染，注意尽量少开合培养箱，确保培养环境稳定。融合后第5天，向培养板中补加HAT培养基，50μL/孔。

三、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

当融合细胞直径长至大概为1～2mm时，吸取50～200μL培养液上清进行首次细胞筛选(ELISA、IHC-P及其他方法检测)，同时往培养孔中补加HAT培养基至200μL。ELISA检测该培养液上清，将检测得到阳性结果的培养孔内细胞培养液全部转移至24孔培养板，补加HT培养基，2mL/孔，培养3天。

重复筛选24孔板中各细胞株，剔除不是阳性结果的培养孔细胞，获得阳性结果较好的培养孔细胞。将这些24孔培养板得到的阳性孔细胞采用有限稀释法进行亚克隆筛选，即将有限稀释法得到细胞液加入96孔培养板中转移至CO₂培养箱培养11天，待克隆细胞直径为1～2mm时，重复进行细胞筛选。根据检测结果，每个亚克隆细胞株，选取4个生长良好的单克隆阳性培养孔，并转移至24孔板中继续培养。一段时间后再次筛选24孔板中克隆得到的阳性克隆细胞株，即为分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将此细胞株转入T-75培养瓶中扩增至对数生长期保种或进行后续实验。

实施例3体外培养法制备单克隆抗体

一、体外培养

获得稳定的杂交瘤细胞系后，主要采用体外培养法获取单抗。

以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基培养杂交瘤细胞，然后低速离心后收集培养上清，4℃储存备用。

二、单克隆抗体的纯化

用rProtein A sepharose Fast Flow(GE公司)亲和层析柱纯化抗体：①装柱，将购买的ProteinA填料适量装于重力层析柱中用平衡缓冲液(0.1MTris溶液，pH7.0)冲洗至平衡；②上样，将经过0.22μm滤膜过滤的腹水加入装好的层析柱中，控制流速1滴/秒；③平衡，上完样液后使用平衡缓冲液冲洗至平衡；④洗脱，加入洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸溶液，pH3.0)冲洗柱子并收集洗脱液；⑤再生，洗脱完成后加入平衡缓冲液冲洗柱子至平衡，2倍柱体积的20％乙醇冲洗后置于4℃保存。最后采用SDS-PAGE法鉴定抗体纯度，图2为GFAP纯化后单抗的聚丙烯酰胺凝胶电泳图，抗体纯度达95％以上，紫外微量分光光度计法测定抗体浓度，浓度达到3.0mg/mL以上。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚型鉴定

将免疫原溶液稀释成1μg/mL包被酶标板,每孔加100μL，4℃包被过夜，倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗板3次，每孔加入200μL封闭液(含2％BSA的PBS-T溶液)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入稀释5倍的0.1mL杂交瘤细胞株培养液上清，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。用封闭液1：400稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ，IgM，IgG₁，IgG1，IgG_2b，IgG₃，IgA)抗体(Southern Biotech公司)，每孔分别加入0.1mL，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加100μLTMB(湖州英创生物科技有限公司)底物(A、B等体积混合溶液)进行显色,室温反应15min，每孔加入50μL 1N HCl溶液终止显色反应，然后酶标仪测定450nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被重组GFAP蛋白，包被浓度为100μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭1h，PBS-T洗3次。实施例3纯化的单克隆抗体，稀释成以下浓度(单位：ng/mL)：2000、500、125、62.5、31.25、15.625、3.125、0.625，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：5000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl TMB(湖州英创生物科技有限公司)显色液，显色13min，加100μl 1.0N盐溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出1/2“平台OD值”对应的抗体浓度A。利用下列公式计算出亲和常数为6.53×10⁹L×mol-1。

三、单抗反应特异性和应用效果

选择免疫原溶液，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，对GFAP蛋白进行15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。用常规湿转法将凝胶蛋白转移到PVDF膜。将膜置于5％BSA-TBST溶液中(蛋白面朝下)，于37℃摇床封闭1h，以消除非特异性背景。封闭结束后用TBST洗掉5％BSA-TBST，加入本发明制备的GFAP的单克隆抗体，于脱色摇床摇荡孵育1h。用TBST洗膜后，加入二抗，于脱色摇床孵育1h，使二抗与一抗充分结合。再次用TBST洗膜，加入ECL显色试剂盒。实验结果如图3GFAP单抗检测人GFAP蛋白的免疫印迹图所示：条带单一且颜色较深，说明抗体与抗原的特异性反应明显。

实施例5组织芯片染色和鉴定

一、组织蜡块制备过程

对星形细胞瘤、肾细胞癌、肾母细胞瘤和结直肠癌等样本组织进行HE切片染色，以确定肿瘤病变部位。对病变位点画圈，预备打孔。制作受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在56～58℃)倒入模具，将组织块放入模具中的蜡液中后再加入适量蜡液使组织块完全包埋在蜡液中，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2％APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二、IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染20秒，PBS返蓝。按照85％(3分钟)、95％(3分钟)、95％(3分钟)、100％(3分钟)、100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后两次二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。显微镜下观察结果，记录并分析。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三、样本检测结果：

用抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7)和对照抗体-市售GFAP(6F2)在34例的星形细胞瘤、39例的肾细胞癌、21例的肾母细胞瘤和42例结直肠癌中进行同步检测，结果如下表所示：

检测结果显示：抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7)在细胞膜的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净，说明抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7)特异性强。同时，与市售抗体GFAP(6F2)的阳性和阴性结果一致，说明本抗体的特异性同市售抗体GFAP(6F2)相当。

而部分病例样本中，使用抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7)的阳性染色强度高于使用对照试剂，说明抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7)的敏感性高于市售抗体。图4为星形细胞瘤免疫组化染色对比图；左侧为抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7),右侧为GFAP(6F2)。

而在对脑胶质瘤样本的检测中，抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7)的阳性染色强度明显高于对照试剂，有助于鉴别诊断。图5为脑胶质瘤免疫组化染色对比图；左侧为抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7),右侧为GFAP(6F2)。

而用抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7)和对照抗体-市售抗GFAP蛋白单克隆抗体(鼠单抗6F2)，在正常组织芯片上进行同步检测，样本阳性和阴性结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。

图6为垂体免疫组化染色对比图；左侧为抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7),右侧为GFAP(6F2)。图7为脑组织免疫组化染色对比图；左侧为抗GFAP蛋白单克隆抗体(10G1G11H7),右侧为GFAP(6F2)。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗GFAP蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

<130> 2012

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 141

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Leu Thr Cys Asp Leu Glu Ser Leu Arg Gly Thr Asn Glu Ser Leu Glu

1 5 10 15

Arg Gln Met Arg Glu Gln Glu Glu Arg His Val Arg Glu Ala Ala Ser

20 25 30

Tyr Gln Glu Ala Leu Ala Arg Leu Glu Glu Glu Gly Gln Ser Leu Lys

35 40 45

Asp Glu Met Ala Arg His Leu Gln Glu Tyr Gln Asp Leu Leu Asn Val

50 55 60

Lys Leu Ala Leu Asp Ile Glu Ile Ala Thr Tyr Arg Lys Leu Leu Glu

65 70 75 80

Gly Glu Glu Asn Arg Ile Thr Ile Pro Val Gln Thr Phe Ser Asn Leu

85 90 95

Gln Ile Arg Glu Thr Ser Leu Asp Thr Lys Ser Val Ser Glu Gly His

100 105 110

Leu Lys Arg Asn Ile Val Val Lys Thr Val Glu Met Arg Asp Gly Glu

115 120 125

Val Ile Lys Glu Ser Lys Gln Glu His Lys Asp Val Met

130 135 140

<210> 2

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly

1 5 10 15

Val Asn Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile

35 40 45

Lys Asp Thr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Lys Thr Lys Tyr Asp

65 70 75 80

Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Ile Met Thr Thr Val Pro Phe Ala Tyr

115 120 125

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

130 135

<210> 3

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

Met Arg Cys Leu Ala Glu Phe Leu Gly Leu Leu Val Leu Trp Ile Pro

1 5 10 15

Gly Ala Ile Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Ala Pro Ser Val Pro

20 25 30

Val Thr Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser

35 40 45

Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Thr

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe

85 90 95

Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Phe Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys

130

<210> 4

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

atgaaatgca gctgggttat cttcttcctg atggcagtgg ttacaggggt caattcagag 60

gttcagctgc agcagtctgg ggcagagctt gtgaagccag gggcctcagt caagttgtcc 120

tgcacagctt ctggcttcaa cattaaagac acctatatgc attgggtgaa gcagaggcct 180

gaacagggcc tggagtggat tggaaggatt gatcctgcga atggtaagac taaatatgac 240

ccgaagttcc agggcaaggc cactataaca gcagacacat cctccaacac agcctacctg 300

cagctcagca gcctgacatc tgaggacact gccgtctatt actgtgctag aagggggatt 360

atgactacgg tcccgtttgc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 417

<210> 5

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

atgaggtgcc tagctgagtt cctggggctg cttgtgctct ggatccctgg agccattggg 60

gatattgtga tgactcaggc tgcaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 120

atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctt catagtaatg gcaacactta cttgtattgg 180

ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttacc 240

tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgctttcac actgagaatc 300

agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatcct 360

ttcacgttcg gaggggggac caagctggaa ataaaa 396

<210> 6

<211> 438

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

gaattcctga cctgtgatct ggaaagcctg cgtggcacca atgaaagcct ggaacgtcag 60

atgcgtgaac aagaggaacg tcatgttcgt gaagcagcaa gctatcaaga agcactggca 120

cgtctggaag aagaaggtca gagcctgaaa gatgaaatgg cacgtcatct gcaagaatat 180

caggatctgc tgaatgttaa actggccctg gatattgaaa ttgccaccta tcgtaaactg 240

ctggaaggtg aagaaaatcg tattaccatt ccggttcaga cctttagcaa cctgcagatt 300

cgtgaaacca gcctggatac caaaagcgtt agcgaaggtc atctgaaacg taacattgtt 360

gttaagaccg tggaaatgcg tgatggcgaa gttattaaag aaagcaaaca agagcacaaa 420

gatgtgatgt aaaagctt 438

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

tgaattccat atgcccccca ccttctcccc ag 32

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

gtactcgagt tctgcccttc tctctgtcac c 31

Claims

1.一种抗GFAP蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列所编码。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.17407的小鼠杂交瘤细胞系分泌。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别GFAP蛋白。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。

6.一株分泌抗GFAP蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系10G1G11H7，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.17407。

7.权利要求1-5任一所述的抗GFAP蛋白单克隆抗体在制备GFAP蛋白免疫检测试剂中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。