CN104846013A - 一种复制缺陷型人55型腺病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种复制缺陷型人55型腺病毒载体及其制备方法和应用。所述的复制缺陷型人55型腺病毒载体由如下方法制备得到：通过敲除Ad55的E1、E3基因，再将Ad55基因组中的E4基因开放阅读框6或开放阅读框2、3、4、6、6/7改换为Ad5基因组的相应阅读框，此外还在Ad55的E1基因区域整合外源基因表达框。所述的载体能够在293、PerC6等辅助细胞株中大量生产，并可以密度梯度离心浓缩纯化；在正常人体细胞不具备复制能力因此具备减毒表型；此外，该载体还可在靶细胞内高效表达外源基因。本发明所述载体可作为疫苗或基因治疗载体，还可应用于药物及中和抗体的研发，以及报告示踪系统。

Description

一种复制缺陷型人55型腺病毒载体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种复制缺陷型人55型腺病毒载体及其制备方法和应用。
背景技术
腺病毒(Adenovirus，Ad)是双链DNA病毒，其基因组长度约35-40kb。已知人腺病毒分为7个亚群(A～G)，包括60多个血清型，其中B亚群中的3、4、7、14型腺病毒感染后可引起急性呼吸道疾病甚至致死性肺炎。近年来，出现了由11、14型腺病毒重组产生的55型腺病毒(以下简称Ad55)，已导致一系列社区获得性肺炎疫情甚至死亡病例。但是，尚无抗Ad55感染的特效药物及疫苗，临床上只能采取支持性治疗。因此，研发抗Ad55的疫苗及药物，对于控制Ad55在广大人群尤其是入伍新兵、青少年学生等人群中的传播至关重要。
目前，抗腺病毒感染的疫苗仅在美国军队获得使用。该疫苗为野生型Ad4、Ad7在人胚肾二倍体成纤维细胞上传代，经冷冻脱水、混和纤维素乳糖等制成的肠溶型胶囊，为口服活病毒疫苗。该疫苗的使用有效遏制了美军腺病毒感染疫情的爆发。但是，美军使用的腺病毒疫苗尚存在极大的缺陷，一方面，该疫苗主要预防Ad4、Ad7的感染，而对致病力极强的Ad14、Ad55等无确切的预防效果；另一方面，该疫苗主要成分为野生型腺病毒，安全性较差，残余活病毒从肠道排出后极易污染水源，造成病毒的扩散，因而不能应用于普通人群。因此，研制安全性高并能预防Ad55等强毒株的复制缺陷型腺病毒疫苗是迫在眉睫的需求。
已有研究显示，腺病毒E1基因是其复制增殖的必需基因，E3基因则可以对抗宿主的免疫系统。敲除E1、E3基因后，腺病毒在正常人体内丧失复制能力，具有减毒表型，而其主要的表面抗原如Hexon、Fibre等则不受影响。因此，采用复制缺陷的腺病毒作为疫苗可有效提升其安全性，扩大其使用范围。复制缺陷型腺病毒可在互补细胞株，如表达Ad5E1基因的293细胞、PerC6细胞中生产。但是，很多腺病毒尤其是B亚群腺病毒，敲除E1、E3基因后在这些生产细胞株中难以获得有效产量，主要原因是Ad5E1B 55K不能与B亚型腺病毒E4Orf6相互作用，不能有效抑制宿主细胞mRNA的出核并提升病毒晚期蛋白的表达。
复制缺陷型Ad55还可作为基因载体在基因治疗、疫苗等领域获得广泛应用。腺病毒载体在这些领域具有一系列优势，如良好的安全性、基因转导的有效性以及方便的大规模生产能力等。基于这些优势，全球范围内已有数百项临床试验以腺病毒作为基因载体，居各类载体之首(24.8％)。这些研究大部分采用Ad5或Ad2作为载体。然而，多数人体内由于既往腺病毒感染而产生的抗腺病毒免疫反应限制了传统腺病毒载体的应用。研究表明非洲、南美及我国等发展中国家和地区的人群中Ad2、Ad5中和抗体阳性率很高，甚至超过90％。这些中和抗体会抑制腺病毒载体进入机体细胞，使其难以行使免疫或治疗功能。为克服预存抗腺病毒免疫反应，研究者已开发一系列技术如：1)采用免疫抑制剂如环孢霉素、环磷酰胺、FK506等抑制抗腺病毒免疫反应；2)修饰或改造腺病毒载体表面蛋白，绕开预存中和抗体；3)我们此前开发的以腺病毒体外感染PBMC然后自体回输的AVIP技术；等等。但是这些策略或者具有相当高的毒副作用(如免疫抑制剂)，或者仅能使用一次即因产生针对新载体的免疫反应而不能继续重复使用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术的上述问题，提供一种复制缺陷型人55型腺病毒载体。
本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以解决：
一种复制缺陷型人55型腺病毒载体，由如下方法制备得到：通过敲除Ad55的E1、E3基因，再将Ad55基因组中的E4基因开放阅读框6或开放阅读框2、3、4、6、6/7改换为Ad5基因组的相应阅读框。
优选地，所述的复制缺陷型人55型腺病毒载体，还在Ad55的E1基因区域整合外源基因表达框。
一种复制缺陷型人55型腺病毒载体的制备方法，包含如下步骤：
S1.PCR扩增Ad55E1区同源重组臂并反向连接至卡那霉素抗性载体，线性化后与经部分酶切线性化的pAd55ΔE3同源重组，得到基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3-Kana；
S2.PCR扩增Ad55E1区同源重组臂并同向连接至卡那霉素抗性载体，线性化后与线性化的pAd55ΔE1ΔE3-Kana同源重组，得到基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3；
S3.PCR扩增Ad5E4Orf2-6、Ad55E4基因，以Ad5E4Orf2-6取代Ad55E4基因中相应区域得到p55E4(5E4)，线性化后与线性化的pAd55ΔE1ΔE3同源重组，得到基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3(5E4)；
S4.PCR扩增Ad5E4Orf6，以其取代步骤S3.所述Ad55E4基因的相应区域得到p55E4(5Orf6)，线性化后与线性化的pAd55ΔE1ΔE3同源重组，得到基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)。
优选地，步骤S1.的具体方法为：
以Ad55基因组为模板，PCR扩增得到E1基因同源重组臂L-delE1及R-delE1，酶切后连接至pVax载体得到pVax-delE1(L+R)，线性化后，与经部分酶切线性化的pAd55ΔE3同源重组，经氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选得到敲除E1、E3基因并引入唯一酶切位点PmeI的基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3-Kana。
最优选地，在其中一个实施例中，步骤S1.的具体方法为：
以Ad55基因组为模板，PCR得到E1基因上下游重组臂L-delE1及R-delE1，L-delE1以SpeI+EcoRI双酶切后连接至同样酶切的pVax载体得到pVax-L-delE1；R-delE1以EcoRI+XbaI双酶切后连接至同样酶切的pVax-L-delE1得到敲除E1基因的穿梭质粒pVax-delE1(L+R)；
pVax-delE1(L+R)以EcoRI线性化，pAd55ΔE3以PacI部分酶切线性化，两者同源重组并经双抗性筛选得到基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3-Kana。
优选地，步骤S2.的具体方法为：
以Ad55基因组为模板，PCR扩增得到E1基因同源重组臂L-delK(E1)及R-delK(E1)，酶切后连接至pVax载体得到pVax-delK(E1)，线性化后与线性化的pAd55ΔE1ΔE3-Kana同源重组，得到去除E1、E3、卡那霉素基因并引入唯一酶切位点PmeI的基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3。
最优选地，在其中一个实施例中，步骤S2.的具体方法为：
以Ad55基因组为模板，PCR得到E1基因上下游重组臂L-delK及R-delK，L-delK以SpeI+EcoRI双酶切后连接至同样酶切的pVax载体得到pVax-L-delK(E1)；R-delK以EcoRI+XbaI双酶切后连接至同样酶切的pVax-L-delK(E1)得到敲除卡那霉素抗性基因的穿梭质粒pVax-delK(E1)；
pVax-delK(E1)以SpeI+XbaI双酶切线性化，pAd55ΔE1ΔE3-Kana以PmeI线性化，两者同源重组得到去除卡那霉素抗性基因并在原E1区引入唯一酶切位点PmeI的基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3。
优选地，步骤S3.的具体方法为：
分别以Ad5、Ad55基因组为模板，PCR扩增得到Ad5E4Orf2-6以及Ad55E4，将Ad55E4连接至T载体得到p55E4，进一步以p55E4为模板PCR去除Ad55E4Orf2-6，然后与Ad5E4Orf2-6连接得到p55E4(5E4)，线性化后与线性化的pAd55ΔE1ΔE3同源重组，得到pAd55ΔE1ΔE3(5E4)。
最优选地，在其中一个实施例中，步骤S3.的具体方法为：
以Ad5、Ad55基因组为模板，PCR扩增得到Ad5E4Orf2-6、Ad55E4基因，分别连接至T载体得到p5Orf2-6、p55E4；以p55E4为模板，PCR去除Ad55的E4Orf2-6并引入SapI位点，两者经SapI酶切、连接得到p55E4(5E4)；
p55E4(5E4)以PmeI+MluI双酶切，pAd55ΔE1ΔE3以PsiI酶切，重组得到已将Ad55E4Orf2-6置换为Ad5E4Orf2-6的基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3(5E4)。
优选地，步骤S4.的具体方法为：
以Ad5基因组为模板，PCR扩增得到Ad5E4Orf6，将p55E4经PCR去除Ad55E4Orf6，两者连接得到p55E4(5Orf6)，线性化后与线性化pAd55ΔE1ΔE3同源重组，得到pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)。
最优选地，在其中一个实施例中，步骤S4.的具体方法为：
以p5Orf2-6、p55E4为模板，PCR得到Ad5E4Orf6并引入SapI位点，并在p55E4中去除Ad55E4Orf6，两者经SapI酶切连接得到p55E4(5Orf6)；
p55E4(5Orf6)以PmeI+MluI双酶切，pAd55ΔE1ΔE3以PsiI双酶切，重组得到已将Ad55E4Orf6置换为Ad5E4Orf6的基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)。
一种复制缺陷型人55型腺病毒载体的制备方法，还包含如下步骤：
S5.以Ad55基因组为模板PCR得到E1区同源重组臂SE1L、SE1R，酶切并连接至pVax载体得到pSE1LR；以pGA1-EGFP为模板PCR得到外源基因表达框CMV-EGFP-BGH，与pSE1LR经酶切、连接得到pGK551-EGFP，线性化后与线性化的权利要求3、4所述pAd55ΔE1ΔE3(5E4)、pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)分别同源重组得到pAd55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP、pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP，进一步线性化后转染293细胞，经培养并离心纯化得到复制缺陷型人55型腺病毒载体。
优选地，步骤S5.的具体方法为：
S5(1).分别以pVax、Ad55基因组、pGA1-EGFP为模板PCR得到Vax骨架、E1区上下游同源重组臂SE1L、SE1R以及外源基因表达框CMV-EGFP-BGH，Vax骨架、SE1L、SE1R酶切并连接得到pSE1LR；CMV-EGFP-BGH与pSE1LR经酶切、连接得到携带外源基因表达框的目标穿梭质粒pGK551-EGFP；
S5(2).pGK551-EGFP线性化后分别与线性化的pAd55ΔE1ΔE3(5E4)、pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)同源重组，得到pAd55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP、pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP；
S5(3).pAd55ΔE1ΔE3(5E4)、pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)、pAd55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP、pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP以AsiSI线性化后转染293细胞，扩增培养，密度梯度离心得到纯化的复制缺陷型人55型腺病毒载体Ad55ΔE1ΔE3(5E4)、Ad55ΔE1ΔE3(5Orf6)、Ad55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP、Ad55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP。
最优选地，在其中一个实施例中，步骤S5.的具体方法为：
S5(1).分别以pVax、Ad55基因组为模板PCR得到Vax骨架及E1区上下游同源重组臂SE1L、SE1R，Vax骨架以SpeI切，SE1L以XbaI切后加磷酸化，两者连接得到pSE1L；pSE1L及SE1R以SpeI+EcoRV切并连接得到pSE1LR；以pGA1-EGFP为模板PCR得到CMV-EGFP-BGH，与pSE1LR经SpeI+EcoRV切后连接得到携带外源基因表达框的目标穿梭质粒pGK551-EGFP；
S5(2).pGK551-EGFP以BstZ17I+SgrAI切，pAd55ΔE1ΔE3(5E4)、pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)以PmeI切，分别同源重组得到pAd55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP、pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP；
S5(3).pAd55ΔE1ΔE3(5E4)、pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)、pAd55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP、pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP分别以AsiSI线性化，转染293细胞进行拯救并扩增培养，经密度梯度离心得到纯化的复制缺陷型Ad55载体Ad55ΔE1ΔE3(5E4)、Ad55ΔE1ΔE3(5Orf6)、Ad55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP、Ad55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP。
所述的复制缺陷型人55型腺病毒载体在制备疫苗中的应用。
所述的复制缺陷型人55型腺病毒载体在制备中和抗体中的应用。
所述的复制缺陷型人55型腺病毒载体在生物学报告示踪系统中的应用。
所述的复制缺陷型人55型腺病毒载体在制备抗人55型腺病毒的疫苗中的应用。
所述的复制缺陷型人55型腺病毒载体在制备抗人55型腺病毒药物中的应用。
有益效果：(1)本发明所述的载体能够在293、PerC6等辅助细胞株中大量生产，并可以密度梯度离心浓缩纯化；在正常人体细胞不具备复制能力因此具备减毒表型；(2)该重组载体还可在靶细胞内高效表达外源基因；(3)本发明所述重组载体可作为疫苗或基因治疗载体，还可应用于药物及中和抗体的研发，以及报告示踪系统等。
附图说明
附图1是双抗性筛选技术敲除pAd55ΔE3中E1基因的原理，及敲除E1基因的穿梭质粒、pAd55ΔE1ΔE3-Kana质粒的酶切鉴定结果。
附图2是敲除pAd55ΔE1ΔE3-Kana中卡那霉素抗性基因的原理，以及敲除卡那霉素抗性基因的穿梭质粒、pAd55ΔE1ΔE3质粒的酶切鉴定结果。
附图3是将pAd55ΔE1ΔE3中的E4Orf6及E4Orf2-6改换为Ad5E4Orf6及Ad5E4Orf2-6的原理，以及pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)、pAd55ΔE1ΔE3(5E4)质粒的酶切鉴定结果。
附图4是构建携带外源基因表达框的pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP、pAd55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP质粒的过程示意图及酶切鉴定结果。
附图5是Ad55ΔE1ΔE3(5Orf6)等复制缺陷型Ad55载体的生产及纯化结果。
附图6是复制缺陷型Ad55载体在293及A549细胞中的噬斑形成实验结果。
附图7是Ad55ΔE1ΔE3(5Orf6)等复制缺陷型Ad55载体免疫小鼠后产生的抗Ad55中和抗体的检测结果及攻毒后小鼠血清中SEAP含量检测结果。
附图8是复制缺陷型Ad55载体携带Ebola病毒GP蛋白的构建及蛋白表达检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一种复制缺陷型人55型腺病毒载体的制备方法。本发明所述腺病毒载体的制备方法和构建思路适用于针对腺病毒及其他病原体疫苗的研发，抗腺病毒药物及中和抗体的筛选，以及生物学研究中的报告示踪系统。
本发明术语“人55型腺病毒”指本领域普通技术人员已知的55型腺病毒，实施例中用到的Ad55基因组也来源于这些已知的人55型腺病毒。本发明所述复制缺陷型人55型腺病毒载体不局限于实施例所采用的特定临床分离株。
本发明术语“外源序列”是指非55型腺病毒来源的任何DNA序列。本领域普通技术人员应当理解，外源序列可以是外源基因表达框，也可以是shRNA或miRNA的表达框等。
在以下实施例中，根据本领域技术人员的理解，外源基因表达框可包含真核启动子、外源基因编码序列、转录终止子。所述外源基因编码序列可以是但不仅限于绿色荧光蛋白、其他病毒抗原、shRNA等的编码序列。
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
实施例1：E1基因的敲除及pAd55ΔE1ΔE3-Kana质粒的构建。
1.E1基因敲除穿梭质粒pVax-delE1(L+R)的构建。
以Ad55基因组为模板进行PCR扩增，得到重组臂L-delE1及R-delE1。
L-delE1引物序列：
L-delE1F，ATAGAATTCGGGGTGGAGTGTTTTTGCAAG(SEQ ID NO.1)；
L-delE1R，TTTACTAGTGTTTAAACGTAATCGAAACCTCCACGTAATGG(SEQID NO.2)。
PCR程序：95℃，30秒；62℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。
R-arm引物序列：
R-delE1F，ATTTCTAGAGTTTAAACGAGACCGGATCATTTGGTTATTG(SEQ IDNO.3)；
R-delE1R，AAAGAATTCGGGAAATGCAAATCTGTGAGGG(SEQ ID NO.4)。
PCR程序：95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，80秒；25个循环。
L-delE1以SpeI+EcoRI酶切后连接至同样酶切的pVax载体(Invitrogen)得到pVax-L-delE1；R-delE1以EcoRI+XbaI双酶切后连接至同样酶切的pVax-L-delE1得到敲除E1基因的穿梭质粒pVax-delE1(L+R)。
2.pAd55ΔE1ΔE3-Kana质粒的构建。
pVax-delE1(L+R)以EcoRI线性化后，与PacI单酶切线性化的pAd55ΔE3共转化BJ5183感受态细胞(Stratagene)；经氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选后，手工提取质粒，进一步转化XL-Blue感受态细胞(北京斯百汇生物科技有限公司)；手工提取质粒，得到pAd55ΔE1ΔE3-Kana质粒。以不同的酶切组合进行酶切鉴定，如附图1所示。所得到的pAd55ΔE1ΔE3-Kana质粒中的腺病毒基因组原E1区引入2个PmeI酶切位点，以方便后续克隆。
实施例2：Kana抗性基因的敲除及pAd55ΔE1ΔE3质粒的构建。
1.Kana抗性基因敲除穿梭质粒pVax-delK(L+R)的构建。
以Ad55基因组为模板进行PCR扩增，得到重组臂L-delK及R-delK。
L-delK引物序列：
L-delK F，ATAACTAGTGGGGTGGAGTGTTTTTGCAAG(SEQ ID NO.5)；
L-delK R，TTTGAATTCGTTTAAACGTAATCGAAACCTCCACGTAATGG(SEQID NO.6)。
PCR程序：95℃，30秒；61℃，30秒；72℃，20秒；25个循环。
R-delK引物序列：
R-delK F，ATCGTTTAAACGAGACCGGATCATTTGGTTATTG(SEQ ID NO.7)；
R-delK R，ATCTCTAGAGGGAAATGCAAATCTGTGAGGG(SEQ ID NO.8)。
PCR程序：95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，80秒；25个循环。
L-delK以SpeI+EcoRI酶切后连接至同样酶切的pVax载体(Invitrogen)得到pVax-L-delK；R-delK以EcoRI+XbaI双酶切后连接至同样酶切的pVax-L-delE3得到敲除Kana基因的穿梭质粒pVax-delK(L+R)。
2.pAd55ΔE1ΔE3质粒的构建。
pVax-delK(L+R)以SpeI+XbaI线性化，pAd55ΔE1ΔE3-Kana以PmeI线性化，乙醇沉淀法回收后共转化BJ5183感受态细胞(Stratagene)，涂至氨苄抗性平板，手工提取质粒后，继续转化XL-Blue感受态细胞(北京斯百汇生物科技有限公司)，手工提取质粒并进行酶切鉴定。得到去除Kana抗性基因并在E1区引入唯一酶切位点PmeI的基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3。穿梭质粒及pAd55ΔE1ΔE3质粒的构建示意图及酶切鉴定结果如附图2所示。
实施例3：Ad55E4基因的改造及pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)、pAd55ΔE1ΔE3(5E4)质粒的构建。
1.Ad55E4基因改造的穿梭质粒构建。
1)以Ad55基因组为模板，以下列引物进行PCR扩增，得到Ad55E4基因。
R-delE3Mlu，GATCACGCGTGGACTAAGAGACCTGCTACCCATG(SEQ IDNO.9)；
L-delK R，TGTAGATCTGTTTAAACCTTTAGCCCCATTACGTCAGTTTAG(SEQID NO.10)。
PCR程序：95℃，30秒；61℃，30秒；72℃，4分钟；25个循环。
PCR产物末端加磷酸化之后，与平末端T载体(TaKaRa)连接，得到p55E4。
2)以p55E4质粒为模板，PCR扩增得到末端加入SapI酶切位点且去除Ad55E4Orf6基因的线性化p55E4。
Sap-p55E4R，TTACGCTCTTCCTAGCCGTGATCCAGACTCCGG(SEQ IDNO.11)；
Sap-p55E4orf6F，AGCTGCTCTTCCCATTCTCGTATTTTGTATAGCAAAACG(SEQ ID NO.12)。
PCR程序：95℃，30秒；63℃，30秒；72℃，5分钟；25个循环。
以Ad5基因组为模板，PCR得到末端加入SapI位点的Ad5E4Orf6基因。
Sap-5ORF6F，AATAGCTCTTCCCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCG(SEQ IDNO.13)
Sap-5ORF6R，ACTAGCTCTTCCATGACTACGTCCGGCGTTCC(SEQ ID NO.14)。
PCR程序：95℃，30秒；61.5℃，30秒；72℃，45秒；25个循环。
上述线性化p55E4及Ad5E4Orf6以SapI酶切后相连接，得到p55E4(5Orf6)。
3)类似地，以p55E4质粒为模板，以下列引物进行PCR扩增，得到末端加入SapI酶切位点且去除Ad55E4Orf(2-6)基因的线性化p55E4。
Sap-p55E4R，TTACGCTCTTCCTAGCCGTGATCCAGACTCCGG(SEQ IDNO.11)；
Sap-p55E4orf2F，ATAGCTCTTCCCATTGTTAGTTTTGAATGAGTCTGCA(SEQID NO.15)；
PCR程序：95℃，30秒；61.5℃，30秒；72℃，4分钟；25个循环。
以Ad5基因组为模板，PCR扩增得到末端加入SapI位点的Ad5E4Orf(2-6)。
Sap-5ORF6F，AATAGCTCTTCCCTACATGGGGGTAGAGTCATAATCG(SEQ IDNO.13)
Sap-5ORF2R，ATATGCTCTTCCATGCAGAAACCCGCAGACATG(SEQ ID NO.16)
PCR程序：95℃，30秒；61℃，30秒；72℃，2分钟；25个循环。
上述线性化p55E4及Ad5E4Orf(2-6)片段以SapI酶切后相连接，得到p55E4(5E4)。
2.pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)、pAd55ΔE1ΔE3(5E4)质粒的构建。
p55E4(5Orf6)、p55E4(5E4)以MluI+PmeI线性化，pAd55ΔE1ΔE3以PsiI线性化，共转化BJ5183感受态细胞，重组得到缺失E1、E3基因，且E4基因经过改造的基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)、pAd55ΔE1ΔE3(5E4)。具体构建过程及鉴定结果参见附图3。
实施例4：携带外源基因的穿梭质粒及pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP等复制缺陷型Ad55基因组质粒的构建。
1.构建携带外源基因表达框的穿梭质粒pGK551-EGFP。
1)以Ad55基因组为模板PCR扩增得到E1区同源重组臂SE1L及SE1R：
SE1L引物序列：
SE1L F，AATGGTACCGGGGTGGAGTGTTTTTGCAAG(SEQ ID NO.17)；
SE1L R，ATCGTAATCGAAACCTCCACGTAATGG(SEQ ID NO.18)。
PCR程序：95℃，30秒；61℃，30秒；72℃，30秒；25个循环。
SE1R引物序列：
SE1R F，AACACTAGTGAGACCGGATCATTTGGTTATTG(SEQ ID NO.19)；
SE1R R，TTAACGCGTGTATACGGGAAATGCAAATCTGTGAGGG(SEQ IDNO.20)。
PCR程序：95℃，30秒；60℃，30秒；72℃，1分钟30秒；25个循环。
2)构建携带重组臂的穿梭质粒pSE1LR。
pSE3LR以KpnI+EcoRV切，SE1L同样酶切，连接得到pSE1L；pSE1L以SpeI+MluI切，SE1R同样切，连接得到pSE1LR。
3)构建携带外源基因表达框的穿梭质粒pGK551-EGFP等。
以pGA1-EGFP为模板，以下列引物PCR得到CMV-EGFP-BGH表达框。
CMV，AGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAG(SEQ ID NO.21)；
BGH，GCTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAG(SEQ ID NO.22)。
PCR程序：95℃，30秒；66℃，30秒；72℃，1分钟45秒；25个循环。
pSE1LR以SpeI+EcoRV切，CMV-EGFP-BGH以SpeI切，连接得到目标穿梭质粒pGK551-EGFP。
2.构建基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP等。
pGK551-EGFP质粒以BstZ17I+SgrAI切，乙醇沉淀回收；pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)、pAd55ΔE1ΔE3(5E4)以PmeI线性化后乙醇沉淀回收；共转化BJ5183，同源重组得到携带外源基因表达框的pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP、pAd55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP质粒。具体构建过程及鉴定结果参见附图4。
实施例5：复制缺陷型Ad55载体的拯救与生产
按照常规方法，pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP、pAd55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP分别以AsiSI线性化，乙醇沉淀回收，阳离子脂质体转染法转染293细胞，转染后8小时，加入2毫升含5％胎牛血清的DMEM培养基，孵育7-10天，观察细胞病变；出毒后，收集细胞及培养上清，在37度水浴及液氮中反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染10厘米皿；2-3天后，收集细胞及培养上清，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清感染6-10个15厘米皿；2-3天后，收集细胞，反复冻融3次并离心去除细胞碎片，上清加至氯化铯密度梯度离心管；4℃,35000转，离心4小时；吸出病毒条带，脱盐，分装；以OD260吸光度测定病毒粒子滴度，计算公式为：病毒浓度＝OD260×稀释倍数×36/基因组长度(Kb)；病毒储存液于-80℃冻存。复制缺陷型Ad55载体的生产及纯化结果如附图5所示。
实施例6：复制缺陷型Ad55病毒在A549及293细胞中的复制能力鉴定。
按照常规方法，以噬斑形成实验鉴定复制缺陷型Ad55载体在辅助细胞293以及非辅助细胞A549中的生长能力。六孔板中293或A549细胞长至九成满后，以Ad55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP、Ad55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP以及Ad55ΔE3-EGFP进行感染，感染滴度为1X107Vp/孔。感染后4小时，吸走培养基，并铺上1％的琼脂糖凝胶(含1％琼脂糖，5％胎牛血清，1×MEM培养基)。37℃培养箱内放置10-12天后，在荧光显微镜下观察病毒克隆的形成,并拍照记录。结果如附图6所示。Ad55ΔE3-EGFP保留完整的E1基因，因此感染293及A549细胞后均可形成噬斑；而复制缺陷型Ad55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP、Ad55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP仅能在293细胞中形成噬斑，在A549细胞中则不能形成噬斑。这表明，复制缺陷型Ad55载体可在293细胞中有效增殖，但在正常人体细胞如A549细胞中不具备复制能力，具有减毒表型。同时，该结果也显示复制缺陷型人55型腺病毒载体可携带报告基因进入靶细胞，因而可应用于报告示踪系统中。
实施例7：复制缺陷型Ad55载体在小鼠中免疫原性的评估。
按照附图7所示的免疫方案，对复制缺陷型Ad55的免疫原性进行了评估。
6-8周龄Balb/c小鼠分为5组，每组5只；第0天，分别肌注免疫热灭活的Ad55ΔE3-EGFP、Ad55ΔE3-EGFP、Ad55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP、Ad55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP、Ad5ΔE1ΔE3；第21天，眼眶取血并分离血清；同时按上述方案加强免疫；第35天，眼眶取血并分离血清；第42天，以Ad55ΔE3-SEAP尾静脉注射攻毒，剂量为2×1010vp/只；第44天，取血并分离血清。最后，测定攻毒前血清中的抗Ad55中和抗体以及攻毒后血清中SEAP的表达量。
按照常规方法，以Ad55ΔE3-SEAP及Ad5-SEAP作为报告病毒检测小鼠血清中抗Ad55、Ad5的中和抗体。293细胞铺至96孔板，小鼠血清以无酚红无血清培养基梯度稀释；分别以1X107Vp的Ad55ΔE3-SEAP及Ad5-SEAP与血清共孵育，37℃1小时后加至细胞培养板；继续孵育24小时后，每孔取50微升培养上清，加至96孔黑色板；以phospha-lightTM system(Applied Biosystem)进行检测，在荧光照度计上读取发光值；根据读数计算中和抗体的滴度。小鼠体内中和抗体滴度如图7所示，免疫组小鼠在初免后即可产生Ad55中和抗体；而加强后抗体水平显著提升；灭活Ad55免疫产生的中和抗体滴度相对其他组较低；Ad55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP、Ad55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP产生的中和抗体比Ad55ΔE3-EGFP略高。该结果说明复制缺陷型Ad55载体可潜在的应用于抗Ad55疫苗研发。
实施例8：复制缺陷型Ad55载体在研制抗埃博拉病毒疫苗中的应用。
按照实施例4、5所述方法，将埃博拉病毒囊膜蛋白GP(此处采用Zaier亚型的两种毒株，Guinea 2014株以及Maynia1976株，分别命名为GP(ZG)以及GP(ZM))的编码基因密码子优化后克隆至穿梭载体pGK551，得到pGK551-GP(ZG)以及pGK551-GP(ZM)，以BstZ17I+SgrAI线性化后与经PmeI线性化的pAd55ΔE1ΔE3(5E4)进行重组，得到pAd55-GP(ZG)、pAd55-GP(ZM)。进一步用AsiSI线性化后转染293细胞，可拯救出携带埃博拉包膜抗原基因的复制缺陷型Ad55载体。该载体可在靶细胞中高效表达埃博拉病毒包膜抗原。如附图8所示实验结果，说明复制缺陷型Ad55载体可应用于其他病原体疫苗的研究。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种复制缺陷型人55型腺病毒载体，其特征在于，由如下方法制备得到：通过敲除Ad55的E1、E3基因，再将Ad55基因组中的E4基因开放阅读框6或开放阅读框2、3、4、6、6/7改换为Ad5基因组的相应阅读框。
2.根据权利要求1所述的复制缺陷型人55型腺病毒载体，其特征在于，还在Ad55的E1基因区域整合外源基因表达框。
3.权利要求1或2所述的复制缺陷型人55型腺病毒载体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
S1.PCR扩增Ad55E1区同源重组臂并反向连接至卡那霉素抗性载体，线性化后与经部分酶切线性化的pAd55ΔE3同源重组，得到基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3-Kana；
S2.PCR扩增Ad55E1区同源重组臂并同向连接至卡那霉素抗性载体，线性化后与线性化的pAd55ΔE1ΔE3-Kana同源重组，得到基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3；
S3.PCR扩增Ad5E4Orf2-6、Ad55E4基因，以Ad5E4Orf2-6取代Ad55E4基因中相应区域得到p55E4(5E4)，线性化后与线性化的pAd55ΔE1ΔE3同源重组，得到基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3(5E4)；
S4.PCR扩增Ad5E4Orf6，以其取代步骤S3.所述Ad55E4基因的相应区域得到p55E4(5Orf6)，线性化后与线性化的pAd55ΔE1ΔE3同源重组，得到基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S1.的具体方法为：以Ad55基因组为模板，PCR扩增得到E1基因同源重组臂L-delE1及R-delE1，酶切后连接至pVax载体得到pVax-delE1(L+R)，线性化后，与经部分酶切线性化的pAd55ΔE3同源重组，经氨苄青霉素、卡那霉素双抗性筛选得到敲除E1、E3基因并引入唯一酶切位点PmeI的基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3-Kana。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S2.的具体方法为：以Ad55基因组为模板，PCR扩增得到E1基因同源重组臂L-delK(E1)及R-delK(E1)，酶切后连接至pVax载体得到pVax-delK(E1)，线性化后与线性化的pAd55ΔE1ΔE3-Kana同源重组，得到去除E1、E3、卡那霉素基因并引入唯一酶切位点PmeI的基因组质粒pAd55ΔE1ΔE3。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤S3.的具体方法为：分别以Ad5、Ad55基因组为模板，PCR扩增得到Ad5E4Orf2-6以及Ad55E4，将Ad55E4连接至T载体得到p55E4，进一步以p55E4为模板PCR去除Ad55E4Orf2-6，然后与Ad5E4Orf2-6连接得到p55E4(5E4)，线性化后与线性化的pAd55ΔE1ΔE3同源重组，得到pAd55ΔE1ΔE3(5E4)。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤S4.的具体方法为：以Ad5基因组为模板，PCR扩增得到Ad5E4Orf6，将p55E4经PCR去除Ad55E4Orf6，两者连接得到p55E4(5Orf6)，线性化后与线性化pAd55ΔE1ΔE3同源重组，得到pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤：
S5.以Ad55基因组为模板PCR得到E1区同源重组臂SE1L、SE1R，酶切并连接至pVax载体得到pSE1LR；以pGA1-EGFP为模板PCR得到外源基因表达框CMV-EGFP-BGH，与pSE1LR经酶切、连接得到pGK551-EGFP，线性化后与线性化的权利要求3、4所述pAd55ΔE1ΔE3(5E4)、pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)分别同源重组得到pAd55ΔE1ΔE3(5E4)-EGFP、pAd55ΔE1ΔE3(5Orf6)-EGFP，进一步线性化后转染293细胞，经培养并离心纯化得到复制缺陷型人55型腺病毒载体。
9.权利要求1或2所述的复制缺陷型人55型腺病毒载体在制备疫苗、中和抗体或生物学报告示踪系统中的应用。
10.权利要求1或2所述的复制缺陷型人55型腺病毒载体在制备抗人55型腺病毒的疫苗或抗人55型腺病毒药物中的应用。
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