CN116082498A - 一种猴痘病毒蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种猴痘病毒蛋白的单克隆抗体及其应用 Download PDF

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Abstract

本说明书一些实施例提供了一种猴痘病毒蛋白的单克隆抗体及其应用。所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中，所述重链可变区包括：如SEQ ID NO:1所示的CDRH1的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2所示的CDRH2的氨基酸序列、如SEQ ID NO:3所示的CDRH3的氨基酸序列；所述轻链可变区包括：如SEQ ID NO:4所示的CDRL1的氨基酸序列、CDRL2的氨基酸序列YAS、如SEQ ID NO:6所示的CDRL3的氨基酸序列。

Description

一种猴痘病毒蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
本说明书涉及生物工程技术领域，特别涉及一种猴痘病毒蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段及相关应用。
背景技术
猴痘病毒在生物学分类中，归于痘病毒科的正痘病毒属，是一组呈单一线状双股DNA病毒，具有很强的传染性。猴痘病毒对人类健康存在巨大威胁，目前在世界范围内已经发生了传播现象。因此，对潜在的猴痘病毒传染爆发前期能够迅速作出反应是至关重要的，这往往决于是否有适当的分析方法，可以在猴痘病毒发生大规模传播之前对其进行快速和准确的检测。
因此，需要提供一种能够特异性结合猴痘病毒蛋白的抗体和使用该抗体检测样品中是否存在猴痘病毒的方法。
发明内容
本说明书一些实施例提供了一种能结合猴痘病毒蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包括：如SEQ ID NO:1所示的CDRH1的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2所示的CDRH2的氨基酸序列、如SEQ ID NO:3所示的CDRH3的氨基酸序列；所述轻链可变区包括：如SEQ ID NO:4所示的CDRL1的氨基酸序列、CDRL2的氨基酸序列YAS、如SEQ ID NO:6所示的CDRL3的氨基酸序列。
本说明书一些实施例还提供了一种核酸分子，在一些实施例中，所述核酸分子编码前述抗体或其抗原结合片段。
本说明书一些实施例还提供了一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如前述核酸分子。
本说明书一些实施例还提供了一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括前述表达载体。
本说明书一些实施例还提供了一种用于检测猴痘病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括前述抗体或其抗原结合片段。
本说明书一些实施例还提供了前述抗体或其抗原结合片段在制备用于检测猴痘病毒的试剂盒中的用途。
本说明书一些实施例还提供了一种检测猴痘病毒的方法，其特征在于，包括使用前述试剂盒检测样本中是否存在猴痘病毒。
具体实施方式
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
除另有定义外，本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。
术语“约”和“左右”可描述在某个值的一定取值范围内，例如加上或减去该值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％等。例如，术语“约10mL”可以包括9mL至11mL。
如本文所用，术语“抗体”通常是指包含通过共价二硫键和非共价相互作用保持在一起的两条重链(H)和两条轻链(L)多肽链的Y形四聚体蛋白。例如，抗体的轻链可以分为κ和λ轻链。重链可分为μ、δ、γ、α和ε，它们分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链中，可变区通过约12个或更多个氨基酸的“J”区与恒定区连接，并且重链还包含约3个或更多个氨基酸的“D”区。每条重链由重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)组成。重链恒定区由3个结构域(CH1，CH2和CH3)组成。每条轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可以进一步分为由相对保守的区域(称为框架区(FR))间隔开的高变区(称为互补决定区(CDR))。每个VH和VL通常由以下顺序的3个CDR和4个FR组成：从N端到C端的FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。每个重链/轻链对的可变区(VH和VL)分别形成抗原结合位点。抗体可以具有不同的抗体同种型，例如IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”，是指包含全长抗体的片段的多肽，其保留了与全长抗体特异性结合的抗原特异性结合的能力，和/或其与全长抗体竞争结合相同的抗原。在一些实施例中，抗原结合片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(例如scFv)、嵌合抗体，双抗体和包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的至少一部分抗体的多肽。抗体的抗原结合片段可从给定抗体(例如，在本申请中提供的抗猴痘病毒A35R抗原的单克隆抗体)通过本领域技术人员已知的常规技术(例如，重组DNA技术或酶促或化学切割方法)获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选特异性。
术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。“百分比同一性”是指比较分子中氨基酸或核苷酸之间相同残基的百分比，并基于被比较的最小分子的大小计算。
以下将对本说明书实施例所涉及的方法进行详细说明。值得注意的是，以下实施例仅仅用以解释本说明书，并不构成对本说明书的限定。
猴痘病毒与天花病毒是较为相似的，在生物学分类中，猴痘病毒归于痘病毒科的正痘病毒属，是一组呈单一线状双股DNA病毒。正痘病毒属是痘病毒科、脊椎动物痘病毒亚科的一个属，包括痘苗病毒(vaccinia virus)、天花病毒(variola virus)、兔痘病毒(rabbitpox virus)、小鼠脱脚病病毒ectromelia(mice)virus、水牛痘病毒(buffalopoxvirus)、骆驼痘病毒(camelpox virus)和猴痘病毒(monkeypox virus)等，痘苗病毒为该属的代表种。
正痘病毒(牛痘vaccinia、天花/天花variola/smallpox、猴痘monkeypox)有两种病毒粒子形式，即细胞内成熟病毒粒子(Intracellular Mature Virion,IMV)和细胞外包膜病毒粒子(Extracellular Enveloped Virion,EEV)，每一种都具有不同的结构和生物学特性。重要的是，这两种病毒粒子形式不共享任何表面蛋白，因此病毒粒子的形式在免疫学上是不同的，不会被单一的特异性的抗体识别。IMV具有坚硬的外壳蛋白，有利于从宿主到宿主的传播，而更脆弱的EEV适用于病毒在血液细胞间传播，所以EEV是被设计用于限制宿主免疫清除的靶点。病毒EEV膜特异编码七种蛋白质：A33、A34、A36、A56、B5、F12和F13。
而最新的研究表明，用蛋白组学分析发现，在猴痘病毒感染的血液中早期人的IgM抗体主要识别猴痘病毒的EEV蛋白F13L，A35R和B6R，还有A44R一个未知蛋白。而在猴痘病毒感染的血液中后期人的IgG抗体主要识别猴痘病毒的EEV蛋白F13L，A35R和B6R，还有IMV蛋白D8L，A29L，H3L，还有核心蛋白A4L。
本发明运用原核表达的猴痘病毒A35R蛋白免疫小鼠，取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，通过特异性的高通量筛选得到具有高度特异性的杂交瘤细胞，通过培养和再免疫获得大量小鼠腹水，再经多步分离及纯化获得高纯度、高灵敏度和高特异性的抗猴痘病毒A35R抗原的单克隆抗体，为开发检测猴痘病毒的试剂盒提供了所需的原料。本发明提供的抗猴痘病毒A35R抗原的单克隆抗体经验证具有良好的特异性结合能力，可用于免疫印迹、免疫荧光等免疫学检测。
本说明书一些实施例提供了一种能结合猴痘病毒蛋白的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区包括：CDRH1、CDRH2和CDRH3；所述轻链可变区包括：CDRL1、CDRL2和CDRL3。其中，CDRH是指重链可变区中的互补决定区；CDRL是指轻链可变区中的互补决定区。
在一些实施例中，CDRH1的氨基酸序列为：GYTFTSYW(SEQ ID NO:1)。CDRH2的氨基酸序列为：INPSNGRF(SEQ ID NO:2)。CDRH3的氨基酸序列为：ARNNPTGNFAF(SEQ ID NO:3)。
在一些实施例中，CDRL1的氨基酸序列为：QSISNY(SEQ ID NO:4)。CDRL2的氨基酸序列为：YAS。CDRL3的氨基酸序列为：QQNNSWPQLT(SEQ ID NO:6)。
在一些实施例中，所述重链可变区包括如下序列：
VKLQQSGAELVKPGASVRLSCKASGYTFTSYWMHWVRQRPGQGLEWIGEIN
PSNGRFNCNEKFRTKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARNNPTGN FAFWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:7)。
在一些实施例中，所述轻链可变区包括如下序列：
DIVLIQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISNYLHWYQQKSHESPRLLIKYASQS ISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQNNSWPQLTFGAGTK(SEQ ID NO:8)。
在一些实施例中，上述重链可变区或轻链可变区中可以含有不多于2个氨基酸或不多于1个氨基酸的保守取代。如本文所用，术语“保守取代”是指不会不利地影响或改变包含氨基酸序列的蛋白质/多肽的基本性质的氨基酸取代。例如，保守取代可以通过本领域已知的标准技术(例如定点诱变和PCR介导的诱变)引入。保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基被具有相似侧链的另一氨基酸残基取代的取代，例如物理或功能相似的残基(例如具有相似的大小，形状，电荷，化学性质包括形成共价键或氢键的能力等)至相应的氨基酸残基的取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸，精氨酸和组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸，色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸)，具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)。因此，相应的氨基酸残基优选被来自相同侧链家族的另一个氨基酸残基取代。
在一些实施例中，所述重链可变区包括与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比在框架区中具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述重链可变区包括与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比在框架区中具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述轻链可变区包括与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比在框架区中具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所述轻链可变区包括与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比在框架区中具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述猴痘病毒蛋白为猴痘病毒A35R蛋白。猴痘病毒A35R蛋白(MPXV-A35R)是一种细胞外包膜病毒(EEV)特异性II型膜糖蛋白，在有效的EEV形成中起着关键作用，并有助于病毒颗粒有效在细胞间传播。
本说明书一些实施例还提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前述抗体或其抗原结合片段，是开发猴痘病毒检测抗体和治疗性抗体的潜在靶点。
在一些实施例中，所述核酸分子可以包括编码所述重链可变区中的CDRH1的核苷酸序列：GGCTACACCTTCACCAGCTACTGG(SEQ ID NO:5)。所述核酸分子可以包括编码所述重链可变区中的CDRH2的核苷酸序列：ATTAATCCTAGCAACGGTCGTTTT(SEQ ID NO:11)。所述核酸分子可以包括编码所述重链可变区中的CDRH3的核苷酸序列：GCAAGAAATAACCCAACTGGGAACTTTGCCTTC(SEQ ID NO:12)。
在一些实施例中，所述核酸分子可以包括编码所述轻链可变区中的CDRL1的核苷酸序列：CAAAGTATTAGCAACTAC(SEQ ID NO:13)。所述核酸分子可以包括编码所述轻链可变区中的CDRL2的核苷酸序列：TATGCTTCC。所述核酸分子可以包括编码所述轻链可变区中的CDRL3的核苷酸序列：CAACAGAATAACAGCTGGCCTCAGCTCACG(SEQ ID NO:14)。
在一些实施例中，所述核酸分子包括编码所述重链可变区的如下核苷酸序列:
GTCAAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGT
GAGGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGC
ACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGAT
TAATCCTAGCAACGGTCGTTTTAACTGCAATGAGAAGTTCAGGACCAAGG
CCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGC
AGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAAATAACCC
AACTGGGAACTTTGCCTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA(SEQ ID NO:9)。
在一些实施例中，所述核酸分子包括编码所述轻链可变区的如下核苷酸序列：
GATATTGTGCTAATTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGAT
AGAGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGTCAAAGTATTAGCAACTACCTACA
CTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATG
CTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCA
GGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGG
AATGTATTTCTGTCAACAGAATAACAGCTGGCCTCAGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAG(SEQ IDNO:10)。
本说明书一些实施例还提供了一种表达载体，所述表达载体包括前述包含如SEQID NO:9所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列的核酸分子。在一些实施例中，可以使用例如本领域众所周知的重组DNA技术和基因转染方法，将前述核酸分子插入一个或多个表达载体中，使得所述基因可操作地连接于转录和翻译调节序列。在此上下文中，术语“可操作地连接”意在表示将抗体基因连接到载体中，使得载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节抗体基因转录和翻译的预期功能，从而表达本发明所提供的猴痘病毒蛋白抗体。
本说明书一些实施例还提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包括前述表达载体。所述宿主细胞包括但不限于微生物细胞、动物细胞等。例如，当将含有编码本发明所提供的猴痘病毒蛋白抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列的表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，通过培养宿主细胞，可以得到所述猴痘病毒蛋白抗体或其抗原结合片段。通过类似方法，可以批量生产本发明所提供的猴痘病毒蛋白抗体或其抗原结合片段。
本说明书一些实施例还提供了一种用于检测猴痘病毒蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括前述抗体或其抗原结合片段。
在一些实施例中，所述试剂盒可以是胶体金检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、酶免检测试剂盒、化学发光试剂盒、免疫比浊检测试剂盒等。本发明对此不作限制。
本说明书一些实施例还提供了前述抗体或其抗原结合片段在制备用于检测猴痘病毒的试剂盒中的用途。
本说明书一些实施例还提供了一种检测猴痘病毒的方法，包括使用前述试剂盒检测样本中是否存在猴痘病毒。
在一些实施例中，所述方法还可以是非诊断目的方法。例如所述检测猴痘病毒的方法可以用于检测环境或某些物体是否被猴痘病毒污染。作为示例，所述样品可以是取自环境的样本，如饮用水。又例如，所述样品可以是从物体表面以涂抹等方式取得的样本，如食品包装袋。在一些实施例中，所述检测猴痘病毒的方法还可以用于科学研究等目的，本发明对此不作限制。
实施例
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，若无特殊说明，均设置三次重复实验，结果取平均值。实施例1抗A35R抗原单克隆抗体的制备
一、构建重组质粒
本实施例中所使用的猴痘病毒A35R蛋白序列由Genebank获得(登录号:928958)。在合成的猴痘病毒A35R蛋白序列上游加BamH I的酶切位点GGATCC，下游加EcoR I的酶切位点GAATTC。利用BamH I和EcoR I双酶切出546bp的A35R片段，回收后连接到同样被BamH I和EcoR I双酶切的pGEX-6p-1载体中，得到细菌表达质粒pGEX-6p-1-A35R。将测序正确的pGEX-6p-1-A35R质粒转化到BL21菌株中诱导表达。
二、制备猴痘病毒A35R抗原
将含有pGEX-6p-1-A35R的BL21菌株在含有50μg/mL氨苄的10mLLB+0.5％葡萄糖培养基中37℃过夜培养(37℃，200rpm)，次日1：100放大转接至500mL培养基中，37℃、200rpm培养至OD600约0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃诱导16小时后收集菌体(500mL收菌瓶，4000rpm，10min，4℃)，弃上清。加入30mL磷酸缓冲液(phosphate buffered salinebuffer，PBS)缓冲液，震荡悬起菌体，置冰上(之后步骤都在冰上进行)，4℃超声破碎(70w，超声90次，每次10s，10s间歇)至溶液清亮后离心去除沉淀，按照参照GE公司GlutathioneSepharose 4B使用指南过柱收集目标蛋白。
过柱操作如下：
1、样品的澄清过滤：使用50mL注射器以及0.22μm滤膜将准备好的菌体上清进行澄清；
2、采用蛋白层析柱，在AKTA层析系统上进行捕获、纯化；
3、进行系统冲洗，再用平衡液冲洗AKTA层析系统的A1泵，洗脱液冲洗B1泵；
4、设置好系统流速0.1mL/min，选择相应的柱位1号位连接蛋白层析柱，用平衡液PBS对AKTA层析系统及柱子进行平衡，平衡结束后紫外调零；
5、开始上样，将A1泵转移至上样离心管内上样；
6、上样结束后，将A1泵转移至PBS中，冲洗至检测波长稳定后，将A1泵转移至洗脱液(1mM PBS+15mM还原性谷胱甘肽，pH 8.0-9.0)中洗脱，收集洗脱液；再用平衡液A(PBS)冲洗，最后用20％的乙醇冲洗柱子。
7、用洗脱缓冲液(1mM PBS+15mM还原性谷胱甘肽，pH 8.0-9.0)从柱上洗脱重组GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标记的A35R抗原，用SDS-PAGE分析纯化抗原，用考马斯亮蓝染色法观察。用重组HRV 3C蛋白酶过夜酶切GST-A35R蛋白，切掉GST标签，过GE公司的凝胶过滤预装柱(Superdex 200Increase10/300GL)，通过分子筛作用，分离获得高纯度的猴痘病毒A35R抗原。三、A35R抗原单克隆抗体的制备
选用6-8周龄Balb/c健康雌性小鼠，按照预先指定的免疫方案进行动物免疫实验。将免疫Balb/c小鼠作为免疫原，从中提取免疫成功的小鼠脾脏淋巴细胞，通过细胞融合技术将淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合，经过二轮亚克隆筛选后获得稳定分泌的猴痘病毒A35R抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，从而获得猴痘病毒A35R抗原的单克隆抗体。
动物免疫实验具体步骤包括：
1、将体重、周龄均值一致的Balb/c小鼠随机分为2组，加铝佐剂(氢氧化铝佐剂)组A组和不加铝佐剂组B组。A组小鼠中含有的免疫抗原的剂量为100ug/只，B组小鼠中含有的免疫抗原的剂量为150ug/只，每一组小鼠都有对照组。
2、实验开始前，小鼠各收集免疫前血清(第五天收集免疫前血清，通过眼球取血，适量取血，保证小鼠正常状态)，收集好的血清存于-80℃。
3、加铝佐剂(氢氧化铝佐剂)组配制方式：免疫前，每一抗原在75μL PBS中分别稀释至对应剂量(100ug/只或150ug/只小鼠)，并与明矾佐剂(1mg/只小鼠)混合，按照体积抗原:佐剂＝3:1(即75μL免疫原稀释液中加入25μL佐剂)混合；佐剂使用前摇匀，将注射佐剂(25μL)缓慢滴加至免疫原溶液中；佐剂与免疫原稀释液充分混合后，两者充分混合30分钟。使佐剂有效吸附抗原；后续根据免疫动物实验操作进行。
4、不加铝佐剂组配制：抗原在100μL PBS中分别稀释至表1中的对应剂量(100ug/只或150ug/只小鼠)，100μL的免疫原，后续根据免疫动物实验操作进行。
5、以2周的间隔皮下注射：实验设计为3次免疫方式，但分别在每一次免疫注射7天后眼球取血，离心法获得部分小鼠上清，先进行血清滴度检测，最后一次免疫结束7天后，心脏取血取最大血量，离心获得上清，存于-80℃。
6、检测血清效价。
(1)免疫了5只小鼠，小鼠编号依次为A0，A1，A2，B0，B1。3次免疫结束后，检测血清效价。检测数据如下表1所示。
表1：血清效价检测数据
Figure BDA0004035882680000111
对A0，B0和B1三只小鼠免疫脾细胞与骨髓瘤细胞系SP2/0细胞融合，通过HAT选择培养基(HAT选择培养基含有次黄嘌呤(Hypoxantin)、氨基蝶呤(Aminopterin)和胸腺嘧啶脱氧核苷(Thymidin))筛选融合细胞，并对融合细胞进行酶联免疫吸附测定(enzymelinked immunosorbent assay，简称ELISA)阳性筛选及亚克隆；筛选出的阳性单克隆，取腹水，用Protein A/G抗体纯化柱纯化杂交瘤细胞产生的腹水抗体。纯化后的腹水抗体的纯度>90％。
实施例2抗A35R抗原单克隆抗体筛选
(1)细胞融合和克隆筛选
选取实施例中小鼠编号依次为A0，B0，B1的三只小鼠，共完成了三轮融合。
A0，B0，B1三只小鼠融合筛选共挑出25个阳性孔进行亚克隆，经融合筛选，共挑选出80个OD450值>2.2以上的阳性克隆进行倍比稀释检测效价，再进行第二次亚克隆筛选。得到9个杂交瘤细胞株，分别命名为A0-1，A0-2，A0-3，B0-1，B0-2，B0-3，B1-1，B1-2，B1-3。
(2)腹水制备和检测数据
将每个杂交瘤细胞株分别注入F1代小鼠腹腔，共收集了9份腹水，所有腹水检测效价数据如下表2所示：
表2：腹水检测效价
Figure BDA0004035882680000121
(3)抗体纯化条件摸索和检测数据
以上腹水经3.3％正辛酸-硫胺沉淀法纯化，共得到9个杂交瘤细胞株对应的抗体，所有抗体的效价检测数据见下表:
表3：抗体效价检测
稀释浓度 A0-1 A0-2 A0-3 B0-1 B0-2 B0-3 B1-1 B1-2 B1-3
20ug/mL 3.3986 3.2062 3.0380 3.0501 3.0699 3.1823 3.1736 3.2625 3.3681
4ug/mL 3.6199 3.3263 3.1059 3.1774 3.1081 3.5701 3.2811 3.1167 3.3728
800ug/mL 3.3729 3.1843 3.0528 3.0719 3.0222 3.2752 3.2167 3.0001 3.3659
160ng/mL 3.5558 3.1849 2.9123 3.1115 2.9032 3.1238 3.1836 2.8315 3.4020
32ng/mL 3.0831 2.0089 1.4791 3.01 1.5582 1.8511 2.9987 1.5366 2.8988
6.4ng/mL 1.4789 0.6346 0.5663 2.092 0.4544 0.6648 1.7001 0.6162 1.2542
1.28ng/mL 0.5495 0.3317 0.2434 0.8273 0.3590 0.2543 0.6144 0.2648 0.3162
PBS 0.2301 0.1528 0.1165 0.1832 0.1647 0.1692 0.1961 0.1149 0.1705
以上数据显示9个杂交瘤细胞株的单克隆抗体对A35R抗原具有良好的特异性结合能力。
实施例3ELISA检测单克隆抗A35R抗原单克隆抗体的结合活性
采用IgG抗体滴度检测方式检测抗A35R抗原单克隆抗体的结合活性，具体步骤如下：
(1)底板包被：将所用抗原用包被稀释液稀释到3μg/mL，每孔各加入配好的包被液100μL，置4℃冰箱，放置24h。
(2)24h后，从冰箱取出后置于37℃平衡30min，之后弃去孔中液体；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。
(3)封闭酶标反应孔：每孔加入200μL 5％小牛血清后置37℃封闭90min，封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。
(4)加入待检测样品：将样本按照需要的比例进行稀释，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每孔100μL，置于37℃，90min；用洗涤液满孔洗涤3遍，每遍3min。
(5)加入酶标抗体：按照说明书加入适宜浓度的二抗；37℃，90min，每孔加100μL洗涤同前。
(6)加入底物液：底物加入量每孔100μL，置37℃避光放置15～30min。
(7)终止反应：每孔加入终止液50μL终止反应，于20min内测定实验结果。
使用实施例1得到的纯化后的抗体按照上述步骤进行ELISA效价检测，得到的结果为ELISA效价均>1：128，000，表明抗A35R抗原单克隆抗体具有较好的结合活性。
实施例4抗A35R抗原单克隆抗体在试剂盒中的应用
本实施例以免疫胶体金检测法为例，通过免疫胶体金平台对抗A35R抗原单克隆抗体进行验证。
具体的，我们购买了其他公司的A35R抗原，包括苏州近岸蛋白质科技股份有限公司的A35R抗原，货号:DRA209；南京欧凯生物科技有限公司的A35R抗原，货号：C1620；北京孚博生物科技有限公司的A35R抗原，货号：FB0606。将实施例2中产生的9个单克隆抗体对于外购的A35R抗原的结合活性进行检测，将所用抗原用包被稀释液稀释到3ug/mL，每孔各加入配好的包被液100μL，ELISA检测数据见下表：
表4：9个单克隆抗体在免疫胶体金法中的初评结果
Figure BDA0004035882680000131
Figure BDA0004035882680000141
通过表4可以看出，单克隆抗体B1-2对其他三个公司购买的A35R抗原都有很好的结合活性，将其命名为Anti-A35R-1抗体，单克隆抗体Anti-A35R-1可用于免疫印迹、免疫荧光等免疫学检测。
实施例5单克隆抗体Anti-A35R-1重链可变区(VH)及轻链可变区(VL)序列分析
扩增重链V区(VH)及轻链V区(VL)基因的引物如下：
重链可变区正向引物(VH-FOR):GGGAATTCGAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGG
(SEQ ID NO:15)；
重链可变区反向引物(VH-BACK):GGAAGGTGTGCACACCGCTGGAC(SEQ ID NO:16)；
轻链可变区正向引物(VL-FOR):ATGGAATCACAGRCYCWGGT(SEQ ID NO:17)；
轻链可变区反向引物(VL-BACK):GATGGTGGGAAGATGGATACAGTT(SEQ ID NO:18)。
取Anti-A35R-1对数生长期的杂交瘤细胞株(约107个细胞)，按照Trizol RNA提取试剂盒的说明书抽提细胞的总RNA，以总RNA为模板反转录合成cDNA第一链，以上述扩增产物为模板PCR扩增抗体的VH/VL基因。
回收Anti-A35R-1的重链VH(约360bp)、轻链VL(约300bp)片段，进行测序。
然后分析VH/VL基因序列:
所得序列如下：
重链的可变区序列：
Anti-A35R-1-VH:351bp
GTCAAGCTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGTGAAGCCTGGGGCT TCAGTGAGGCTGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTCACCAGCTACTGGATGCACTGGGTGAGGCAGAGGCCTGGACAAGGCCTTGAGTGGATTGGAGAGATTAATCCTAGCAACGGTCGTTTTAACTGCAATGAGAAGTTCAGGACCAAGGCCACACTGACTGTAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGAAATAACCCAACTGGGAACTTTGCCTTCTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGT CTCCTCA(SEQ ID NO:9)。
Anti-A35R-1-VH protein：117aa
VKLQQSGAELVKPGASVRLSCKASGYTFTSYWMHWVRQRPGQGLE WIGEINPSNGRFNCNEKFRTKATLTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCAR NNPTGNFAFWGQGTTLTVSS(SEQ ID NO:7)
轻链的可变区序列：
Anti-A35R-1LVκ：312bp
GATATTGTGCTAATTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAG GAGATAGAGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGTCAAAGTATTAGCAACTACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAATAACAGCTGGCCTCAGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAG(SEQ ID NO:10)。
Anti-A35R-1LVκprotein:104aa
DIVLIQSPATLSVTPGDRVSLSCRASQSISNYLHWYQQKSHESPRLLIKY ASQSISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVETEDFGMYFCQQNNSWPQLTFGAGTK(SEQ ID NO:8)。
本发明所披露的一种猴痘病毒蛋白抗原的单克隆抗体或其抗原结合片段及相关应用，带来的有益效果包括但不限于：(1)本发明提供的猴痘病毒蛋白抗原的新型单克隆抗体具有高效价和高特异性；(2)本发明所提供的猴痘病毒蛋白单克隆抗体可用于免疫印迹、免疫荧光等免疫学检测，例如可用于通过胶体金检测平台，检测样本中是否存在猴痘病毒。需要说明的是，不同实施例可能产生的有益效果不同，在不同的实施例里，可能产生的有益效果可以是以上任意一种或几种的组合，也可以是其他任何可能获得的有益效果。
本领域的技术人员应当理解，以上实施例仅为说明本发明，而不对本发明构成限制。凡在本发明的精神和原则内所作的任何修改、等同替换和变动等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (13)

1.一种猴痘病毒蛋白的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包括：如SEQ ID NO:1所示的CDRH1的氨基酸序列、如SEQ ID NO:2所示的CDRH2的氨基酸序列、如SEQ ID NO:3所示的CDRH3的氨基酸序列；
所述轻链可变区包括：如SEQ ID NO:4所示的CDRL1的氨基酸序列、CDRL2的氨基酸序列YAS、如SEQ ID NO:6所示的CDRL3的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述重链可变区由以下任一项组成：
如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；
与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列在框架区中具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；以及
与如SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列相比在框架区中具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
3.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区由以下任一项组成：
如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列在框架区中具有至少85％、90％或95％同一性的氨基酸序列；以及
与如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列相比在框架区中具有一个或多个氨基酸的添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。
4.如权利要求3所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段与所述猴痘病毒蛋白的结合能力的ELISA效价大于1:128，000。
5.如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述猴痘病毒蛋白为猴痘病毒A35R蛋白。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
7.如权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码所述重链可变区的如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，以及编码所述轻链可变区的如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列。
8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求6所述的核酸分子。
9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括如权利要求8所述的表达载体。
10.一种用于检测猴痘病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
11.如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是胶体金检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、酶免检测试剂盒、化学发光试剂盒或免疫比浊检测试剂盒。
12.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测猴痘病毒的试剂盒中的用途。
13.一种用于非诊断目的的检测猴痘病毒的方法，其特征在于，包括使用如权利要求10所述的试剂盒检测样本中是否存在猴痘病毒。
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