CN113698475B

CN113698475B - 抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体和猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条

Info

Publication number: CN113698475B
Application number: CN202110755498.2A
Authority: CN
Inventors: 李建; 张敏; 于义娟; 薛霜; 王碧群; 牟林琳; 黄涛; 石宝兰; 漆世华; 朱薇; 谢红玲; 郑良益; 李婷婷; 李晶梅; 冯钊; 秦红刚; 舒银辉; 徐松
Original assignee: National Pharmaceutical Group Animal Health Co ltd
Current assignee: National Pharmaceutical Group Animal Health Co ltd
Priority date: 2021-07-05
Filing date: 2021-07-05
Publication date: 2022-10-11
Anticipated expiration: 2041-07-05
Also published as: CN113698475A

Abstract

本发明提供了一种抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体和猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条，所述单克隆抗体包括：E8，重链和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1和NO：2所示；A10，重链和轻链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3和NO：4所示。所述胶体金快速检测试纸条包括：底板，粘合在所述底板上且依次搭接的样品吸收垫、结合垫、层析基质和吸水垫；所述结合垫上涂有所述E8包被的胶体金复合物；所述层析基质上靠近所述结合垫的一侧设有质控线，所述层析基质上靠近所述吸水垫的一侧设有检测线；所述质控线上涂有包被有抗鼠IgG二抗；所述检测线上包被有所述A10。特异性良好，灵敏度高。

Description

抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体和猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体和猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条。

背景技术

腹泻性疾病严重限制养猪业的发展，复杂多样的病原感染是导致猪腹泻的重要病因之一。由猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus，PDCoV)引起的新发病毒性腹泻成为当前猪病防控的又一难题。

基于临床需求，目前已经建立了多种PDCoV检测方法，然而每一种方法各有优缺点，单一的技术不能解决临床样本检测中的所有问题。病毒分离技术耗时费力，不便于快速检测，仅适合实验室病原学的研究；PCR技术设备依赖性强，需要专业人员操作，同时操作过程中易交叉污染，存在假阳性或假阴性的结果；等温扩增技术的引物设计复杂，样本容易交叉污染且结果判断不够客观；基因芯片技术的成本高且耗时相对较长，对于临床样本的检测实用性不强。一些免疫学的手段虽能检测病毒的抗体或者抗原，但不适合早期诊断，且多数限于实验室操作。目前对于PDCoV的检测多采用PCR和RT-qPCR技术，无法实现即时性检测。针对猪腹泻病的流行现状和防治要求，对于猪δ冠状病毒的诊断，不但要求高的特异性和敏感性，还需要快速、简便、易于基层规模化养殖场和基层单位使用。

因此，如何开发一种检测该疫病的胶体金快速检测试纸条，对于养殖户预防有猪δ冠状病毒引起的疫病具有重要意义。

发明内容

为了解决所述技术问题，本发明提供了一种抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体和猪 δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条，可以特异性识别猪δ冠状病毒N蛋白，抗体特异性良好，灵敏度高。

在本发明的第一方面，提供了一种抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体，包括：

抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体E8，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；

抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体A10，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

进一步地，所述单克隆抗体还包括：

所述单克隆抗体的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的抗体；

或者包括具有与所述重链可变区具有至少80％的同源性的氨基酸序列的重链可变区；和与所述轻链可变区具有至少80％的同源性的氨基酸序列的轻链可变区；

或者所述单克隆抗体的N端和/或C端连接标签得到的抗体；

所述单克隆抗体包括：人抗体、人源化或嵌合抗体。

在另外一些实施方案中，VH和/或VL氨基酸序列可以与上述序列85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源。具有与上述序列的VH和VL区高度(即80％或更高)同源的 VH和VL区的抗体可以如下获得：诱变(例如定点诱变或PCR介导的诱变)编码SEQIDNO： 1-6的核酸分子，然后用此处所述的功能试验检测编码的被改变抗体的保留的功能。

在其他实施方式中，可采用将可变区基因转化为scFv基因，一旦获得编码V_H和V_L片段的DNA片段，即可通过标准重组DNA技术进一步操作这些DNA片段，例如将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。

在这些操作中，编码V_L或V_H的DNA片段与编码另外一种蛋白质如抗体恒定区或柔性连接体的另一个DNA片段有效连接。如本文使用的术语“有效连接”意思是两个DNA片段连接在一起，使得这两个DNA片段编码的氨基酸序列保持符合阅读框。

在其他实施方式中，可通过将编码V_H的DNA与编码重链恒定区(C_H1、C_H2和C_H3)的另外一种DNA分子有效连接，可以将分离的编码V_H区的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中公知，包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选的是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，编码V_H的DNA可以与只编码重链C_H1恒定区的另外一种DNA分子有效连接。

在其他实施方式中，可通过将编码V_L的DNA与编码轻链恒定区C_L的另外一种DNA 分子有效连接，可以将分离的编码V_L区的DNA转化为全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中公知包括这些区域的DNA片段可以通过标准PCR扩增获得。在优选的实施方案中，轻链恒定区可以是κ或λ恒定区。为了产生scFv基因，将编码V_H和V_L的DNA片段与编码柔性连接体例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另外一个片段有效连接，使得V_H和V_L序列可以表达为连续的单链蛋白质，其V_L和V_H区通过该柔性连接体连接。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种编码所述单克隆抗体的核酸分子，所述核酸分子包括编码所述重链可变区的核酸分子和编码所述轻链可变区的核酸分子。

编码所述重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示；编码所述重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

在本发明的第三方面，提供了一种包含所述核酸的表达载体，所述表达载体能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。

所述载体可以是常规的载体；具体可以为质粒载体、噬菌体载体、病毒载体；

在本发明的第四方面，提供了一种包含所述的表达载体的工程菌或真核宿主细胞。

在本发明的第五方面，提供了所述的抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体在制备猪δ 冠状病毒N蛋白试剂或试剂盒中的用途。

在本发明的第六方面，提供了一种猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条，包括：

底板，

粘合在所述底板上且依次搭接的样品吸收垫、结合垫、层析基质和吸水垫；其中，

所述结合垫上涂有所述的抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体E8包被的胶体金复合物；所述层析基质上靠近所述结合垫的一侧设有质控线C，所述层析基质上靠近所述吸水垫的一侧设有检测线T；所述质控线C上涂有包被有抗鼠IgG二抗；所述检测线T上包被有所述的猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体A10。

上述技术方案中，结合垫的材质可选用聚酯纤维膜；层析基质的材质可选用硝酸纤维素膜；

进一步地，所述抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体E8包被的胶体金复合物的pH为7.2～7.6，标记量为30μg/ml胶体金溶液；

所述抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体A10浓度为1mg/ml，包被量为1～5μl/cm；所述抗鼠IgG抗体的浓度为1mg/ml，1～5μl/cm。

本申请经过试验发现用E8做金标抗体，A10做检测线包被抗体，敏感性相对高；而其他方式，比如金标抗体和检测线包被抗体都采用E8或者都采用A10，或者用A10做金标抗体，E8做检测线包被抗体敏感性都很差。

在本发明的第七方面，提供了一种采用所述猪δ冠状病毒胶体金检测试纸条进行检测方法，所述方法包括：

获得所述的猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体E8和A10；

将所述抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体E8包被的胶体金复合物的pH调整为7.2～7.6，所述抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体E8的标记量为30μg/ml胶体金溶液，经稳定剂处理后，喷涂于结合垫上，获得涂有所述的抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体 E8包被的胶体金复合物的结合垫；

将所述抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体A10稀释成1mg/ml，将抗鼠IgG抗体稀释成1mg/ml，均以1-5μl/cm喷于层析基质上，获得含有检测线T和对照线C的层析基质；

在底板上依次相互搭接粘贴样品吸收垫、涂有所述的抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体E8包被的胶体金复合物的结合垫、含有检测线T和对照线C的层析基质和吸水垫。

本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

1、本发明提供的抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体可以特异性识别猪δ冠状病毒N 蛋白，该抗体抗体特异性良好，灵敏度高，具体地：

灵敏度：PDCoV-N单抗E8和A10敏感性均达到1:8000倍(间接免疫荧光方法)，检测的抗体浓度低至200ng/ml；

特异性：E8和A10单抗均不与PEDV、PDCoV等猪肠道冠状病毒发生反应；

亲和力常数：该抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体以1×10^-7M或更低的KD与猪δ冠状病毒N蛋白结合；

2、本发明提供的猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条，操作简单方便快速：检测时间只需5-10min，不需要特殊仪器设备及专业培训，完全能够满足现场检测的需要。特异性好，灵敏度高：与猪其他疾病病原无交叉反应。结果稳定可靠，易于保存。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为本发明猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条的纵切面结构图；

附图标记说明：1、样品吸收垫；2、胶体金标记猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体E8聚酯纤维膜；3、硝酸纤维素膜；4、吸水纸；5、猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体A10的检测线T线；6、羊抗鼠IgG对照线C线；7、底板；

图2为胶体金试纸条的检测结果示意图；从左至右依次为：C、T两条线，阳性；C一条线，阴性；C无线，无效；

图3为猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条敏感性检测结果图；自左向右PDCoV稀释度分别为：10⁵TCID50/ml、10⁴TCID50/ml、10³TCID50/ml、10²TCID50/ml，加液量为0.1ml/孔；

图4为猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条特异性检测结果图；自左向右分别为猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪δ冠状病毒阴性对照；

图5为间接免疫荧光方法PDCoV-N单抗E8和A10敏感性结果；其中图5a为单抗E8 的结果；图5b为单抗A10的结果；

图6为特异性结果：E8和A10单抗均不与PEDV、PDCoV等猪肠道冠状病毒发生反应；其中图6a为单抗E8的结果；图6b为单抗A10的结果.

具体实施方式

下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

下面将结合实施例及实验数据对本申请的单克隆抗体及其制备方法与猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条进行详细说明。

实施例1、猪δ冠状病毒N蛋白基因的克隆、表达及纯化

1、重组表达质粒pCold-PDCoV-N的构建

以猪δ冠状病毒核酸为模板，通过RT-PCR扩增得到猪δ冠状病毒N基因片段，其中RT-PCR所用到的引物序列为：

PDCoV-NF：5’-ttttctcgagatggccgcaccagtagtccctactactg-3’(如SEQ ID NO：9所示)

PDCoV-NR：5’-aaaaaagcttctacgctgctgattcctgctttatctcaa-3’(如SEQ ID NO：10所示)

所述N基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；

将所述N基因片段经BamHI、SalI酶切消化处理后与同样酶切处理的原核表达载体pColdI相连，构建原核表达质粒pCold-PDCoV-N，重组表达质粒转化大肠杆菌DH5α，随机挑取单个菌落接种于5mLLB/Amp^r培养液中，37℃振摇过夜，用碱裂解法提取质粒。将PCR、酶切鉴定为阳性的重组质粒进行测序确证。

2、重组蛋白的诱导表达与纯化

将测序正确的重组表达质粒pCold-PDCoV-N再次转化大肠杆菌BL21(DE3)，挑取单菌落接入5mLLB/Amp^r培养液中，37℃振摇培养过夜，次日按1:100将菌液接入LB/Amp^r培养液，37℃振摇培养2～4h至OD₆₀₀值达到0.4～0.5时，加入IPTG至终浓度1mmol/L， 15℃继续振摇培养24h进行诱导表达。将诱导表达的样品按His.tag蛋白纯化试剂盒说明书方法进行纯化，分步洗脱并收集目的蛋白洗脱液，对纯化的蛋白进行SDS-PAGE检测。

3、重组蛋白的鉴定

将纯化的蛋白经SDS-PAGE电泳并进行膜转移后，用5％的脱脂奶粉4℃封闭过夜。以 1:5000稀释的His单克隆抗体为一抗，以HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，进行Western-blot 鉴定。鉴定结果表明成功制备得到重组猪δ冠状病毒N蛋白抗原。

实施例2、抗猪δ冠状病毒N蛋白单克隆抗体的制备

1、动物免疫及细胞融合

将实施例1纯化鉴定的重组猪δ冠状病毒N蛋白免疫B/c小鼠，三免后，取ELISA效价达到1:10000的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，以HAT培养基37℃、5％CO2培养融合细胞。

2、单克隆杂交瘤细胞株筛选及鉴定

融合后第四天开始观察集落，待集落生长至孔底约1/6时半量换HT培养基，次日PDCoV-N蛋白包板进行间接ELISA检测，挑选出阳性孔进行亚克隆。依据有限稀释法进行亚克隆，亚克隆板第5天以PDCoV-N蛋白包板进行间接ELISA检测，挑选出阳性孔转入 24孔板进行第二次亚克隆。二亚第5天，取培养上清同步进行免疫荧光(IFA)和以重组 PDCoV-N蛋白包板的间接ELISA检测。最终筛选出同时满足免疫荧光(IFA)阳性及ELISA 检测阳性的抗PDCoV-N蛋白抗体单克隆细胞株。此杂交瘤细胞即为可识别猪δ冠状病毒N 蛋白的细胞株。

3、细胞株冻存及单克隆抗体制备

将上述成功建株的杂交瘤细胞株进行冻存，同时分别打10只小鼠制备腹水，每只小鼠腹腔注射细胞量为5×10⁵～1×10⁶个/0.5mL。将制得的小鼠腹水以辛酸硫酸铵沉淀法纯化，透析，制得抗猪δ冠状病毒N蛋白(PDCoV-N)单克隆抗体。

4、抗体轻链和重链可变区测序

(1)培养杂交瘤细胞

复苏杂交瘤细胞株后培养，待细胞数扩增至约1×10⁷时，1000rpm×5min，离心收集细胞。

(2)提取细胞RNA

超净工作台环境下，将1ml Trizol试剂加入离心细胞，静置5min，加入氯仿2mL，剧烈摇晃15sec，室温静置3min，12000rpm×15min，移叏上层水样层至新的EP管，加入 0.5mL异丙醇，室温静置10min。12000rpm×10min。弃上清，加入1mL 75％乙醇，7500 rpm×5min，干燥沉淀，加入50μL双蒸水。琼脂糖电泳鉴定纯度并定量，保存于-70℃备用。

(3)反转录制备cDNA

细胞总RNA1μL，RNase Free ddH2O 6μL，oligo dT Primer 0.5μL，PRIME ScriptRT Enzyme Mix I 0.5μL，5x Prime Script Buffer 2μL，混匀，37℃15min，85℃5s。

(4)扩增cDNA

用小鼠IgG VHVL引物库，分别扩增上述cDNA。5×Prime Star Buffer 10μL，dNTP4μL， cDNA 1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，PrimeSTAR 0.5μL，补水至50μL。按以下反应条件进行PCR反应:94℃温育5min，94℃变性45s，63℃退火45s，72℃延伸1min，30 个循环后72℃延伸10min。

(5)琼脂糖凝胶电泳及胶回收

将上述PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察电泳结果，将分子量在250-350bp的扩增产物送交测序。

最终筛选得到2株抗猪δ冠状病毒N蛋白(PDCoV-N)单克隆抗体：

5、抗体性能测定

(1)如图5所示，PDCoV-N单抗E8和A10敏感性均达到1:8000倍(间接免疫荧光方法)；

(2)特异性：结果如图6所示，E8和A10单抗均不与PEDV、PDCoV等猪肠道冠状病毒发生反应。

实施例3猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条

1、胶体金-抗体结合物的制备

①取调到最佳pH9.0的胶体金和猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体E8溶液，采用30μg 单抗每1ml胶体金的比例，将胶体金和单抗充分搅拌混合15min后，加稳定剂3％PEG20000, 使终浓度为0.05％，再搅拌10～15min；

②4℃9000～11000r/min离心60min；

③小心吸取上清液，取管底疏松的粉红色沉淀部分，即为胶体金标记的抗体，用含有 1％BSA,0.02％NaN₃的0.02M Tris-HClpH7.2缓冲液稀释金标记复合物，最终回收量为原体积的10％；

④用0.22um的微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃保存备用。

2、包被抗体于硝酸纤维素膜

将猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体A10用0.01M的PBS稀释成1mg/ml。将抗鼠IgG抗体用0.01M的PBS稀释成1mg/ml。用喷膜机将二者以1-5μl/cm的速度喷于硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和对照线。两条线之间的间隔为0.5cm。

3、猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条的组装

①将样品吸收垫、聚酯纤维膜、硝酸纤维素膜、吸水纸等依次粘在底板上。

②将粘好的底板材料切成60mm长、4mm宽的试纸条，即为猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条，将试纸条密封于铝箔袋中，干燥保存。

4、猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条的敏感性及特异性试验

①产品敏感性：

将10⁵TCID₅₀/ml的PDCoV液用PBS进行稀释。分别用本试纸条进行检测，每个稀释度重复3次。结果表明，本试纸条检测PDCoV的最低限为100TCID₅₀。

②产品特异性：

分别用猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒、猪δ冠状病毒阴性对照进行交叉反应实验。结果表明，该试纸条产品与猪其它病毒性疾病间不存在交叉反应。

实施例4、猪δ冠状病毒胶体金试纸条的应用效果研究

分别采用本发明的猪δ冠状病毒胶体金试纸条和病毒分离法对40份临床样品进行检测，对比两种方法的检测结果，其中病毒分离方法按如下步骤操作：

将采集的猪肛拭子样品用含青霉素10000IU、链霉素10000μg/ml的pH7.2 PBS制成5 倍悬液，4℃条件下，3000r/min离心30min，取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤。用含8％新生牛血清的DMEM培养基培养PK1细胞，置37℃、含5％CO₂培养箱中培养，单层细胞长至80％～90％时，接种处理好的样品0.1ml。接种后置37℃、含5％CO₂培养箱吸附1小时，加入无血清DMEM继续培养5～7日，观察结果。若第一次接种未出现细胞病变，应将细胞培养物冻融后盲传三代，如仍无细胞病变，则判为猪δ冠状病毒病原分离阴性，若接种细胞出现病变，判定为阳性。

表1-猪δ冠状病毒胶体金试纸条与病毒分离方法符合率比较

检测结果显示，两种方法的阳性符合率为85.7％，阴性符合率为100％，总符合率为 95％。本发明的猪δ冠状病毒胶体金试纸条与经典的病毒分离法符合率较高，检测结果准确、可信。

最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110> 国药集团动物保健股份有限公司

<120> 抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体和猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Val Leu Ser Thr Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Ile Ser Gly

1 5 10 15

Phe Ser Leu Thr Ser Tyr Gly Val His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly

20 25 30

Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Val Gly Asn Thr Thr

35 40 45

Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Ser Arg Leu Ser Ile Thr Lys Asp Asn Ser

50 55 60

Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr

65 70 75 80

Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Val Tyr Gly Asn Ser Phe Ala Tyr

85 90 95

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

100 105

<210> 2

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ala Leu Leu Leu Ser Ser Trp Arg Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser

1 5 10 15

Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp His

20 25 30

Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser

35 40 45

Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly

65 70 75 80

Val Tyr Phe Cys Ser Gln Gly Thr His Val Met Tyr Thr Phe Gly Gly

85 90 95

Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100

<210> 3

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gln Ala Ser Val Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile

1 5 10 15

Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Gly Leu

20 25 30

Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala

35 40 45

Pro Arg Phe Leu Gly Lys Ala Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn

50 55 60

Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Gly Val

65 70 75 80

Tyr Tyr Cys Lys Val Tyr Asp Gly Tyr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln

85 90 95

Gly Thr Pro Leu Thr Val Ser Ser

100

<210> 4

<211> 102

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Arg Cys Leu Leu His Trp Thr Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser

1 5 10 15

Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu

20 25 30

Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser

35 40 45

Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly

50 55 60

Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly

65 70 75 80

Ile Tyr Tyr Cys Trp Gln Ala Thr His Phe Pro His Thr Phe Gly Gly

85 90 95

Gly Thr Lys Leu Glu Arg

100

<210> 5

<211> 358

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcctcagca cgtcacagag cctgtccatc acatgcacca tctcagggtt ctcattaacc 60

agctatggtg tacactggat tcgccagcct ccaggaaagg gtctggagtg gctgggagtg 120

atatggagtg ttggaaatac aacctataat tcaactctca gatccagact gagcatcacc 180

aaggacaact ccaagagcca agttttctta aaaatgaaca gtctccaaac tgatgacaca 240

gccatttact actgtgccag acaggtctat ggtaactcct ttgcttactg gggccaaggg 300

actctggtca ctgtctctgc agccaaaacg acacccccat ctgtctatag atcttcca 358

<210> 6

<211> 285

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agccttgtac acagtaatgg aaacacctat ttacattggc acctgcagaa gccaggccag 60

tctccaaagc tcctgatcta caaagtttcc aaccgatttt ctggggtccc agacaggttc 120

agtggcagtg gatcagggac agatttcaca ctcaagatca gcagagtgga ggctgaggat 180

ctgggagttt atttctgctc tcaaggtaca catgttatgt acacgttcgg aggggggacc 240

aagctggaaa taaaacgggc tgatgctgca ccaactgtat cggca 285

<210> 7

<211> 359

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atcaatctaa ggacaggcct cagtcaggtt gtcctgcaca gcttctggct tcaacattaa 60

agactactat atgcattggg tgaagcagag gcctgaacag ggcctggagt ggattggatg 120

gattgatcct gagaacggtg atactgaata tgccccgagg ttcctgggca aggccactat 180

gactacagac acatcctcca acacagccta cctgcagctc agcagcctga catctgagga 240

cactggcgtc tattactgta aggtctatga tggttactac tttgacttct ggggccaagg 300

cacccctctc acagtctcct cagccaaaac gacaccccca tctgtctaag gatcttcca 359

<210> 8

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctcgttgtc tgttacattg gacaccagcc tccatctctt gcaagtcaag tcagagcctc 60

ttaaatagtg atggaaagac atatttgaat tggttgttac agaggccagg ccagtctcca 120

aagcgcctaa tctatctggt gtctaaactg gactctggag tccctgacag gttcactggc 180

agtggatcag ggacagattt cacactgaaa atcagcagag tggaggctga ggatttggga 240

atttattatt gctggcaagc cacacatttt cctcacacgt tcggaggggg gaccaagctg 300

gaaagaaaac gggctgatgc tgcaccaact gtatcggca 339

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ttttctcgag atggccgcac cagtagtccc tactactg 38

<210> 10

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aaaaaagctt ctacgctgct gattcctgct ttatctcaa 39

<210> 11

<211> 1148

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taagaaggta taaccatgaa tcacaaagtg catcatcatc atcatcatat cgaaggtagg 60

catatggagc tcggtaccct cgagatggcc gcaccagtag tccctactac tgacgcgtct 120

tggtttcagg tgctcaaagc tcaaaacaaa aaggctactc atcctcagtt tcgtggcaat 180

ggagttccgc ttaactccgc catcaaaccc gttgaaaacc atggctactg gctgcgttac 240

accagacaaa agccaggtgg cactccgatt cctccatcct atgcctttta ttatactggc 300

acaggtccca gaggaaatct taagtatggt gaactccctc ctaatgatac cccagcaacc 360

actcgtgtta cttgggttaa gggttcggga gctgacactt ctattaaacc tcatgttgcc 420

aaacgcaacc ccaacaatcc taaacatcag ctgctacctc tccgattccc aaccggagat 480

ggcccagctc aaggtttcag agttgacccc ttcaacgcta gaggaagacc tcaggagcgt 540

ggaagtggcc caagatctca atctgttaac tccagaggca caggcaatca gcccaggaaa 600

cgcgaccaat ctgcaccagc tgcggtacgt cgtaagaccc agcatcaagc tcccaagcgg 660

actttaccca agggtaaaac catttctcag gtatttggca accggtctcg cactggtgcc 720

aatgtcggct ctgcagacac tgagaagacg ggtatggctg atcctcgcat catggctcta 780

gccagacatg tgcctggtgt tcaggaaatg cttttcgctg gccaccttga gagcaacttt 840

caggcagggg caattaccct taccttctct tactcaatca cagtcaagga gggttctcct 900

gactatgaga gacttaagga tgcgctcaat acggtcgtta accagaccta tgagccaccc 960

accaaaccaa ctaaggacaa gaagcctgac aaacaagacc agtctgctaa atccaaacag 1020

cagaagaaac ctaaaaaggt aactctgcca gcagacaaac aggattggga gtgggatgat 1080

gcttttgaga taaagcagga atcagcagcg tagaagcttg tcgacctgca gtctagatag 1140

gtatctct 1148

Claims

1.一种抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的一种抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体还包括：

所述单克隆抗体的N端和/或C端连接标签得到的抗体；

或者所述单克隆抗体的人源化或嵌合抗体。

3.一种编码权利要求1-2任一所述单克隆抗体的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码所述重链可变区的核酸分子和编码所述轻链可变区的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，编码所述E8重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：5；编码所述E8轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示；

编码所述A10重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：7；编码所述A10轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示。

5.一种包含权利要求4所述核酸的表达载体，其特征在于，所述表达载体能够在原核或者真核宿主细胞中表达所述核酸。

6.一种包含权利要求5所述的表达载体的工程菌或真核宿主细胞。

7.权利要求1-2任一所述的抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体在制备猪δ冠状病毒检测试剂或试剂盒中的用途。

8.一种猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条，其特征在于，包括：

底板，

所述结合垫上涂有权利要求1-2任一所述的抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体E8包被的胶体金复合物；所述层析基质上靠近所述结合垫的一侧设有质控线C，所述层析基质上靠近所述吸水垫的一侧设有检测线T；所述质控线C上涂有包被有抗鼠IgG二抗；所述检测线T上包被有权利要求1-2任一所述的猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体A10。

9.根据权利要求8所述猪δ冠状病毒胶体金快速检测试纸条，其特征在于，

所述抗猪δ冠状病毒N蛋白的单克隆抗体E8包被的胶体金复合物的pH为7.2～7.6，标记量为30μg/ml胶体金溶液；