CN117683122A - 抗猴痘病毒的抗体及其制备方法与应用 - Google Patents

抗猴痘病毒的抗体及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117683122A
CN117683122A CN202410129969.2A CN202410129969A CN117683122A CN 117683122 A CN117683122 A CN 117683122A CN 202410129969 A CN202410129969 A CN 202410129969A CN 117683122 A CN117683122 A CN 117683122A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
chain variable
variable region
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202410129969.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN117683122B (zh
Inventor
程功
曲园园
肖望成
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tsinghua University
Shenzhen Bay Laboratory
Original Assignee
Tsinghua University
Shenzhen Bay Laboratory
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tsinghua University, Shenzhen Bay Laboratory filed Critical Tsinghua University
Priority to CN202410129969.2A priority Critical patent/CN117683122B/zh
Publication of CN117683122A publication Critical patent/CN117683122A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN117683122B publication Critical patent/CN117683122B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G01N2333/065—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)

Abstract

本发明公开了抗猴痘病毒的抗体及其制备方法与应用，涉及抗体技术领域。本发明具体公开了多株对B6R蛋白具有很好的特异性和亲和力的抗体（B010、B019、B026、B041、B050、B083、B089、B161），且其对猴痘病毒和痘苗病毒等正痘病毒都具有很好的中和活性，不仅可用于B6R抗原蛋白、MPXV和VACV的检测，还可用于天花病毒、牛痘病毒、猴痘病毒以及痘苗病毒等正痘病毒感染治疗药物的开发，具有很好的应用前景。

Description

抗猴痘病毒的抗体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，尤其是涉及抗猴痘病毒的抗体及其制备方法与应用。
背景技术
猴痘是由猴痘病毒引起一种病毒性人畜共患病。猴痘病毒（Monkeypox virus，MPXV）属痘病毒科，正痘病毒属，与其同属的还有天花病、痘苗病毒和牛痘病毒等。血清学研究表明历史天花疫苗（MVA-BN疫苗）诱导低水平的猴痘病毒中和抗体，不能为高危人群提供完全的保护。而目前还尚无针对MPXV感染的特异性疫苗或药物。因此，开发一种能够有助于预防猴痘病毒和其他正痘病毒感染的抗体非常重要。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种抗痘病毒的抗体或其抗原结合片段，对B6R蛋白具有很好的亲和力，对猴痘病毒和痘苗病毒都具有很好的中和活性。
本发明还提供一种重组蛋白。
本发明还提供与上述抗体或其抗原结合片段、或重组蛋白相关的生物材料。
本发明还提供一种偶联物。
本发明还提供上述抗体或其抗原结合片段、上述重组蛋白、上述生物材料或上述偶联物的应用。
本发明还提供一种包含上述抗体或其抗原结合片段、上述重组蛋白、上述生物材料或上述偶联物的产品。
本发明还提供上述抗体或其抗原结合片段、或重组蛋白的制备方法。
根据本发明的第一方面实施例的抗痘病毒的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段选自a1）至a8）中的任一种；且具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区均分别含有互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
a1）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:1中第26~33位、第51~58位、第97~105位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:2中第27~32位、第51~53位、第89~97位所示；
a2）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:5中第26~33位、第51~58位、第97~103位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:6中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；
a3）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:9中第26~33位、第51~58位、第97~115位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:10中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；
a4）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:13中第26~33位、第51~58位、第97~115位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:14中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；
a5）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:17中第26~33位、第51~58位、第97~104位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:18中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；
a6）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:21中第26~33位、第51~57位、第97~105位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:22中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；
a7）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:25中第26~33位、第51~58位、第97~110位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:26中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；
a8）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:29中第26~33位、第51~58位、第97~105位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:30中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示。
根据本发明实施例的抗体或其抗原结合片段，至少具有如下有益效果：
实施例的抗体B010、B019、B026、B041、B050、B083、B089、B161对B6R蛋白均具有很好的亲和力，且对反式互补缺陷猴痘病毒以及痘苗病毒（VACV）等正痘病毒具有很好的中和活性，与其他MPXV表面蛋白特异性抗体混合使用时可更有效中和MPXV和VACV，有望在未来的MPXV治疗中替代牛痘免疫球蛋白（VIG）。实施例的抗体或其抗原结合片段不仅可用于B6R抗原蛋白、MPXV和VACV的检测，还可用于天花病毒、牛痘病毒、猴痘病毒以及痘苗病毒等正痘病毒感染治疗药物的开发。
根据本发明的一些实施例，a1）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a111）如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列；或
a112）将SEQ ID No:1经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a113）与SEQ ID No:1具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a1）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a121）如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列；或
a122）将SEQ ID No:2经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:2所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a123）与SEQ ID No:2具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:2所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a2）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a211）如SEQ ID No:5所示的氨基酸序列；或
a212）将SEQ ID No:5经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a213）与SEQ ID No:5具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a2）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a221）如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列；或
a222）将SEQ ID No:6经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:6所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a223）与SEQ ID No:6具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:6所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a3）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a311）如SEQ ID No:9所示的氨基酸序列；或
a312）将SEQ ID No:9经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:9所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a313）与SEQ ID No:9具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:9所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a3）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a321）如SEQ ID No:10所示的氨基酸序列；或
a322）将SEQ ID No:10经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:10所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a323）与SEQ ID No:10具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:10所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a4）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a411）如SEQ ID No:13所示的氨基酸序列；或
a412）将SEQ ID No:13经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:13所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a413）与SEQ ID No:13具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:13所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a4）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a421）如SEQ ID No:14所示的氨基酸序列；或
a422）将SEQ ID No:14经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:14所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a423）与SEQ ID No:14具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:14所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a5）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a511）如SEQ ID No:17所示的氨基酸序列；或
a512）将SEQ ID No:17经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:17所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a513）与SEQ ID No:17具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:17所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a5）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a521）如SEQ ID No:18所示的氨基酸序列；或
a522）将SEQ ID No:18经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:18所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a523）与SEQ ID No:18具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:18所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a6）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a611）如SEQ ID No:21所示的氨基酸序列；或
a612）将SEQ ID No:21经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:21所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a613）与SEQ ID No:21具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:21所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a6）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a621）如SEQ ID No:22所示的氨基酸序列；或
a622）将SEQ ID No:22经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:22所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a623）与SEQ ID No:22具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:22所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a7）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a711）如SEQ ID No:25所示的氨基酸序列；或
a712）将SEQ ID No:25经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:25所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a713）与SEQ ID No:25具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:25所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a7）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a721）如SEQ ID No:26所示的氨基酸序列；或
a722）将SEQ ID No:26经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:26所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a723）与SEQ ID No:26具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:26所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a8）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a811）如SEQ ID No:29所示的氨基酸序列；或
a812）将SEQ ID No:29经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:29所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a813）与SEQ ID No:29具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:29所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a8）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a821）如SEQ ID No:30所示的氨基酸序列；或
a822）将SEQ ID No:30经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:30所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a823）与SEQ ID No:30具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:30所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区和轻链恒定区；
所述重链恒定区的氨基酸序列包含：
b11）如SEQ ID No:33所示的氨基酸序列；或
b12）将SEQ ID No:33经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:33所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
b13）与SEQ ID No:33具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:33所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链恒定区的氨基酸序列包含：
b21）如SEQ ID No:34所示的氨基酸序列；或
b22）将SEQ ID No:34经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ ID No:34所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
b23）与SEQ ID No:34具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:34所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
本文中，术语“同源性”指氨基酸序列或核苷酸序列之间的相似性。同源性可以通过计算机软件进行评价。
本文中，所述至少80%同源性可以为至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的同源性。
根据本发明的一些实施例，所述抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双体、融合抗体和完整抗体中的任一种。
根据本发明的第二方面实施例的一种重组蛋白，包含标签以及上述抗体或其抗原结合片段。所述标签可以连接在所述抗体或其抗原结合片段的N端或/和C端。所述标签可以为利于所述抗体或其抗原结合片段的溶解和/或纯化的标签。
根据本发明的一些实施例，所述标签包括His标签、GGGS序列、FLAG标签、strep标签、nus标签、麦芽糖结合蛋白、GST标签中的至少一种。本发明的重组蛋白可以包含一个或多个标签；多个标签可以包含多个相同标签的组合，也可以为多个不同标签的组合。
根据本发明的第三方面实施例的与上述抗体或其抗原结合片段、或上述重组蛋白相关的生物材料，所述生物材料为c1）至c5）中的任一种；
c1）编码上述抗体或其抗原结合片段、或上述重组蛋白的核酸分子；
c2）含有c1）中所述核酸分子的表达盒；
c3）含有c1）中所述核酸分子或c2）中所述表达盒的重组载体；
c4）含有c1）中所述核酸分子或c2）中所述表达盒或c3）中所述重组载体的重组微生物；
c5）含有c1）中所述核酸分子或c2）中所述表达盒或c3）中所述重组载体的转基因细胞系。
根据本发明的一些实施例，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
根据本发明的一些实施例，所述核酸分子为编码上述抗体或其抗原结合片段、或上述重组蛋白的DNA分子。
根据本发明的一些实施例，所述DNA分子为d1）至d10）中的任一种，且包含编码所述重链可变区的核苷酸序列和编码所述轻链可变区的核苷酸序列；
d1）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示；
d2）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:7所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:8所示；
d3）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:11所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:12所示；
d4）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:15所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:16所示；
d5）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:19所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:20所示；
d6）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:23所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:24所示；
d7）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:27所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:28所示；
d8）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:31所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:32所示；
d9）与d1）至d8）中任一限定的核苷酸序列具有80%、85%或90%以上的同源性，且编码所述抗体或其抗原结合片段的DNA分子；
d10）在严格条件下与d1）至d9）中任一限定的核苷酸序列杂交，且编码所述抗体或其抗原结合片段的DNA分子。
本领域技术人员可以采用已知的方法（如定向进化和点突变）对核苷酸序列进行突变，那些经过人工修饰的，具有与本发明所述抗体或其抗原结合片段具有一定同源性的核苷酸序列，只要编码所述抗体或其抗原结合片段或变体并且具有所述抗体或其抗原结合片段相同的功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的核苷酸序列。
根据本发明的一些实施例，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合片段的DNA，该DNA不但可以包括启动编码所述抗体或其抗原结合片段的DNA分子转录的启动子，还可包括终止编码所述抗体或其抗原结合片段的DNA分子转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括复制起始位点、转录起始序列、增强子序列、选择元件或报告基因。
根据本发明的一些实施例，所述重组载体可为质粒、噬菌体、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒。所述重组载体用于实现外源目的基因在受体细胞的复制、整合、扩增和/或表达；其可以为克隆载体，也可以为表达载体。例如：c3）中所述重组载体具体可以为将所述核酸分子插入CMV载体得到的重组质粒。
根据本发明的一些实施例，所述重组微生物可为细菌（如大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等）或真菌（如酵母或曲霉菌等）。例如：c4）中所述重组微生物具体可以为大肠杆菌DN5α。
根据本发明的一些实施例，所述转基因细胞系可为昆虫细胞（如S2果蝇细胞或Sf9细胞等）、动物细胞系（如293T细胞、293F细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞或HEK293细胞等）或植物细胞（如拟南芥或烟草等）。所述转基因细胞系均可为非繁殖材料。
根据本发明的第四方面实施例的一种偶联物，包含：上述抗体或其抗原结合片段，或上述重组蛋白；
以及偶联部分，所述偶联部分包含可检测标记物、药物、毒素、放射性核素、酶中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述可检测标记物选自放射性同位素、荧光物质、化学发光物质、有色物质中的至少一种。
根据本发明的第五方面实施例的上述抗体或其抗原结合片段、上述重组蛋白、上述生物材料或上述偶联物在e1）至e5）任一项中的应用；
e1）制备预防和/或治疗痘病毒的药物；
e2）非诊断治疗目的地检测痘病毒；
e3）制备检测痘病毒的试剂盒；
e4）非诊断治疗目的地检测猴痘病毒B6R蛋白；
e5）制备检测猴痘病毒B6R蛋白的试剂盒；
所述痘病毒包括猴痘病毒、痘苗病毒中的至少一种。
根据本发明的第六方面实施例的产品，包括f1）至f4）中的至少一种；
f1）上述抗体或其抗原结合片段；
f2）上述重组蛋白；
f3）上述生物材料；
f4）上述偶联物；
所述产品选自药物、试剂、检测板、芯片、试纸和试剂盒的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述产品具有g1）至g3）中至少一种功能；
g1）预防和/或治疗痘病毒感染相关疾病；
g2）检测痘病毒的存在或其含量；
所述痘病毒包括猴痘病毒、痘苗病毒中的至少一种；
g3）检测猴痘病毒B6R蛋白的存在或其含量。
根据本发明的一些实施例，所述产品为药物；所述产品还包括药学上可以接受的辅料。其所用剂量对接受者无毒。
根据本发明的一些实施例，所述辅料包括溶剂、分散剂、稀释剂、填充剂、润湿剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、助悬剂、乳化剂、赋形剂、稳定剂、缓冲剂、等张剂、调味剂、载体中的至少一种。所述辅料用于促进所述抗体或其抗原结合片段的吸收，以发挥预防和/或治疗作用。
根据本发明的第七方面实施例的抗体或其抗原结合片段的制备方法，包括以下步骤：
通过培养上述重组微生物或转基因细胞系得到。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
图1为重组B6R蛋白在还原胶（Reduced）及非还原胶（Non-Reduced）中的电泳结果；其中，M为Marker，样本1为B6R-His；
图2为重组B6R-His蛋白以及生物素标记后B6R-His-Biotin蛋白的活性检测结果；
图3为三轮筛选得到的噬菌体子文库的Pool ELISA检测结果；其中，A图为实验板结果，B图为阴性包被板结果；
图4为筛选得到的猴痘特异性抗体的序列分析结果；其中，A图为重链可变区胚系基因占比的统计结果，B图为轻链可变区胚系基因占比的统计结果，C图为重链CDR3长度和轻链CDR3长度的统计结果；
图5为40株抗体对B6R抗原的结合活性的检测结果；
图6为35株抗体的中和活性的检测结果；
图7为不同抗猴痘病毒单克隆抗体在不同浓度时与B6R蛋白的结合与解离曲线；
图8为不同抗猴痘病毒单克隆抗体的反式互补缺陷猴痘病毒中和试验结果；
图9为B026-HRP与B6R蛋白的结合情况；
图10猴痘病毒B6R抗原蛋白特异性检测方法建立及检测范围测定结果；其中，A图为实验板结果，B图为阴性包被板结果。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
在本发明的描述中，“抗体”是指能够与特定抗原结合的任何免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、二价抗体、一价抗体、多特异性抗体或双特异性抗体。完整抗体通常由两对多肽链组成，每对包含一条轻(L)链和一条重(H)链，轻链可以分为Kappa (κ)型或Lambda (λ)型，而根据重链的类型分别为μ、δ、γ、α和ε可以将抗体定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。重链包含重链恒定区(CH)和重链可变区(VH)。不同类型的重链的CH含有3到4个不等的结构域（CH1、CH2、CH3和CH4）。轻链包含轻链恒定区（CL）和轻链可变区（VL）。VH和VL中各自包含具有高度可变性的互补决定区（CDR）以及散布其间的构架区（FR），各VH和VL由氨基末端至羧基末端包含依次的FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
在本发明的描述中，“抗原结合片段”是指抗体中保持有特异性结合抗原能力的一个或多个片段，具体而言，包括但不限于Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、Fv片段、sc-Fv和双体中的至少一种。
在本发明的描述中，“Fab片段”包含一条轻链以及一条重链的CH1和可变区。Fab分子的重链不能与另一个重链分子形成二硫键。
在本发明的描述中，“Fab’片段”含有一条轻链以及一条重链的部分或片段，所述部分或片段含有VH结构域和CH1结构域以及在CH1和CH2结构域之间的区域。
在本发明的描述中，“F(ab’)2片段”含有两条轻链和两条重链，所述重链含有在CH1和CH2结构域之间的恒定区的一部分，使得在两条重链之间形成链间二硫键。F(ab’)2片段因而由两个Fab’片段组成，而两个Fab’片段通过两条重链之间的二硫键连接在一起。
在本发明的描述中，“Fv片段”包含来自重链和轻链的可变区，但是缺少恒定区。
在本发明的描述中，“单链Fv”或“scFv”，是指包含抗体的VH结构域和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域以单一多肽链形式存在。通常，Fv多肽还包含VH结构域和VL结构域之间的多肽接头，所述接头使scFv能够形成期望的结构以进行抗原结合。
在本发明的描述中，“双体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，所述片段在同一多肽链中包含重链可变结构域（VH）和与之连接的轻链可变结构域（VL）（VH-VL或VL-VH）。通过使用短得不能让同一链上的两个结构域之间发生配对的接头，各结构域被迫与另一条链的互补结构域发生配对，从而产生两个抗原结合位点。
若无特殊说明，本申请中“室温”表示(25±5)℃。
若无特殊说明，本申请中“Amp”指氨苄青霉素（Ampicillin）；“Tet”指四环素（Tetracycline）；“Kana”指卡那霉素（Kanamycin）。
若无特殊说明，本申请中“氨基酸”是指构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使他的分子具有生化活性。例如，本发明所用“氨基酸”包括下列20种天然氨基酸：丙氨酸（Ala或A）、甘氨酸（Gly或G）、异亮氨酸（Ile或I）、天冬酰胺（Asn或N）、精氨酸（Arg或R）、赖氨酸（Lys或K）、赖氨酸（Lys或K）、半胱氨酸（Cys或C）、天冬氨酸（Asp或D）、谷氨酸（Glu或E）、谷胺酰胺（Gln或Q）、组氨酸（His或H）、亮氨酸（Leu或L）、甲硫氨酸（Met或M）、苯丙氨酸（Phe或F）、脯氨酸（Pro或P）、丝氨酸（Ser或S）、苏氨酸（Thr或T）、色氨酸（Trp或W）、缬氨酸（Val或V）和酪氨酸（Tyr或Y）。
若无特殊说明，本申请中氨基酸序列均是从N端到C端的顺序；核苷酸序列均是从5’端到3’端的顺序。
下述实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下述实施例中，部分实验材料和试剂说明如下：
反式互补缺陷猴痘病毒系统：由深圳湾实验室刘建英老师馈赠，参考专利为《反式互补缺陷猴痘病毒及其应用》（申请号：2023113941163）。
猴痘病毒G9R+A1L基因稳定表达的Vero E6回补细胞系：由深圳湾实验室刘建英老师馈赠，参考专利为《反式互补缺陷猴痘病毒及其应用》（申请号：2023113941163）。
重组猴痘病毒表面蛋白B6R：参考文献（Virology. 2005 May;79(10):6260-71）自制得到，B6R蛋白氨基酸序列为MKTISVVTLLCVLPAVVYSTCTVPTMNNAKLTSTETSFNDKQKVTFTCDSGYHSLDPNAVCETDKWKYENPCKKMCTVSDYVSELYDKPLYEVNSTMTLSCNGETKYFRCEEKNGNTSWNDTVTCPNAECQPLQLEHGSCQPVKEKYSFGEYMTINCDVGYEVIGVSYISCTANSWNVIPSCQQKCDIPSLSNGLISGSTFSIGGVIHLSCKSGFTLTGSPSSTCIDGKWNPILPTCVRSNEEFDPVDDGPDDETDLSKLSKDVVQYEQEIESLEATYH。
参考抗体8AH8AL：参考文献（Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Feb 7;103(6):1882-7.）自制得到。
重链和轻链的表达载体CMV：由清华大学张林琦教授实验室馈赠，记载于Nature.2020 Aug; 584(7819):115-119。
阴性无关抗体：Anti-Monkeypox virus/MPXV M1R Antibody，购自普健生物科技有限或公司，货号：SAA0283。
二抗：Goat-Anti-mouse-IgG-Fc-HRP（abcam; ab97265），Goat Anti-Human IgG-Fc-HRP （Jackson, 109-001-008），Mouse-Anti-M13Bacteriophage Antibody（HRP）。
Octet®Ni-NTA Biosensors (SARTORIUS，18-5102)。
PBST缓冲液：含0.1% Tween20的1×PBS。
293T细胞是HEK293细胞中转入SV40T-抗原基因形成的高转衍生细胞系。
293F细胞是一类能够在无血清中高表达蛋白的野生型HEK293细胞系。
实施例1（抗猴痘病毒单克隆抗体的制备）
1、重组猴痘病毒表面蛋白B6R-His的表达。
（1）将处在对数生长期且活率高于90%的293F细胞以1.5×106个/mL的密度接种到新鲜培养基中，置于恒温摇床中，在37℃、5% CO2、150 rpm转速条件下培养一天后，取样计数细胞密度和活率（活率高于90%），调整细胞密度为2×106个/mL，得到293F细胞悬液。
（2）采用无内毒素质粒大提试剂盒（天根，DP117-T）提取得到构建成功的B6R蛋白表达载体，用150 mM NaCl溶液调整B6R-His蛋白表达载体浓度为80 µg/mL，混匀后室温静置约5 min；用150 mM NaCl溶液稀释120 µL Sinofection转染试剂至总体积为0.75 mL，混匀后室温静置约5 min；将稀释后的B6R蛋白表达载体溶液和Sinofection转染试剂等体积混合，室温静置约10 min，得到转染液。
（3）将1.5 mL转染液逐滴加入到200 mL 293F细胞悬液中，滴加的同时轻轻摇动培养瓶，摇匀后放回恒温摇床中继续培养，依次在转染后24 h、72 h、120 h时加入2%（V/V）SMS 293-SUPI 加料液（Sino Biological，M293-SUPI），转染5天后收集细胞培养上清。
（4）对细胞培养上清进行纯化，得到重组B6R-His蛋白；将重组B6R-His蛋白跑蛋白胶。
结果如图1所示。
重组B6R-His蛋白在还原胶及非还原胶中均呈现为30 KD左右的蛋白，与文献中记载一致。
2、重组猴痘病毒表面蛋白B6R-His及其生物素化蛋白B6R-his-Biotin的活性鉴定。
通过检测B6R阳性结合抗体8AH8AL对步骤1得到的重组B6R-His及其生物素化蛋白B6R-his-Biotin的结合活性，以评估重组二者的活性。步骤具体如下：
（1）包被：用PBS将重组B6R-His蛋白和B6R-his-Biotin蛋白分别稀释至浓度为2 μg/mL，得到包被液；按30 µL/孔将包被液加入到96孔ELISA板中，4℃包被过夜。
（2）封闭：弃去96孔ELISA板中的液体，按100 µL/孔将封闭液（含5%（V/V）脱脂牛奶的PBST缓冲液）加入到各孔中，室温封闭2 h。
（3）洗涤：弃去96孔ELISA板中的液体，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。
（4）加样品：将10 μg/mL 8AH8AL抗体溶液进行系列10倍稀释，按100 µL/孔将各样品分别加至各孔中，室温孵育1 h；以其他无关抗体（Anti-Monkeypox virus/MPXV M1RAntibody）处理作为阴性对照，以PBS处理作为空白对照。
（5）洗涤：弃去96孔ELISA板中的液体，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。
（6）加二抗：将Goat-Anti-mouse-IgG-Fc-HRP抗体用稀释液（含1% BSA（w/v）的PBST缓冲液）按1：8000稀释，并按30 µL/孔将稀释后二抗溶液分别加至各孔中，室温孵育1h。
（7）洗涤：弃去96孔ELISA板中的液体，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。
（8）显色、终止和读数：向每孔加50 µL显色液，室温避光孵育15 min后，向每孔加25 µL终止液，用酶标仪读取450 nm，并分析8AH8AL抗体对重组B6R蛋白的结合活性。
以8AH8AL抗体浓度以及对应的OD450做回归曲线，求得8AH8AL抗体对重组B6R蛋白的EC50值。
结果如图2所示。
经计算得到8AH8AL抗体对重组B6R-His蛋白和B6R-his-Biotin蛋白有亲和活性，其EC50值均为0.0039 μg/mL。这表明重组蛋白可用于后续抗体筛选。
3、筛选猴痘特异性抗体。
使用健康人PBMC构建的噬菌体文库筛选能特异性结合重组B6R蛋白的Fab抗体序列。
（1）重复下示步骤1）~4）三次，以展开三轮筛选。
1）第一轮抗体筛选。
将重组B6R-His蛋白和B6R-his-Biotin蛋白分别包被免疫管（50 µg/管，包被液为CBS，pH 9.6，2 mL/管），4℃缓慢旋转过夜，同时平行包被50 µg 5V/V%脱脂牛奶作对照。弃去免疫管中的液体，用2mL PBS室温清洗免疫管3次，每次旋转5 min。加入2 mL封闭液（含3%BSA（w/v）的PBST缓冲液）室温旋转封闭2 h。弃去封闭液，用1 mL PBS室温清洗免疫管3次，每次旋转5min。向清洗后的免疫管中加入2 mL PBS和噬菌体文库，室温旋转孵育1 h。弃去免疫管内液体，用2 mL PBST缓冲液室温清洗免疫管20次，每次旋转5 min。向清洗后的免疫管中加入1mL 0.25 mg/mL Trypsin 溶液，室温旋转洗脱30 min后，加入10 µL 10% AEBSF终止洗脱，将免疫管中的溶液转移至新的1.5 mL离心管中，即得第一轮筛选噬菌体洗脱液。
2）第一轮筛选噬菌体洗脱液的效价检测。
将XL1-Blue菌株接种到5 mL含有10 µg/mL Tet的2×YT培养基中，37℃过夜培养后，取250 µL菌液转接到5 mL含有10 µg/mL Tet的2×YT培养基中，37℃、250rpm条件下培养至OD600为0.5~0.55，得到XL1-Blue菌液。将第一轮筛选噬菌体洗脱液连续进行12个梯度的10倍稀释后，向10 µL稀释后的第一轮筛选噬菌体洗脱液中分别加入90 µL XL1-Blue菌液，混匀，37℃孵育30 min后，取5 µL菌液滴加到2×YT固体培养基（Amp）中，37℃倒置过夜培养，统计2×YT固体培养基上可以明显区分单菌落的稀释度对应的单菌落数量，并计算噬菌体文库效价。
噬菌体文库效价（T，pfu/mL）为每毫升噬菌体溶液中噬菌粒的数量，其计算公式如下：
T=N×D×400；
其中，D为稀释倍数，N为相应稀释倍数的2×YT固体培养基上的单菌落个数。
3）第一轮噬菌体洗脱液的扩增。
将XL1-Blue菌株接种到5 mL含有10 µg/mL Tet的2×YT培养基中，37℃过夜培养后，取250 µL菌液转接到5 mL含有10 µg/mL Tet的2×YT培养基中，37℃、250rpm条件下培养至OD600为0.5~0.55，得到XL1-Blue菌液。向XL1-Blue菌液中加入500 µL第一轮筛选噬菌体洗脱液，37℃、220 rpm条件下继续培养30 min后，将全部菌液均匀涂布到2%琼脂糖平板（含有100 µg/mL Amp和2%（W/V）葡萄糖）上，37℃过夜培养。向2%琼脂糖平板表面加入6 mL2×YT液体培养基（含10 µg/mL Tet），刮下并收集菌落，并检测OD600值，加入终浓度为20%（V/V）的甘油，即得第一轮细菌文库。
将第一轮细菌文库转接到100 mL 2×YT液体培养基中（含10 µg/mL Tet和100 µg/mL Amp），使初始OD600约为0.1，37℃、250 rpm条件下培养至OD600为0.5~0.55，按公式（I）加入辅助噬菌体M13K07，以使细菌个数：噬菌体数=1：20，于37℃、220 rpm条件下继续培养30 min；再加入Kana（终浓度为50 µg/mL）和IPTG（终浓度为0.2 µM），于37℃、250 rpm条件下过夜培养。
（公式I）；
其中，v为加入辅助噬菌体的体积，Thelper-phage为辅助噬菌体效价，OD600为菌液的OD600值。
4）第一轮噬菌体纯化。
将步骤3）过夜培养得到的菌液4000 rpm、4℃离心10 min，取上清；向上清中加入1/4体积的4℃预冷的20% PEG/2.5 M NaCl溶液，充分混匀后冰上放置30 min后，4000 rpm、4℃离心20 min，弃上清，并在纸上倒置2 min；用1 mL PBS重悬沉淀，12000 rpm、4℃离心20min，取上清；向上清中加入1/4体积的4℃预冷的20% PEG/2.5 M NaCl溶液，充分混匀后冰上放置10 min后，12000 rpm、4℃离心10 min，弃上清；用1 mL PBS重悬沉淀，12000 rpm、4℃离心2 min，取上清，即得第一轮筛选的噬菌体子文库，用于下一轮筛选。
5）共进行三轮富集筛选每轮获得的噬菌体子文库一部分用于下一轮筛选，一部分冻存用于后续实验。
三轮筛选富集结果如表1所示。
表1
B6R-his-Bio筛选组在第三轮出现明显富集。
（2）Pool ELISA检测。
用PBS将重组B6R-His蛋白稀释至2 μg/mL，得到包被液，按30 µL/孔将包被液加入96孔ELISA板中，4℃包被过夜，作为实验板；同时以PBS进行包被，作为阴性包被板。弃去包被液，按100 µL/孔将封闭液（含5%（V/V）脱脂牛奶的PBST缓冲液）加入到各孔中，室温封闭2h。弃去封闭液，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。将步骤（1）中三轮筛选得到的噬菌体子文库（Phage pool）进行系列10倍稀释，并加其他无关抗原噬菌体库（阴性对照）及辅助噬菌体作为对照，室温孵育1 h。弃去样品，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。将二抗（Mouse-Anti-M13Bacteriophage Antibody（HRP）抗体）用稀释液（含1% BSA（w/v）的PBST缓冲液）按1：8000稀释，并按30 µL/孔将稀释后二抗溶液分别加至各孔中，室温孵育1 h。弃去稀释后二抗溶液，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。向每孔加50 µL显色液，室温避光孵育15min后，向每孔加25 µL终止液，用酶标仪读取OD450。
结果如图3所示。
在Phage水平上，Pool 1012-37 (2nd)、1012-38 (2nd)、1014-35 (3rd)、1014-36(3rd)、1014-37 (3rd)、1014-38 (3rd)与重组B6R-His蛋白或B6R-his-Biotin蛋白有富集。在这六个筛选Pool中挑选单克隆进行下一步筛选。
（3）单克隆ELISA检测。
1）将XL1-Blue菌株接种到5 mL含有10 µg/mL Tet的2×YT培养基中，37℃过夜培养后，取250 µL菌液转接到5 mL含有10 µg/mL Tet的2×YT培养基中，37℃、250rpm条件下培养至OD600为0.5~0.55，得到XL1-Blue菌液。将筛选编号1012-37、1012-38、1014-35、1014-36、1014-37、1014-38（见表1）对应的噬菌体子文库连续进行12个梯度的10倍稀释后，向10 µL稀释后的噬菌体洗脱液中分别加入90 µL XL1-Blue菌液，混匀，37℃、220 rpm培养30 min后，将菌液均匀涂布到含有100 µg/mL Amp的固体培养基平板上，37℃倒置过夜培养。随机挑取平板上的单克隆菌落于无菌96孔细胞培养板中，每孔加入200 µL 2×YT培养基（含有100 µg/mL Amp和10 µg/mL Tet），于37℃、220 rpm条件下过夜培养；取2 µL菌液转接至200 µL 2×YT液体培养基中，37℃静置培养3~5 h；按公式（I）加入辅助噬菌体M13K07，以使细菌个数：噬菌体数=1：20，于37℃孵育30 min；再加入Kana（终浓度为50 µg/mL）和IPTG（终浓度为0.2 µM），于30℃静置过夜培养。4000 rpm离心10 min，取上清。
2）用PBS将重组B6R蛋白稀释至2 μg/mL，得到包被液，按30 µL/孔将包被液加入96孔ELISA板中，4℃包被过夜，同时以PBS进行包被，作为阴性包被板。弃去包被液，按100 µL/孔将封闭液（含5%（V/V）脱脂牛奶的PBST缓冲液）加入到各孔中，室温封闭1 h。弃去封闭液，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。向每孔加入30 µL 3% BSA以及80 µL步骤1）得到的上清，室温孵育1 h；以8AH8AL抗体（5 µg/mL）作为阳性对照，以无关抗体（Anti-Monkeypoxvirus/MPXV M1R Antibody）作为阴性对照。弃去样品，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。将Mouse-Anti-M13Bacteriophage Antibody（HRP）抗体用稀释液（含1% BSA（w/v）的PBST缓冲液）按1：8000稀释，并按30 µL/孔将稀释后二抗溶液分别加至各实验孔中，室温孵育1 h；阳性对照及阴性对照的每孔中加入30 µL按1:8000稀释的Anti-mouse-Fc-HRP。弃去稀释后二抗溶液，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。向每孔加50 µL显色液，室温避光孵育15min后，向每孔加25 µL终止液，用酶标仪读取OD450。
（4）阳性克隆测序。
根据单克隆ELISA检测数据选定OD450值大于阴性对照OD450值2.1倍的克隆为阳性单克隆。将阳性单克隆接种至2×YT培养基（含100 µg/mL Amp和10µg/mL Tet）中，37℃、250 rpm培养至OD600为0.8~1.0，取适量菌液送测序。
使用GENtle软件对测序结果进行序列比对分析，并使用GENtle软件将抗体序列翻译成氨基酸序列。
筛选结果如表2所示。抗体序列分析结果如图4所示。
表2
注：阳性率=B6R-his阳性克隆/挑克隆数×100%。unique是指送测序后获得的抗体可变区具有独特非重复序列的克隆。
初筛挑选了538个克隆，得到了与抗原B6R-his结合的阳性克隆274个，送测了OD值在1.3以上阳性克隆205个，经序列分析后，最终得到53个unique。
获得53对抗体序列，重链可变区分别来自12个不同的胚系基因，IGHV3-23占比最大为28%；互补决定区CDR3 loop的长度分析显示，重链可变区有4aa~19aa。轻链均为κ链，以IGKV1-12以及IGLV1-39为主；互补决定区CDR3 loop的长度分析显示，轻链可变区有8aa~10aa。
4、人源IgG抗体表达载体构建。
可以通过如下方法获得人源IgG抗体表达载体，也可以通过人工合成得到人源IgG抗体表达载体。
（1）抗体序列扩增。
根据步骤3的测序结果设计特异性引物，以阳性单克隆Fab抗体的表达质粒为模板，进行PCR扩增。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，并采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根，DP209）进行胶回收。
PCR反应体系（总体积：20 µL）如下：
PrimerSTAR Max Premix (2×)10 µL；
5′引物（10 μM）0.6 µL；
3′引物（10 μM）0.6µL；
模板（0.2 µg/mL）5 µL；
灭菌蒸馏水3.8 µL。
PCR反应条件为：预变性98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃ 5 s，72℃ 10 s，35个循环；终延伸72℃ 5 min。
（2）将重链和轻链的巨细胞病毒表达载体CMV分别用限制性内切酶进行双酶切，获得酶切产物。将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，并采用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根，DP209）进行胶回收。
重链表达载体的双酶切反应体系（总体积：30 µL）为：CMV-H (1 µg) 1 µL；10×NEBuffer 3 µL；Age I-HF 1 µL；Sal I-HF 1 µL；去离子水 24 µL。
轻链(κ)表达载体的双酶切反应体系（总体积：30 µL）为：CMV-κ (1 µg) 1 µL；10×NE Buffer 3 µL；Age I-HF 1 µL；BsiW I-HF 1 µL；去离子水 24 µL。
轻链(λ)表达载体的双酶切反应体系（总体积：30 µL）为：CMV-λ (1 µg) 1 µL；10×NE Buffer 3 µL；Age I-HF 1 µL；Xho I-HF 1 µL；去离子水24 µL。
反应条件：37℃反应20 min。
（3）将步骤（1）和（2）胶回收得到的PCR产物和酶切产物进行同源重组，获得连接产物。
CMV-H连接产物的反应体系（总体积：10 µL）为：同源重组试剂(2×) (vazyme，C115) 5 µL；CMV-H酶切产物（约50 ng） 1 µL；重链基因片段（约10 ng） 1 µL；无核酸酶水3µL。
CMV-κ连接产物的反应体系（总体积：10 µL）为：同源重组试剂(2×) 5 µL；CMV-κ酶切产物（约50 ng） 1 µL；κ链基因片段（约10 ng） 1 µL；无核酸酶水 3 µL。
CMV-λ连接产物的反应体系（总体积：10 µL）为：同源重组试剂(2×) 5 µL；CMV-λ酶切产物（约50 ng） 1 µL；λ链基因片段（约10 ng） 1 µL；无核酸酶水 3 µL。
反应条件：50℃反应20 min。
（4）将步骤（3）获得的CMV-H连接产物、CMV-κ连接产物、CMV-λ连接产物分别转化感受态细胞DH5α；并通过抗性筛选和测序鉴定转化成功的阳性克隆。
实施例2（抗猴痘病毒单克隆抗体的制备）
1、40株抗猴痘病毒单克隆抗体的表达。
将成功配对的抗体重链和轻链基因表达载体瞬时转染293T细胞。具体如下：
按5×105个/孔将293T细胞接种到12孔板中，培养至细胞汇合程度70%~80%。将成功配对的1 µg抗体重链表达载体和1 µg轻链基因表达载体溶解于60 µL Opti-MEM培养基中，将4 µL Lipofectamine®2000 Reagent用60 µL Opti-MEM培养基稀释后，等体积混合，得到混合液，室温孵育5 min。将120 µL混合液轻轻加入293T细胞中，5%CO2、37℃培养48 h后，12000 rpm离心2 min，收集细胞培养上清和细胞沉淀。取1 mL预冷的PBS洗涤细胞沉淀2次后，向细胞沉淀中加入100 µL细胞裂解液（Promega，E1531），冰浴10 min，12000 rpm离心5 min，收获细胞裂解上清。
2、对40株抗猴痘病毒单克隆抗体进行抗体结合活性初筛检测。具体如下：
用PBS将重组B6R-His蛋白稀释至2 μg/mL，得到包被液，按30 µL/孔将包被液加入96孔ELISA板中，4℃包被过夜，作为实验板；同时以PBS进行包被，作为阴性包被板。弃去包被液，按100 µL/孔将封闭液（含5%（V/V）脱脂牛奶的PBST缓冲液）加入到各孔中，室温封闭2h。弃去封闭液，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。检测细胞裂解上清中蛋白浓度，将细胞裂解上清分别进行8个梯度的系列10倍稀释，室温孵育1 h，以8AH8AL抗体处理作为阳性对照，以无关抗体（Anti-Monkeypox virus/MPXV M1R Antibody）处理作为阴性对照，以PBS处理作为空白对照。弃去样品，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。将二抗（Goat Anti-HumanIgG-Fc-HRP抗体）用稀释液（含1% BSA（w/v）的PBST缓冲液）按1：8000稀释，并按30 µL/孔将稀释后二抗溶液分别加至样品中，阳性对照、阴性对照的每孔中加入30 µL按1:8000稀释的Anti-mouse-Fc-HRP，室温孵育50 min。弃去稀释后二抗溶液，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。向每孔加50 µL显色液，室温避光孵育15 min后，向每孔加25 µL终止液，用酶标仪读取OD450，以样本OD450值大于阴性对照OD450值的2.1倍作为阳性判定。
结果如图5所示。EC50统计结果如表3所示。
表3
在筛选得到的54株抗体中，构建表达了40株抗体，其中35株抗体对B6R蛋白具有结合活性。
3、对经结合活性初筛得到的35株抗体进行中和活性初筛检测。具体如下：
在24孔板中铺设猴痘病毒G9R+A1L基因稳定表达的Vero E6回补细胞。检测细胞裂解上清浓度，将其稀释至10 μg/mL后，与等体积含反式互补缺陷猴痘病毒的DMEM培养基（浓度为200 PUF/mL）混合，37℃孵育1 h，得到混合物。取100 μL混合物加入铺有单层G9R+A1L基因稳定表达的Vero E6回补细胞板中，于5% CO2、37℃条件下恒温培养1 h；弃去板内液体，添加1 mL琼脂覆盖物（1.6wt%琼脂：（2×DMEM+胰酶混合物）=1：1（V/V）），置于37℃培养箱培养5天。向每孔中加入2 mL 4%多聚甲醛固定液，过夜固定；弃去多聚甲醛固定液，用水轻轻冲洗，将琼脂覆盖物挑出至含有有效氯的消毒液中，以杀灭琼脂内病毒，再用水轻轻冲洗掉板中残余4%多聚甲醛固定液，甩干；加入结晶紫染色5min，用自来水冲洗干净后，晾干后在LED灯箱上拍照，并计数空斑，计算抑制率（抑制率（%）=1-（实验组平均PFU数/病毒对照孔平均PFU数）×100%）。抗体在10 μg/mL时抑制率大于60%，则认为该抗体具有中和活性。
结果如图6所示。
35株抗体中有27株具有中和活性。
结合抗体结合活性结果，我们选择结合活性及中和活性均较好的8株抗体（B010、B019、B026、B041、B050、B083、B089、B161）进行后续实验。
4、抗猴痘病毒单克隆抗体制备。步骤如下：
（1）将处在对数生长期且活率高于90%的293F细胞以1.5×106个/mL的密度接种到新鲜培养基中，置于恒温摇床中，在37℃、5% CO2、150 rpm转速条件下培养一天后，取样计数细胞密度和活率（活率高于90%），调整细胞密度为2×106个/mL，得到293F细胞悬液。
（2）采用无内毒素质粒大提试剂盒（天根，DP117-T）提取得到抗猴痘病毒单克隆抗体表达载体（重链和轻链摩尔比1：1），用150 mM NaCl溶液调整表达载体浓度为80 µg/mL，混匀后室温静置约5 min；用150 mM NaCl溶液稀释120 µL Sinofection转染试剂至总体积为0.75 mL，混匀后室温静置约5 min；将稀释后的含B026表达载体的溶液和稀释后Sinofection转染试剂等体积混合，室温静置约10 min，得到转染液。
（3）将1.5 mL转染液逐滴加入到293F细胞悬液中，滴加的同时轻轻摇动培养瓶，摇匀后放回恒温摇床中继续培养，依次在转染后24 h、72 h、120 h时加入2%（V/V） SMS 293-SUPI 加料液（Sino Biological，M293-SUPI），转染5天后收集细胞培养上清。
（4）将细胞培养上清经0.45 µM滤膜过滤后，与rProtein G Beads (Solarbio，R8300)混合，在摇床上缓慢摇动孵育2 h。将适量rProtein G Beads装入层析柱中，用5倍柱体积的结合缓冲液（0.15M NaCl，20 mM Na2HPO4，pH7.0）进行平衡后，将孵育好的细胞培养上清加到平衡后的rProtein G Beads中，收集流出液；将流出液重新加到层析柱中，收集二次流出液。用10倍柱体积的洗杂缓冲液（0.15M NaCl，20 mM Na2HPO4，pH7.0）进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白。使用10倍柱体积的洗脱缓冲液（0.1 M甘氨酸，pH 3.0），收集洗脱液，即得目的蛋白组分。采用BCA法对纯化抗体进行蛋白定量，并采用SDS-PAGE对纯化抗体进行电泳检测。
经检测抗体在细胞培养上清中大量表达，亲和层析后的蛋白纯度较高，提示该目标抗体可用于体外活性分析。抗体解链后的重链大小约55 KD，轻链大小约为25 KD。
经测序，抗体B026、B010、B019、B041、B050、B083、B089、B161的序列信息如下。
抗体B026：VH的氨基酸序列为EVQLLESGGGVVQPGNSLRLSCAASGFTFSSYNMNWVRQAPGKGLEWVSSISSRSSYIYYADSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLRSEDTAVYFCVRRNGAFDIWGQGTMVTVSS（SEQID No:1）；其中，VH CDR1为GFTFSSYN（SEQ ID No:1中第26~33位）、VH CDR2为ISSRSSYI（SEQID No:1中第51~58位）；VH CDR3为VRRNGAFDI（SEQ ID No:1中第97~105位）。VL的氨基酸序列为DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSITTYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYGIPRTFGQGTKVEIK（SEQ ID No:2）；其中，VL CDR1为QSITTY（SEQ IDNo:2中第27~32位）；VL CDR2为AAS（SEQ ID No:2中第51~53位）；VL CDR3为QQSYGIPRT（SEQID No:2中第89~97位）。编码VH的核苷酸序列为GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAATTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATAACATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTAGTCGTAGTAGTTACATATACTACGCAGACTCAGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACCCTGTATCTTCAAATGAGCAGTCTGAGATCTGAGGACACGGCTGTGTATTTCTGTGTGAGGCGGAATGGTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACCATGGTCACCGTCTCATCA（SEQ ID No:3）。编码VL的核苷酸序列为GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTACCACCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGTAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACGGTATCCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA（SEQ ID No:4）。
抗体B010：VH的氨基酸序列为QVQLLDSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAQGWFDYWGQGTTVTVSS（SEQID No:5）；其中，VH CDR1为GFTFSSYA（SEQ ID No:5中第26~33位）、VH CDR2为ISYDGSNK（SEQID No:5中第51~58位）；VH CDR3为AQGWFDY（SEQ ID No:5中第97~103位）。VL的氨基酸序列为NIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSIGPWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYHCQQYKSYPYSFGQGTKVDIK（SEQ ID No:6）；其中，VL CDR1为QSIGPW（SEQ IDNo:6中第27~32位）；VL CDR2为KAS（SEQ ID No:6中第50~52位）；VL CDR3为QQYKSYPYS（SEQID No:6中第89~97位）。编码VH的核苷酸序列为CAGGTGCAGCTGTTGGACTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCCCAAGGGTGGTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCACGGTCACCGTCTCATCA（SEQ ID No:7）。编码VL的核苷酸序列为AACATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTGGTCCCTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCGTCTAGTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAGGATTTTGCAACTTATCACTGCCAACAGTATAAAAGTTACCCGTACAGTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGACATCAAA（SEQ ID No:8）。
抗体B019：VH的氨基酸序列为QVQLLESGGTLVQPGGSLRLSCAASGFSFRTHDMNWVRQAPGKGLEWVSHISSTGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRADDTAVYYCARDRFTIFGVGPPFYYMDVWGQGTLVTVSS（SEQ ID No:9）；其中，VH CDR1为GFSFRTHD（SEQ ID No:9中第26~33位）、VH CDR2为ISSTGSTI（SEQ ID No:9中第51~58位）；VH CDR3为ARDRFTIFGVGPPFYYMDV（SEQ ID No:9中第97~115位）。VL的氨基酸序列为DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPRTFGQGTKVEIK（SEQ ID No:10）；其中，VL CDR1为QGISSY（SEQ ID No:10中第27~32位）；VL CDR2为AAS（SEQ ID No:10中第50~52位）；VL CDR3为QQSYSTPRT（SEQ ID No:10中第89~97位）。编码VH的核苷酸序列为CAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAACCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGCTTCAGAACTCATGATATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCACACATTAGTAGTACTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGATGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGATCGCTTTACGATTTTTGGCGTGGGCCCACCTTTCTACTACATGGACGTCTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCATCA（SEQ ID No:11）。编码VL的核苷酸序列为GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCTCGAACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA（SEQ ID No:12）。
抗体B041：VH的氨基酸序列为QVQLLDSGGTLVQPGGSLRLSCAASGFSFRTHDMNWVRQAPGKGLEWVSHISSTGSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRADDTAVYYCARDRFTIFGVGPPFYYMDVWGQGTMVTVSS（SEQ ID No:13）；其中，VH CDR1为GFSFRTHD（SEQ ID No:13中第26~33位）、VH CDR2为ISSTGSTI（SEQ ID No:13中第51~58位）；VH CDR3为ARDRFTIFGVGPPFYYMDV（SEQ ID No:13中第97~115位）。VL的氨基酸序列为DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLNSYPRTFGQGTKVEIK（SEQ ID No:14）；其中，VL CDR1为QGISSY（SEQ ID No:14中第27~32位）；VL CDR2为AAS（SEQ ID No:14中第50~52位）；VL CDR3为QQLNSYPRT（SEQ ID No:14中第89~97位）。编码VH的核苷酸序列为CAGGTGCAGCTGTTGGACTCTGGGGGAACCTTGGTACAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCAGCTTCAGAACTCATGATATGAACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTTTCACACATTAGTAGTACTGGTAGTACCATATACTACGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGATGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGAGATCGCTTTACGATTTTTGGCGTGGGCCCACCTTTCTACTACATGGACGTCTGGGGCCAAGGAACCATGGTCACCGTCTCATCA（SEQ IDNo:15）。编码VL的核苷酸序列为GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTAGCAGTTATTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGCTTAATAGTTACCCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA（SEQ ID No:16）。
抗体B050：VH的氨基酸序列为EVQLVESGGGLVQPGGPLRLSCAAAGFTFSDSTMSWVRQAPGKGLEWVSAISNTGSVTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQINSLRADDTAVYYCARGAGLFYWGQGTPVTVSS（SEQID No:17）；其中，VH CDR1为GFTFSDST（SEQ ID No:17中第26~33位）、VH CDR2为ISNTGSVT（SEQ ID No:17中第51~58位）；VH CDR3为ARGAGLFY（SEQ ID No:17中第97~104位）。VL的氨基酸序列为DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISYFLNWYQQKPGEAPKLLIYAATSVHGGDPSRFSGRGSGTEFTFTITSLQPEDFATYYCQQSYSPPRTFGQGTKVEIK（SEQ ID No:18）；其中，VL CDR1为QSISYF（SEQ ID No:18中第27~32位）；VL CDR2为AAT（SEQ ID No:18中第50~52位）；VL CDR3为QQSYSPPRT（SEQ ID No:18中第89~97位）。编码VH的核苷酸序列为GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGGGGGCCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCGCTGGATTCACCTTTAGCGACTCTACCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCAGCTATTAGTAATACTGGTAGTGTTACATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACACTGTATCTACAAATAAACAGCCTGAGAGCCGACGACACGGCCGTCTATTACTGTGCGAGAGGAGCTGGCCTTTTCTACTGGGGCCAAGGGACACCGGTCACCGTCTCATCA（SEQ ID No:19）。编码VL的核苷酸序列为GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGTATCAGTTATTTTTTGAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGGAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCGACCAGTGTGCATGGTGGGGACCCCTCAAGGTTCAGTGGCCGTGGATCTGGGACAGAGTTCACCTTCACGATCACCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTCCCCCTCGTACTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAA（SEQID No:20）。
抗体B083：VH的氨基酸序列为EVQLLESGGGVVRPGGSLRLSCAASGFTFGDYGMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRVEDSGVYYCARYGRVPDNWGQGTMVTVSS（SEQID No:21）；其中，VH CDR1为GFTFGDYG（SEQ ID No:21中第26~33位）、VH CDR2为INWNGGS（SEQ ID No:21中第51~57位）；VH CDR3为ARYGRVPDN（SEQ ID No:21中第97~105位）。VL的氨基酸序列为NIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGVNNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLESGVPSRFSGSGSATDFTLTINGLQPEDFATYYCQQAKRFPWTFGQGTKVEIK（SEQ ID No:22）；其中，VL CDR1为QGVNNW（SEQ ID No:22中第27~32位）；VL CDR2为AAS（SEQ ID No:22中第50~52位）；VL CDR3为QQAKRFPWT（SEQ ID No:22中第89~97位）。编码VH的核苷酸序列为GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGTGTGGTACGGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGGTGATTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAAGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCTGGTATTAATTGGAATGGTGGTAGCACAGGTTATGCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGTCGAGGACTCGGGTGTATATTACTGTGCGAGATATGGGAGGGTGCCTGACAACTGGGGCCAAGGGACCATGGTCACCGTCTCATCA（SEQ ID No:23）。编码VL的核苷酸序列为AACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTGTTAATAACTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTAATTTATGCTGCATCCACTTTGGAAAGTGGGGTCCCATCAAGATTCAGCGGCAGTGGATCTGCGACAGATTTCACTCTCACCATCAACGGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAAACGTTTCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAG（SEQ ID No:24）。
抗体B089：VH的氨基酸序列为EVQLLESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARFSGAYSYGYGVYWGQGTPVTVSS（SEQ ID No:25）；其中，VH CDR1为GFTFSSYA（SEQ ID No:25中第26~33位）、VH CDR2为ISYDGSNK（SEQ ID No:25中第51~58位）；VH CDR3为ARFSGAYSYGYGVY（SEQ ID No:25中第97~110位）。VL的氨基酸序列为DIQLTQSPSFLSASVGDNVTITCRASQGIASRLAWYQQKPGKAPNLLISSSSTLQSGVPSRFTGSGYGTEFTLTMNTLQPEDSATYYCQQLNSYPLTFGGGTKVEIK（SEQ ID No:26）；其中，VLCDR1为QGIASR（SEQ ID No:26中第27~32位）；VL CDR2为SSS（SEQ ID No:26中第50~52位）；VL CDR3为QQLNSYPLT（SEQ ID No:26中第89~97位）。编码VH的核苷酸序列为GAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGCTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCATATGATGGAAGCAATAAATACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCTGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGATTTTCGGGTGCGTACAGCTATGGTTACGGCGTCTACTGGGGCCAGGGAACACCGGTCACCGTCTCATCA（SEQ ID No:27）。编码VL的核苷酸序列为GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTTCCTGTCTGCTTCTGTAGGAGACAACGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGGGCATTGCCAGTCGTTTAGCCTGGTATCAGCAAAAACCAGGCAAAGCCCCGAACCTCCTGATCTCTTCTTCATCCACTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCACCGGCAGTGGATATGGGACAGAATTCACTCTCACAATGAACACCCTGCAGCCTGAAGATTCTGCAACTTATTATTGTCAACAACTTAATAGTTATCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTAGAGATCAAA（SEQ ID No:28）。
抗体B161：VH的氨基酸序列为QVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGGSDYIYYADPVRGRFTISRDNAKNSVYLQMNSLRAEDTAVYYCGRGITGIFNWGQGTPVTVSS（SEQID No:29）；其中，VH CDR1为GFTFSSYS（SEQ ID No:29中第26~33位）、VH CDR2为ISGGSDYI（SEQ ID No:29中第51~58位）；VH CDR3为GRGITGIFN（SEQ ID No:29中第97~105位）。VL的氨基酸序列为DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINNYLNWYQQKPGKAPKVLIYAASSLPRGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFASYYCQQSYTSPLTFGQGTKVEVK（SEQ ID No:30）；其中，VL CDR1为QSINNY（SEQ ID No:30中第27~32位）；VL CDR2为AAS（SEQ ID No:30中第50~52位）；VL CDR3为QQSYTSPLT（SEQ ID No:30中第89~97位）。编码VH的核苷酸序列为CAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCCTGGTCAAGCCTGGGGGGTCACTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAGTTATAGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTCTCATCCATTAGTGGGGGTAGTGATTACATATACTACGCAGACCCAGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCAGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTATATTATTGTGGGAGAGGTATAACTGGAATTTTCAACTGGGGCCAAGGAACACCGGTCACCGTCTCATCA（SEQ ID No:31）。编码VL的核苷酸序列为GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGTATTAACAACTATTTAAACTGGTATCAACAAAAACCAGGAAAGGCCCCTAAGGTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCCAAGGGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAAGTTACTACTGTCAACAGAGTTACACTTCCCCTCTGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAGTCAAA（SEQ ID No:32）。
上述抗体的重链恒定区的氨基酸序列为ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（SEQ IDNo:33）。轻链恒定区的氨基酸序列为RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（SEQ ID No:34）。
实施例3（抗体亲和力和中和活性分析）
1、对B6R蛋白的亲和力检测。
用buffer（1×PBS，0.02% tween (V/V)，0.5%BSA (W/V)）将抗体B026进行5个梯度的2倍系列稀释，起始浓度为200 nM。按如下表4从低浓度到高浓度进样分析。在分析软件中进行如表5所示的设置，并进行曲线拟合。
表4
表5
结果如图8所示。
抗体B010、B019、B026、B041、B050、B083、B089、B161均对B6R蛋白具有较好的亲和力。其中，抗体B010、B019、B026、B083、B089、B161与B6R蛋白的KD小于1 nM。
2、对反式互补缺陷猴痘病毒（MPXV）及痘苗病毒（VACV）的中和活性检测。
在12孔板中铺设猴痘病毒G9R+A1L基因稳定表达的Vero E6回补细胞和Vero细胞。将抗体进行8个梯度的3倍系列稀释后，与等体积含病毒的DMEM培养基（浓度为200 PUF/mL）混合，37℃孵育1 h，得到混合物。取100 μL混合物加入铺有单层G9R+A1L基因稳定表达的Vero E6回补细胞板及和Vero细胞板中，于5% CO2、37℃条件下恒温培养1 h；弃去板内液体，添加1 mL琼脂覆盖物（1.6wt%琼脂: （2×DMEM+胰酶混合物(0.25%胰酶+0.02%EDTA)）=1：1（V/V）），置于37℃培养箱培养5天。向每孔中加入2 mL 4%多聚甲醛固定液，过夜固定；弃去多聚甲醛固定液，用水轻轻冲洗，将琼脂覆盖物挑出至含有有效氯的消毒液中，以杀灭琼脂内病毒，再用水轻轻冲洗掉板中残余4%多聚甲醛固定液，甩干；加入结晶紫染色5min，用自来水冲洗干净后，晾干后在LED灯箱上拍照，并计数空斑，计算抑制率。
结果如图8和表6所示。
抗体B010、B019、B041、B050、B083、B089、B161均能够高效中和反式互补缺陷猴痘病毒及痘苗病毒。其中，抗体B026的中和活性较高，对反式互补缺陷猴痘病毒及痘苗病毒的IC50分别为0.019 µg/mL、0.02 µg/mL，可用于针对猴痘病毒、痘苗病毒等正痘病毒的感染治疗药物的开发。
表6
实施例4（抗原检测方法）
1、抗体标记过氧化物酶（HRP）。
将抗体B026在碳酸盐缓冲液（0.015M Na2CO3，0.035M NaHCO3，pH9.6）中透析（其间换液2次），将抗体/蛋白浓度调整为2 mg/mL，得到抗体溶液。将100 μL NaIO4水溶液（21mg/mL）与100 μL的HRP水溶液（2 mg/mL）缓慢混合，4℃下静置30 min后，加入２µL乙二醇，室温避光静置 30min，得到HRP溶液。将HRP溶液加入到抗体溶液中，室温反应2 h后，加入20 μL NaBH4水溶液（20 mg/mL），4℃静置2 h，每30 min摇动一次；PBS（pH7.2）透析过夜，即得HRP标记的抗体B026或B019（HRP-B026或HRP-B019）。对抗体进行定量，加入体积比30%～50%的甘油，混匀后置于-20℃保存。
2、标记抗体活性检测。
用PBS将重组B6R-His蛋白稀释至2 μg/mL，得到包被液，按30 µL/孔将包被液加入96孔ELISA板中，4℃包被过夜，作为实验板；同时包被无关蛋白（M1R-His）作为阴性包被板。弃去包被液，按100 µL/孔将封闭液（含5%（V/V）脱脂牛奶的PBST缓冲液）加入到各孔中，室温封闭2 h。弃去封闭液，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。将标记抗体进行8个梯度的系列10倍稀释，室温孵育30min。弃去样品，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。向每孔加50 µL显色液，室温避光孵育15 min后，向每孔加25 µL终止液，用酶标仪读取OD450，以样本OD450值大于阴性对照OD450值的2.1倍作为阳性判定。
结果如图9所示。
HRP标记的B026（B026-HRP)可良好结合B6R-His蛋白，同时对阴性蛋白无结合活性。HRP标记的B026可作为B6R-His的检测抗体。
3、B6R及猴痘病毒抗原检测方法建立及抗原检测范围判定。
用PBS将抗体B019、B026、B041、B083、B089蛋白稀释至2 μg/mL，得到包被液，按30µL/孔将包被液加入96孔ELISA板中，4℃包被过夜，作为实验板。弃去包被液，按100 µL/孔将封闭液（含5%（V/V）脱脂牛奶的PBST缓冲液）加入到各孔中，室温封闭2 h。弃去封闭液，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。将B6R-His蛋白进行8个梯度的系列10倍稀释，室温孵育30 min。以无关蛋白（M1R-His)处理作为阴性对照，以PBS处理作为空白对照。弃去样品，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。将二抗（B026-HRP）用稀释液（含1% BSA（w/v）的PBST缓冲液）按1：10000稀释，并按30 µL/孔将稀释后二抗溶液分别加至样品及阴性对照、空白对照中。弃去稀释后二抗溶液，用PBST缓冲液洗涤96孔ELISA板3次。向每孔加50 µL显色液，室温避光孵育15 min后，向每孔加25 µL终止液，用酶标仪读取OD450，以样本OD450值大于阴性对照OD450值的2.1倍作为阳性判定。
结果如图10和表7所示。
表7
本研究成功建立了猴痘病毒B6R抗原蛋白特异性检测方法，其中B041+B026-HPR、B083+B026-HPR、B089+B026-HPR三个抗体组合对B6R-His蛋白的检测下限较高，其中B083+B026-HPR可达到10 pg，可用于猴痘病毒B6R抗原蛋白的检测。
上面结合实施例对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (13)

1.抗痘病毒的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段选自a1）至a8）中的任一种；且具有重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区均分别含有互补决定区CDR1、CDR2、CDR3；
a1）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:1中第26~33位、第51~58位、第97~105位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:2中第27~32位、第51~53位、第89~97位所示；
a2）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:5中第26~33位、第51~58位、第97~103位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:6中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；
a3）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:9中第26~33位、第51~58位、第97~115位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:10中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；
a4）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:13中第26~33位、第51~58位、第97~115位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:14中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；
a5）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:17中第26~33位、第51~58位、第97~104位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:18中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；
a6）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:21中第26~33位、第51~57位、第97~105位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:22中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；
a7）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:25中第26~33位、第51~58位、第97~110位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:26中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示；
a8）所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:29中第26~33位、第51~58位、第97~105位所示；
所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID No:30中第27~32位、第50~52位、第89~97位所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，a1）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a111）如SEQ ID No:1所示的氨基酸序列；或
a112）将SEQ ID No:1经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ IDNo:1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a113）与SEQ ID No:1具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:1所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a1）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a121）如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列；或
a122）将SEQ ID No:2经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ IDNo:2所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a123）与SEQ ID No:2具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:2所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a2）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a211）如SEQ ID No:5所示的氨基酸序列；或
a212）将SEQ ID No:5经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ IDNo:5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a213）与SEQ ID No:5具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:5所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a2）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a221）如SEQ ID No:6所示的氨基酸序列；或
a222）将SEQ ID No:6经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ IDNo:6所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a223）与SEQ ID No:6具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:6所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a3）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a311）如SEQ ID No:9所示的氨基酸序列；或
a312）将SEQ ID No:9经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ IDNo:9所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a313）与SEQ ID No:9具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:9所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a3）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a321）如SEQ ID No:10所示的氨基酸序列；或
a322）将SEQ ID No:10经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID No:10所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a323）与SEQ ID No:10具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:10所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a4）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a411）如SEQ ID No:13所示的氨基酸序列；或
a412）将SEQ ID No:13经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID No:13所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a413）与SEQ ID No:13具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:13所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a4）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a421）如SEQ ID No:14所示的氨基酸序列；或
a422）将SEQ ID No:14经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID No:14所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a423）与SEQ ID No:14具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:14所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a5）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a511）如SEQ ID No:17所示的氨基酸序列；或
a512）将SEQ ID No:17经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID No:17所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a513）与SEQ ID No:17具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:17所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a5）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a521）如SEQ ID No:18所示的氨基酸序列；或
a522）将SEQ ID No:18经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID No:18所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a523）与SEQ ID No:18具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:18所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a6）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a611）如SEQ ID No:21所示的氨基酸序列；或
a612）将SEQ ID No:21经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID No:21所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a613）与SEQ ID No:21具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:21所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a6）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a621）如SEQ ID No:22所示的氨基酸序列；或
a622）将SEQ ID No:22经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID No:22所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a623）与SEQ ID No:22具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:22所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a7）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a711）如SEQ ID No:25所示的氨基酸序列；或
a712）将SEQ ID No:25经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID No:25所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a713）与SEQ ID No:25具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:25所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a7）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a721）如SEQ ID No:26所示的氨基酸序列；或
a722）将SEQ ID No:26经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID No:26所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a723）与SEQ ID No:26具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:26所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a8）所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列包含：
a811）如SEQ ID No:29所示的氨基酸序列；或
a812）将SEQ ID No:29经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID No:29所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a813）与SEQ ID No:29具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:29所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
a8）所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列包含：
a821）如SEQ ID No:30所示的氨基酸序列；或
a822）将SEQ ID No:30经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQID No:30所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
a823）与SEQ ID No:30具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:30所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段还包括重链恒定区和轻链恒定区；
所述重链恒定区的氨基酸序列包含：
b11）如SEQ ID No:33所示的氨基酸序列；或
b12）将SEQ ID No:33经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ IDNo:33所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
b13）与SEQ ID No:33具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:33所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；
所述轻链恒定区的氨基酸序列包含：
b21）如SEQ ID No:34所示的氨基酸序列；或
b22）将SEQ ID No:34经过一个或几个氨基酸的取代和/或缺失和/或添加，且与SEQ IDNo:34所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列；或
b23）与SEQ ID No:34具有80%、85%或90%以上的同源性，且与SEQ ID No:34所示的蛋白具有相同功能的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、双体、融合抗体和完整抗体中的任一种。
5.一种重组蛋白，其特征在于，包含标签以及权利要求1至4任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
6.与权利要求1至4任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求5所述的重组蛋白相关的生物材料，其特征在于，所述生物材料为c1）至c5）中的任一种；
c1）编码权利要求1至4任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求5所述的重组蛋白的核酸分子；
c2）含有c1）中所述核酸分子的表达盒；
c3）含有c1）中所述核酸分子或c2）中所述表达盒的重组载体；
c4）含有c1）中所述核酸分子或c2）中所述表达盒或c3）中所述重组载体的重组微生物；
c5）含有c1）中所述核酸分子或c2）中所述表达盒或c3）中所述重组载体的转基因细胞系。
7.根据权利要求6所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子为编码权利要求1至4任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求5所述的重组蛋白的DNA分子。
8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于，所述DNA分子为d1）至d10）中的任一种，且包含编码所述重链可变区的核苷酸序列和编码所述轻链可变区的核苷酸序列；
d1）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:4所示；
d2）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:7所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:8所示；
d3）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:11所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:12所示；
d4）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:15所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:16所示；
d5）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:19所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:20所示；
d6）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:23所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:24所示；
d7）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:27所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:28所示；
d8）编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:31所示；编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No:32所示；
d9）与d1）至d8）中任一限定的核苷酸序列具有80%、85%或90%以上的同源性，且编码所述抗体或其抗原结合片段的DNA分子；
d10）在严格条件下与d1）至d9）中任一限定的核苷酸序列杂交，且编码所述抗体或其抗原结合片段的DNA分子。
9.一种偶联物，其特征在于，包含：权利要求1至4任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求5所述的重组蛋白；
以及偶联部分，所述偶联部分包含可检测标记物、药物、毒素、放射性核素、酶中的至少一种。
10.权利要求1至4任一项所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求5所述的重组蛋白、权利要求6至8任一项所述的生物材料或权利要求9所述的偶联物在e1）至e5）任一项中的应用；
e1）制备预防和/或治疗痘病毒的药物；
e2）非诊断治疗目的地检测痘病毒；
e3）制备检测痘病毒的试剂盒；
e4）非诊断治疗目的地检测猴痘病毒B6R蛋白；
e5）制备检测猴痘病毒B6R蛋白的试剂盒；
所述痘病毒包括猴痘病毒、痘苗病毒中的至少一种。
11.一种产品，其特征在于，包括f1）至f4）中的至少一种；
f1）权利要求1至4任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
f2）权利要求5所述的重组蛋白；
f3）权利要求6至8任一项所述的生物材料；
f4）权利要求9所述的偶联物；
所述产品选自药物、试剂、检测板、芯片、试纸和试剂盒的至少一种。
12.根据权利要求11所述的产品，其特征在于，所述产品具有g1）至g3）中至少一种功能；
g1）预防和/或治疗痘病毒感染相关疾病；
g2）检测痘病毒的存在或其含量；
所述痘病毒包括猴痘病毒、痘苗病毒中的至少一种；
g3）检测猴痘病毒B6R蛋白的存在或其含量。
13.权利要求1至4任一项所述的抗体或其抗原结合片段、或权利要求5所述的重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
通过培养权利要求6至8任一项中所述的重组微生物或转基因细胞系得到。
CN202410129969.2A 2024-01-31 2024-01-31 抗猴痘病毒的抗体及其制备方法与应用 Active CN117683122B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410129969.2A CN117683122B (zh) 2024-01-31 2024-01-31 抗猴痘病毒的抗体及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410129969.2A CN117683122B (zh) 2024-01-31 2024-01-31 抗猴痘病毒的抗体及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN117683122A true CN117683122A (zh) 2024-03-12
CN117683122B CN117683122B (zh) 2024-05-07

Family

ID=90139316

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410129969.2A Active CN117683122B (zh) 2024-01-31 2024-01-31 抗猴痘病毒的抗体及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117683122B (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100215658A1 (en) * 2007-10-10 2010-08-26 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Vaccinia virus h3l and b5r specific monoclonal antibodies and methods of making and using same
CN116082498A (zh) * 2023-01-03 2023-05-09 杭州旭科生物技术有限公司 一种猴痘病毒蛋白的单克隆抗体及其应用
CN116102663A (zh) * 2023-01-05 2023-05-12 华兰基因工程有限公司 一种猴痘病毒b6r抗原及其制备方法与应用
CN116284349A (zh) * 2023-03-24 2023-06-23 北京科跃中楷生物技术有限公司 一种猴痘抗体检测试剂盒
CN116603060A (zh) * 2023-06-07 2023-08-18 深圳鹏泊生物科技有限公司 一种猴痘病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN117050165A (zh) * 2023-08-14 2023-11-14 三优生物医药(上海)有限公司 一种靶向猴痘病毒的抗体、其抗原结合片段及其用途
CN117466994A (zh) * 2023-07-19 2024-01-30 中国科学院微生物研究所 猴痘病毒单克隆中和抗体及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100215658A1 (en) * 2007-10-10 2010-08-26 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Vaccinia virus h3l and b5r specific monoclonal antibodies and methods of making and using same
CN116082498A (zh) * 2023-01-03 2023-05-09 杭州旭科生物技术有限公司 一种猴痘病毒蛋白的单克隆抗体及其应用
CN116102663A (zh) * 2023-01-05 2023-05-12 华兰基因工程有限公司 一种猴痘病毒b6r抗原及其制备方法与应用
CN116284349A (zh) * 2023-03-24 2023-06-23 北京科跃中楷生物技术有限公司 一种猴痘抗体检测试剂盒
CN116603060A (zh) * 2023-06-07 2023-08-18 深圳鹏泊生物科技有限公司 一种猴痘病毒亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN117466994A (zh) * 2023-07-19 2024-01-30 中国科学院微生物研究所 猴痘病毒单克隆中和抗体及其应用
CN117050165A (zh) * 2023-08-14 2023-11-14 三优生物医药(上海)有限公司 一种靶向猴痘病毒的抗体、其抗原结合片段及其用途

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LUCA M ZAECK等: "Low levels of monkeypox virus-neutralizing antibodies after MVA-BN vaccination in healthy individuals", NAT MED, vol. 29, no. 1, 18 October 2022 (2022-10-18), pages 270 - 278 *
丁森等: "基因芯片在痘病毒研究中的应用", 动物医学进展, vol. 32, no. 6, 20 June 2011 (2011-06-20), pages 105 - 108 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN117683122B (zh) 2024-05-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111995676B (zh) 一种针对新冠病毒棘突蛋白非rbd区的单克隆抗体及其应用
CN113264998B (zh) 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S1蛋白的单链抗体及其应用
CN113583112B (zh) Aav特异性抗体及其应用
CN110655574B (zh) 一种针对绿色荧光蛋白的纳米抗体、应用和gfp免疫亲和吸附材料
CN113150129A (zh) 抗新冠病毒SARS-CoV-2表面S2蛋白的单链抗体及其应用
WO2022061594A1 (zh) 新型冠状病毒（sars-cov-2）刺突蛋白结合分子及其应用
CN114702578B (zh) 新型冠状病毒Omicron突变株特异性抗体及其应用
CN110577594B (zh) 一种金黄色葡萄球菌肠毒素a纳米抗体a21、应用及试剂盒
CN117700534B (zh) 一种抗猴痘病毒a35r蛋白的抗体及其应用
WO2021250097A1 (en) Anti-bk virus antibody molecules
CN113480659A (zh) 人源抗结核分枝杆菌复合群lam单克隆抗体及其制备和应用
CN117683122B (zh) 抗猴痘病毒的抗体及其制备方法与应用
CN110878124B (zh) Dna聚合酶的抗体片段、抗体及其应用
WO2024124637A1 (zh) 抗cll1单域抗体及其应用
CN117659177B (zh) 抗猴痘病毒的抗体或其抗原结合片段及其应用
CN116754766A (zh) 检测猫杯状病毒的试剂盒
CN115058431B (zh) mEOS纳米抗体及其制备方法和应用
CN110702913A (zh) 一种用于定量检测贝氏柯克斯体i相株的单抗组合物
CN117229393B (zh) 特异性结合腺相关病毒5的抗体及其应用
CN117129675B (zh) 用于人博卡病毒型别特异性检测或诊断的试剂或试剂盒
CN117126270B (zh) 一种2型人博卡病毒型别特异性抗体及其应用
CN114773462B (zh) 用于检测牛crp蛋白的重组单链抗体及其应用
CN114560931B (zh) 抗SARS-CoV-2的中和抗体及其应用
CN113943367B (zh) 针对新型冠状病毒的单域抗体、试剂盒和药物
CN109096394B (zh) 一种抗葡萄球菌蛋白a的b亚单位的纳米抗体及核酸分子和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant