CN110656090B - 一种表达质粒、用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种表达质粒、一种用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株及其应用。本发明的细胞株于2019年05月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201996，分类命名是人胚肾转化细胞AY293‑TD‑37。本发明的细胞株包含腺病毒的E2a‑DBP基因和E4‑ORF6基因，能够用于包装E2a‑DBP基因和E4基因缺失的二代腺病毒而形成完整的具有感染性的二代腺病毒颗粒，该二代腺病毒与第一代腺病毒相比，出现RCA的几率大大降低，为制备活载体疫苗奠定了基础，并且由于E2a‑DBP和E4基因的同时缺失使得包装容量相较与E2a突变或E4缺失的二代腺病毒再次增加，进一步提高了腺病毒载体外源基因的插入量，对增强腺病毒载体的应用水平具有重要意义。

Description

一种表达质粒、用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株及 其应用

技术领域

本发明属于基因治疗和重组疫苗领域，具体涉及一种表达质粒、用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株及其应用。

背景技术

腺病毒载体具有宿主范围广、基因转移效率高、稳定、安全、易操作等优点，是基因转移、基因治疗领域最为重要的病毒载体之一。腺病毒基因组含有4个早期转录元，分别为E1(E1a和E1b)、E2(E2a和E2b)、E3和E4，编码病毒的调节蛋白，以及5个晚期转录元L1～L5，编码晚期表达的病毒结构蛋白。腺病毒的基因组约为36000bp，整个基因组被分为100个基因图距单位，基因组的5＇端和3＇端各有长100-150bp的反向末端重复序列(ITR)，在其左端ITR 3＇端为长约300bp的包装信号Ψ，ITR及包装信号Ψ是腺病毒基因组复制和包装不可缺少的顺式作用元件，其长度不到1kb，除此以外的病毒基因组都可以被置换，其功能可用反式作用提供补偿。要在腺病毒中插入外源基因，必须缺失一段腺病毒基因组，缺失位点一般有E1、E3及E4与末端反向重复序列(ITR)之前的区域。

现有的腺病毒载体根据病毒基因的置换程度分为三代。第一代腺病毒载体为缺失E1和/或E3区，外源基因片段最多可插入6kb。第二代腺病毒载体为缺失E1、E3的基础上将E2a突变或者缺失E4，最大包装容量为9kb。第三代腺病毒载体为辅助依赖型腺病毒载体，缺失所有的编码序列，只含有两端的ITR和包装信号Ψ，插入外源基因可达36kb。这些腺病毒载体由于病毒基因组内非必需区域缺失，插入外源基因后，必须由反式作用提供补偿。反式补偿方式有两种，一种是由辅助病毒提供反式补偿，即辅助病毒依赖型，腺病毒基因片段可缺失相当一部分；另一种是由辅助包装细胞提供反式补偿，即由互补的细胞系提供反式补偿，比如第一代腺病毒载体需要293细胞系、911细胞系以及PERC6细胞系等，这些细胞系可以反式提供E1区的蛋白功能，使E1区缺失的腺病毒载体增殖并产生成熟的腺病毒颗粒。

第一代腺病毒载体由于病毒滴度高、感染效率高及制备简单等优点，使其在基因治疗领域备受青睐，但是，第一代腺病毒载体与表达E1蛋白的293细胞之间存在同源序列，通过重组，可重新获得E1区，导致产生可复制的腺病毒(RCA，replication-competentadenovirus)，由于RCA具有复制能力，在腺病毒的包装过程中一旦出现，就可能呈现优势生长，它不但影响载体病毒的产量，也为腺病毒噬菌斑的筛选纯化带来困难。另一方面，研究发现当以较高的MOI(感染复数，病毒/细胞Multiply Of Infection)感染细胞时，E2区对E1区功能上的依赖可以被忽略，病毒仍可以复制并表达晚期基因。另外，第一代非增殖型腺病毒载体最多只能装载约8kb的外源基因，这对于许多基因治疗方案来说仍是远远不够的。

因此，第二代腺病毒载体的应用尤为重要，其引起的宿主抗病毒免疫反应与第一代相比较要弱很多，因此在靶细胞中更稳定，目的基因的表达的时间也更长。同第一代腺病毒载体一样，

第二代腺病毒载体的包装依赖于辅助细胞(或)病毒提供其所缺失的反式作用元件，研究人员已经建立了多个细胞株用作第二代腺病毒载体的辅助细胞系，如可表达E2a区的DNA结合蛋白(DBP，DNA Binding protein)、E2b区的DNA聚合酶、E2b编码的末端蛋白以及可表达全部或大部分E4区蛋白的细胞株，而研发一种能够大规模生产高容量第二代腺病毒载体的特异性细胞系仍然是目前增强腺病毒载体临床应用水平的理想解决方案。

发明内容

基于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种表达质粒以及一种能够包装二代腺病毒载体的细胞株，以期通过该细胞株对二代腺病毒提供反式补偿，为生产包装容量大、RCA出现几率低的二代腺病毒载体提供技术支撑。

作为本发明的第一方面，本发明提供了一种表达质粒。

作为优选，所述表达质粒包含编码腺病毒E2a-DBP蛋白和E4-ORF6蛋白的核酸序列。

作为优选，所述表达质粒是通过将腺病毒的E2a-DBP基因序列和E4-ORF6基因序列插入真核表达载体的多克隆位点制备而成，其中，所述E2a-DBP基因序列如SEQ ID No.5所示，所述E4-ORF6基因序列如SEQ ID No.6所示。

作为优选，所述真核表达载体为pcDNA3.1。

作为优选，所述表达质粒通过IRES序列串联启动E2a-DBP基因和E4-ORF6基因的表达，其中，IRES序列的基因序列如SEQ ID No.7所示。

作为优选，所述表达质粒的碱基序列如SEQ ID No.9所示。

作为本发明的第二方面，本发明提供了一种包含本发明所述的表达质粒的细胞株。

作为本发明的第三方面，本发明提供了本发明所述的表达质粒在用于制备能够包装二代腺病毒的细胞株中的应用。

作为本发明的第四方面，本发明提供了一种用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株，该细胞株中包含腺病毒的E2a-DBP基因和E4-ORF6基因。

作为优选，所述细胞株的保藏编号为：CCTCC No:C201996。

作为优选，所述细胞株是通过将HEK293细胞经过基因工程改造所获得，该细胞株用于包装缺失E2a-DBP基因和E4基因的二代腺病毒。

作为优选，所述细胞株的构建包括如下步骤：

1)构建表达质粒，所述表达质粒包含编码腺病毒E2a-DBP蛋白和E4-ORF6蛋白的核酸序列；

2)以步骤1)所获得的表达质粒转染HEK293细胞，筛选获得同时表达E2a-DBP蛋白和E4-ORF6蛋白的阳性细胞株；

3)用缺失E2a-DBP基因和E4基因的二代腺病毒载体转染步骤2)所得的阳性细胞株，筛选获得用于包装所述缺失E2a-DBP基因和E4基因的二代腺病毒的稳定细胞株。

作为优选，所述步骤1)中的表达质粒是通过将腺病毒的E2a-DBP基因序列和E4-ORF6基因序列插入真核表达载体的多克隆位点制备而成，其中，所述E2a-DBP基因序列如SEQ ID No.5所示，所述E4-ORF6基因序列如SEQ ID No.6所示。

作为优选，所述真核表达载体为pcDNA3.1。

作为优选，所述表达质粒通过IRES序列串联启动E2a-DBP基因和E4-ORF6基因的表达，其中，IRES序列的基因序列如SEQ ID No.7所示。

作为本发明的第五方面，本发明提供了本发明所述的细胞株在用于包装容量增加的二代腺病毒中的应用。

作为本发明的第六方面，本发明提供了一种制备用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株的方法。

作为优选，所述方法包括如下步骤：

1)构建表达质粒，所述表达质粒包含编码腺病毒E2a-DBP蛋白和E4-ORF6蛋白的核酸序列；

2)以步骤1)所构建的表达质粒转染表达腺病毒E1蛋白的包装细胞株，筛选获得同时表达E2a-DBP蛋白和E4-ORF6蛋白的阳性细胞株；

3)用缺失E2a-DBP基因和E4基因的二代腺病毒载体转染步骤2)所得阳性细胞株，筛选获得用于包装所述缺失E2a-DBP基因和E4基因的二代腺病毒的稳定细胞株。

作为优选，所述步骤1)中的表达质粒是通过将腺病毒的E2a-DBP基因序列和E4-ORF6基因序列插入真核表达载体的多克隆位点制备而成，其中，所述E2a-DBP基因序列如SEQ ID No.5所示，所述E4-ORF6基因序列如SEQ ID No.6所示。

作为优选，所述真核表达载体为pcDNA3.1。

作为优选，所述表达质粒通过IRES序列串联启动E2a-DBP基因和E4-ORF6基因的表达，其中，IRES序列的基因序列如SEQ ID No.7所示。

作为优选，所述步骤2)中的表达腺病毒E1蛋白的包装细胞株为293细胞系、911细胞系或PERC6细胞系。

有益效果：

(1)本发明将腺病毒hAd5-E2a-DBP基因和hAd5-E4-ORF6基因运输到真核表达载体中构建了一种表达质粒，以及利用该表达质粒将腺病毒hAd5-E2a-DBP基因和hAd5-E4-ORF6基因运输到包装细胞HEK293的细胞核，获得了一种能够用于包装E2a基因和E4基因同时缺失的二代腺病毒的新型细胞株，具体为缺失E2a-DBP基因和E4基因的二代腺病毒。该细胞株能够使缺失E2a-DBP基因和E4基因的二代腺病毒的基因组复制，结构蛋白表达，形成完整的具有感染性的二代腺病毒颗粒。第二代腺病毒与第一代腺病毒相比，出现RCA的几率大大降低，为制备活载体疫苗奠定了基础。

(2)本发明的新细胞株能够对同时缺失E2a-DBP基因和E4基因的二代腺病毒提供反式补偿，该二代腺病毒载体由于E2a-DBP和E4基因的同时缺失使得包装容量相较与E2a突变或E4缺失的二代腺病毒再次增加，进一步提高了腺病毒载体外源基因的插入量。

(3)本发明提供了一种制备用于包装二代腺病毒的细胞株的方法，本发明采用通用的引物，操作简单、特异性高、耗材少，大大降低了操作成本，特别适用于腺病毒感染以及转基因技术安全性实验的大量临床样本的快速检测。

本发明所涉及的术语定义：

表达腺病毒E1蛋白的包装细胞株－本发明中描述的表达腺病毒E1蛋白的包装细胞株是指可以反式提供E1区的蛋白功能，使E1区缺失的腺病毒载体增殖并产生成熟的腺病毒颗粒的细胞或细胞系，即能够编码腺病毒E1蛋白质的细胞或细胞系，如293细胞系(如HEK293)、911细胞系以及PERC6细胞系等。

转染－是指使用本领域技术人员已知的技术将细胞或细胞系与包含腺病毒基因组的质粒接触，通过用磷酸钙、二乙胺乙基葡萄糖、聚凝胺与DNA的共沉淀，电穿孔，显微注射，脂质体介导的融合，反转录和biolistic转染等方式所进行的转染。

真核表达载体－是指用于将目标核酸序列插入以构建表达质粒的载体，适合本发明的用于插入目标核酸序列构建表达质粒的真核表达载体包括pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1、pZeoSV2、pSVL等。

附图说明

图1是DBP扩增片段的电泳检测结果，其中，泳道1表示pcDNA3.1+，泳道2表示DBP-6HIS，M表示marker。

图2是DBP片段单克隆菌落进行PCR验证

图3是pcDNA3.1-DBP-6His载体的酶切鉴定结果。

图4是目的片段DBP和ORF6扩增片段和酶切的电泳检测结果，其中，泳道1表示pcDNA3.1+(hyg)-DBP-6His，泳道2表示pcDNA3.1+(hyg)-DBP-6His酶切，泳道3表示ORF6-IRES酶切，M表示marker

图5是pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP-6his的电泳检测结果。

图6是pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP-6his的酶切鉴定结果。

图7是pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP-6his的载体图谱。

图8是目的基因及蛋白Western blot检测结果。

图9是pAd5-△E4△E2a-PacI线性化电泳结果。

图10是AY293-TD-37细胞包装病毒的CPE结果图，其中，(A)为转染后0代，(B)为转染后1代，(C)为转染后2代，(D)为转染后3代。

图11是HEK293细胞包装病毒的CPE结果图，其中，(A)为转染后0代，(B)为转染后1代，(C)为转染后2代，(D)为转染后3代。

图12是将AY293-TD-6\24\37\40\55细胞传代到25代次，检测外源基因表达的结果，1～5道样品分别为AY293-TD-37\24\55\40\6。

本发明的细胞株的保藏编号为：CCTCC NO:C201996；分类命名是：人胚肾转化细胞AY293-TD-37；保藏时间是：2019年05月08日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学校内，邮政编码430072。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围。

实施例1pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP-6his质粒的构建

1、引物合成

根据NCBI中人5型腺病毒(hAd5)序列设计引物(序列号AC_000008.1)，PCR分别扩增编码hAd5-E4的ORF6蛋白和hAd5-E2a的DBP蛋白的两个序列，并添加6his标签序列，两个蛋白通过IRES序列启动翻译，构建基于IRES序列的两个基因共表达质粒pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP-6His。引物序列如下表所示：

表1引物序列

2、质粒构建

(1)pcDNA3.1-DBP-6his的构建

①目的片段的扩增

PCR模板：腺病毒hAd5型基因组；

反应体系：高保真Q5 DNA聚合酶25μL，DBP-6HIS序列上下游引物各1μL，PCR模板1μL，补水至50μL；

反应条件：98℃，30sec；(98℃，10sec；60℃，30sec；72℃，60sec)×35循环；72℃，7min；4℃，∞；

1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，检测结果如图1所示，测得DBP-6his(E2a-DBP)片段的碱基序列如SEQ ID No.5所示。

②目的片段和载体片段酶切

酶切反应体系：载体(pcDNA3.1+，购买自Thermo，货号为V79020，携带有hyg标签)2μg，NotI1μL，XbaI1μL，10×cutsmart buffer 5μL，补水至50μL。

DBP-6his片段2μg，NotI、XbaI各1μL；10×cutsmart buffer 5μL，补水至50μL。

反应条件：37℃，30min；65℃，20min灭活。

PCR clean-up试剂盒纯化，Axygen胶回收纯化试剂盒，取2.5μL跑胶鉴定。

③连接载体与片段

连接体系：载体(pcDNA3.1+)1.5μL；DBP-6his片段3μL；2x Smealess Cloning Mix酶5μL，补水至10μL。

反应条件：室温25℃条件下，30min。

转化DH5α感受态细胞，LB固体培养基(Ampamycin抗性)涂布，37℃过夜培养。

④载体构建验证

挑取单克隆菌落进行PCR和酶切验证，并测序鉴定，pcDNA3.1-DBP-6HIS载体1％琼脂糖电泳检测结果如图2所示。

pcDNA3.1-DBP-6His载体使用NotI和XbaI酶切鉴定，从图3可以看出，22号质粒正确。

(2)PCDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP-6his载体的构建

①目的片段的合成

通过ORF6-IRES序列上下游引物，委托博迈德生物公司化学合成目的片段ORF6-IRES，使用1％琼脂糖凝胶电泳检测ORF6-IRES片段，检测结果如图4所示，E4-ORF6的基因序列如SEQ ID No.6所示，IRES的序列如SEQ ID No.7所示，ORF6-IRES的序列如SEQ ID No.8所示。

②目的片段和载体片段酶切

酶切反应体系：载体(pcDNA3.1-DBP-6HIS)2μg，NotI 1μL，BamHI 1μL，10×cutsmart buffer5μL，补水至50μL；

ORF6-IRES片段2μg，NotI 1μL，BamHI 1μL，10×cutsmart buffer 5μL，补水至50μL；

反应条件：37℃，40min；65℃，20min灭活。

PCR clean-up试剂盒纯化，Axygen胶回收纯化试剂盒，取2.5μL跑胶鉴定。

③连接载体与片段

连接体系：载体(pcDNA3.1-DBP-6His)1.5μL，ORF6-IRES片段3μL，2x SmealessCloningMix酶5μL，补水至10μL。

反应条件：室温℃条件下，30min。

转化DH5α感受态细胞，LB固体培养基(Ampamycin抗性)涂布，37℃过夜培养。

④载体构建验证

挑取单克隆菌落进行PCR和酶切验证，并测序鉴定，载体的1％琼脂糖电泳检测结果如图5所示。

pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP-6His载体使用NotI和BamHI酶切鉴定，从图6可以看出，17号质粒正确。

所构建的pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP-6His载体的碱基序列如SEQ ID No.9所示，载体图谱如图7所示。

实施例2细胞系的构建

1、细胞稳定转染

接种HEK293细胞在6孔板中，按照8×10⁵活细胞/mL的密度，待细胞汇合率在80％左右，将pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-6His-IRES-DBP-6His质粒2μg和PEI 5μL混合后，转染至6孔板的细胞中，放置37℃，5％CO₂静置培养。

2、筛选阳性克隆

转染2日后换抗性培养基，含125μg/mL潮霉素(hygromycin)的10％FBS的DMEM，之后3、4日换液一次，直至对照空白细胞99％全部死亡，用0.05％的胰蛋白酶消化细胞，按1:20的稀释传到10cm平皿。继续每3天换新的筛选培养基，直至形成肉眼可见克隆，通过克隆环将细胞克隆扩大到24孔板中。

3、目的基因及蛋白Western blot检测

待克隆细胞生长良好后，将每个克隆部分细胞通过SDS-loading buffer裂解，进行SDS-PAGE电泳，然后转移至硝酸纤维素膜，采用His抗体孵育，β-actin抗体作为内参，羊抗鼠二抗-HRP结合，ECL染色，凝胶成像检测，实验结果如图8所示，从图可以看出，共筛选到5株(第2、7、9、11、12泳道)既表达hAd5-E4-ORF6又表达hAd5-E2a(DBP，60kd)的阳性细胞株，因E4的ORF6是通过IRES和DBP串联表达，所以hAd5-E4-ORF6正常表达，将筛选到的阳性细胞株扩大培养，冻存原始细胞库，一个月后复苏再次验证蛋白表达情况，与冻存前基本一致，其中两株细胞正常，另外三株细胞表达降低，成功获得细胞株，命名为AY293-TD-6\24\37\40\55。

实施例3AY293-TD-6\24\37\40\55包装腺病毒能力分析

将对数生长的AY293-TD-6\24\37\40\55和HEK293细胞按照6×10⁵/mL的密度接种6孔板，当细胞汇合率在60～70％时，将腺病毒载体pAd5△E4△E2a-EGFP 2μg DNA通过PacI内切酶线性化灭活，其中，pAd5△E4△E2a-EGFP线性化电泳结果如图9所示，将线性化后的pAd5△E4△E2a-EGFP命名为pAd5-△E4△E2a-PacI。然后将线性化后的pAd5-△E4△E2a-PacI转染至上述细胞中，培养72小时后，收集细胞悬液，经过-80℃和37℃反复冻融3次后，500g，4℃离心5min，后，取上清再次接种同样密度细胞，传代3代次后发现，其中，AY293-TD-37细胞中能够表达大量绿色荧光蛋白，并且出现明显的细胞病变(CPE，CytopathicEffect)，说明AY293-TD-37可以成功包装二代腺病毒载体(图10)，其他几个细胞株也在随后的代次中出现病变和荧光，而转染pAd5-△E4△E2a-PacI的HEK293细胞随着接种代次增加并没有荧光出现，说明HEK293细胞不能包装二代腺病毒载体(图11)。

其中，pAd5△E4△E2a-EGFP的制备流程如下：

在A549细胞(

CCL-185)中扩增野生型人腺病毒5型(/>

VR-1516，基因序列AC_000008.1)病毒，收集并进行浓缩病毒液，采用HirtVirual DNA Extract方法提取腺病毒基因组，使用cosmid的方法将线性的hAd5基因组构建成环状的supercos-Ad5载体质粒，利用CRISPR/cas9对hAd5腺病毒E1区域进行切除，设计gRNA如下：

hAd5-E1上游gRNA:

GGCGGGAAAACUGAAUAAGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

hAd5-E1下游gRNA:

GAGAUGAUCCAGUCGUAGCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

在hAd5 E1区域的上下游设计gRNA位点，切割后回收大片段载体，设计引物，通过融合PCR将ITR，PIX序列分别插入上、下游，并引入SwaI酶切位点，然后将融合后的片段与载体进行无缝克隆，获得E1敲除的supercos-Ad5△E1腺病毒载体，而后对supercos-Ad5△E1质粒进行E3区域的切除，设计gRNA如下：

hAd5-E3上游gRNA:

GCGGGACAUUUCAGAUCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

hAd5-E3下游gRNA:

GUAAGGGUACUGCUAUCGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

在hAd5 E3区域的上下游设计gRNA位点，切割后回收大片段载体，后设计引物，对E3上下游过多切除的Fiber，以及pVIII序列进行融合PCR，使用无缝克隆的方式连接，得到E3敲除的载体，并将其命名为pAd5。在pAd5的基础上敲除E4，设计gRNA如下：

hAd5-E4上游gRNA:

GUACUAAACAAUUCCUUCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

hAd5-E4下游gRNA:

GGUUCGCGUGCGGUUUUCUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

在Ad5 E4区域的上下游设计gRNA位点，对序列进行“切割”，回收大片段的载体；后设计引物，对E4上下游过多切除的Fiber，以及ITR序列进行融合PCR，并引入ISceI酶切位点，使用无缝克隆的方式连接，得到的质粒命名为pAd5△E4。

在pAd5△E4的基础上敲除E2a，根据hAd5-E2a(DBP)，设计gRNA如下：

E2a上游gRNA：

GAGGUGGCGUUCGUAGGCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

E2a下游gRNA：

GCCCCGGUAAUAAGGUUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU

在DBP的上游100k蛋白部位，以及DBP下游protease蛋白进行切割，使用融合PCR的方式，将过多切除的部分100k、Protease序列进行融合，并使用无缝克隆的方式获得pAd5△E4△E2a质粒；

通过同源重组的方式，将E1区域的穿梭质粒pS5E1-EGFP与载体质粒pAd5△E4△E2a重组，进而获得能够表达绿色荧光的质粒pAd5△E4△E2a-EGFP。

实施例4AY293-TD-37包装腺病毒滴度分析

通过免疫荧光法检测腺病毒pAd5△E4△E2a-EGFP-AY293-TD-37-F4的滴度在1×10⁸FFU/mL。方法将对数生长的AY293-TD-37细胞按照10×10⁵活细胞/mL密度接种6孔板，当细胞汇合率在90％左右时，将腺病毒pAd5△E4△E2a-EGFP-AY293-TD-37-F4经过10倍倍比稀释，将500μL接种至6孔板中，次日200倍显微镜下记录荧光数量，根据公式病毒滴度(FFU/ml)＝(平均数)*1013*2*10^(-n)计算病毒滴度。

发明人进一步使用PCDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP-6his表达质粒转染911细胞和PERC6细胞，同样获得了能够包装二代腺病毒的细胞株，说明本发明公开了一种能够用于构建二代腺病毒包装细胞的表达质粒，以及一种二代腺病毒包装细胞的构建方法。

发明人进一步通过将腺病毒E4-ORF6基因和E2a(DBP)基因插入本发明所列举的其他真核表达载体中构建表达质粒，并将该表达质粒转染HEK293细胞，同样获得了能够包装二代腺病毒的细胞株，此处不再一一赘述。

实施例5AY293-TD-37细胞株增殖腺病毒的稳定性分析

将AY293-TD-37细胞株传代25代，每5代进行一次病毒包装和腺病毒滴度的检测，检测结果显示，AY293-TD-37细胞株增殖腺病毒的滴度维持在1.0×10⁸FFU/mL左右，说明本发明构建得到的AY293-TD-37细胞株具有较好的稳定性。

表2AY293-TD-37细胞株增殖腺病毒的稳定性检测

本发明所涉及的相关基因和质粒的碱基序列如下所示：

SEQ ID No.5：DBP-6His的碱基序列

SEQ ID No.6：E4-ORF6的基因序列

SEQ ID No.7：IRES的基因序列

SEQ ID No.8：ORF6-IRES的基因序列

SEQ ID No.9pcDNA3.1+(hyg)-ORF6-IRES-DBP-6HIS载体的碱基序列

/>

/>

/>

/>

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，而不是本发明全部的实施例。上述实施例并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则范围内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 嘉兴安宇生物科技有限公司

<120> 一种表达质粒、用于包装容量增加的二代腺病毒的细胞株及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

aaggaaaaaa gcggccgcat ggccagtcgg gaagagg 37

<210> 2

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctagtctaga ttagtggtgg tggtggtggt gaaaatcaaa ggggttctgc cg 52

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acgcgtcgac ttacatgggg gtagagtcat 30

<210> 4

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaggaaaaaa gcggccgcgg ttgtggccat tatcatcg 38

<210> 5

<211> 1608

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggccagtc gggaagagga gcagcgcgaa accacccccg agcgcggacg cggtgcggcg 60

cgacgtcccc caaccatgga ggacgtgtcg tccccgtccc cgtcgccgcc gcctccccgg 120

gcgcccccaa aaaagcggat gaggcggcgt atcgagtccg aggacgagga agactcatca 180

caagacgcgc tggtgccgcg cacacccagc ccgcggccat cgacctcggc ggcggatttg 240

gccattgcgc ccaagaagaa aaagaagcgc ccttctccca agcccgagcg cccgccatca 300

ccagaggtaa tcgtggacag cgaggaagaa agagaagatg tggcgctaca aatggtgggt 360

ttcagcaacc caccggtgct aatcaagcat ggcaaaggag gtaagcgcac agtgcggcgg 420

ctgaatgaag acgacccagt ggcgcgtggt atgcggacgc aagaggaaga ggaagagccc 480

agcgaagcgg aaagtgaaat tacggtgatg aacccgctga gtgtgccgat cgtgtctgcg 540

tgggagaagg gcatggaggc tgcgcgcgcg ctgatggaca agtaccacgt ggataacgat 600

ctaaaggcga acttcaaact actgcctgac caagtggaag ctctggcggc cgtatgcaag 660

acctggctga acgaggagca ccgcgggttg cagctgacct tcaccagcaa caagaccttt 720

gtgacgatga tggggcgatt cctgcaggcg tacctgcagt cgtttgcaga ggtgacctac 780

aagcatcacg agcccacggg ctgcgcgttg tggctgcacc gctgcgctga gatcgaaggc 840

gagcttaagt gtctacacgg aagcattatg ataaataagg agcacgtgat tgaaatggat 900

gtgacgagcg aaaacgggca gcgcgcgctg aaggagcagt ctagcaaggc caagatcgtg 960

aagaaccggt ggggccgaaa tgtggtgcag atctccaaca ccgacgcaag gtgctgcgtg 1020

cacgacgcgg cctgtccggc caatcagttt tccggcaagt cttgcggcat gttcttctct 1080

gaaggcgcaa aggctcaggt ggcttttaag cagatcaagg cttttatgca ggcgctgtat 1140

cctaacgccc agaccgggca cggtcacctt ttgatgccac tacggtgcga gtgcaactca 1200

aagcctgggc acgcgccctt tttgggaagg cagctaccaa agttgactcc gttcgccctg 1260

agcaacgcgg aggacctgga cgcggatctg atctccgaca agagcgtgct ggccagcgtg 1320

caccacccgg cgctgatagt gttccagtgc tgcaaccctg tgtatcgcaa ctcgcgcgcg 1380

cagggcggag gccccaactg cgacttcaag atatcggcgc ccgacctgct aaacgcgttg 1440

gtgatggtgc gcagcctgtg gagtgaaaac ttcaccgagc tgccgcggat ggttgtgcct 1500

gagtttaagt ggagcactaa acaccagtat cgcaacgtgt ccctgccagt ggcgcatagc 1560

gatgcgcggc agaacccctt tgattttcac caccaccacc accactaa 1608

<210> 6

<211> 885

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgactacgt ccggcgttcc atttggcatg acactacgac caacacgatc tcggttgtct 60

cggcgcactc cgtacagtag ggatcgtcta cctccttttg agacagaaac ccgcgctacc 120

atactggagg atcatccgct gctgcccgaa tgtaacactt tgacaatgca caacgtgagt 180

tacgtgcgag gtcttccctg cagtgtggga tttacgctga ttcaggaatg ggttgttccc 240

tgggatatgg ttctaacgcg ggaggagctt gtaatcctga ggaagtgtat gcacgtgtgc 300

ctgtgttgtg ccaacattga tatcatgacg agcatgatga tccatggtta cgagtcctgg 360

gctctccact gtcattgttc cagtcccggt tccctgcagt gtatagccgg cgggcaggtt 420

ttggccagct ggtttaggat ggtggtggat ggcgccatgt ttaatcagag gtttatatgg 480

taccgggagg tggtgaatta caacatgcca aaagaggtaa tgtttatgtc cagcgtgttt 540

atgaggggtc gccacttaat ctacctgcgc ttgtggtatg atggccacgt gggttctgtg 600

gtccccgcca tgagctttgg atacagcgcc ttgcactgtg ggattttgaa caatattgtg 660

gtgctgtgct gcagttactg tgctgattta agtgagatca gggtgcgctg ctgtgcccgg 720

aggacaaggc gccttatgct gcgggcggtg cgaatcatcg ctgaggagac cactgccatg 780

ttgtattcct gcaggacgga gcggcggcgg cagcagttta ttcgcgcgct gctgcagcac 840

caccgcccta tcctgatgca cgattatgac tctaccccca tgtaa 885

<210> 7

<211> 644

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggactataag gatgatgacg acaaataata gcaattcctc gacgactgca tagggttacc 60

cccctctccc tccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 120

tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 180

gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 240

aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 300

aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 360

ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 420

cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 480

ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 540

cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg 600

gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taatggccac aacc 644

<210> 8

<211> 1529

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgactacgt ccggcgttcc atttggcatg acactacgac caacacgatc tcggttgtct 60

cggcgcactc cgtacagtag ggatcgtcta cctccttttg agacagaaac ccgcgctacc 120

atactggagg atcatccgct gctgcccgaa tgtaacactt tgacaatgca caacgtgagt 180

tacgtgcgag gtcttccctg cagtgtggga tttacgctga ttcaggaatg ggttgttccc 240

tgggatatgg ttctaacgcg ggaggagctt gtaatcctga ggaagtgtat gcacgtgtgc 300

ctgtgttgtg ccaacattga tatcatgacg agcatgatga tccatggtta cgagtcctgg 360

gctctccact gtcattgttc cagtcccggt tccctgcagt gtatagccgg cgggcaggtt 420

ttggccagct ggtttaggat ggtggtggat ggcgccatgt ttaatcagag gtttatatgg 480

taccgggagg tggtgaatta caacatgcca aaagaggtaa tgtttatgtc cagcgtgttt 540

atgaggggtc gccacttaat ctacctgcgc ttgtggtatg atggccacgt gggttctgtg 600

gtccccgcca tgagctttgg atacagcgcc ttgcactgtg ggattttgaa caatattgtg 660

gtgctgtgct gcagttactg tgctgattta agtgagatca gggtgcgctg ctgtgcccgg 720

aggacaaggc gccttatgct gcgggcggtg cgaatcatcg ctgaggagac cactgccatg 780

ttgtattcct gcaggacgga gcggcggcgg cagcagttta ttcgcgcgct gctgcagcac 840

caccgcccta tcctgatgca cgattatgac tctaccccca tgtaaggact ataaggatga 900

tgacgacaaa taatagcaat tcctcgacga ctgcataggg ttacccccct ctccctcccc 960

cccccctaac gttactggcc gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt ttgtctatat 1020

gttattttcc accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt 1080

cttcttgacg agcattccta ggggtctttc ccctctcgcc aaaggaatgc aaggtctgtt 1140

gaatgtcgtg aaggaagcag ttcctctgga agcttcttga agacaaacaa cgtctgtagc 1200

gaccctttgc aggcagcgga accccccacc tggcgacagg tgcctctgcg gccaaaagcc 1260

acgtgtataa gatacacctg caaaggcggc acaaccccag tgccacgttg tgagttggat 1320

agttgtggaa agagtcaaat ggctctcctc aagcgtattc aacaaggggc tgaaggatgc 1380

ccagaaggta ccccattgta tgggatctga tctggggcct cggtgcacat gctttacatg 1440

tgtttagtcg aggttaaaaa acgtctaggc cccccgaacc acggggacgt ggttttcctt 1500

tgaaaaacac gatgataatg gccacaacc 1529

<210> 9

<211> 9341

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata 300

tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc 360

cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc 420

attgacgtca atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt 480

atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt 540

atgcccagta catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca 600

tcgctattac catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg 660

actcacgggg atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc 720

aaaatcaacg ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg 780

gtaggcgtgt acggtgggag gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca 840

ctgcttactg gcttatcgaa attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctggctagc 900

gtgagtttgg ggacccttga ttgttctttc tttttcgcta ttgtaaaatt catgttatat 960

ggagggggca aagttttcag ggtgttgttt agaatgggaa gatgtccctt gtatcaccat 1020

ggaccctcat gataattttg tttctttcac tttctactct gttgacaacc attgtctcct 1080

cttattttct tttcattttc tgtaactttt tcgttaaact ttagcttgca tttgtaacga 1140

atttttaaat tcacttttgt ttatttgtca gattgtaagt actttctcta atcacttttt 1200

tttcaaggca atcagggtat attatattgt acttcagcac agttttagag aacaattgtt 1260

ataattaaat gataaggtag aatatttctg catataaatt ctggctggcg tggaaatatt 1320

cttattggta gaaacaacta catcctggtc atcatcctgc ctttctcttt atggttacaa 1380

tgatatacac tgtttgagat gaggataaaa tactctgagt ccaaaccggg cccctctgct 1440

aaccatgttc atgccttctt ctttttccta cagctcctgg gcaacgtgct ggttattgtg 1500

ctgtctcatc attttggcaa agaattgtaa tacgactcac tatagggcga attgatctta 1560

agcttggtac cgagctcgga tccgccacca tgactacgtc cggcgttcca tttggcatga 1620

cactacgacc aacacgatct cggttgtctc ggcgcactcc gtacagtagg gatcgtctac 1680

ctccttttga gacagaaacc cgcgctacca tactggagga tcatccgctg ctgcccgaat 1740

gtaacacttt gacaatgcac aacgtgagtt acgtgcgagg tcttccctgc agtgtgggat 1800

ttacgctgat tcaggaatgg gttgttccct gggatatggt tctaacgcgg gaggagcttg 1860

taatcctgag gaagtgtatg cacgtgtgcc tgtgttgtgc caacattgat atcatgacga 1920

gcatgatgat ccatggttac gagtcctggg ctctccactg tcattgttcc agtcccggtt 1980

ccctgcagtg tatagccggc gggcaggttt tggccagctg gtttaggatg gtggtggatg 2040

gcgccatgtt taatcagagg tttatatggt accgggaggt ggtgaattac aacatgccaa 2100

aagaggtaat gtttatgtcc agcgtgttta tgaggggtcg ccacttaatc tacctgcgct 2160

tgtggtatga tggccacgtg ggttctgtgg tccccgccat gagctttgga tacagcgcct 2220

tgcactgtgg gattttgaac aatattgtgg tgctgtgctg cagttactgt gctgatttaa 2280

gtgagatcag ggtgcgctgc tgtgcccgga ggacaaggcg ccttatgctg cgggcggtgc 2340

gaatcatcgc tgaggagacc actgccatgt tgtattcctg caggacggag cggcggcggc 2400

agcagtttat tcgcgcgctg ctgcagcacc accgccctat cctgatgcac gattatgact 2460

ctacccccat gtaaggacta taaggatgat gacgacaaat aatagcaatt cctcgacgac 2520

tgcatagggt tacccccctc tccctccccc ccccctaacg ttactggccg aagccgcttg 2580

gaataaggcc ggtgtgcgtt tgtctatatg ttattttcca ccatattgcc gtcttttggc 2640

aatgtgaggg cccggaaacc tggccctgtc ttcttgacga gcattcctag gggtctttcc 2700

cctctcgcca aaggaatgca aggtctgttg aatgtcgtga aggaagcagt tcctctggaa 2760

gcttcttgaa gacaaacaac gtctgtagcg accctttgca ggcagcggaa ccccccacct 2820

ggcgacaggt gcctctgcgg ccaaaagcca cgtgtataag atacacctgc aaaggcggca 2880

caaccccagt gccacgttgt gagttggata gttgtggaaa gagtcaaatg gctctcctca 2940

agcgtattca acaaggggct gaaggatgcc cagaaggtac cccattgtat gggatctgat 3000

ctggggcctc ggtgcacatg ctttacatgt gtttagtcga ggttaaaaaa cgtctaggcc 3060

ccccgaacca cggggacgtg gttttccttt gaaaaacacg atgataatgg ccacaaccgc 3120

ggccgcatgg ccagtcggga agaggagcag cgcgaaacca cccccgagcg cggacgcggt 3180

gcggcgcgac gtcccccaac catggaggac gtgtcgtccc cgtccccgtc gccgccgcct 3240

ccccgggcgc ccccaaaaaa gcggatgagg cggcgtatcg agtccgagga cgaggaagac 3300

tcatcacaag acgcgctggt gccgcgcaca cccagcccgc ggccatcgac ctcggcggcg 3360

gatttggcca ttgcgcccaa gaagaaaaag aagcgccctt ctcccaagcc cgagcgcccg 3420

ccatcaccag aggtaatcgt ggacagcgag gaagaaagag aagatgtggc gctacaaatg 3480

gtgggtttca gcaacccacc ggtgctaatc aagcatggca aaggaggtaa gcgcacagtg 3540

cggcggctga atgaagacga cccagtggcg cgtggtatgc ggacgcaaga ggaagaggaa 3600

gagcccagcg aagcggaaag tgaaattacg gtgatgaacc cgctgagtgt gccgatcgtg 3660

tctgcgtggg agaagggcat ggaggctgcg cgcgcgctga tggacaagta ccacgtggat 3720

aacgatctaa aggcgaactt caaactactg cctgaccaag tggaagctct ggcggccgta 3780

tgcaagacct ggctgaacga ggagcaccgc gggttgcagc tgaccttcac cagcaacaag 3840

acctttgtga cgatgatggg gcgattcctg caggcgtacc tgcagtcgtt tgcagaggtg 3900

acctacaagc atcacgagcc cacgggctgc gcgttgtggc tgcaccgctg cgctgagatc 3960

gaaggcgagc ttaagtgtct acacggaagc attatgataa ataaggagca cgtgattgaa 4020

atggatgtga cgagcgaaaa cgggcagcgc gcgctgaagg agcagtctag caaggccaag 4080

atcgtgaaga accggtgggg ccgaaatgtg gtgcagatct ccaacaccga cgcaaggtgc 4140

tgcgtgcacg acgcggcctg tccggccaat cagttttccg gcaagtcttg cggcatgttc 4200

ttctctgaag gcgcaaaggc tcaggtggct tttaagcaga tcaaggcttt tatgcaggcg 4260

ctgtatccta acgcccagac cgggcacggt caccttttga tgccactacg gtgcgagtgc 4320

aactcaaagc ctgggcacgc gccctttttg ggaaggcagc taccaaagtt gactccgttc 4380

gccctgagca acgcggagga cctggacgcg gatctgatct ccgacaagag cgtgctggcc 4440

agcgtgcacc acccggcgct gatagtgttc cagtgctgca accctgtgta tcgcaactcg 4500

cgcgcgcagg gcggaggccc caactgcgac ttcaagatat cggcgcccga cctgctaaac 4560

gcgttggtga tggtgcgcag cctgtggagt gaaaacttca ccgagctgcc gcggatggtt 4620

gtgcctgagt ttaagtggag cactaaacac cagtatcgca acgtgtccct gccagtggcg 4680

catagcgatg cgcggcagaa cccctttgat tttcaccacc accaccacca ctaatctaga 4740

gggcccgttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt 4800

gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc 4860

taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt gtcattctat tctggggggt 4920

ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat 4980

gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc 5040

cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 5100

gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 5160

acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 5220

agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg 5280

ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 5340

ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta 5400

taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 5460

aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc 5520

cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccagg tgtggaaagt 5580

ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca 5640

tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc gcccagttcc gcccattctc 5700

cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc cgaggccgcc tctgcctctg 5760

agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct aggcttttgc aaaaagctcc 5820

cgggagcttg tatatccatt ttcggatctg atcagcacgt gatgaaaaag cctgaactca 5880

ccgcgacgtc tgtcgagaag tttctgatcg aaaagttcga cagcgtctcc gacctgatgc 5940

agctctcgga gggcgaagaa tctcgtgctt tcagcttcga tgtaggaggg cgtggatatg 6000

tcctgcgggt aaatagctgc gccgatggtt tctacaaaga tcgttatgtt tatcggcact 6060

ttgcatcggc cgcgctcccg attccggaag tgcttgacat tggggaattc agcgagagcc 6120

tgacctattg catctcccgc cgtgcacagg gtgtcacgtt gcaagacctg cctgaaaccg 6180

aactgcccgc tgttctgcag ccggtcgcgg aggccatgga tgcgatcgct gcggccgatc 6240

ttagccagac gagcgggttc ggcccattcg gaccgcaagg aatcggtcaa tacactacat 6300

ggcgtgattt catatgcgcg attgctgatc cccatgtgta tcactggcaa actgtgatgg 6360

acgacaccgt cagtgcgtcc gtcgcgcagg ctctcgatga gctgatgctt tgggccgagg 6420

actgccccga agtccggcac ctcgtgcacg cggatttcgg ctccaacaat gtcctgacgg 6480

acaatggccg cataacagcg gtcattgact ggagcgaggc gatgttcggg gattcccaat 6540

acgaggtcgc caacatcttc ttctggaggc cgtggttggc ttgtatggag cagcagacgc 6600

gctacttcga gcggaggcat ccggagcttg caggatcgcc gcggctccgg gcgtatatgc 6660

tccgcattgg tcttgaccaa ctctatcaga gcttggttga cggcaatttc gatgatgcag 6720

cttgggcgca gggtcgatgc gacgcaatcg tccgatccgg agccgggact gtcgggcgta 6780

cacaaatcgc ccgcagaagc gcggccgtct ggaccgatgg ctgtgtagaa gtactcgccg 6840

atagtggaaa ccgacgcccc agcactcgtc cgagggcaaa ggaatagcac gtgctacgag 6900

atttcgattc caccgccgcc ttctatgaaa ggttgggctt cggaatcgtt ttccgggacg 6960

ccggctggat gatcctccag cgcggggatc tcatgctgga gttcttcgcc caccccaact 7020

tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 7080

aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc 7140

atgtctgtat accgtcgacc tctagctaga gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc 7200

ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 7260

gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 7320

ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 7380

ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 7440

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 7500

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 7560

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 7620

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 7680

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 7740

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 7800

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 7860

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 7920

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 7980

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 8040

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 8100

gcaaacaaac caccgctggt agcggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 8160

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 8220

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 8280

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 8340

acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 8400

ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 8460

gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 8520

taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 8580

tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 8640

gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 8700

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aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 8820

cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 8880

tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 8940

gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 9000

tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 9060

gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 9120

ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 9180

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gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt c 9341

Claims (3)

1.一种表达质粒用于制备包装缺失E2a-DBP基因和E4基因的二代腺病毒的细胞株的用途，其特征在于，所述表达质粒包含编码腺病毒E2a-DBP蛋白和E4-ORF6蛋白的核酸序列；所述表达质粒是通过将腺病毒的E2a-DBP基因序列和E4-ORF6基因序列插入真核表达载体的多克隆位点制备而成，其中，所述E2a-DBP基因序列如SEQ ID No.5所示，所述E4-ORF6基因序列如SEQ ID No.6所示；所述真核表达载体为pcDNA3.1；所述表达质粒通过IRES序列串联启动E2a-DBP基因和E4-ORF6基因的表达，其中，IRES序列的基因序列如SEQ ID No.7所示；所述表达质粒的碱基序列如SEQ IDNo.9所示；

所述细胞株的制备方法由如下步骤组成：

1)构建表达质粒：设计引物，扩增E4-ORF6和E2a-DBP序列，添加6his标签序列，E4-ORF6和E2a-DBP通过IRES序列启动翻译，构建基于IRES序列的两个基因共表达质粒pcDNA3.1+（hyg）-ORF6-IRES-DBP-6His；

2)以步骤1)所构建的表达质粒转染表达腺病毒E1蛋白的包装细胞株，筛选获得同时表达E2a-DBP蛋白和E4-ORF6蛋白的阳性细胞株；所述表达腺病毒E1蛋白的包装细胞株为293细胞系、911细胞系或PERC6细胞系；

3)用缺失E2a-DBP基因和E4基因的二代腺病毒载体转染步骤2)所得阳性细胞株，筛选获得用于包装所述缺失E2a-DBP基因和E4基因的二代腺病毒的稳定细胞株。

2.一种包装缺失E2a-DBP基因和E4基因的二代腺病毒的细胞株，所述细胞株的保藏编号为：CCTCC No:C201996。

3.如权利要求2所述的细胞株在用于制备包装容量增加的二代腺病毒中的应用。

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