CN110702913A

CN110702913A - 一种用于定量检测贝氏柯克斯体i相株的单抗组合物

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Publication number: CN110702913A
Application number: CN201911029861.1A
Authority: CN
Inventors: 熊小路; 张平平; 杨瑞馥; 焦俊; 赵勇; 王津; 周冬生
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Priority date: 2019-10-28
Filing date: 2019-10-28
Publication date: 2020-01-17
Anticipated expiration: 2039-10-28
Also published as: CN110702913B

Abstract

本发明提供一种用于贝氏柯克斯体I相株定量检测的单克隆抗体，该单克隆抗体克结合上转发光技术进行检测，跟传统的贝氏柯克斯体检测方法相比，具有准确定量、零背景干扰，检测结果稳定，检测简便快速的特点。

Description

一种用于定量检测贝氏柯克斯体I相株的单抗组合物

技术领域

本发明涉及一种用于定量检测贝氏柯克斯体I相株的单抗组合物。

背景技术

贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)为重要的人兽共患病——Q热(Qfever)的病原菌，革兰氏阴性染色、专性胞内寄生、呈小短杆状或小球杆状。贝氏柯克斯体在生长过程中存在相变，I相株通常为Q热病人或感染动物上分离到的强毒株，在经过数十甚至数百代的实验室人工传代，I相株的LPS部分抗原丢失，形成减毒株即II相株。贝氏柯克斯体I相菌株含有I相和II相抗原，可以诱导动物产生I相和II相抗体，而II菌株主要为II相抗原，只能诱导产生II相抗体。

急性Q热的临床症状多以急性发热、头痛、肌肉酸痛为主，常并发肺炎、肝炎等。慢性Q热常并发心内膜炎、骨髓炎等严重疾病。Q热在临床上无特异的症状和体征且缺乏特异的临床诊断标志，因此它与其它热性传染病难以区分开来，误诊率较高。血清学检测贝氏柯克斯体特异性抗体是最常用的方法，包括补体结合实验(CF)、酶联免疫吸附(ELISA)、间接免疫荧光(IFA)、微量凝集实验(MA)等；分子生物学检测方法包括多聚酶链式反应(PCR)、实时荧光定量PCR、重组酶聚合酶扩增反应(RPA)、环介导等温扩增(Lamp)、DNA斑点杂交等。血清学检测方法专业性强、生物安全要求高、技术要求高，发病急的病人往往检测不出抗体，且从血液中分离病原十分困难；核酸检测时需要提前提取基因组，操作费时耗力，且需要专业的仪器设备，需要在专业的实验室内操作进行，同时核酸检测的方法不能判断菌体是否存活，易导致结果判断和感染风险评估的复杂化。

随着化学和材料学等相关学科的发展和社会应用领域的不断拓展，近年来，免疫诊断技术一直朝着稳定、高通量、高敏感性、宽领域的方向发展。如上转发光技术(Up-Converting Phosphor Technology，UPT)等，它在提高传统免疫层析灵敏度的基础上，还对各种复杂检测样品具有极强的耐受性，使得直接对病人或动物血清中的痕量级抗体或抗原进行定量检测成为可能。

发明内容

本发明提供一种用于定量检测贝氏柯克斯体I相株的单抗组合物。

本发明提供一种用于贝氏柯克斯体检测的试纸，所述试纸包括结合垫和与所述结合垫连接的分析膜；所述结合垫包被有UCP-单抗10复合物，所述UCP-单抗10复合物是用UCP标记单抗10得到的复合物；

所述分析膜具有相互分离的检测带和质控带，所述检测带包被有单抗10；

所述单抗10是由重链和轻链组成的单克隆抗体，所述重链和所述轻链均由可变区和恒定区组成，所述可变区均由决定簇互补区和框架区组成，所述决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述单抗10的重链的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第26-33位所示；所述单抗10的重链的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第51-60位所示；所述单抗10的重链的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第99-106位所示；所述单抗10的轻链的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.8的第26-32位所示；所述单抗10的轻链的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.8的第50-52位所示；所述单抗10的轻链的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.8的第89-97位所示；。

其中，所述单抗10的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.4中的第1-117位；所述单抗10的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.8中的第1-107位。

其中，所述单抗10的重链的氨基酸序列为SEQ ID No.4；所述单抗10的轻链的氨基酸序列为SEQ ID No.8。

其中，所述质控带包被有与所述UCP-单抗10复合物特异结合的第二抗体。

本发明还提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体为如上所述单抗10。

所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体。

与所述的单克隆抗体相关的生物材料，所述生物材料为B1)至B16)中的任一种：

B1)编码权所述的单克隆抗体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

其中，B1)所述核酸分子为编码所述的单克隆抗体的基因。

所述基因为如下A)或B)所述的DNA分子：

A)所述单抗10是由重链和轻链组成的单克隆抗体，所述重链和所述轻链均由可变区和恒定区组成，所述可变区均由决定簇互补区和框架区组成，所述决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述单抗10的重链的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第26-33位所示；所述单抗10的重链的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第51-60位所示；所述单抗10的重链的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第99-106位所示；所述单抗10的轻链的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.8的第26-32位所示；所述单抗10的轻链的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.8的第50-52位所示；所述单抗10的轻链的CDR3的氨基酸序列如SEQ IDNo.8的第89-97位所示；

B)与A)限定的DNA分子具有90％以上的同一性且编码所述单克隆抗体的DNA。

一种用于检测的贝氏柯克斯体I相株的组合物，所述组合物的活性成分为所述的单抗10。

本发明制备的贝氏柯克斯体检测的试纸，用该单抗组合物检测贝氏柯克斯体I相株抗原具有准确定量、零背景干扰，检测结果稳定，检测简便快速的特点。

附图说明

图1为Cbu-UPT-LF各个浓度检测结果示意图；

图2为Cbu-UT-LF对贝氏柯克斯体检测的定量曲线。

具体实施方式

以下实施例中利用仪器。

BALB/c小鼠：北京维通利华公司。

下述实施例中的羊抗鼠IgM为辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠抗体：英国Abcam公司，货号分别为：ab97230。单克隆抗体亚类鉴定试剂盒：美国Sigma公司，货号：ISO2-1KT

1640培养基：美国Gibco公司

UVM340酶标仪：英国ASYS公司

贝氏柯克斯体新桥株(Xin Qiao strain)、七医株(Qi Yi strain)、Grita株(Grita strain)、Henzerling株(Henzerling strain)在文献“Wen BH,Yu SR,Yu GQ,LiQJ,Zhang X.Analysis of proteins and lipopolysaccharides from Chinese isolatesof Coxiella burnetii with monoclonal antibodies.Acta Virol.1991Nov；35(6):538-44.”中公开；贝氏柯克斯体九里株(Nine Mile strain)在文献“Amy M Denison,Herbert AThompson,and Robert F Massung.IS1111 insertion sequences of Coxiellaburnetii:characterization and use for repetitive element PCR-baseddifferentiation of Coxiella burnetii isolates.BMC Microbiol.2007；7:91.”中公开；贝氏柯克斯体YH-11株(YH-11 strain)在文献“余全，张国全，Fukushi Hideto，Yamaguchi Tsuyoshi，Hirai Katsuya。贝氏柯克斯体中国分离株com1基因的序列分析。第三军医大学学报，2002年4月第24卷第4期：404-406。”中公开。公众均可从中国人民解放军军事科学院军事医学研究院获得。

实施例1、抗贝氏柯克斯体单克隆抗体制备

1)小鼠免疫

采用灭活的贝氏柯克斯体新桥株全菌抗原作为免疫原，皮下注射免疫雌性8周龄BALB/c小鼠，获取脾脏淋巴细胞用于杂交瘤融合实验。

用pH7.4的PBS稀释纯化的灭活贝氏柯克斯体全菌抗原。选取5只8周龄、体重相近的雌性BALB/c小鼠。首次免疫以全菌抗原20μg与100μl体积的弗氏完全佐剂乳化混合后皮下注射；每间隔两周进行第二次皮下免疫和第三次皮下免疫，第二、三次免疫时佐剂改用弗氏不完全佐剂；融合前3天进行加强免疫，不加佐剂，腹腔注射纯化的灭活贝氏柯克斯体全菌抗原。免疫注射体积不变。

2)免疫BALB/c小鼠血清效价测定

将灭活贝氏柯克斯体全菌抗原稀释成2x10⁹/ml，按100μl/孔加入酶标板，4℃包被过夜，PBST洗涤5min×5次，最后将孔板倒置在吸水纸上，拍净孔内液体。按200μl/孔加入封闭液37℃孵育2h，PBST洗涤5min×5次，拍净孔内液体。小鼠第三次免疫7天后尾静脉取血200μl，2000rpm离心30min，取上清从1:100至1:51200进行倍比稀释，按100μl/孔加入稀释过的血清，同时以1:100稀释的免疫前小鼠血清为阴性对照，以抗体稀释液做空白对照，37℃孵育1h，PBST洗涤5min×5次；按100μl/孔加入0.1％PBST以1:6000稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤5min×5次；按100μl/孔加入TMB底物显色液，室温暗处反应15min；按50μl/孔加入终止液观察结果，用酶联免疫检测仪记录450mm读数。选择血清效价达到1:20000以上的最高者用于细胞融合。

3)脾细胞和SP2/0细胞悬液的制备

脾脏细胞的制备：取一只免疫好的雌性BALB/c小鼠，摘除眼球放血处死，无菌操作取出脾脏，放于细胞筛中，用注射器的内芯研磨，不时用无血清1640冲洗细胞筛，使脾脏细胞穿过网孔悬浮于溶液中，将脾脏细胞移至15mL离心管中，1000rpm离心7min，去上清。无血清1640重悬，1000rpm离心7min，去上清。15mL无血清1640重悬混匀并计数。

SP2/0细胞悬液的制备：将SP2/0细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇晃，直至细胞溶液完全溶解，1000rpm离心7min，弃上清，5mL完全培养基重悬沉淀，把细胞悬液转移到75mL培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。融合当天收集细胞离心，15mL无血清1640重悬细胞并计数。

4)细胞融合

将脾脏细胞悬液和骨髓瘤细胞悬液混匀(脾脏细胞悬液和骨髓瘤细胞悬液按细胞数5:1或10:1)，1000rpm离心7min，弃上清，轻弹管底，使细胞团松散成糊状。吸取0.8mL预温的PEG1500溶液，沿管壁慢慢加入细胞中，边加边转动离心管轻柔混匀细胞。静置90s，逐渐加入1mL37℃预温的无血清1640终止融合，边加边转动离心管轻柔混匀细胞；加入40ml无血清1640轻柔重悬细胞，1000rpm离心5min，洗掉PEG，弃上清。用2ml融合细胞培养液(含1％氨苄青霉素和链霉素、1％E3、2％HAT、20％FBS的1640)轻柔重悬融合细胞，定容至50ml。

将融合细胞按100μl/孔接种至已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板，每块培养板留6孔接种SP2/0细胞，作为HAT选择的阴性对照，置于37℃、5％CO2培养箱中培养。培养48小时后，以每孔加入新鲜的100μl 2×HAT选择培养基。融合后第隔4-5天可补加1×HAT选择培养基100μl，在2～5周可见到克隆群。

5)特异性杂交细胞瘤的筛选

培养10天后，镜下检测生长出克隆细胞孔为融合阳性孔，计算融合率。采用间接ELISA法检测培养上清，筛选阳性克隆：以2x109/ml的灭活贝氏柯克斯体新桥株作为免疫原包被酶标板，100μl/孔，4℃包被过夜，PBST洗涤5min×5次，拍净孔内液体。按200μl/孔加入封闭液37℃孵育2h，PBST洗涤5min×5次，拍净孔内液体。按100μl/孔加入细胞上清，以SP2/0细胞培养上清为阴性对照，以小鼠的免疫血清为阳性对照，37℃孵育1h，PBST洗涤5min×5次；按100μl/孔加入0.1％PBST以1:6000稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤5min×5次；按100μl/孔加入TMB底物显色液，室温暗处反应15min；按50μl/孔加入终止液观察结果，用酶联免疫检测仪记录450mm读数。OD值明显高于阴性对照2.1倍以上者定为阳性，阳性克隆采用有限稀释法进行亚克隆培养，连续进行三次以上的克隆化筛选直至获得高特异性抗单克隆杂交瘤细胞株，并扩大化培养。

6)单克隆抗体腹水制备

筛选出阳性克隆后，采用有限稀释法对阳性孔进行克隆化培养，经过两到三轮的克隆化培养后获得能够稳定的产生高效价单抗的杂交瘤细胞克隆。将6-8周龄的小鼠用石蜡油处理约10天后，每只小鼠注射5×105个杂交瘤细胞，10-14天采用抽取或者杀死小鼠的方式获得腹水用于纯化抗体。

7)纯化单克隆抗体(正辛酸-硫酸铵法)

将小鼠腹水8000rpm离心20min，将1体积的腹水与2体积的0.06M PH 4.8的醋酸盐缓冲液进行室温下混合，边搅拌边缓慢加入正辛酸，加入正辛酸的量为33ul/ml腹水。2到8摄氏度静置过夜，使其充分沉淀。8000rpm离心20min，弃去沉淀取上清。将上清转移到MD14000透析袋内，用0.01M PBS进行透析，透析4次以上，每次至少1小时以上。

将透析液与0.01M PBS等体积混合，向其中加入等体积的饱和硫酸铵溶液，边滴加边摇匀，2到8摄氏度静置过夜。将静置过夜的待分离物8000rpm离心20min，弃上清。将沉淀用2ml 0.01M PBS溶解，然后缓慢加入3ml饱和硫酸铵溶液，边滴加边摇匀，然后置于2到8摄氏度静置2小时。8000rpm离心20min，弃上清。将离心后的沉淀用1.65ml 0.01M PBS溶解，然后缓慢加入3.35ml饱和硫酸铵溶液，边滴加边摇匀，然后置于2到8摄氏度静置2小时。将待分离物8000rpm离心20min，弃上清。

将离心后的沉淀用1ml 0.01M PBS溶解,转移到MD 14000透析袋内，用0.01M PBS进行透析，透析4次以上，每次至少1小时以上。最后测定管中蛋白质的含量。

8)单克隆抗体类型鉴定

采用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒(Mouse Monoclonal AntibodyIsotypingReagents，ISO2-1KT，Sigma公司)进行亚类鉴定，按说明书操作，单克隆抗体编号10B5(以下称为单抗10B5)和10G7(以下称为单抗10G7)的鉴定结果均为IgM。

将单抗10B5和单抗10G7进行测序所述单抗10B5的重链信号肽的氨基酸序列如序列2所示，编码单抗10B5的重链信号肽的DNA序列如序列1所示；所述单抗10B5的重链全长的氨基酸序列如序列4所示，编码单抗10B5的重链全长的DNA序列如序列3所示；所述单抗10B5的轻链信号肽的氨基酸序列如序列6所示，编码单抗10B5的轻链信号肽的DNA序列如序列5所示；所述单抗10B5的轻链全长的氨基酸序列如序列8所示，编码单抗10B5的轻链全长的DNA序列如序列7所示。

所述单抗10G7的重链信号肽的氨基酸序列如序列2所示，编码单抗10G7的重链信号肽的DNA序列如序列1所示；所述单抗10G7的重链全长的氨基酸序列如序列4所示，编码单抗10G7的重链全长的DNA序列如序列3所示；所述单抗10G7的轻链信号肽的氨基酸序列如序列6所示，编码单抗10G7的轻链信号肽的DNA序列如序列5所示；所述单抗10G7的轻链全长的氨基酸序列如序列8所示，编码单抗10G7的轻链全长的DNA序列如序列7所示。

比对上述数据发现所述单抗10B5和单抗10G7具有相同的序列，具有这一序列的单克隆抗体命名为单抗10。

所述单抗10的可以通过以下步骤制备：

1.重链和轻链编码基因的合成

重链的编码基因由人工合成得到(即人工合成SEQ ID NO：3所示的核苷酸)。

轻链的编码基因由人工合成得到(即人工合成SEQ ID NO：7所示的核苷酸)。

2.重组质粒的构建

将载体pET32a(+)(Takara)的限制性内切酶BamHI和SalI识别序列间的小片段替换为序列表中序列3所示的DNA分子，表达序列表中序列4的蛋白质；将载体pET32a(Takara)的限制性内切酶酶HindIII和XhoI的酶切识别位间的小片段替换序列表中序列7所示的DNA分子，表达序列表中序列8的蛋白质；最终得到重组质粒1，重组质粒1表达序列4和序列8的融合蛋白。

3.重组细胞株1的获得

采用电转或钙转的方式将步骤2中构建的重组质粒1转化至大肠杆菌BL21感受态细胞(Takara)，并涂布于Amp抗性LB平板，37摄氏度培养过夜。挑取阳性单克隆。将测序正确的单克隆转接至新鲜的含有Amp抗性的LB培养基中摇过夜后30％甘油中保种冻存。

4.抗体的制备

将重组菌株1在含有Amp抗性的LB培养基中培养8小时，得到种子液；取种子液转接在含有Amp抗性的LB中继续培养2-4小时，待OD值大于0.6加入IPTG诱导表达8小时以上得到重组菌发酵液。将重组菌发酵液经超声破碎后，12000rpm高速离心处理，后取上清液，用Ni-NTA亲和层析的方式进一步分进行分离纯化，得到重组蛋白溶液，所述重组蛋白即为本专利单抗10G。

实施例2.抗贝氏柯克斯体单克隆抗体的特异性检测(ELISA法)

将斑点热立克次体(Th1 epitope peptides induce protective immunityagainst Rickettsia rickettsii infection in C3H/HeN mice.Wang P,Xiong X,JiaoJ,Yang X,Jiang Y,Wen B,Gong W.Vaccine.2017Dec 18；35(51):7204-7212)、大肠杆菌、沙门氏菌5型、李斯特杆菌、布鲁氏杆菌、炭疽芽孢杆菌、军团菌为本室保存或培养，见文献(Zhao Y,Wang H,Zhang P,Sun C,Wang X,Wang X,Yang R,Wang C,Zhou L.2016.Rapidmultiplex detection of 10foodborne pathogens with an up-converting phosphortechnology-based 10-channel lateral flow assay.Scientific reports 6:21342；HaoM,Zhang P,Li B,Liu X,Zhao Y,Tan H,Sun C,Wang X,Wang X,Qiu H,Wang D,Diao B,Jing H,Yang R,Kan B,Zhou L.2017.Development and evaluation of an up-converting phosphor technology-based lateral flow assay for the rapid,simultaneous detection of Vibrio cholerae serogroups O1 and O139.12:e0179937.)变形杆菌(OX2，OX19，OXK)购自宁波天润生物药业有限公司。分别稀释成2×10⁹cfu/ml，按100μl/孔加入酶标板，各6个复孔，4℃过夜包被，PBST洗涤5min×5次，拍净孔内液体。按200μl/孔加入封闭液37℃孵育2h，PBST洗涤5min×5次，拍净孔内液体。分别将实施例1的单克隆抗体(单抗10)从240μg/ml进行倍比稀释，按100μl/孔加入，37℃孵育1h，PBST洗涤5min×5次；按100μl/孔加入0.1％PBST以1:6000稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤5min×5次；按100μl/孔加入TMB底物显色液，室温暗处反应15min；按50μl/孔加入终止液观察结果，用酶联免疫检测仪记录450nm读数。以单克隆抗体(单抗10)与PBS阴性对照组反应的OD450nm读数+3倍标准差，即OD450nm值≥0.2为判断结果阳性的标准。如果单克隆抗体(单抗10)与该细菌反应的OD450nm≥0.2，即单克隆抗体(单抗10)与该细菌存在交叉反应，最终结果如表1所示：

表1单克隆抗体ELISA特异性评价结果

说明实施例1的单克隆抗体(单抗10)不与其他菌株产生交叉反应，特异性好。

实施例3.抗贝氏柯克斯体单克隆抗体的灵敏度检测(ELISA法)

将灭活贝氏柯克斯体全菌抗原稀释成2x10⁹拷贝数/ml，按100μl/孔加入酶标板，各6个复孔，4℃包被过夜，PBST洗涤5min×5次，拍净孔内液体。按200μl/孔加入封闭液37℃孵育2h，PBST洗涤5min×5次，拍净孔内液体。分别取单克隆抗体(单抗10)从250μg/ml进行倍比稀释，按100μl/孔加入，37℃作用1h，洗涤5min×5次；按100μl/孔加入0.1％PBST以1:6000稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗小鼠抗体，37℃孵育1h，PBST洗涤5min×5次；按100μl/孔加入TMB底物显色液，室温暗处反应15min；按50μl/孔加入终止液观察结果，用酶联免疫检测仪记录450nm读数。以单克隆抗体(单抗10)与PBS阴性对照组反应的OD450nm数值+3倍标准差，即OD450nm值≥0.2为判断结果阳性的标准。如果该稀释度的单克隆抗体(单抗10)与贝氏柯克斯体全菌抗原反应的OD450nm≥0.2，说明该稀释度下的单克隆抗体(单抗10)反应为阳性。结果如表2所示：

表2：单克隆抗体ELISA检测Q热灵敏度评价

实施例4、上转发光免疫层析试纸的制备

采用双抗体夹心方式建立能够对贝氏柯克斯体I相株进行快速定量检测的上转发光免疫层析方法(Cbu-UPT-LF)，其中单克隆抗体(单抗10)为实施例1制备的单克隆抗体。Cbu-UPT-LF检测原理为：(1)阳性样品：样品在加入样品垫后，在虹吸作用下向前涌动，阳性样品中的贝氏柯克斯体首先与结合垫中的UCP-单抗10相结合，形成UCP-单抗10–贝氏柯克斯体复合物。该复合物和游离的UCP-单抗10继而流经分析膜，检测带捕获复合物形成固相单抗10-贝氏柯克斯体-单抗10-UCP，质控带捕获游离UCP-单抗10形成固相羊抗鼠-单抗10-UCP。(2)阴性样品：样品和UCP-单抗10结合物一起进入分析膜，UCP-单抗10只与质控带上羊抗鼠IgM结合。因此，在间接模式中，阳性样品在检测带与质控带上都有特异性的信号峰出现，而阴性样品只在质控带上有特异的信号峰。

1)NC膜(分析膜)的制备

将2.5cm宽的硝酸纤维素膜(NC膜)剪裁成27cm/条备用；实施例1的单抗10和羊抗鼠IgM分别用磷酸缓冲液PB(0.01mol/L,pH7.2)稀释至2mg/ml，并使用喷膜仪以1μL/cm划线速度分别喷于NC膜的不同位置作为检测带(包被实施例1的单抗10)和质控带(包被羊抗鼠IgM)；然后将NC膜置于电热恒温鼓风干燥箱内37℃干燥1h，置于干燥柜内备用。

2)结合垫的制备

将表面修饰过的UCP(上转化颗粒，上海科润光电技术有限公司)使用常规标记缓冲液重悬至1mg/ml，放置于恒温振荡器上振荡，加入实施例1的抗贝氏柯克斯体单抗10B5，持续搅拌1h；加入BSA封闭10min，4℃、12000rpm、30min离心获得UCP-单抗10复合物。将UCP-单抗10用结合物稀释液重悬后均匀浇于玻璃纤维上，于-80℃冰箱预冻2h后再放置冻干机内冻干3h，制备成结合垫，置于干燥柜内保存。

3)样品垫的制备

将玻璃纤维裁剪为宽度为1.5cm×20cm的细长条，将3ml样品处理液(0.03mol/LPB含有0.5％NP-40和0.1mol/L NaCl)浇于其上，并37℃烘干1h，作为样品垫，于干燥柜中储存备用。

4)吸水垫的制备和试纸条的组装

将吸水纸剪裁为3cm×30cm，作为吸水垫。将样品垫、结合垫、分析膜、吸水垫依次粘贴在底衬上，用高速数控斩切机斩切为4mm宽的试纸条，并装配于塑料卡壳中制备为检测试纸条，得到用于贝氏柯克斯体定量检测的试纸，命名为Cbu-UPT-LF试纸条。所述试纸包括结合垫和与所述结合垫连接的分析膜；所述结合垫包被有UCP-单抗10复合物，所述UCP-单抗10复合物是用UCP标记单抗10得到的复合物；所述分析膜具有相互分离的检测带和质控带，所述检测带包被有单抗10。

5)上样检测

将样品使用0.03mol/LPB缓冲液稀释，取100μL加入试纸条，静置15min。使用UPT生物传感器扫描，NC膜检测带和质控带上的信号被扫描出现检测峰，将各自的峰面积比值(记作T/C)作为检测结果。(所述T/C＝检测带的检测峰面积/质控带的检测峰面积)

实施例5、上转发光免疫层析试纸的特异性、灵敏度及覆盖度检测

1)Cbu-UPT-LF灵敏度检测和定量曲线

将贝氏柯克斯体I相株使用0.03mol/L的磷酸缓冲液(PB)梯度稀释成10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹cfu/ml，各取100μL加入至Cbu-UPT-LF试纸条，静置15min后用UPT生物传感器检测，每个浓度样品重复检测3次。均值与标准差的比即为试纸条的变异系数。0.03mol/LPB作为空白对照，测试3次获取均值为0.079，标准差为0.0585，设定cutoff值为均值+3倍标准差为0.097。高于cutoff值的最低浓度值(1-5×10⁴cfu/ml)(最低浓度应该是个点值，是否应该为1×10⁴)，即为Cbu-UPT-LF的灵敏度。结果如表3，图1所示所示。

表3：Cbu-UPT-LF灵敏度检测

取1×10⁴cfu/ml至1×10⁸cfu/ml浓度的检测值，以Log(T/C-cutoff)为横轴，以Log(浓度)为纵轴，绘制贝氏柯克斯体检测的标准定量曲线。经线性拟合获得Cbu-UPT-LF的定量曲线为Y＝0.961X+6.739(r值为0.993，P<0.0001)，定量范围为1×10⁴cfu/ml至1×10⁸cfu/ml，如图2所示。Cbu-UPT-LF的灵敏度为1×10⁴cfu/ml。

2)特异性检测(Cbu-UPT-LF)

以贝氏柯克斯体新桥株(I相)作为阳性对照，与贝氏柯克斯体近缘、生境相似、或烈性病原体的菌株以10⁷cfu/ml浓度取100μL加入Cbu-UPT-LF试纸条，获得T/C检测值，如下表4所示，本发明的Cbu-UPT-LF试纸条对贝氏柯克斯体新桥株的T/C检测值是0.931，大于cutoff值0.097，为阳性；本发明的Cbu-UPT-LF试纸条对与贝氏柯克斯体近缘、生境相似、或烈性病原体的菌株的T/C检测值均小于cutoff值0.097，均为阴性。由表4可以看出，本发明的Cbu-UPT-LF试纸条对贝氏柯克斯体新桥株有着良好的特异性检出。

表4:Cbu-UPT-LF特异性检测

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种用于定量检测贝氏柯克斯体I相株的单抗组合物

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgtacttgg gactgaactg tgtattcata gtttttctct taaaaggtgt ccagagt 57

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Tyr Leu Gly Leu Asn Cys Val Phe Ile Val Phe Leu Leu Lys Gly

1 5 10 15

Val Gln Ser

<210> 3

<211> 1716

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaagtgaagc ttgaggagtc tggaggaggc ttggtgcaac ctggaggatc catgaaactc 60

tcctgtgttg cctctggatt cagtttcagt aactactgga tgaactgggt ccgccagtct 120

ccagagaagg ggcttgagtg ggttgctgaa attagattga aatctaataa ttatgtaaca 180

tattatgcgg agtctgtgaa agggaggttc accatctcaa gagatgattc caaaagtagt 240

gtctacctgc aaatgaacaa cttaagagct gaagacactg gcatttacta ctgttccaga 300

actgggtctt ttgactactg gggccaaggc accactctca cagtctcctc agagagtcag 360

tccttcccaa atgtcttccc cctcgtctcc tgcgagagcc ccctgtctga taagaatctg 420

gtggccatgg gctgcctggc ccgggacttc ctgcccagca ccatttcctt cacctggaac 480

taccagaaca acactgaagt catccagggt atcagaacct tcccaacact gaggacaggg 540

ggcaagtacc tagccacctc gcaggtgttg ctgtctccca agagcatcct tgaaggttca 600

gatgaatacc tggtatgcaa aatccactac ggaggcaaaa acagagatct gcatgtgccc 660

attccagctg tcgcagagat gaaccccaat gtaaatgtgt tcgtcccacc acgggatggc 720

ttctctggcc ctgcaccacg caagtctaaa ctcatctgcg aggccacgaa cttcactcca 780

aaaccgatca cagtatcctg gctaaaggat gggaagctcg tggaatctgg cttcaccaca 840

gatccggtga ccatcgagaa caaaggatcc acaccccaaa cctacaaggt cataagcaca 900

cttaccatct ctgaaatcga ctggctgaac ctgaatgtgt acacctgccg tgtggatcac 960

aggggtctca ccttcttgaa gaacgtgtcc tccacatgtg ctgccagtcc ctccacagac 1020

atcctaacct tcaccatccc cccctccttt gccgacatct tcctcagcaa gtccgctaac 1080

ctgacctgtc tggtctcaaa cctggcaacc tatgaaaccc tgaatatctc ctgggcttct 1140

caaagtggtg aaccactgga aaccaaaatt aaaatcatgg aaagccatcc caatggcacc 1200

ttcagtgcta agggtgtggc tagtgtttgt gtggaagact ggaataacag gaaggaattt 1260

gtgtgtactg tgactcacag ggatctgcct tcaccacaga agaaattcat ctcaaaaccc 1320

aatgaggtgc acaaacatcc acctgctgtg tacctgctgc caccagctcg tgagcaactg 1380

aacctgaggg agtcagccac agtcacctgc ctggtgaagg gcttctctcc tgcagacatc 1440

agtgtgcagt ggcttcagag agggcaactc ttgccccaag agaagtatgt gaccagtgcc 1500

ccgatgccag agcctggggc cccaggcttc tactttaccc acagcatcct gactgtgaca 1560

gaggaggaat ggaactccgg agagacctat acctgtgttg taggccacga ggccctgcca 1620

cacctggtga ccgagaggac cgtggacaag tccactggta aacccacact gtacaatgtc 1680

tccctgatca tgtctgacac aggcggcacc tgctat 1716

<210> 4

<211> 572

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Val Thr Tyr Tyr Ala Glu

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ser Arg Thr Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

100 105 110

Leu Thr Val Ser Ser Glu Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val Phe Pro Leu

115 120 125

Val Ser Cys Glu Ser Pro Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val Ala Met Gly

130 135 140

Cys Leu Ala Arg Asp Phe Leu Pro Ser Thr Ile Ser Phe Thr Trp Asn

145 150 155 160

Tyr Gln Asn Asn Thr Glu Val Ile Gln Gly Ile Arg Thr Phe Pro Thr

165 170 175

Leu Arg Thr Gly Gly Lys Tyr Leu Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Ser

180 185 190

Pro Lys Ser Ile Leu Glu Gly Ser Asp Glu Tyr Leu Val Cys Lys Ile

195 200 205

His Tyr Gly Gly Lys Asn Arg Asp Leu His Val Pro Ile Pro Ala Val

210 215 220

Ala Glu Met Asn Pro Asn Val Asn Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly

225 230 235 240

Phe Ser Gly Pro Ala Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Glu Ala Thr

245 250 255

Asn Phe Thr Pro Lys Pro Ile Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Lys

260 265 270

Leu Val Glu Ser Gly Phe Thr Thr Asp Pro Val Thr Ile Glu Asn Lys

275 280 285

Gly Ser Thr Pro Gln Thr Tyr Lys Val Ile Ser Thr Leu Thr Ile Ser

290 295 300

Glu Ile Asp Trp Leu Asn Leu Asn Val Tyr Thr Cys Arg Val Asp His

305 310 315 320

Arg Gly Leu Thr Phe Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Cys Ala Ala Ser

325 330 335

Pro Ser Thr Asp Ile Leu Thr Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe Ala Asp

340 345 350

Ile Phe Leu Ser Lys Ser Ala Asn Leu Thr Cys Leu Val Ser Asn Leu

355 360 365

Ala Thr Tyr Glu Thr Leu Asn Ile Ser Trp Ala Ser Gln Ser Gly Glu

370 375 380

Pro Leu Glu Thr Lys Ile Lys Ile Met Glu Ser His Pro Asn Gly Thr

385 390 395 400

Phe Ser Ala Lys Gly Val Ala Ser Val Cys Val Glu Asp Trp Asn Asn

405 410 415

Arg Lys Glu Phe Val Cys Thr Val Thr His Arg Asp Leu Pro Ser Pro

420 425 430

Gln Lys Lys Phe Ile Ser Lys Pro Asn Glu Val His Lys His Pro Pro

435 440 445

Ala Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu

450 455 460

Ser Ala Thr Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Ser Pro Ala Asp Ile

465 470 475 480

Ser Val Gln Trp Leu Gln Arg Gly Gln Leu Leu Pro Gln Glu Lys Tyr

485 490 495

Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gly Ala Pro Gly Phe Tyr Phe

500 505 510

Thr His Ser Ile Leu Thr Val Thr Glu Glu Glu Trp Asn Ser Gly Glu

515 520 525

Thr Tyr Thr Cys Val Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Leu Val Thr

530 535 540

Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val

545 550 555 560

Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Gly Gly Thr Cys Tyr

565 570

<210> 5

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgatgtcct ctgctcagtt ccttggtctc ctgttgctct gttttcaagg aaccagatgt 60

<210> 6

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln

1 5 10 15

Gly Thr Arg Cys

20

<210> 7

<211> 642

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagc aattatttag actggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct aatctactac acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggaggaa 240

gaagatattg gcacttactt ttgccgacag gataaaacgc ttccgtggac gttcggtgga 300

ggcaccaagc tggaaatcaa acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360

tccagtgagc agttaacatc tggaggtgcc tcagtcgtgt gcttcttgaa caacttctac 420

cccaaagaca tcaatgtcaa gtggaagatt gatggcagtg aacgacaaaa tggcgtcctg 480

aacagttgga ctgatcagga cagcaaagac agcacctaca gcatgagcag caccctcacg 540

ttgaccaagg acgagtatga acgacataac agctatacct gtgaggccac tcacaagaca 600

tcaacttcac ccattgtcaa gagcttcaac aggaatgagt gt 642

<210> 8

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Glu

65 70 75 80

Glu Asp Ile Gly Thr Tyr Phe Cys Arg Gln Asp Lys Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala

100 105 110

Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly

115 120 125

Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile

130 135 140

Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu

145 150 155 160

Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr

180 185 190

Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Asn Glu Cys

210

Claims

1.一种用于贝氏柯克斯体I相株检测的试纸，其特征在于，所述试纸包括结合垫和与所述结合垫连接的分析膜；所述结合垫包被有UCP-单抗10复合物，所述UCP-单抗10复合物是用UCP标记单抗10得到的复合物；

所述单抗10是由重链和轻链组成的单克隆抗体，所述重链和所述轻链均由可变区和恒定区组成，所述可变区均由决定簇互补区和框架区组成，所述决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述单抗10的重链的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第26-33位所示；所述单抗10的重链的CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第51-60位所示；所述单抗10的重链的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第99-106位所示；所述单抗10的轻链的CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.8的第26-32位所示；所述单抗10的轻链的CDR2的氨基酸序列如SEQ IDNo.8的第50-52位所示；所述单抗10的轻链的CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.8的第89-97位所示。

2.根据权利要求1所述的试纸，其特征在于，所述单抗10的重链可变区的氨基酸序列为序列4中的第1-117位；所述单抗10的轻链可变区的氨基酸序列为序列8中的第1-107位。

3.根据权利要求1或2所述的试纸，其特征在于，所述单抗10的重链的氨基酸序列为序列4；所述单抗10的轻链的氨基酸序列为序列8。

4.根据权利要求1-3任一所述的试纸，其特征在于，所述质控带包被有与所述UCP-单抗10复合物特异结合的第二抗体。

5.一种单克隆抗体，所述单克隆抗体为如权利要求1-3任一所述单抗10。

6.根据权利要求5所述的单克隆抗体，所述单克隆抗体为鼠源单克隆抗体。

7.与权利要求5或6中所述的单克隆抗体相关的生物材料，所述生物材料为B1)至B16)中的任一种：

B1)编码权利要求5或6中所述的单克隆抗体的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系；

B11)含有B3)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B12)含有B4)所述重组载体的转基因动物细胞系；

B13)含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；

B14)含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B15)含有B3)所述重组载体的转基因植物细胞系；

B16)含有B4)所述重组载体的转基因植物细胞系。

8.根据权利要求7所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为编码权利要求5或6所述的单克隆抗体的基因。

9.根据权利要求8所述的生物材料，其特征在于：所述基因为如下A)或B)所述的DNA分子：

A)所述单抗10的重链的CDR1的编码序列如SEQ ID No.3的第76-99位所示；所述单抗10的重链的CDR2的编码序列如SEQ ID No.3的第151-180位所示；所述单抗10的重链的CDR3的编码序列如SEQ ID No.3的第295-318位所示；

所述单抗10的轻链的CDR1的编码序列如SEQ ID No.7的第79-96位所示；所述单抗10的轻链的CDR2的编码序列如SEQ ID No.7的第148-156位所示；所述单抗10的轻链的CDR3的编码序列如SEQ ID No.7的第267-291位所示；

10.一种用于检测的贝氏柯克斯体I相株的组合物，其特征在于，所述组合物的活性成分为权利要求1-3任一所述的单抗10。