CN113621064B

CN113621064B - 抗cd117蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

Info

Publication number: CN113621064B
Application number: CN202110926658.5A
Authority: CN
Inventors: 赵腾; 杨清海; 陈惠玲; 王小亚; 周洪辉; 程本亮; 陈昌星
Original assignee: Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Current assignee: Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Priority date: 2021-08-12
Filing date: 2021-08-12
Publication date: 2023-03-07
Anticipated expiration: 2041-08-12
Also published as: CN113621064A

Abstract

本发明涉及一种可以识别人CD117抗原的单克隆抗体，分泌细胞株、其制备方法以及其在免疫检测中的用途。上述技术方案化学合成CD117蛋白C末端的950‑976位氨基酸为抗原肽，偶联KLH后得到免疫原。所述CD117‑KLH蛋白对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗CD117蛋白单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株33G5,以及由该细胞株所分泌的抗CD117蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达CD117蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

Description

抗CD117蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗CD117蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用。

背景技术

CD117蛋白是一种分子量为145～160kDa的跨膜蛋白，属于Ⅲ型酪氨酸激酶受体，免疫球蛋白超家族成员，分为膜外区、跨膜区和胞质区3部分。该蛋白在结构上与血小板衍化生长因子关系密切。

CD117是c-kit原癌基因的表达产物，是干细胞因子受体(c-kit受体)膜外区分子表面抗原标志，是经典的经典的肿瘤干细胞TSCs标志分子。研究发现CD117与新生血管的形成有关。干细胞因子偶联能导致受体形成二聚体并磷酸化，诱导增生并限制凋亡。

CD117(c-kit)参与信号转导，调节基因表达，控制细胞增殖和分化，并且与新生血管形成有关，因此是被广泛研究的一种TSCs标志物。研究表明，TSCs不仅参与肿瘤血管的发生，还可能通过诸如信号转导通路或者细胞塑形及横向分化等，参与恶性肿瘤的形成，以致促进肿瘤血管生成，为肿瘤的生长、侵袭和转移提供营养支持

正常情况下，CD117存在于造血干细胞、间叶组织肥大细胞、皮肤基底细胞、黑色素细胞、乳腺上皮细胞、生殖细胞和胃肠道Cajal间质细胞等，这些细胞发生的肿瘤大部分可以表达CD117。

发明内容

发明人提供了一种抗CD117蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别CD117蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体为小鼠IgG2bκ亚型单克隆抗体。

进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO 21977的杂交瘤细胞株产生。

发明人又提供了一种抗CD117蛋白单克隆抗体的制备方法，选取CD117蛋白中SEQID NO.1所示的氨基酸序列(第950-976位),在其羧基端添加了一个半胱氨酸后，与载体蛋白KLH进行偶联作为免疫原。

发明人还提供了一株分泌抗CD117蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株33G5，所述细胞株已于2021年3月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO 21977，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

发明人还提供了上述单克隆抗体在CD117蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

发明人最后提供了一种CD117蛋白免疫组化检测试剂，所述免疫组化检测试剂含有重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列的抗CD117蛋白单克隆抗体为其有效成分。

区别于现有技术，本发明所产生的有益技术效果为：上述技术方案选取CD117蛋白C末端的第950-976位氨基酸为抗原肽,偶联KLH后得到的免疫原对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗CD117蛋白单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株33G5,以及由该细胞株所分泌的抗CD117蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达CD117蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1为胃肠道间质瘤免疫组化染色结果对比图；其中左为33G5分泌的CD117，右为市售CD117。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1免疫原的制备

一、免疫原制备

依据Uniprot中登录号为P10721蛋白质序列进行序列和二级结构分析，全长为976个氨基酸长度的CD117蛋白分子量约为109kDa左右。依据通过在线服务器http://www.cbs.dtu.dk/services/NetSurfP/预测的蛋白的二级结构(secondary structure)和表面可及性(Surface Accessibility)参数，并通过对其抗原性指数(Jameson BA,WolfH.The antigenic index:a novel algorithm for predicting antigenicdeterminants.Comput Appl Biosci.1988,4(1):181-6.)的分析结果，选择第950-976位的氨基酸序列SEQ ID NO.1作为抗原肽进行化学合成，为便于偶联，在该多肽的羧基端添加了一个半胱氨酸用于提供巯基偶联。

二、多肽的偶联及纯化

选择Thermo Scientific(货号：77653)的马来酰胺活化的匙孔嘁血蓝蛋白试剂盒，按照试剂盒提供的流程操作。对于待偶联的多肽，首先以Ellman试剂(ThermoScientific，货号：22582)检测多肽中自由巯基：在96孔板中加入100μL Ellman试剂储备液，再加入10μL多肽溶，液用Nano Drop分光光度计在λ＝412nm下测其紫外吸收值，如果OD值>0.15做下一步；OD值<0.15并>0.05补加多肽，直至达到要求；OD值<0.05返回多肽合成步骤重质控。开始偶联时，在每个mcKLH包装中加入200μL去离子水，配制成10mg/mL的KLH溶液，在500μL的Imject EDC偶联缓冲液中溶解2mg半抗原，将500μL多肽溶液加入到200μL的载体蛋白溶液中，将1mL去离子水加入到一个包装的EDC(10mg)中，缓慢振摇至完全溶解，取50μL加入到mcKLH多肽溶液中，反应2小时后，经脱盐柱处理除去未偶联的交联剂和盐类，得到CD117-KLH。

实施例2杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂(Sigma公司，F5881)乳化，免疫ICR小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司，F5506)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCCNumberCRL-8287)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

三、克隆化及ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO2培养箱中培养。3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μL上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μL含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数约5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl含0.15％ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸缓冲液(PH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。

结果显示，本发明单克隆抗体为IgG2bκ型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

取实施例1中制备的CD117多肽，包被浓度为2μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。将实施例3中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找到最大结合OD值的一半时对应的稀释倍数A，利用下列公式计算出该抗体的亲和常数为4.8×10⁸。

三.单抗反应特异性和应用效果

取实施例1中制备的CD117多肽，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入由33G5杂交瘤分泌的抗体的单克隆抗体(1：1000稀释)4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDocMP多色荧光成像系统(Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。

实施例5.免疫组化组织芯片染色和鉴定

一.芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。使用3DHISTECH公司的全自动组织芯片仪制作组织芯片。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入68℃烤箱内10分钟,使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为3μm，将连续切片漂在40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到50℃的温水中展片30秒，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入68℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二.IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育15-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85％(3分钟)-95％(3分钟)-100％(3分钟)-100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三.数据统计

1、肿瘤组织芯片检测结果：

将本抗体CD117(33G5)和市售抗体CD117(兔单抗YR145)在28例胃肠道间质瘤组织芯片进行同步检测并比较检测结果。

CD117的免疫组化结果进行统计。整个试验过程采取双盲设计，统计结果如下表：

结果显示:33G5细胞株所分泌的抗CD117蛋白单克隆抗体的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。在阳性检测中，有有3例胃肠道间质瘤，33G5分泌的CD117抗体的染色强度明显高于市售CD117的染色强度；说明33G5分泌的CD117抗体敏感度更高，有效避免假阴性结果。

图1为胃肠道间质瘤免疫组化染色结果对比图(左为33G5分泌的CD117，右为市售CD117)。

2、正常组织芯片检测结果：

正常组织芯片包括30种正常组织样本，正常组织样本主要选自新鲜、及时固定的手术标本；每种组织包括3个不同病例样本。30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。

将本抗体(33G5)和市售抗体(兔单抗YR145)在正常组织芯片上进行同步检测，阴阳性检测结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗CD117蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

<130> 2021

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Val Val Asp His Ser Val Arg Ile Asn Ser Val Gly Ser Thr Ala Ser

1 5 10 15

Ser Ser Gln Pro Leu Leu Val His Asp Asp Val

20 25

<210> 2

<211> 345

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gaggtgaagc tgcaggagtc aggacctagc ctggtgcaac ctggaggatc catgagactc 60

tcctgtgttg cctctggatt cattttcagt aactactgga ttaattgggt ccgccagtct 120

ccagagatgg gacttgagtg gattgctcaa gttaaattga aatctgataa ttatgcaaca 180

cattatgcgg ggtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc gaagtctagt 240

gtctacctgc aaatgaacaa cttgaggcct gaagatactg gaatttattt ctgcttgggc 300

cgcctcgatg tctggggcgc agggaccacg gtcaccgtct cctca 345

<210> 3

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

gatatcatgc tgacccaatc tccactctct ttgtctgtta ccattggaca gccagcttcc 60

atttcttgca agtcaagtca gagcctctta tatactgatg gaaaaaccta tttgaattgg 120

ttattacaga ggccaggcca gtctccaaag ctcctaatct atctggtgtc taaactagat 180

tctggagtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actgaaaatc 240

agcagagtgg aggctgagga tttgggagtt tattactgct tgcaagctac acattttcct 300

cagacgttcg gtggaggcac caagctggaa atcaaa 336

<210> 4

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Met Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Gln Val Lys Leu Lys Ser Asp Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Gly

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Phe Cys Leu Gly Arg Leu Asp Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

Asp Ile Met Leu Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Ile Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Thr

20 25 30

Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala

85 90 95

Thr His Phe Pro Gln Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Claims

1.一种抗CD117蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQID NO.5所示的氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的编码DNA序列为SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别CD117蛋白。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG2bκ亚型单克隆抗体。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCCNO 21977的杂交瘤细胞株产生。

6.一株分泌抗CD117蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株33G5，所述细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO21977。

7.一种CD117蛋白免疫组化检测试剂，其特征在于，所述免疫组化检测试剂含有权利要求1所述的抗CD117蛋白单克隆抗体为其有效成分。