CN106754740A - 小鼠抗人mdr‑1单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株 - Google Patents

Abstract

一种小鼠抗人MDR‑1单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。所述的分泌MDR‑1单克隆抗体的杂交瘤细胞株克隆号为6C6，保藏编号为：CGMCC No. 6917。本发明还提供了所述杂交瘤细胞株6C6产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10。该抗体可用于科研或临床免疫组化检测MDR‑1表达。

Description

小鼠抗人MDR-1单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细 胞株

技术领域

本发明涉及以原核表达的MDR-1蛋白免疫小鼠获得的分泌MDR-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C6，属于生物工程技术领域。

背景技术

多药耐药（multidrug resistance, MDR）是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物出现抗药性的同时，对其他结构不同、作用靶位各异的抗肿瘤药物也产生耐药性。肿瘤细胞产生MDR是化疗失败的重要原因，临床上许多肿瘤患者因此对化疗药物不敏感，导致化疗效果差和肿瘤的复发与转移。MDR受多因素、多机制调控，主要表现为降低化疗药物的内流、减少细胞内药物的积聚、增加能量依赖性的药物主动外排、增强DNA的修复活性、加强细胞解毒系统的作用和阻碍药物引起的凋亡等因素。

目前对多耐药（MDR）研究最多的基因是MDR-1基因。人类MDR-1基因位于7号染色体长臂上，包含28个内含子，其中26个位于蛋白编码序列区。MDR-1基因编码分子量为17kDa的跨膜糖蛋白，P-糖蛋白（P-glyco-protein），简称P-gp。P-gp为ABC蛋白家族成员之一，由1280个氨基酸组成，包含2个同源单体，是MDR-1的主要抗原蛋白，含有在MDR-1间高度保守的抗原决定簇。肿瘤细胞出现MDR的一个主要机制是MDR-1基因及其调控的P-gp增多，P-gp具有将进入细胞内的作用底物，包括化学物质和药物等主动泵出细胞外的功能，使细胞内药物浓度始终保持在非杀伤水平，由此形成耐药。

结肠癌、肾癌、肝癌、非小细胞癌、神经胶质瘤等实体瘤是容易产生MDR的恶性肿瘤，这些肿瘤的细胞常有P-gp的高度表达。急性淋巴性白血病、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞常对化疗药物敏感，但是一段时间用药后又会产生耐药性，表现为P-gp表达上调。化疗是大部分肿瘤的重要治疗方法之一，而肿瘤细胞产生的多药耐药是临床化疗的一大障碍。几乎所有肿瘤细胞均有不同程度上的MDR/P-gp的表达，但是其中对化疗药物不敏感或疗效差的肿瘤往往会有较高的MDR-1基因表达。多数研究认为，MDR-1/P-gp的表达与肿瘤对化疗的敏感性呈负相关，由此认为MDR-1基因表达与化疗疗效不佳有关，MDR-1基因表达水平也成为筛选肿瘤多耐药逆转剂的一个重要指标。MDR-1单克隆抗体应用于检测该基因表达水平对临床化疗具有指导意义。

目前，国内外已经获得了多种MDR-1的单克隆抗体，但一直以来都需要表达量更多，亲和性更好，稀释度更高，具有更多优良特性的单克隆抗体。获得活性高的MDR-1的单克隆抗体对于临床诊断和科学研究具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种高亲和性的、可用于科研或临床免疫组化检测MDR-1表达的小鼠抗人MDR-1单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

（1）根据MDR-1的基因序列（NM_000927.4）的编码框，设计一对特异引物，TrizolReagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增MDR-1基因，构建重组表达载体PET28a- MDR-1，转化大肠杆菌BL21感受态，IPTG诱导蛋白表达并亲和纯化蛋白作为抗原。

（2）采用经典的细胞融合技术制备MDR-1单克隆抗体。亲和层析纯化抗体蛋白，SDS-PAGE测定抗体纯度，直接ELISA 法测定纯化抗体的滴度。

（3）通过免疫组织化学分析MDR-1单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。

（4）根据抗体基因的恒定区序列合成特异性引物，PCR扩增单克隆抗体MDR-1重链可变区和轻链可变区，回收目的片段，克隆到pGEM-T载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后筛选阳性克隆，抽提质粒后测序确定了单克隆抗体MDR-1的重链和轻链可变区序列。

本发明提供的以原核表达的MDR-1蛋白为抗原、免疫小鼠获得的分泌MDR-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株，名称为6C6，分类命名为小鼠抗人MDR-1杂交瘤细胞系，该细胞株已于2012年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No. 6917。

本发明还提供了所述杂交瘤细胞株6C6，CGMCC No. 6917产生的单克隆抗体。该抗体包括重链可变区和轻链可变区，重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10。

本发明的优点和有益效果：

本发明应用重组人的MDR-1蛋白为免疫抗原，免疫Balb/c小鼠, 采用经典的细胞融合技术，通过ELISA筛选，获得一株能稳定分泌抗MDR-1的杂交瘤细胞株，命名为6C6，亚型鉴定为IgG1，将杂交瘤细胞株扩大培养后收集上清，采用Protein A亲和层析法对MDR-1单抗进行纯化。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上；ELISA 滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1:10000以上。人乳腺癌石蜡切片经抗MDR-1抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到呈均匀着色的棕黄色颗粒，定位于胞浆，背景清晰，无非特异性着色。从实验结果上来看，本发明制备了高效价，高特异性的MDR-1单克隆抗体，用该抗体检测证实，其对细胞中的MDR-1蛋白具有高识别能力，可用于科研或临床免疫组化检测MDR-1表达。

附图说明

图1 SDS-PAGE 分析纯化后的MDR-1单克隆抗体。

图2 ELISA 法测定MDR-1单克隆抗体滴度。

图3是免疫组织化学检测分析MDR-1单克隆抗体染色人乳腺癌石蜡切片。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常施方法。

实施例1：杂交瘤细胞株6C6及其产生的单克隆抗体的获得

1、抗原制备

（1）获得目的基因

在该实施例中，根据MDR-1的基因序列（NM_000927.4）的编码框，设计1对特异引物：

引物1 ：5'-ATAGGATCC ATGGATCTTGAAGGGGAC-3' (SEQ ID NO:1)

引物2 ：5'-CTCGAG TCACTGFCGCTTTGTTCCAG-3'；(SEQ ID NO:2)

Trizol Reagent试剂提取人脂肪组织总RNA，将总RNA逆转录成cDNA并以cDNA为模板PCR扩增MDR-1基因。

（2）构建重组表达载体

将步骤（1）获得的PCR产物双酶切后回收，在T4 DNA连接酶作用下连接入表达载体PET28a，构建重组质粒PET28a-MDR-1。

（3）获得含重组表达质粒的表达菌种

将步骤（2）获得的连接产物转化大肠杆菌BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的

固体培养基筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确，进入下步操作。以此重组质粒DNA转化表达宿主菌的感受态细胞。

（4）诱导表达和蛋白纯化

将步骤（2）提取的质粒转化BL21感受态，用含有硫酸卡那霉素的固体培养基筛选，挑选单克隆至10ml含有硫酸卡那霉素的LB液体培养基中培养，37℃，220rpm培养10h，取5ml液体培养基转移至250ml的大瓶中继续培养，培养至OD值为0.8，加入0.2mM IPTG诱导表达，16℃诱导过夜，收集菌液超声，取上清用Ni-NTA琼脂糖亲和层析法纯化MDR-1蛋白。

2、单抗的制备和纯化

(1)、免疫动物

一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行三次免疫注射。

首次免疫。纯化的重组蛋白MDR-1（用适量生理盐水稀释）+完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；

二次免疫（间隔两周）。纯化的重组蛋白MDR-1（用适量生理盐水稀释）+不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；

三次免疫（间隔两周）。纯化的重组蛋白MDR-1（用适量生理盐水稀释），不完全弗氏佐剂，100μg/只，颈背部皮下多点注射；

三次免疫后7~10天采血，用建立的ELISA法检测效价，选择效价最高者用于细胞融合。

加强免疫（融合前3天），用纯化的重组蛋白50μg腹腔注射。3天后，取脾脏融合。

(2)、细胞融合

采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞SP2/0与小鼠脾细胞按一定比例混合（1:5~1:10），并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。采用HAT选择性培养基，进行杂交瘤细胞的选择性培养和筛选。

用ELISA方法检测杂交瘤细胞培养上清：以纯化的MDR-1蛋白（10μg/ml）包被酶标板，每孔100μl，4℃包板过夜。甩掉包被液，加入200μl 5%的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，洗涤3次，加杂交瘤细胞培养检测上清100μl（阴性对照为PBS 100μl），37℃孵育1小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗（羊抗鼠 IgG-HRP），37℃孵育1小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μl，室温静置5分钟，加终止液50μl。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。OD值明显高于阴性对照2倍以上者定为阳性。最后筛选得到一株分泌性能最佳的抗MDR-1杂交瘤细胞株，命名为6C6，亚型鉴定为IgG1。

将选出的阳性杂交瘤细胞株6C6克隆化培养（有限稀释法），获得能产生高效价单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。将杂交瘤细胞株扩大培养，并冻存保种。所述的阳性杂交瘤细胞为抗人MDR-1杂交瘤细胞系6C6，该细胞系已保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 6917。

(3)单克隆抗体的大量制备与纯化

将步骤（2）获得的细胞株6C6接种至Balb/c小鼠腹腔，制备腹水，然后从腹水中提取抗体。

单克隆抗体MDR-1的纯化：采用Protein A亲和层析法。首先制备protein A亲和柱，用PBS平衡柱子后，取抗MDR-1的腹水过柱，然后用PBS洗至OD值接近于零，以50mmol/LPH2.5的甘氨酸-HCl溶液（PH）洗脱，收集峰值区的洗脱液，经透析浓缩后备用。SDS-PAGE结果显示，纯化后抗体纯度在95%以上(参见图1)。

(4) 直接ELISA 法测定纯化抗体的滴度

以纯化的MDR-1蛋白（10μg/ml）包被酶标板，每孔100μl，4℃包板过夜。甩掉包被液，加入200μl 5%的脱脂奶粉，37℃封闭1h后，洗涤3次，将纯化的抗体按1: 200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800进行稀释，以每孔100μl 加入酶标板中（阴性对照为PBS 100μl），37℃孵育1小时。洗涤3遍后，加酶标记二抗（羊抗鼠 IgG-HRP），37℃孵育1小时，去掉酶标二抗，洗涤3遍，加底物显色剂50μl，室温静置5分钟，加终止液50μl。用酶标仪检测450nm波长处的OD值。ELISA 滴度测定结果显示，单抗的滴度均在1:10000以上（参见图2）。

实施例2：单克隆抗体免疫组化应用检测

用MDR-1单抗，按常规法作病理切片，对人乳腺癌石蜡切片进行免疫组化染色。

具体方法为：

(1) 脱蜡

切片依次置于二甲苯I、II、III脱蜡每次5分钟，移至无水乙醇I、II中各浸泡4分钟，移至95%酒精中浸泡4分钟，移至85%酒精中浸泡4分钟，再移至70%酒精中浸泡4分钟，流水冲洗2分钟。

(2) 抗原修复

将已冲洗干净组织切片放入高压锅内，加入约3000ml左右的柠檬酸盐抗原修复液（pH6.0），高火加热煮沸后调至低火保持沸腾喷气3分钟，关掉电磁炉开关，两分钟后将高压锅移至冷水中冷却，待高压锅内抗原修复液完全冷却后，打开高压锅将组织切片用流水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡2分钟。

(3) 阻断

3%H₂O₂中浸泡10分钟，流水冲洗蒸馏水冲洗。取出切片，擦干组织周围的水，用免疫组化笔在组织块周围画一圆圈注意圈接头要接好，防止抗体跑出圈外造成假阴性。PBS缓冲液冲洗。

(4) 滴加一抗

甩去待测组织切片上多余的PBS，滴加一抗，其中一抗为实施例1步骤（3）制备并纯化的MDR-1单克隆抗体，稀释度为1 : 600。放置在孵育盒内4℃冰箱中过夜孵育约12小时。

(5) 滴加二抗

将孵育盒从冰箱取出，恢复至室温后取出切片，用PBS洗3次，每次5分钟。滴加通用型二抗-HRP聚合物。将切片放入孵育湿盒中，盖上盖子，连孵育盒一起放入37℃恒温箱中孵育30分钟。

(6) 显色、衬染、封片

取出切片，擦掉组织周围的多余的PBS，加入DAB显色液中显色3～5分钟，在显微镜下控制染色的强度。待强度适中后将切片置自来水中终止显色，再用流水冲洗5-10分钟，苏木素染液复染1分钟，0.5%盐酸酒精分化3秒钟，流水冲洗5-10分钟，脱水、透明、封片、镜检。

结果判定:按照国外学者对组织中MDR-1的判定标准，MDR-1蛋白阳性反应为出现明显棕黄色颗粒，定位于胞浆。人乳腺癌组织（参见图3）经抗MDR-1抗体免疫组化染色，可于光镜下观察到呈均匀着色的棕黄色颗粒，定位于胞浆，背景清晰，无非特异性着色，说明此MDR-1小鼠单克隆抗体可以特异性的应用于免疫组织化学实验。

实施例3：单克隆抗体可变区测序

根据抗体基因的恒定区序列合成以下引物：

zh09 5'-GGGGATATCCACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT-3'　 　(SEQ ID NO:3)

zhr11 5'-GACHGATGGGGSTGTYGTGCTAGCTGNRGAGACDGTGA-3' 　 　(SEQ ID NO:4)

zl01 　5'-GGGGATATCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT-3' 　 　(SEQ lD NO:5)

zlr05　5'-GGATACAGTTGGTGCAGTCGACTTACGTTTKATTTCCARCTT-3' (SEQ ID NO:6)

Trizol Reagent试剂分别提取5×10⁶杂交瘤细胞6C6的总RNA，将总RNA逆转录成cDNA。用zh08和zhr11为引物进行PCR扩增单克隆抗体MDR-1重链可变区，用zl01和zlr05为引物进行PCR扩增单克隆抗体MDR-1轻链可变区，PCR反应均采用热启动，反应条件:94℃ 5分钟；94℃ 45 秒，60℃ 45 秒，72℃ 1分10 秒，30个循环；72℃ 7 分钟。PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后回收纯化目的片段（轻链长度391 bp，重链长度420 bp）。克隆到pGEM-T(Promega)载体中，转化大肠杆菌TGl细胞后在 IPTGIX-gal平板上进行筛选，取白色菌斑接种于含有氨韦青霉素的 LB 液体培养基中扩增。筛选阳性克隆，用 QIAGEN 的质粒抽提试剂盒抽提质粒并进行测序，确定了单克隆抗体MDR-1的重链和轻链可变区序列。

单克隆抗体MDR-1可变区的 DNA 序列和氨基酸序列：

单克隆抗体MDR-1重链可变区DNA序列(5'→3'，409bp) (SEQ ID NO:7)；

单克隆抗体MDR-1的轻链可变区DNA序列(5'→3'，390bp) (SEQ 1D NO:8)；

单克隆抗体MDR-1重链可变区的推断氨基酸序列 (136氨基酸) (SEQ ID NO:9)；

单克隆抗体MDR-1轻链可变区的推断氨基酸序列(129 氨基酸) (SEQ 10 ID NO:10)。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津三箭生物技术股份有限公司

<120> 小鼠抗人MDR-1单克隆抗体及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株

<130> DNA

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物

<400> 1

ataggatcca tggatcttga aggggac 27

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物

<400> 2

ctcgagtcac tggcgctttg ttccag 26

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物

<400> 3

ggggatatcc accatggctg tcttggggct gctcttct 38

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

gachgatggg gstgtygtgc tagctgnrga gacdgtga 38

<210> 5

<211> 38

<212> DNA

<213> 引物

<400> 5

ggggatatcc accatggaga cagacacact cctgctat 38

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 6

ggatacagtt ggtgcagtcg acttacgttt katttccarc tt 42

<210> 7

<211> 409

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 7

aggtaaattg atacaactac tctgttctga gaggctcatc acacagacgt aatacatggc 60

cgtgtcctca gacctcagac tgctcattag caggtacagg atgttcctgg cattatctct 120

ggagatggtg aatcggccct tcacactgtc tggatagtag gtactaccac caccaccact 180

actaatagat gcgacccact ccagcctctt ctctggagtc tggcgaaccc aagacatggc 240

atagttactg aaagtgaatc cagaggctgc acaggagagt ttcagggacc ctccaggctt 300

cactaagcct cccccagact ccaccagctt cacttcacac tggacacctt ttaaaacaag 360

gacaaggaaa acccagctca acccgaagtt catggtggat atccccaag 409

<210> 8

<211> 390

<212> DNA

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 8

gggcgttccc ccctccgacg tgtaagctcc ctaatgtgct gacagtaata ggttgcagca 60

tcctcctcct ccacaggatg gatgttgagg gtgaagtctg tcccagaccc actgccactg 120

aacctggcag ggaccccaga ttctaggttg gatacaagat agatgaggag tctgggtggc 180

tgtcctggtt tctgttggtt ccagtgcata taactatagc cagatgtact gacacttttg 240

ctggccctgt atgagatggt ggccctctgc cccagagata cagctaagga agcaggagac 300

tgtgtcagca caatgtcacc agtggaacct ggaacccaga gcagcagtac ccatagcagg 360

agtgtgtctg tctccatggt ggatatcccc 390

<210> 9

<211> 136

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 9

Leu Gly Ile Ser Thr Met Asn Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val

1 5 10 15

Leu Val Leu Lys Gly Val Gln Cys Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly

20 25 30

Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala

35 40 45

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Thr

50 55 60

Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Gly

65 70 75 80

Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu Leu Met Ser Ser Leu Arg

100 105 110

Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Val Cys Val Met Ser Leu Ser Glu

115 120 125

Gln Ser Ser Cys Ile Asn Leu Pro

130 135

<210> 10

<211> 129

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 10

Gly Ile Ser Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu

1 5 10 15

Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro

20 25 30

Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg

35 40 45

Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn

50 55 60

Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser

65 70 75 80

Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

85 90 95

Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala

100 105 110

Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg Glu Leu Thr Arg Arg Arg Gly Glu

115 120 125

Arg

Claims (2)

1.一种以原核表达的MDR-1蛋白免疫小鼠获得的分泌MDR-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C6，保藏编号为CGMCC No. 6917。

2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株6C6产生的重链可变区氨基酸序列为SEQ IDNO:9，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:10的免疫球蛋白。