CN111454365A

CN111454365A - 抗msh6蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111454365A
Application number: CN202010289898.4A
Authority: CN
Inventors: 杨清海; 高惠然; 陈泳; 胡滨阳; 王小亚
Original assignee: Fuzhou Maixin Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Fuzhou Maixin Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2020-04-14
Filing date: 2020-04-14
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2040-04-14
Also published as: CN111454365B

Abstract

本发明涉及生物检测领域，提供了一种抗MSH6蛋白单克隆抗体,其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。发明人还提供了抗MSH6蛋白单克隆抗体的制备方法，其免疫小鼠所用的抗原为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码，经由大肠杆菌重组表达的重组蛋白。发明人还提供了一株分泌抗MSH6蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系AbM58060‑20A2‑PU，保藏号为：CGMCC NO.17492。抗MSH6蛋白单克隆抗体,具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达MSH6蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

Description

抗MSH6蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗MSH6蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。

背景技术

MSH6全称为MutS homolog6(E.coli)，是一种错配修复基因，定位于2 号染色体的P臂16位上。DNA错配修复对于超时遗传信息完整性的维持是非常必要的。微卫星重现性的改变是由于DNA复制时铰链不对位产生滑动而导致的结果，又称为微卫星不稳定性。突变型的错配修复基因常表达于高频度微卫星不稳定(MSI-H)患者中，与常染色体的显性遗传性疾病相关，称为遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC)，也可见于散发性(MSI-H)结直肠癌患者。

错配修复(MMR)蛋白是一组细胞核内酶，存在于所有的增殖细胞内，参与发生了DNA复制过程碱基错配的修复。这些蛋白形成复合物(异二聚体)结合于非正常的DNA并启动清除过程。MMR蛋白的丧失导致增殖细胞中DNA复制错误的堆积，特别是位于短重复核苷酸序列基因组的区域，这种现象即为所谓的微卫星不稳定性(MSI)，因此，细胞中的MMR蛋白的缺失与微卫星高度不稳定(MSI-H)密切相关，与此相反即是微卫星低度不稳定(MSI-L)和微卫星稳定(MSS)。

人类已经认定的错配修复功能的基因有九个，其中五种和临床关系密切，因为在遗传性非息肉病性结直肠癌(HNPCC，又称Lynch综合征)中可能发生突变，其中MSH6发生频率9％。MSH2与MSH6形成异二聚体复合物，当MSH2 缺乏时，MSH6蛋白也同样缺失，可能是由于蛋白的不稳定造成的。

目前，其用途主要为：联合检测MSH2、MSH6、PMS2、MLH1可用于Lynch syndrome(遗传性非息肉性结肠癌)的筛查。

发明内容

发明人提供了一种抗MSH6蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列所编码。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别MSH6蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.17492的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系AbM58060-20A2-PU，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2019年04月3日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

进一步地，所述抗MSH6蛋白为小鼠IgG2b亚型单克隆抗体。

发明人还提供了一种抗MSH6蛋白单克隆抗体的制备方法，其免疫小鼠所用的抗原为SEQ ID NO.1所示核苷酸序列编码，经由大肠杆菌重组表达的重组蛋白。

发明人还提供了一株分泌抗MSH6蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系AbM58060-20A2-PU，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.17492。

发明人还提供上述任一所述的抗MSH6蛋白单克隆抗体，在MSH6蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

区别于现有技术，上述技术方案依据MSH6蛋白、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择MSH6蛋白第1-100位氨基酸序列与GST蛋白融合表达,其DNA编码序列为SEQ ID No.1,用大肠杆菌进行表达，得到免疫原。对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗MSH6蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系AbM58060-20A2-PU,以及由该细胞系所分泌的抗 MSH6蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达MSH6蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1为纯化后重组MSH6蛋白的电泳结果图,其中M：分子量标记、1：0.5mg/ml 的BSA2：0.04mg/ml的MSH-6 3、2.0mg/ml的MSH-6。

图2为结肠癌组织免疫组化染色结果图(左为AbM58060-20A2-PU分泌的MSH6，右为市售MSH6)。

图3为膀胱癌组织免疫组化染色结果图(左为AbM58060-20A2-PU分泌的MSH6，右为市售MSH6)。

图4为睾丸组织免疫组化染色结果图(左为AbM58060-20A2-PU分泌的MSH6，右为市售MSH6)。

具体实施方式

实施例1重组MSH6蛋白片段的制备

一、抗原片段选择

依据Uniprot中登录号为P52701的蛋白质序列进行序列和二级结构分析，全长为1360个氨基酸长度的MSH6蛋白含有MutS超家族区域，其分子量约为 152kDa左右，依据通过在线服务器 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/预测的蛋白的二级结构(secondary structure)和表面可及性(Surface Accessibility)参数，并通过对其抗原性指数(Jameson BA,Wolf H.The antigenic index:a novel algorithm for predictingantigenic determinants.Comput Appl Biosci. 1988,4(1):181-6.)的分析结果，选择靠近N末端的氨基酸区域1-100位氨基酸序列与GST蛋白融合表达为抗原片段，抗原片段的DNA编码序列为SEQ ID No.1。

二.重组MSH6蛋白片段的表达和纯化

将SEQ ID No.1的DNA序列直接合成并克隆进克隆载体质粒pUC57(南京金斯瑞生物科技有限公司)。该DNA片段5’端和3’端分别带有EcoRI和XhoI 酶切位点，取5μL(约1微克)带有MSH6片段的质粒pUC57-MSH6和用作载体的pET30a-GST(Merck)5μL(约1微克)分别进行双酶切，酶切体系为： EcoRI(TakaRa)1μL，XhoI(TaKaRa)1μL，5μL 10×buffer H，38μLddH2O， 37℃酶切三小时。酶切产物经1％琼脂糖电泳，柱离心式DNA回收试剂盒(北京华大蛋白质研发中心有限公司)切胶回收基因和载体片段。取2μL回收的线性化载体，3μL酶切回收的MSH6基因片段，5μL 2×EZ-lig T4DNA快连试剂(北京华大蛋白质研发中心有限公司)，混匀，室温连接三十分钟。取出-80℃保存的感受态细胞(BL21)，解冻后加入连接产物，冰上放置30min。 42℃热激90秒后冰浴2min后，加入800μL无抗性的LB培养基。37℃复苏培养20min，涂板。从转化的平板挑单克隆到1.5ml LB液体培养基中，37℃， 200rpm培养，DNA测序(北京华大基因)。

将测序正确的克隆菌液2ul活化的菌液到5ml LB液体培养基中，37℃，200 rpm，培养。将培养的菌液转接到500ml LB液体培养基混合，37℃，200rpm，培养至OD＝0.6-0.8，IPTG(0.5mM)低温过夜诱导。400ml大离心筒，6000 rpm，离心5min收集菌体，弃上清。沉淀用20-30ml 10mM Tris-HCl(pH 8.0) 和终浓度为0.5M的NaCl溶液吹散，超声破碎菌体。12000rpm离心20分钟，取离心上清上样到Ni-NTA镍柱(QIAGEN)进行纯化，之后分别用含15mM咪唑、60mM咪唑、300mM咪唑的10mM Tris-HCl(pH 8.0)(含0.5M氯化钠)溶液洗脱，分别收集蛋白峰，电泳检测，备用；所制备的重组蛋白，蛋白浓度为0.5mg/ml，纯度为80％。

图1为纯化后重组MSH6蛋白的电泳结果图,其中M：分子量标记、1：0.5mg/ml 的BSA2：0.04mg/ml的MSH-6 3、2.0mg/ml的MSH-6

实施例2 AbM58060-20A2-PU杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中的重组蛋白用弗氏完全佐剂(Sigma公司，F5881)乳化，免疫ICR小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司，F5506)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7 天，MSH6-1蛋白，2ug/ml，4℃包被过夜，ELISA检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合：

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCCNumberCRL-8287)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃ 5％CO₂培养箱中培养。

三、克隆化及ELISA筛选阳性杂交瘤细胞：

融合后11天，克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团(10板×93个)打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃ 5％CO₂培养箱中培养。

3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μL上清进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μL含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。筛选出分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞株AbM58060-20A2-PU。将此细胞株转入T-75培养瓶中扩增至对数生长期保种或进行后续实验。

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数～5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或 -20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚型鉴定

用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween 的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清， 37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2b， IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μL含0.15％ ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸缓冲液(PH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG2b型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

包被MSH6重组蛋白，包被浓度为2μg/ml,100μL/孔，4℃包被过夜，PBS-T 洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μL， 37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和 0.03％H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μL 0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出≥1/2“平台OD值”对应的稀释倍数A。利用下列公式计算出亲和常数为 3.07×10⁹。

三、单抗反应特异性和应用效果

选择MSH6重组蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明单克隆抗体的识别特异性，免疫印迹实验过程如下：每种蛋白上样约5-10ng，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF 膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入单克隆抗体MSH6(1：1000稀释)4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDoc MP多色荧光成像系统(Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。

实施例5组织芯片染色和鉴定

一、芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。对肿瘤靶位点画圈，预备打孔。制作空白受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在55～58℃)倒入模具，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出。在组织样品机上选择1mm直径的样品针在受体蜡块上打孔，孔深3～4mm，用另一直径1mm的打孔针在蜡块的标记部位打孔采集组织芯，其长度比受体蜡块的孔深浅0.1mm左右。将采集到的组织芯直接插入或用镊子小心夹取插入受体蜡块的空孔内。如此反复直至完成全部样品点的制备。最后用载玻片将所有组织芯按平，使组织芯片蜡块平坦光滑。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入60℃烤箱内15min，使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为3μm，将连续切片漂在凉水中,让其自然展开，再将分开的切片转移到 45℃的温水中展片30秒，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入65℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二、IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃) 孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染20秒， PBS返蓝。按照85％(3分钟)、95％(3分钟)、95％(3分钟)、100％(3分钟)、100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后两次二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三、样本检测结果：

用本发明制备的抗MSH6蛋白单克隆抗体和市售抗MSH6蛋白单克隆抗体 (鼠单抗44)对骨髓和脾脏细胞进行检测，结果显示:AbM58060-20A2-PU细胞株所分泌的抗MSH6蛋白单克隆抗体的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。在阳性组织检测中，阳性强度都高于市售抗体，特别是结直肠癌和胃癌，检测的阳性率都高于市售抗体，在以上两种肿瘤的检测中可有效的协助病理医生诊断，降低误诊。

图2为结肠癌组织免疫组化染色结果图(左为AbM58060-20A2-PU分泌的 MSH6，右为市售MSH6)。图2中，AbM58060-20A2-PU的MSH6为阳性，而市售MSH6为阴性。

图3为膀胱癌组织免疫组化染色结果图(左为AbM58060-20A2-PU分泌的 MSH6，右为市售MSH6)。图3中，AbM58060-20A2-PU的MSH6为高度阳性(+++)，而市售MSH6为弱阳性(+)。

阴性样本检测中，本抗体检测结果和市售抗体一致，特异性一致。

在30种正常组织芯片上进行同步检测，样本阳性和阴性结果一致，但在阑尾和睾丸组织中，AbM58060-20A2-PU的MSH6染色强度高于市售抗体，进一步说明了其敏感度较高。

图4为睾丸组织免疫组化染色结果图(左为AbM58060-20A2-PU分泌的MSH6，右为市售MSH6)。图4中，AbM58060-20A2-PU的MSH6为高度阳性(+++)，而市售MSH6为中度阳性(++)。

30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗MSH6蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

<130> 2020

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 300

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 1

atgtcgcgac agagcaccct gtacagcttc ttccccaagt ctccggcgct gagtgatgcc 60

aacaaggcct cggccagggc ctcacgcgaa ggcggccgtg ccgccgctgc ccccggggcc 120

tctccttccc caggcgggga tgcggcctgg agcgaggctg ggcctgggcc caggcccttg 180

gcgcgctccg cgtcaccgcc caaggcgaag aacctcaacg gagggctgcg gagatcggta 240

gcgcctgctg cccccaccag ttgtgacttc tcaccaggag atttggtttg ggccaagatg 300

<210> 2

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Ser Tyr Ser

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Ala Gln Asp Val Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Arg Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Ile Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Val Tyr His Gly Gly Phe Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala

115

<210> 3

<211> 113

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

Gly Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Ile

1 5 10 15

Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Phe

20 25 30

Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Gln

35 40 45

Ser Pro Lys Arg Leu Met Tyr Gln Val Ser Arg Leu Asp Pro Gly Ile

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys

65 70 75 80

Ile Ser Arg Val Glu Ala Asp Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys Ser Gln

85 90 95

Gly Ser Phe Tyr Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 4

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

gaggtgaagc tgcaggagtc aggacctagc ctggtgaaac ctggggcctc agtgaagatt 60

tcctgcaaag cttctggcta taaattcagt tactcctgga tgaactgggt gaaacagagg 120

cctggaaagg gtcttgagtg gattggatgg atttatcctg cacaagatgt tactaattac 180

aatggaaaat tcagggacaa ggccacactg actgcagaca tatcctcaag cacagcctac 240

atgcagctca gcggcctgac ctctgaggac tctgcggtct atttctgtgt ctaccatggt 300

ggctttcttg acttttgggg ccaaggtacc actctcacag tctcctcagc c 351

<210> 5

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

ggtgatatct tgatgaccca atctccactc tctttgtcgg ttaccattgg acaaccagcc 60

tctatctcct gcaagtcaag tcagagcctc ttatttagtg atggcaagac atatttgaac 120

tggttacaac agaggccagg ccagtctcca aagcgcctaa tgtatcaggt atccagattg 180

gaccctggca tccctgacag gttcagtggc agtggatcag agacagattt cacacttaaa 240

attagcagag tggaggctga cgatttggca atttattact gctcgcaagg ttctttttat 300

cctcagacgt tcggtggagg caccaggctg gaaatcaaa 339

Claims

1.一种抗MSH6蛋白单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于,所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列所编码。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别MSH6蛋白。

4.一种抗MSH6蛋白单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO.17492的杂交瘤细胞系产生。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于,所述抗MSH6蛋白为小鼠IgG2b亚型单克隆抗体。

6.一种抗MSH6蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，其免疫小鼠所用的抗原为SEQID NO.1所示核苷酸序列编码，经由大肠杆菌重组表达的重组蛋白。

7.一株分泌抗MSH6蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系AbM58060-20A2-PU，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO.17492。

8.权利要求1-5任一所述的抗MSH6蛋白单克隆抗体，在MSH6蛋白免疫检测中的用途。

9.根据权利要求8所述的免疫检测，其特征在于，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。