CN113045652A

CN113045652A - 抗dog1蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

Info

Publication number: CN113045652A
Application number: CN202110383274.3A
Authority: CN
Inventors: 程本亮; 蒋宁城; 杨清海; 陈惠玲; 王小亚
Original assignee: Fuzhou Maixin Biotechnology Development Co ltd
Current assignee: Fuzhou Maixin Biotechnology Development Co ltd
Priority date: 2021-04-09
Filing date: 2021-04-09
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2041-04-09
Also published as: CN113045652B

Abstract

本发明涉及一种可以识别人DOG1抗原的单克隆抗体，分泌细胞株、其制备方法以及其在免疫检测中的用途。技术方案选取DOG1蛋白C末端的53‑291位氨基酸为抗原肽，进行密码子优化，成为适合在大肠杆菌BL21(DE3)表达的基因片段，最后得到的重组蛋白包含DOG1蛋白片段及组氨酸蛋白标签。所述重组蛋白对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗DOG1蛋白单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株19F2,以及由该细胞株所分泌的抗DOG1蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达DOG1蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

Description

抗DOG1蛋白的单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医学工程领域，特别涉及一种抗DOG1蛋白单克隆抗体及其细胞株、制备方法和应用。

背景技术

DOG1(discovered on gastrointestinal stromal tumors protein 1)蛋白是一种新近发现的膜蛋白，DOG1,该蛋白的编码基因是TMEM家族的一员，包含有26个外显子，定位于11q13。该区域是人类癌症中扩增最频繁的区域之一，主要调控细胞周期、增值与调亡，周围有著名的癌基因，如FGF4、FGF9、CCND1、FADD、CTIN等。该蛋白主要定位于胞膜上，有八个跨膜结构，并且N端和C端均在胞质内，是一个钙离子激活的氯离子通道蛋白，推测其功能可能是一种转运蛋白。近年以来，许多研宄发现该蛋白主要在胃肠道间质瘤中选择性高表达，与传统的CD117相比，其对于诊断胃肠道间质瘤具有更高的敏感性与特异性。

很多研究同时也证明，在胃肠道间质瘤的前体细胞—卡哈儿细胞(Insterstialcell of cajal，ICC)上高表达。在人和小鼠的ICC细胞免疫荧光染色研究中发现，所有的CD117阳性的细胞上也同样存在的DOG1表达，但是在CD117阳性的肥大细胞上面没有DOG1的表达。进一步的研究发现，DOG1蛋白是细胞形成慢波，从而调节胃肠道基本电节律的基础。

目前绝大部分对于DOG1蛋白的研究是关注于其与胃肠道间质瘤的关系，而DOG1蛋白与其他肿瘤的关系目前研究较少。该蛋白的编码基因于2002年首次被报道在口腔癌中扩增，并被认为是一个潜在的癌基因。美国陆军病理研究所2009年报道了他们对1168例胃肠道间质瘤和672例其他肿瘤及正常组织的免疫组化染色结果，发现DOG1主要表达在胃肠道间质瘤(94.7％)、食管鳞癌(60％)、胃癌(26.2％)以及部分其他部位的平滑肌瘤，而在正常组织中几乎不表达。另外一篇类似的研究使用了2837例不同的肿瘤进行DOG1免疫组化染色，发现约100％的胃肠道间质瘤、10％的头颈部麟癌、13％的食管鳞癌和腺癌以及11％的膀胱腺癌为阳性结果。此外，其他的一些研究也证实DOG1蛋白在乳腺癌、胰腺癌中也有表达。

最近已有部分研宄开始探索DOG1在恶性肿瘤发生、发展中的机制。研究发现大约15％的乳腺癌中，11q13区域扩增，从而会导致DOG1蛋白高表达。此外，还发现DOG1基因扩增与蛋白高表达与乳腺癌患者疾病进展和预后不良有关。接着，在DOG1扩增的三株乳腺癌细胞系(ZR75-1、HCC1954、MDA-MB-415)、一株头颈部鳞癌细胞系(Tel1)以及一株食管鳞癌细胞系(FaDu)中将其敲降，发现细胞增殖变缓、调亡增加，而小鼠模型上移植瘤生长变慢。此外，还证实敲降或者利用药物阻滞可以抑制EGFR信号通路以及CAMKII信号通路。证实了DOG1在肿瘤增值中的意义以及作为候选治疗靶点的价值。

胰腺上皮细胞富含钙离子激活的氯离子通道，其对于调节上皮分泌、维持细胞容量、调节细胞调亡有重要意义，而DOG1就是一种钙离子激活的氯离子通道。研究发现DOG1基因及蛋白在人转移性胰腺癌细胞系扩增和高表达，在72例胰腺癌组织的免疫组化中染色发现，表达越高，分期越晚，评分越高。利用敲降后肿瘤细胞生存时间缩短、转移侵袭能力减弱。向小鼠移植瘤内直接注射可以抑制肿瘤生长。同样证明了DOG1是一种潜在癌基因。

发明内容

发明人提供了一种抗DOG1单克隆抗体，由保藏号为CGMCC NO 20771的杂交瘤细胞株产生。

进一步地，所述单克隆抗体特异性识别DOG1蛋白。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的DNA序列为SEQ ID2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的DNA序列为SEQ ID3所示的核苷酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID5所示的氨基酸序列。

进一步地，所述单克隆抗体为小鼠IgG_2a亚型单克隆抗体。

发明人又提供了一种抗DOG1蛋白单克隆抗体的制备方法，其用于免疫小鼠的抗原为重组蛋白，所述重组蛋白由大肠杆菌重组表达，包含DOG1蛋白片段及组氨酸蛋白标签。

进一步地，所述DOG1蛋白片段为DOG1蛋白的第53位至第291位氨基酸片段，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

发明人还提供了一株分泌抗DOG1蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株19F2，所述细胞株已于2020年9月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO 20771，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

发明人还提供了上述单克隆抗体在DOG1蛋白免疫检测中的用途。

进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。

区别于现有技术，本发明所产生的有益技术效果为：上述技术方案选取DOG1蛋白C末端的53-291氨基酸为抗原肽，进行密码子优化，成为适合在大肠杆菌BL21(DE3)表达的基因片段，最后得到的重组蛋白包含DOG1蛋白片段及组氨酸蛋白标签。所述重组蛋白对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗DOG1蛋白单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株19F2,以及由该细胞株所分泌的抗DOG1蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达DOG1蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测。

附图说明

图1为实施例1融合组氨酸标签的重组DOG1蛋白纯化结果胶图，其中M表示Marker；1为超声后上清液样本；2为超声后沉淀样本。

图2为胃肠道间质瘤免疫组化染色结果对比图；其中左为19F2分泌的DOG1，右为市售DOG1。

图3为乳腺组织免疫组化染色结果对比图；其中左为19F2分泌的DOG1，右为市售DOG1。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。

实施例1重组DOG1蛋白片段的制备

一、基因优化与合成

DOG1按照Uniprot数据库中登录号为Q5XXA6的蛋白质序列，选择53-291氨基酸残基的蛋白片段，直接优化成适合在大肠杆菌BL21(DE3)表达的基因片段。在PCR的过程中在基因5’和3’端分别加入EcoR I和XhoI酶切位点。

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后回收，分别对回收的融合蛋白基因和用于表达的质粒载体Pet30a进行EcoRⅠ和XhoI酶切，再次电泳回收，以T4DNA连接酶连接。连接产物转化大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)，挑取平板上的克隆接种，进行菌液PCR鉴定。挑选PCR结果阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆使用。

选择不同的抗原进行免疫可能制备出不同结合特性的抗体，该分子同时存在多种因可变剪切引起的变异体，最终导致不同抗体对表达抗原细胞的识别能力和模式不同。DOG1分子按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的区域用于重组表达，选择DOG1的53-291氨基酸残基进行密码子优化，分子量约为42kDa。通过序列优化设计利用原核表达基因序列获得DOG1蛋白。而重组免疫原由具有抗原性的DOG1蛋白片段及用于重组蛋白纯化的HIS蛋白标签组成。

二、蛋白表达和纯化

按1:100的比例将单菌落培养的过夜菌转接至100mL LB培养基，加入终浓度为10μg/mL的卡那霉素，37℃振荡培养至OD600为0.6-0.8，加入1mmol/L的IPTG，16℃震荡培养过夜，收菌后超声破碎。该重组蛋白带有组氨酸标签，使用镍柱进行蛋白质的亲和纯化。用500mmol/L咪唑进行洗脱，SDSPAGE分离检测。

图1为融合组氨酸标签的重组DOG1蛋白纯化结果胶图。蛋白浓度为0.5mg/mL，可用于动物免疫和抗体筛选与鉴定的要求。

实施例2杂交瘤细胞系的建立

一、免疫

将实施例1中交联的多肽用弗氏完全佐剂(Sigma公司，F5881)乳化，免疫4-6周龄雌性ICR小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，腹部皮下注射每只小鼠6点，剂量为60μg/只。每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(Sigma公司，F5506)乳化，剂量为30μg/只。第3次加强免疫后7天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用生理盐水混匀，剂量为50μg/只。

二、细胞融合

无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCCNumberCRL-8287)以5:1比例混合，离心1500rpm，5min。弃上清后离心管放入37℃水浴中，在1分钟内缓慢加入1ml的PEG1500(Roche公司)，并搅动细胞。在温水中静置1min后，加入10ml无血清的IMDM(Sigma公司)，混匀，离心1000rpm，5min。弃上清后，加入10ml血清(PAA公司)小心的将细胞吹打起来，并加入5ml混合10xHAT(Sigma公司)的胸腺细胞，混匀。再加入25ml含有2.1％硝基纤维素(Sigma公司)的半固体培养基充分混匀，然后均匀的倒入20个细胞培养皿中。将细胞培养皿放入到湿盒中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。

三、克隆化及ELISA筛选阳性杂交瘤细胞

融合后7天克隆细胞团大小密度适中，在解剖镜下，吸取圆、实、大的克隆团打入事先准备好培养基的96孔培养板中，放入37℃5％CO₂培养箱中培养。3天后，细胞量大约占底面积2/3，取100μL上清用免疫原和合成多肽分别进行ELISA筛选。阳性克隆完全换液，加入200μL含饲养细胞和1％HT(Sigma公司)的完全培养基。两天后进行第二次ELISA筛选，阳性克隆转入事先准备好培养基(含饲养细胞和HT)的24孔板培养。五天后取100μl上清进行第三次ELISA筛选，阳性克隆逐次转入6孔板和细胞培养瓶扩大培养并冻存。

实施例3腹水诱生法制备单克隆抗体

一、腹水制备

对数生长期细胞用无血清培养基洗涤并悬起，计数约5×10⁵，1ml。悬浮的细胞腹腔注射事先用石蜡油致敏的小鼠。7天后开始收集腹水。取出的腹水于4℃离心4000rpm，10min。小心吸出中间的腹水收集于离心管中，4℃或-20℃保存。

二、单克隆抗体的纯化

用HiTrap rProtein A FF(GE公司)亲和层析法按说明书从腹水中纯化抗体。SDS-PAGE胶鉴定纯度，Bradford法测定浓度。纯化的抗体保存于-20℃。

实施例4单克隆抗体特性鉴定

一、亚类鉴定

用100mM PBS(pH7.4)稀释包被羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)至0.5μg/ml,每孔加100μl，4℃，过夜。倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗3次，每孔加入200μl封闭液(含2％BSA和3％蔗糖的PBS)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入0.1ml杂交瘤上清，37℃孵育1h。倾空液体用PBS-T清洗3次。用封闭液1：1000稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ)抗体或1：2000稀释HRP标记的羊抗鼠(IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)0.1ml每孔分别加入适当的孔中，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加50μl含0.15％ABTS(Southern Biotech公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸缓冲液(PH4.0)进行显色反应，10-20min内测定405nm波长下的OD值。

结果显示，本发明单克隆抗体为IgG_2b型鼠源单克隆抗体。

二、亲和常数测定

取实施例1中制备的DOG1重组蛋白，包被浓度为2μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭2h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，从1：200开始2倍梯度稀释，最后1孔留空白对照，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：20000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl含0.1％TMB(Sigma公司)和0.03％H₂O₂的柠檬酸-磷酸缓冲液显色10min，加50μl0.5M硫酸溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找到最大结合OD值的一半时对应的稀释倍数A，利用下列公式计算出该抗体的亲和常数为9.6×10⁸。

三.单抗反应特异性和应用效果

取实施例1中制备的DOG1重组蛋白，用免疫印迹的方法检测本发明的单克隆抗体的识别特异性，进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。按常规方法在Bio-Rad电转移系统中将凝胶蛋白带转移到PVDF膜上(Millipore公司)。将膜置于含5％脱脂奶粉的TBS-T封闭液中4℃过夜。加入由19F2杂交瘤分泌的DOG1的单克隆抗体(1：1000稀释)4℃孵育过夜。用TBS-T洗膜后，加入1：5000稀释的羊抗鼠二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)，室温孵育1小时。再次TBST洗膜，加入ECL超敏显色液(北京普利莱基因技术有限公司)，以ChemiDocMP多色荧光成像系统(Bio-Rad)进行化学发光图像数据的采集。

实施例5抗体的可变区序列测定

取培养新鲜的杂交瘤细胞，取上清进行抗原结合特性验证，证实用于克隆的细胞株的确能分泌需要的抗体，结果确认后，离心收集10⁶以上杂交瘤细胞。Trizol法提取杂交瘤细胞总RNA，取9μL总RNA，加入2.5μLoligo(dT)12–18primer(10mM)，及5μL dNTPs，混合均匀，70℃保温5分钟后置冰上5分钟，或依照使用的逆转录酶进行变性操作。随后加入5μLRTbuffer(5X)，2.5μL DTT(0.1M)及1μL逆转录酶，42℃反应1小时。70℃孵育15分钟以终止反应，获得的cDNA保存在-20℃。将获得的第一链cDNA进行PCR扩增，在50μL反应体系中加入引物各25pmol，重链可变区和轻链可变区扩增用引物的序列按照沈倍奋主编的《重组抗体》(科学出版社，2005年出版)一书中鼠单抗引物序列设计和合成。

其余dNTPs及缓冲液均按照常规加入，最后加入cDNA模板1μL和1U热启动Taq DNA聚合酶。设置PCR扩增程序为94℃40秒，52℃40秒，72℃40秒，进行20至25个循环，最后72℃延伸3分钟，产物可置于4℃备用或直接电泳。取20μL PCR产物进行电泳分析，在1.5％琼脂糖凝胶上分离，轻链(κ轻链)的长度在320-340bp之间，重链的长度在340-370bp之间，有该区域特异产物时切胶回收，克隆至T载体或表达载体测序。

实施例6.免疫组化组织芯片染色和鉴定

一.芯片制备过程

对各样本先进行HE切片染色，以确定肿瘤部位。使用3DHISTECH公司的全自动组织芯片仪制作组织芯片。将制成的组织芯片蜡块再放入蜡块制作模具，放入68℃烤箱内10分钟,使组织芯与受体腊块的蜡融为一体，然后轻轻从烤箱中取出模具，让半融状态的石蜡在室温条件下冷却约30min，再放入-20℃冰箱冷冻6min后将组织芯片蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为3μm，将连续切片漂在40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到50℃的温水中展片30秒，用经多聚赖氨酸处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入68℃烤箱内烤片2小时，取出，室温冷却，放入-4℃冰箱保存。

二.IHC染色及分析

常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H₂O₂孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育15-30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染25秒，PBS返蓝30秒。按照85％(3分钟)-95％(3分钟)-100％(3分钟)-100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后二甲苯透明3分钟，中性树胶封片。

免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：

1、样本为弱阳性；标记为“+”；

2、样本为中度阳性；标记为“++”；

3、样本为高度阳性；标记为“+++”。

4、样本为阴性，标记为“-”。

三.数据统计

1、肿瘤组织芯片检测结果：

将本抗体DOG1(19F2)和市售抗体DOG1(SP31)在25例的胃肠道间质瘤进行同步检测并比较检测结果。

DOG1的免疫组化结果进行统计。整个试验过程采取双盲设计，统计结果如下表：

结果显示:19F2细胞株所分泌的抗DOG1蛋白单克隆抗体的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净,其中有6例的染色强度明显高于市售DOG1的染色强度，说明其敏感度更高。

图2为胃肠道间质瘤免疫组化染色结果对比图(左为19F2分泌的DOG1，右为市售DOG1)。

2、正常组织芯片检测结果：

正常组织芯片包括30种正常组织样本，正常组织样本主要选自新鲜、及时固定的手术标本；每种组织包括3个不同病例样本。30种正常组织包括：大脑、心脏、小脑、食管、肾上腺、胃、卵巢、小肠、胰腺、结直肠、甲状旁腺、肝脏、垂体、唾液腺、睾丸、肾、甲状腺、前列腺、乳腺、子宫、脾、膀胱、扁桃体、骨骼肌、胸腺(幼儿)、皮肤、骨髓、外周神经、肺、间皮细胞。

将本抗体(19F2)和市售抗体(SP31)在正常组织芯片上进行同步检测，阴阳性检测结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。

图3为乳腺组织上IHC染色结果对比图(左为19F2分泌的DOG1，右为市售DOG1)。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。

序列表

<110> 福州迈新生物技术开发有限公司

<120> 抗DOG1蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用

<130> 2021

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 239

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Leu Tyr Phe Arg Asp Gly Arg Arg Lys Val Asp Tyr Ile Leu Val Tyr

1 5 10 15

His His Lys Arg Pro Ser Gly Asn Arg Thr Leu Val Arg Arg Val Gln

20 25 30

His Ser Asp Thr Pro Ser Gly Ala Arg Ser Val Lys Gln Asp His Pro

35 40 45

Leu Pro Gly Lys Gly Ala Ser Leu Asp Ala Gly Ser Gly Glu Pro Pro

50 55 60

Met Asp Tyr His Glu Asp Asp Lys Arg Phe Arg Arg Glu Glu Tyr Glu

65 70 75 80

Gly Asn Leu Leu Glu Ala Gly Leu Glu Leu Glu Arg Asp Glu Asp Thr

85 90 95

Lys Ile His Gly Val Gly Phe Val Lys Ile His Ala Pro Trp Asn Val

100 105 110

Leu Cys Arg Glu Ala Glu Phe Leu Lys Leu Lys Met Pro Thr Lys Lys

115 120 125

Met Tyr His Ile Asn Glu Thr Arg Gly Leu Leu Lys Lys Ile Asn Ser

130 135 140

Val Leu Gln Lys Ile Thr Asp Pro Ile Gln Pro Lys Val Ala Glu His

145 150 155 160

Arg Pro Gln Thr Met Lys Arg Leu Ser Tyr Pro Phe Ser Arg Glu Lys

165 170 175

Gln His Leu Phe Asp Leu Ser Asp Lys Asp Ser Phe Phe Asp Ser Lys

180 185 190

Thr Arg Ser Thr Ile Val Tyr Glu Ile Leu Lys Arg Thr Thr Cys Thr

195 200 205

Lys Ala Lys Tyr Ser Met Gly Ile Thr Ser Leu Leu Ala Asn Gly Val

210 215 220

Tyr Ala Ala Ala Tyr Pro Leu His Asp Gly Asp Tyr Asn Gly Glu

225 230 235

<210> 2

<211> 369

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 2

gaggtgaaac tgcagcagtc tgggactgac gtggtgaagc ctggggcttc agtgaagctg 60

tcctgcaagg cttctggata taccttcact acctactgga tgcactgggt gaagcagagg 120

cctggacaag gccttgagtg gatcggagag attgatcctt ctgatagtta tacttactac 180

aatcaaaagt tcaagggcaa ggccacattg actgtagaca gatcctccag cacagcctac 240

atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagatcgaaa 300

tactatggtg actacattta ctggtacttc gatgtctggg gcgcagggac cacggtcacc 360

gtctcctca 369

<210> 3

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 3

gatatcttga tgacccaatc tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcttcc 60

atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagcactg gaaacaccca tttatattgg 120

tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acagggtttc caaccgtttt 180

tctggggtcc cagaccggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240

agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ttcaaggtac acatgttccg 300

ctcacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaa 336

<210> 4

<211> 123

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 4

Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Thr Asp Val Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Lys Tyr Tyr Gly Asp Tyr Ile Tyr Trp Tyr Phe Asp Val

100 105 110

Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial)

<400> 5

Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser

20 25 30

Thr Gly Asn Thr His Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Phe Gln Gly

85 90 95

Thr His Val Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 110

Claims

1.一种抗DOG1单克隆抗体，由保藏号为CGMCCNO20771的杂交瘤细胞株产生。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体特异性识别DOG1蛋白。

3.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的编码DNA序列为SEQID2所示的核苷酸序列，所述单克隆抗体的轻链可变区的编码DNA序列为SEQID3所示的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQID4所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列为SEQID5所示的氨基酸序列。

5.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为小鼠IgG_2b亚型单克隆抗体。

6.一种抗DOG1蛋白单克隆抗体的制备方法，其特征在于，用于免疫小鼠的抗原为重组蛋白，所述重组蛋白由大肠杆菌重组表达，包含DOG1蛋白片段及组氨酸蛋白标签。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述DOG1蛋白片段为DOG1蛋白的第53位至第291位氨基酸片段，其氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

8.一株分泌抗DOG1蛋白分子的杂交瘤细胞株，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞株19F2，所述细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO20771。

9.权利要求1-6任一所述的单克隆抗体在DOG1蛋白免疫检测中的用途。

10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。