CN110055224A - 一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110055224A
CN110055224A CN201910372692.5A CN201910372692A CN110055224A CN 110055224 A CN110055224 A CN 110055224A CN 201910372692 A CN201910372692 A CN 201910372692A CN 110055224 A CN110055224 A CN 110055224A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
gly
cell
seq
acid sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910372692.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110055224B (zh
Inventor
不公告发明人
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen In Vivo Biological Medicine Technology Co Ltd
Original Assignee
Shenzhen In Vivo Biological Medicine Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen In Vivo Biological Medicine Technology Co Ltd filed Critical Shenzhen In Vivo Biological Medicine Technology Co Ltd
Publication of CN110055224A publication Critical patent/CN110055224A/zh
Priority to PCT/CN2020/088806 priority Critical patent/WO2020200325A1/zh
Priority to AU2020255735A priority patent/AU2020255735B2/en
Priority to US17/600,884 priority patent/US20220185858A1/en
Application granted granted Critical
Publication of CN110055224B publication Critical patent/CN110055224B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/53—Liver
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/55—Lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4635—Cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464469—Tumor associated carbohydrates
    • A61K39/46447—Mucins, e.g. MUC-1
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464474—Proteoglycans, e.g. glypican, brevican or CSPG4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5412—IL-6
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3076—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties
    • C07K16/3092—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells against structure-related tumour-associated moieties against tumour-associated mucins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

本发明提供了一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用，所述免疫细胞过表达HIL‑6和/或L‑GP130。本发明通过在免疫细胞中处理/过表达/条件性诱导过表达HIL‑6或L‑GP130，免疫细胞的扩增、迁移和杀伤肿瘤的能力得到显著增强，不会对其他免疫细胞造成影响，不会引起或加剧全身性或者局部的炎症反应，在保持免疫效应和抗肿瘤效果的同时，降低了CAR T治疗的副作用，在治疗恶性肿瘤、艾滋病中具有潜在价值。

Description

一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用，尤其涉及一种过表达HIL-6和/或L-GP130的免疫细胞及其制备方法和应用。
背景技术
抗CD19嵌合抗原受体(CAR)T细胞(tisagenlecleucel和axicabtageneciloleucel)的临床应用已显示出其对CD19阳性B细胞恶性肿瘤具有显著的杀伤效果。但是，CAR T细胞治疗仍然存在多种问题。在白血病治疗方面，CAR T细胞治疗存在复发率高的问题，促进CAR T细胞的维持和记忆性T细胞的形成可能是解决该问题的技术突破口；此外，抗CD19的CAR T细胞的临床治疗研究结果显示，患者对CAR T细胞治疗的响应率与细胞因子释放综合征(CRS)的发生存在一定的正相关关系，而CRS又可能导致CART细胞相关的脑病综合征(CRES)等副作用，严重限制了CAR T细胞的临床应用；而在实体瘤治疗方面，CAR T细胞疗效差，目前尚未报道相关的临床研究突破。
T细胞的活化与扩增需要有效的协调信号，包括T细胞受体(TCR)信号(第一信号)、共刺激信号(第二信号)和细胞因子信号(第三信号)。其中，携带第三信号的分子(如IL-12、IL-7和IL-15)显著改善了CAR T细胞的扩增、迁移、持久性和抗肿瘤功效。
CRS以白细胞介素-6(interleukin 6，IL-6)作为检测指标。IL-6作为趋化因子家族中的一种多效细胞因子，主要由单核巨噬细胞、Th2细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞生成。IL-6的靶细胞众多，生物效应复杂，可通过调节细胞生长、基因激活、增殖、存活和分化，引发广泛的细胞和生理反应，包括免疫反应、炎症、造血和肿瘤发生等。IL-6通过与非信号转导IL-6Rα结合形成蛋白复合体，随后与亚基糖蛋白130(Glycoprotein 130，GP130)二聚化，通过转录因子、Janus激酶(JAKs)和信号转导子、以及转录激活因子(STATs)启动信号转导级联。其中，IL-6和IL-6R的结合包括膜结合(mIL-6R)和可溶性IL-6R(sIL-6R)两种，分别称为经典或非经典信号传导。
现有技术通常采用IL-6单抗(PMID：27049586)或IL-1β单抗(PMID：29808007，PMID：29808005)抑制IL-6的作用，或者以IL-6和IL-6R为靶点(EP3305890A1、US20180369282A1、US15018797和US15106657)，抑制CAR T细胞治疗的副作用。然而，IL-6的作用机制复杂，具有两面性，片面地对IL-6进行抑制，可能会影响CAR T细胞的抗肿瘤作用。
WO2017007985公开了采用IL-6治疗肿瘤的方法。然而单纯地采用IL-6治疗可能同时激活膜结合(mIL-6R)和可溶性IL-6R(sIL-6R)，mIL-6R多与非肿瘤杀伤相关，过多地激活mIL-6R可能会干扰免疫细胞的功能，同时损耗可溶性IL-6R的IL-6用量。
早期报道显示IL-6在小鼠模型中具有抗肿瘤的作用，然而小鼠模型限制了IL-6副作用的发现。随着科技的发展，研究人员逐渐认识到IL-6不仅可以引起严重的副作用，而且全身性使用IL-6可以造成炎症微环境，引发患者的细胞因子风暴，促进肿瘤生长或者免疫逃逸。近期研究常采用IL-6受体单抗、敲除IL-6受体等方法来阻断IL-6的副作用(PMID：27076371)，然而，阻断IL-6会影响免疫细胞抗肿瘤作用的最大化，影响抗肿瘤治疗的效果。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用，所述免疫细胞的扩增、迁移和杀伤肿瘤的能力得到显著增强，提高了在实体瘤中的浸润，在治疗实体肿瘤中具有潜在价值。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种免疫细胞，所述免疫细胞过表达HIL-6和/或L-GP130。
本发明中，复合型IL-6(hyper IL-6，HIL-6)为IL-6和IL-6Rα的蛋白复合物，糖蛋白130(Glycoprotein130，GP130)也称为CD130、IL6ST或IL6β，可与IL-6受体、IL-11受体、IL-12受体、IL-27受体、白血病抑制因子受体(LIF)、致瘤素M受体(OSM)、睫状神经营养因子(CNTF)、心肌营养素(cardiotrophin-1，CT-1)、类心肌营养素细胞因子(CLC)和Kaposi肉瘤相关的疱疹病毒白细胞介素6样蛋白(KSHV-IL6)结合。
本发明中，在免疫细胞中处理/过表达/诱导过表达HIL-6或者L-GP130，降低了CART在治疗过程中的副作用，同时保留了抗肿瘤作用。
优选地，所述HIL-6的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，或与SEQ ID NO:1具有80％以上同源性的具有相同或相似活性的氨基酸序列。
优选地，所述HIL-6的核酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述L-GP130的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或与SEQ ID NO:3具有80％以上同源性的具有相同或相似活性的氨基酸序列。
优选地，所述L-GP130的核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞、NKT细胞或γδT细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+CD8+T细胞，进一步优选为Th1细胞、记忆性T细胞或中枢记忆性T细胞。
优选地，所述免疫细胞修饰有一种或者两种以上的CAR分子和/或TCR分子。
优选地，所述CAR分子的胞外scFv序列识别抗原包括5T4、α5β1-整联蛋白、707-AP、AFP、ART-4、B7H4、B7-H3、BAGE、β-联蛋白/m、Bcr-abl、MN/C IX抗体、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CDC27/m、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、hTRT、iCE、IGF-1R、IL-2R、IL-5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/melan-A、MART-2/Ski、MC1R、Mesothelin、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、PSCA、NA88-A、PAP、蛋白酶-3、GPC3、p190minorbcr-abl、Pml/RARα、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、生存蛋白、TEL/AML1、PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、LAG3、TGFβ、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF、WT1、IL-13Rα2、CD123、GUCY2C、NY-Eso-1或NY-Eso-B中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种。
优选地，所述抗CD19CAR的scFv1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，核酸序列如SEQ ID NO:6所示。
优选地，所述抗CD19CAR的scFv2-7的氨基酸序列如SEQ ID NO:7-12所示。
优选地，所述抗GPC3CAR的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，核酸序列如SEQ ID NO:14所示。
优选地，所述抗MUC1CAR的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，核酸序列如SEQ ID NO:16所示。
优选地，所述抗Mesothelin的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，核酸序列如SEQ ID NO:18所示。
优选地，所述抗PSCA的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，核酸序列如SEQID NO:20所示。
优选地，所述抗HER2的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，核酸序列如SEQID NO:22所示。
优选地，所述CAR分子的胞内共刺激信号传导结构域包括CD28、4-1BB、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、DAP10、CD27、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、NKp46、NKp30、NKp44、DNAM1、B7-H3或CD83中的任意一种或至少两种分子的胞内结构域组合。
优选地，所述TLR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，核酸序列如SEQ ID NO:24所示。
优选地，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，核酸序列如SEQ ID NO:26所示。
优选地，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，核酸序列如SEQ ID NO:28所示。
优选地，所述TLR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，核酸序列如SEQ ID NO:30所示。
优选地，所述DAP10的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，核酸序列如SEQ ID NO:32所示。
优选地，所述CAR分子的信号肽的核酸序列如SEQ ID NO:33所示。
优选地，所述CAR分子的跨膜区的核酸序列如SEQ ID NO:34所示。
优选地，所述CAR分子的CD3ζ的核酸序列如SEQ ID NO:35所示。
第二方面，本发明提供了一种如第一方面所述的免疫细胞的制备方法，所述方法包括将HIL-6和/或L-GP130过表达于免疫细胞中。
优选地，所述过表达包括持续性过表达和/或条件性诱导过表达，优选为条件性诱导过表达。
根据本发明，HIL-6分泌到免疫细胞外可能会引起强烈的局部免疫效应，导致机体炎症发烧，加剧肿瘤免疫治疗引起的细胞因子风暴风险，存在一定的安全风险，本申请优选采用条件性诱导表达HIL-6；
L-GP130为针对HIL-6外分泌安全风险进行的完善，为非外泌形式，对其他免疫细胞无刺激作用，不会形成全身性或局部免疫效应，不会引起或加剧细胞因子风暴风险，并且保留了HIL-6对特异性表达的免疫细胞或修饰性免疫细胞抗肿瘤作用的提升效果，可以促进T细胞、CAR T细胞的抗肿瘤作用，然而考虑到L-GP130在肝脏细胞等组织中过表达可能会存在一定的致瘤风险，L-GP130优选采用条件性诱导表达方式。
优选地，所述条件性诱导过表达包括CAR识别激活诱导过表达和/或外源化合物诱导过表达。
优选地，在所述CAR识别激活诱导过表达体系中，质粒载体包括pUC57-CAR、pUC57-NFAT序列-IL2启动子-HIL-6、或pUC57-NFAT序列-IL2启动子-L-GP130中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述NFAT的核酸序列如SEQ ID NO:37所示。
优选地，所示IL2启动子的核酸序列如SEQ ID NO:38所示。
优选地，所述外源化合物包括强力霉素。
优选地，所述过表达采用脂质体转导、电转导或病毒转导的方式。
优选地，所述过表达采用的载体包括病毒载体和/或PB载体。
优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体中的任意一种或至少两种的组合，优选为慢病毒载体，进一步优选为慢病毒载体pWPXLd。
优选地，所述PB载体的核酸序列如SEQ ID NO:36所示。
优选地，所述慢病毒载体pWPXLd的核酸序列如SEQ ID NO:44所示。
第三方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面所述的免疫细胞。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的免疫细胞或如第三方面所述的药物组合物在制备肿瘤和/或HIV病毒感染引起的艾滋病治疗药物中的用途。
优选地，所述肿瘤包括血液肿瘤和/或实体瘤。
优选地，所述血液肿瘤包括白血病、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤。
优选地，所述白血病包括B急性淋系白血病、T急性淋巴细胞白血病、急性髓系细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病或慢性髓系细胞白血病。
优选地，所述实体瘤包括肺癌、肝癌、乳腺癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌，优选为肝癌、肺癌。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过在免疫细胞中处理/过表达/诱导过表达HIL-6或L-GP130，不会对其他免疫细胞造成影响，不会引起或加剧全身性或者局部的炎症反应，在保持抗肿瘤效果的同时，降低了CAR T治疗的副作用；
(2)本发明的HIL-6增强了靶细胞刺激后CAR T细胞的生长、抗凋亡和细胞毒性，同时增强了CART细胞在体内的扩增和抗肿瘤作用，经HIL-6刺激后，T细胞/CAR T细胞上调了细胞迁移、记忆分化和IL-6/STAT3途径相关的基因的表达；
(3)本发明的L-GP130促进了CAR T细胞的抗肿瘤效果。
附图说明
图1(a)为简略的CAR分子的结构示意图，图1(b)为本申请说明书中提及的CAR分子的结构示意图，图1(c)为HIL-6的结构示意图，图1(d)为L-GP130的结构示意图，图1(e)为DOX诱导HIL-6或L-GP130过表达的载体体系；
图2(a)为在肿瘤靶细胞激活的情况下，HIL-6对CAR19T细胞扩增的影响，图2(b)为在肿瘤靶细胞激活的情况下，HIL-6对CAR19T细胞抗凋亡的影响，图2(c)为在是/否过表达HIL-6的情况下，T细胞/CAR T细胞对CD19+NALM-6、MUC1+A549和GPC3+Huh-7的杀伤能力，图2(d)为在是/否过表达HIL-6的情况下，不同胞内共刺激信号传导结构域的CAR T细胞对NALM-6的杀伤能力，图2(e)为在是/否过表达HIL-6的情况下，T细胞/CAR19T细胞的细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-17α、IL-6、HIL-6和IL-2的分泌情况，图2(f)为在是/否过表达HIL-6的情况下，T细胞/CAR MUC1T细胞的细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-17α、IL-6、HIL-6和IL-2的分泌情况；
图3(a)为在是/否过表达HIL-6的情况下，T细胞/CAR 19T细胞移植入B急性淋系白血病(NALM6细胞系)荷瘤小鼠后，小鼠外周血(PB)、脾脏(SP)中T细胞的比例和扩增的情况，图3(b)为在是/否过表达HIL-6的情况下，T细胞/CAR19T细胞移植入B急性淋系白血病(NALM6细胞系)荷瘤小鼠后，小鼠外周血(PB)、脾脏(SP)中CAR T细胞的比例和扩增的情况，图3(c)为在是/否过表达HIL-6的情况下，T细胞/CAR MUC1T细胞移植入肺癌(A549细胞系)荷瘤小鼠后，小鼠外周血(PB)、脾脏(SP)中T细胞的比例，图3(d)为在是/否过表达HIL-6的情况下，T细胞/CAR MUC1T细胞移植入肝癌(Huh-7细胞系)荷瘤小鼠后，小鼠外周血(PB)、脾脏(SP)中T细胞的比例，图3(e)为在是/否过表达HIL-6的情况下，T细胞/CAR MUC1T细胞/CAR GPC3T细胞分别移植入肺癌(A549细胞系)荷瘤小鼠和肝癌(Huh-7细胞系)荷瘤小鼠体内后，CAR T细胞的比例，图3(f)为在是/否过表达HIL-6的情况下，T细胞/CAR MUC1T细胞/CAR GPC3T细胞分别移植入肺癌(A549细胞系)荷瘤小鼠和肝癌(Huh-7细胞系)荷瘤小鼠体内后，杀伤肿瘤(肿瘤组织重量)的情况，图3(g)为在是/否诱导表达HIL-6、分别采用CAR19或Dox激活过表达HIL-6的情况下，NALM6荷瘤小鼠的生存时间制作生存曲线；
图4(a)为RNA测序结果热图，图4(b)为qRT-PCR检测不同组的抗CD19的CAR T细胞中相关基因的转录表达量，其中，S1为CD19CAR T细胞，S2为用HIL-6处理后的抗CD19CAR T细胞，S3为NALM6细胞激活后的抗CD19CAR T细胞，S4为NALM6细胞激活和HIL-6处理后的抗CD19CAR T细胞，图4(c)和图4(d)为高通量转录组测序对比过表达HIL-6的T细胞相关信号通路具有转录表达差异的基因数量；
图5(a)为过表达L-GP130对CAR T细胞的体外细胞毒性的影响，图5(b)为在是/否过表达L-GP130的情况下，不同胞内共刺激信号传导结构域的CAR T细胞对NALM-6的杀伤能力；
图6(a)为过表达L-GP130对CAR T细胞体内肿瘤细胞杀伤和抑制作用的影响，图6(b)为过表达L-GP130对靶细胞总量的影响，图6(c)为过表达L-GP130对荷瘤小鼠生存率的影响，图6(d)为是/否过表达L-GP130的T细胞、抗MUC1的CAR T细胞处理后，A549荷瘤小鼠的肿瘤体积大小变化，图6(e)为是/否过表达L-GP130的T细胞、抗GPC3的CAR T细胞处理后，Huh-7荷瘤小鼠的肿瘤体积大小变化。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
本申请实施例中，CAR分子的结构如图1(a)和图1(b)所示，HIL-6的分子结构如图1(c)所示，L-GP130的分子结构如图1(d)所示。
实施例1构建持续性共表达体系
通过基因合成，获得识别肿瘤抗原的CAR分子和HIL-6或L-GP130基因的持续性共表达质粒载体pUC57-CAR-2A-HIL-6、pUC57-CAR-2A-L-GP130。
对pUC57-CAR-2A-HIL-6和pUC57-CAR-2A-L-GP130进行酶切，获得CAR-2A-HIL-6和CAR-2A-L-GP130基因，连接至慢病毒载体pWPXLd(含GFP基因)或者PB载体(含GFP基因)中，构建pWPXLd-CAR-2A-HIL-6-2A-GFP和pWPXLd-CAR-2A-L-GP130-2A-GFP，或者PB-CAR-2A-HIL-6-2A-GFP和PB-CAR-2A-L-GP130-2A-GFP。
本实施例中，HIL-6的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或与SEQ ID NO:1具有80％以上同源性的具有相同或相似活性的氨基酸序列，核酸序列如SEQ ID NO:2所示；L-GP130的氨基酸序列为SEQ ID NO:3或与SEQ ID NO:3具有80％以上同源性的具有相同或相似活性的氨基酸序列，核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本实施例中，CAR分子的胞外scFv序列识别抗原CD19、GPC3、MUC1、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种。其中，anti-CD19scFv1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，核酸序列如SEQ ID NO:6所示；anti-CD19scFv2的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，anti-CD19scFv3的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示，anti-CD19scFv4的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示，anti-CD19scFv5的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示，anti-CD19scFv6的氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示，anti-CD19scFv7的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示；anti-GPC3scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，核酸序列如SEQ ID NO:14所示；anti-MUC1scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，核酸序列如SEQ ID NO:16所示；anti-Mesothelin scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，核酸序列如SEQ ID NO:18所示；anti-PSCA scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，核酸序列如SEQ ID NO:20所示；anti-HER2scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，核酸序列如SEQ ID NO:22所示。
本实施例中，CAR分子的胞内共刺激信号传导序列为TLR2-CD28、TLR2-4-1BB、TLR2-DAP10*3或CD28-41BB中的任意一种。其中，TLR2的域氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，核酸序列如SEQ ID NO:24所示；4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，核酸序列如SEQ ID NO:26所示；CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，核酸序列如SEQ ID NO:28所示；DAP10*3的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，核酸序列如SEQ ID NO:32所示；
CAR分子的信号肽可为任意人源信号肽，本实施例的信号肽的核酸序列如SEQ IDNO:33所示；
CAR分子的跨膜区可为任意人源信号肽，本实施例的跨膜区的核酸序列如SEQ IDNO:34所示；
本实施例中，CAR分子的CD3ζ的核酸序列如SEQ ID NO:35所示；
本实施例中，载体中2A的核酸序列如SEQ ID NO:39所示，GFP的核酸序列如SEQ IDNO:40所示，PB载体的核酸序列如SEQ ID NO:36所示，慢病毒载体pWPXLd的核酸序列如SEQID NO:44所示。
实施例2构建持续性分开共表达体系
通过分子克隆，获得持续性表达识别肿瘤抗原的CAR分子、HIL-6基因和L-GP130基因的质粒载体pUC57-CAR、pUC57-HIL-6和pUC57-L-GP130。对pUC57-CAR、pUC57-HIL-6和pUC57-L-GP130进行酶切，获得CAR、HIL-6和L-GP130基因，连接至慢病毒载体pWPXLd(含GFP基因)或者PB载体(含GFP基因)中，构建pWPXLd-CAR-2A-GFP、pWPXLd-HIL-6-2A-GFP和pWPXLd-L-GP130-2A-GFP，或者PB-CAR-2A-GFP、PB-HIL-6-2A-GFP和PB-L-GP130-2A-GFP。
本实施例中，构建体系所采用的CAR分子、HIL-6、L-GP130和载体的序列信息与实施例1相同。
实施例3构建CAR识别激活诱导过表达体系
通过基因合成，获得表达识别肿瘤抗原的CAR分子、NFAT重复序列(6个重复序列)-IL2启动子-HIL-6基因和NFAT重复序列-IL2启动子-L-GP130基因的质粒载体pUC57-CAR、pUC57-NFAT重复序列-IL2启动子-HIL-6和pUC57-NFAT重复序列-IL2启动子-L-GP130。对pUC57-CAR、pUC57-NFAT重复序列-IL2启动子-HIL-6和pUC57-NFAT重复序列-IL2启动子-L-GP130进行酶切，获得CAR、NFAT重复序列-IL2启动子-HIL-6和NFAT重复序列-IL2启动子-L-GP130基因，连接至慢病毒载体pWPXLd(无启动子，含GFP基因)或者PB载体(无启动子，含GFP基因)中，构建pWPXLd-CAR-2A-GFP、pWPXLd(无启动子)-NFAT重复序列-IL2启动子-HIL-6-2A-GFP和pWPXLd(无启动子)-NFAT重复序列-IL2启动子-L-GP130-2A-GFP，或者PB-CAR-2A-GFP、PB(无启动子)-NFAT重复序列-IL2启动子-HIL-6-2A-GFP和PB(无启动子)-NFAT重复序列-IL2启动子-L-GP130-2A-GFP。该体系诱导HIL-6或L-GP130在CAR分子识别肿瘤抗原后高表达。
本实施例中，构建体系所采用的CAR分子、HIL-6和L-GP130的序列信息与实施例1相同。另外，NFAT的核酸序列如SEQ ID NO:37所示，IL2启动子的核酸序列如SEQ ID NO:38所示，PB载体(无启动子)的核酸序列与如SEQ ID NO:36所示的PB载体的核酸序列相比缺少启动子部分，具体如SEQ ID NO:45所示，慢病毒载体pWPXLd(无启动子)的核酸序列与如SEQID NO:44所示的慢病毒载体pWPXLd的核酸序列相比缺少启动子部分。
实施例4构建DOX诱导过表达体系
参考现有技术(PMID：1990348)，通过分子克隆，将HIL-6或L-GP130基因克隆入PB-TRE载体，构建PB-TRE-HIL-6-2A-GFP、PB-TRE-L-GP130-2A-GFP，与PB-CAG-rtTA和PB-PL623载体通过脂质体转入免疫细胞中，而CAR分子通过慢病毒转入。该体系转入免疫细胞后，将通过强力霉素处理(DOX，Doxycycline)诱导HIL-6或L-GP130的表达，如图1(e)所示。
本实施例中，构建体系所采用的CAR分子、HIL-6和L-GP130的序列信息与实施例1相同。另外，PB-TRE的核酸序列如SEQ ID NO:41所示；PB-CAG-rtTA的核酸序列如SEQ IDNO:42所示；PB-PL623的核酸序列如SEQ ID NO:43所示。
实施例5质粒在免疫细胞中的转导表达
可通过病毒载体转导法、基于转座子系统的电转法或脂质体介导的质粒转导等方式，将持续性、DOX诱导表达或在嵌合抗原受体识别抗原后激活表达的CAR分子和HIL-6或L-GP130基因整合或转导到免疫细胞，随后免疫系统在载体启动子的驱动下表达HIL-6或L-GP130基因，从而使CAR分子受体表达于免疫细胞表面。
示例性地，本实施例采用慢病毒转导T细胞的方法，具体步骤如下：
(1)在150mm培养皿中培养处于对数生长期的293T细胞(培养基为DMEM高糖培养基+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液))，当细胞密度达80-90％时，更换培养基为DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；2-6小时后，用PEI将实施例1-4构建的pWPXLd-目标基因-GFP，即CAR和HIL-6/L-GP130共表达/分开共表达/诱导表达慢病毒质粒(对照质粒为pWPXLd-GFP)、pMD2.G和psPAX2三个质粒共同转化293T细胞；转化后第24、48和72小时，收集培养基上清，并加入新鲜培养基(DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗)；培养基上清收集完毕，使用0.45μM PVDF滤膜过滤去除细胞碎片，放置在4℃冰箱待用；
(2)T细胞分离纯化：通过Ficoll密度梯度法分离血液中的单个核细胞，采用红细胞裂解液裂解去除红细胞后，通过MACS Pan-T磁珠分选出T细胞，采用培养基AIM-V加5％FBS、100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素稀释至浓度为2.5×106个/mL待用；利用包被CD2、CD3和CD28抗体的磁珠(美天旎)刺激T细胞，磁珠与T细胞比例为1:2，T细胞密度为5×106个/mL/cm2，T细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养刺激48h；
(3)T细胞的慢病毒转导：去除T细胞中的磁珠，将激活后的T细胞在300g下离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬，分别加入CAR载体慢病毒、8μg/mL的polybrene和300IU/mL的IL-2，病毒加入量为MOI＝10，37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬细胞，37℃、5％CO2培养箱培养；
(4)CAR T细胞扩增：将CAR T细胞密度维持在1×106个/mL左右，每2-3天进行一次半量换液；两周后，T细胞数可扩增100倍，GFP阳性的细胞为转导成功的CAR T细胞，GFP阳性比例通过流式细胞仪进行检测，即得到CAR T细胞或对照T细胞的比例。
实施例6HIL-6对CAR T细胞的生长、抗凋亡和细胞毒性的影响
在采用HIL-6(5ng/mL)处理/不处理的情况下，利用NALM-6细胞系刺激抗CD19的CAR T细胞(示例性地，CAR分子的scFv序列为anti-CD19scFv1)，7天后检测CAR T细胞的扩增。结果如图2(a)所示，HIL-6可以促进抗CD19的CAR T细胞的显著扩增。
将抗CD19的CAR T细胞与NALM-6细胞共培养24小时，在含有/不含有HIL-6(5ng/mL)的情况下，用Annexin V和PI染色，采流式细胞技术检测CAR T细胞的凋亡情况。结果如图2(b)所示，HIL-6可以抑制靶细胞激活的CAR T细胞的凋亡。
将普通T细胞和分别抗CD19、抗MUC1、抗GPC3的CAR T细胞，在过表达或不表达HIL-6的情况下，分别与靶细胞CD19+NALM-6(B急性淋系白血病细胞系)、MUC1+A549(肺癌细胞系)和GPC3+Huh-7(肝癌细胞系)以不同的梯度混合，检测效应细胞(Effected Cell)和靶细胞(Target Cell)以不同比例混合24小时后的梯度杀伤效果，结果如图2(c)所示；
在不同的嵌合CD19受体胞内共刺激信号传导结构域组合CD28-41BB、CD28-TLR2、CD28-TLR2-DAP10的CAR T细胞，过表达/不过表达HIL-6的情况下，分别与靶细胞NALM-6(B急性淋系白血病细胞系)以不同的梯度混合，检测效应细胞(Effected Cell)和靶细胞(Target Cell)以不同比例混合24小时后的梯度杀伤效果，结果如图2(d)所示；
在过表达或不表达HIL-6的情况下，检测普通T细胞和靶向CD19的CAR T或靶向MUC1的CAR T细胞上清中的细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-17a、IL-6、HIL-6和IL-2的分泌情况，结果如图2(e)和2(f)所示。
结果表明，HIL-6可以促进CAR T细胞分泌促肿瘤杀伤细胞因子，同时提升体外对肿瘤细胞的细胞毒性。
实施例7HIL-6对CAR T细胞的体内扩增和抗肿瘤作用的影响
通过静脉注射，向NOD/SCID/IL2rg-/-免疫缺陷小鼠体内移植入2×105的NALM6细胞(第0天)，随后输注5×106抗CD19的CAR T细胞(对照组为T细胞)，过表达HIL-6(对照组为不过表达HIL-6)；在第19天，获取用T细胞、抗CD19的CAR T细胞、过表达HIL-6的T细胞和过表达HIL-6的抗CD19CAR T细胞处理的四组小鼠的外周血(PB)和脾脏(SP)，通过流式细胞技术检测其中人CD3+T细胞和GFP标记的CAR T细胞的比例。
如图3(a)和图3(b)所示，过表达HIL-6的T细胞和CAR T细胞在体内显著扩增，提升了抗肿瘤效果；过表达HIL-6的CAR T细胞相对于CAR T细胞组和HIL-6组，CAR T细胞的比例均显著上升，并高于两者单独提升效果的总和。
通过皮下注射，分别向NOD/SCID/IL2rg-/-免疫缺陷小鼠体内分别移植入5×105的A549细胞和Huh-7细胞(第0天)，构建肺癌和肝癌荷瘤小鼠模型；在第7天，分别向肺癌和肝癌荷瘤小鼠体内输注5×106抗MUC1的CAR T细胞和5×106抗GPC3的CAR T细胞(对照组为T细胞)，并且过表达HIL-6(对照组为不过表达HIL-6)；约3-4周后，取小鼠肿瘤组织称重并记录，获取用T细胞、抗MUC1或抗GPC3的CAR T细胞和过表达HIL-6的抗MUC1或抗GPC3的CAR T细胞处理的各组小鼠体内的外周血(PB)和脾脏(SP)，通过流式细胞技术检测其中人CD3+T细胞和GFP标记的CAR T细胞的比例。
通过静脉注射，向NOD/SCID/IL2rg-/-免疫缺陷小鼠体内移植入2×105的NALM6细胞(第0天)，随后输注5×106抗CD19的CAR T细胞(对照组为T细胞)，通过CAR激活过表达HIL-6(CAR19sti HIL-6组)和Dox激活过表达HIL-6(CAR19Dox HIL-6组)的情况下(对照组为不诱导表达HIL-6的CAR19T细胞)，每个实验组设置六个重复实验小鼠，记录不同实验组的NALM6荷瘤小鼠的生存时间制作生存曲线。
结果如图3(c)、图3(d)、图3(e)、图3(f)和图3(g)所示，过表达HIL-6的CAR T细胞能在体内显著扩增，提升抗肿瘤效果。
实施例8HIL-6对T细胞/CAR T细胞中调控细胞迁移、记忆分化和IL-6/STAT3途径相关基因的影响
通过RNA-Seq高通量转录测序，分析在肿瘤靶细胞刺激和/或HIL-6刺激的情况下CAR T细胞基因转录表达差异。图4(a)为RNA测序结果热图，采用靶细胞加5ng/mL的HIL-6处理后，CAR T细胞中的部分基因具有上调或下调变化(倍数变化≥2和p值≤0.05)；这些基因与T细胞迁移、早期记忆分化和IL-6/GP130/STAT3途径等相关。
qRT-PCR检测靶细胞刺激加5ng/mL的HIL-6处理后的CAR T细胞。结果如图4(b)所示，HIL-6可以促进CAR T细胞上调迁移相关基因(CCL5、CCR5和CXCR6)、期记忆分化基因(CD62L、IL7R、CCR7和TCF7)和IL-6/STAT3途径基因(SCOC3、JAK3和IL6ST)的转录表达。
如图4(c)和图4(d)所示为高通量转录组测序对比HIL-6处理的T细胞/CAR T细胞(相对于不过表达的T细胞/CAR T细胞)相关信号通路具有转录表达差异的基因数量。
实施例9L-GP130对CAR T细胞的体外肿瘤杀伤效果的影响
在过表达或不表达L-GP130的情况下，将普通T细胞和靶向CD19抗原的CAR T细胞，分别与靶细胞NALM-6(B急性淋巴细胞白血病细胞系)以不同比例混合，24小时后检测不同梯度的肿瘤细胞的被杀伤比例，以及共培养上清中的细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-17a、IL-6、HIL-6和IL-2的分泌。如图5(a)所示，L-GP130可提升CAR T细胞对肿瘤细胞的体外细胞毒性。
在不同的嵌合CD19受体胞内共刺激信号传导结构域组合CD28-41BB、CD28-TLR2、CD28-TLR2-DAP10的CAR T细胞，过表达/不过表达L-GP130的情况下，分别与靶细胞NALM-6(B急性淋系白血病细胞系)以不同的梯度混合，检测效应细胞(Effected Cell)和靶细胞(Target Cell)以不同比例混合24小时后的梯度杀伤效果，结果如图5(b)所示，L-GP130显著提升了CAR T细胞对NALM-6杀伤效果。
实施例10L-GP130对CAR T细胞的体内抗肿瘤效果的影响
第0天，向免疫缺陷小鼠体内移植入2×105个NALM6-GL(荧光素酶标记)，构建白血病荷瘤小鼠模型；第3天，分别输注5×106个是/否过表达L-GP130的抗CD19的CAR T细胞(对照组为T细胞)，并于第7天、第14天、第21天、第28天和第35天，注射荧光素酶底物进行活体成像，检测T细胞、抗CD19的CAR T细胞(CAR19T)、过表达L-GP130的T细胞和过表达L-GP130的CAR19T细胞组处理的荷瘤小鼠体内NALM6-GL的分布和定量，同时记录不同实验组荷瘤小鼠的死亡时间和生存比例。结果如图6(a)、图6(b)和图6(c)所示，L-GP130可以提升T细胞和CAR T细胞的体内抗肿瘤作用，延长荷瘤小鼠的生存期限。
第0天，通过皮下注射，向NOD/SCID/IL2rg-/-免疫缺陷小鼠体内移植入5×105的A549细胞，构建肺癌荷瘤小鼠模型；第5天，在肺癌荷瘤小鼠体内输注5×106个过表达/不过表达L-GP130的抗MUC1的CAR T细胞(对照组T细胞，每个实验组设置5只重复实验小鼠)，并于第7天之后，每三天量取肺癌肿瘤组织块体积，记录并制作肿瘤体积随时间变化的曲线。如图6(d)显示，过表达L-GP130可显著促进T细胞和CAR T细胞的体内抗肿瘤作用。
第0天，通过皮下注射，向NOD/SCID/IL2rg-/-免疫缺陷小鼠体内移植入5×105的Huh-7细胞，构建肝癌荷瘤小鼠模型；第5天，在肝癌荷瘤小鼠体内输注5×106个过表达/不过表达L-GP130的抗GPC3的CAR T细胞(对照组T细胞，每个实验组设置5只重复实验小鼠)，并于第7天之后，每三天量取肝癌肿瘤组织块体积，记录并制作肿瘤体积随时间变化的曲线。如图6(e)显示，过表达L-GP130可显著促进T细胞和CAR T细胞的体内抗肿瘤作用。
综上所述，本发明通过在免疫细胞中处理/过表达/诱导过表达HIL-6或L-GP130，不会对其他免疫细胞造成影响，不会引起或加剧全身性或者局部的炎症反应，在保持抗肿瘤效果的同时，降低了CAR T治疗的副作用；其中，HIL-6增强了靶细胞刺激后CAR T细胞的生长、抗凋亡和细胞毒性，同时增强了CART细胞在体内的扩增和抗肿瘤作用，经HIL-6刺激后，T细胞/CAR T细胞上调了细胞迁移、记忆分化和IL-6/STAT3途径相关的基因的表达；L-GP130促进了CAR T细胞的抗肿瘤效果。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳市体内生物医药科技有限公司
<120> 一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用
<130> 20190403
<160> 45
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 407
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser
1 5 10 15
Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr
20 25 30
Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp
35 40 45
Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys
50 55 60
Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met
65 70 75 80
Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe
85 90 95
Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val
100 105 110
Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp
115 120 125
Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg
130 135 140
Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp
145 150 155 160
Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His
165 170 175
Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser
180 185 190
Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser
195 200 205
Pro Pro Ala Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Glu Pro
210 215 220
Val Pro Pro Gly Glu Asp Ser Lys Asp Val Ala Ala Pro His Arg Gln
225 230 235 240
Pro Leu Thr Ser Ser Glu Arg Ile Asp Lys Gln Ile Arg Tyr Ile Leu
245 250 255
Asp Gly Ile Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met
260 265 270
Cys Glu Ser Ser Lys Glu Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Asn Leu Pro
275 280 285
Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu Glu
290 295 300
Thr Cys Leu Val Lys Ile Ile Thr Gly Leu Leu Glu Phe Glu Val Tyr
305 310 315 320
Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala Arg
325 330 335
Ala Val Gln Met Ser Thr Lys Val Leu Ile Gln Phe Leu Gln Lys Lys
340 345 350
Ala Lys Asn Leu Asp Ala Ile Thr Thr Pro Asp Pro Thr Thr Asn Ala
355 360 365
Ser Leu Leu Thr Lys Leu Gln Ala Gln Asn Gln Trp Leu Gln Asp Met
370 375 380
Thr Thr His Leu Ile Leu Arg Ser Phe Lys Glu Phe Leu Gln Ser Ser
385 390 395 400
Leu Arg Ala Leu Arg Gln Met
405
<210> 2
<211> 1221
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ccccccgagg agccccagct ctcctgcttc cggaagagcc ccctcagcaa tgttgtttgt 60
gagtggggtc ctcggagcac cccatccctg acgacaaagg ctgtgctctt ggtgaggaag 120
tttcagaaca gtccggccga agacttccag gagccgtgcc agtattccca ggagtcccag 180
aagttctcct gccagttagc agtcccggag ggagacagct ctttctacat agtgtccatg 240
tgcgtcgcca gtagtgtcgg gagcaagttc agcaaaactc aaacctttca gggttgtgga 300
atcttgcagc ctgatccgcc tgccaacatc acagtcactg ccgtggccag aaacccccgc 360
tggctcagtg tcacctggca agacccccac tcctggaact catctttcta cagactacgg 420
tttgagctca gatatcgggc tgaacggtca aagacattca caacatggat ggtcaaggac 480
ctccagcatc actgtgtcat ccacgacgcc tggagcggcc tgaggcacgt ggtgcagctt 540
cgtgcccagg aggagttcgg gcaaggcgag tggagcgagt ggagcccgga ggccatgggc 600
acgccttgga cagaatccag gagtcctcca gctcgcggtg gtggatcagg aggtggaggg 660
tcagtcgagc cagtaccccc aggagaagat tccaaagatg tagccgcccc acacagacag 720
ccactcacct cttcagaacg aattgacaaa caaattcggt acatcctcga cggcatctca 780
gccctgagaa aggagacatg taacaagagt aacatgtgtg aaagcagcaa agaggcactg 840
gcagaaaaca acctgaacct tccaaagatg gctgaaaaag atggatgctt ccaatctgga 900
ttcaatgagg agacttgcct ggtgaaaatc atcactggtc ttttggagtt tgaggtatac 960
ctagagtacc tccagaacag atttgagagt agtgaggaac aagccagagc tgtgcagatg 1020
agtacaaaag tcctgatcca gttcctgcag aaaaaggcaa agaatctaga tgcaataacc 1080
acccctgacc caaccacaaa tgccagcctg ctgacgaagc tgcaggcaca gaaccagtgg 1140
ctgcaggaca tgacaactca tctcattctg cgcagcttta aggagttcct gcagtccagc 1200
ctgagggctc ttcggcaaat g 1221
<210> 3
<211> 344
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn
1 5 10 15
Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln
20 25 30
Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Ala Gln Gly Glu Ile Glu Ala Ile Val
35 40 45
Val Pro Val Cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu Leu Gly Val Leu
50 55 60
Phe Cys Phe Asn Lys Arg Asp Leu Ile Lys Lys His Ile Trp Pro Asn
65 70 75 80
Val Pro Asp Pro Ser Lys Ser His Ile Ala Gln Trp Ser Pro His Thr
85 90 95
Pro Pro Arg His Asn Phe Asn Ser Lys Asp Gln Met Tyr Ser Asp Gly
100 105 110
Asn Phe Thr Asp Val Ser Val Val Glu Ile Glu Ala Asn Asp Lys Lys
115 120 125
Pro Phe Pro Glu Asp Leu Lys Ser Leu Asp Leu Phe Lys Lys Glu Lys
130 135 140
Ile Asn Thr Glu Gly His Ser Ser Gly Ile Gly Gly Ser Ser Cys Met
145 150 155 160
Ser Ser Ser Arg Pro Ser Ile Ser Ser Ser Asp Glu Asn Glu Ser Ser
165 170 175
Gln Asn Thr Ser Ser Thr Val Gln Tyr Ser Thr Val Val His Ser Gly
180 185 190
Tyr Arg His Gln Val Pro Ser Val Gln Val Phe Ser Arg Ser Glu Ser
195 200 205
Thr Gln Pro Leu Leu Asp Ser Glu Glu Arg Pro Glu Asp Leu Gln Leu
210 215 220
Val Asp His Val Asp Gly Gly Asp Gly Ile Leu Pro Arg Gln Gln Tyr
225 230 235 240
Phe Lys Gln Asn Cys Ser Gln His Glu Ser Ser Pro Asp Ile Ser His
245 250 255
Phe Glu Arg Ser Lys Gln Val Ser Ser Val Asn Glu Glu Asp Phe Val
260 265 270
Arg Leu Lys Gln Gln Ile Ser Asp His Ile Ser Gln Ser Cys Gly Ser
275 280 285
Gly Gln Met Lys Met Phe Gln Glu Val Ser Ala Ala Asp Ala Phe Gly
290 295 300
Pro Gly Thr Glu Gly Gln Val Glu Arg Phe Glu Thr Val Gly Met Glu
305 310 315 320
Ala Ala Thr Asp Glu Gly Met Pro Lys Ser Tyr Leu Pro Gln Thr Val
325 330 335
Arg Gln Gly Gly Tyr Met Pro Gln
340
<210> 4
<211> 1032
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 4
cgtatcgctc gtctggaaga aaaagttaaa accctgaaag ctcagaactc cgaactggct 60
tccaccgcta acatgctgcg tgaacaggtt gctcagctga aacagaaagt tatgaacgct 120
caaggagaaa ttgaagccat agtcgtgcct gtttgcttag cattcctatt gacaactctt 180
ctgggagtgc tgttctgctt taataagcga gacctaatta aaaaacacat ctggcctaat 240
gttccagatc cttcaaagag tcatattgcc cagtggtcac ctcacactcc tccaaggcac 300
aattttaatt caaaagatca aatgtattca gatggcaatt tcactgatgt aagtgttgtg 360
gaaatagaag caaatgacaa aaagcctttt ccagaagatc tgaaatcatt ggacctgttc 420
aaaaaggaaa aaattaatac tgaaggacac agcagtggta ttggggggtc ttcatgcatg 480
tcatcttcta ggccaagcat ttctagcagt gatgaaaatg aatcttcaca aaacacttcg 540
agcactgtcc agtattctac cgtggtacac agtggctaca gacaccaagt tccgtcagtc 600
caagtcttct caagatccga gtctacccag cccttgttag attcagagga gcggccagaa 660
gatctacaat tagtagatca tgtagatggc ggtgatggta ttttgcccag gcaacagtac 720
ttcaaacaga actgcagtca gcatgaatcc agtccagata tttcacattt tgaaaggtca 780
aagcaagttt catcagtcaa tgaggaagat tttgttagac ttaaacagca gatttcagat 840
catatttcac aatcctgtgg atctgggcaa atgaaaatgt ttcaggaagt ttctgcagca 900
gatgcttttg gtccaggtac tgagggacaa gtagaaagat ttgaaacagt tggcatggag 960
gctgcgactg atgaaggcat gcctaaaagt tacttaccac agactgtacg gcaaggcggc 1020
tacatgcctc ag 1032
<210> 5
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 5
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
260 265
<210> 6
<211> 803
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120
gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180
aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300
gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360
ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420
ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480
ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540
gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600
agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660
tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720
tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780
acctcagtca ccgtctcctc agc 803
<210> 7
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Ile Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
145 150 155 160
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
165 170 175
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
180 185 190
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
210 215 220
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Tyr Thr
225 230 235 240
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245 250
<210> 8
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Phe Tyr Asp Gly Ser Gln Asn Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Ile Thr Trp Asn Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Pro Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val
145 150 155 160
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
165 170 175
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
180 185 190
Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Ala Ile Ser Ser Leu Gln
210 215 220
Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Phe Tyr
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245 250
<210> 9
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Ile Thr Trp Asp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val
145 150 155 160
Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
165 170 175
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
180 185 190
Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
210 215 220
Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Tyr
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245 250
<210> 10
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 10
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Tyr Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Ile Thr Trp Asn Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val
145 150 155 160
Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser
165 170 175
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
180 185 190
Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
210 215 220
Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Tyr
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245 250
<210> 11
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asp
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ser Ile Thr Trp Asp Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val
115 120 125
Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val
145 150 155 160
Gly Asp Arg Val Thr Val Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Ser
165 170 175
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
180 185 190
Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln
210 215 220
Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Tyr
225 230 235 240
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
245 250
<210> 12
<211> 257
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Ala Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Trp His Asp Gly Ser Ile Lys Asn Tyr Ala Asp Phe Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asp Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Gln Gly Asn Tyr Tyr Gly Trp Gly Ser Tyr Lys Ala Phe
100 105 110
Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr
115 120 125
Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe
145 150 155 160
Leu Ser Val Phe Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
165 170 175
Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
180 185 190
Ala Pro Glu Leu Leu Leu Tyr Ala Thr Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val
195 200 205
Pro Ser Arg Leu Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr
210 215 220
Leu Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
225 230 235 240
Val Tyr Ser Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
245 250 255
Lys
<210> 13
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 13
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn
85 90 95
Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
115 120 125
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser
130 135 140
Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Glu
145 150 155 160
Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Val His Gly Leu Lys Trp Ile Gly
165 170 175
Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe Lys
180 185 190
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
195 200 205
Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ala
<210> 14
<211> 726
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 14
gatgttgtga tgacccaaac tccactctcc ctgcctgtca gtcttggaga tcaagcctcc 60
atctcttgca gatctagtca gagccttgta cacagtaatg gaaacaccta tttacattgg 120
tacctgcaga agccaggcca gtctccaaag ctcctgatct acaaagtttc caaccgattt 180
tctggggtcc cagacaggtt cagtggcagt ggatcaggga cagatttcac actcaagatc 240
agcagagtgg aggctgagga tctgggagtt tatttctgct ctcaaaatac acatgttcct 300
cctacgttcg gatcggggac caagctggaa ataaaaggtg gaggcggttc aggcggaggt 360
ggcagcggcg gtggcgggtc gcaggttcaa ctgcagcagt ctggggctga gctggtgagg 420
cctggggctt cagtgaagct gtcctgcaag gcttcgggct acacatttac tgactatgaa 480
atgcactggg tgaagcagac acctgtgcat ggcctaaaat ggattggagc tcttgatcct 540
aaaactggtg atactgccta cagtcagaag ttcaagggca aggccacact gactgcagac 600
aaatcctcca gcacagccta catggagctc cgcagcctga catctgagga ctctgccgtc 660
tattactgta caagattcta ctcctatact tactggggcc aagggactct ggtcactgtc 720
tctgca 726
<210> 15
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 15
Asp Ile Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn
85 90 95
His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Glu
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Glu
115 120 125
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser
130 135 140
Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Trp
145 150 155 160
Met Asn Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
165 170 175
Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser
180 185 190
Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val
195 200 205
Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr
210 215 220
Cys Thr Phe Gly Asn Ser Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
225 230 235 240
Thr Val Ser Ser
<210> 16
<211> 732
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 16
gatatcgttg tgactcagga atctgcactc accacatcac ctggtgaaac agtcacactc 60
acttgtcgct caagtactgg ggctgttaca acaagtaact atgccaactg ggtccaagaa 120
aaaccagatc atttattcac tggtctaata ggtggtacca acaaccgagc accaggtgtt 180
cctgccagat tctcaggctc cctgattgga gacaaggctg ccctcaccat cacaggggca 240
cagactgagg atgaggcaat atatttctgt gctctatggt acagcaacca ttgggtgttc 300
ggtggaggaa ccaaactgac tgtcctagga tccgagggtg gctcaggatc gggtggatca 360
ggctctggtg gctcaggatc ggaggtccag ctgcagcagt caggaggagg cttggtgcaa 420
cctggaggat ccatgaaact ctcctgtgtt gcctctggat tcactttcag taactactgg 480
atgaactggg tccgccagtc tccagagaag gggcttgagt gggttgctga aattagattg 540
aaatctaata attatgcaac acattatgcg gagtctgtga aagggaggtt caccatctca 600
agagatgatt ccaaaagtag tgtctacctg caaatgaaca acttaagagc tgaagacact 660
ggcatttatt actgtacctt tggtaactcc tttgcttact ggggccaagg gaccacggtc 720
accgtctcct ca 732
<210> 17
<211> 267
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 17
Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser
1 5 10 15
Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser
20 25 30
Asn Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu
35 40 45
Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr
50 55 60
Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys
65 70 75 80
Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala
85 90 95
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ile Leu Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
145 150 155 160
Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Pro
165 170 175
Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr
180 185 190
Leu Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val
195 200 205
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Val
210 215 220
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
225 230 235 240
Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu
245 250 255
Thr Val Leu Ser Gly Ile Leu Glu Gln Gln Gly
260 265
<210> 18
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
agccaggtac agctgcagca gtcaggtcca ggactcgtga cgccctcgca gaccctctca 60
ctcacctgtg ccatctccgg ggacagtgtc tctagcaaca gtgctacttg gaactggatc 120
aggcagtccc catcgagagg ccttgagtgg ctgggaagga catactacag gtccaagtgg 180
tataacgact atgcagtatc tgtgaaaagt cgaatgagca tcaacccaga cacatccaag 240
aaccagttct ccctgcagct gaactctgtg actcccgagg acacggctgt gtattactgt 300
gcaagaggaa tgatgactta ctattacggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360
accgtctcct caggaattct aggatccggt ggcggtggca gcggcggtgg tggttccgga 420
ggcggcggtt ctcagcctgt gctgactcag tcgtcttccc tctctgcatc tcctggagca 480
tcagccagtc tcacctgcac cttgcgcagt ggcatcaatg ttggtcccta caggatatac 540
tggtaccagc agaagccagg gagtcctccc cagtatctcc tgaactacaa atcagactca 600
gataagcagc agggctctgg agtccccagc cgcttctctg gatccaaaga tgcttcggcc 660
aatgcagggg ttttactcat ctctgggctc cggtctgagg atgaggctga ctattactgt 720
atgatttggc acagcagcgc tgctgtgttc ggaggaggca cccaactgac cgtcctctcc 780
ggaattctag aacaacaggg t 801
<210> 19
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 19
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Arg Phe Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Val Gln Leu
115 120 125
Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
130 135 140
Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Tyr Tyr Ile His Trp
145 150 155 160
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Trp Ile Asp
165 170 175
Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Phe Val Pro Lys Phe Gln Gly Arg Ala
180 185 190
Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn
195 200 205
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Lys Thr Gly Gly
210 215 220
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser
225 230 235 240
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250
<210> 20
<211> 750
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
gacattcagc tgacccaatc tccaagctct ttgtccgcct ctgtggggga tagggtcacc 60
atcacctgca gtgccagttc aagtgtaaga ttcattcact ggtaccagca gaaaccagga 120
aaagctccca aaagactcat ctatgacaca tccaaactgg cttctggcgt cccttctagg 180
ttcagtggct ccgggtctgg gacagacttc accctcacca ttagcagtct gcagccggaa 240
gatttcgcca cctattactg tcagcagtgg agtagtagcc cattcacgtt cggacagggg 300
accaaggtgg agataaaagg cagtactagc ggcggtggct ccggaggcgg ctccggaggt 360
ggcggcagct cagaggttca gctggtggag tctgggggtg gccttgtgca gccagggggc 420
tcactccgtt tgtcctgcgc agcttctggc ttcaacatta aagactacta tatacactgg 480
gtgcgtcagg cccctggtaa gggcctggaa tgggttgcat ggattgatcc tgagaatggt 540
gacactgaat ttgtcccgaa gttccagggc cgtgccacta taagcgcaga cacatccaaa 600
aacacagcct acctgcagat gaacagcctg cgtgctgagg acactgccgt ctattattgt 660
aaaacggggg ggttctgggg tcaaggaacc ctggtcaccg tctcgagcga gcccaaatct 720
tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc 750
<210> 21
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 21
Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ile Met Ser Ala
1 5 10 15
Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val
20 25 30
Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg
35 40 45
Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met
65 70 75 80
Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn
85 90 95
Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Gly Pro Gly Leu
115 120 125
Ala Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe
130 135 140
Ser Leu Thr Ser Tyr Val Ile Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys
145 150 155 160
Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Thr Gly Gly Gly Thr Asn Tyr
165 170 175
Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys
180 185 190
Ser Gln Val Ser Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala
195 200 205
Arg Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Ser Tyr Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
210 215 220
Gln Gly Thr Thr Val
225
<210> 22
<211> 689
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 22
attctgatga cccagtctcc agcaatcatg tctgcaatca tgtctgcatc tccaggggag 60
aaggtcacca tgacctgcag tgccagctca agtgtaagtt acatgcactg gtaccagcag 120
aagtcaggca cctcccccaa aagatggatt tatgacacat ccaaactggc ttctggagtc 180
cctgctcgct tcagtggcag tgggtctggg acctcttact ctctcacaat cagcagcatg 240
gaggctgaag atgctgccac ttattactgc cagcagtgga gtagtaaccc gctcacgttc 300
ggtgctggga ccaagctgga aataaaaggt ggctcaggat cgggtggatc aggctctggt 360
ggctcaggat cgggacctgg cctggcggcg ccctcacaga gcctgtccat cacatgcact 420
gtctctgggt tctcattaac cagctatgtt ataagttggg ttcgccagcc accaggaaag 480
ggtctggagt ggcttggagt aatatggact ggtggaggca caaattataa ttcagctctc 540
aaatccagac tgagcatcag caaagacaac tccaagagtc aagtttcctt aaaaatgaac 600
agtctgcaaa ctgatgacac agccaggtac tactgtgcca gcctttccta tgatggtttc 660
gactactggg gccaagggac cacggtcac 689
<210> 23
<211> 159
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 23
Gln Ala Lys Arg Lys Pro Arg Lys Ala Pro Ser Arg Asn Ile Cys Tyr
1 5 10 15
Asp Ala Phe Val Ser Tyr Ser Glu Arg Asp Ala Tyr Trp Val Glu Asn
20 25 30
Leu Met Val Gln Glu Leu Glu Asn Phe Asn Pro Pro Phe Lys Leu Cys
35 40 45
Leu His Lys Arg Asp Phe Ile Pro Gly Lys Trp Ile Ile Asp Asn Ile
50 55 60
Ile Asp Ser Ile Glu Lys Ser His Lys Thr Val Phe Val Leu Ser Glu
65 70 75 80
Asn Phe Val Lys Ser Glu Trp Cys Lys Tyr Glu Leu Asp Phe Ser His
85 90 95
Phe Arg Leu Phe Asp Glu Asn Asn Asp Ala Ala Ile Leu Ile Leu Leu
100 105 110
Glu Pro Ile Glu Lys Lys Ala Ile Pro Gln Arg Phe Cys Lys Leu Arg
115 120 125
Lys Ile Met Asn Thr Lys Thr Tyr Leu Glu Trp Pro Met Asp Glu Ala
130 135 140
Gln Arg Glu Gly Phe Trp Val Asn Leu Arg Ala Ala Ile Lys Ser
145 150 155
<210> 24
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 24
caggccaaaa ggaagcccag gaaagctccc agcaggaaca tctgctatga tgcatttgtt 60
tcttacagtg agcgggatgc ctactgggtg gagaacctta tggtccagga gctggagaac 120
ttcaatcccc ccttcaagtt gtgtcttcat aagcgggact tcattcctgg caagtggatc 180
attgacaata tcattgactc cattgaaaag agccacaaaa ctgtctttgt gctttctgaa 240
aactttgtga agagtgagtg gtgcaagtat gaactggact tctcccattt ccgtcttttt 300
gatgagaaca atgatgctgc cattctcatt cttctggagc ccattgagaa aaaagccatt 360
ccccagcgct tctgcaagct gcggaagata atgaacacca agacctacct ggagtggccc 420
atggacgagg ctcagcggga aggattttgg gtaaatctga gagctgcgat aaagtcc 477
<210> 25
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 25
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 26
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 26
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 27
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 27
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr
85 90 95
Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
100 105
<210> 28
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 28
attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc 60
catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt cccctatttc ccggaccttc taagcccttt 120
tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc 180
tttattattt tctgggtgag gagtaagagg agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac 240
atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc aagcattacc agccctatgc cccaccacgc 300
gacttcgcag cctatcgctc c 321
<210> 29
<211> 162
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 29
Asn Ile Pro Leu Glu Glu Leu Gln Arg Asn Leu Gln Phe His Ala Phe
1 5 10 15
Ile Ser Tyr Ser Gly His Asp Ser Phe Trp Val Lys Asn Glu Leu Leu
20 25 30
Pro Asn Leu Glu Lys Glu Gly Met Gln Ile Cys Leu His Glu Arg Asn
35 40 45
Phe Val Pro Gly Lys Ser Ile Val Glu Asn Ile Ile Thr Cys Ile Glu
50 55 60
Lys Ser Tyr Lys Ser Ile Phe Val Leu Ser Pro Asn Phe Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Trp Cys His Tyr Glu Leu Tyr Phe Ala His His Asn Leu Phe His
85 90 95
Glu Gly Ser Asn Ser Leu Ile Leu Ile Leu Leu Glu Pro Ile Pro Gln
100 105 110
Tyr Ser Ile Pro Ser Ser Tyr His Lys Leu Lys Ser Leu Met Ala Arg
115 120 125
Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Pro Lys Glu Lys Ser Lys Arg Gly Leu Phe
130 135 140
Trp Ala Asn Leu Arg Ala Ala Ile Asn Ile Lys Leu Thr Glu Gln Ala
145 150 155 160
Lys Lys
<210> 30
<211> 486
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 30
aacataccct tagaagaact ccaaagaaat ctccagtttc atgcatttat ttcatatagt 60
gggcacgatt ctttctgggt gaagaatgaa ttattgccaa acctagagaa agaaggtatg 120
cagatttgcc ttcatgagag aaactttgtt cctggcaaga gcattgtgga aaatatcatc 180
acctgcattg agaagagtta caagtccatc tttgttttgt ctcccaactt tgtccagagt 240
gaatggtgcc attatgaact ctactttgcc catcacaatc tctttcatga aggatctaat 300
agcttaatcc tgatcttgct ggaacccatt ccgcagtact ccattcctag cagttatcac 360
aagctcaaaa gtctcatggc caggaggact tatttggaat ggcccaagga aaagagcaaa 420
cgtggccttt tttgggctaa cttaagggca gccattaata ttaagctgac agagcaagca 480
aagaaa 486
<210> 31
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 31
Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Glu Asp Gly Lys Val
1 5 10 15
Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
20
<210> 32
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 32
ctgtgcgcac gcccacgccg cagccccgcc caagaagatg gcaaagtcta catcaacatg 60
ccaggcaggg gc 72
<210> 33
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 33
aaacatggag acagacacac tcctgctatg ggtgctgctg ctctgggttc caggttccac 60
cggt 64
<210> 34
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 34
ttttgggtgc tggtggtggt tgggggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 60
gcctttatta ttttctgggt g 81
<210> 35
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 35
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 36
<211> 5995
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 36
tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct 60
ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg 120
gggtggggtg gggcaggaca gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg 180
ggatgcggtg ggctctatgg cttctgaggc ggaaagaacc agctggggct cgactagagc 240
ttgcggaacc cttactcgag ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgctagc 300
caacaagctc gtcatcgctt tgcagaagag cagagaggat atgctcatcg tctaaagaac 360
tacccatttt attatatatt agtcacgata tctataacaa gaaaatatat atataataag 420
ttatcacgta agtagaacat gaaataacaa tataattatc gtatgagtta aatcttaaaa 480
gtcacgtaaa agataatcat gcgtcatttt gactcacgcg gtcgttatag ttcaaaatca 540
gtgacactta ccgcattgac aagcacgcct cacgggagct ccaagcggcg actgagatgt 600
cctaaatgca cagcgacgga ttcgcgctat ttagaaagag agagcaatat ttcaagaatg 660
catgcgtcaa ttttacgcag actatctttc tagggttaaa aaagatttgc gctttactcg 720
acctaaactt taaacacgtc atagaatctt cgtttgacaa aaaccacatt gtggccaagc 780
tgtgtgacgc gacgcgcgct aaagaatggc aaaccaagtc gcgcgaggta cccagctttt 840
gttcccttta gtgagggtta attccgagct tggcgtaatc atggtcatag ctgtttcctg 900
tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc ataaagtgta 960
aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc tcactgcccg 1020
ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga 1080
gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 1140
tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 1200
aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 1260
gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 1320
aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 1380
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 1440
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 1500
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 1560
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 1620
tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 1680
ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 1740
tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 1800
aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 1860
aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 1920
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 1980
ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 2040
acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 2100
ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 2160
gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 2220
taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 2280
tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 2340
gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 2400
cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 2460
aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 2520
cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 2580
tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 2640
gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 2700
tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 2760
gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 2820
ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 2880
cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 2940
agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 3000
gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgggaa attgtaaacg ttaatatttt 3060
gttaaaattc gcgttaaatt tttgttaaat cagctcattt tttaaccaat aggccgaaat 3120
cggcaaaatc ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt 3180
ttggaacaag agtccactat taaagaacgt ggactccaac gtcaaagggc gaaaaaccgt 3240
ctatcagggc gatggcccac tacgtgaacc atcaccctaa tcaagttttt tggggtcgag 3300
gtgccgtaaa gcactaaatc ggaaccctaa agggagcccc cgatttagag cttgacgggg 3360
aaagccggcg aacgtggcga gaaaggaagg gaagaaagcg aaaggagcgg gcgctagggc 3420
gctggcaagt gtagcggtca cgctgcgcgt aaccaccaca cccgccgcgc ttaatgcgcc 3480
gctacagggc gcgtcgcgcc attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc 3540
ggtgcgggcc tcttcgctat tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt 3600
aagttgggta acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 3660
gtaatacgac tcactatagg gcgaattgga gctcggtatt cacgacagca ggctgaataa 3720
taaaaaaatt agaaactatt atttaaccct agaaagataa tcatattgtg acgtacgtta 3780
aagataatca tgcgtaaaat tgacgcatgt gttttatcgg tctgtatatc gaggtttatt 3840
tattaatttg aatagatatt aagttttatt atatttacac ttacatacta ataataaatt 3900
caacaaacaa tttatttatg tttatttatt tattaaaaaa aaacaaaaac tcaaaatttc 3960
ttctataaag taacaaaact tttaaacatt ctctctttta caaaaataaa cttattttgt 4020
actttaaaaa cagtcatgtt gtattataaa ataagtaatt agcttaacct atacataata 4080
gaaacaaatt atacttatta gtcagtcaga aacaactttg gcacatatca atattatgct 4140
ctcgttaatc gcataacttc gtataatgta tgctatacga agttataatt cagatctttc 4200
ggcgcgccgg gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca 4260
ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct 4320
ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta 4380
acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac 4440
ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt 4500
aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag 4560
tacatctacg tattagtcat cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt 4620
cactctcccc atctcccccc cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt 4680
attttgtgca gcgatggggg cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg 4740
gcgaggggcg gggcggggcg aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc 4800
tccgaaagtt tccttttatg gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg 4860
cgcggcgggc gggagtcgct gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc 4920
gccgcccgcc ccggctctga ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc 4980
cttctcctcc gggctgtaat tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc 5040
tgcgtgaaag ccttaaaggg ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg 5100
ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct 5160
gtgagcgctg cgggcgcggc gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc 5220
ggccgggggc ggtgccccgc ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg 5280
ggtgtgtgcg tgggggggtg agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc 5340
cctgcacccc cctccccgag ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtgc 5400
ggggcgtggc gcggggctcg ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg 5460
cggggcgggg ccgcctcggg ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gccccggagc 5520
gccggcggct gtcgaggcgc ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag 5580
agggcgcagg gacttccttt gtcccaaatc tggcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc 5640
gcaccccctc tagcgggcgc gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg 5700
ggagggcctt cgtgcgtcgc cgcgccgccg tccccttctc catctccagc ctcggggctg 5760
ccgcaggggg acggctgcct tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt 5820
gtgaccggcg gctctagagc ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag 5880
ctcctgggca acgtgctggt tgttgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga attc 5934
<210> 37
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 37
ggaggaaaaa ctgtttcata cagaaggcgt 30
<210> 38
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 38
agatctagac tctagagggt atataatgga agctcgaatt ccagcttggc attccggtac 60
tgttggtaaa aagcttggca atccggtact gttggtaaag ccacc 105
<210> 39
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 39
aaaattgtcg ctcctgtcaa acaaactctt aactttgatt tactcaaact ggctggggat 60
gtagaaagca atccaggtcc a 81
<210> 40
<211> 720
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 40
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 41
<211> 4254
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 41
gctcgctgat cagcctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc 60
cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag 120
gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag 180
gacagcaagg gggaggattg ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct 240
atggcttctg aggcggaaag aaccagctgg ggctcgacta gagcttgcgg aacccttact 300
cgagataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatgc tagccaacaa gctcgtcatc 360
gctttgcaga agagcagaga ggatatgctc atcgtctaaa gaactaccca ttttattata 420
tattagtcac gatatctata acaagaaaat atatatataa taagttatca cgtaagtaga 480
acatgaaata acaatataat tatcgtatga gttaaatctt aaaagtcacg taaaagataa 540
tcatgcgtca ttttgactca cgcggtcgtt atagttcaaa atcagtgaca cttaccgcat 600
tgacaagcac gcctcacggg agctccaagc ggcgactgag atgtcctaaa tgcacagcga 660
cggattcgcg ctatttagaa agagagagca atatttcaag aatgcatgcg tcaattttac 720
gcagactatc tttctagggt taaaaaagat ttgcgcttta ctcgacctaa actttaaaca 780
cgtcatagaa tcttcgtttg acaaaaacca cattgtggcc aagctgtgtg acgcgacgcg 840
cgctaaagaa tggcaaacca agtcgcgcga ggtacccagc ttttgttccc tttagtgagg 900
gttaattccg agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc 960
gctcacaatt ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta 1020
atgagtgagc taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa 1080
cctgtcgtgc cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat 1140
tgggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg 1200
agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc 1260
aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt 1320
gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag 1380
tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc 1440
cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc 1500
ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt 1560
cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt 1620
atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc 1680
agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa 1740
gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa 1800
gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg 1860
tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga 1920
agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg 1980
gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg 2040
aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt 2100
aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact 2160
ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat 2220
gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg 2280
aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg 2340
ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat 2400
tgctacaggc atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc 2460
ccaacgatca aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt 2520
cggtcctccg atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc 2580
agcactgcat aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga 2640
gtactcaacc aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc 2700
gtcaatacgg gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa 2760
acgttcttcg gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta 2820
acccactcgt gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg 2880
agcaaaaaca ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg 2940
aatactcata ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat 3000
gagcggatac atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt 3060
tccccgaaaa gtgccacctg ggaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta 3120
aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat 3180
aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca 3240
ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc 3300
ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta 3360
aatcggaacc ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg 3420
gcgagaaagg aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg 3480
gtcacgctgc gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcg 3540
cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg 3600
ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca 3660
gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta 3720
tagggcgaat tggagctcgg tattcacgac agcaggctga ataataaaaa aattagaaac 3780
tattatttaa ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgcgta 3840
aaattgacgc atgtgtttta tcggtctgta tatcgaggtt tatttattaa tttgaataga 3900
tattaagttt tattatattt acacttacat actaataata aattcaacaa acaatttatt 3960
tatgtttatt tatttattaa aaaaaaacaa aaactcaaaa tttcttctat aaagtaacaa 4020
aacttttaaa cattctctct tttacaaaaa taaacttatt ttgtacttta aaaacagtca 4080
tgttgtatta taaaataagt aattagctta acctatacat aatagaaaca aattatactt 4140
attagtcagt cagaaacaac tttggcacat atcaatatta tgctctcgtt aatcgcataa 4200
cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat aattcagatc tttcggcgcg ccgg 4254
<210> 42
<211> 2497
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 42
agctttgcaa agatggataa agttttaaac agagaggaat ctttgcagct aatggacctt 60
ctaggtcttg aaaggagtgg gaattggctc cggtgcccgt cagtgggcag agcgcacatc 120
gcccacagtc cccgagaagt tggggggagg ggtcggcaat tgaaccggtg cctagagaag 180
gtggcgcggg gtaaactggg aaagtgatgt cgtgtactgg ctccgccttt ttcccgaggg 240
tgggggagaa ccgtatataa gtgcagtagt cgccgtgaac gttctttttc gcaacgggtt 300
tgccgccaga acacaggtaa gtgccgtgtg tggttcccgc gggcctggcc tctttacggg 360
ttatggccct tgcgtgcctt gaattacttc cactggctgc agtacgtgat tcttgatccc 420
gagcttcggg ttggaagtgg gtgggagagt tcgaggcctt gcgcttaagg agccccttcg 480
cctcgtgctt gagttgaggc ctggcctggg cgctggggcc gccgcgtgcg aatctggtgg 540
caccttcgcg cctgtctcgc tgctttcgat aagtctctag ccatttaaaa tttttgatga 600
cctgctgcga cgcttttttt ctggcaagat agtcttgtaa atgcgggcca agatctgcac 660
actggtattt cggtttttgg ggccgcgggc ggcgacgggg cccgtgcgtc ccagcgcaca 720
tgttcggcga ggcggggcct gcgagcgcgg ccaccgagaa tcggacgggg gtagtctcaa 780
gctggccggc ctgctctggt gcctggcctc gcgccgccgt gtatcgcccc gccctgggcg 840
gcaaggctgg cccggtcggc accagttgcg tgagcggaaa gatggccgct tcccggccct 900
gctgcaggga gctcaaaatg gaggacgcgg cgctcgggag agcgggcggg tgagtcaccc 960
acacaaagga aaagggcctt tccgtcctca gccgtcgctt catgtgactc cacggagtac 1020
cgggcgccgt ccaggcacct cgattagttc tcgagctttt ggagtacgtc gtctttaggt 1080
tggggggagg ggttttatgc gatggagttt ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt 1140
aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga gtttggatct 1200
tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcg 1260
tgaggaattt cgacatttaa atttaattaa tctcgacggt atcggttaac ttttaaaaga 1320
aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac 1380
atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttcc gatcacgaga 1440
ctagcctcga ggtttaaact acgggatccg gccattacgg ccgaattcca ccatgtctag 1500
attagataaa agtaaagtga ttaacagcgc attagagctg cttaatgagg tcggaatcga 1560
aggtttaaca acccgtaaac tcgcccagaa gcttggtgta gagcagccta cactgtattg 1620
gcatgtaaaa aataagcggg ctttgctcga cgccttagcc attgagatgt tagataggca 1680
ccatactcac ttttgccctt taaaagggga aagctggcaa gattttttac gcaataacgc 1740
taaaagtttt agatgtgctt tactaagtca tcgcaatgga gcaaaagtac attcagatac 1800
acggcctaca gaaaaacagt atgaaactct cgaaaatcaa ttagcctttt tatgccaaca 1860
aggtttttca ctagagaacg cgttatatgc actcagcgct gtggggcatt ttactttagg 1920
ttgcgtattg gaagatcaag agcatcaagt cgctaaagaa gaaagggaaa cacctactac 1980
tgatagtatg ccgccattat tacgacaagc tatcgaatta tttgatcacc aaggtgcaga 2040
gccagccttc ttattcggcc ttgaattgat catatgcgga ttagaaaaac aacttaaatg 2100
tgaaagtggg tccgcgtaca gccgcgcgcg tacgaaaaac aattacgggt ctaccatcga 2160
gggcctgctc gatctcccgg acgacgacgc ccccgaagag gcggggctgg cggctccgcg 2220
cctgtccttt ctccccgcgg gacacacgcg cagactgtcg acggcccccc cgaccgatgt 2280
cagcctgggg gacgagctcc acttagacgg cgaggacgtg gcgatggcgc atgccgacgc 2340
gctagacgat ttcgatctgg acatgttggg ggacggggat tccccgggtc cgggatttac 2400
cccccacgac tccgccccct acggcgctct ggatatggcc gacttcgagt ttgagcagat 2460
gtttaccgat gcccttggaa ttgacgagta cggtggg 2497
<210> 43
<211> 2053
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 43
agagacggcc gcatcttctt gtgcagtgcc agcctcgtcc cgtagacaaa cctgcaggat 60
gggcagcagc ctggacgacg agcacatcct gagcgccctg ctgcagagcg acgacgagct 120
ggtcggcgag gacagcgaca gcgaggtgag cgaccacgtg agcgaggacg acgtgcagtc 180
cgacaccgag gaggccttca tcgacgaggt gcacgaggtg cagcctacca gcagcggctc 240
cgagatcctg gacgagcaga acgtgatcga gcagcccggc agctccctgg ccagcaacag 300
gatcctgacc ctgccccaga ggaccatcag gggcaagaac aagcactgct ggtccacctc 360
caagcccacc aggcggagca gggtgtccgc cctgaacatc gtgagaagcc agaggggccc 420
caccaggatg tgcaggaaca tctacgaccc cctgctgtgc ttcaagctgt tcttcaccga 480
cgagatcatc agcgagatcg tgaagtggac caacgccgag atcagcctga agaggcggga 540
gagcatgacc tccgccacct tcagggacac caacgaggac gagatctacg ccttcttcgg 600
catcctggtg atgaccgccg tgaggaagga caaccacatg agcaccgacg acctgttcga 660
cagatccctg agcatggtgt acgtgagcgt gatgagcagg gacagattcg acttcctgat 720
cagatgcctg aggatggacg acaagagcat caggcccacc ctgcgggaga acgacgtgtt 780
cacccccgtg agaaagatct gggacctgtt catccaccag tgcatccaga actacacccc 840
tggcgcccac ctgaccatcg acgagcagct gctgggcttc aggggcaggt gccccttcag 900
ggtctatatc cccaacaagc ccagcaagta cggcatcaag atcctgatga tgtgcgacag 960
cggcaccaag tacatgatca acggcatgcc ctacctgggc aggggcaccc agaccaacgg 1020
cgtgcccctg ggcgagtact acgtgaagga gctgtccaag cccgtccacg gcagctgcag 1080
aaacatcacc tgcgacaact ggttcaccag catccccctg gccaagaacc tgctgcagga 1140
gccctacaag ctgaccatcg tgggcaccgt gagaagcaac aagagagaga tccccgaggt 1200
cctgaagaac agcaggtcca ggcccgtggg caccagcatg ttctgcttcg acggccccct 1260
gaccctggtg tcctacaagc ccaagcccgc caagatggtg tacctgctgt ccagctgcga 1320
cgaggacgcc agcatcaacg agagcaccgg caagccccag atggtgatgt actacaacca 1380
gaccaagggc ggcgtggaca ccctggacca gatgtgcagc gtgatgacct gcagcagaaa 1440
gaccaacagg tggcccatgg ccctgctgta cggcatgatc aacatcgcct gcatcaacag 1500
cttcatcatc tacagccaca acgtgagcag caagggcgag aaggtgcaga gccggaaaaa 1560
gttcatgcgg aacctgtaca tgggcctgac ctccagcttc atgaggaaga ggctggaggc 1620
ccccaccctg aagagatacc tgagggacaa catcagcaac atcctgccca aagaggtgcc 1680
cggcaccagc gacgacagca ccgaggagcc cgtgatgaag aagaggacct actgcaccta 1740
ctgtcccagc aagatcagaa gaaaggccag cgccagctgc aagaagtgta agaaggtcat 1800
ctgccgggag cacaacatcg acatgtgcca gagctgtttc tgattaatta agaaaccctg 1860
gaccacccac cccagcaagg acactgagca agagaggccc tatcccaact cggcccccaa 1920
cactgagcat ctccctcaca atttccatcc cagaccccca taataacagg aggggcctag 1980
ggagccctcc ctactctctt gaataccatc aataaagttc gctgcaccca caaaaaaaaa 2040
aaaaaaaaaa aaa 2053
<210> 44
<211> 9601
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 44
gataatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt 60
gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc 120
cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag 180
ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc 240
actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc 300
cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg 360
ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg 420
ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc 480
ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt 540
cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcatcggtac 600
gtatggccag gtacctttaa gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt 660
tttaaaagaa aaggggggac tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct 720
ttttgcttgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta 780
actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg 840
tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg 900
gaaaatctct agcagcatct agaattaatt ccgtgtattc tatagtgtca cctaaatcgt 960
atgtgtatga tacataaggt tatgtattaa ttgtagccgc gttctaacga caatatgtac 1020
aagcctaatt gtgtagcatc tggcttactg aagcagaccc tatcatctct ctcgtaaact 1080
gccgtcagag tcggtttggt tggacgaacc ttctgagttt ctggtaacgc cgtcccgcac 1140
ccggaaatgg tcagcgaacc aatcagcagg gtcatcgcta gccagatcct ctacgccgga 1200
cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg ctggcgccta tatcgccgac 1260
atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca tgagcgcttg tttcggcgtg 1320
ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg ccatctcctt gcatgcacca 1380
ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac tgggctgctt cctaatgcag 1440
gagtcgcata agggagagcg tcgaatggtg cactctcagt acaatctgct ctgatgccgc 1500
atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct 1560
gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag 1620
gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc ctcgtgatac gcctattttt 1680
ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca ggtggcactt ttcggggaaa 1740
tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat 1800
gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagta tgagtattca 1860
acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt tgccttcctg tttttgctca 1920
cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag ttgggtgcac gagtgggtta 1980
catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt tttcgccccg aagaacgttt 2040
tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg gtattatccc gtattgacgc 2100
cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag aatgacttgg ttgagtactc 2160
accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta agagaattat gcagtgctgc 2220
cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg acaacgatcg gaggaccgaa 2280
ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta actcgccttg atcgttggga 2340
accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac accacgatgc ctgtagcaat 2400
ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt actctagctt cccggcaaca 2460
attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca cttctgcgct cggcccttcc 2520
ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag cgtgggtctc gcggtatcat 2580
tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta gttatctaca cgacggggag 2640
tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag ataggtgcct cactgattaa 2700
gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca 2760
tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatga ccaaaatccc 2820
ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta gaaaagatca aaggatcttc 2880
ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc 2940
agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt 3000
cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt 3060
caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc 3120
tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa 3180
ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac 3240
ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gcattgagaa agcgccacgc ttcccgaagg 3300
gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga 3360
gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact 3420
tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa 3480
cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc 3540
gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg 3600
ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat 3660
acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa tgcagctgtg gaatgtgtgt 3720
cagttagggt gtggaaagtc cccaggctcc ccagcaggca gaagtatgca aagcatgcat 3780
ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg 3840
caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg 3900
cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt 3960
tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt 4020
tttggaggcc taggcttttg caaaaagctt ggacacaaga caggcttgcg agatatgttt 4080
gagaatacca ctttatcccg cgtcagggag aggcagtgcg taaaaagacg cggactcatg 4140
tgaaatactg gtttttagtg cgccagatct ctataatctc gcgcaaccta ttttcccctc 4200
gaacactttt taagccgtag ataaacaggc tgggacactt cacatgagcg aaaaatacat 4260
cgtcacctgg gacatgttgc agatccatgc acgtaaactc gcaagccgac tgatgccttc 4320
tgaacaatgg aaaggcatta ttgccgtaag ccgtggcggt ctgtaccggg tgcgttactg 4380
gcgcgtgaac tgggtattcg tcatgtcgat accgtttgta tttccagcta cgatcacgac 4440
aaccagcgcg agcttaaagt gctgaaacgc gcagaaggcg atggcgaagg cttcatcgtt 4500
attgatgacc tggtggatac cggtggtact gcggttgcga ttcgtgaaat gtatccaaaa 4560
gcgcactttg tcaccatctt cgcaaaaccg gctggtcgtc cgctggttga tgactatgtt 4620
gttgatatcc cgcaagatac ctggattgaa cagccgtggg atatgggcgt cgtattcgtc 4680
ccgccaatct ccggtcgcta atcttttcaa cgcctggcac tgccgggcgt tgttcttttt 4740
aacttcaggc gggttacaat agtttccagt aagtattctg gaggctgcat ccatgacaca 4800
ggcaaacctg agcgaaaccc tgttcaaacc ccgctttaaa catcctgaaa cctcgacgct 4860
agtccgccgc tttaatcacg gcgcacaacc gcctgtgcag tcggcccttg atggtaaaac 4920
catccctcac tggtatcgca tgattaaccg tctgatgtgg atctggcgcg gcattgaccc 4980
acgcgaaatc ctcgacgtcc aggcacgtat tgtgatgagc gatgccgaac gtaccgacga 5040
tgatttatac gatacggtga ttggctaccg tggcggcaac tggatttatg agtgggcccc 5100
ggatctttgt gaaggaacct tacttctgtg gtgtgacata attggacaaa ctacctacag 5160
agatttaaag ctctaaggta aatataaaat ttttaagtgt ataatgtgtt aaactactga 5220
ttctaattgt ttgtgtattt tagattccaa cctatggaac tgatgaatgg gagcagtggt 5280
ggaatgcctt taatgaggaa aacctgtttt gctcagaaga aatgccatct agtgatgatg 5340
aggctactgc tgactctcaa cattctactc ctccaaaaaa gaagagaaag gtagaagacc 5400
ccaaggactt tccttcagaa ttgctaagtt ttttgagtca tgctgtgttt agtaatagaa 5460
ctcttgcttg ctttgctatt tacaccacaa aggaaaaagc tgcactgcta tacaagaaaa 5520
ttatggaaaa atattctgta acctttataa gtaggcataa cagttataat cataacatac 5580
tgttttttct tactccacac aggcatagag tgtctgctat taataactat gctcaaaaat 5640
tgtgtacctt tagcttttta atttgtaaag gggttaataa ggaatatttg atgtatagtg 5700
ccttgactag agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa 5760
aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac 5820
ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat 5880
aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttat 5940
catgtctgga tcaactggat aactcaagct aaccaaaatc atcccaaact tcccacccca 6000
taccctatta ccactgccaa ttacctagtg gtttcattta ctctaaacct gtgattcctc 6060
tgaattattt tcattttaaa gaaattgtat ttgttaaata tgtactacaa acttagtagt 6120
tggaagggct aattcactcc caaagaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 6180
cacaaggcta cttccctgat tagcagaact acacaccagg gccaggggtc agatatccac 6240
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagcc agataaggta gaagaggcca 6300
ataaaggaga gaacaccagc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 6360
agagagaagt gttagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac gtggcccgag 6420
agctgcatcc ggagtacttc aagaactgct gatatcgagc ttgctacaag ggactttccg 6480
ctggggactt tccagggagg cgtggcctgg gcgggactgg ggagtggcga gccctcagat 6540
cctgcatata agcagctgct ttttgcctgt actgggtctc tctggttaga ccagatctga 6600
gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta agcctcaata aagcttgcct 6660
tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc 6720
agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag 6780
cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg 6840
caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga 6900
aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg 6960
aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga aaaaatataa attaaaacat atagtatggg 7020
caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct 7080
gtagacaaat actgggacag ctacaaccat cccttcagac aggatcagaa gaacttagat 7140
cattatataa tacagtagca accctctatt gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca 7200
ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc 7260
aagcggccgc tgatcttcag acctggagga ggagatatga gggacaattg gagaagtgaa 7320
ttatataaat ataaagtagt aaaaattgaa ccattaggag tagcacccac caaggcaaag 7380
agaagagtgg tgcagagaga aaaaagagca gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc 7440
ttgggagcag caggaagcac tatgggcgca gcgtcaatga cgctgacggt acaggccaga 7500
caattattgt ctggtatagt gcagcagcag aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa 7560
cagcatctgt tgcaactcac agtctggggc atcaagcagc tccaggcaag aatcctggct 7620
gtggaaagat acctaaagga tcaacagctc ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc 7680
atttgcacca ctgctgtgcc ttggaatgct agttggagta ataaatctct ggaacagatt 7740
tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac aagcttaata 7800
cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga attattggaa 7860
ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa caaattggct gtggtatata 7920
aaattattca taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt 7980
tctatagtga atagagttag gcagggatat tcaccattat cgtttcagac ccacctccca 8040
accccgaggg gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga gagagacaga 8100
gacagatcca ttcgattagt gaacggatct cgacggtatc gatgtcgacg ataagctttg 8160
caaagatgga taaagtttta aacagagagg aatctttgca gctaatggac cttctaggtc 8220
ttgaaaggag tgggaattgg ctccggtgcc cgtcagtggg cagagcgcac atcgcccaca 8280
gtccccgaga agttgggggg aggggtcggc aattgaaccg gtgcctagag aaggtggcgc 8340
ggggtaaact gggaaagtga tgtcgtgtac tggctccgcc tttttcccga gggtggggga 8400
gaaccgtata taagtgcagt agtcgccgtg aacgttcttt ttcgcaacgg gtttgccgcc 8460
agaacacagg taagtgccgt gtgtggttcc cgcgggcctg gcctctttac gggttatggc 8520
ccttgcgtgc cttgaattac ttccactggc tgcagtacgt gattcttgat cccgagcttc 8580
gggttggaag tgggtgggag agttcgaggc cttgcgctta aggagcccct tcgcctcgtg 8640
cttgagttga ggcctggcct gggcgctggg gccgccgcgt gcgaatctgg tggcaccttc 8700
gcgcctgtct cgctgctttc gataagtctc tagccattta aaatttttga tgacctgctg 8760
cgacgctttt tttctggcaa gatagtcttg taaatgcggg ccaagatctg cacactggta 8820
tttcggtttt tggggccgcg ggcggcgacg gggcccgtgc gtcccagcgc acatgttcgg 8880
cgaggcgggg cctgcgagcg cggccaccga gaatcggacg ggggtagtct caagctggcc 8940
ggcctgctct ggtgcctggc ctcgcgccgc cgtgtatcgc cccgccctgg gcggcaaggc 9000
tggcccggtc ggcaccagtt gcgtgagcgg aaagatggcc gcttcccggc cctgctgcag 9060
ggagctcaaa atggaggacg cggcgctcgg gagagcgggc gggtgagtca cccacacaaa 9120
ggaaaagggc ctttccgtcc tcagccgtcg cttcatgtga ctccacggag taccgggcgc 9180
cgtccaggca cctcgattag ttctcgagct tttggagtac gtcgtcttta ggttgggggg 9240
aggggtttta tgcgatggag tttccccaca ctgagtgggt ggagactgaa gttaggccag 9300
cttggcactt gatgtaattc tccttggaat ttgccctttt tgagtttgga tcttggttca 9360
ttctcaagcc tcagacagtg gttcaaagtt tttttcttcc atttcaggtg tcgtgaggaa 9420
tttcgacatt taaatttaat taatctcgac ggtatcggtt aacttttaaa agaaaagggg 9480
ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa 9540
ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa ttcaaaattt tccgatcacg agactagcct 9600
c 9601
<210> 45
<211> 3591
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 45
gatatctata acaagaaaat atatatataa taagttatca cgtaagtaga acatgaaata 60
acaatataat tatcgtatga gttaaatctt aaaagtcacg taaaagataa tcatgcgtca 120
ttttgactca cgcggtcgtt atagttcaaa atcagtgaca cttaccgcat tgacaagcac 180
gcctcacggg agctccaagc ggcgactgag atgtcctaaa tgcacagcga cggattcgcg 240
ctatttagaa agagagagca atatttcaag aatgcatgcg tcaattttac gcagactatc 300
tttctagggt taaaaaagat ttgcgcttta ctcgacctaa actttaaaca cgtcatagaa 360
tcttcgtttg acaaaaacca cattgtggcc aagctgtgtg acgcgacgcg cgctaaagaa 420
tggcaaacca agtcgcgcga ggtacccagc ttttgttccc tttagtgagg gttaattccg 480
agcttggcgt aatcatggtc atagctgttt cctgtgtgaa attgttatcc gctcacaatt 540
ccacacaaca tacgagccgg aagcataaag tgtaaagcct ggggtgccta atgagtgagc 600
taactcacat taattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc 660
cagctgcatt aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgctct 720
tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca 780
gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac 840
atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt 900
ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg 960
cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 1020
tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 1080
gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 1140
aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 1200
tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 1260
aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct 1320
aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc 1380
ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt 1440
ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg 1500
atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc 1560
atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa 1620
tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt accaatgctt aatcagtgag 1680
gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag ttgcctgact ccccgtcgtg 1740
tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca gtgctgcaat gataccgcga 1800
gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc agccagccgg aagggccgag 1860
cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt ctattaattg ttgccgggaa 1920
gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg ttgttgccat tgctacaggc 1980
atcgtggtgt cacgctcgtc gtttggtatg gcttcattca gctccggttc ccaacgatca 2040
aggcgagtta catgatcccc catgttgtgc aaaaaagcgg ttagctcctt cggtcctccg 2100
atcgttgtca gaagtaagtt ggccgcagtg ttatcactca tggttatggc agcactgcat 2160
aattctctta ctgtcatgcc atccgtaaga tgcttttctg tgactggtga gtactcaacc 2220
aagtcattct gagaatagtg tatgcggcga ccgagttgct cttgcccggc gtcaatacgg 2280
gataataccg cgccacatag cagaacttta aaagtgctca tcattggaaa acgttcttcg 2340
gggcgaaaac tctcaaggat cttaccgctg ttgagatcca gttcgatgta acccactcgt 2400
gcacccaact gatcttcagc atcttttact ttcaccagcg tttctgggtg agcaaaaaca 2460
ggaaggcaaa atgccgcaaa aaagggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata 2520
ctcttccttt ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac 2580
atatttgaat gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa 2640
gtgccacctg ggaaattgta aacgttaata ttttgttaaa attcgcgtta aatttttgtt 2700
aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa aatcccttat aaatcaaaag 2760
aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa caagagtcca ctattaaaga 2820
acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca gggcgatggc ccactacgtg 2880
aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg taaagcacta aatcggaacc 2940
ctaaagggag cccccgattt agagcttgac ggggaaagcc ggcgaacgtg gcgagaaagg 3000
aagggaagaa agcgaaagga gcgggcgcta gggcgctggc aagtgtagcg gtcacgctgc 3060
gcgtaaccac cacacccgcc gcgcttaatg cgccgctaca gggcgcgtcg cgccattcgc 3120
cattcaggct gcgcaactgt tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc 3180
agctggcgaa agggggatgt gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc 3240
agtcacgacg ttgtaaaacg acggccagtg aattgtaata cgactcacta tagggcgaat 3300
tggagctcgg tattcacgac agcaggctga ataataaaaa aattagaaac tattatttaa 3360
ccctagaaag ataatcatat tgtgacgtac gttaaagata atcatgcgta aaattgacgc 3420
atgtgtttta tcggtctgta tatcgaggtt tatttattaa tttgaataga tattaagttt 3480
tattatattt acacttacat actaataata aattcaacaa acaatttatt tatgtttatt 3540
tatttattaa aaaaaaacaa aaactcaaaa tttcttctat aaagtaacaa a 3591

Claims (10)

1.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞过表达HIL-6和/或L-GP130。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞，其特征在于，所述HIL-6的氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示，或与SEQ ID NO:1具有80％以上同源性的具有相同或相似活性的氨基酸序列；
优选地，所述HIL-6的核酸序列如SEQ ID NO:2所示；
优选地，所述L-GP130的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，或与SEQ ID NO:3具有80％以上同源性的具有相同或相似活性的氨基酸序列；
优选地，所述L-GP130的核酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1或2所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、NK细胞或巨噬细胞中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+CD8+T细胞、NKT细胞或γδT细胞中的任意一种或至少两种的组合，优选为CD4+T细胞、CD8+T细胞或CD4+CD8+T细胞，进一步优选为Th1细胞、记忆性T细胞或中枢记忆性T细胞。
4.根据权利要求1-3任一项所述的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞修饰有一种或者两种以上的CAR分子和/或TCR分子。
5.根据权利要求4所述的免疫细胞，其特征在于，所述CAR分子的胞外scFv序列识别抗原包括5T4、α5β1-整联蛋白、707-AP、AFP、ART-4、B7H4、B7-H3、BAGE、β-联蛋白/m、Bcr-abl、MN/C IX抗体、CA125、CAMEL、CAP-1、CASP-8、CD4、CD19、CD20、CD22、CD25、CDC27/m、CD30、CD33、CD52、CD56、CD80、CDK4/m、CEA、CT、Cyp-B、DAM、EGFR、ErbB3、ELF2M、EMMPRIN、EpCam、ETV6-AML1、G250、GAGE、GnT-V、Gp100、HAGE、HER-2、HLA-A*0201-R170I、HPV-E7、HSP70-2M、HST-2、hTERT、hTRT、iCE、IGF-1R、IL-2R、IL-5、KIAA0205、LAGE、LDLR/FUT、MAGE、MART-1/melan-A、MART-2/Ski、MC1R、Mesothelin、肌球蛋白/m、MUC1、MUM-1、MUM-2、MUM-3、PSCA、NA88-A、PAP、蛋白酶-3、GPC3、p190minor bcr-abl、Pml/RARR、PRAME、PSA、PSM、PSMA、RAGE、RU1、RU2、SAGE、SART-1、SART-3、生存蛋白、TEL/AML1、PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM3、LAG3、TGF3、TPI/m、TRP-1、TRP-2、TRP-2/INT2、VEGF、WT1、IL-13RIN、CD123、GUCY2C、NY-Eso-1或NY-Eso-B中的任意一种，优选为CD19、MUC1、GPC3、Mesothelin、PSCA或HER2中的任意一种；
优选地，所述抗CD19 CAR的scFv1的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，核酸序列如SEQID NO:6所示；
优选地，所述抗CD19 CAR的scFv2-7的氨基酸序列如SEQ ID NO:7-12所示；
优选地，所述抗GPC3 CAR的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，核酸序列如SEQID NO:14所示；
优选地，所述抗MUC1 CAR的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，核酸序列如SEQID NO:16所示；
优选地，所述抗Mesothelin的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示，核酸序列如SEQID NO:18所示；
优选地，所述抗PSCA的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，核酸序列如SEQ IDNO:20所示；
优选地，所述抗HER2的scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，核酸序列如SEQ IDNO:22所示；
优选地，所述CAR分子的胞内共刺激信号传导结构域包括CD28、4-1BB、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、DAP10、CD27、OX40、CD30、CD40、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、NKG2D、NKp46、NKp30、NKp44、DNAM1、B7-H3或CD83中的任意一种或至少两种分子的胞内结构域组合；
优选地，所述TLR2的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示，核酸序列如SEQ ID NO:24所示；
优选地，所述4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示，核酸序列如SEQ ID NO:26所示；
优选地，所述CD28的氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示，核酸序列如SEQ ID NO:28所示；
优选地，所述TLR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示，核酸序列如SEQ ID NO:30所示；
优选地，所述DAP10的氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示，核酸序列如SEQ ID NO:32所示；
优选地，所述CAR分子的信号肽的核酸序列如SEQ ID NO:33所示；
优选地，所述CAR分子的跨膜区的核酸序列如SEQ ID NO:34所示；
优选地，所述CAR分子的CD3ζ的核酸序列如SEQ ID NO:35所示。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将HIL-6和/或L-GP130过表达于免疫细胞中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述过表达包括持续性过表达和/或条件性诱导过表达，优选为条件性诱导过表达；
优选地，所述条件性诱导过表达包括CAR识别激活诱导过表达和/或外源化合物诱导过表达；
优选地，在所述CAR识别激活诱导过表达体系中，质粒载体包括pWPXLd-CAR-2A-GFP、pWPXLd(无启动子)-NFAT重复序列-IL2启动子-HIL-6-2A-GFP和pWPXLd(无启动子)-NFAT重复序列-IL2启动子-L-GP130-2A-GFP中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述NFAT的核酸序列如SEQ ID NO:37所示；
优选地，所示IL2启动子的核酸序列如SEQ ID NO:38所示；
在所述外源化合物诱导过表达系统中，质粒载体包括PB-TRE-HIL-6-2A-GFP、PB-TRE-L-GP130-2A-GFP，与PB-CAG-rtTA和PB-PL623中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述外源化合物包括强力霉素。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述过表达采用脂质体转导、电转导或病毒转导的方式；
优选地，所述过表达采用的载体包括病毒载体和/或PB载体；
优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺病毒载体或逆转录病毒载体中的任意一种或至少两种的组合，优选为慢病毒载体，进一步优选为慢病毒载体pWPXLd；
优选地，所述PB载体的核酸序列如SEQ ID NO:36所示；
优选地，所述慢病毒载体pWPXLd的核酸序列如SEQ ID NO:44所示。
9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1-5任一项所述的免疫细胞；
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
10.一种如权利要求1-5任一项所述的免疫细胞和/或如权利要求9所述的药物组合物在制备肿瘤和/或艾滋病治疗药物中的用途；
优选地，所述肿瘤包括血液肿瘤和/或实体瘤；
优选地，所述血液肿瘤包括白血病、多发性骨髓瘤或恶性淋巴瘤；
优选地，所述白血病包括B急性淋系白血病、T急性淋巴细胞白血病、急性髓系细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病或慢性髓系细胞白血病；
优选地，所述实体瘤包括肺癌、肝癌、乳腺癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌，优选为肝癌、肺癌。
CN201910372692.5A 2019-04-03 2019-05-06 一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用 Active CN110055224B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2020/088806 WO2020200325A1 (zh) 2019-04-03 2020-05-06 一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用
AU2020255735A AU2020255735B2 (en) 2019-04-03 2020-05-06 Genetically modified immune cell, preparation method therefor, and application
US17/600,884 US20220185858A1 (en) 2019-04-03 2020-05-06 Genetically modified immune cell, preparation method therefor, and application

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910267702 2019-04-03
CN2019102677029 2019-04-03

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110055224A true CN110055224A (zh) 2019-07-26
CN110055224B CN110055224B (zh) 2023-06-30

Family

ID=67322391

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910372692.5A Active CN110055224B (zh) 2019-04-03 2019-05-06 一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220185858A1 (zh)
CN (1) CN110055224B (zh)
AU (1) AU2020255735B2 (zh)
WO (1) WO2020200325A1 (zh)

Cited By (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110684739A (zh) * 2019-11-11 2020-01-14 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用
WO2020200325A1 (zh) * 2019-04-03 2020-10-08 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用
CN111763264A (zh) * 2020-07-31 2020-10-13 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种靶向psca的嵌合抗原受体及其应用
CN111826400A (zh) * 2020-07-21 2020-10-27 中科宝承生物医学科技有限公司 一种双特异性抗体nk细胞制备方法及其细胞和应用
CN111848819A (zh) * 2020-07-31 2020-10-30 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种靶向msln的嵌合抗原受体及其应用
CN111875712A (zh) * 2020-07-31 2020-11-03 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种增强型靶向muc1的嵌合抗原受体及其应用
CN111875711A (zh) * 2020-07-31 2020-11-03 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种增强型免疫细胞及其应用
CN112175998A (zh) * 2020-10-12 2021-01-05 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用
CN112210018A (zh) * 2020-10-12 2021-01-12 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种靶向gpc3的嵌合抗原受体及其应用
CN112210539A (zh) * 2020-10-12 2021-01-12 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种第四代car-t细胞及其应用
CN112522207A (zh) * 2020-12-21 2021-03-19 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种靶向muc1的car-t细胞及其应用
CN112608902A (zh) * 2020-12-21 2021-04-06 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种第四代car-t细胞及其应用
CN114634580A (zh) * 2022-03-21 2022-06-17 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种膜锚定式il-15超级复合物的研制及其在肿瘤免疫细胞治疗中的应用
CN114774364A (zh) * 2022-04-26 2022-07-22 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN115820697A (zh) * 2022-09-23 2023-03-21 中国海洋大学 一种免疫细胞及其制备方法和应用
CN116836299A (zh) * 2023-06-09 2023-10-03 上海恩凯细胞技术有限公司 嵌合抗原受体及其应用
WO2024027815A1 (zh) * 2022-08-05 2024-02-08 江苏恒瑞医药股份有限公司 特异性结合gucy2c和cd3的抗原结合分子及其医药用途

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024039744A1 (en) * 2022-08-16 2024-02-22 Ourotech, Inc. Methods of forming patient-derived 3d cell cultures for tracking live immune-tumor interactions
US20240342284A1 (en) 2023-03-03 2024-10-17 Arsenal Biosciences, Inc. Systems targeting psma and ca9
WO2024192100A1 (en) 2023-03-13 2024-09-19 Arsenal Biosciences, Inc. Synthetic pathway activators

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5536657A (en) * 1993-07-19 1996-07-16 Hoffmann-La Roche Inc. Recombinant DNA encoding human receptor for interleukin-12
US7112436B1 (en) * 1996-03-07 2006-09-26 Angewandte Gentechnologie Systeme Gmbh Conjugate for modifying interactions between proteins
WO2011063198A2 (en) * 2009-11-20 2011-05-26 St. Jude Children's Research Hospital Methods and compositions for modulating the activity of the interleukin-35 receptor complex
CN102089326A (zh) * 2008-05-13 2011-06-08 诺维莫尼公司 抗白细胞介素-6/白细胞介素-6受体的抗体及其使用方法
CN102264390A (zh) * 2008-07-02 2011-11-30 新兴产品开发西雅图有限公司 Il6免疫治疗
CN107573419A (zh) * 2017-01-24 2018-01-12 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种增强t细胞抗肿瘤活性的核酸分子
US20180022801A1 (en) * 2007-05-21 2018-01-25 Alderbio Holdings Llc Antibodies to il-6 and use thereof
US20180057794A1 (en) * 2015-01-23 2018-03-01 Musc Foundation For Research Development Cytokine receptor genes and the use thereof to enhance therapy
CN107827990A (zh) * 2017-10-30 2018-03-23 河北森朗生物科技有限公司 一种多肽、编码其的核酸、其修饰的t淋巴细胞及其应用
WO2018073391A1 (en) * 2016-10-19 2018-04-26 Cellectis Targeted gene insertion for improved immune cells therapy
CN109468284A (zh) * 2018-11-30 2019-03-15 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于cd19和psma的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2612538T3 (es) * 2007-05-29 2017-05-17 Christopher B. Reid Métodos para producción y usos de poblaciones de células multipotentes, poblaciones de células pluripotentes, poblaciones de células diferenciadas, y poblaciones de células resistentes a VIH
CN108148863B (zh) * 2016-12-05 2019-12-17 上海优卡迪生物医药科技有限公司 一种封闭il6r的用于缓解crs的car-t转基因载体及其构建方法和应用
KR20200075851A (ko) * 2017-10-19 2020-06-26 셀렉티스 개선된 면역 세포들 치료를 위한 nk 억제제들의 타겟인 유전자 통합
CN110055224B (zh) * 2019-04-03 2023-06-30 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用

Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5536657A (en) * 1993-07-19 1996-07-16 Hoffmann-La Roche Inc. Recombinant DNA encoding human receptor for interleukin-12
US7112436B1 (en) * 1996-03-07 2006-09-26 Angewandte Gentechnologie Systeme Gmbh Conjugate for modifying interactions between proteins
US20180022801A1 (en) * 2007-05-21 2018-01-25 Alderbio Holdings Llc Antibodies to il-6 and use thereof
CN102089326A (zh) * 2008-05-13 2011-06-08 诺维莫尼公司 抗白细胞介素-6/白细胞介素-6受体的抗体及其使用方法
CN102264390A (zh) * 2008-07-02 2011-11-30 新兴产品开发西雅图有限公司 Il6免疫治疗
WO2011063198A2 (en) * 2009-11-20 2011-05-26 St. Jude Children's Research Hospital Methods and compositions for modulating the activity of the interleukin-35 receptor complex
US20180057794A1 (en) * 2015-01-23 2018-03-01 Musc Foundation For Research Development Cytokine receptor genes and the use thereof to enhance therapy
WO2018073391A1 (en) * 2016-10-19 2018-04-26 Cellectis Targeted gene insertion for improved immune cells therapy
CN107573419A (zh) * 2017-01-24 2018-01-12 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种增强t细胞抗肿瘤活性的核酸分子
CN107827990A (zh) * 2017-10-30 2018-03-23 河北森朗生物科技有限公司 一种多肽、编码其的核酸、其修饰的t淋巴细胞及其应用
CN109468284A (zh) * 2018-11-30 2019-03-15 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于cd19和psma的双重嵌合抗原受体基因修饰的免疫细胞及其应用

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KOROTAEVA AA ET AL.: "interleukin-6 receptor subunit beta isoform 8 [Homo sapiens]", 《GENBANK:NP_001351208.1》 *
STEFAN ROSE-JOH: "IL-6 Trans-Signaling via the Soluble IL-6 Receptor: Importance for the Pro-Inflammatory Activities of IL-6", 《INT. J. BIOL. SCI.》 *
杨镇珲等: "hIL-6与其受体作用的结构基础及拮抗剂的研究进展", 《中国生物化学与分子生物学报》 *
秦云龙等: "中国流行株HIV-1gag和hIL-2/hIL-6核酸疫苗构建与实验免疫研究", 《免疫学杂志》 *
郄春花等: "Hyper-IL-6基因诱导的体内抗肝癌免疫功能", 《细胞与分子免疫学杂志》 *

Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020200325A1 (zh) * 2019-04-03 2020-10-08 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用
CN110684739B (zh) * 2019-11-11 2022-05-27 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用
CN110684739A (zh) * 2019-11-11 2020-01-14 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用
CN111826400A (zh) * 2020-07-21 2020-10-27 中科宝承生物医学科技有限公司 一种双特异性抗体nk细胞制备方法及其细胞和应用
CN111763264A (zh) * 2020-07-31 2020-10-13 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种靶向psca的嵌合抗原受体及其应用
CN111848819A (zh) * 2020-07-31 2020-10-30 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种靶向msln的嵌合抗原受体及其应用
CN111875712A (zh) * 2020-07-31 2020-11-03 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种增强型靶向muc1的嵌合抗原受体及其应用
CN111875711A (zh) * 2020-07-31 2020-11-03 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种增强型免疫细胞及其应用
CN112175998A (zh) * 2020-10-12 2021-01-05 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用
CN112210018A (zh) * 2020-10-12 2021-01-12 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种靶向gpc3的嵌合抗原受体及其应用
CN112210539A (zh) * 2020-10-12 2021-01-12 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种第四代car-t细胞及其应用
CN112522207A (zh) * 2020-12-21 2021-03-19 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种靶向muc1的car-t细胞及其应用
CN112608902A (zh) * 2020-12-21 2021-04-06 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种第四代car-t细胞及其应用
CN112608902B (zh) * 2020-12-21 2024-07-02 广东昭泰细胞生物科技有限公司 一种第四代car-t细胞及其应用
CN114634580A (zh) * 2022-03-21 2022-06-17 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种膜锚定式il-15超级复合物的研制及其在肿瘤免疫细胞治疗中的应用
CN114634580B (zh) * 2022-03-21 2024-01-30 皖南医学院第一附属医院（皖南医学院弋矶山医院） 一种膜锚定式il-15超级复合物的研制及其在肿瘤免疫细胞治疗中的应用
CN114774364A (zh) * 2022-04-26 2022-07-22 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
CN114774364B (zh) * 2022-04-26 2024-04-26 深圳市体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其制备方法和应用
WO2024027815A1 (zh) * 2022-08-05 2024-02-08 江苏恒瑞医药股份有限公司 特异性结合gucy2c和cd3的抗原结合分子及其医药用途
CN115820697A (zh) * 2022-09-23 2023-03-21 中国海洋大学 一种免疫细胞及其制备方法和应用
CN116836299A (zh) * 2023-06-09 2023-10-03 上海恩凯细胞技术有限公司 嵌合抗原受体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110055224B (zh) 2023-06-30
US20220185858A1 (en) 2022-06-16
WO2020200325A1 (zh) 2020-10-08
AU2020255735B2 (en) 2024-02-29
AU2020255735A1 (en) 2021-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110055224B (zh) 一种基因修饰的免疫细胞及其制备方法和应用
KR102606929B1 (ko) 동족 항원과 t-세포 수용체 상호작용의 발견 및 특징규명을 위한 조작된 2-부분 세포 디바이스
AU2024216517A1 (en) Enhanced systems for cell-mediated oncolytic viral therapy
DK2173869T3 (en) Fusion protein comprising a CASPASEDOMÆNE AND A NUKLÆRHORMONRECEPTORBINDINGSDOMÆNE AND METHODS AND USES THEREOF
CN110656090B (zh) 一种表达质粒、用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株及其应用
KR102681113B1 (ko) 조작된 캐스케이드 구성성분 및 캐스케이드 복합체
CA3041673A1 (en) Engineered artificial antigen presenting cells for tumor infiltrating lymphocyte expansion
KR20160023649A (ko) 심근증을 치료하기 위한 유전자―치료 벡터
US11820998B2 (en) Porcine Thy1 gene promoter specifically expressed in neurons
KR102614328B1 (ko) T-세포 수용체 합성 및 tcr-제시 세포에 대한 안정적인 게놈 통합을 위한 2-부분 디바이스
KR102584628B1 (ko) T-세포 수용체, t-세포 항원 및 이들의 기능성 상호작용의 식별 및 특징규명을 위한 조작된 다성분 시스템
CN114835821B (zh) 一种高效特异实现碱基颠换的编辑系统、方法及用途
US11129890B1 (en) Non-integrating HIV-1 comprising mutant RT/IN proteins and the SARS-CoV-2 spike protein
JP2023025182A (ja) Ｔ細胞レセプター及びｔ細胞抗原の同定及び特徴決定のための遺伝子操作された多成分システム
KR20240029020A (ko) Dna 변형을 위한 crispr-트랜스포손 시스템
CN110964748B (zh) 含线粒体靶向序列的载体及其构建方法和应用
CN109957551A (zh) 表达人β-防御素2的重组痘苗病毒及其应用
RU2761637C1 (ru) Штамм клеток Escherichia coli BL21(DE3)/pET32v11-Cre, продуцирующих сайт-специфическую рекомбиназу Cre
RU2774631C1 (ru) Сконструированные компоненты cascade и комплексы cascade
CN114107384A (zh) 一种靶向人非小细胞肺癌细胞株中eml4-alk融合基因变体1的载体及应用
EP1453965A2 (en) Dna vaccine
Polanec et al. Effect of Wnt-1 antisense RNA on the outgrowth of a mammary adenocarcinoma cell line expressing that oncogene

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB03 Change of inventor or designer information

Inventor after: Request for anonymity

Inventor before: Request for anonymity

CB03 Change of inventor or designer information
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant