CN113045667B

CN113045667B - 抗ido1蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

Info

Publication number: CN113045667B
Application number: CN202110517847.7A
Authority: CN
Inventors: 傅椿辉; 杨清海; 陈惠玲; 王小亚
Original assignee: Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Current assignee: Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Priority date: 2021-05-12
Filing date: 2021-05-12
Publication date: 2022-04-22
Anticipated expiration: 2041-05-12
Also published as: CN113045667A

Abstract

本发明涉及一种可以识别人IDO1抗原的单克隆抗体，分泌细胞株、其制备方法以及其在免疫检测中的用途。上述技术方案选取IDO1蛋白的1‑403位氨基酸片段，进行密码子优化，成为适合在大肠杆菌BL21(DE3)表达的IDO1重组肽段，最后得到的重组蛋白包含GST蛋白标签、IDO1重组肽段及组氨酸蛋白标签。所述重组蛋白对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗IDO1蛋白单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株19C5,以及由该细胞株所分泌的抗IDO1蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达IDO1蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

Description

抗IDO1蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗IDO1蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用。

背景技术

吲哚胺2，3－双加氧酶1(indoleamine 2，3–dioxygenase 1，IDO1)主要存在于人类胎盘和哺乳动物中，由人类8p12染色体上的IDO-1基因编码，它是色氨酸转化为犬尿氨酸类的限速酶。IDO在肿瘤微环境中的肿瘤细胞和抗原递呈细胞上过表达，IDO激活促进色氨酸分解产生犬尿氨酸，后者诱导T细胞耗竭。

IDO1在人多种癌症中表达，IDO1的过表达与很多种癌症的发展进程及转移相关。IDO1既可以在肿瘤细胞中表达也可以在宿主的抗原提呈细胞中表达。通过过表达IDO1，肿瘤可以创造一个免疫抑制的微环境来阻断抗肿瘤的免疫反应。IDO1介导肿瘤免疫逃逸包括以下几种途径：(1)色氨酸耗竭：色氨酸是人体细胞生长、增殖的必需氨基酸之一。IDO1过度表达引起色氨酸缺乏，导致T淋巴细胞、NK细胞等不能有效完成增殖、分化，由于细胞凋亡而被清除；(2)色氨酸有毒代谢产物：色氨酸代谢犬尿氨酸途径的中间产物如3-羟基邻氨苯甲酸、喹啉酸、吡啶甲酸等具有抑制活化T细胞的功能，引起胸腺细胞及T淋巴细胞溶解、凋亡。(3)诱导调节性T细胞(Tregs)细胞：一是通过GCN2(general control nonderepress-ible2)途径直接激活Tregs细胞，抑制效应T细胞的增殖。二是在耐受型DCs中IDO1的表达能够促进DCs成熟，从而间接活化Tregs细胞。研究结果提示，诱导肿瘤局部Tregs细胞的增殖是IDO1介导局部微环境发生免疫耐受的主要调控机制。如今，免疫治疗已成一种新的抗肿瘤治疗方法，其发展前景广阔。由于IDO1经过上述途径可产生肿瘤免疫抑制，因此有可能成为新的免疫治疗靶点。

发明内容

发明人提供了一种抗IDO1蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO.5所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别IDO1蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体为小鼠IgG₁亚型单克隆抗体。

进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO 20770的杂交瘤细胞株产生。

发明人又提供了一种抗IDO1蛋白单克隆抗体的制备方法，其用于免疫小鼠的抗原为重组蛋白，所述重组蛋白由大肠杆菌重组表达，包含IDO1重组肽段及组氨酸蛋白标签；所述IDO1重组肽段的氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

发明人还提供了一株分泌抗IDO1蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株19C5，所述细胞株已于2020年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO 20770，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

发明人还提供了上述单克隆抗体在IDO1蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

发明人最后提供了一种IDO1蛋白免疫组化检测试剂，所述免疫组化检测试剂含有重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的抗IDO1蛋白单克隆抗体为其有效成分。

区别于现有技术，本发明所产生的有益技术效果为：上述技术方案选取IDO1蛋白的1-403位氨基酸片段，进行密码子优化，成为适合在大肠杆菌BL21表达的IDO1重组肽段，最后得到的重组蛋白包含IDO1重组肽段及组氨酸蛋白标签。所述重组蛋白对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗IDO1蛋白单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株19C5,以及由该细胞株所分泌的抗IDO1蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达IDO1蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1为实施例1融合组氨酸标签的IDO1重组肽段纯化结果胶图，其中M表示Marker；1为超声后全菌样本；2为超声后上清液样本；3为超声后沉淀样本；4为未诱导对照样本。

图2为霍奇金淋巴瘤免疫组化染色结果对比图；其中左为19C5分泌的IDO1，右为市售IDO1。

图3为淋巴结组织免疫组化染色结果对比图；其中左为19C5分泌的IDO1，右为市售IDO1。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1重组IDO1蛋白片段的制备

一、基因优化与合成

IDO1按照Uniprot数据库中登录号为P14902的蛋白质序列，选择DO1的1-403位氨基酸片段，为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；直接优化成适合在大肠杆菌BL21表达的基因片段。在PCR的过程中在基因5’和3’端分别加入EcoRI和XhoI酶切位点。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体Pet30a进行EcoRⅠ和XhoI酶切，再次电泳回收，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞Rosetta，挑取平板上的克隆接种，进行菌液PCR鉴定。挑选PCR结果阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆使用。

选择不同的抗原进行免疫可能制备出不同结合特性的抗体，该分子同时存在多种因可变剪切引起的变异体，最终导致不同抗体对表达抗原细胞的识别能力和模式不同。IDO1分子按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达，选择IDO1的1-403位氨基酸片段,进行密码子优化，所得到IDO1重组肽段分子量约为51kDa。通过序列优化设计利用原核表达基因序列获得IDO1重组肽段。而重组免疫原由具有抗原性的IDO1重组肽段及用于重组蛋白纯化的蛋白标签组成，蛋白标签为HIS。

二、蛋白表达和纯化

按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100mL LB培养基，加入终浓度为10μg/mL的卡那霉素，37℃振荡培养至OD600为0.6-0.8，加入1mmol/L的IPTG，16℃震荡培养过夜，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化。用500mmol/L咪唑进行洗脱，SDS PAGE分离检测。

图1为融合组氨酸标签的重组IDO1蛋白纯化结果胶图。蛋白浓度为0.5mg/mL，可用于动物免疫和抗体筛选与鉴定的要求。

实施例2杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1制备的IDO1重组肽段用弗氏完全佐剂(Sigma公司，F5881)乳化，免疫4-6周龄雌性ICR小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为20μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司，F5506)乳化，剂量为20μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCCNumberCRL-8287)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

三、克隆化及ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO2培养箱中培养。3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μL上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μL含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数约5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl含0.15％ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸缓冲液(pH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。

结果显示，本发明单克隆抗体为IgG₁型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

取实施例1中制备的IDO1重组肽段，包被浓度为2μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例3中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找到最大结合OD值的一半时对应的稀释倍数A，利用下列公式计算出该抗体的亲和常数为7.68×10⁹。

三.单抗反应特异性和应用效果

取实施例1中制备的IDO1重组肽段，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入由19C5杂交瘤分泌的抗体的单克隆抗体(1：1000稀释)4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDocMP多色荧光成像系统(Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。

实施例5抗体的可变区序列测定

取培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，证实用于克隆的细胞株的确能分泌需要的抗体，结果确认后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，取9μL总RNA，加入2.5μL oligo(dT)12–18primer(10mM)，及5μL dNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5μLRT buffer(5X)，2.5μL DTT(0.1M)及1μL逆转录酶，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50μL反应体系中加入引物各25pmol，重链可变区和轻链可变区扩增用引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》(科学出版社，2005年出版)一书中鼠单抗引物序列设计和合成。

其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1μL和1U热启动Taq DNA聚合酶。设置PCR扩增程序为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25个循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μL PCR产物进行电泳分析，在1.5％琼脂糖凝胶上分离，轻链(κ轻链)的长度在320-340bp之间，重链的长度在340-370bp之间，有该区域特异产物时切胶回收，克隆至T载体或表达载体测序。

实施例6.免疫组化组织芯片染色和鉴定

一.芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。使用3DHISTECH公司的全自动组织芯片仪制作组织芯片。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入68℃烤箱内10分钟,使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为3μm，将连续切片漂在40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到50℃的温水中展片30秒，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入68℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二.IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育15-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85％(3分钟)-95％(3分钟)-100％(3分钟)-100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三.数据统计

1、肿瘤组织芯片检测结果：

将本抗体IDO1(19C5)和市售抗体IDO1(EPR20374)在45例人体多肿瘤组织芯片的进行同步检测并比较检测结果。

IDO1的免疫组化结果进行统计。整个试验过程采取双盲设计，统计结果如下表：

结果显示:19C5细胞株所分泌的抗IDO1蛋白单克隆抗体的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。在免疫组化检测中，阳性率与市售抗体相当，但阳性强度高于市售抗体。

图2为霍奇金淋巴瘤免疫组化染色结果对比图(左为19C5分泌的IDO1，右为市售IDO1)。

2、正常组织芯片检测结果：

正常组织芯片包括30种正常组织样本，正常组织样本主要选自新鲜、及时固定的手术标本；每种组织包括3个不同病例样本。30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。

将本IDO1(19C5)和市售IDO1抗体(市售EPR20374)在正常组织芯片上进行同步检测，阴阳性检测结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。

图3为淋巴结组织免疫组合染色结果对比图(左为19C5分泌的IDO1，右为市售IDO1)。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗IDO1蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

<130> 2021

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 403

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ala His Ala Met Glu Asn Ser Trp Thr Ile Ser Lys Glu Tyr His

1 5 10 15

Ile Asp Glu Glu Val Gly Phe Ala Leu Pro Asn Pro Gln Glu Asn Leu

20 25 30

Pro Asp Phe Tyr Asn Asp Trp Met Phe Ile Ala Lys His Leu Pro Asp

35 40 45

Leu Ile Glu Ser Gly Gln Leu Arg Glu Arg Val Glu Lys Leu Asn Met

50 55 60

Leu Ser Ile Asp His Leu Thr Asp His Lys Ser Gln Arg Leu Ala Arg

65 70 75 80

Leu Val Leu Gly Cys Ile Thr Met Ala Tyr Val Trp Gly Lys Gly His

85 90 95

Gly Asp Val Arg Lys Val Leu Pro Arg Asn Ile Ala Val Pro Tyr Cys

100 105 110

Gln Leu Ser Lys Lys Leu Glu Leu Pro Pro Ile Leu Val Tyr Ala Asp

115 120 125

Cys Val Leu Ala Asn Trp Lys Lys Lys Asp Pro Asn Lys Pro Leu Thr

130 135 140

Tyr Glu Asn Met Asp Val Leu Phe Ser Phe Arg Asp Gly Asp Cys Ser

145 150 155 160

Lys Gly Phe Phe Leu Val Ser Leu Leu Val Glu Ile Ala Ala Ala Ser

165 170 175

Ala Ile Lys Val Ile Pro Thr Val Phe Lys Ala Met Gln Met Gln Glu

180 185 190

Arg Asp Thr Leu Leu Lys Ala Leu Leu Glu Ile Ala Ser Cys Leu Glu

195 200 205

Lys Ala Leu Gln Val Phe His Gln Ile His Asp His Val Asn Pro Lys

210 215 220

Ala Phe Phe Ser Val Leu Arg Ile Tyr Leu Ser Gly Trp Lys Gly Asn

225 230 235 240

Pro Gln Leu Ser Asp Gly Leu Val Tyr Glu Gly Phe Trp Glu Asp Pro

245 250 255

Lys Glu Phe Ala Gly Gly Ser Ala Gly Gln Ser Ser Val Phe Gln Cys

260 265 270

Phe Asp Val Leu Leu Gly Ile Gln Gln Thr Ala Gly Gly Gly His Ala

275 280 285

Ala Gln Phe Leu Gln Asp Met Arg Arg Tyr Met Pro Pro Ala His Arg

290 295 300

Asn Phe Leu Cys Ser Leu Glu Ser Asn Pro Ser Val Arg Glu Phe Val

305 310 315 320

Leu Ser Lys Gly Asp Ala Gly Leu Arg Glu Ala Tyr Asp Ala Cys Val

325 330 335

Lys Ala Leu Val Ser Leu Arg Ser Tyr His Leu Gln Ile Val Thr Lys

340 345 350

Tyr Ile Leu Ile Pro Ala Ser Gln Gln Pro Lys Glu Asn Lys Thr Ser

355 360 365

Glu Asp Pro Ser Lys Leu Glu Ala Lys Gly Thr Gly Gly Thr Asp Leu

370 375 380

Met Asn Phe Leu Lys Thr Val Arg Ser Thr Thr Glu Lys Ser Leu Leu

385 390 395 400

Lys Glu Gly

<210> 2

<211> 351

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gaggtccagc tgcaggagtc agggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt agctatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120

ccagagaaga ggctggagtg ggtcgcagcc atttatacta atggtggtat cacctactat 180

ccagacactg tgaaggaccg attcaccatc tccagagaca atgccaagaa caccctgtac 240

ctgcaaatga acattctgag gtctgaggac acagccttgt attactgtgc aagacatgag 300

actgggggtt ttgcttactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351

<210> 3

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

gatatcatga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcttcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgtg cacagcaatg gaaacaccta tttatattgg 120

tacctgcaga agtcaggcca gtctccaaag gtcctgatct acagggtttc caaccgattt 180

tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ttcaaggcac acatgttcca 300

ttcacgttcg gcacggggac aaaattggaa ataaaa 336

<210> 4

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ala Ile Tyr Thr Asn Gly Gly Ile Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ile Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Glu Thr Gly Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

Asp Ile Met Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Val Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Thr His Val Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.一种抗IDO1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO.5所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别IDO1蛋白。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG₁亚型单克隆抗体。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO 20770的杂交瘤细胞株产生。

6.一株分泌抗IDO1蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株19C5，所述细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO20770。

7.权利要求1-5任一所述的单克隆抗体在制备IDO1蛋白免疫检测试剂中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

9.一种IDO1蛋白免疫组化检测试剂，其特征在于，所述免疫组化检测试剂含有权利要求1所述的抗IDO1蛋白单克隆抗体为其有效成分。