CN109748973A

CN109748973A - 表达于t淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合及其应用

Info

Publication number: CN109748973A
Application number: CN201910107815.2A
Authority: CN
Inventors: 刘未斌; 刘曲波; 李琼书; 胡源
Original assignee: Shenzhen Mustard Zhihe Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Shenzhen Mustard Zhihe Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2019-02-02
Filing date: 2019-02-02
Publication date: 2019-05-14
Anticipated expiration: 2039-02-02
Also published as: CN109748973B

Abstract

本发明提供表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合及其应用，所述包括嵌合抗原受体1即Anti MUC1 synNotch具有如下顺序连接的三个部分：特异性识别MUC1蛋白的SCFV、Notch core和转录因子Gal4‑VP64；以及嵌合抗原受体2即Anti CD19 CAR具有如下的顺序连接的胞外结合区，铰链区和胞内信号区：特异性识别CD19蛋白的SCFV，IgD，CD28–4‑1BB–CD3ζ。所述嵌合抗原受体组合表达于T淋巴细胞表面，具有特异性识别MUC1和CD19蛋白的效果。

Description

表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合及其应用

技术领域

本发明涉及基因修饰细胞及肿瘤治疗技术领域，尤其涉及表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合及其应用。

背景技术

近年来发展的利用基因改造技术表达肿瘤特异性嵌合抗原受体(chimericantigen receptor，CAR)的T细胞显示出的靶向性、杀伤活性和持久性为过继性细胞免疫治疗注入了新的解决方案。嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)主要由两部分构成，一端位于细胞外，能够特异性识别癌细胞表面的某一抗原；另一端位于胞内，含有信号激活元件(如T细胞受体的Zeta链)，起传递信号激活T细胞的作用。这样表达CAR的T淋巴细胞(CAR-T细胞)就能避免T细胞受体识别靶细胞的限制，从而起到靶向癌细胞的杀伤作用。

第一代CAR-T细胞的临床研究源自治疗B细胞恶性肿瘤(通过靶向CD20或CD19抗原)显示出该方法的可行性；然而这些加工过的细胞缺乏显著的抗肿瘤活性，可能是因为CAR-T细胞的持久性不足。第二代和第三代CAR设计采用一个或两个共刺激信号域。临床研究显示第二代CAR提高了体内转染T细胞的作用范围和持久性。第三代CAR包含两个共刺激结构域。第四代“装甲”CAR-T细胞额外表达细胞因子或共刺激配体，其目的是增强CAR-T细胞的扩增和寿命。CAR-T细胞识别抗原不受MHC限制，目前，CAR-T细胞技术在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、脑胶质瘤等恶性肿瘤治疗中均显示出良好的抗肿瘤效应。

Mucin 1是膜结合型粘蛋白家族成员，简称MUC1。人类MUC1基因是第一个被克隆的黏蛋白基因，定位于人1q21，包含七个exons，其编码产物是一种高分子量糖蛋白(＞200kD)，糖链占整个粘蛋白含量的50％以上,且多以O-糖苷键与多肽骨架上的Ser/Thr相连。正常情况下，MUC1粘蛋白呈低水平表达于乳腺，胰腺，胃肠道，呼吸道及泌尿生殖道的分泌上皮细胞的近管腔面，呈顶端表达，极性分布。在大多数腺癌、血液系恶性肿瘤及上皮组织的炎性疾病中，MUC1呈异常过表达，并失去极性，遍布于整个细胞表面，可通过调控多个信号通路调节细胞恶性转化，是促进肿瘤发生与发展的重要癌基因。因此，MUC1蛋白可作为CAR-T细胞抗肿瘤治疗的一个理想靶点。

CD19是正常和恶性B淋巴细胞特异性表面蛋白，在B细胞的发育、增殖和分化以及恶性转化中发挥重要作用。因CD19在B淋巴细胞表达的特异性和恶性肿瘤表达的广泛性，使其成为一个颇具潜力的B淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点受到极大的关注。首先，CD19只在正常和恶性B细胞表达，几乎不在其他组织表达；其次，CD19在B细胞恶性转化过程中不丢失，难治/复发性病例仍然有效；再者，CD19在造血干细胞和pro-B细胞不表达，治疗停止后，B细胞可以得到有效地补充。基于良好的临床前和临床研究结果，靶向CD19的CAR修饰T细胞(CAR-T)产品已获FDA批准上市。值得注意的是，CAR-T疗法最大的临床风险就是细胞因子风暴。细胞因子风暴是由于CAR-T细胞杀伤B细胞后导致肿瘤细胞溶解所致，由于CAR-T的杀瘤作用在局部产生超大量的细胞因子，引起过强的免疫反应，导致炎症反应综合征，甚至危及生命。所以如何精细调控细胞因子的释放速度和水平，在保证CAR-T细胞杀伤活性的基础上，避免出现细胞因子风暴非常关键。

发明内容

本发明提供一种表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合，使得所述T淋巴细胞能特异性识别MUC1和CD19。

本发明还提供了编码所述嵌合抗原受体组合的核酸，包含所述核酸的表达载体，以及包含所述表达载体的病毒。

本发明还提供了所述嵌合抗原受体组合，或所述核酸，或所述表达载体，或所述病毒的用途，用于制备靶向MUC1和CD19的基因修饰的T淋巴细胞。

本发明还提供了一种基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达所述的嵌合抗原受体组合，使得所述T淋巴细胞能靶向MUC1和CD19。

本发明还提供了所述的基因修饰的T淋巴细胞的用途，用于制备抑制肿瘤的药物，所述肿瘤是MUC1和CD19阳性的肿瘤。

本发明提供的表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合，包括

嵌合抗原受体1即Anti MUC1 synNotch具有如下顺序连接的三个部分：特异性识别MUC1蛋白的SCFV、Notch core(即Notch信号核心元件)和转录因子Gal4-VP64；以及

嵌合抗原受体2即Anti CD19CAR具有如下的顺序连接的胞外结合区，铰链区和胞内信号区：特异性识别CD19蛋白的SCFV，IgD，CD28–4-1BB–CD3ζ

进一步的，所述嵌合抗原受体1具有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列。

更进一步的，所述嵌合抗原受体2具有SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，编码所述嵌合抗原受体1核苷酸序列具有SEQID NO:3所述的核苷酸序列，编码所述嵌合抗原受体2核苷酸序列具有SEQ ID NO:4所述的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述表达载体来源于慢病毒质粒，例如pGreenpuro。

本发明提供的一种基因修饰的T淋巴细胞，其转导有所述的核酸、或所述的表达载体或所述的病毒。

本发明提供的一种基因修饰的T淋巴细胞，其表面表达嵌合抗原受体组合，所述嵌合抗原受体组合包括具有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的所述嵌合抗原受体1以及具有SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列的所述嵌合抗原受体2。

本发明还提供了制备本发明所述的基因修饰的T淋巴细胞的方法，包括：慢病毒质粒载体的构建，慢病毒的包装，慢病毒的纯化，CD8+T淋巴细胞的分离，靶向MUC1和CD19的T淋巴细胞的制备。

其中，慢病毒质粒载体的构建：使用慢病毒表达载体pGreen puro，将酶切位点XbaI和BamHI、转录因子Gal4-VP64的结合序列，以及EF1启动子，酶切位点NheI和EcoRI插入到慢病毒表达载体pGreen puro的CMV启动子后面，获得改造后的慢病毒表达载体pGreenpuro。这对于本领域技术人员来说是可以通过常规手段实现的。

SEQ ID NO:3(编码所述嵌合抗原受体1的核苷酸序列)通过XbaI和BamHI酶切位点连到该载体上；SEQ ID NO:4(编码所述嵌合抗原受体2的核苷酸序列)通过酶切位点NheI和EcoRI连接到该载体上。

本发明的方案中，所述嵌合抗原受体1即Anti MUC1 synNotch分子在与MUC1抗原结合后可释放转录因子Gal4-VP64，该转录因子可结合到Anti CD19CAR分子的启动子前的转录因子结合位点(即转录因子Gal4-VP64的结合序列)上，促进所述嵌合抗原受体2即AntiCD19CAR基因表达，从而可靶向并杀伤CD19高表达的肿瘤细胞。

本发明方案具有以下优点：

1)本发明提供的基因修饰的T淋巴细胞，能够特异性识别和高效杀伤MUC1和CD19阳性的肿瘤。

2)嵌合抗原受体1在与MUC1抗原结合后发挥转录开关的作用，能控制嵌合抗原受体2表达，从而实现可控地并且特异性地识别和杀伤MUC1和CD19阳性表达的肿瘤。

附图说明

图1A显示了改造前慢病毒质粒载体pGreen puro的结构示意图,图1B显示了改造后的pGreen puro载体上，CMV启动子，酶切位点XbaI和BamHI、转录因子Gal4-VP64的结合序列，以及EF1启动子，酶切位点NheI和EcoRI的连接方式。

图2A是嵌合抗原受体1与嵌合抗原受体2的设计示意图。图2B是嵌合抗原受体1在与MUC1抗原结合后(发挥转录开关的作用)控制嵌合抗原受体2表达的示意图。

图3显示了本发明提供基因修饰的T淋巴细胞在体外对淋巴瘤细胞系Raji和采用siRNA沉默MUC1表达的Raji细胞的杀伤效果。

图4显示了本发明提供基因修饰的T淋巴细胞在体内治疗肿瘤效果。

图5显示了本发明提供基因修饰的T淋巴细胞在体内治疗肿瘤效果。

具体实施方式

实施例1靶向MUC1和CD19的T淋巴细胞的制备

1.慢病毒质粒载体的构建

1)合成并扩增编码本发明靶向MUC1和CD19的嵌合抗原受体组合的核苷酸序列SEQID NO:3和SEQ ID NO:4，由苏州泓迅生物科技有限公司完成；

2)连接酶切位点XbaI和BamHI、转录因子Gal4-VP64的结合序列，以及EF1启动子，和酶切位点NheI和EcoRI，并插入到慢病毒表达载体pGreen puro(其结构图如图1A所示)的CMV启动子的后面，获得改造后的慢病毒表达载体pGreen puro；CMV启动子与酶切位点XbaI和BamHI、转录因子Gal4-VP64的结合序列，以及EF1启动子，和酶切位点NheI和EcoRI的连接体的示意图如图1B所示；SEQ ID NO:3(编码所述嵌合抗原受体1的核苷酸序列)通过XbaI和BamHI酶切位点连到该载体上；SEQ ID NO:4(编码所述嵌合抗原受体2的核苷酸序列)通过酶切位点NheI和EcoRI连接到该载体上，上述步骤均由苏州泓迅生物科技有限公司完成。

2.慢病毒的包装

1)用含10％FBS的1640培养基培养293T细胞；然后将293T细胞以3x 10⁵/cm²的密度传至直径15cm的培养皿中培养20h，保证转染时细胞汇合度为80-90％；用不含血清的1640培养基换液，备用；

2)取两个EP管，分别在两个EP管中加入1ml 1640培养基；将改造后所述重组慢病毒载体pGreen puro(具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)与pMDLg PRRE、pRSV-Rev和pMD2.G质粒按照摩尔比1：1：1：1在EP管1中混匀，在EP管2中加入150ul lipo2000，混匀放置5min；将EP管2中混有lipo2000的1640培养基加入含有质粒的EP管1中，混匀得到混合液，室温放置20min；

3)然后将所述混合液逐滴加入上述制备的293T细胞的培养皿中，继续培养4h后，用含10％FBS的1640培养基更换培养液，继续培养48h后收集293T细胞的上清用于重组慢病毒纯化。

3.慢病毒的纯化

将293T细胞的上清用0.22μm过滤膜过滤，滤液收集在50ml超滤管中，3000g/min下离心45min；将剩余的浓缩液转移至EP管，放-80℃保存备用，获得含有重组慢病毒的浓缩液。

4.CD8+T淋巴细胞的分离

A、人全血倒入50ml离心管，室温700g下离心20分钟(普通离心)。

B、弃上清，在沉淀中加DPBS至50ml。

C：分别取25ml上述液体加到20ml人淋巴细胞分离液(购自北京索莱宝科技有限公司)，将离心管室温离心800g 15分钟。

D：取白膜层细胞，加入DPBS，补足至50ml。

E：离心600g 10分钟，弃上清液，得外周血单个核细胞PBMC。

F：采用CD8+T细胞磁珠分选试剂盒(购自德国美天旎)分选CD8+T细胞。

5.靶向MUC1和CD19的T淋巴细胞的制备

重组慢病毒感染CD8+T淋巴细胞：

用含10％胎牛血清(购自Gibco-BRL)的RPMI 1640完全培养基(RPMI 1640购自Gibco-BRL,添加胎牛血清后即为RPMI 1640完全培养基)培养CD8+T细胞。

第一天：加入抗CD3单克隆抗体(购自北京同立海源生物科技有限公司)对CD8+T细胞进行活化；

第三天：将活化的CD8+T细胞分为实验组和对照组

1)实验组，在4x10⁶个活化的CD8+T细胞中加入150MOI的重组慢病毒；

2)对照组，不做处理；

16h后将培养基更换为含有50IU/ml重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基(IL-2购自北京同立海源生物科技有限公司)，继续培养10-20天，然后观察T淋巴细胞生长情况。结果显示：细胞在感染病毒后，能够形成典型的增殖克隆团。

第十四天，将实验组CD8+T细胞，以600g的离心力离心10min，弃尽上清以收集CD8+T细胞沉淀；再用PBS溶液重悬CD8+T细胞，并将CD8+T细胞调整密度为1x 10⁷个/ml；将100μl的CD8+T细胞置于EP管，加入10μl FITC标记小鼠抗人CD8单克隆抗体(购自BD公司)和10μlPE标记的羊抗鼠F(ab)2抗体(购自Coulter公司)；4℃孵育30min，PBS溶液洗涤2次，上流式细胞仪检测嵌合抗原受体1，嵌合抗原受体2(在添加MUC1抗原后)的正确表达，说明获得了靶向MUC1和CD19的T淋巴细胞。图2A显示了嵌合抗原受体1与嵌合抗原受体2的设计示意图。图2B显示了嵌合抗原受体1在与MUC1抗原结合后(发挥转录开关的作用)控制嵌合抗原受体2表达的示意图。

实施例2本发明提供基因修饰的CD8+T淋巴细胞在体外治疗肿瘤效果验证

a、以稳定表达MUC1和CD19的淋巴瘤细胞系Raji(MUC1和CD19双阳性表达，购自ATCC)作为靶细胞，将其分为2组。

将实施例1中制备的靶向MUC1和CD19的CD8+T淋巴细胞(即开关-CAR-T细胞)作为效应细胞1；还有未感染病毒的CD8+T细胞作为效应细胞2；

1)实验组(即开关-CAR-T细胞/Raji)，以5:1，10:1，20:1效靶比将效应细胞1加入第一组靶细胞；

2)对照组(即T细胞/Raji)，以5:1，10:1，20:1效靶比将效应细胞2加入第二组靶细胞；

具体的，将靶细胞按照密度1x 10⁵个/ml接种96孔板，每孔100μl，然后按照上述1)-2)加入效应细胞，置于5％CO₂，37℃培养箱培养4h。采用WST-1检测细胞活力，计算杀伤效率。

b、以稳定表达MUC1和CD19的采用siRNA沉默MUC1表达的Raji细胞(仅CD19阳性表达)作为靶细胞，将其分为2组。

将实施例1中制备的靶向MUC1和CD19的CD8+T淋巴细胞(即开关-CAR-T细胞)作为效应细胞1；还有未感染病毒的CD8+T细胞作为效应细胞3；

1)实验组(即开关-CAR-T细胞/Raji-MUC1siRNA)，以5:1，10:1，20:1效靶比将效应细胞1加入第一组靶细胞；

2)对照组(即T细胞/Raji-MUC1siRNA)，以5:1，10:1，20:1效靶比将效应细胞2加入第二组靶细胞；

结果如图3所示，可以看出，与T细胞组相比，靶向MUC1和CD19的T淋巴细胞(即开关-CAR-T细胞)对MUC1和CD19阳性淋巴瘤细胞系Raji具有很强的杀伤作用；采用siRNA沉默Raji细胞的MUC1表达之后，靶向MUC1和CD19的T淋巴细胞(即开关-CAR-T细胞)失去了对Raji细胞的杀伤作用。说明嵌合抗原受体1在与MUC1抗原结合后(发挥转录开关的作用)，能控制嵌合抗原受体2表达，即能可控地特异性地识别和杀伤MUC1和CD19阳性表达的肿瘤。

实施例3本发明提供基因修饰的T淋巴细胞在体内治疗肿瘤效果验证

在30只裸鼠(6周龄，体重18～20g，购自广东省医学实验动物中心)，其中15只右腋下皮下注射5x 10⁶淋巴瘤细胞系Raji(MUC1和CD19双阳性表达，购自ATCC)，另外15只皮下注射siRNA沉默MUC1表达的Raji细胞(仅CD19阳性表达)，观察小鼠是否出现肿瘤，待肿瘤长到60mm³大小，将其随机分为3组。

a.MUC1和CD19双阳性表达的肿瘤细胞移植瘤小鼠

1)对照组(对照/Raji)，尾静脉注射生理盐水200ul/次，每周2次；

2)T细胞治疗组(T细胞/Raji)，分别尾静脉注射没有经过病毒感染的CD8+T细胞1×10⁷个/次，每周2次；

3)靶向MUC1和CD19的T淋巴细胞治疗组(开关-CAR-T细胞/Raji)：尾静脉注射实施例1制备靶向MUC1和CD19的T淋巴细胞1×10⁷个/次，每周2次。

b.CD19阳性表达的肿瘤细胞移植瘤小鼠

1)对照组(对照/Raji-MUC1siRNA)，尾静脉注射生理盐水200ul/次，每周2次；

2)T细胞治疗组(T细胞/Raji-MUC1 siRNA)，分别尾静脉注射没有经过病毒感染的CD8+T细胞1×10⁷个/次，每周2次；

3)靶向MUC1和CD19的T淋巴细胞治疗组(开关-CAR-T细胞/Raji-MUC1 siRNA)：尾静脉注射实施例1制备靶向MUC1和CD19的T淋巴细胞1×10⁷个/次，每周2次。

c.统计100天内小鼠生存状态，做生存率曲线，实验结果如图4-5所示。

可以看出，与对照组和T细胞组比较，靶向MUC1和CD19的T淋巴细胞(即开关-CAR-T细胞)可延长MUC1和CD19双阳性表达的肿瘤细胞移植瘤小鼠模型的生存期(图4)，采用siRNA沉默Raji细胞的MUC1表达之后，靶向MUC1和CD19的T淋巴细胞(即开关-CAR-T细胞)失去了对Raji细胞的杀伤作用，因此对CD19阳性表达的肿瘤细胞移植瘤小鼠的生存期没有显著影响(图5)。

序列表

<110> 深圳市芥至和生物科技有限公司

<120> 表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合及其应用

<130> CNCNP201811694

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 819

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asp

20 25 30

Ile Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu Thr

35 40 45

Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn

50 55 60

Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly Leu

65 70 75 80

Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

85 90 95

Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln

100 105 110

Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn His

115 120 125

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Glu Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

145 150 155 160

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Met

165 170 175

Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp Met

180 185 190

Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu

195 200 205

Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser Val

210 215 220

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr

225 230 235 240

Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys

245 250 255

Thr Phe Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr

260 265 270

Val Ser Ser Ile Leu Asp Tyr Ser Phe Thr Gly Gly Ala Gly Arg Asp

275 280 285

Ile Pro Pro Pro Gln Ile Glu Glu Ala Cys Glu Leu Pro Glu Cys Gln

290 295 300

Val Asp Ala Gly Asn Lys Val Cys Asn Leu Gln Cys Asn Asn His Ala

305 310 315 320

Cys Gly Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Asn Phe Asn Asp Pro Trp

325 330 335

Lys Asn Cys Thr Gln Ser Leu Gln Cys Trp Lys Tyr Phe Ser Asp Gly

340 345 350

His Cys Asp Ser Gln Cys Asn Ser Ala Gly Cys Leu Phe Asp Gly Phe

355 360 365

Asp Cys Gln Leu Thr Glu Gly Gln Cys Asn Pro Leu Tyr Asp Gln Tyr

370 375 380

Cys Lys Asp His Phe Ser Asp Gly His Cys Asp Gln Gly Cys Asn Ser

385 390 395 400

Ala Glu Cys Glu Trp Asp Gly Leu Asp Cys Ala Glu His Val Pro Glu

405 410 415

Arg Leu Ala Ala Gly Thr Leu Val Leu Val Val Leu Leu Pro Pro Asp

420 425 430

Gln Leu Arg Asn Asn Ser Phe His Phe Leu Arg Glu Leu Ser His Val

435 440 445

Leu His Thr Asn Val Val Phe Lys Arg Asp Ala Gln Gly Gln Gln Met

450 455 460

Ile Phe Pro Tyr Tyr Gly His Glu Glu Glu Leu Arg Lys His Pro Ile

465 470 475 480

Lys Arg Ser Thr Val Gly Trp Ala Thr Ser Ser Leu Leu Pro Gly Thr

485 490 495

Ser Gly Gly Arg Gln Arg Arg Glu Leu Asp Pro Met Asp Ile Arg Gly

500 505 510

Ser Ile Val Tyr Leu Glu Ile Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Ser Ser

515 520 525

Ser Gln Cys Phe Gln Ser Ala Thr Asp Val Ala Ala Phe Leu Gly Ala

530 535 540

Leu Ala Ser Leu Gly Ser Leu Asn Ile Pro Tyr Lys Ile Glu Ala Val

545 550 555 560

Lys Ser Glu Pro Val Glu Pro Pro Leu Pro Ser Gln Leu His Leu Met

565 570 575

Tyr Val Ala Ala Ala Ala Phe Val Leu Leu Phe Phe Val Gly Cys Gly

580 585 590

Val Leu Leu Ser Arg Lys Arg Arg Arg Gln Leu Cys Ile Gln Lys Leu

595 600 605

Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu

610 615 620

Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu

625 630 635 640

Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro

645 650 655

Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu

660 665 670

Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile

675 680 685

Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu

690 695 700

Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala

705 710 715 720

Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser

725 730 735

Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu

740 745 750

Thr Val Ser Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Asp

755 760 765

Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp

770 775 780

Asp Phe Asp Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp

785 790 795 800

Leu Asp Met Leu Gly Ser Asp Ala Leu Asp Asp Phe Asp Leu Asp Met

805 810 815

Leu Gly Ser

<210> 2

<211> 597

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser

35 40 45

Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly

50 55 60

Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val

65 70 75 80

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr

85 90 95

Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

100 105 110

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile

115 120 125

Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala

145 150 155 160

Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu

165 170 175

Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser

195 200 205

Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln

210 215 220

Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr

225 230 235 240

Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

245 250 255

Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Phe Thr Cys Phe

260 265 270

Val Val Gly Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala

275 280 285

Gly Lys Val Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His

290 295 300

Ser Asn Gly Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser

305 310 315 320

Leu Trp Asn Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser

325 330 335

Leu Pro Pro Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala

340 345 350

Pro Val Lys Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu

355 360 365

Ala Ala Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr

370 375 380

Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys

385 390 395 400

Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg

405 410 415

Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp

420 425 430

Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys

435 440 445

Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr

450 455 460

Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu

465 470 475 480

Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro

485 490 495

Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly

500 505 510

Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro

515 520 525

Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr

530 535 540

Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly

545 550 555 560

Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln

565 570 575

Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln

580 585 590

Ala Leu Pro Pro Arg

595

<210> 3

<211> 2460

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atggctctgc cagtgacagc tctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgcagctaga 60

ccagagcaga agctgatcag cgaggaggac ctggacatcg tggtgacaca ggagagcgct 120

ctgacaacat ctccaggcga gaccgtgacc ctgacttgta gaagcagcac cggagccgtg 180

accaccagca actacgccaa ttgggtgcag gagaagcccg accatctgtt caccggactg 240

atcggcggca ccaataacag agccccagga gtgccagcca gattcagcgg aagcctgatc 300

ggcgataagg ccgccctgac aatcacagga gcccagaccg aggacgaggc catctacttt 360

tgcgccctct ggtacagcaa ccattgggtg tttggcggcg gcacaaagct gacagtgctg 420

ggatctgagg gaggaggagg aagcggagga ggaggaagcg gaggaggagg aagcgaagtg 480

cagctgcagc agtcaggagg aggactggtg cagccaggcg gaagcatgaa gctgtcttgc 540

gtggccagcg gcttcacctt cagcaactac tggatgaatt gggtccggca gagcccagag 600

aaaggactcg agtgggtggc agagatccgg ctgaagagca acaactacgc cacccactac 660

gccgaaagcg tgaagggcag gttcaccatc agcagggacg acagcaagag cagcgtgtac 720

ctgcagatga acaacctgag ggccgaggac accggcatct actattgcac cttcggcaac 780

agcttcgcct attggggcca gggaacaacc gtgaccgtgt ccagcatcct ggactacagc 840

ttcacaggcg gagccggcag agatatccct ccacctcaga tcgaggaggc ttgcgaactg 900

ccagagtgtc aggtggacgc cggaaacaag gtctgcaacc tccagtgcaa caaccacgct 960

tgcggatggg acggaggaga ttgtagcctg aacttcaacg acccttggaa gaattgcacc 1020

cagagcctcc agtgttggaa gtacttctcc gacggccatt gcgacagcca gtgtaactcc 1080

gccggttgcc tgtttgacgg cttcgattgc cagctgacag aaggccagtg caatcccctg 1140

tacgaccagt attgcaagga ccacttcagc gacggccatt gcgaccaggg ctgtaattcc 1200

gccgaatgcg agtgggacgg actggattgc gcagaacacg tgccagagag actggcagca 1260

ggaacactgg tgctggtggt gctgctgcct ccagaccagc tgcggaacaa cagcttccac 1320

ttcctgcggg aactgtctca cgtgctgcac accaacgtcg tgttcaagcg ggacgctcag 1380

ggacagcaga tgatcttccc ctactacggc cacgaagagg agctgaggaa gcaccccatc 1440

aagaggagca ccgtgggttg ggccacatct tctctgctgc caggaacctc cggaggaaga 1500

cagagaaggg agctggaccc catggacatc aggggcagca tcgtgtacct ggagatcgac 1560

aaccgccagt gcgtgcagtc ttctagccag tgtttccaga gcgctacaga cgtggccgct 1620

tttctgggag ctctggcttc tctgggcagc ctgaacatcc cctacaagat cgaggccgtg 1680

aagagcgagc cagtggaacc tcctctgcct tctcagctgc acctgatgta cgtggcagcc 1740

gcagccttcg tgctgctgtt tttcgtgggc tgcggcgtgc tgctgagcag aaagaggagg 1800

cgccagctct gcatccagaa gctgatgaag ctgctgagca gcatcgagca ggcttgcgat 1860

atctgccggc tgaagaagct caagtgctcc aaggagaagc ccaagtgcgc caagtgcctc 1920

aagaacaatt gggagtgccg gtacagcccc aagaccaaga gaagccccct gaccagagcc 1980

cacctgaccg aagtggagag cagactggag cgcctggagc agctgttcct gctgatcttc 2040

cccagggagg acctggacat gatcctgaag atggacagcc tgcaggacat caaggccctg 2100

ctgacaggcc tgttcgtgca ggacaacgtc aacaaggacg ccgtgaccga cagactggct 2160

agcgtggaga cagacatgcc cctgacactg aggcagcaca gaatcagcgc caccagctct 2220

agcgaggaga gcagcaacaa gggccagaga cagctgaccg tgtcagcagc agcaggaggt 2280

tctggaggaa gcggaggaag cgacgctctg gacgacttcg atctggacat gctgggcagc 2340

gacgctctgg acgacttcga cctggacatg ctgggaagcg acgccctgga cgatttcgat 2400

ctggacatgc tgggatcaga cgctctggac gacttcgacc tggacatgct gggctcttaa 2460

<210> 4

<211> 1791

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgctgctgc tggtgacaag cctgctgctc tgcgaactgc ctcatccagc cttcctgctg 60

atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tcttctctga gcgcctctct gggcgacaga 120

gtgacaatct cttgcagggc cagccaggac atcagcaagt acctgaattg gtaccagcag 180

aagccagacg gcaccgtgaa gctgctgatc taccacacca gcagactgca cagcggagtg 240

cctagcagat tcagcggcag cggaagcgga accgactaca gcctgaccat cagcaacctg 300

gagcaggagg acatcgccac ctacttctgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttc 360

ggaggaggca caaagctgga gatcacaggc tctacaagcg gcagcggcaa accaggaagc 420

ggagagggct ctaccaaggg cgaagtgaag ctgcaggaat caggaccagg actggtggct 480

ccttctcaga gcctgagcgt gacttgcacc gtgtccggag tgtctctgcc agactacgga 540

gtgtcttgga tcaggcagcc ccccagaaag ggactcgagt ggctgggagt gatttgggga 600

agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660

agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga cagacgacac cgccatctac 720

tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactattg gggacagggc 780

accagcgtga cagtgtccag caccttcacc tgcttcgtcg tgggaagcga cctgaaggac 840

gctcacctga cttgggaggt ggcaggaaag gtgccaacag gaggagtgga ggaaggactg 900

ctggagagac acagcaacgg ctctcagagc cagcacagca gactgaccct gcctagaagc 960

ctctggaacg ccggaacaag cgtgacttgc accctgaacc acccttctct gcctcctcag 1020

agactgatgg ccctgagaga gccagcagct caggctccag tgaagctgtc cctgaacctg 1080

ctggcctctt cagatcctcc agaagccgct ttttgggtgc tggtggtcgt gggaggagtg 1140

ctggcttgtt acagcctgct ggtgaccgtg gccttcatca tcttctgggt ccggagcaag 1200

agaagcagac tgctgcacag cgactacatg aacatgaccc cccggaggcc aggccctacc 1260

agaaagcact accagcccta cgcccctcct agagatttcg ccgcctacag aagcagattc 1320

agcgtggtga agaggggcag gaagaagctg ctgtacatct tcaagcagcc cttcatgcgg 1380

ccagtgcaga caacccagga ggaagacggt tgctcttgca ggttccccga ggaagaagag 1440

ggcggttgcg agctgagagt gaagttcagc agaagcgccg aacctccagc ctatcagcag 1500

ggccagaacc agctgtacaa cgagctgaac ctgggcagga gggaggaata cgacgtgctg 1560

gacaagagga ggggcagaga tccagagatg ggcggcaagc ctaggagaaa gaaccctcag 1620

gagggcctgt acaacgagct gcagaaggac aagatggccg aggcctacag cgagatcggc 1680

atgaagggcg agaggagaag gggaaaggga cacgacggac tgtaccaggg actgagcaca 1740

gccaccaagg acacctacga cgctctgcac atgcaggctc tgcctcctag a 1791

Claims

1.表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合，其特征在于，包括

嵌合抗原受体1即Anti MUC1 synNotch具有如下顺序连接的三个部分：特异性识别MUC1蛋白的SCFV、Notch core和转录因子Gal4-VP64；以及

嵌合抗原受体2即Anti CD19 CAR具有如下的顺序连接的胞外结合区，铰链区和胞内信号区：特异性识别CD19蛋白的SCFV，IgD，CD28–4-1BB–CD3ζ。

2.根据权利要求1所述的表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合，所述嵌合抗原受体1具有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的表达于T淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合，所述嵌合抗原受体2具有SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列。

4.编码权利要求1-3任一项所述嵌合抗原受体组合的核酸。

5.如权利要求4所述的核酸，其特征在于，编码所述嵌合抗原受体1核苷酸序列具有SEQID NO:3所述的核苷酸序列，编码所述嵌合抗原受体2核苷酸序列具有SEQ ID NO:4所述的核苷酸序列。

6.一种表达载体，其特征在于，其包含权利要求4或5所述的核酸。

7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体来源于慢病毒质粒。

8.一种病毒，其特征在于，其包含权利要求6或7所述的表达载体。

9.权利要求1-3任一项所述嵌合抗原受体组合、或权利要求4或5所述的核酸、或权利要求6或7所述的表达载体或权利要求8所述的病毒的用途，用于制备靶向MUC1和CD19的基因修饰的T淋巴细胞。

10.一种基因修饰的T淋巴细胞，其特征在于，其转导有权利要求4或5所述的核酸、或权利要求6或7所述的表达载体或权利要求8所述的病毒。

11.一种基因修饰的T淋巴细胞，其特征在于，其表面表达嵌合抗原受体组合，所述嵌合抗原受体组合包括具有SEQ ID NO:1所述的氨基酸序列的所述嵌合抗原受体1以及具有SEQID NO:2所述的氨基酸序列的所述嵌合抗原受体2。

12.权利要求10或11所述的基因修饰的T淋巴细胞的用途，其特征在于，用于制备抑制肿瘤的药物，所述肿瘤是MUC1和CD19阳性的肿瘤。