CN113061186B - 抗ca125蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用 - Google Patents

抗ca125蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113061186B
CN113061186B CN202110383268.8A CN202110383268A CN113061186B CN 113061186 B CN113061186 B CN 113061186B CN 202110383268 A CN202110383268 A CN 202110383268A CN 113061186 B CN113061186 B CN 113061186B
Authority
CN
China
Prior art keywords
monoclonal antibody
protein
leu
cell strain
thr
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110383268.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113061186A (zh
Inventor
高惠然
杨清海
王小亚
陈惠玲
林洋
李萍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Original Assignee
Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fuzhou Maixin Biotech Co ltd filed Critical Fuzhou Maixin Biotech Co ltd
Priority to CN202110383268.8A priority Critical patent/CN113061186B/zh
Publication of CN113061186A publication Critical patent/CN113061186A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113061186B publication Critical patent/CN113061186B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57449—Specifically defined cancers of ovaries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种可以识别人CA125抗原的单克隆抗体，分泌细胞株、其制备方法以及其在免疫检测中的用途。上述技术方案选取CA125蛋白C末端的13837‑14184氨基酸为抗原肽，进行密码子优化，成为适合在大肠杆菌BL21(DE3)表达的基因片段，最后得到的重组蛋白包含CA125蛋白片段及组氨酸蛋白标签。所述重组蛋白对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗CA125蛋白单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株20E3,以及由该细胞株所分泌的抗CA125蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达CA125蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

Description

抗CA125蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗CA125蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用。
背景技术
CA125是一种由定位于染色体19pl3.2区域、含有5797个碱基对的基因表达的跨膜大分子糖蛋白，因可被卵巢的浆液性囊腺癌单克隆抗体OC125识别，故被命名为卵巢癌相关抗原，它在卵巢上皮性癌中检测率较高，是目前上皮性卵巢癌的重要标志物之一，在卵巢癌的预防、筛查、病情监测、和预后方面已获得了许多有意义的结果。随着对CA125的广泛应用及研究，发现不仅卵巢细胞和肺癌细胞产生，而且在正常人浆膜上皮细胞(如胸膜、心包膜、腹膜、子宫内膜、宫颈内膜及正常肺组织包括呼吸道黏膜的柱状上皮细胞和腺体等)均可分泌CA125。由于CA125合成于上皮细胞，并储存于细胞内，正常时因细胞基膜的阻挡作用和细胞间的连接而不能入血，但在肿瘤的演进、复发、转移及其他较严重的非肿瘤性疾病过程中，细胞的上述保护屏障遭到破坏，CA125得以释放，因此，在多种恶性肿瘤中可检测到异常增高的CA125。
有研究表明，在卵巢癌中CA125水平和肿瘤大小、肿瘤分期密切相关。利用CA125还可判断残存肿瘤情况，CA125估计再手术的敏感性为50％，特异性为96％。第一个化疗周期后CA125水平可提示疾病的预后，如能降至原来水平的1/10表明病情转归良好；三个化疗周期后CA125水平持续升高者预后较差。CA125预测肿瘤复发、转移的精确度为75％。从CA125升高到出现临床症状有3-4个月。80％-90％病例中CA125与疾病的预后和转归有关。虽然CA125对卵巢癌有一定的诊断价值，但对于早期患者其诊断的敏感性还是较低。有研究者对早期卵巢癌患者进行检测，固定特异性为98％，单独检测的敏感性为48％。虽然CA125并非卵巢癌诊断“金标准”，但是CA125在卵巢癌的疗效及预后监测中发挥重要的作用。在卵巢癌患者中，约90％的病例血清CA125的升高与疾病的进展相关。总之，CA125在卵巢癌的诊断、疗效监测和病情随访方面有着很好的应用前景。
发明内容
发明人提供了一种抗CA125单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO 20773的杂交瘤细胞株产生。
进一步地，所述单克隆抗体特异性识别CA125蛋白。
进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID3所示的核苷酸序列。
进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID5所示的氨基酸序列。
进一步地，所述单克隆抗体为小鼠IgG2b亚型单克隆抗体。
发明人又提供了一种抗CA125蛋白单克隆抗体的制备方法，其用于免疫小鼠的抗原为重组蛋白，所述重组蛋白由大肠杆菌重组表达，包含CA125蛋白片段及组氨酸蛋白标签。
进一步地，所述CA125蛋白片段为CA125蛋白的第13837位至第14184位氨基酸片段，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
发明人还提供了一株分泌抗CA125蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株20E3，所述细胞株已于2020年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO 20773，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
发明人还提供了上述单克隆抗体在CA125蛋白免疫检测中的用途。
进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。
区别于现有技术，本发明所产生的有益技术效果为：上述技术方案选取CA125蛋白C末端的第13837位至第14184位氨基酸为抗原肽，进行密码子优化，成为适合在大肠杆菌BL21表达的基因片段，最后得到的重组蛋白包含CA125蛋白片段及组氨酸蛋白标签。所述重组蛋白对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗CA125蛋白单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株20E3,以及由该细胞株所分泌的抗CA125蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达CA125蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。
附图说明
图1为实施例1融合组氨酸标签的重组CA125蛋白纯化结果胶图，其中M表示Marker；1为超声后上清液样本；2为超声后沉淀样本。
图2为重组CA125蛋白免疫印迹检测结果。
图3为卵巢浆液性腺癌免疫组化染色结果对比图；其中左为20E3分泌的CA125，右为市售CA125。
图4为输卵管免疫组化染色结果对比图；其中左为20E3分泌的CA125，右为市售CA125。
具体实施方式
为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。
实施例1重组CA125蛋白片段的制备
一、基因优化与合成
CA125按照Uniprot数据库中登录号为Q8WXI7的蛋白质序列，选择第13837-14184位的蛋白片段，直接优化成适合在大肠杆菌BL21(DE3)表达的基因片段。在PCR的过程中在基因5’和3’端分别加入EcoR I和XhoI酶切位点。
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体Pet30a进行EcoRⅠ和XhoI酶切，再次电泳回收，以T4 DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑取平板上的克隆接种，进行菌液PCR鉴定。挑选PCR结果阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆使用。
选择不同的抗原进行免疫可能制备出不同结合特性的抗体，该分子同时存在多种因可变剪切引起的变异体，最终导致不同抗体对表达抗原细胞的识别能力和模式不同。CA125分子按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达，选择CA125的13837-14184氨基酸残基进行密码子优化，分子量约为45kDa。通过序列优化设计利用原核表达基因序列获得CA125蛋白。而重组免疫原由具有抗原性的CA125蛋白片段及用于重组蛋白纯化的蛋白标签组成，蛋白标签为HIS。
二、蛋白表达和纯化
按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100mL LB培养基，加入终浓度为10μg/mL的卡那霉素，37℃振荡培养至OD600为0.6-0.8，加入1mmol/L的IPTG，16℃震荡培养过夜，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化。用500mmol/L咪唑进行洗脱，SDS PAGE分离检测。
图1为重组CA125蛋白纯化结果胶图。蛋白浓度为0.5mg/mL，可用于动物免疫和抗体筛选与鉴定的要求。
实施例2杂交瘤细胞系的建立
一、免疫
将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂(Sigma公司，F5881)乳化，免疫4-6周龄雌性ICR小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为20μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司，F5506)乳化，剂量为20μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为20μg/只。
二、细胞融合
无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCCNumberCRL-8287)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO2培养箱中培养。
三、克隆化及ELISA筛选阳性杂交瘤细胞
融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO2培养箱中培养。3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μL上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μL含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。
实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体
一、腹水制备
对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数约5×105，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。
二、单克隆抗体的纯化
用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。
实施例4单克隆抗体特性鉴定
一、亚类鉴定
用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl含0.15％ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H2O2的柠檬酸缓冲液(PH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。
结果显示，本发明单克隆抗体为IgG2b型鼠源单克隆抗体。
二、亲和常数测定
取实施例1中制备的CA125重组蛋白，包被浓度为2μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H2O2的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找到最大结合OD值的一半时对应的稀释倍数A，利用下列公式计算出该抗体的亲和常数为3.84×109。
Figure GDA0003557806340000071
三.单抗反应特异性和应用效果
取实施例1中制备的CA125重组蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入由20E3杂交瘤分泌的抗体的单克隆抗体(1：1000稀释)4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDocMP多色荧光成像系统(Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。
图2为重组CA125蛋白免疫印迹检测结果图，分子量为151kDa。
实施例5抗体的可变区序列测定
取培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，证实用于克隆的细胞株的确能分泌需要的抗体，结果确认后，离心收集106以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，取9μL总RNA，加入2.5μL oligo(dT)12–18primer(10mM)，及5μL dNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5μLRT buffer(5X)，2.5μL DTT(0.1M)及1μL逆转录酶，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50μL反应体系中加入引物各25pmol，重链可变区和轻链可变区扩增用引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》(科学出版社，2005年出版)一书中鼠单抗引物序列设计和合成。
其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1μL和1U热启动Taq DNA聚合酶。设置PCR扩增程序为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25个循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μL PCR产物进行电泳分析，在1.5％琼脂糖凝胶上分离，轻链(κ轻链)的长度在320-340bp之间，重链的长度在340-370bp之间，有该区域特异产物时切胶回收，克隆至T载体或表达载体测序。
实施例6.免疫组化组织芯片染色和鉴定
一.芯片制备过程
对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。使用3DHISTECH公司的全自动组织芯片仪制作组织芯片。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入68℃烤箱内10分钟,使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为3μm，将连续切片漂在40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到50℃的温水中展片30秒，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入68℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入-4℃冰箱保存。
二.IHC染色及分析
常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H2O2孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育15-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85％(3分钟)-95％(3分钟)-100％(3分钟)-100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。
免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：
1、样本为弱阳性；标记为“+”；
2、样本为中度阳性；标记为“++”；
3、样本为高度阳性；标记为“+++”。
4、样本为阴性，标记为“-”。
三.数据统计
1、肿瘤组织芯片检测结果：
将本抗体CA125(20E3)和市售抗体CA125(TA347)在不同人体肿瘤组织芯片(包括44例的卵巢浆液性腺癌和35例的卵巢粘液性腺癌)的进行同步检测并比较检测结果。
CA125的免疫组化结果进行统计。整个试验过程采取双盲设计，统计结果如下表：
Figure GDA0003557806340000101
结果显示:20E3细胞株所分泌的抗CA125蛋白单克隆抗体的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净。在免疫组化检测中，阳性率与市售抗体相当，大部分样品阳性强度高于市售抗体，说明其敏感度更高，有效避免假阴性结果。
图3为卵巢浆液性腺癌免疫组化染色结果对比图(左为CA125、20E3，右为市售CA125)。
2、正常组织芯片检测结果：
正常组织芯片包括30种正常组织样本，正常组织样本主要选自新鲜、及时固定的手术标本；每种组织包括3个不同病例样本。30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。
将本抗体(20E3)和市售抗体(TA347)在正常组织芯片上进行同步检测，阴阳性检测结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。
图4为输卵管免疫组化染色结果对比图(左为CA125(20E3)，右为市售CA125)。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。
需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。
序列表
<110> 福州迈新生物技术开发有限公司
<120> 抗CA125蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用
<130> 2021
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 348
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Pro Leu Tyr Ser Gly Cys Arg Leu Thr Leu Leu Arg Pro Glu Lys Asp
1 5 10 15
Gly Glu Ala Thr Gly Val Asp Ala Ile Cys Thr His Arg Pro Asp Pro
20 25 30
Thr Gly Pro Gly Leu Asp Arg Glu Gln Leu Tyr Leu Glu Leu Ser Gln
35 40 45
Leu Thr His Ser Ile Thr Glu Leu Gly Pro Tyr Thr Leu Asp Arg Asp
50 55 60
Ser Leu Tyr Val Asn Gly Phe Thr His Arg Ser Ser Val Pro Thr Thr
65 70 75 80
Ser Thr Gly Val Val Ser Glu Glu Pro Phe Thr Leu Asn Phe Thr Ile
85 90 95
Asn Asn Leu Arg Tyr Met Ala Asp Met Gly Gln Pro Gly Ser Leu Lys
100 105 110
Phe Asn Ile Thr Asp Asn Val Met Gln His Leu Leu Ser Pro Leu Phe
115 120 125
Gln Arg Ser Ser Leu Gly Ala Arg Tyr Thr Gly Cys Arg Val Ile Ala
130 135 140
Leu Arg Ser Val Lys Asn Gly Ala Glu Thr Arg Val Asp Leu Leu Cys
145 150 155 160
Thr Tyr Leu Gln Pro Leu Ser Gly Pro Gly Leu Pro Ile Lys Gln Val
165 170 175
Phe His Glu Leu Ser Gln Gln Thr His Gly Ile Thr Arg Leu Gly Pro
180 185 190
Tyr Ser Leu Asp Lys Asp Ser Leu Tyr Leu Asn Gly Tyr Asn Glu Pro
195 200 205
Gly Pro Asp Glu Pro Pro Thr Thr Pro Lys Pro Ala Thr Thr Phe Leu
210 215 220
Pro Pro Leu Ser Glu Ala Thr Thr Ala Met Gly Tyr His Leu Lys Thr
225 230 235 240
Leu Thr Leu Asn Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Tyr Ser Pro Asp Met
245 250 255
Gly Lys Gly Ser Ala Thr Phe Asn Ser Thr Glu Gly Val Leu Gln His
260 265 270
Leu Leu Arg Pro Leu Phe Gln Lys Ser Ser Met Gly Pro Phe Tyr Leu
275 280 285
Gly Cys Gln Leu Ile Ser Leu Arg Pro Glu Lys Asp Gly Ala Ala Thr
290 295 300
Gly Val Asp Thr Thr Cys Thr Tyr His Pro Asp Pro Val Gly Pro Gly
305 310 315 320
Leu Asp Ile Gln Gln Leu Tyr Trp Glu Leu Ser Gln Leu Thr His Gly
325 330 335
Val Thr Gln Leu Gly Phe Tyr Val Leu Asp Arg Asp
340 345
<210> 2
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
caggtgaagc tgcagcagtc aggacctgag ctggtgaagc ctggggcttc agtgaagatg 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcact gactactaca tgatgtgggt gaaacagagc 120
catggaaaga gccttgagtg gattggagat atttatccta acagtggtga tactttctac 180
aaccagaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca tatcctccag cacagtctac 240
atgcagctca acagcctgac atctgaggac tctgcagtct attactgtgc aagaagggtg 300
gctgactact ggggccaagg caccactctc acagtctcct ca 342
<210> 3
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
gacattgtga tgacacagta tcaaaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca gaatgtgggt actgatgtat cctggtttca acagaaacca 120
gggaaatctc ctaaagcact gatttactgg gcatcaaacc ggttcactgg agtccctgat 180
cgcttcacag gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcaa tgtgcagtct 240
gaagacttgg cagattattt ctgtgagcaa tttaggacct atccgtatac gttcggatcg 300
gggaccaagc tggaaatgaa a 321
<210> 4
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Tyr Met Met Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Asp Ile Tyr Pro Asn Ser Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Ile Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Val Ala Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val
100 105 110
Ser Ser
<210> 5
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Tyr Gln Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asp
20 25 30
Val Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Asn Arg Phe Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Glu Gln Phe Arg Thr Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys
100 105

Claims (8)

1.一种抗CA125单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO 20773的杂交瘤细胞株产生。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别CA125蛋白。
3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的编码DNA序列为SEQ ID2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的编码DNA序列为SEQ ID3所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQID5所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG2b亚型单克隆抗体。
6.一株分泌抗CA125蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株20E3，所述细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO20773。
7.权利要求1-5任一所述的单克隆抗体在制备CA125蛋白免疫检测试剂中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。
CN202110383268.8A 2021-04-09 2021-04-09 抗ca125蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用 Active CN113061186B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110383268.8A CN113061186B (zh) 2021-04-09 2021-04-09 抗ca125蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110383268.8A CN113061186B (zh) 2021-04-09 2021-04-09 抗ca125蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113061186A CN113061186A (zh) 2021-07-02
CN113061186B true CN113061186B (zh) 2022-05-13

Family

ID=76566580

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110383268.8A Active CN113061186B (zh) 2021-04-09 2021-04-09 抗ca125蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113061186B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113831410B (zh) * 2021-08-12 2023-03-07 福州迈新生物技术开发有限公司 抗cd56蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113735971B (zh) * 2021-09-27 2023-06-27 福州迈新生物技术开发有限公司 抗ck18蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113845592B (zh) * 2021-09-27 2023-03-10 福州迈新生物技术开发有限公司 抗ck5/6蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7309760B2 (en) * 2001-04-17 2007-12-18 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Repeat sequences of the CA125 gene and their use for diagnostic and therapeutic interventions
US20060134116A1 (en) * 2002-03-11 2006-06-22 Universite De Sherbrooke Ca 125 tumor antigen function and uses thereof
CA2505919A1 (en) * 2002-11-15 2004-06-03 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Ca125 gene and its use for diagnostic and therapeutic interventions
WO2008127285A2 (en) * 2006-10-05 2008-10-23 The Board Of Trustees Of The University Of Arkansas Target peptides for ovarian cancer immunotherapy
AU2016233309B2 (en) * 2015-03-17 2021-11-18 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-MUC16 antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CN113061186A (zh) 2021-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113061186B (zh) 抗ca125蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113045667B (zh) 抗ido1蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN112940118B (zh) 抗ck8蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113234155B (zh) 抗Calponin蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113061184B (zh) 抗ck7蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113265003B (zh) 抗TdT蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113278070B (zh) 抗ck17蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113045652B (zh) 抗dog1蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN112940133B (zh) 抗atrx蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113105547B (zh) 抗cd5蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113087793B (zh) 抗ck14蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113072642B (zh) 抗oct3/4蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113087794B (zh) 抗HNF1β蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113234159B (zh) 抗lag3蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113583120B (zh) 抗ck20蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113234158B (zh) 抗tim3蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113845592B (zh) 抗ck5/6蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113735971B (zh) 抗ck18蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN112940125B (zh) 抗vista蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113831410B (zh) 抗cd56蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN108623683B (zh) 抗Pax-5蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113265000B (zh) 抗cdx2蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN113307875B (zh) 抗TCRβF1蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN116003607B (zh) 抗btla蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用
CN108659128B (zh) 抗cd19蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant