CN111875712A - 一种增强型靶向muc1的嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种增强型靶向MUC1的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域包括抗MUC1单链抗体；所述信号转导结构域包括4‑1BB、CD3ζ和TLR2。本发明的嵌合抗原受体不仅对MUC1阳性肿瘤细胞具有靶向作用，而且可以高效激活T细胞、消除调节性T细胞免疫抑制作用、促进记忆性T细胞的形成，构建的表达嵌合抗原受体的T细胞具有显著增强的肿瘤细胞杀伤能力。

Description

一种增强型靶向MUC1的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种增强型靶向MUC1的嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)由肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区以及胞内信号转导区组成。通常，CAR分子包含的抗体单链片段可变区(single chain fragment variable，scFv)对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)具有特异性结合作用，其通过铰链和跨膜区与信号传导分子的胞质结构域偶联。

近年来，随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。目前，CAR-T细胞疗法已经广泛应用于治疗B细胞恶性肿瘤，靶向CD19的CAR-T细胞是CAR-T疗法治疗B细胞恶性肿瘤的先驱，为治疗B细胞恶性肿瘤提供了有效方案。然而，CAR-T疗法始终面临着肿瘤复发、抗药的问题。

因此，有必要对嵌合抗原受体进行进一步改进，不仅提高嵌合抗原受体对肿瘤抗原的靶向结合能力，而且提高嵌合抗原受体对T细胞的活性激活功能。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种增强型靶向MUC1的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体不仅对MUC1阳性肿瘤细胞具有靶向作用，而且可以高效激活T细胞，在治疗实体瘤方面具有广阔的前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；

所述抗原结合结构域包括抗MUC1单链抗体；

所述信号转导结构域包括4-1BB、CD3ζ和TLR2。

本发明中，采用抗MUC1单链抗体作为抗原结合结构域，与信号传导结构域连接后构建嵌合抗原受体，对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，对T细胞具有高效的激活作用。

优选地，所述抗原结合结构域包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

DIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEGGSGSGGSGSGGSGSEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSS。

优选地，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α。

优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。

优选地，所述信号肽包括GM-CSF信号肽。

优选地，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗MUC1单链抗体、CD8α、4-1BB、CD3ζ和TLR2串联组成。

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；

SEQ ID NO:2：

MLLLVTSLLLCELPHPAFLLDIVVTQESALTTSPGETVTLTCRSSTGAVTTSNYANWVQEKPDHLFTGLIGGTNNRAPGVPARFSGSLIGDKAALTITGAQTEDEAIYFCALWYSNHWVFGGGTKLTVLGSEGGSGSGGSGSGGSGSEVQLQQSGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYATHYAESVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTFGNSFAYWGQGTTVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRQAKRKPRKAPSRNICYDAFVSYSERDAYWVENLMVQELENFNPPFKLCLHKRDFIPGKWIIDNIIDSIEKSHKTVFVLSENFVKSEWCKYELDFSHFRLFDENNDAAILILLEPIEKKAIPQRFCKLRKIMNTKTYLEWPMDEAQREGFWVNLRAAIKS。

第二方面，本发明提供了一种编码基因，所述编码基因编码第一方面所述的嵌合抗原受体。

优选地，所述编码基因包括抗MUC1单链抗体编码序列。

优选地，所述编码基因还包括GM-CSF信号肽编码序列、CD8α编码序列、4-1BB编码序列、CD3ζ编码序列和TLR2编码序列。

优选地，所述编码基因包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列；

SEQ ID NO:3：

atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctggatatcgttgtgactcaggaatctgcactcaccacatcacctggtgaaacagtcacactcacttgtcgctcaagtactggggctgttacaacaagtaactatgccaactgggtccaagaaaaaccagatcatttattcactggtctaataggtggtaccaacaaccgagcaccaggtgttcctgccagattctcaggctccctgattggagacaaggctgccctcaccatcacaggggcacagactgaggatgaggcaatatatttctgtgctctatggtacagcaaccattgggtgttcggtggaggaaccaaactgactgtcctaggatccgagggtggctcaggatcgggtggatcaggctctggtggctcaggatcggaggtccagctgcagcagtcaggaggaggcttggtgcaacctggaggatccatgaaactctcctgtgttgcctctggattcactttcagtaactactggatgaactgggtccgccagtctccagagaaggggcttgagtgggttgctgaaattagattgaaatctaataattatgcaacacattatgcggagtctgtgaaagggaggttcaccatctcaagagatgattccaaaagtagtgtctacctgcaaatgaacaacttaagagctgaagacactggcatttattactgtacctttggtaactcctttgcttactggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgccaggccaaaaggaagcccaggaaagctcccagcaggaacatctgctatgatgcatttgtttcttacagtgagcgggatgcctactgggtggagaaccttatggtccaggagctggagaacttcaatccccccttcaagttgtgtcttcataagcgggacttcattcctggcaagtggatcattgacaatatcattgactccattgaaaagagccacaaaactgtctttgtgctttctgaaaactttgtgaagagtgagtggtgcaagtatgaactggacttctcccatttccgtctttttgatgagaacaatgatgctgccattctcattcttctggagcccattgagaaaaaagccattccccagcgcttctgcaagctgcggaagataatgaacaccaagacctacctggagtggcccatggacgaggctcagcgggaaggattttgggtaaatctgagagct gcgataaagtcc。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体为含有第二方面所述的编码基因的慢病毒载体。

第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒为转染有第三方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞。

第五方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体T细胞，所述嵌合抗原受体T细胞表达第一方面所述的嵌合抗原受体。

优选地，所述嵌合抗原受体T细胞的基因组中整合有第二方面所述的编码基因。

优选地，所述嵌合抗原受体T细胞包括第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。

第六方面，本发明提供了一种第五方面所述的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，所述方法包括将第一方面所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞的步骤。

第七方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的编码基因、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的嵌合抗原受体T细胞在制备疾病治疗药物中的应用。

优选地，所述疾病包括肿瘤。

优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明构建的嵌合抗原受体采用抗MUC1单链抗体作为抗原结合结构域，与信号传导结构域4-1BB、CD3ζ和TLR2连接后构建嵌合抗原受体，对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，对T细胞具有显著提高的激活活性，消除调节性T细胞免疫抑制作用、促进记忆性T细胞的形成；

(2)本发明构建的表达嵌合抗原受体的T细胞对MUC1阳性肿瘤细胞具有显著的清除杀伤作用。

附图说明

图1为WT、αMUC1-CAR-T、αMUC1-CAR-T2-T对MUC1阴性细胞的杀伤效率；

图2为WT、αMUC1-CAR-T、αMUC1-CAR-T2-T对MUC1阳性细胞的杀伤效率；

图3为CAR-T与检测细胞共培养后颗粒酶B的分泌。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1CAR分子载体的构建

本实施例构建了抗原结合结构域为抗MUC1单链抗体、信号转导结构域为4-1BB、CD3ζ和TLR2的嵌合抗原受体αMUC1-CAR-T2，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，核酸序列如SEQ ID NO:3所示；

首先基因合成αMUC1-CAR-T2嵌合抗原受体的编码基因(SEQ ID NO:3)，并在编码基因的5’端和3’端分别添加限制性内切酶Pme1酶切位点及其保护碱基和限制性内切酶Spe1酶切位点及其保护碱基；

利用限制性内切酶Pme1和Spe1对编码基因进行双酶切，37℃水浴中孵育30min，琼脂凝胶电泳回收获得含有粘性末端的酶切产物，连接入同样经Pme1和Spe1双酶切的线性化pWPXLd-eGFP质粒(含粘性末端)中，连接反应在T4 DNA聚合酶(Invitrogent公司)的参与下进行，得到含有αMUC1-CAR-T2的编码基因的慢病毒载体。

本实施例同时构建αMUC1-CAR(antiMUC1 scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ)，并构建相应的慢病毒载体。

实施例2慢病毒包装

将实施例1构建的慢病毒载体转入大肠杆菌，挑选阳性单克隆进行过夜培养，利用质粒提取试剂盒提取慢病毒载体，进行病毒包装；

使用293T细胞进行病毒包装，配制包装体系，pWPXLd-表达质粒包括含有αMUC1-CAR-T2的编码基因的慢病毒载体和含有αMUC1-CAR的编码基因的慢病毒载体，pWPXLd-eGFP质粒为不含有CAR编码基因的空载体；

将辅助质粒和带有CAR分子的慢病毒载体同时转染293T细胞，分别于48h和72h后收取第一和第二次病毒，过滤后冻于-80℃，以备免疫细胞转导使用。

实施例3T细胞激活和慢病毒转染

从成人外周血中分离单个核细胞(PBMC)，使用T细胞分选试剂盒将总T细胞分选出来，经过CD3和CD28抗体体外刺激24小时后，加入实施例2制备的过表达CAR分子的重组慢病毒；

转导12h后，对T细胞进行离心换液；转导三天后，利用流式细胞术测定GFP阳性细胞含量，评估CAR-T的比例；

按照每毫升培养基培养2×10⁶个细胞的密度培养扩增CAR-T细胞，获得αMUC1-CAR-T2-T、αMUC1-CAR-T和WT(转染空白对照eGFP慢病毒)细胞，十天后将细胞冻存，待用。

实施例4CAR-T细胞的功能评估

本实施例采用实施例3制备的CAR-T细胞实施体外杀伤，步骤如下：

首先，计数MUC1阴性细胞K562、MUC1阳性细胞K562-MUC1、αMUC1-CAR-T2-T细胞、αMUC1-CAR-T细胞和WT细胞，于白色平底96孔板中，将CAR-T细胞与K562或K562-MUC1按照4:1、2:1、1:1、1:2、1:4和1:8比例接种，使用200μL含5％胎牛血清的IMDM培养基共培养24h；

共培养结束后，向每孔中加入100μL含有Luciferase荧光底物的PBS，使用多功能酶标仪测定发光强度，经计算后得到体外杀伤效果折线图，直观对比αMUC1-CAR-T2-T细胞、αMUC1-CAR-T细胞和WT细胞对靶细胞的体外杀伤能力。

如图1和图2所示，αMUC1-CAR-T2-T细胞对表达MUC1的肿瘤靶细胞的杀伤效率显著高于αMUC1-CAR-T细胞和WT细胞，在E:T很小的情况下，即肿瘤细胞数量远大于效应T细胞数量，αMUC1-CAR-T2-T细胞也能表现出很强的肿瘤杀伤活性。

实施例5

分别将K562、K562-MUC1细胞按照5×10⁵细胞/孔的密度接种24孔板，随后加入WT、αMUC1-CAR-T或αMUC1-CAR-T2-T，于孵箱中共培养12h；采用颗粒酶B(Granzyme B)ELISA检测试剂盒对共培养上清进行检测。

如图3所示，αMUC1-CAR-T2-T细胞分泌颗粒酶B的水平高于αMUC1-CAR-T和WT，说明αMUC1-CAR-T2-T在杀伤肿瘤细胞的同时能够分泌多种细胞因子发挥杀伤功能。

综上所述，本发明采用抗MUC1单链抗体作为抗原结合结构域，与含有TLR2的信号传导结构域连接后构建嵌合抗原受体，对肿瘤细胞具有明显的靶向作用，对T细胞具有高效的激活作用；表达所述嵌合抗原受体的免疫细胞肿瘤细胞具有显著的清除杀伤作用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

序列表

<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司

<120> 一种增强型靶向MUC1的嵌合抗原受体及其应用

<130> 2020

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Asp Ile Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Glu

100 105 110

Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Glu

115 120 125

Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

130 135 140

Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp

145 150 155 160

Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

165 170 175

Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser

180 185 190

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val

195 200 205

Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr

210 215 220

Cys Thr Phe Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser

<210> 2

<211> 646

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Asp Ile Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr

20 25 30

Ser Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala

35 40 45

Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His

50 55 60

Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val

65 70 75 80

Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr

85 90 95

Ile Thr Gly Ala Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu

100 105 110

Trp Tyr Ser Asn His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

115 120 125

Leu Gly Ser Glu Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His

195 200 205

Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser

210 215 220

Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr

225 230 235 240

Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Phe Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

305 310 315 320

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly

325 330 335

Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val

340 345 350

Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu

355 360 365

Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp

370 375 380

Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn

385 390 395 400

Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg

405 410 415

Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly

420 425 430

Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu

435 440 445

Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu

450 455 460

Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His

465 470 475 480

Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gln Ala Lys Arg Lys Pro Arg Lys Ala

485 490 495

Pro Ser Arg Asn Ile Cys Tyr Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ser Glu Arg

500 505 510

Asp Ala Tyr Trp Val Glu Asn Leu Met Val Gln Glu Leu Glu Asn Phe

515 520 525

Asn Pro Pro Phe Lys Leu Cys Leu His Lys Arg Asp Phe Ile Pro Gly

530 535 540

Lys Trp Ile Ile Asp Asn Ile Ile Asp Ser Ile Glu Lys Ser His Lys

545 550 555 560

Thr Val Phe Val Leu Ser Glu Asn Phe Val Lys Ser Glu Trp Cys Lys

565 570 575

Tyr Glu Leu Asp Phe Ser His Phe Arg Leu Phe Asp Glu Asn Asn Asp

580 585 590

Ala Ala Ile Leu Ile Leu Leu Glu Pro Ile Glu Lys Lys Ala Ile Pro

595 600 605

Gln Arg Phe Cys Lys Leu Arg Lys Ile Met Asn Thr Lys Thr Tyr Leu

610 615 620

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Arg Ala Ala Ile Lys Ser

645

<210> 3

<211> 1938

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

gatatcgttg tgactcagga atctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 120

acttgtcgct caagtactgg ggctgttaca acaagtaact atgccaactg ggtccaagaa 180

aaaccagatc atttattcac tggtctaata ggtggtacca acaaccgagc accaggtgtt 240

cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggggca 300

cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acagcaacca ttgggtgttc 360

ggtggaggaa ccaaactgac tgtcctagga tccgagggtg gctcaggatc gggtggatca 420

ggctctggtg gctcaggatc ggaggtccag ctgcagcagt caggaggagg cttggtgcaa 480

cctggaggat ccatgaaact ctcctgtgtt gcctctggat tcactttcag taactactgg 540

atgaactggg tccgccagtc tccagagaag gggcttgagt gggttgctga aattagattg 600

aaatctaata attatgcaac acattatgcg gagtctgtga aagggaggtt caccatctca 660

agagatgatt ccaaaagtag tgtctacctg caaatgaaca acttaagagc tgaagacact 720

ggcatttatt actgtacctt tggtaactcc tttgcttact ggggccaagg gaccacggtc 780

accgtctcct caaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 960

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca aacggggcag aaagaaactc 1020

ctgtatatat tcaaacaacc atttatgaga ccagtacaaa ctactcaaga ggaagatggc 1080

tgtagctgcc gatttccaga agaagaagaa ggaggatgtg aactgagagt gaagttcagc 1140

aggagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1200

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1260

gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1320

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1380

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1440

atgcaggccc tgccccctcg ccaggccaaa aggaagccca ggaaagctcc cagcaggaac 1500

atctgctatg atgcatttgt ttcttacagt gagcgggatg cctactgggt ggagaacctt 1560

atggtccagg agctggagaa cttcaatccc cccttcaagt tgtgtcttca taagcgggac 1620

ttcattcctg gcaagtggat cattgacaat atcattgact ccattgaaaa gagccacaaa 1680

actgtctttg tgctttctga aaactttgtg aagagtgagt ggtgcaagta tgaactggac 1740

ttctcccatt tccgtctttt tgatgagaac aatgatgctg ccattctcat tcttctggag 1800

cccattgaga aaaaagccat tccccagcgc ttctgcaagc tgcggaagat aatgaacacc 1860

aagacctacc tggagtggcc catggacgag gctcagcggg aaggattttg ggtaaatctg 1920

agagctgcga taaagtcc 1938

Claims (10)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；

所述抗原结合结构域包括抗MUC1单链抗体；

所述信号转导结构域包括4-1BB、CD3ζ和TLR2。

2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述抗原结合结构域包括SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α；

优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽；

优选地，所述信号肽包括GM-CSF信号肽。

4.根据权利要求1-3任一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由GM-CSF信号肽、抗MUC1单链抗体、CD8α、4-1BB、CD3ζ和TLR2串联组成；

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体；

优选地，所述编码基因包括抗MUC1单链抗体编码序列；

优选地，所述编码基因还包括GM-CSF信号肽编码序列、CD8α编码序列、4-1BB编码序列、CD3ζ编码序列和TLR2编码序列；

优选地，所述编码基因包括SEQ ID NO:3所示的核酸序列。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体为含有权利要求5所述的编码基因的慢病毒载体。

7.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒为转染有权利要求6所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞。

8.一种嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体T细胞表达权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体；

优选地，所述嵌合抗原受体T细胞的基因组中整合有权利要求5所述的编码基因；

优选地，所述嵌合抗原受体T细胞包括权利要求6所述的表达载体和/或权利要求7所述的重组慢病毒。

9.一种权利要求8所述的嵌合抗原受T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞的步骤。

10.一种权利要求1-4任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求5所述的编码基因、权利要求6所述的表达载体、权利要求7所述的重组慢病毒或权利要求8所述的嵌合抗原受体T细胞在制备疾病治疗药物中的应用；

优选地，所述疾病包括肿瘤；

优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、胃癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。

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