CN107574175A - 一种基于重组腺病毒的表达载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括：以野生型腺病毒AdC6的基因组为基础，通过基因组直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I‑Ceu I和PI‑Sce I酶切位点，同时以人源腺病毒Ad5的ORF6替换AdC6的ORF6，提高了在人源肾胚细胞(293A)中包装重组病毒的成功率和包装出重组病毒的滴度,获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体。本发明通过直接分子克隆的方法，构建大片段质粒，方法简单，已操作，可以用于任何大片段载体的构建；本发明通过几次克隆连接可以构建完成腺病毒表达载体，步骤简单；本发明删除E1、E3区和替换Ad5 ORF6，都可以用通过PCR扩增DNA片段的过程中能够完成删除和替换；本发明在细菌水平筛选阳性克隆更加容易、快捷，而且缩短了腺病毒载体构建时间。

Description

一种基于重组腺病毒的表达载体及其构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种用于基因治疗和疫苗载体的重组腺病毒载体及其构建方法。

背景技术

腺病毒 （adenovirus, Ad）作为基因表达载体的研制起始于20世纪60年代初，当时病毒学家观察到腺病毒基因组可与猴类病毒 40（SV40）基因组杂交，说明腺病毒基因组可承载异源性基因。此后腺病毒逐步发展成一种重要的载体系统。

目前，已经鉴别了57种不同的腺病毒血清型，重组腺病毒载体在基因治疗和疫苗载体方面得到了很多的应用，尤其是人血清5型腺病毒，它也是当前肿瘤基因治疗和人类免疫缺陷病毒（HIV）疫苗的研究的主要病毒载体。另外，诸如乙肝病毒、疟疾、结核等病原体的疫苗研制也都十分重视5型腺病毒载体的应用。

然而，由于人体内普遍存在抗Ad5腺病毒本身的免疫反应，这种预存的免疫反应包括抗腺病毒中和抗体和针对腺病毒的杀伤性T细胞，从而抑制其进入机体细胞而其所携带的目的基因就得不到预期水平的表达甚至是完全不表达，此外具有交叉性的针对腺病毒载体的细胞免疫CTL反应会杀死已经感染了腺病毒载体的靶细胞从而阻断外源基因的持续表达。总之，预存免疫反应会大大降低基于腺病毒载体的疫苗免疫或者基因治疗的效果。

为了克服预存免疫反应对腺病毒载体的影响，研究者们尝试了多种方法：（1）利用新方法运载重组Ad5载体；（2）对Ad5载体进行基因工程改造；（3）从其它人体腺病毒血清型甚至其他动物种属中开发新的重组腺病毒载体。由于人群中一般不会含有抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，因此基于黑猩猩型腺病毒的疫苗载体，其免疫效果显著优于以人血清型腺病毒构建的疫苗载体。该方法具体是以源于黑猩猩型腺病毒6型，改造为复制缺陷型的腺病毒载体

构建重组腺病毒载体的方法有三种。传统的方法是在包装病毒细胞系中进行外源基因和野生型病毒的同源重组，从而获得重组腺病毒，但这种方法操作复杂，不容易获得单一的重组腺病毒；第二种方法是基于在大肠杆菌中同源重组，其缺点是相对费时，容易发生突变；第三种方法是将像病毒基因组直接克隆到质粒载体，然后线性化转染包装细胞系，包装出重组腺病毒。

发明内容

为了弥补已有技术的缺陷，本发明提供一种基于腺病毒的表达载体及其构建方法。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现：

一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括：以野生型腺病毒AdC6的基因组为基础，通过基因组直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I-Ceu I和PI-Sce I酶切位点，同时以人血清型腺病毒Ad5的E4 ORF6替换AdC6的E4 ORF6，获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体；其中，野生型腺病毒AdC6的基因组的genebank登录号为AY530877，人血清型腺病毒Ad5基因组的genebank登录号为AY601635.1。

进一步地，所述的删除E1编码区是指删除野生型腺病毒AdC6的基因组中第492-3022位的碱基序列。

进一步地，所述的删除E3编码区是指删除野生型腺病毒AdC6的基因组中第17895-31909位的碱基序列。

进一步地，所述的AdC6的E4 ORF6是指野生型腺病毒AdC6的基因组中第33841-34746位的碱基序列。

进一步地，所述的Ad5的E4 ORF6是指人血清型腺病毒Ad5基因组中第33193-34077位的碱基序列。

进一步地，制备腺病毒表达载体的方法包括：

（1）PCR扩增AdC6的基因组的LITR片段(1-492)（基于geNEBank登录号AY530877的序列计算序列位点），用PmeI和BstAPI酶切pNEB193质粒和上述PCR产物，连接，获得质粒pNEB193-PB；

（2）用SnaBI和NdeI分别双酶切PUC57-linker和质粒pNEB193-PB，连接获得质粒pNEB193-PB +linker；

（3）用NdeI和MluI分别双酶切AdC6的基因组，将切下的目的片段插入到质粒pNEB193-PB +linker的NdeI和MluI位点中，获得质粒pNEB193-PB +linker+NM;

（4）PCR分别扩增AdC6的基因组从30137位至33841位片段和从34746位至36604位片段（基于genebank登录号AY530877的序列计算序列位点），同时PCR扩增Ad5基因组从33193位至34077位片段；通过Overlapping PCR扩增连接上述获得的三段片段，通过EcoRI和PacI酶切位点，连接于pNEB193载体，获得质粒pNEB193-EP-Ad5-ORF6；

（5）用XbaI和PacI双酶切AdC6的基因组，将切下的目的片段插入到pNEB193载体，获得质粒pNEB193-XP;

(6)PCR扩增AdC6的基因组从24045位至27110位片段，通过EcoRV和PacI酶切位点，连接于质粒pNEB193-XP，获得质粒pNEB193-XP-DE3；

(7) 用XbaI和PacI分别双酶切质粒pNEB193-XP-DE3和pNEB193-EP-Ad5-ORF6，获得质粒pNEB193-EX-Ad5-ORF6；

（8）用PmeI和MluI分别双酶切质粒pNEB193-PB+linker+NM和pNEB193-EX-Ad5-ORF6，连接之后，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。

在本发明的另一方面，提供一种腺病毒表达载体，所述表达载体在野生型腺病毒AdC6的基因组基础上删除E1和E3编码区，并且在E1删除区插入I-CeuI和PI-SceI酶切位点，同时以人血清型腺病毒Ad5的E4 ORF6替换AdC6的E4 ORF6，提高包装病毒的成功概率和包装出病毒滴度。

进一步地，所述腺病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示。

在另外的一选例中，所述腺病毒表达载体的酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I之间，还包括外源的抗原编码基因。

进一步地，所述外源的抗原是寨卡的包膜蛋白E抗原。

在本发明的另外一方面，提供一种制备疫苗的方法，所述方法包括：

（1）提供所述的重组腺病毒表达载体；

（2）将外源的抗原编码基因插入到（1）中腺病毒表达载体的酶切位点I-CeuI和PI-SceI之间；

（3）将步骤（2）的重组表达载体转染包装病毒细胞，病毒在细胞内包装完成，从而获得具有免疫原性的疫苗。

本发明具有如下有益效果：

（1）本发明人经过深入的研究，设计了一种有效的方法，成功地基于黑猩猩型腺病毒AdC6构建成一种新型表达载体，所述的疫苗载体可应用于制备高效表达且具有良好免疫原性的病毒疫苗。

（2）本发明通过分子克隆连接的方法，构建大片段质粒，简单，容易操作；同时以人源腺病毒Ad5的ORF6替换AdC6的ORF6，提高了在人源肾胚细胞中包装病毒的成功率和包装出病毒的滴度，本发明在细菌水平筛选阳性克隆更加容易、快捷，而且缩短了腺病毒载体构建时间。

（3）本发明的载体构建的方法可以适用于一切腺病毒载体的构建，能被普遍推广应用于所有生物医学实验室，并且对腺病毒内部序列可以进行优化改造，构建各种特异的腺病毒载体。

附图说明

图1为AdC6的基因组DNA的酶切鉴定结果。

图2为重组腺病毒表达载体AdC6-Ad5 ORF6的酶切鉴定结果。

图3为构建重组腺病毒AdC6- Ad5 ORF6-eGFP的鉴定结果，其中

A：重组腺病毒载体AdC6- Ad5 ORF6-eGFP的酶切鉴定结果；

B: 重组腺病毒载体AdC6- Ad5 ORF6-eGFP的噬斑形成结果。

图4为构建重组腺病毒AdC6- Ad5 ORF6-Zika-E的鉴定结果，其中，

A: AdC6- Ad5 ORF6-Zika-E的酶切鉴定结果；

B:WB检测AdC6- Ad5ORF6-Zika-E的包膜E蛋白抗原的表达。

图5为构建复制缺陷性腺病毒载体AdC6-Ad5 ORF6的流程图。

具体实施方式

本发明提供了一种重组腺病毒表达载体，所述表达载体包括：在野生型腺病毒AdC6的基因组基础上删除E1和E3编码区，且在E1删除区插入酶切位点I-CeuI和PI-SceI，同时以人血清型腺病毒Ad5的E4 ORF6替换野生型腺病毒AdC6的E4 ORF6，提高了在人源肾胚细胞(293A)中包装重组病毒的成功率和包装出重组病毒的滴度。其中，野生型腺病毒AdC6的E1编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO：15，野生型腺病毒AdC6的E3编码区的核苷酸序列如SEQ ID NO：16，人血清型腺病毒Ad5的E4 ORF6的核苷酸序列如SEQ ID NO：17，野生型腺病毒AdC6的E4 ORF6的核苷酸序列如SEQ ID NO：18。

经过仔细的分析AdC6的基因组，最终确认应用酶切位点I-Ceu I和PI-SceI作为外源基因的插入位点，此酶切位点不存在于腺病毒表达载体的其它位置。

黑猩猩型腺病毒AdC6，即SadV23，从黑猩猩体内分离得到。本发明以野生型AdC6为基础，通过基因组直接克隆方法，删除E1和E3编码区，在E1删除区插入酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I，同时以人源腺病毒Ad5的E4 ORF6替换AdC6的E4 ORF6，最终获得复制缺陷性的AdC6重组腺病毒表达载体。

本发明还提供了一种制备重组腺病毒表达载体的方法，所述方法包括：以野生型腺病毒AdC6的基因组为基础，删除E1和E3编码区，在E1删除区插入酶切位点I-CeuI和PI-SceI，同时以人源腺病毒Ad5的E4 ORF6替换AdC6的E4 ORF6，最终获得复制缺陷性的AdC6-Ad5ORF6重组腺病毒表达载体。

作为本发明的优选方式，克隆步骤包括： （1）PCR扩增AdC6的基因组的LITR片段（约450bp），用PmeI和BstAPI分别双酶切pNEB193质粒和PCR产物，连接形成质粒pNEB193-PB；（2）用SnaBI和NdeI分别双酶切PUC57-linker和pNEB193-PB质粒，连接成质粒PNEB193-PB +linker；（3）用NdeI和MluI双酶切AdC6的基因组，将切下的目的片段插入到质粒PNEB193-PB +linker的NdeI和MluI位点中，获得质粒pNEB193-PB +linker+NM；（4） PCR分别扩增AdC6的基因组从30137位至33841位和从34746位至36604位的DNA片段，同时PCR扩增Ad5基因组从33193位至34077位的DNA片段；通过Overlapping PCR扩增连接上述获得的三段片段，通过EcoRI和PacI酶切位点，连接于PNEB193载体，获得质粒PNEB193-EP-Ad5-ORF6；（5）用XbaI和PacI双酶切AdC6的基因组，将切下的目的片段插入到PNEB193载体，获得质粒PNEB193-XP；（6） PCR扩增AdC6的基因组从24045位至27110位，通过EcoRV和PacI酶切位点，连接于质粒PNEB193-XP，获得质粒PNEB193-XP-DE3；（7） 用XbaI和PacI分别双酶切质粒PNEB193-XP-DE3和PNEB193-EP-Ad5-ORF6，获得质粒PNEB193-EX-Ad5-ORF6；（8）用PmeI和MluI分别双酶切质粒PNEB193-PB +linker+NM和PNEB193-EX-Ad5-ORF6，连接之后，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。

获得重组腺病毒表达载体之后，线性化之后将其转染入包装病毒细胞，进行病毒的扩增；转染一段时间后，可以收获病毒；收获的病毒可以反复感染病毒包装细胞系，持续传代。

本发明的复制缺陷型的重组腺病毒表达载体作为一种表达载体平台，适用于表达多种抗原，从而制备病毒疫苗。

为了验证AdC6-Ad5 ORF6的有效性，本发明将绿色荧光蛋白基因克隆入AdC6-Ad5ORF6载体，研究显示AdC6-Ad5 ORF6载体能高表达抗原基因，证明本发明获得了一种新型的腺病毒载体，可用于疫苗研发以及其它生物医学基础研究，为新型疫苗研发提供一种新型的载体平台。

本发明通过腺病毒基因组直接克隆的方法，利用HOST08大肠杆菌稳定转化体系，极大程度上降低了大片段腺病毒载体发生突变的可能，获得的重组腺病毒载体遗传稳定性好。因此，应用本发明构建的腺病毒载体表达外源基因将更稳定。本发明利用体外直接分子克隆的方法构建重组腺病毒载体，在细菌水平筛选阳性克隆更加容易、快捷，而且缩短了重组腺病毒载体构建时间。而且本发明的载体构建的方法可以适用于一切腺病毒载体的构建，能被普遍推广应用于所以生物医学实验室，并且对腺病毒内部序列可以进行优化改造，构建各种特异的腺病毒载体。因此，本发明不仅提供了一种新的腺病毒表达载体，而且提供了一种新型的腺病毒构建方法，有利于促进腺病毒载体在生物医学基础研究领域和临床开发方面的应用。

下面结合具体实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不是限制本发明的范围。下列实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J. 萨姆布鲁克等编著的分子克隆指南第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或者按照试剂的说明书的条件。

材料

1.1病毒株和细胞

野生型腺病毒AdC6购于ATCC(VR-592 )；293A细胞株本实验室保存，培养基为10%胎牛血清（FBS）的DMEM。

限制性内切酶、菌种和质粒

限制性内切酶购自New England Biolabs；DH5α感受态购自于天根生化科技有限公司；E.coli HST08感受态购自于Takara。

pHAGE-CMV-MCS-eGFP质粒由实验室保存。

PreM-M-E (Zika)质粒由实验室保存。

pNEB193 质粒由实验室保存。

pShuttle2-CMV-Flag载体购于Addgene。

pUC57-Linker质粒：linker序列（SEQ ID NO：1）由北京华大基因合成并克隆至pUC57载体上，获得pUC57-Linker。

方法

2.1 腺病毒的扩增与纯化

293A细胞在含有10%FBS的DMEM培养基培养，AdC6腺病毒在293A细胞中培养增值，当细胞全部表现出病毒病变（CPE）后，收集感染的细胞，离心，用DMEM重悬，反复冻融细胞三次，使细胞裂解释放出病毒。病毒经过CsCl密度梯度离心纯化，加入甘油保存于-80摄氏度。

提取腺病毒基因组DNA

AdC6腺病毒纯化后，用标准方法提取基因组DNA。用AgeI酶切鉴定基因组DNA。

构建复制缺陷性的的重组腺病毒载体

2.3.1构建质粒pNEB193-PB

以AdC6的基因组为模版，用如下的引物PCR扩增得到PmeI到BstAPI约450bp，然后用PmeI和BstAPI分别双酶切PCR产物和pNEB193，连接，获得质粒pNEB193-PB。含有限制性内切酶位点PmeI和BstAPI的引物如下：

F:5-GGGTTTAAACCCGCGATCGCGCATCATCAATAATATACCTCAAAC-3（SEQ ID NO：2）

R:5-AAGGGCACCATCTGCACGCGTCGCCATATGGAATACGTAAAAACACCGGACTTTG-3（SEQ ID NO：3）

2.3.2 构建质粒pNEB193-PB +linker

用SnaBI和NdeI分别双酶切PUC57-linker和质粒pNEB193-PB，连接成质粒PNEB193-PB+linker。

构架质粒pNEB193- PB +linker+NM

用NdeI和MluI双酶切AdC6的基因组，将切下的目的片段插入到PNEB193-PB +linker质粒的NdeI和MluI位点中，获得质粒PNEB193-PB +linker+NM。

构建质粒pNEB193- EP-Ad5-ORF6

用引物F1和R1 PCR扩增AdC6的基因组从30137位至33841位DNA片段A1，用引物F2和R2扩增AdC6的基因组从34746位至36604位DNA片段A2，同时用引物F3和R3扩增Ad5基因组从33193位至34077位的DNA片段A3；通过引物F1和R3 Overlapping PCR扩增连接A1，A2和A3三段DNA片段，通过EcoRI和PacI酶切位点，连接于pNEB193载体，获得质粒pNEB193-EP-Ad5-ORF6。

表1

2.3.5 构建质粒PNEB193-XP

用XbaI和PacI双酶切AdC6的基因组，将切下的目的片段插入到pNEB193载体，获得质粒pNEB193-XP；

2.3.6 构建质粒pNEB193-XP+PE-DE3

用引物F4和R4 PCR扩增AdC6的基因组从24045位至27110位的DNA片段A4，使用EcoRV和PacI分别双酶切质粒pNEB193-XP和扩增的DNA片段A4，回收目的片段，连接获得质粒pNEB193-XP+PE-DE3；

表2

2.3.7 构建质粒pNEB193-EX-Ad5-ORF6

用XbaI和PacI分别双酶切质粒pNEB193-XP+PE-DE3和PNEB193-EP-Ad5-ORF6，回收目的片段，连接获得质粒PNEB193-EX-Ad5-ORF6；

2.3.8用PmeI和MluI分别双酶切质粒PNEB193-PB+linker+NM和PNEB193-EX-Ad5-ORF6，回收目的片段，连接之后，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。

获得的复制缺陷型的重组腺病毒表达载体AdC6-Ad5 ORF6的核苷酸序列如SEQ IDNO：12。

构建重组腺病毒AdC6- Ad5 ORF6-eGFP

2.4.1 将eGFP基因克隆至AdC6- Ad5 ORF6

以EcoRI和BamHI分别双酶切pHAGE-CMV-MCS-eGFP和pShuttle2-CMV-Flag质粒，琼脂糖凝胶回收目的片段，连接获得载体pShuttle2-CMV-eGFP；用I-Ceu I和PI-Sce I分别双酶切pShuttle2-CMV-eGFP和AdC6-Ad5 ORF6，琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段，连接，转化，鉴定，获得载体AdC6-Ad5 ORF6-eGFP。

包装AdC6- Ad5 ORF6-eGFP重组腺病毒

用SgfI酶切线性化AdC6- Ad5 ORF6-eGFP质粒（eGFP核苷酸序列SEQ ID NO：13）；用293A细胞铺六孔板，当细胞融合度到70%-80%时，用X-tremeGENE(Roche)转染约2ug已线性化的AdC6-Ad5ORF6-eGFP质粒包装重组腺病毒。每天观察荧光及细胞状态，直至约第八天左右出现细胞病变（CPE）。

构建重组腺病毒AdC6- Ad5ORF6-Zika-E

2.5.1 将寨卡（Zika）的包膜蛋白（E）基因克隆至AdC6- Ad5 ORF6

用KpnI和BamHI分别双酶切pShuttle2-CMV-Flag质粒和PreM-M-E (Zika)质粒，胶回收载体和目的基因片段，连接，转化，鉴定，获得pShuttle2-CMV-E (Zika)（寨卡E抗原核苷酸序列SEQ ID NO：14）。用I-Ceu I和PI-Sce I分别双酶切pShuttle2-CMV-E (Zika)和AdC6-Ad5ORF6，琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段，连接，转化，鉴定，获得载体AdC6- Ad5ORF6-Zika-E。

包装AdC6- Ad5ORF6-Zika-E重组腺病毒

用SgfI酶切线性化AdC6- Ad5 ORF6-Zika-E质粒；用293A细胞铺六孔板，当细胞融合度到70%-80%时，用X-tremeGENE(Roche)转染约2ug已线性化的AdC6- Ad5ORF6-Zika-E质粒包装重组腺病毒。每天观察细胞状态，直至约第八天左右出现细胞病变（CPE）。

扩增与纯化重组腺病毒AdC6- Ad5ORF6-Zika-E

293A细胞在含有10%FBS的DMEM培养基培养，AdC6- Ad5ORF6-Zika-E腺病毒在293A细胞中培养扩增；重组腺病毒感染293A细胞后，当细胞全部出现细胞病变（CPE），收集被感染的细胞，离心；用DMEM重悬细胞，反复冻融细胞三次，使细胞裂解，释放出病毒。病毒经过CsCl密度梯度离心纯化，然后用病毒保存液冻存于-80℃冰箱。

酶切鉴定AdC6- Ad5 ORF6-Zika-E病毒核酸

AdC6-Ad5 ORF6-Zika-E重组腺病毒纯化之后，用标准方法提取基因组DNA；用AgeI、HindIII和SphI分别酶切做鉴定。

检测Zika的E蛋白的表达

用293A细胞铺六孔板；当细胞融合度达到80-90%时，用AdC6- Ad5ORF6-Zika-E病毒去感染细胞，同时用AdC6-Ad5ORF6病毒去感染细胞，24小时之后收细胞，western blot 检测E蛋白的表达。

实施例

实施例1、腺病毒的扩增、纯化与腺病毒基因组的提取

野生型AdC6在293A细胞中增值，经过CsCl密度梯度离心得到纯化的病毒，之后提取病毒基因组DNA，用AgeI酶切鉴定，进行琼脂糖电泳，结果显示扩增和纯化的病毒是AdC6的腺病毒，实验结果请参阅图1。

实施例2构建复制缺陷性的腺病毒载体

按照图5所示的流程图，PCR扩增AdC6基因组的LITR片段（约450bp），用PmeI和BstAPI酶切pNEB193质粒和PCR产物，连接形成质粒pNEB193-PB。

用SnaBI和NdeI酶切PUC57-linker和pNEB193-PB质粒，连接成质粒PNEB193-PB+linker。

用NdeI和MluI酶切AdC6的基因组，将切下的目的片段插入到PNEB193-PB +linker质粒的NdeI和MluI位点中，获得质粒PNEB193-PB +linker+NM。

PCR分别扩增AdC6基因组从30137位至33841位和从34746位至36604位DNA片段，同时PCR扩增Ad5基因组从33193位至34077位DNA片段。通过Overlapping PCR扩增三段基因组，通过EcoRI和PacI酶切位点，连接于PNEB193载体，获得质粒PNEB193-EP-Ad5-ORF6；

用XbaI和PacI酶切AdC6的基因组，将切下的目的片段插入到PNEB193载体，获得质粒PNEB193-XP；

PCR扩增AdC6基因组从24045位至27110位DNA片段，通过EcoRV和PacI酶切位点，连接于质粒PNEB193-XP，获得质粒PNEB193-XP-DE3；

用XbaI和PacI酶切质粒PNEB193-XP-DE3和PNEB193-EP-Ad5-ORF6，获得质粒PNEB193-EX-Ad5-ORF6；

用PmeI和MluI酶切质粒PNEB193-PB+linker+NM和PNEB193-EX-Ad5-ORF6，连接之后，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体AdC6-Ad5 ORF6。用AgeI、HindIII和SphI分别酶切AdC6-Ad5 ORF6，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果显示AdC6-Ad5 ORF6为正确目的载体。实验结果请参阅图2。

实施例3、构建重组腺病毒AdC6-Ad5ORF6-eGFP

将eGFP基因片段克隆至AdC6-Ad5 ORF6之后，重组腺病毒载体AdC6-Ad5ORF6-eGFP的酶切鉴定结果请参阅图3A。

参阅图3B，重组载体AdC6-Ad5ORF6-eGFP线性化之后转染293A细胞，第八天出现细胞病变，随后细胞病变逐渐扩大。

实施例4、构建重组腺病毒AdC6- Ad5ORF6-Zika-E

将Zika的包膜蛋白（E）基因克隆至AdC6-Ad5ORF6之后，线性化质粒转染293A细胞，包装出病毒。扩增、纯化病毒之后，提基因组酶切鉴定，请参阅图4A。

用重组的复制缺陷性的AdC6- Ad5ORF6-Zika-E和空载的AdC6-Ad5ORF6病毒分别感染293A细胞，24小时之后，收集细胞，Weatern blot鉴定E蛋白的表达，请参阅图4B。

结论

通过以上病毒基因组直接克隆的方法，本发明将野生型腺病毒AdC6构建成能稳定表达外源基因的载体，同时以人源腺病毒Ad5的ORF6替换AdC6的ORF6，这种嵌合重组的腺病毒载体，其中Ad5ORF6能够提高包装病毒过程中对人源肾胚细胞(293A)中Ad5的E1的利用，更加利于包装出重组病毒和提高了包装出重组病毒的病毒滴度。因此本发明为新型疫苗的研发以及生物医学的基础研究提供了一种基于AdC6-Ad5ORF6的新型表达载体，同时提供了一种新型的构建腺病毒载体的方法。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 南方医科大学

<120> 一种基于重组腺病毒的表达载体及其构建方法

<141> 2017-09-11

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 165

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgctacgtac gatatcattt ccccgaaagt gccacctgac cgtaactata acggtcctaa 60

ggtagcgaag catctatgtc gggtgcggag aaagaggtaa tgaaatggca ttatgggtat 120

tatgggtctg cattaatgaa tcggtcagat atcgacatat gctgc 165

<210> 2

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gggtttaaac ccgcgatcgc gcatcatcaa taatatacct caaac 45

<210> 3

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagggcacca tctgcacgcg tcgccatatg gaatacgtaa aaacaccgga ctttg 55

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tctcagaatg ggttaattaa aggacagagt gttagtgtga 40

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gactctaccc ccatgtagcc gtgatcccga ccaccgagga caa 43

<210> 6

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctcggtggtc gggatcacgg ctacatgggg gtagagtcat aa 42

<210> 7

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tacagcaagt acgaaaatga ctacgtccgg cgttccatt 39

<210> 8

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acgccggacg tagtcatttt cgtacttgct gtagcagaa 39

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cggaattccg gcgatcgcgc atcatcaata atatacctca aac 43

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcccgcctac ctgatatcac ctccttggaa 30

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atccttaatt aagagctagg tcagctgcgc ca 32

<210> 12

<211> 33077

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcgcccaata cgcaaaccgc ctctccccgc gcgttggccg attcattaat gcagctggca 60

cgacaggttt cccgactgga aagcgggcag tgagcgcaac gcaattaatg tgagttagct 120

cactcattag gcaccccagg ctttacactt tatgcttccg gctcgtatgt tgtgtggaat 180

tgtgagcgga taacaatttc acacaggaaa cagctatgac catgattacg ccaagcttgc 240

atgcctgcag gtttaaaccc gcgatcgcgc atcatcaata atatacctca aacttttggt 300

gcgcgttaat atgcaaatga gctgtttgaa tttggggagg gaggaaggtg attggctgcg 360

ggagcggcga ccgttagggg cggggcgggt gacgttttga tgacgtggct atgaggcgga 420

gccggtttgc aagttctcgt gggaaaagtg acgtcaaacg aggtgtggtt tgaacacgga 480

aatactcaat tttcccgcgc tctctgacag gaaatgaggt gtttctgggc ggatgcaagt 540

gaaaacgggc cattttcgcg cgaaaactga atgaggaagt gaaaatctga gtaatttcgc 600

gtttatggca gggaggagta tttgccgagg gccgagtaga ctttgaccga ttacgtgggg 660

gtttcgatta ccgtattttt cacctaaatt tccgcgtacg gtgtcaaagt ccggtgtttt 720

tacgtacgat atcatttccc cgaaagtgcc acctgaccgt aactataacg gtcctaaggt 780

agcgaagcat ctatgtcggg tgcggagaaa gaggtaatga aatggcatta tgggtattat 840

gggtctgcat taatgaatcg gtcagatatc gacatatgct ggccaccgtg catgtggcct 900

cgcacccccg caagacatgg cccgagttcg agcacaacgt catgacccgc tgcaatgtgc 960

acctgggctc ccgccgaggc atgttcatgc cctaccagtg caacatgcaa tttgtgaagg 1020

tgctgctgga gcccgatgcc atgtccagag tgagcctgac gggggtgttt gacatgaatg 1080

tggagctgtg gaaaattctg agatatgatg aatccaagac caggtgccgg gcctgcgaat 1140

gcggaggcaa gcacgccagg cttcagcccg tgtgtgtgga ggtgacggag gacctgcgac 1200

ccgatcattt ggtgttgtcc tgcaacggga cggagttcgg ctccagcggg gaagaatctg 1260

actagagtga gtagtgtttg gggctgggtg tgagcctgca tgaggggcag aatgactaaa 1320

atctgtggtt ttctgtgtgt tgcagcagca tgagcggaag cgcctccttt gagggagggg 1380

tattcagccc ttatctgacg gggcgtctcc cctcctgggc gggagtgcgt cagaatgtga 1440

tgggatccac ggtggacggc cggcccgtgc agcccgcgaa ctcttcaacc ctgacctacg 1500

cgaccctgag ctcctcgtcc gtggacgcag ctgccgccgc agctgctgct tccgccgcca 1560

gcgccgtgcg cggaatggcc ctgggcgccg gctactacag ctctctggtg gccaactcga 1620

gttccaccaa taatcccgcc agcctgaacg aggagaagct gctgctgctg atggcccagc 1680

tcgaggccct gacccagcgc ctgggcgagc tgacccagca ggtggctcag ctgcaggcgg 1740

agacgcgggc cgcggttgcc acggtgaaaa ccaaataaaa aatgaatcaa taaataaacg 1800

gagacggttg ttgattttaa cacagagtct tgaatcttta tttgattttt cgcgcgcggt 1860

aggccctgga ccaccggtct cgatcattga gcacccggtg gatcttttcc aggacccggt 1920

agaggtgggc ttggatgttg aggtacatgg gcatgagccc gtcccggggg tggaggtagc 1980

tccattgcag ggcctcgtgc tcggggatgg tgttgtaaat cacccagtca tagcaggggc 2040

gcagggcgtg gtgctgcacg atgtccttga ggaggagact gatggccacg ggcagcccct 2100

tggtgtaggt gttgacgaac ctgttgagct gggagggatg catgcggggg gagatgagat 2160

gcatcttggc ctggatcttg agattggcga tgttcccgcc cagatcccgc cgggggttca 2220

tgttgtgcag gaccaccagc acggtgtatc cggtgcactt ggggaatttg tcatgcaact 2280

tggaagggaa ggcgtgaaag aatttggaga cgcccttgtg accgcccagg ttttccatgc 2340

actcatccat gatgatggcg atgggcccgt gggcggcggc ctgggcaaag acgtttcggg 2400

ggtcggacac atcgtagttg tggtcctggg tgagctcgtc ataggccatt ttaatgaatt 2460

tggggcggag ggtgcccgac tgggggacga aggtgccctc gatcccgggg gcgtagttgc 2520

cctcgcagat ctgcatctcc caggccttga gctcggaggg ggggatcatg tccacctgcg 2580

gggcgatgaa aaaaacggtt tccggggcgg gggagatgag ctgggccgaa agcaggttcc 2640

ggagcagctg ggacttgccg caaccggtgg ggccgtagat gaccccgatg accggctgca 2700

ggtggtagtt gagggagaga cagctgccgt cctcgcggag gaggggggcc acctcgttca 2760

tcatctcgcg cacatgcatg ttctcgcgca cgagttccgc caggaggcgc tcgcccccca 2820

gcgagaggag ctcttgcagc gaggcgaagt ttttcagcgg cttgagtccg tcggccatgg 2880

gcattttgga gagggtctgt tgcaagagtt ccagacggtc ccagagctcg gtgatgtgct 2940

ctagggcatc tcgatccagc agacctcctc gtttcgcggg ttggggcgac tgcgggagta 3000

gggcaccagg cgatgggcgt ccagcgaggc cagggtccgg tccttccagg gccgcagggt 3060

ccgcgtcagc gtggtctccg tcacggtgaa ggggtgcgcg ccgggctggg cgcttgcgag 3120

ggtgcgcttc aggctcatcc ggctggtcga gaaccgctcc cggtcggcgc cctgcgcgtc 3180

ggccaggtag caattgagca tgagttcgta gttgagcgcc tcggccgcgt ggcccttggc 3240

gcggagctta cctttggaag tgtgtccgca gacgggacag aggagggact tgagggcgta 3300

gagcttgggg gcgaggaaga cggactcggg ggcgtaggcg tccgcgccgc agctggcgca 3360

gacggtctcg cactccacga gccaggtgag gtcggggcgg ttggggtcaa aaacgaggtt 3420

tcctccgtgc tttttgatgc gtttcttacc tctggtctcc atgagctcgt gtccccgctg 3480

ggtgacaaag aggctgtccg tgtccccgta gaccgacttt atgggccggt cctcgagcgg 3540

ggtgccgcgg tcctcgtcgt agaggaaccc cgcccactcc gagacgaagg cccgggtcca 3600

ggccagcacg aaggaggcca cgtgggaggg gtagcggtcg ttgtccacca gcgggtccac 3660

cttctccagg gtatgcaagc acatgtcccc ctcgtccaca tccaggaagg tgattggctt 3720

gtaagtgtag gccacgtgac cgggggtccc ggccgggggg gtataaaagg gggcgggccc 3780

ctgctcgtcc tcactgtctt ccggatcgct gtccaggagc gccagctgtt ggggtaggta 3840

ttccctctcg aaggcgggca tgacctcggc actcaggttg tcagtttcta gaaacgagga 3900

ggatttgata ttgacggtgc cgttggagac gcctttcatg agcccctcgt ccatttggtc 3960

agaaaagacg atctttttgt tgtcgagctt ggtggcgaag gagccgtaga gggcgttgga 4020

gagcagcttg gcgatggagc gcatggtctg gttcttttcc ttgtcggcgc gctccttggc 4080

ggcgatgttg agctgcacgt actcgcgcgc cacgcacttc cattcgggga agacggtggt 4140

gagctcgtcg ggcacgattc tgacccgcca gccgcggttg tgcagggtga tgaggtccac 4200

gctggtggcc acctcgccgc gcaggggctc gttggtccag cagaggcgcc cgcccttgcg 4260

cgagcagaag gggggcagcg ggtccagcat gagctcgtcg ggggggtcgg cgtccacggt 4320

gaagatgccg ggcaggagct cggggtcgaa gtagctgatg caggtgccca gattgtccag 4380

cgccgcttgc cagtcgcgca cggccagcgc gcgctcgtag gggctgaggg gcgtgcccca 4440

gggcatgggg tgcgtgagcg cggaggcgta catgccgcag atgtcgtaga cgtagagggg 4500

ctcctcgagg acgccgatgt aggtggggta gcagcgcccc ccgcggatgc tggcgcgcac 4560

gtagtcgtac agctcgtgcg agggcgcgag gagccccgtg ccgaggttgg agcgttgcgg 4620

cttttcggcg cggtagacga tctggcggaa gatggcgtgg gagttggagg agatggtggg 4680

cctttggaag atgttgaagt gggcgtgggg caggccgacc gagtccctga tgaagtgggc 4740

gtaggagtcc tgcagcttgg cgacgagctc ggcggtgacg aggacgtcca gggcgcagta 4800

gtcgagggtc tcttggatga tgtcatactt gagctggccc ttctgcttcc acagctcgcg 4860

gttgagaagg aactcttcgc ggtccttcca gtactcttcg agggggaacc cgtcctgatc 4920

ggcacggtaa gagcccacca tgtagaactg gttgacggcc ttgtaggcgc agcagccctt 4980

ctccacgggg agggcgtaag cttgcgcggc cttgcgcagg gaggtgtggg tgagggcgaa 5040

ggtgtcgcgc accatgacct tgaggaactg gtgcttgaag tcgaggtcgt cgcagccgcc 5100

ctgctcccag agttggaagt ccgtgcgctt cttgtaggcg gggttaggca aagcgaaagt 5160

aacatcgttg aagaggatct tgcccgcgcg gggcatgaag ttgcgagtga tgcggaaagg 5220

ctggggcacc tcggcccggt tgttgatgac ctgggcggcg aggacgatct cgtcgaagcc 5280

gttgatgttg tgcccgacga tgtagagttc cacgaatcgc gggcggccct tgacgtgggg 5340

cagcttcttg agctcgtcgt aggtgagctc ggcggggtcg ctgagcccgt gctgctcgag 5400

ggcccagtcg gcgacgtggg ggttggcgct gaggaaggaa gtccagagat ccacggccag 5460

ggcggtctgc aagcggtccc ggtactgacg gaactgttgg cccacggcca ttttttcggg 5520

ggtgacgcag tagaaggtgc gggggtcgcc gtgccagcgg tcccacttga gctggagggc 5580

gaggtcgtgg gcgagctcga cgagcggcgg gtccccggag agtttcatga ccagcatgaa 5640

ggggacgagc tgcttgccga aggaccccat ccaggtgtag gtttccacat cgtaggtgag 5700

gaagagcctt tcggtgcgag gatgcgagcc gatggggaag aactggatct cctgccacca 5760

gttggaggaa tggctgttga tgtgatggaa gtagaaatgc cgacggcgcg ccgagcactc 5820

gtgcttgtgt ttatacaagc gtccgcagtg ctcgcaacgc tgcacgggat gcacgtgctg 5880

cacgagctgt acctgggttc ctttggcgag gaatttcagt gggcagtgga gcgctggcgg 5940

ctgcatctcg tgctgtacta cgtcttggcc atcggcgtgg ccatcgtctg cctcgatggt 6000

ggtcatgctg acgagcccgc gcgggaggca ggtccagacc tcggctcgga cgggtcggag 6060

agcgaggacg agggcgcgca ggccggagct gtccagggtc ctgagacgct gcggagtcag 6120

gtcagtgggc agcggcggcg cgcggttgac ttgcaggagc ttttccaggg cgcgcgggag 6180

gtccagatgg tacttgatct ccacggcgcc gttggtggct acgtccacgg cttgcagggt 6240

gccgtgcccc tggggcgcca ccaccgtgcc ccgtttcttc ttgggcgctg cttccatgtc 6300

ggtcagaagc ggcggcgagg acgcgcgccg ggcggcaggg gcggctcggg gcccggaggc 6360

aggggcggca ggggcacgtc ggcgccgcgc gcgggcaggt tctggtactg cgcccggaga 6420

agactggcgt gagcgacgac gcgacggttg acgtcctgga tctgacgcct ctgggtgaag 6480

gccacgggac ccgtgagttt gaacctgaaa gagagttcga cagaatcaat ctcggtatcg 6540

ttgacggcgg cctgccgcag gatctcttgc acgtcgcccg agttgtcctg gtaggcgatc 6600

tcggtcatga actgctcgat ctcctcctcc tgaaggtctc cgcggccggc gcgctcgacg 6660

gtggccgcga ggtcgttgga gatgcggccc atgagctgcg agaaggcgtt catgccggcc 6720

tcgttccaga cgcggctgta gaccacggct ccgtcggggt cgcgcgcgcg catgaccacc 6780

tgggcgaggt tgagctcgac gtggcgcgtg aagaccgcgt agttgcagag gcgctggtag 6840

aggtagttga gcgtggtggc gatgtgctcg gtgacgaaga agtacatgat ccagcggcgg 6900

agcggcatct cgctgacgtc gcccagggct tccaagcgtt ccatggcctc gtagaagtcc 6960

acggcgaagt tgaaaaactg ggagttgcgc gccgagacgg tcaactcctc ctccagaaga 7020

cggatgagct cggcgatggt ggcgcgcacc tcgcgctcga aggccccggg gggctcctct 7080

tccatctcct cctcttcctc ctccactaac atctcttcta cttcctcctc aggaggcggt 7140

ggcgggggag gggccctgcg tcgccggcgg cgcacgggca gacggtcgat gaagcgctcg 7200

atggtctccc cgcgccggcg acgcatggtc tcggtgacgg cgcgcccgtc ctcgcggggc 7260

cgcagcatga agacgccgcc gcgcatctcc aggtggccgc cgggggggtc tccgttgggc 7320

agggagaggg cgctgacgat gcatcttatc aattgacccg tagggactcc gcgcaaggac 7380

ctgagcgtct cgagatccac gggatccgaa aaccgctgaa cgaaggcttc gagccagtcg 7440

cagtcgcaag gtaggctgag cccggtttct tgttcttcgg gtatttggtc gggaggcggg 7500

cgggcgatgc tgctggtgat gaagttgaag taggcggtcc tgagacggcg gatggtggcg 7560

aggagcacca ggtccttggg cccggcttgc tggatgcgca gacggtcggc catgccccag 7620

gcgtggtcct gacacctggc gaggtccttg tagtagtcct gcatgagccg ctccacgggc 7680

acctcctcct cgcccgcgcg gccgtgcatg cgcgtgagcc cgaacccgcg ctgcggctgg 7740

acgagcgcca ggtcggcgac gacgcgctcg gtgaggatgg cctgctggat ctgggtgagg 7800

gtggtctgga agtcgtcgaa gtcgacgaag cggtggtagg ctccggtgtt gatggtgtag 7860

gagcagttgg ccatgacgga ccagttgacg gtctggtggc cgggtcgcac gagctcgtgg 7920

tacttgaggc gcgagtaggc gcgcgtgtcg aagatgtagt cgttgcaggc gcgcacgagg 7980

tactggtatc cgacgaggaa gtgcggcggc ggctggcggt agagcggcca tcgctcggtg 8040

gcgggggcgc cgggcgcgag gtcctcgagc atgaggcggt ggtagccgta gatgtacctg 8100

gacatccagg tgatgccggc ggcggtggtg gaggcgcgcg ggaactcgcg gacgcggttc 8160

cagatgttgc gcagcggcag gaagtagttc atggtggccg cggtctggcc cgtgaggcgc 8220

gcgcagtcgt ggatgctcta gacatacggg caaaaacgaa agcggtcagc ggctcgactc 8280

cgtggcctgg aggctaagcg aacgggttgg gctgcgcgtg taccccggtt cgaatctcga 8340

atcaggctgg agccgcagct aacgtggtac tggcactccc gtctcgaccc aagcctgcta 8400

acgaaacctc caggatacgg aggcgggtcg ttttttggcc ttggtcgctg gtcatgaaaa 8460

actagtaagc gcggaaagcg gccgcccgcg atggctcgct gccgtagtct ggagaaagaa 8520

tcgccagggt tgcgttgcgg tgtgccccgg ttcgagcctc agcgctcggc gccggccgga 8580

ttccgcggct aacgtgggcg tggctgcccc gtcgtttcca agacccctta gccagccgac 8640

ttctccagtt acggagcgag cccctctttt tttttcttgt gtttttgcca gatgcatccc 8700

gtactgcggc agatgcgccc ccaccctcca ccacaaccgc ccctaccgca gcagcagcaa 8760

cagccggcgc ttctgccccc gccccagcag cagccagcca ctaccgcggc ggccgccgtg 8820

agcggagccg gcgttcagta tgacctggcc ttggaagagg gcgaggggct ggcgcggctg 8880

ggggcgtcgt cgccggagcg gcacccgcgc gtgcagatga aaagggacgc tcgcgaggcc 8940

tacgtgccca agcagaacct gttcagagac aggagcggcg aggagcccga ggagatgcgc 9000

gcctcccgct tccacgcggg gcgggagctg cggcgcggcc tggaccgaaa gcgggtgctg 9060

agggacgagg atttcgaggc ggacgagctg acggggatca gccccgcgcg cgcgcacgtg 9120

gccgcggcca acctggtcac ggcgtacgag cagaccgtga aggaggagag caacttccaa 9180

aaatccttca acaaccacgt gcgcacgctg atcgcgcgcg aggaggtgac cctgggcctg 9240

atgcacctgt gggacctgct ggaggccatc gtgcagaacc ccacgagcaa gccgctgacg 9300

gcgcagctgt ttctggtggt gcagcacagt cgggacaacg agacgttcag ggaggcgctg 9360

ctgaatatca ccgagcccga gggccgctgg ctcctggacc tggtgaacat tttgcagagc 9420

atcgtggtgc aggagcgcgg gctgccgctg tccgagaagc tggcggccat caacttctcg 9480

gtgctgagtc tgggcaagta ctacgctagg aagatctaca agaccccgta cgtgcccata 9540

gacaaggagg tgaagatcga cgggttttac atgcgcatga ccctgaaagt gctgaccctg 9600

agcgacgatc tgggggtgta ccgcaacgac aggatgcacc gcgcggtgag cgccagccgc 9660

cggcgcgagc tgagcgacca ggagctgatg cacagcctgc agcgggccct gaccggggcc 9720

gggaccgagg gggagagcta ctttgacatg ggcgcggacc tgcgctggca gcccagccgc 9780

cgggccttgg aagctgccgg cggttccccc tacgtggagg aggtggacga tgaggaggag 9840

gagggcgagt acctggaaga ctgatggcgc gaccgtattt ttgctagatg cagcaacagc 9900

caccgccgcc gcctcctgat cccgcgatgc gggcggcgct gcagagccag ccgtccggca 9960

ttaactcctc ggacgattgg acccaggcca tgcaacgcat catggcgctg acgacccgca 10020

atcccgaagc ctttagacag cagcctcagg ccaaccggct ctcggccatc ctggaggccg 10080

tggtgccctc gcgctcgaac cccacgcacg agaaggtgct ggccatcgtg aacgcgctgg 10140

tggagaacaa ggccatccgc ggtgacgagg ccgggctggt gtacaacgcg ctgctggagc 10200

gcgtggcccg ctacaacagc accaacgtgc agacgaacct ggaccgcatg gtgaccgacg 10260

tgcgcgaggc ggtgtcgcag cgcgagcggt tccaccgcga gtcgaacctg ggctccatgg 10320

tggcgctgaa cgccttcctg agcacgcagc ccgccaacgt gccccggggc caggaggact 10380

acaccaactt catcagcgcg ctgcggctga tggtggccga ggtgccccag agcgaggtgt 10440

accagtcggg gccggactac ttcttccaga ccagtcgcca gggcttgcag accgtgaacc 10500

tgagccaggc tttcaagaac ttgcagggac tgtggggcgt gcaggccccg gtcggggacc 10560

gcgcgacggt gtcgagcctg ctgacgccga actcgcgcct gctgctgctg ctggtggcgc 10620

ccttcacgga cagcggcagc gtgagccgcg actcgtacct gggctacctg cttaacctgt 10680

accgcgaggc catcggacag gcgcacgtgg acgagcagac ctaccaggag atcacccacg 10740

tgagccgcgc gctgggccag gaggacccgg gcaacctgga ggccaccctg aacttcctgc 10800

tgaccaaccg gtcgcagaag atcccgcccc agtacgcgct gagcaccgag gaggagcgca 10860

tcctgcgcta cgtgcagcag agcgtggggc tgttcctgat gcaggagggg gccacgccca 10920

gcgcggcgct cgacatgacc gcgcgcaaca tggagcccag catgtacgcc cgcaaccgcc 10980

cgttcatcaa taagctgatg gactacttgc atcgggcggc cgccatgaac tcggactact 11040

ttaccaacgc catcttgaac ccgcactggc tcccgccgcc cgggttctac acgggcgagt 11100

acgacatgcc cgaccccaac gacgggttcc tgtgggacga cgtggacagc agcgtgttct 11160

cgccgcgtcc aggaaccaat gccgtgtgga agaaagaggg cggggaccgg cggccgtcct 11220

cggcgctgtc cggtcgcgcg ggtgctgccg cggcggtgcc cgaggccgcc agccccttcc 11280

cgagcctgcc cttttcgctg aacagcgtgc gcagcagcga gctgggtcgg ctgacgcgac 11340

cgcgcctgct gggcgaggag gagtacctga acgactcctt gttgaggccc gagcgcgaga 11400

agaacttccc caataacggg atagagagcc tggtggacaa gatgagccgc tggaagacgt 11460

acgcgcacga gcacagggac gagccccgag ctagcagcgc aggcacccgt agacgccagc 11520

ggcacgacag gcagcgggga ctggtgtggg acgatgagga ttccgccgac gacagcagcg 11580

tgttggactt gggtgggagt ggtggtaacc cgttcgctca cctgcgcccc cgtatcgggc 11640

gcctgatgta agaatctgaa aaaataaaag acggtactca ccaaggccat ggcgaccagc 11700

gtgcgttctt ctctgttgtt tgtagtagta tgatgaggcg cgtgtacccg gagggtcctc 11760

ctccctcgta cgagagcgtg atgcagcagg cggtggcggc ggcgatgcag cccccgctgg 11820

aggcgcctta cgtgcccccg cggtacctgg cgcctacgga ggggcggaac agcattcgtt 11880

actcggagct ggcacccttg tacgatacca cccggttgta cctggtggac aacaagtcgg 11940

cagacatcgc ctcgctgaac taccagaacg accacagcaa cttcctgacc accgtggtgc 12000

agaacaacga tttcaccccc acggaggcca gcacccagac catcaacttt gacgagcgct 12060

cgcggtgggg cggccagctg aaaaccatca tgcacaccaa catgcccaac gtgaacgagt 12120

tcatgtacag caacaagttc aaggcgcggg tgatggtctc gcgcaagacc cccaacgggg 12180

tggatgatga ttatgatggt agtcaggacg agctgaccta cgagtgggtg gagtttgagc 12240

tgcccgaggg caacttctcg gtgaccatga ccatcgatct gatgaacaac gccatcatcg 12300

acaactactt ggcggtgggg cggcagaacg gggtgctgga gagcgacatc ggcgtgaagt 12360

tcgacacgcg caacttccgg ctgggctggg accccgtgac cgagctggtg atgccgggcg 12420

tgtacaccaa cgaggccttc caccccgaca tcgtcctgct gcccggctgc ggcgtggact 12480

tcaccgagag ccgcctcagc aacctgctgg gcatccgcaa gcggcagccc ttccaggagg 12540

gcttccagat cctgtacgag gacctggagg ggggcaacat ccccgcgctc ttggatgtcg 12600

aagcctacga gaaaagcaag gaggatagca ccgccgcggc gaccgcagcc gtggccaccg 12660

cctctaccga ggtgcggggc gataattttg ctagcgctgc ggcagcggcc gaggcggctg 12720

aaaccgaaag taagatagtc atccagccgg tggagaagga cagcaaggac aggagctaca 12780

acgtgctcgc ggacaagaaa aacaccgcct accgcagctg gtacctggcc tacaactacg 12840

gcgaccccga gaagggcgtg cgctcctgga cgctgctcac cacctcggac gtcacctgcg 12900

gcgtggagca agtctactgg tcgctgcccg acatgatgca agacccggtc accttccgct 12960

ccacgcgtca agttagcaac tacccggtgg tgggcgccga gctcctgccc gtctactcca 13020

agagcttctt caacgagcag gccgtctact cgcagcagct gcgcgccttc acctcgctca 13080

cgcacgtctt caaccgcttc cccgagaacc agatcctcgt ccgcccgccc gcgcccacca 13140

ttaccaccgt cagtgaaaac gttcctgctc tcacagatca cgggaccctg ccgctgcgca 13200

gcagtatccg gggagtccag cgcgtgaccg tcactgacgc cagacgccgc acctgcccct 13260

acgtctacaa ggccctgggc gtagtcgcgc cgcgcgtcct ctcgagccgc accttctaaa 13320

aaatgtccat tctcatctcg cccagtaata acaccggttg gggcctgcgc gcgcccagca 13380

agatgtacgg aggcgctcgc caacgctcca cgcaacaccc cgtgcgcgtg cgcgggcact 13440

tccgcgctcc ctggggcgcc ctcaagggcc gcgtgcgctc gcgcaccacc gtcgacgacg 13500

tgatcgacca ggtggtggcc gacgcgcgca actacacgcc cgccgccgcg cccgtctcca 13560

ccgtggacgc cgtcatcgac agcgtggtgg ccgacgcgcg ccggtacgcc cgcaccaaga 13620

gccggcggcg gcgcatcgcc cggcggcacc ggagcacccc cgccatgcgc gcggcgcgag 13680

ccttgctgcg cagggccagg cgcacgggac gcagggccat gctcagggcg gccagacgcg 13740

cggcctccgg cagcagcagc gccggcagga cccgcagacg cgcggccacg gcggcggcgg 13800

cggccatcgc cagcatgtcc cgcccgcggc gcggcaacgt gtactgggtg cgcgacgccg 13860

ccaccggtgt gcgcgtgccc gtgcgcaccc gcccccctcg cacttgaaga tgctgacttc 13920

gcgatgttga tgtgtcccag cggcgaggag gatgtccaag cgcaaataca aggaagagat 13980

gctccaggtc atcgcgcctg agatctacgg ccccgcggcg gcggtgaagg aggaaagaaa 14040

gccccgcaaa ctgaagcggg tcaaaaagga caaaaaggag gaggaagatg acggactggt 14100

ggagtttgtg cgcgagttcg ccccccggcg gcgcgtgcag tggcgcgggc ggaaagtgaa 14160

accggtgctg cggcccggca ccacggtggt cttcacgccc ggcgagcgtt ccggctccgc 14220

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gcgtctgggc gagtttgcgt acggcaagcg cagccgcccc gcgcccttga aagaggaggc 14340

ggtgtccatc ccgctggacc acggcaaccc cacgccgagc ctgaagccgg tgaccctgca 14400

gcaggtgcta ccgagcgcgg cgccgcgccg gggcttcaag cgcgagggcg gcgaggatct 14460

gtacccgacc atgcagctga tggtgcccaa gcgccagaag ctggaggacg tgctggagca 14520

catgaaggtg gaccccgagg tgcagcccga ggtcaaggtg cggcccatca agcaggtggc 14580

cccgggcctg ggcgtgcaga ccgtggacat caagatcccc acggagccca tggaaacgca 14640

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agcaccagct tccaccagca ctcgccgaag acgcaagtac ggcgcggcca gcctgctgat 14760

gcccaactac gcgctgcatc cttccatcat ccccacgccg ggctaccgcg gcacgcgctt 14820

ctaccgcggc tacaccagca gccgccgccg caagaccacc acccgccgcc gtcgtcgcag 14880

ccgccgcagc agcaccgcga cttccgcctt ggtgcggaga gtgtatcgca gcgggcgcga 14940

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tacttgcaga tatggccctc acatgccgcc tccgcgtccc cattacgggc taccgaggaa 15060

gaaagccgcg ccgtagaagg ctgacgggga acgggctgcg tcgccatcac caccggcggc 15120

ggcgcgccat cagcaagcgg ttggggggag gcttcctgcc cgcgctgatc cccatcatcg 15180

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actgagacac aaaaaagcat ggatttgtaa taaaaaaaaa aatggactga cgctcctggt 15300

cctgtgatgt gtgtttttag atggaagaca tcaatttttc gtccctggca ccgcgacacg 15360

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ccttcaattg gagcagtctc tggagcgggc ttaagaattt cgggtccacg ctcaaaacct 15480

atggcaacaa ggcgtggaac agcagcacag ggcaggcgct gagggaaaag ctgaaagaac 15540

agaacttcca gcagaaggtg gttgatggcc tggcctcagg catcaacggg gtggttgacc 15600

tggccaacca ggccgtgcag aaacagatca acagccgcct ggacgcggtc ccgcccgcgg 15660

ggtccgtgga gatgccccag gtggaggagg agctgcctcc cctggacaag cgcggcgaca 15720

agcgaccgcg tcccgacgcg gaggagacgc tgctgacgca cacggacgag ccgcccccgt 15780

acgaggaggc ggtgaaactg ggcctgccca ccacgcggcc cgtggcgcct ctggccaccg 15840

gagtgctgaa acccagcagc agccagcccg cgaccctgga cttgcctccg cctcgcccct 15900

ccacagtggc taagcccctg ccgccggtgg ccgtcgcgtc gcgcgccccc cgaggccgcc 15960

cccaggcgaa ctggcagagc actctgaaca gcatcgtggg tctgggagtg cagagtgtga 16020

agcgccgccg ctgctattaa aagacactgt agcgcttaac ttgcttgtct gtgtgtatat 16080

gtatgtccgc cgaccagaag gaggagtgtg aagaggcgcg tcgccgagtt gcaagatggc 16140

caccccatcg atgctgcccc agtgggcgta catgcacatc gccggacagg acgcttcgga 16200

gtacctgagt ccgggtctgg tgcagttcgc ccgcgccaca gacacctact tcagtctggg 16260

gaacaagttt aggaacccca cggtggcgcc cacgcacgat gtgaccaccg accgcagcca 16320

gcggctgacg ctgcgcttcg tgcccgtgga ccgcgaggac aacacctact cgtacaaagt 16380

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catccgcggc gtgctggacc ggggccctag cttcaaaccc tactctggca ccgcctacaa 16500

cagcctagct cccaagggag ctcccaattc cagccagtgg gagcaagcaa aaacaggcaa 16560

tgggggaact atggaaacac acacatatgg tgtggcccca atgggcggag agaatattac 16620

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cgacaaaaca tttcaaccag aaccgcaagt aggagaagaa aattggcaag aaactgaaaa 16740

cttttatggc ggtagagctc ttaaaaaaga cacaaacatg aaaccttgct atggctccta 16800

tgctagaccc accaatgaaa aaggaggtca agctaaactt aaagttggag atgatggagt 16860

tccaaccaaa gaattcgaca tagacctggc tttctttgat actcccggtg gcaccgtgaa 16920

cggtcaagac gagtataaag cagacattgt catgtatacc gaaaacacgt atttggaaac 16980

tccagacacg catgtggtat acaaaccagg caaggatgat gcaagttctg aaattaacct 17040

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gaatgctgtg gttgatttgc aagacagaaa caccgagctg tcctaccagc tcttgcttga 17220

ctctttgggt gacagaaccc ggtatttcag tatgtggaac caggcggtgg acagttatga 17280

ccccgatgtg cgcatcatcg aaaaccatgg tgtggaggat gaattgccaa actattgctt 17340

ccccttggac ggctctggca ctaacgccgc ataccaaggt gtgaaagtaa aagatggtca 17400

agatggtgat gttgagagtg aatgggaaaa tgacgatact gttgcagctc gaaatcaatt 17460

atgtaaaggt aacattttcg ccatggagat taatctccag gctaacctgt ggagaagttt 17520

cctctactcg aacgtggccc tgtacctgcc cgactcctac aagtacacgc cgaccaacgt 17580

cacgctgccg accaacacca acacctacga ttacatgaat ggcagagtga cacctccctc 17640

gctggtagac gcctacctca acatcggggc gcgctggtcg ctggacccca tggacaacgt 17700

caaccccttc aaccaccacc gcaacgcggg cctgcgctac cgctccatgc tcctgggcaa 17760

cgggcgctac gtgcccttcc acatccaggt gccccaaaag tttttcgcca tcaagagcct 17820

cctgctcctg cccgggtcct acacctacga gtggaacttc cgcaaggacg tcaacatgat 17880

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catcaacctc tacgccacct tcttccccat ggcgcacaac accgcctcca cgctcgaggc 18000

catgctgcgc aacgacacca acgaccagtc cttcaacgac tacctctcgg cggccaacat 18060

gctctacccc atcccggcca acgccaccaa cgtgcccatc tccatcccct cgcgcaactg 18120

ggccgccttc cgcggatggt ccttcacgcg cctgaagacc cgcgagacgc cctcgctcgg 18180

ctccgggttc gacccctact tcgtctactc gggctccatc ccctacctag acggcacctt 18240

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ccactacaac atcggctacc agggcttcta cgtgcccgag ggctacaagg accgcatgta 18480

ctccttcttc cgcaacttcc agcccatgag ccgccaggtc gtggacgagg tcaactacaa 18540

ggactaccag gccgtcaccc tggcctacca gcacaacaac tcgggcttcg tcggctacct 18600

cgcgcccacc atgcgccagg gccagcccta ccccgccaac tacccctacc cgctcatcgg 18660

caagagcgcc gtcgccagcg tcacccagaa aaagttcctc tgcgaccggg tcatgtggcg 18720

catccccttc tccagcaact tcatgtccat gggcgcgctc accgacctcg gccagaacat 18780

gctctacgcc aactccgccc acgcgctaga catgaatttc gaagtcgacc ccatggatga 18840

gtccaccctt ctctatgttg tcttcgaagt cttcgacgtc gtccgagtgc accagcccca 18900

ccgcggcgtc atcgaagccg tctacctgcg cacgcccttc tcggccggca acgccaccac 18960

ctaagccgct cttgcttctt gcaagatgac ggcgggctcc ggcgagcagg agctcagggc 19020

catcctccgc gacctgggct gcgggccctg cttcctgggc accttcgaca agcgcttccc 19080

tggattcatg gccccgcaca agctggcctg cgccatcgtg aacacggccg gccgcgagac 19140

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cgaccccttc gggttctcgg acgagcgcct caagcagatc taccagttcg agtacgaggg 19260

cctgctgcgt cgcagcgccc tggccaccga ggaccgctgc gtcaccctgg aaaagtccac 19320

ccagaccgtg cagggtccgc gctcggccgc ctgcgggctc ttctgctgca tgttcctgca 19380

cgccttcgtg cactggcccg accgccccat ggacaagaac cccaccatga acttactgac 19440

gggggtgccc aacggcatgc tccagtcgcc ccaggtggaa cccaccctgc gccgcaacca 19500

ggaagcgctc taccgcttcc tcaatgccca ctccgcctac tttcgctccc accgcgcgcg 19560

catcgagaag gccaccgcct tcgaccgcat gaatcaagac atgtaaaaaa ccggtgtgtg 19620

tatgtgaatg ctttattcat aataaacagc acatgtttat gccaccttct ctgaggctct 19680

gactttattt agaaatcgaa ggggttctgc cggctctcgg catggcccgc gggcagggat 19740

acgttgcgga actggtactt gggcagccac ttgaactcgg ggatcagcag cttgggcacg 19800

gggaggtcgg ggaacgagtc gctccacagc ttgcgcgtga gttgcagggc gcccagcagg 19860

tcgggcgcgg agatcttgaa atcgcagttg ggacccgcgt tctgcgcgcg agagttgcgg 19920

tacacggggt tgcagcactg gaacaccatc agggccgggt gcttcacgct tgccagcacc 19980

gtcgcgtcgg tgatgccctc cacgtccaga tcctcggcgt tggccatccc gaagggggtc 20040

atcttgcagg tctgccgccc catgctgggc acgcagccgg gcttgtggtt gcaatcgcag 20100

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atgaaagcct ccagctggcg gaaggcctgc tgcgccttgc cgccctcggt gaagaagacc 20220

ccgcaggact tgctagagaa ctggttggtg gcgcagccgg cgtcgtgcac gcagcagcgc 20280

gcgtcgttgt tggccagctg caccacgctg cgcccccagc ggttctgggt gatcttggcc 20340

cggttggggt tctccttcag cgcgcgctgc ccgttctcgc tcgccacatc catctcgata 20400

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gtgcagccgt gcagccacag cgcgcagccg gtgcactccc agttcttgtg ggcgatctgg 20520

gagtgcgagt gcacgaagcc ctgcaggaag cggcccatca tcgcggtcag ggtcttgttg 20580

ctggtgaagg tcagcgggat gccgcggtgc tcctcgttca catacaggtg gcagatgcgg 20640

cggtacacct cgccctgctc gggcatcagc tggaaggcgg acttcaggtc gctctccacg 20700

cggtaccggt ccatcagcag cgtcatcact tccatgccct tctcccaggc cgaaacgatc 20760

ggcaggctca gggggttctt caccgccatt gtcatcttag tcgccgccgc cgaggtcagg 20820

gggtcgttct cgtccagggt ctcaaacact cgcttgccgt ccttctcgat gatgcgcacg 20880

gggggaaagc tgaagcccac ggccgccagc tcctcctcgg cctgcctttc gtcctcgctg 20940

tcctggctga tgtcttgcaa aggcacatgc ttggtcttgc ggggtttctt tttgggcggc 21000

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ggcgacgggc tctcgcggtt cggcgggcgg ctggcagagc cccttccgcg ttcgggggtg 21180

cgctcctggc ggcgctgctc tgactgactt cctccgcggc cggccattgt gttctcctag 21240

ggagcaacaa caagcatgga gactcagcca tcgtcgccaa catcgccatc tgcccccgcc 21300

gccaccgccg acgagaacca gcagcagaat gaaagcttaa ccgccccgcc gcccagcccc 21360

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gagaaccacc aagagcagcc agagcaggaa gcagagaacg agcagaacca ggctgggcac 21540

gagcatggcg actacctgag cggggcagag gacgtgctca tcaagcatct ggcccgccaa 21600

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gcgaacgctc tgcaaggaag cggagaggag catgagcacc acagcgccct ggtggagttg 22020

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tacccggcgc tcaacctgcc ccccaaggtc atgagcgccg tcatggacca ggtgctcatc 22140

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cgtaccaccg cctcggacct ggccgacctc atcttccccg agcgcctgcg gctgacgctg 22740

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ctcgaacgct ccgggatcct gcccgccacc tgctccgcgc tgccctcgga cttcgtgccg 22860

ctgaccttcc gcgagtgccc cccgccgctc tggagccact gctacttgct gcgcctggcc 22920

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cagaaatccc gccaagaatt tctgctgaaa aagggccacg gggtctactt ggacccccag 23340

accggagagg agctcaaccc cagcttcccc caggatgccc cgaggaagca gcaagaagct 23400

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gtcctcggcg gagaaagcaa gcagcacgga taccatctcc gctccgggtc ggggtcgcgg 23640

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cggtaagaag gagcggcagg gatacaagtc ctggcggggg cacaaaaacg ccatcgtctc 23760

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tgcaacatat attggaaatg gcttagacta tggatcttat gatagtgatg gaaaaacaag 26640

acccgtaatt accaaaattg gagcaggatt aaattttgat gctaacaaag caatagctgt 26700

caaactaggc acaggtttaa gttttgactc cgctggtgcc ttgacagctg gaaacaaaca 26760

ggatgacaag ctaacacttt ggactacccc tgacccaagc cctaattgtc aattactttc 26820

agacagagat gccaaattta ctctctgtct tacaaaatgc ggtagtcaaa tactaggcac 26880

tgtggcagtg gcggctgtta ctgtaggatc agcactaaat ccaattaatg acacagtcaa 26940

aagcgccata gttttcctta gatttgattc cgatggtgta ctcatgtcaa actcatcaat 27000

ggtaggtgat tactggaact ttagggaggg acagaccact caaagtgtag cctatacaaa 27060

tgctgtggga ttcatgccaa atataggtgc atatccaaaa acccaaagta aaacacctaa 27120

aaatagcata gtcagtcagg tatatttaac tggagaaact actatgccaa tgacactaac 27180

cataactttc aatggcactg atgaaaaaga cacaacccca gttagcacct actctatgac 27240

ttttacatgg cagtggactg gagactataa ggacaaaaat attacctttg ctaccaactc 27300

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accacctttg tctatatgga aactctgaaa cagaaaaata aagttcaagt gttttattga 27420

atcaacagtt ttacaggact cgagcagtta tttttcctcc accctcccag gacatggaat 27480

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caccacaata ttgttcaaaa tcccacagtg caaggcgctg tatccaaagc tcatggcggg 28200

gaccacagaa cccacgtggc catcatacca caagcgcagg tagattaagt ggcgacccct 28260

cataaacacg ctggacataa acattacctc ttttggcatg ttgtaattca ccacctcccg 28320

gtaccatata aacctctgat taaacatggc gccatccacc accatcctaa accagctggc 28380

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caggcacacg tgcatacact tcctcaggat tacaagctcc tcccgcgtta gaaccatatc 28560

ccagggaaca acccattcct gaatcagcgt aaatcccaca ctgcagggaa gacctcgcac 28620

gtaactcacg ttgtgcattg tcaaagtgtt acattcgggc agcagcggat gatcctccag 28680

tatggtagcg cgggtttctg tctcaaaagg aggtagacga tccctactgt acggagtgcg 28740

ccgagacaac cgagatcgtg ttggtcgtag tgtcatgcca aatggaacgc cggacgtagt 28800

catattttcg tacttgctgt agcagaacct ggtccgggcg ctgcacaccg atcgccggcg 28860

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tcctccctca gcaataactg taagtactct ttcatatcgt ctccgaaatt tttagccata 29580

ggacccccag gaataagaga agggcaagcc acattacaga taaaccgaag tcccccccag 29640

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gcgaccctcg taaaaattgt cgctatgatt gaaaaccatc acagagagac gttcccggtg 30000

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atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 31260

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gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 31380

gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 31440

gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 31500

ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 31560

tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 31620

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cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 31740

catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 31800

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atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 32220

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ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 32400

actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 32460

gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 32520

ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 32580

gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 32640

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cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 32940

ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc 33000

gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg 33060

agcgaggaag cggaaga 33077

<210> 13

<211> 720

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

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aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

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ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 14

<211> 2001

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgtgggagtg catactatat gtacttggac agaaacgatg ctggggaggc catatctttt 60

ccaaccacat tggggatgaa taagtgttat atacagatca tggatcttgg acacatgtgt 120

gatgccacca tgagctatga atgccctatg ctggatgagg gggtggaacc agatgacgtc 180

gattgttggt gcaacacgac gtcaacttgg gttgtgtacg gaacctgcca tcacaaaaaa 240

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gaaaattgga tattcaggaa ccctggcttc gcgttagcag cagctgccat cgcttggctt 420

ttgggaagct caacgagcca aaaagtcata tacttggtca tgatactgct gattgccccg 480

gcatacagca tcaggtgcat aggagtcagc aatagggact ttgtggaagg tatgtcaggt 540

gggacttggg ttgatgttgt cttggaacat ggaggttgtg tcaccgtaat ggcacaggac 600

aaaccgactg tcgacataga gctggttaca acaacagtca gcaacatggc ggaggtaaga 660

tcctactgct atgaggcatc aatatcggac atggcttcgg acagccgctg cccaacacaa 720

ggtgaagcct accttgacaa gcaatcagac actcaatatg tctgcaaaag aacgttagtg 780

gacagaggct ggggaaatgg atgtggactt tttggcaaag ggagcctggt gacatgcgct 840

aagtttgcat gctccaagaa aatgaccggg aagagcatcc agccagagaa tctggagtac 900

cggataatgc tgtcagttca tggctcccag cacagtggga tgatcgttaa tgacacagga 960

catgaaactg atgagaatag agcgaaggtt gagataacgc ccaattcacc aagagccgaa 1020

gccaccctgg ggggttttgg aagcctagga cttgattgtg aaccgaggac aggccttgac 1080

ttttcagatt tgtattactt gactatgaat aacaagcact ggttggttca caaggagtgg 1140

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aacaaagaag cactggtaga gttcaaggac gcacatgcca aaaggcaaac tgtcgtggtt 1260

ctagggagtc aagaaggagc agttcacacg gcccttgctg gagctctgga ggctgagatg 1320

gatggtgcaa agggaaggct gtcctctggc cacttgaaat gtcgcctgaa aatggataaa 1380

cttagattga agggcgtgtc atactccttg tgtaccgcag cgttcacatt caccaagatc 1440

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ctgataaccg ctaaccccgt aatcactgaa agcactgaga actccaagat gatgctggaa 1620

cttgatccac catttgggga ctcttacatt gtcataggag tcggggagaa gaagatcacc 1680

caccactggc acaggagtgg cagcaccatt ggaaaagcat ttgaagccac tgtgagaggt 1740

gccaggagaa tggcagtctt gggagacaca gcctgggact ttggatcagt tggaggcgct 1800

ctcaactcat tgggcaaggg catccatcaa atttttggag cagctttcaa atcattgttt 1860

ggaggaatgt cctggttctc acaaattctc attggaacgt tgctgatgtg gttgggtctg 1920

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ttatccacag ccgtctctgc t 2001

<210> 15

<211> 2531

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gctctctagt caagaggcca ctcttgagtg ccagcgagta gagttttctc ctccgcgccg 60

cgagtcagat ctacactttg aaagatgagg cacctgagag acctgcccgg taatgttttc 120

ctggctactg ggaacgagat tctggaattg gtggtggacg ccatgatggg tgacgaccct 180

ccagagcccc ctaccccatt tgaggcgcct tcgctgtacg atttgtatga tctggaggtg 240

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ctgctggctg ccgagcaggc taatacggac tctggctcag acagcgattc ctctctccat 360

accccgagac ccggcagagg tgagaaaaag atccccgagc ttaaagggga agagctcgac 420

ctgcgctgct atgaggaatg cttgcctccg agcgatgatg aggaggacga ggaggcgatt 480

cgagctgcgg tgaaccaggg agtgaaaact gcgggcgaga gctttagcct ggactgtcct 540

actctgcccg gacacggctg taagtcttgt gaatttcatc gcatgaatac tggagataag 600

aatgtgatgt gtgccctgtg ctatatgaga gcttacaacc attgtgttta cagtaagtgt 660

gattaacttt agttgggaag gcagagggtg actgggtgct gactggttta tttatgtata 720

tgttttttta tgtgtaggtc ccgtctctga cgtagatgag acccccactt cagagtgcat 780

ttcatcaccc ccagaaattg gcgaggaacc gcccgaagat attattcata gaccagttgc 840

agtgagagtc accgggcgga gagcagctgt ggagagtttg gatgacttgc tacagggtgg 900

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tgtttactta aggtgatgtc agtatttata gggtgtggag tgcaataaaa tccgtgttga 1020

ctttaagtgc gtgttttatg actcaggggt ggggactgtg ggtatataag caggtgcaga 1080

cctgtgtggt cagttcagag caggactcat ggagatctgg actgtcttgg aagactttca 1140

ccagactaga cagttgctag agaactcatc ggagggagtc tcttacctgt ggagattctg 1200

cttcggtggg cctctagcta agctagtcta tagggccaaa caggattata aggaacaatt 1260

tgaggatatt ttgagagagt gtcctggtat ttttgactct ctcaacttgg gccatcagtc 1320

tcactttaac cagagtattc tgagagccct tgacttttct actcctggca gaactaccgc 1380

cgcggtagcc ttttttgcct ttattcttga caaatggagt caagaaaccc atttcagcag 1440

ggattaccgt ctggactgct tagcagtagc tttgtggaga acatggaggt gccagcgcct 1500

gaatgcaatc tccggctact tgccagtaca gccggtagac acgctgagga tcctgagtct 1560

ccagtcaccc caggaacacc aacgccgcca gcagccgcag caggagcagc agcaagagga 1620

ggaccgagaa gagaacccga gagccggtct ggaccctccg gtggcggagg aggaggagta 1680

gctgacttgt ttcccgagct gcgccgggtg ctgactaggt cttccagtgg acgggagagg 1740

gggattaagc gggagaggca tgaggagact agccacagaa ctgaactgac tgtcagtctg 1800

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gaggtctcgg tgatgcatga gaaatattcc ctagaacaag tcaagacttg ttggttggag 1920

cccgaggatg attgggaggt agccatcagg aattatgcca agctggctct gaagccagac 1980

aagaagtaca agattaccaa actgattaat atcagaaatt cctgctacat ttcagggaat 2040

ggggccgagg tggagatcag tacccaggag agggtggcct tcagatgttg tatgatgaat 2100

atgtacccgg gggtggtggg catggaggga gtcaccttta tgaacacgag gttcaggggt 2160

gatgggtata atggggtggt ctttatggcc aacaccaagc tgacagtgca cggatgctcc 2220

ttctttggct tcaataacat gtgcatcgag gcctggggca gtgtttcagt gaggggatgc 2280

agcttttcag ccaactggat gggggtcgtg ggcagaacca agagcaaggt gtcagtgaag 2340

aaatgcctgt tcgagaggtg ccacctgggg gtgatgagcg agggcgaagc caaagtcaaa 2400

cactgcgcct ctaccgagac gggctgcttt gtgctgatca agggcaatgc ccaagtcaag 2460

cataacatga tctgtggggc ctcggatgag cgcggctacc agatgctgac ctgcgccggt 2520

gggaacagcc a 2531

<210> 16

<211> 4015

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

cgctaggcct agttgcgggt gggcttttgg ttctctgcta cctatacctc ccttgctgtt 60

cgtacttagt ggtgctgtgt tgctggttta agaaatgggg aagatcaccc tagtgagctg 120

cggtgcgctg gtggcggtgt tgctttcgat tgtgggactg ggcggcgcgg ctgtagtgaa 180

ggagaaggcc gatccctgct tgcatttcaa tcccaacaaa tgccagctga gttttcagcc 240

cgatggcaat cggtgcgcgg tactgatcaa gtgcggatgg gaatgcgaga acgtgagaat 300

cgagtacaat aacaagactc ggaacaatac tctcgcgtcc gtgtggcagc ccggggaccc 360

cgagtggtac accgtctctg tccccggtgc tgacggctcc ccgcgcaccg tgaataatac 420

tttcattttt gcgcacatgt gcaacacggt catgtggatg agcaagcagt acgatatgtg 480

gccccccacg aaggagaaca tcgtggtctt ctccatcgct tacagcctgt gcacggcgct 540

aatcaccgct atcgtgtgcc tgagcattca catgctcatc gctattcgcc ccagaaataa 600

tgccgagaaa gagaaacagc cataacacgt tttttcacac accttgtttt tacagacaat 660

gcgtctgtta aattttttaa acattgtgct cagtattgct tatgcctctg gttatgcaaa 720

catacagaaa accctttatg taggatctga tggtacacta gagggtaccc aatcacaagc 780

caaggttgca tggtattttt atagaaccaa cactgatcca gttaaacttt gtaagggtga 840

attgccgcgt acacataaaa ctccacttac atttagttgc agcaataata atcttacact 900

tttttcaatt acaaaacaat atactggtac ttattacagt acaaactttc atacaggaca 960

agataaatat tatactgtta aggtagaaaa tcctaccact cctagaacta ccaccaccac 1020

cactactgca aagcccactg tgaaaactac aactaggacc accacaacta cagaaaccac 1080

caccagcaca acacttgctg caactacaca cacacacact aagctaacct tacagaccac 1140

taatgatttg atcgccctgc tgcaaaaggg ggataacagc accacttcca atgaggagat 1200

acccaaatcc atgattggca ttattgttgc tgtagtggtg tgcatgttga tcatcgcctt 1260

gtgcatggtg tactatgcct tctgctacag aaagcacaga ctgaacgaca agctggaaca 1320

cttactaagt gttgaatttt aattttttag aaccatgaag atcctaggcc tttttagttt 1380

ttctatcatt acctctgctc tttgtgaatc agtggataga gatgttacta ttaccactgg 1440

ttctaattat acactgaaag ggccaccctc aggtatgctt tcgtggtatt gctattttgg 1500

aactgacact gatcaaactg aattatgcaa ttttcaaaaa ggcaaaacct caaactctaa 1560

aatctctaat tatcaatgca atggcactga tctgatacta ctcaatgtca cgaaagcata 1620

tggtggcagt tattattgcc ctggacaaaa cactgaagaa atgatttttt acaaagtgga 1680

agtggttgat cccactacac cacccaccac cacaactatt cataccacac acacagaaca 1740

aacaccagag gcaacagaag cagagttggc cttccaggtt cacggagatt cctttgctgt 1800

caatacccct acacccgatc agcggtgtcc ggggccgcta gtcagcggca ttgtcggtgt 1860

gctttcggga ttagcagtca taatcatctg catgttcatt tttgcttgct gctatagaag 1920

gctttaccga caaaaatcag acccactgct gaacctctat gtttaatttt ttccagagcc 1980

atgaaggcag ttagcgctct agttttttgt tctttgattg gcattgtttt taatagtaaa 2040

attaccagag ttagctttat taaacatgtt aatgtaactg aaggagataa catcacacta 2100

gcaggtgtag aaggtgctca aaacaccacc tggacaaaat accatctagg atggagagat 2160

atttgcacct ggaatgtaac ttattattgc ataggagtta atcttaccat tgttaacgct 2220

aaccaatctc agaatgggtt aattaaagga cagagtgtta gtgtgaccag tgatgggtac 2280

tatacccagc atagttttaa ctacaacatt actgtcatac cactgcctac gcctagccca 2340

cctagcacta ccacacagac aaccacatac agtacatcaa atcagcctac caccactaca 2400

gcagcagagg ttgccagctc gtctggggtc cgagtggcat ttttgatgtt ggccccatct 2460

agcagtccca ctgctagtac caatgagcag actactgaat ttttgtccac tgtcgagagc 2520

cacaccacag ctacctccag tgccttctct agcaccgcca atctctcctc gctttcctct 2580

acaccaatca gccccgctac tactcctagc cccgctcctc ttcccactcc cctgaagcaa 2640

acagacggcg gcatgcaatg gcagatcacc ctgctcattg tgatcgggtt ggtcatcctg 2700

gccgtgttgc tctactacat cttctgccgc cgcattccca acgcgcaccg caagccggcc 2760

tacaagccca tcgttatcgg gcagccggag ccgcttcagg tggaaggggg tctaaggaat 2820

cttctcttct cttttacagt atggtgattg aactatgatt cctagacaat tcttgatcac 2880

tattcttatc tgcctcctcc aagtctgtgc caccctcgct ctggtggcca acgccagtcc 2940

agactgtatt gggcccttcg cctcctacgt gctctttgcc ttcgtcacct gcatctgctg 3000

ctgtagcata gtctgcctgc ttatcacctt cttccagttc attgactgga tctttgtgcg 3060

catcgcctac ctgcgccacc acccccagta ccgcgaccag cgagtggcgc agctgctcag 3120

gctcctctga taagcatgcg ggctctgcta cttctcgcgc ttctgctgtt agtgctcccc 3180

cgtcccgtcg acccccggtc ccccactcag tcccccgagg aggttcgcaa atgcaaattc 3240

caagaaccct ggaaattcct caaatgctac cgccaaaaat cagacatgca tcccagctgg 3300

atcatgatca ttgggatcgt gaacattctg gcctgcaccc tcatctcctt tgtgatttac 3360

ccctgctttg actttggttg gaactcgcca gaggcgctct atctcccgcc tgaacctgac 3420

acaccaccac agcagcaacc tcaggcacac gcactaccac caccacagcc taggccacaa 3480

tacatgccca tattagacta tgaggccgag ccacagcgac ccatgctccc cgctattagt 3540

tacttcaatc taaccggcgg agatgactga cccactggcc aataacaacg tcaacgacct 3600

tctcctggac atggacggcc gcgcctcgga gcagcgactc gcccaacttc gcattcgtca 3660

gcagcaggag agagccgtca aggagctgca ggacggcata gccatccacc agtgcaagag 3720

aggcatcttc tgcctggtga aacaggccaa gatctcctac gaggtcaccc agaccgacca 3780

tcgcctctcc tacgagctcc tgcagcagcg ccagaagttc acctgcctgg tcggagtcaa 3840

ccccatcgtc atcacccagc agtcgggcga taccaagggg tgcatccact gctcctgcga 3900

ctcccccgac tgcgtccaca ctctgatcaa gaccctctgc ggcctccgcg acctcctccc 3960

catgaactaa tcaccccctt atccagtgaa ataaagatca tattgatgat gattt 4015

<210> 17

<211> 885

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

ctacatgggg gtagagtcat aatcgtgcat caggataggg cggtggtgct gcagcagcgc 60

gcgaataaac tgctgccgcc gccgctccgt cctgcaggaa tacaacatgg cagtggtctc 120

ctcagcgatg attcgcaccg cccgcagcat aaggcgcctt gtcctccggg cacagcagcg 180

caccctgatc tcacttaaat cagcacagta actgcagcac agcaccacaa tattgttcaa 240

aatcccacag tgcaaggcgc tgtatccaaa gctcatggcg gggaccacag aacccacgtg 300

gccatcatac cacaagcgca ggtagattaa gtggcgaccc ctcataaaca cgctggacat 360

aaacattacc tcttttggca tgttgtaatt caccacctcc cggtaccata taaacctctg 420

attaaacatg gcgccatcca ccaccatcct aaaccagctg gccaaaacct gcccgccggc 480

tatacactgc agggaaccgg gactggaaca atgacagtgg agagcccagg actcgtaacc 540

atggatcatc atgctcgtca tgatatcaat gttggcacaa cacaggcaca cgtgcataca 600

cttcctcagg attacaagct cctcccgcgt tagaaccata tcccagggaa caacccattc 660

ctgaatcagc gtaaatccca cactgcaggg aagacctcgc acgtaactca cgttgtgcat 720

tgtcaaagtg ttacattcgg gcagcagcgg atgatcctcc agtatggtag cgcgggtttc 780

tgtctcaaaa ggaggtagac gatccctact gtacggagtg cgccgagaca accgagatcg 840

tgttggtcgt agtgtcatgc caaatggaac gccggacgta gtcat 885

<210> 18

<211> 906

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ttatctggaa gaagcagaag agcggcggtg ggaatcatag tccgcgaacg ggatcggccg 60

gtggtgtcgc atcaggcccc gcagcagtcg ctgccgccgc cgctccgtca agctgctgct 120

cagggggttc gggtccaggg actccctcag catgatgccc acggccctca gcatcagtcg 180

tctggtgcgg cgggcgcagc agcgcatgcg aatctcgctc aggtcactgc agtacgtgca 240

acacaggacc accaggttgt tcaacagtcc atagttcaac acgctccagc cgaaactcat 300

cgcgggaagg atgctaccca cgtggccgtc gtaccagatc ctcaggtaaa tcaagtggcg 360

ctccctccag aagacgctgc ccatgtacat gatctccttg ggcatgtggc ggttcaccac 420

ctcccggtac cacatcaccc tctggttgaa catgcagccc cggatgatcc tgcggaacca 480

cagggccagc accgccccgc ccgccatgca gcgaagagac cccggatccc ggcaatgaca 540

atggaggacc caccgctcgt acccgtggat catctgggag ctgaacaagt ctatgttggc 600

acagcacagg catatgctca tgcatctctt cagcactctc agctcctcgg gggtcaaaac 660

catatcccag ggcacgggga actcttgcag gacagcgaac cccgcagaac agggcaatcc 720

tcgcacataa cttacattgt gcatggacag ggtatcgcaa tcaggcagca ccgggtgatc 780

ctccaccaga gaagcgcggg tctcggtctc ctcacagcgt ggtaaggggg ccggccgata 840

cgggtgatgg cgggacgcgg ctgatcgtgt tctcgaccgt gtcatgatgc agttgctttc 900

ggacat 906

Claims (10)

1.一种制备重组腺病毒表达载体的方法，其特征在于，所述方法包括：

以野生型腺病毒AdC6的基因组为基础，通过基因组直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I-Ceu I和PI-Sce I酶切位点，同时以人血清型腺病毒Ad5的E4ORF6替换AdC6的E4 ORF6，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的删除E1编码区是指删除野生型腺病毒AdC6的基因组中第492-3022位的碱基序列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的删除E3编码区是指删除野生型腺病毒AdC6的基因组中第27895-31909位的碱基序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的AdC6的E4 ORF6是指野生型腺病毒AdC6的基因组中第33841-34746位的碱基序列。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的Ad5的E4 ORF6是指人血清型腺病毒Ad5基因组中第33193-34077位的碱基序列。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述克隆方法包括：

（1）PCR扩增AdC6腺病毒基因组的LITR片段，用PmeI和BstAPI分别双酶切pNEB193质粒和PCR产物，连接获得质粒pNEB193-PB；

（2）用SnaBI和NdeI分别双酶切PUC57-linker和pNEB193-PB质粒，连接获得质粒PNEB193-PB +linker；

（3）用NdeI和MluI双酶切AdC6的基因组，将切下的目的片段插入到PNEB193-PB +linker质粒的NdeI和MluI位点中，获得质粒PNEB193-PB +linker+NM;

（4）PCR分别扩增AdC6腺病毒基因组从30137位至33841位和从34746位至36604位DNA片段，同时PCR扩增Ad5基因组从33193位至34077位DNA片段；通过Overlapping PCR扩增连接上述获得的三段片段，通过EcoRI和PacI酶切位点，连接于PNEB193载体，获得质粒PNEB193-EP-Ad5-ORF6；

（5）用XbaI和PacI双酶切AdC6的基因组，将切下的目的片段插入到PNEB193载体，获得质粒PNEB193-XP;

(6)PCR扩增AdC6基因组从24045位至27110位DNA片段，通过EcoRV和PacI酶切位点，连接于质粒PNEB193-XP，获得质粒PNEB193-XP-DE3；

(7) 用XbaI和PacI分别双酶切质粒PNEB193-XP-DE3和PNEB193-EP-Ad5-ORF6，获得质粒PNEB193-EX-Ad5-ORF6；

（8）用PmeI和MluI分别双酶切质粒PNEB193-PB+linker+NM和PNEB193-EX-Ad5-ORF6，连接之后，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。

7.一种重组腺病毒表达载体，其特征在于，其由权利要求1-6任一项所述方法制备得到。

8.如权利要求7所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述重组腺病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示。

9.如权利要求7所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述重组腺病毒表达载体的酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I之间，还包括外源的抗原基因。

10.一种制备疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）提供权利要求7所述的重组腺病毒表达载体；

（2）将外源的抗原编码基因插入到（1）表达载体的酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I之间；

（3）将（2）的重组表达载体感染病毒包装细胞，病毒在细胞内包装，从而获得具有免疫原性的疫苗。