CN117129675B - 用于人博卡病毒型别特异性检测或诊断的试剂或试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于人博卡病毒型别特异性检测或诊断的试剂或试剂盒，其包括特定的针对1型人博卡病毒的型别特异性抗体和特定的针对2型人博卡病毒的型别特异性抗体的组合；本发明还提供了上述抗体组合在制备用于1型人博卡病毒和2型人博卡病毒之间的鉴别诊断的检测或诊断类产品中的应用。本发明的人博卡病毒型别特异性检测或诊断试剂或试剂盒能够在1型人博卡病毒与2型人博卡病毒之间准确地进行型别鉴别或诊断，并且其对于1型或2型人博卡病毒的检测或诊断灵敏度较高，具有重大的临床应用价值。

Description

用于人博卡病毒型别特异性检测或诊断的试剂或试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫学和分子病毒学技术领域，具体涉及一种用于人博卡病毒型别特异性检测或诊断的试剂或试剂盒，以及特定的1型、2型人博卡病毒的型别特异性抗体的组合在制备用于1型人博卡病毒和2型人博卡病毒之间的鉴别诊断的检测或诊断类产品中的应用。
背景技术
自2005年瑞典科学家Allander等人首次在呼吸道感染患儿的鼻咽吸出物中发现人博卡病毒（Human bocavirus，HBoV）以来，各国研究学者又陆续发现了三种不同基因型别的HBoV；迄今为止，HBoV共有四个基因型别，分别命名为HBoV1、2、3、4。越来越多的临床证据支持HBoV1为下呼吸道感染的致病病毒，而HBoV2～4主要在腹泻患儿的粪便标本中检出，这些感染肠道的HBoVs尤其是HBoV2在粪便标本中的检出率要高于其它基因型别，提示它们可能与儿童的急性胃肠炎有关。
HBoV属于细小病毒科细小病毒亚科，博卡病毒属，是继细小病毒B19之后的第二个对人类致病的细小病毒科成员。HBoV是一种单负链无包膜的DNA病毒，直径约为25 nm，呈二十面体对称，基因组全长约为5kb。
HBoV1具有细小病毒科特有的发卡结构，在3’（LEH）端为兔耳朵型发卡，5’端（REH）为经典发卡。HBoV1通过基因组左端启动子P5进行转录，经过RNA剪接及加工形成不同长度的成熟mRNA，继而进行病毒蛋白的表达。HBoV1的基因组含有三个主要的开放阅读框ORF，其中，3'端的ORF编码非结构蛋白NS1、NS2、NS3、NS4；中间的ORF编码非结构蛋白NP1（其为博卡病毒属特有）；5’端的ORF编码衣壳蛋白VP1、VP2、VP3，其中VP2、VP3基因编码区起始于VP1基因内部，是一个典型的重叠基因，所编码蛋白具有共同的羧基端。衣壳蛋白VP1：VP2：VP3表达比为1:1:10，VP3是形成二十面体衣壳的最主要蛋白，单独表达衣壳蛋白VP3可以自组装成病毒样颗粒，这样的病毒样颗粒具有很强的免疫原性，可诱导强烈的体液和细胞免疫反应。
由于HBoV1、HBoV2的VP3蛋白序列之间存在较高的同源性，且血清学研究中存在交叉反应OAS现象，因此，制备特异性针对HBoV1或HBoV2的、高亲和性的型别特异性抗体是特异性识别两种型别人博卡病毒从而对其进行鉴别诊断的关键。
发明内容
发明目的
针对现有技术中存在的问题或需求，本发明的目的在于提供一种能够用于人博卡病毒型别特异性检测或诊断的试剂或试剂盒，以及特定的1型、2型人博卡病毒的型别特异性抗体的组合在制备用于1型人博卡病毒和2型人博卡病毒之间的鉴别诊断的检测或诊断类产品中的应用。
解决方案
为了实现上述目的，本发明经过大量的筛选获得了一种针对1型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体或其抗原结合片段和一种针对2型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体或其抗原结合片段，并将两者进行组合以制成用于人博卡病毒型别特异性检测或诊断的试剂或试剂盒；此外，本发明还提供了这两种抗体的组合在制备用于1型人博卡病毒和2型人博卡病毒之间的鉴别诊断的检测或诊断类产品中的应用。
具体地，本发明提供了如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种针对1型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区包含：
氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示的三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3；
和/或，所述轻链可变区包含：
氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 4、KVS和SEQ ID NO: 5所示的三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。
作为优选，所述重链可变区还包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9所示的框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4；
和/或，所述轻链可变区还包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13所示的框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。
进一步优选地，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列或与SEQID NO: 14所示的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或由其组成；
和/或，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。
在优选的具体实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示；和，
轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示。
在某些优选的具体实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段在其重链可变区和/或轻链可变区的N端还具有前导序列；优选地，所述重链可变区的前导序列具有如SEQID NO: 31所示的氨基酸序列，进一步优选地，所述前导序列由如SEQ ID NO: 32所示的核苷酸序列编码；优选地，所述轻链可变区的前导序列具有如SEQ ID NO: 33所示的氨基酸序列，进一步优选地，所述前导序列由如SEQ ID NO: 34所示的核苷酸序列编码。
此外，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括恒定区；优选地，所述恒定区为选自以下的任意一种：IgG、IgA或IgM抗体的恒定区。
在优选的具体实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区和/或轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示；并且，优选地，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示。
在一些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
重链，其包含如SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 18所示的氨基酸序列具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或由其组成；和，
轻链，其包含如SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 19所示的氨基酸序列具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。
进一步优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示；和，
轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示。
在一些可行的实施方案中，所述单克隆抗体的抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体。
第二方面，本发明提供了一种针对2型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区和轻链可变区，其中，
所述重链可变区包含：
氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37所示的三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3；
和/或，所述轻链可变区包含：
氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 38、LAS和SEQ ID NO: 39所示的三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3。
作为优选，所述重链可变区还包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43所示的框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4；
和/或，所述轻链可变区还包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 47所示的框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。
进一步优选地，所述重链可变区包含如SEQ ID NO: 48所示的氨基酸序列或与SEQID NO: 48所示的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或由其组成；
和/或，所述轻链可变区包含如SEQ ID NO: 49所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列具有至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。
在优选的具体实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 48所示；和，
轻链可变区，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 49所示。
在某些优选的具体实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段在其重链可变区和/或轻链可变区的N端还具有前导序列；优选地，所述重链可变区的前导序列具有如SEQID NO: 65所示的氨基酸序列，进一步优选地，所述前导序列由如SEQ ID NO: 66所示的核苷酸序列编码；优选地，所述轻链可变区的前导序列具有如SEQ ID NO: 67所示的氨基酸序列，进一步优选地，所述前导序列由如SEQ ID NO: 68所示的核苷酸序列编码。
此外，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括恒定区；优选地，所述恒定区为选自以下的任意一种：IgG、IgA或IgM抗体的恒定区。
在优选的具体实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区和/或轻链恒定区；优选地，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 50所示；并且，优选地，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 51所示。
在一些优选的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
重链，其包含如SEQ ID NO: 52所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 52所示的氨基酸序列具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或由其组成；和，
轻链，其包含如SEQ ID NO: 53所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO: 53所示的氨基酸序列具有至少90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸序列，或由其组成。
进一步优选地，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包含：
重链，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 52所示；和，
轻链，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 53所示。
在一些可行的实施方案中，所述单克隆抗体的抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段、单链抗体、人抗体、嵌合抗体或双特异或多特异抗体。
第三方面，本发明提供了多核苷酸，所述多核苷酸编码如上述第一方面或如上述第二方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。该多核苷酸不受限于其产生的方法，并且可以利用基因工程重组技术或化学合成方法获得。
在可行的实施方案中，所述多核苷酸为多核苷酸组。
在编码如上述第一方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的优选实施方案中，所述多核苷酸组包括：
(I)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的第一多核苷酸，优选地，所述第一多核苷酸为包含如SEQ ID NO: 20、21、22所示核苷酸序列（其可分别编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3）的DNA分子或其相应的mRNA分子；和，
(II)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的第二多核苷酸，优选地，所述第二多核苷酸为包含如SEQ ID NO: 23、 AAAGTTTCC、SEQ ID NO: 24所示核苷酸序列（其可分别编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 4、KVS和SEQ IDNO: 5所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3）的DNA分子或其相应的mRNA分子。
进一步优选地，所述多核苷酸组包括：
(I)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的第一多核苷酸，优选地，所述第一多核苷酸为包含如SEQ ID NO: 25所示核苷酸序列（其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示的重链可变区）和任选地如SEQ ID NO: 32所示核苷酸序列（其编码VH链N端的前导序列）的DNA分子或其相应的mRNA分子；和，
(II)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的第二多核苷酸，优选地，所述第二多核苷酸为包含如SEQ ID NO: 26所示核苷酸序列（其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示的轻链可变区）和任选地如SEQ ID NO: 34所示核苷酸序列（其编码VL链N端的前导序列）的DNA分子或其相应的mRNA分子；
优选地，上述多核苷酸组还包括：
(III)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的第三多核苷酸，优选地，所述第三多核苷酸为包含如SEQ ID NO: 27所示核苷酸序列（其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 16所示的重链恒定区）的DNA分子或其相应的mRNA分子；和，
(IV)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区的第四多核苷酸，优选地，所述第四多核苷酸为包含如SEQ ID NO: 28所示核苷酸序列（其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 17所示的轻链恒定区）的DNA分子或其相应的mRNA分子。
在最优选的实施方案中，所述多核苷酸组包括：
(I)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链的第一多核苷酸，优选地，所述第一多核苷酸为核苷酸序列如SEQ ID NO: 29所示的DNA分子或其相应的mRNA分子，其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示的重链；和，
(II)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链的第二多核苷酸，优选地，所述第二多核苷酸为核苷酸序列如SEQ ID NO: 30所示的DNA分子或其相应的mRNA分子，其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示的轻链。
在编码如上述第二方面所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的优选实施方案中，所述多核苷酸组包括：
(I)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3的第一多核苷酸，优选地，所述第一多核苷酸为包含如SEQ ID NO: 54、55、56所示核苷酸序列（其可分别编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO: 36和SEQ ID NO: 37所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3）的DNA分子或其相应的mRNA分子；和，
(II)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3的第二多核苷酸，优选地，所述第二多核苷酸为包含如SEQ ID NO: 57、 CTTGCATCC、SEQ ID NO: 58所示核苷酸序列（其可分别编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 38、LAS和SEQ IDNO: 39所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3）的DNA分子或其相应的mRNA分子。
进一步优选地，所述多核苷酸组包括：
(I)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变区的第一多核苷酸，优选地，所述第一多核苷酸为包含如SEQ ID NO: 59所示核苷酸序列（其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 48所示的重链可变区）和任选地如SEQ ID NO: 66所示核苷酸序列（其编码VH链N端的前导序列）的DNA分子或其相应的mRNA分子；和，
(II)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的第二多核苷酸，优选地，所述第二多核苷酸为包含如SEQ ID NO: 60所示核苷酸序列（其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 49所示的轻链可变区）和任选地如SEQ ID NO: 68所示核苷酸序列（其编码VL链N端的前导序列）的DNA分子或其相应的mRNA分子；
优选地，上述多核苷酸组还包括：
(III)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链恒定区的第三多核苷酸，优选地，所述第三多核苷酸为包含如SEQ ID NO: 61所示核苷酸序列（其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 50所示的重链恒定区）的DNA分子或其相应的mRNA分子；和，
(IV)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链恒定区的第四多核苷酸，优选地，所述第四多核苷酸为包含如SEQ ID NO: 62所示核苷酸序列（其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 51所示的轻链恒定区）的DNA分子或其相应的mRNA分子。
在最优选的实施方案中，所述多核苷酸组包括：
(I)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的重链的第一多核苷酸，优选地，所述第一多核苷酸为核苷酸序列如SEQ ID NO: 63所示的DNA分子或其相应的mRNA分子，其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 52所示的重链；和，
(II)编码本发明的单克隆抗体或其抗原结合片段的轻链的第二多核苷酸，优选地，所述第二多核苷酸为核苷酸序列如SEQ ID NO: 64所示的DNA分子或其相应的mRNA分子，其可编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 53所示的轻链。
第四方面，本发明提供了核酸构建体，其包含如上述第三方面所述的多核苷酸，以及，任选地，与所述多核苷酸可操作地连接的至少一个表达调控元件。
第五方面，本发明提供了一种重组载体，其包含如上述第三方面所述的多核苷酸，或者如上述第四方面所述的核酸构建体。
本发明的载体可以是克隆载体，也可以是表达载体，例如，可以是例如质粒，粘粒，噬菌体等。
在一些优选的实施方案中，所述重组载体为表达载体，优选为真核表达载体。
第六方面，本发明提供了一种转化的宿主细胞，其中转化有如上述第三方面所述的多核苷酸、如上述第四方面所述的核酸构建体或如上述第五方面所述的重组载体；
所述宿主细胞包括但不限于：原核细胞，例如大肠杆菌细胞；真核细胞，例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。所述宿主细胞还可以是细胞系，例如293T细胞系。
优选地，所述宿主细胞为真核细胞，进一步优选为哺乳动物细胞。
第七方面，本发明提供了一种用于人博卡病毒型别特异性检测或诊断的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括：
（1）如上述第一方面所述的针对1型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体或其抗原结合片段，和/或其编码核酸（如上述第三方面所述），包含其编码核酸的构建体（如上述第四方面所述）、表达载体（如上述第五方面所述）和/或转化的宿主细胞（如上述第六方面所述）；以及，
（2）如上述第二方面所述的针对2型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体或其抗原结合片段，和/或其编码核酸（如上述第三方面所述），包含其编码核酸的构建体（如上述第四方面所述）、表达载体（如上述第五方面所述）和/或转化的宿主细胞（如上述第六方面所述）。
第八方面，本发明提供了以下物质（1）和物质（2）的组合在制备用于1型人博卡病毒和2型人博卡病毒之间的鉴别诊断的检测或诊断类产品中的应用：
（1）如上述第一方面所述的针对1型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体或其抗原结合片段，和/或其编码核酸（如上述第三方面所述），包含其编码核酸的构建体（如上述第四方面所述）、表达载体（如上述第五方面所述）和/或转化的宿主细胞（如上述第六方面所述）；以及，
（2）如上述第二方面所述的针对2型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体或其抗原结合片段，和/或其编码核酸（如上述第三方面所述），包含其编码核酸的构建体（如上述第四方面所述）、表达载体（如上述第五方面所述）和/或转化的宿主细胞（如上述第六方面所述）。
对于上述第七和第八方面：
在可行的实施方案中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记；在某些优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第三、第四抗体，所述第三、第四抗体能够特异性识别本发明的1型、2型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体或其抗原结合片段或者抗独特型抗体；优选地，所述第三、第四抗体还包括可检测的标记；此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。
在可行的实施方案中，所述样品为受试者的生物学样品；在具体实施方案中，所述样品为来自受试者的呼吸道样品，优选为鼻咽拭子、痰液和/或肺泡灌洗液。
使用单克隆抗体或其抗原结合片段来检测目标病毒或抗原在样品中的存在或其水平的一般方法是本领域技术人员所熟知的。在某些优选的实施方案中，所述检测方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、酶免疫检测、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法、竞争法及类似检测方法。
有益效果
本发明的用于人博卡病毒型别特异性检测或诊断的试剂或试剂盒可在1型人博卡病毒与2型人博卡病毒之间准确地进行型别鉴别或诊断，并且其对于1型或2型人博卡病毒的检测或诊断灵敏度较高，具有重大的临床应用价值。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
图1为实施例2中记载的、HEK293细胞表达的HBoV1 VP3、HBoV2 VP3蛋白的SDS‐PAGE鉴定结果图。
图2为单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2的SDS‐PAGE鉴定图。
图3显示了单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2分别与抗原多肽HBoV1DR2、HBoV2 DR2的结合动力学曲线；其中，A为Mab-HBoV1 DR2与HBoV1 DR2的结合动力学曲线，B为Mab-HBoV2 DR2与HBoV1 DR2的结合动力学曲线，C为Mab-HBoV2 DR2与HBoV2 DR2的结合动力学曲线，D为Mab-HBoV1 DR2与HBoV2 DR2的结合动力学曲线；并且，其中，每张图中，七条曲线分别代表七个稀释度。
图4显示了Western blot实验检测单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2分别与抗原蛋白HBoV1 VP3、HBoV2 VP3的结合情况。
图5显示了ELISA实验检测单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2分别与抗原多肽HBoV1 DR2（A图）、HBoV2 DR2（B图）的结合情况。
图6显示了IFA实验检测单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2（A图）、Mab-HBoV2 DR2（B图）分别与抗原多肽HBoV1 DR2、HBoV2 DR2的结合情况。
图7显示了单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2对于HBoV1感染的临床诊断有效性。
图8显示了单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2（A图）、Mab-HBoV1 DR2（B图）与其它呼吸道病毒的交叉反应性验证结果。
具体实施方式
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些都在本领域的技术范围内。
为了可以更容易地理解本发明，某些科技术语具体定义如下。除非本文其它部分另有明确定义，否则本文所用的科技术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology(Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。本文(包括权利要求书)所用单数形式包括其相应的复数形式，除非文中另有明确规定。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5％的上限的范围内的数字数值，包括但不限于±5%、±2%、±1%和± 0.1%，因为这些变化适于进行所公开的方法。
术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项中的任意两项或更多项的组合。
如本文所用，术语“或”应被理解为与如上定义的“和/或”具有相同的含义。例如，当分离列表中的项目时，“或”或“和/或”应被解释为包容性的，即，包括数量或元素列表中的至少一个，但也包括多于一个，以及任选地，额外的未列出的项目。只有明确指出相反的术语下，例如“只有一个”或“的确一个”或者在权利要求中使用“由...组成”时，将指的是仅列出的一个数字或列表的一个元素。
术语“百分比(%)氨基酸序列同一性”或简称“同一性”定义为在将氨基酸序列进行比对(并在必要时导入空位)以获取最大百分比序列同一性，且不将任何保守取代视为序列同一性的部分之后，候选氨基酸序列中的氨基酸残基与参比氨基酸序列中的相同氨基酸残基的百分比。可使用本领域各种方法进行序列比对以便测定百分比氨基酸序列同一性，例如，使用公众可得到的计算机软件如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以决定测量比对的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大比对所需的任何算法。
术语“抗体”是指具有所需生物活性的任何形式的抗体。因此，其以最广义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和骆驼源化单结构域抗体。
术语“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即组成该群的各个抗体除可少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相比之下，常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。修饰语“单克隆”表明获自基本均质抗体群的抗体的特征，且不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
“抗原结合片段”是指抗体的抗原结合片段及抗体类似物，其通常包括至少部分母体抗体的抗原结合区或可变区，例如一个或多个CDR。抗体的片段保留母体抗体的至少某些结合特异性。抗原结合片段包括选自Fab、Fab′、Fab′-SH、Fv、scFv、F(ab′)2、双抗体、包含CDR的肽等。
“Fab片段”由一条轻链和一条重链的CH1及可变区组成。
“Fc”区含有包含抗体的CH2和CH3结构域的两个重链片段。两个重链片段由两个或多个二硫键并通过CH3结构域的疏水作用保持在一起。
“Fab′片段”含有一条轻链和一条包含VH结构域、CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链的部分，两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含VH结构域、CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链的部分，由此在两条重链间形成链间二硫键。因此，F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
“Fv区”包含来自重链和轻链二者的可变区，但缺少恒定区。
“单链Fv抗体(scFv抗体)”是指包含抗体的VH和VL结构域的抗原结合片段，这些结构域包含于单个多肽链中。一般而言，scFv多肽在VH和VL结构域之间包含多肽接头，该接头使得scFv能形成用于抗原结合的所需结构。
“双抗体”为具有两个抗原结合位点的小抗原结合片段。所述片段包含在相同的多肽链中与轻链可变结构域(VL)连接的重链可变结构域(VH)(VH-VL或VL-VH)。通过使用短至不能在同一链的两个结构域之间配对的接头，使得所述结构域和另一条链的互补结构域配对并形成两个抗原结合位点。
当提及配体/受体、抗体/抗原或其它结合对时，“特异性”结合是指在蛋白和/或其它生物试剂的异质群体中确定是否存在所述蛋白例如本发明的单克隆抗体与2019-nCoVRBD蛋白的结合反应。因此，在所指定的条件下，特定的配体/抗原与特定的受体/抗体结合，并且并不以显著量与样品中存在的其它蛋白结合。
“亲和力”或“结合亲和力”指反映结合对子的成员之间相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶物Y的亲和力可以通常由平衡解离常数(KD)代表，平衡解离常数是解离速率常数和结合速率常数(分别是kdis和kon)的比值。亲和力可以由本领域已知的常见方法测量。用于测量亲和力的一个具体方法是本文中的ForteBio动力学结合测定法。术语“不结合”蛋白或细胞是指，不与蛋白或细胞结合，或者不以高亲和力与其结合，即结合蛋白或细胞的KD为1.0×10-6 M或更高，更优选1.0×10-5 M或更高，更优选1.0×10-4 M或更高、1.0×10-3 M或更高，更优选1.0×10-2 M或更高。
术语“高亲和性”对于IgG抗体而言，是指对于抗原的KD为1.0×10-6 M或更低，优选5.0×10-8 M或更低，更优选1.0×10-8 M或更低、5.0×10-9 M或更低，更优选1.0×10-9 M或更低。对于其他抗体亚型，“高亲和性”结合可能会变化。例如，IgM亚型的“高亲和性”结合是指KD为10-6 M或更低，优选10-7 M或更低，更优选10-8 M或更低。
术语“核酸”或“多核苷酸”是指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)及其呈单链或双链形式的聚合物。除非明确地限制，否则术语包括具有与参照核酸相似的结合性质并且以与天然存在的核苷酸相似的方式被代谢的含有已知的天然核苷酸的类似物的核酸(参见，属于Kariko等人的美国专利No.8,278,036，其公开了尿苷被假尿苷替代的mRNA分子，合成所述mRNA分子的方法以及用于在体内递送治疗性蛋白的方法)。除非另有所指，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。具体地，简并密码子取代可通过生成其中一个或多个选择的(或全部)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res .19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J .Biol .Chem .260:2605-2608(1985)；和Rossolini等人，Mol .Cell .Probes8:91-98(1994))。
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明本发明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
本发明所涉及的部分序列的信息如下面的表1所示。
表1、本发明所涉及的序列信息
序列描述 SEQ ID NO: 序列信息
HBoV1 -HCDR1 1 GFTFSNHG
HBoV1 -HCDR2 2 INPDGGFT
HBoV1 -HCDR3 3 TRDRGMIKDRDALFAY
HBoV1 -LCDR1 4 QTIVHSNGNTY
HBoV1 -LCDR2 - KVS
HBoV1 -LCDR3 5 FQGSHVPPT
HBoV1 -H-FR1 6 EVHLVESGGDLVLPGGSLKLSCAVS
HBoV1 -H-FR2 7 MCWVRQTPDKSLELVAN
HBoV1 -H-FR3 8 YYPDNVKGRFTISRDSAKNTLYLQMTSLRSEDTALYYC
HBoV1 -H-FR4 9 WGQGTLVTVSA
HBoV1 -L-FR1 10 DILMTQTPLFLPVSLGDQASISCRSS
HBoV1 -L-FR2 11 LEWYLQKPGQSPRLLIY
HBoV1 -L-FR3 12 NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYC
HBoV1 -L-FR4 13 FGGGTKLEIK
HBoV1 -VH 14 EVHLVESGGDLVLPGGSLKLSCAVSGFTFSNHGMCWVRQTPDKSLELVANINPDGGFTYYPDNVKGRFTISRDSAKNTLYLQMTSLRSEDTALYYCTRDRGMIKDRDALFAYWGQGTLVTVSA
HBoV1 -VL 15 DILMTQTPLFLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIK
HBoV1 -CH 16 AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
HBoV1 -CL 17 RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
HBoV1 -H链 18 EVHLVESGGDLVLPGGSLKLSCAVSGFTFSNHGMCWVRQTPDKSLELVANINPDGGFTYYPDNVKGRFTISRDSAKNTLYLQMTSLRSEDTALYYCTRDRGMIKDRDALFAYWGQGTLVTVSAAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
HBoV1 -L链 19 DILMTQTPLFLPVSLGDQASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPRLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPPTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
HBoV1 -HCDR1编码序列 20 GGATTCACTTTCAGTAACCATGGC
HBoV1 -HCDR2编码序列 21 ATTAATCCTGATGGTGGTTTCACC
HBoV1 -HCDR3编码序列 22 ACAAGAGATCGGGGTATGATTAAGGATAGGGACGCCCTATTTGCTTAC
HBoV1 -LCDR1编码序列 23 CAGACCATTGTCCATAGTAATGGAAACACCTAT
HBoV1 -LCDR2编码序列 - AAAGTTTCC
HBoV1 -LCDR3编码序列 24 TTTCAAGGTTCACATGTTCCTCCGACG
HBoV1 -VH基因 25 GAAGTACATCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGCTGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACTTTCAGTAACCATGGCATGTGTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGCCTGGAGTTGGTCGCAAACATTAATCCTGATGGTGGTTTCACCTATTATCCGGACAATGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACTCTGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCTTGTATTACTGTACAAGAGATCGGGGTATGATTAAGGATAGGGACGCCCTATTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
HBoV1 -VL基因 26 GATATTTTGATGACCCAAACTCCACTCTTCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGTAGATCTAGTCAGACCATTGTCCATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAGGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGCTTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGGGGCACGAAGCTGGAAATCAAA
HBoV1 -CH基因 27 GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAA
HBoV1 -CL基因 28 CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
HBoV1 -H链基因 29 GAAGTACATCTGGTGGAGTCTGGGGGAGACTTAGTGCTGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGTCTCTGGATTCACTTTCAGTAACCATGGCATGTGTTGGGTTCGCCAGACTCCAGACAAGAGCCTGGAGTTGGTCGCAAACATTAATCCTGATGGTGGTTTCACCTATTATCCGGACAATGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACTCTGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGACCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCTTGTATTACTGTACAAGAGATCGGGGTATGATTAAGGATAGGGACGCCCTATTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAA
HBoV1 -L链基因 30 GATATTTTGATGACCCAAACTCCACTCTTCCTGCCTGTCAGTCTTGGAGATCAAGCCTCCATCTCTTGTAGATCTAGTCAGACCATTGTCCATAGTAATGGAAACACCTATTTAGAATGGTACCTGCAGAAACCAGGCCAGTCTCCAAGGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGCTTTTCTGGGGTCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTCAAGATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATCTGGGAGTTTATTACTGCTTTCAAGGTTCACATGTTCCTCCGACGTTCGGTGGGGGCACGAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
HBoV1 -H链前导序列 31 MNLGLSFIFLALILKGVQC
HBoV1 -H链前导序列编码基因 32 ATGAACTTAGGGCTCAGCTTCATTTTCCTTGCCCTCATTTTAAAAGGTGTCCAGTGT
HBoV1 -L链前导序列 33 MKLPVRLLVLMFWIPVSSS
HBoV1 -L链前导序列编码基因 34 ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGGTGCTGATGTTCTGGATTCCTGTTTCCAGCAGT
HBoV2 -HCDR1 35 GFSLSTSGMG
HBoV2 -HCDR2 36 IWWDDVK
HBoV2 -HCDR3 37 ARIVGYYASRDALDY
HBoV2 -LCDR1 38 KSVSTSAYSY
HBoV2 -LCDR2 - LAS
HBoV2 -LCDR3 39 QHSRELPWT
HBoV2 -H-FR1 40 QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFS
HBoV2 -H-FR2 41 VGWIRQPSGKGLEWLTH
HBoV2 -H-FR3 42 RYNPALKSRLTISKDTSSSQVFLKIASVDTADTAAYYC
HBoV2-H-FR4 43 WGQGTSVTVSS
HBoV2 -L-FR1 44 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRAS
HBoV2 -L-FR2 45 MHWYQQRPGQPPKLLIY
HBoV2 -L-FR3 46 NLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYC
HBoV2 -L-FR4 47 FGGGTKLEIK
HBoV2 -VH 48 QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLTHIWWDDVKRYNPALKSRLTISKDTSSSQVFLKIASVDTADTAAYYCARIVGYYASRDALDYWGQGTSVTVSS
HBoV2 -VL 49 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSAYSYMHWYQQRPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPWTFGGGTKLEIK
HBoV2 -CH 50 AKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
HBoV2 -CL 51 RADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
HBoV2 -H链 52 QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGMGVGWIRQPSGKGLEWLTHIWWDDVKRYNPALKSRLTISKDTSSSQVFLKIASVDTADTAAYYCARIVGYYASRDALDYWGQGTSVTVSSAKTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLQSDLYTLSSSVTVPSSTWPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIFPPKPKDVLTITLTPKVTCVVVDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRSVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITDFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK
HBoV2 -L链 53 DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSAYSYMHWYQQRPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPWTFGGGTKLEIKRADAAPTVSIFPPSSEQLTSGGASVVCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDSTYSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC
HBoV2 -HCDR1编码序列 54 GGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGT
HBoV2 -HCDR2编码序列 55 ATTTGGTGGGATGATGTCAAG
HBoV2 -HCDR3编码序列 56 GCTCGAATAGTGGGATACTACGCTAGTAGGGATGCTTTGGACTAC
HBoV2 -LCDR1编码序列 57 AAAAGTGTCAGTACATCTGCCTATAGTTAT
HBoV2 -LCDR2编码序列 - CTTGCATCC
HBoV2 -LCDR3编码序列 58 CAGCACAGTAGGGAGCTTCCGTGGACG
HBoV2 -VH基因 59 CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCCATCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGACACACATTTGGTGGGATGATGTCAAGCGCTATAACCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACTATCTCCAAGGATACCTCCAGCAGCCAGGTATTCCTCAAGATCGCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCGCATACTACTGTGCTCGAATAGTGGGATACTACGCTAGTAGGGATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
HBoV2 -VL基因 60 GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGCCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAGACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
HBoV2 -CH基因 61 GCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAA
HBoV2 -CL基因 62 CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
HBoV2 -H链基因 63 CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCTGGGTTTTCACTGAGCACTTCTGGTATGGGTGTAGGCTGGATTCGTCAGCCATCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGACACACATTTGGTGGGATGATGTCAAGCGCTATAACCCAGCCCTGAAGAGCCGACTGACTATCTCCAAGGATACCTCCAGCAGCCAGGTATTCCTCAAGATCGCCAGTGTGGACACTGCAGATACTGCCGCATACTACTGTGCTCGAATAGTGGGATACTACGCTAGTAGGGATGCTTTGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGACCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGACCTCTACACTCTGAGCAGCTCAGTGACTGTCCCCTCCAGCACCTGGCCCAGCGAGACCGTCACCTGCAACGTTGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCCAGGGATTGTGGTTGTAAGCCTTGCATATGTACAGTCCCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGCCCAAGGATGTGCTCACCATTACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATCAGCAAGGATGATCCCGAGGTCCAGTTCAGCTGGTTTGTAGATGATGTGGAGGTGCACACAGCTCAGACGCAACCCCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACTTTCCGCTCAGTCAGTGAACTTCCCATCATGCACCAGGACTGGCTCAATGGCAAGGAGTTCAAATGCAGGGTCAACAGTGCAGCTTTCCCTGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAACCAAAGGCAGACCGAAGGCTCCACAGGTGTACACCATTCCACCTCCCAAGGAGCAGATGGCCAAGGATAAAGTCAGTCTGACCTGCATGATAACAGACTTCTTCCCTGAAGACATTACTGTGGAGTGGCAGTGGAATGGGCAGCCAGCGGAGAACTACAAGAACACTCAGCCCATCATGGACACAGATGGCTCTTACTTCGTCTACAGCAAGCTCAATGTGCAGAAGAGCAACTGGGAGGCAGGAAATACTTTCACCTGCTCTGTGTTACATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGCCTCTCCCACTCTCCTGGTAAA
HBoV2 -L链基因 64 GACATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGCCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAGACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATCTTGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACAGTAGGGAGCTTCCGTGGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACCTACAGCATGAGCAGCACCCTCACGTTGACCAAGGACGAGTATGAACGACATAACAGCTATACCTGTGAGGCCACTCACAAGACATCAACTTCACCCATTGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGT
HBoV2 -H链前导序列 65 MGRLTSSFLLLIVPAYVLS
HBoV2 -H链前导序列编码基因 66 ATGGGCAGGCTTACTTCTTCATTCCTGCTACTGATTGTCCCTGCATATGTCCTGTCC
HBoV2 -L链前导序列 67 METDTLLLWVLLLWVPGSTG
HBoV2 -L链前导序列编码基因 68 ATGGAGACAGACACACTCCTGTTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT
HBoV1 DR2抗原肽 69 IENELADLDGNAAGGNATEKALLYQM
HBoV2 DR2抗原肽 70 VIHELAEMEDANAVEKAIALQI
HBoV1 VP3基因的PCR扩增引物VP3F1 71 AAGCAGATGCCTCCA
HBoV1 VP3基因的PCR扩增引物VP3R1 72 CACCCTTCACTTTCCGC
HBoV1 VP3基因的PCR扩增引物VP3F2 73 CCCAAGCTTCTGTCTGACACTGACATTCAA
HBoV1 VP3基因的PCR扩增引物VP3R2 74 CCCTCGAGTTACAACACTTTATTGATGTTTG
HBoV2 VP3基因的PCR扩增引物VP3F1 75 ATAACGAGCCTAAACCAG
HBoV2 VP3基因的PCR扩增引物VP3R1 76 AATGTATGCTCTTTCGTT
HBoV2 VP3基因的PCR扩增引物VP3F2 77 GAAGACGCAAATGCTGTA
HBoV2 VP3基因的PCR扩增引物VP3R2 78 CTGTGTTTCCGTGCTGTC
HBoV2 VP3基因的PCR扩增引物VP3F3 79 GACAGCACGGAAACACAG
HBoV2 VP3基因的PCR扩增引物VP3R3 80 ATGCCTGACGCAGTACA
。
实施例1：HBoV1、HBoV2型别特异性抗原多肽的筛选、确定
在GenBank数据库中，下载全球范围内不同国家地区上传的HBoV1和HBoV2 VP3氨基酸序列，进行氨基酸序列分析；其中，包括本实验室2007年于本实验室接收的急性呼吸道感染患儿鼻咽分泌物标本中检出并上传的HBoV1 VP3序列（GenBank：ABK32030.1），共计542aa；以及2012年于首都儿科研究所病毒研究室接收的急性腹泻患儿鼻粪便标本中检出并上传的HBoV2 VP3序列（GenBank：AFW98869.1），共计538aa。分别以本实验室上传的HBoV1VP3序列（GenBank：ABK32030.1）和首都儿科研究所病毒研究室上传的HBoV2 VP3序列（GenBank：AFW98869.1）作为HBoV1 VP3和HBoV2 VP3的代表性氨基酸序列进行抗原指数评分计算，应用ProtScale生物学预测网站(https://web. expasy. org/protscale/)预测HBoV1、HBoV2 VP3序列表面暴露的残基信息，获得HBoV1、HBoV2型别特异性抗原多肽，分别命名为HBoV1 DR2、HBoV2 DR2，其氨基酸序列如下：
HBoV1 DR2：195IENELADLDGNAAGGNATEKALLYQM220（SEQ ID NO: 69）
HBoV2 DR2：195VIHELAEMEDANAVEKAIALQI216（SEQ ID NO: 70）。
通过人工合成，获得上述HBoV1、HBoV2 DR2多肽，纯度为99.9%。
实施例2：HBoV1、HBoV2 VP3蛋白的表达与纯化
HBoV1及HBoV2 VP3基因编码区的设计：
在HBoV1 VP3（ABK32030.1）和HBoV2 VP3（AFW98869.1）核酸编码序列的3’端连上TwinStrep标签的核酸编码序列，在其5’端连上Flag标签的核酸编码序列，形成HBoV1 VP3、HBoV2 VP3基因表达区；分别在HBoV1及HBoV2 VP3基因表达区的上游加上NheI酶切位点，在其下游加上XhoI酶切位点，以便于通过NheI/ XhoI双酶切将其构建入表达质粒。
用于扩增HBoV1及HBoV2 VP3基因编码区的引物设计：
分别以HBoV1 VP3核苷酸序列（ABK32030.1）及HBoV2 VP3核苷酸序列（AFW98869.1）为模板，设计扩增HBoV1、HBoV2 VP3基因的引物，在设计引物时引入NheI与XhoI两个酶切位点以添加在扩增基因的两端；具体地，在基因上游添加NheI酶切位点，下游添加XhoI酶切位点。所设计的用于PCR扩增HBoV1 VP3基因的引物序列如SEQ ID NO: 71～74所示，用于扩增HBoV2 VP3基因的引物序列如SEQ ID NO: 75～80所示。
HBoV1 VP3蛋白和HBoV2 VP3蛋白的表达：
1）分别以HBoV1 VP3核苷酸序列（ABK32030.1）及HBoV2 VP3核苷酸序列（AFW98869.1）为模板，采用上述设计的引物，通过PCR扩增，生成带有上述酶切位点和标签的HBoV1及HBoV2 VP3基因表达片段；
2）将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并在蓝光灯下切取有1700 bp大小的凝胶条带进行回收；
3）使用NheI与XhoI分别对回收的基因表达片段和pcDNA3.1空载体进行双酶切；酶切体系为：NheI与XhoI快切酶各1 μL，10×酶切Buffer 4 μL，待切片段或载体34 μL，酶切条件为：37°C水浴2 h；
4）用T4 DNA连接酶，将上述经过双酶切的基因表达片段与载体pcDNA3.1进行连接；
5）将连接产物转化DH101Bac感受态细胞(购自Tiangen)中，提取表达HBoV1 VP3蛋白、HBoV2 VP3蛋白的质粒DNA；
6）将所提取的HBoV1 VP3蛋白、HBoV2 VP3蛋白的表达质粒分别转染HEK293细胞(购自Invitrogen)，进行HBoV1 VP3蛋白和HBoV2 VP3蛋白的表达。
HBoV1 VP3蛋白和HBoV2 VP3蛋白的纯化：
将含有目的蛋白的细胞培养液经镍离子亲和层析(TwinStrep (GE))和凝胶过滤层析(SuperoseTM 6Increase 10/300GL(GE))纯化，获得较纯的目的蛋白，所得目的蛋白经SDS‐PAGE鉴定大小为70KD（见图1），符合HBoV1 VP3蛋白和HBoV2 VP3蛋白的预期大小。
实施例3：单克隆抗体的制备、型别鉴定及测序
步骤一：HBoV1 DR2、HBoV2 DR2免疫小鼠：
用等量的弗氏完全佐剂分别乳化HBoV1 DR2、HBoV2 DR2多肽（如实施例1所获得的），作为免疫原；用免疫原对6周龄左右的BALB/C雌性小鼠（每组3只小鼠）进行颈背部皮下多点免疫接种，接种量为100 μL/小鼠；间隔三周，用等量的弗氏不完全佐剂分别乳化HBoV1DR2、HBoV2 DR2多肽并进行第二次免疫，剂量同为100 μL/小鼠；再次间隔三周后，进行第三次免疫，步骤同二免；三免后14 d，尾静脉采血测定血清中的抗体效价，选择抗体效价最高的一只小鼠进行融合前超免（即，腹腔注射100 μL的不添加佐剂的HBoV1 DR2、HBoV2 DR2多肽）。
步骤二：细胞融合以制备杂交瘤细胞：
将小鼠断颈处死暴露腹腔无菌取出脾脏后，去除脾脏周边结缔组织后剪碎脾脏，将小鼠脾脏细胞制备成单细胞悬液（约1×108）；同时取生长旺盛的小鼠骨髓瘤细胞（约1×107）5：1比例混匀，离心后弃上清，快速转移至37°C水浴。吹打均匀分散细胞，37°C培养10天。
步骤三：单克隆抗体的制备、型别鉴定及测序：
细胞融合后10天左右，待显微镜下能够观察到杂交瘤细胞融合形成克隆并占据96孔板底时，采用IPMA对杂交瘤细胞板初步进行筛查，将初选的阳性克隆转孔到预先铺有饲养细胞的板中继续培养复检，强阳性孔采用有限稀释法进行亚克隆。两周后，挑选阳性单克隆制备腹水。收集杂交瘤细胞（1×106）注射于小鼠腹腔，一周后取腹腔肿大者采集腹水，采集到的腹水离心，收集上清保存；同时，选取2株稳定传代的产单克隆抗体的细胞株，根据Proteintech公司Mouse单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书操作，验证其抗体亚型种类，并进行测序。
通过上述步骤，并经过适当筛选，获得了HBoV1单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2和HBoV2单克隆抗体Mab-HBoV2 DR2，Mab-HBoV1 DR2和Mab-HBoV2 DR2均为IgG1亚型。
所述单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2的有关序列信息见表1。
将所述单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2进行SDS-PAGE凝胶电泳，电泳结束后用考马斯亮蓝过夜染色，染色完成后用纯水洗膜1小时，然后观察蛋白条带。结果如图2所示，图2显示，两个单克隆抗体均显示清晰的两条带，根据其分子量位置判断，两条带分别为抗体的重链和轻链。
实施例4：HBoV1单克隆抗体与抗原多肽的结合能力测定
本实施例中，通过生物膜层干涉实验，对实施例3获得的单克隆抗体进行与抗原的结合能力测定，具体步骤如下：
(1)将分子相互作用分析仪（Probe life，Gator，由Gator Bio公司提供）开机，打开软件，使其自动初始化并预热30分钟；使用K Buffer（购自Gator Bio公司，货号#120011）分别稀释抗原HBoV1 DR2、HBoV2 DR2以及单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2，并将所述抗体进行连续二倍梯度稀释，共做7个稀释度；
(2)按照布局加好各种缓冲液、样品及Anti-His探针，运行Kinetics模块；在KBuffer中预湿探针10分钟(振荡器的振荡速度，除了在结合抗原时为400 rpm外，其余均为1000 rpm)；在Baseline孔中平衡120秒；在Loading孔中结合蛋白至干涉波长位移约为0.8nm；在K Buffer孔中再次平衡60秒；在结合孔中结合抗体；在曲线相对平稳时在解离孔中解离600秒；
(3)利用Gator系统软件计算平衡解离常数。
结果：
单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2与HBoV1 DR2、HBoV2 DR2抗原的结合动力学曲线如图3所示，结合动力学常数如以下表2、表3所示。
表2、Mab-HBoV1 DR2与抗原多肽HBoV1 DR2、HBoV2 DR2结合动力学常数
。
表2显示，单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2与抗原多肽HBoV1 DR2结合的Kd、Kon和Koff值分别为3.62×10-11(M)、1.92×106(1/Ms)和4.25×10-5(1/s)，提示：该抗体与其特异性抗原的结合力较强；Gator系统无法计算Mab-HBoV1 DR2与HBoV2 DR2结合的 Kd、Kon和Koff值，提示Mab-HBoV1 DR2与HBoV2 DR2无结合。
表3、Mab-HBoV2 DR2与抗原多肽HBoV1 DR2、HBoV2 DR2结合动力学常数
。
表3显示，单克隆抗体Mab-HBoV2 DR2与抗原多肽HBoV2 DR2结合的Kd、Kon和Koff值分别为2.42×10-10（M）、1.76×106（1/Ms）和3.67×10-4(1/s)，提示：该抗体与其特异性抗原的结合力较强；Gator系统无法计算Mab-HBoV2 DR2与HBoV1 DR2结合的Kd、Kon和Koff值，提示Mab-HBoV2 DR2与HBoV1 DR2无结合。
上述结果表明，单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2分别与其各自的特异性抗原多肽具有较高的结合能力，而与不同型别的另一种抗原多肽则完全无结合，这说明：单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2具有较高的抗原结合特异性和较高的结合亲和力。
实施例5：单克隆抗体的型别特异性验证
本实施例中，以HEK293真核表达的HBoV1 VP3和HBoV2 VP3蛋白（如实施例2中所制备）作为抗原，或以HBoV1 DR2、HBoV2 DR2多肽（如实施例1中所制备）作为抗原，通过Western blot、ELISA、IFA实验，检测单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2与抗原的结合情况，以确定其型别特异性。
Western blot实验：
采用蛋白免疫印迹（即，Western blot）实验，以真核表达的HBoV1 VP3、HBoV2 VP3蛋白为分析对象，检测抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2与其的结合情况，以检测该抗体的型别特异性。
结果如图4所示；由图4可见，单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2仅能结合HBoV1 VP3蛋白，而与HBoV2 VP3蛋白则无任何结合，即，不发生交叉反应；单克隆抗体Mab-HBoV2 DR2仅能结合HBoV2 VP3蛋白，而与HBoV1 VP3蛋白则无任何结合；这说明：Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2DR2均具有型别特异性。
ELISA实验：
采用酶联免疫吸附（ELISA）实验，检测抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2与抗原多肽HBoV1 DR2、HBoV2 DR2的结合情况，以检测该抗体的型别特异性。具体地，分别将单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2从1:200开始进行倍比稀释，将所得一系列稀释度的单克隆抗体分别与HBoV1 DR2、HBoV2 DR2多肽孵育，以进行抗原-抗体反应；反应完毕后，检测反应物的OD450（均数±标准差），分析抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2与抗原多肽HBoV1 DR2、HBoV2 DR2的结合差异。
结果如图5所示；由图5可见，效价为1:25600的Mab-HBoV1 DR2与HBoV1 DR2蛋白反应的平均OD450（1.346±0.659）显著高于其与HBoV2 DR2反应的平均OD450（0.055±0032）（t=40.397，P＜0.001）；效价为1:25600的Mab-HBoV2 DR2与HBoV2 DR2蛋白反应的OD450（1.209±0.824）显著高于其与HBoV1 DR2反应的OD450（0.081±0.116）（t=26.000，P＜0.001）。
该结果表明：Mab-HBoV1 DR2能与HBoV1 DR2多肽发生抗原-抗体反应，而与HBoV2DR2多肽则几乎不发生抗原-抗体反应；Mab-HBoV2 DR2能与HBoV2 DR2多肽发生抗原-抗体反应，而与HBoV1 DR2多肽则几乎不发生抗原-抗体反应；这说明：抗体MAB-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2均具有型别特异性。
间接免疫荧光（IFA）实验：
以过表达HBoV1 VP3、HBoV2 VP3蛋白的HEK293细胞为检测对象，检测抗体Mab-HBoV1 DR2与所表达抗原的结合情况，以检测该抗体的型别特异性。具体地，分别将HBoV1VP3、HBoV2 VP3蛋白在HEK293细胞中进行真核表达，使用多聚甲醛固定细胞后，应用单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2 DR2以1:100稀释孵育细胞，再以FITC羊抗鼠标记的二抗孵育，然后在荧光显微镜下观察并拍照。
结果如图6所示；图6显示，在表达抗原HBoV1 VP3的细胞中，与抗体Mab-HBoV1 DR2稀释液孵育后，有特异性绿色荧光细胞出现，在与抗体Mab-HBoV2 DR2稀释液孵育后，则没有特异性绿色荧光细胞出现；而对于表达抗原HBoV2 VP3的细胞，在与抗体Mab-HBoV2 DR2稀释液孵育后，有特异性绿色荧光细胞出现，在与抗体Mab-HBoV1 DR2稀释液孵育后，则没有特异性绿色荧光细胞出现；这说明：抗体Mab-HBoV1 DR2与抗原HBoV1 VP3发生了抗体-抗原反应，而与抗原HBoV2 VP3则无此反应；抗体Mab-HBoV2 DR2与抗原HBoV2 VP3发生了抗体-抗原反应，而与抗原HBoV1 VP3则无此反应。上述结果说明，Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV2DR2均具有型别特异性。
实施例6：HBoV1特异性单克隆抗体的临床诊断有效性验证
选取2017年1月至2021年12月于首都儿科研究所附属儿童医院就诊、收治的急性呼吸道感染儿科患者临床标本，包括咽拭子(TS)、鼻咽拭子(NPS)、鼻咽抽吸物 (NPA)和支气管肺泡灌洗液(BLF)。将入组标本在II级生物安全柜中加入2.5 ml病毒转运培养基，500g离心10分钟后，上清液用于核酸提取，剩余物-80℃保存备用；沉淀涂片，丙酮固定后-20℃保存备用。核酸检测HBoV1呈阳性的标本，取细胞沉淀重新悬浮并点样到载玻片上用丙酮固定并在-20℃保存，平衡至室温，将PBS稀释的本发明单克隆抗体（1:20、1:40、1:80）各5μL加到载玻片上，37℃湿盒孵育30分钟；洗涤；1:5000 PBS稀释后的FITC偶联的山羊抗鼠IgG抗体5μL加到载玻片上，37℃湿盒孵育30分钟；洗涤；含0.04%的台盼蓝液体中浸泡5分钟；吹干载玻片，荧光显微镜下观察结果，有明亮的绿色特异性荧光的细胞确定为HBoV1抗原阳性。
结果如图7所示；图7显示：在IFA中，Mab-HBoV1 DR2有特异性绿色荧光细胞出现；提示：在临床呼吸道标本抗原检测中，本发明的单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2可以有效地检出HBoV1感染。
应用D3 Ultra™ DFA呼吸道病毒筛查试剂盒（Diagnostic Hybrids Inc.，Athens，OH，USA）中的RSV、FluA 和 B、HAdV、PIV 1、2 和 3感染细胞的载玻片作为其他儿童常见病原，用于验证两种单克隆抗体的诊断特异性。
抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV1 DR2的检测结果分别如图8A和图8B所示；图8A和图8B显示：抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV1 DR2与RSV、流感A和B、ADV和PIV 1-3感染的阳性细胞反应时均无特异性绿色荧光细胞出现；说明：单克隆抗体Mab-HBoV1 DR2、Mab-HBoV1DR2与其他呼吸道病毒无交叉反应性。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (8)

1.一种用于人博卡病毒型别特异性检测或诊断的试剂，其特征在于，所述试剂包括：（1）抗体I；以及，（2）抗体II；
其中：
所述抗体I为针对1型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区；所述抗体I的重链可变区包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示的三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及氨基酸序列分别如SEQ IDNO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9所示的框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4；所述抗体I的轻链可变区包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 4、KVS和SEQ ID NO: 5所示的三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 10、SEQID NO: 11、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13所示的框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4；
所述抗体II为针对2型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区；所述抗体II的重链可变区包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO: 37所示的三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43所示的框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4；所述抗体II的轻链可变区包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 38、LAS和SEQ ID NO: 39所示的三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及氨基酸序列分别如SEQID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 47所示的框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，
所述抗体I的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示；所述抗体I的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示；
所述抗体II的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 48所示；所述抗体II的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 49所示。
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，
所述抗体I的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示；所述抗体I的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示；
所述抗体II的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 52所示；所述抗体II的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 53所示。
4.抗体I和抗体II的组合在制备用于1型人博卡病毒和2型人博卡病毒之间的鉴别诊断的检测或诊断类产品中的应用，其特征在于，
所述抗体I为针对1型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区；所述抗体I的重链可变区包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 3所示的三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及氨基酸序列分别如SEQ IDNO:6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9所示的框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4；所述抗体I的轻链可变区包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 4、KVS和SEQ ID NO: 5所示的三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 10、SEQID NO: 11、SEQ ID NO: 12和SEQ ID NO: 13所示的框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4；
所述抗体II为针对2型人博卡病毒的型别特异性单克隆抗体，其包含重链可变区和轻链可变区；所述抗体II的重链可变区包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 35、SEQ ID NO:36和SEQ ID NO: 37所示的三个互补决定区HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43所示的框架区H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4；所述抗体II的轻链可变区包含：氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 38、LAS和SEQ ID NO: 39所示的三个互补决定区LCDR1、LCDR2和LCDR3，以及氨基酸序列分别如SEQID NO: 44、SEQ ID NO: 45、SEQ ID NO: 46和SEQ ID NO: 47所示的框架区L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，
所述抗体I的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示；所述抗体I的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 15所示；
所述抗体II的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 48所示；所述抗体II的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 49所示。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，
所述抗体I的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 18所示；所述抗体I的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 19所示；
所述抗体II的重链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 52所示；所述抗体II的轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO: 53所示。
7.根据权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于，样品为受试者的生物学样品。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述样品为来自受试者的呼吸道样品。
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