CN110922485B

CN110922485B - 抗Ep-cam蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN110922485B
Application number: CN201911279561.9A
Authority: CN
Inventors: 李恢波; 王小亚; 李玲玲; 吴茂; 邓晓
Original assignee: Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Current assignee: Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2019-12-13
Publication date: 2021-11-19
Anticipated expiration: 2039-12-13
Also published as: CN110922485A

Abstract

本发明涉及一种抗Ep‑cam蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。发明人还提供了一种抗Ep‑cam蛋白单克隆抗体的制备方法，选取Ep‑cam蛋白第24位至第265位氨基酸片段并在其C末端添加6个His作为免疫原并进行蛋白重组，所述重组蛋白经由大肠杆菌重组表达。发明人再提供了一株分泌抗Ep‑cam蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系4B5E6D7，保藏号为：CGMCC NO.17406。所述的抗Ep‑cam蛋白单克隆抗体适用于免疫检测，膜定位准确、特异性强、敏感性强。

Description

抗Ep-cam蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗Ep-cam蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。

背景技术

1979年在肿瘤细胞表面抗原的研究中发现Ep-cam为胰腺癌抗原。Ep-cam又称为TACSTD1是一种细胞黏附分子,按白细胞分化抗原为CD326，属单次跨膜Ⅰ型糖蛋白。

Ep-cam是由GA733-2基因编码,位于人染色体2p21,基因长度14kbp,成熟的mRNA全长约1.5kb,相对分子量大约为40KD。Ep-cam含有两个上皮生长因子样重复序列,N端半胱氨酸富集,跨膜区为23个氨基酸,胞浆区较短,为26个氨基酸。EpCAM的功能大部分未知,眼下公认的功能是黏附作用,属钙离子非依赖性同型细胞间黏附。研究显示EpCAM和肌动蛋白细胞骨架间通过α辅肌动蛋白相互作用,这可能对黏附和组织形态形成起重要作用。

Ep-cam主要编码一种肿瘤相关抗原，在高等脊椎动物中高度保守,人和小鼠Ep-cam分子的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为80％和82％。Ep-cam分子广泛表达于上皮来源的组织中,具有介导钙非依赖型的同型上皮细胞间粘附的功能。在很多恶性增生的上皮肿瘤中Ep-cam表达的强度远远超过正常组织的表达水平。恶性肿瘤组织不但高表达Ep-cam分子而且Ep-cam阳性细胞无论从数量还是阳性程度上都是与肿瘤发展的程度密切相关的。研究表明，绝大部分的上皮来源的肿瘤组织中都有Ep-cam分子的表达,其中胃和结直肠消化道肿瘤,乳腺癌,卵巢癌,胰腺癌,肺癌,前列腺癌等的Ep-cam阳性率都达到或接近100％，但是在黑素瘤、CNS原发肿瘤、肉瘤、淋巴瘤和干细胞肿瘤中缺乏表达。Ep-cam表达的调节还在研究中,有研究发现肿瘤坏死因子α(TNF-α)在鳞癌中通过核因子κB抑制EpCAM表达,这可能是通过对共活化物转录的竞争性抑制实现的。

Ep-cam分子特异性单抗可以区分上皮和非上皮来源的组织,可以作为上皮型肿瘤的可靠的诊断标志物。如在诊断皮肤基底细胞癌(BCC)和鳞状细胞癌(SCC)时,一种被称为基底鳞状细胞上皮癌的癌症病灶在形态学上有BCC和SCC的混合特点,对BCC中大量表达Ep-cam,而SCC中没有Ep-cam阳性细胞,运用免疫组化的方法用Ep-cam单抗染色,发现BCC中阳性细胞呈广泛和弥散分布,明确的区分这两种不同的病灶。另外,Ep-cam的表达强度还可以作为一些上皮来源肿瘤预后及分化程度的标志。如在胆囊癌中Ep-cam的过表达可以作为独立的标记对预后的生存率作出有效的评价。如在正常宫颈上皮、宫颈上皮内瘤变及宫颈鳞癌中，Epcam表达逐渐增强。因而针对不同的肿瘤分析Epcam的表达情况可以作为肿瘤分化程度的标志。

发明内容

为此，需要提供一种特异性强、敏感性强的识别Ep-cam的抗体。为实现上述目的，发明人提供了一种抗Ep-cam蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列所编码。

进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.17406的小鼠杂交瘤细胞系分泌。所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系4B5E6D7，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2019年03月21日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别Ep-cam蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。

发明人还提供了一种抗Ep-cam蛋白单克隆抗体的制备方法，选取Ep-cam蛋白第24位至第265位氨基酸片段并在其C末端添加6个His作为免疫原并进行蛋白重组，所述重组蛋白经由大肠杆菌重组表达。

进一步地，所述Ep-cam蛋白的第24位至第265位氨基酸片段，其氨基酸序列为SEQID NO.1所示的氨基酸序列。

发明人还提供了一株分泌抗Ep-cam蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系4B5E6D7，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.17406。

发明人还提供了上述任一所述的抗Ep-cam蛋白单克隆抗体，在Ep-cam蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

区别于现有技术，上述技术方案取Ep-cam蛋白第24位至第265位氨基酸对应的核苷酸片段SEQ ID No.6，通过大肠杆菌进行重组表达，重组蛋白由Ep-cam蛋白第24位至第265位氨基酸片段以及组氨酸标签组成。纯化后的重组蛋白作为免疫原，对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗Ep-cam蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系4B5E6D7,以及由该细胞系所分泌的抗Ep-cam蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达Ep-cam蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1：Ep-cam蛋白表达鉴定的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图2：Ep-cam纯化后单抗的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3：肺鳞癌1免疫组化染色对比图；左侧为抗Ep-cam蛋白单克隆抗体(4B5E6D7),右侧为Ep-cam(MOC-31)。

图4：肺腺癌2免疫组化染色对比图；左侧为抗Ep-cam蛋白单克隆抗体(4B5E6D7),右侧为Ep-cam(MOC-31)。

图5：宫颈癌免疫组化染色对比图；左侧为抗Ep-cam蛋白单克隆抗体(4B5E6D7),右侧为Ep-cam(MOC-31)。

图6：结直肠癌免疫组化染色对比图；左侧为抗Ep-cam蛋白单克隆抗体(4B5E6D7),右侧为Ep-cam(MOC-31)。

图7：十二指肠免疫组化染色对比图；左侧为抗Ep-cam蛋白单克隆抗体(4B5E6D7),右侧为Ep-cam(MOC-31)。

图8：直肠免疫组化染色对比图；左侧为抗Ep-cam蛋白单克隆抗体(4B5E6D7),右侧为Ep-cam(MOC-31)。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1重组Ep-cam蛋白片段的制备

一、基因克隆

本发明选取人Ep-cam(又称hEp-cam)蛋白第24位至第265位氨基酸片段作为抗原(SEQ ID NO.1)，根据其对应碱基序列(SEQ ID NO.6)利用软件Primer5.0设计Ep-cam蛋白的特异性上游引物(SEQ ID NO.7):5'GGAATTCCATATGCAGGAAGAATGTGTCTGTGAAAAC3'(酶切位点，NdeⅠ)和下游引物(SEQ ID NO.8)：5'CCGCTCGAGGTTTTAGACCCTGCATTGAG3'(酶切位点，XhoⅠ)，进行PCR扩增。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的目的基因和用于表达的质粒载体pET28a进行NdeI和XhoI双酶切，再次电泳回收，以T4DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta，挑取平板上的克隆接种扩培，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。将PCR显示目的基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆用于进行下一步实验。

二、蛋白表达与纯化

测序正确的重组质粒pET28a(+)-Ep-cam200ug/ul取5ul加入100ul的转化至宿主菌Rosetta感受态细胞中转化制备Ep-cam-pET28a(+)-Rosetta表达菌并保种。(具体步骤如下：1.将5μL溶解的0.2μg/μL的重组质粒Ep-cam-pET28a(+)加入制备好100μL的Rosetta细菌感受态细胞中，冰上放置30min；2.将此混合液于42℃水浴中热击45s；3.再放在冰上2min；4.往此混合液中加入700μL不含抗生素的LB培养基；5.将混合液置于37℃、200rpm恒温培养振荡器中培养1h；6.取培养好的混合液200μL涂布于50μg/mL卡那霉素抗性LB固体平板培养基上，37℃恒温培养箱正置培养30min后，倒置平板培养12-16h。)挑取阳性单克隆菌落，接种于4mL含50mg/L氨苄抗性的试管LB培养基中，37℃培养过夜后将此培养液接种于200ml含有50mg/L氨苄抗性的三角瓶LB培养基中扩培，37℃，200rpm/min培养至菌液OD值达到0.6-0.8，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃继续培养21h，离心收集菌体并进行超声破碎。将破碎溶液离心后沉淀溶于适量含有8M尿素的PBS缓冲液中，逐滴加入复性缓冲液(10mMTris-HClpH8.0，400mM L-Arghydrochloride，2mMEDTA，0.5mMCysteamine)中进行复性，最后再利用Ni-NTA柱对复性后Ep-cam蛋白溶液进一步纯化，获得高纯度，构象均一性的抗原蛋白溶液。图1为Ep-cam蛋白表达鉴定的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

实施例2 4B5E6D7杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

1、常规腹腔免疫：

将实施例1中获得的Ep-cam蛋白用PBS缓冲液稀释至1mg/mL，然后与等体积的完全弗氏佐剂(CFA,Sigma公司)混合乳化，对18-20g的Balb/c小鼠(购自福州吴氏实验动物)进行腹部注射免疫，注射剂量为200μg/只。此后每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(IFA,Sigma公司)乳化，剂量为50μg/只。第3次加强免疫后14天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

2、快速免疫：

取80μL1.0mg/mL抗原溶液加入等体积160μL的博奥龙免疫佐剂混合,对18-20g的Balb/c小鼠(购自福州吴氏实验动物)进行后大腿肌肉注射，注射剂量为100μg/只。每隔21天免疫一次，第14天眼眶采血进行ELISA和IHC检测，血清效价是否达到融合条件。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例混合，1000rpm离心10min，弃上清后，在1分钟内由慢到快加入1mL预热至37℃的PEG(Sigma公司)溶液，加入过程中需轻轻转动离心管，使细胞与PEG充分接触。室温静置90s后，2min内由慢到快加入4mL预热至37℃的无血清DMEM(Hyclone公司)培养基，随后的2min内再加入10mL预热无血清DMEM培养基，最后2min内加完剩余的预热无血清DMEM培养基，定容至50mL，整个加入过程需要缓慢摇动离心管，确保混合均匀，减轻对细胞的伤害。室温静置10min后离心(1000rpm，5min)，弃上清，用10～20mL HAT(Sigma公司)培养基重悬细胞，并用HAT培养基稀释至终浓度为0.5×10⁶cells/mL，所有溶液转移至96孔板中，200μL/孔，并做好标记。将96孔培养板小心转移至37℃，5％CO2培养箱中培养。定期检查细胞的生长状态及潜在的污染，注意尽量少开合培养箱，确保培养环境稳定。融合后第5天，向培养板中补加HAT培养基，50μL/孔。

三、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

当融合细胞直径长至大概为1～2mm时，吸取50～200μL培养液上清进行首次细胞筛选(ELISA、IHC-P及其他方法检测)，同时往培养孔中补加HAT培养基至200μL。ELISA检测该培养液上清，将检测得到阳性结果的培养孔内细胞培养液全部转移至24孔培养板，补加HT培养基，2mL/孔，培养3天。

重复筛选24孔板中各细胞株，剔除不是阳性结果的培养孔细胞，获得阳性结果较好的培养孔细胞。将这些24孔培养板得到的阳性孔细胞采用有限稀释法进行亚克隆筛选，即将有限稀释法得到细胞液加入96孔培养板中转移至CO₂培养箱培养11天，待克隆细胞直径为1～2mm时，重复进行细胞筛选。根据检测结果，每个亚克隆细胞株，选取4个生长良好的单克隆阳性培养孔，并转移至24孔板中继续培养。一段时间后再次筛选24孔板中克隆得到的阳性克隆细胞株，即为分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞株。将此细胞株转入T-75培养瓶中扩增至对数生长期保种或进行后续实验。

实施例3体外培养法制备单克隆抗体

一、体外培养

获得稳定的杂交瘤细胞系后，主要采用体外培养法获取单抗。

以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基培养杂交瘤细胞，然后低速离心后收集培养上清，4℃储存备用。

二、单克隆抗体的纯化

用rProteinAsepharoseFastFlow(GE公司)亲和层析柱纯化抗体：①装柱，将购买的ProteinA填料适量装于重力层析柱中用平衡缓冲液(0.1M Tris溶液，pH7.0)冲洗至平衡；②上样，将经过0.22μm滤膜过滤的腹水加入装好的层析柱中，控制流速1滴/秒；③平衡，上完样液后使用平衡缓冲液冲洗至平衡；④洗脱，加入洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸溶液，pH3.0)冲洗柱子并收集洗脱液；⑤再生，洗脱完成后加入平衡缓冲液冲洗柱子至平衡，2倍柱体积的20％乙醇冲洗后置于4℃保存。最后采用SDS-PAGE法鉴定抗体纯度，结果如图2Ep-cam纯化后单抗的聚丙烯酰胺凝胶电泳图所示,纯度达95％以上，紫外微量分光光度计法测定抗体浓度，浓度达到3.0mg/mL以上。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚型鉴定

将免疫原溶液稀释成1μg/mL包被酶标板,每孔加100μL，4℃包被过夜，倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗板3次，每孔加入200μL封闭液(含2％BSA的PBS-T溶液)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入稀释5倍的0.1mL杂交瘤细胞株培养液上清，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。用封闭液1：400稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ，IgM，IgG₁，IgG1，IgG_2b，IgG₃，IgA)抗体(SouthernBiotech公司)，每孔分别加入0.1mL，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加100μL TMB(湖州英创生物科技有限公司)底物(A、B等体积混合溶液)进行显色,室温反应15min，每孔加入50μL1NHCl溶液终止显色反应，然后酶标仪测定450nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被重组Ep-cam蛋白，包被浓度为100μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭1h，PBS-T洗3次。实施例3纯化的单克隆抗体，稀释成以下浓度(单位：ng/mL)：2000、500、125、62.5、31.25、15.625、3.125、0.625，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：5000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μlTMB(湖州英创生物科技有限公司)显色液，显色13min，加100μl1.0N盐溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出1/2“平台OD值”对应的抗体浓度A。利用下列公式计算出亲和常数为5.92×10⁹L×mol-1。

三、单抗反应特异性和应用效果

选择免疫原溶液，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，对Ep-cam蛋白进行15％的聚丙烯酰胺凝胶电泳。用常规湿转法将凝胶蛋白转移到PVDF膜。将膜置于5％BSA-TBST溶液中(蛋白面朝下)，于37℃摇床封闭1h，以消除非特异性背景。封闭结束后用TBST洗掉5％BSA-TBST，加入本发明制备的Ep-cam的单克隆抗体，于脱色摇床摇荡孵育1h。用TBST洗膜后，加入二抗，于脱色摇床孵育1h，使二抗与一抗充分结合。再次用TBST洗膜，加入ECL显色试剂盒。实验结果条带单一且颜色较深，说明抗体与抗原的特异性反应明显。

实施例5组织芯片染色和鉴定

一、组织蜡块制备过程

对样本组织进行HE切片染色，以确定肿瘤病变部位。对病变位点画圈，预备打孔。制作受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在56～58℃)倒入模具，将组织块放入模具中的蜡液中后再加入适量蜡液使组织块完全包埋在蜡液中，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2％APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二、IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染20秒，PBS返蓝。按照85％(3分钟)、95％(3分钟)、95％(3分钟)、100％(3分钟)、100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后两次二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。显微镜下观察结果，记录并分析。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三、样本检测结果：

用抗Ep-cam蛋白单克隆抗体(4B5E6D7)和对照抗体-市售Ep-cam(MOC-31)在51例的结直肠癌、48例的宫颈癌、46例的肺鳞癌和31例平滑肌瘤中进行同步检测，染色定位为细胞膜，结果如下表所示：

检测结果显示：

本抗体和市售抗体相比，特异性相当，敏感性和亲和力高于市售抗体，体现在部分肿瘤组织的阳性细胞数、阳性强度高于市售抗体。

在正常组织芯片上进行同步检测，样本阳性和阴性结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。

其中，

图3为肺鳞癌1免疫组化染色对比图；左侧为抗Ep-cam蛋白单克隆抗体(4B5E6D7),右侧为Ep-cam(MOC-31)。

图4为肺腺癌2免疫组化染色对比图；左侧为抗Ep-cam蛋白单克隆抗体(4B5E6D7),右侧为Ep-cam(MOC-31)。

图5为宫颈癌免疫组化染色对比图；左侧为抗Ep-cam蛋白单克隆抗体(4B5E6D7),右侧为Ep-cam(MOC-31)。

图6为结直肠癌免疫组化染色对比图；左侧为抗Ep-cam蛋白单克隆抗体(4B5E6D7),右侧为Ep-cam(MOC-31)。

正常组织芯片包括30种正常组织样本，正常组织样本主要选自新鲜、及时固定的手术标本；每种组织包括3个不同病例样本。30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。

其中，图7为十二指肠免疫组化染色对比图；左侧为抗Ep-cam蛋白单克隆抗体(4B5E6D7),右侧为Ep-cam(MOC-31)。

图8为直肠免疫组化染色对比图；左侧为抗Ep-cam蛋白单克隆抗体(4B5E6D7),右侧为Ep-cam(MOC-31)。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗CP-cam蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

<130> 2019

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 242

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Gln Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe

1 5 10 15

Val Asn Asn Asn Arg Gln Cys Gln Cys Thr Ser Val Gly Ala Gln Asn

20 25 30

Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala Lys Cys Leu Val Met Lys Ala

35 40 45

Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala

50 55 60

Leu Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly

65 70 75 80

Leu Phe Lys Ala Lys Gln Cys Asn Gly Thr Ser Thr Cys Trp Cys Val

85 90 95

Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys

100 105 110

Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile Ile Ile Glu Leu Lys His Lys

115 120 125

Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gln

130 135 140

Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gln Leu Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser

145 150 155 160

Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser

165 170 175

Ser Gln Lys Thr Gln Asn Asp Val Asp Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr

180 185 190

Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser Leu Phe His Ser Lys Lys Met

195 200 205

Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gln Leu Asp Leu Asp Pro Gly Gln Thr

210 215 220

Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly

225 230 235 240

Leu Lys

<210> 2

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

atggaatgta actggatact tccttttatt ctgtcggtaa tttcaggggt ctactcagag 60

gttcagctcc agcagtctgg gactgtgctg gcaaggcctg gggcttccgt gaagatgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacag ctttaccagc tactggatgc actggataaa acagaggcct 180

ggacagggtc tagaatggat tggtggtatt tatcctggaa atggtgatac tagttacaag 240

cagaagttca ggggcaaggc caaactgact gcagtcacat ccgccagcac tgcccacatg 300

gagctcagca gcctgacaaa tgaggactct gcggtctatt actgtataag aggggggaac 360

tactggggcc aaggcaccac tctcacagtc tcctca 396

<210> 3

<211> 396

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

atgacgagtc ctgcccagtt cctgtttctg ttagtgctct ggattcggga aaccaacggt 60

gatgttgtga tgacccagac tccactcact ttgtcggtta ccattggaca accagcctcc 120

atctcttgca agtcaagtca gagcctctta gatagtgatg gaaagacata tttgaattgg 180

ttgttacaga ggccaggcca ggctccaaag cgcctaatct atctggtgtt tagactggac 240

tctggagtcc ctgacaggtt cactggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 300

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattattgct ggcaaggtac acattttccg 360

tggacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaag 396

<210> 4

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Ile Ser Gly

1 5 10 15

Val Tyr Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Gly Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Lys

65 70 75 80

Gln Lys Phe Arg Gly Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala His Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asn Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ile Arg Gly Gly Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

115 120 125

Thr Val Ser Ser

130

<210> 5

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

Met Thr Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg

1 5 10 15

Glu Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser

20 25 30

Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser

35 40 45

Leu Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg

50 55 60

Pro Gly Gln Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Phe Arg Leu Asp

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys

130

<210> 6

<211> 726

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 6

caggaagaat gtgtctgtga aaactacaag ctggccgtaa actgctttgt gaataataat 60

cgtcaatgcc agtgtacttc agttggtgca caaaatactg tcatttgctc aaagctggct 120

gccaaatgtt tggtgatgaa ggcagaaatg aatggctcaa aacttgggag aagagcaaaa 180

cctgaagggg ccctccagaa caatgatggg ctttatgatc ctgactgcga tgagagcggg 240

ctctttaagg ccaagcagtg caacggcacc tccatgtgct ggtgtgtgaa cactgctggg 300

gtcagaagaa cagacaagga cactgaaata acctgctctg agcgagtgag aacctactgg 360

atcatcattg aactaaaaca caaagcaaga gaaaaacctt atgatagtaa aagtttgcgg 420

actgcacttc agaaggagat cacaacgcgt tatcaactgg atccaaaatt tatcacgagt 480

attttgtatg agaataatgt tatcactatt gatctggttc aaaattcttc tcaaaaaact 540

cagaatgatg tggacatagc tgatgtggct tattattttg aaaaagatgt taaaggtgaa 600

tccttgtttc attctaagaa aatggacctg acagtaaatg gggaacaact ggatctggat 660

cctggtcaaa ctttaattta ttatgttgat gaaaaagcac ctgaattctc aatgcagggt 720

ctaaaa 726

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 7

ggaattccat atgcaggaag aatgtgtctg tgaaaac 37

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 8

ccgctcgagg ttttagaccc tgcattgag 29

Claims

1. 一种抗Ep-cam蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列所编码。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO.17406的小鼠杂交瘤细胞系分泌。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别Ep-cam蛋白。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。

6.一株分泌抗Ep-cam蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系4B5E6D7，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.17406。

7.权利要求1-5任一所述的抗Ep-cam蛋白单克隆抗体在制备Ep-cam蛋白免疫检测试剂中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。