CN109797168A - 一种重组腺病毒的表达载体SAd23-L - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种重组腺病毒表达载体，所述载体特征包括：以野生型腺病毒SAd23的基因组为基础，通过分子克隆的方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I‑Ceu I和PI‑Sce I酶切位点，同时以腺病毒人血清型Ad5的E4编码区替换SAd23的E4编码区，提高了在人源肾胚细胞（HEK293）中包装重组病毒的成功率和包装出重组病毒的滴度，获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体。本发明的优势在于：1.通过直接分子克隆的方法，构建大片段质粒，方法简单，易操作，可以用于任何大片段载体的构建；2.通过几次克隆连接可以构建完成腺病毒表达载体，步骤简单；3.在细菌水平筛选阳性克隆更加容易、快捷，而且缩短了腺病毒载体构建时间。

Description

一种重组腺病毒的表达载体SAd23-L

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种用于基因治疗和疫苗载体的重组腺病毒载体；具体是本发明涉及一种重组腺病毒的表达载体SAd23-L。

背景技术

腺病毒（adenovirus, Ad）作为基因表达载体的研制起始于20世纪60年代初。腺病毒可以在不同动物体内刺激诱导出有效的T细胞和B细胞免疫应答，但是不同型别的腺病毒诱导能力是不相同。C亚群中的腺病毒诱导的针对外源基因的特异性T细胞免疫和B细胞免疫反应最强。基于腺病毒人血清型5（Ad5）和2（Ad2）型的表达载体在疫苗研究以及治疗中被广泛应用，但是由于人体内普遍存在抗Ad5腺病毒本身的免疫反应，这种预存的免疫反应包括抗腺病毒中和抗体和针对腺病毒的杀伤性T细胞，从而抑制其进入机体细胞而其所携带的目的基因就得不到预期水平的表达甚至是完全不表达，此外具有交叉性的针对腺病毒载体的细胞免疫CTL反应会杀死已经感染了腺病毒载体的靶细胞从而阻断外源基因的持续表达。为了克服预存免疫反应对腺病毒载体的影响，研究者们尝试了多种方法：（1）利用新方法转运重组Ad5载体；（2）对Ad5载体进行基因工程改造；（3）从其它人腺病毒血清型甚至其他动物种属中开发新的重组腺病毒载体。由于人群中一般不会含有抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，因此基于黑猩猩型腺病毒的疫苗载体，其免疫效果显著优于以人血清型腺病毒构建的疫苗载体。该方法具体是以源于黑猩猩型腺病毒23型，改造为复制缺陷型的腺病毒载体。

但是，之前构建的基于黑猩猩型腺病毒的表达载体，都需要在人源肾胚细胞中完成病毒的包装，由于种属的差异性，包装出的重组病毒无论是滴度还是纯度都达不到临床使用的标准，跟在人源肾胚细胞包装出的Ad5病毒载体相比有一定差距。

CN201710814259.3公开了一种制备腺病毒表达载体的方法，所述方法包括：以野生型腺病毒AdC6基因组为基础，通过基因组直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I-Ceu I和PI-Sce I酶切位点，获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体。但是，发明人在实践中发现，采用这种方法构建的载体Sad23，在包装成功病毒之后，在扩增病毒，准备纯化的过程中遇到困难，病毒感染很多的HEK293细胞之后，回收细胞，冻融细胞，上清氯化铯纯化的病毒总是达不到理想的病毒滴度，Sad23-eGFP病毒感染90个75T的HEK293细胞之后，纯化得到的重组病毒，经过空斑形成实验确定最终的滴度只有10⁹PFU/ml。即Sad23病毒载体在扩增病毒的过程，产生的毒量太低，然后影响其在实际的临床中的应用，因此需要进一步改进。

发明内容

为了弥补已有腺病毒表达载体的在病毒滴度低，纯化困难等方面的缺陷，本发明提供一种新的重组的腺病毒表达载体

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案予以实现。

一种重组腺病毒表达载体，其是以野生型腺病毒SAd23的基因组为基础，通过基因组直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I-Ceu I和PI-Sce I酶切位点，同时以人血清型腺病毒Ad5的E4编码区替换SAd23的E4编码区，获得复制缺陷性的重组腺病毒表达载体。其中，野生型腺病毒SAd23的基因组的genebank登录号为AY530877，人血清型腺病毒Ad5基因组的genebank登录号为AY601635.1。

进一步地，所述的删除E1编码区是指删除野生型腺病毒SAd23的基因组中第492-3022位的碱基序列。

进一步地，所述的删除E3编码区是指删除野生型腺病毒SAd23的基因组中第17895-31909位的碱基序列。

进一步地，所述的SAd23的E4编码区是指野生型腺病毒SAd23的基因组中第33841-36181位的碱基序列。

进一步地，所述的Ad5的E4编码区是指腺人血清型腺病毒Ad5基因组中第33193-35526位的碱基序列。

在另外的一选例中，所述腺病毒表达载体的酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I之间，还包括外源的抗原编码基因。

进一步地，所述外源的抗原是寨卡的包膜蛋白E抗原。

在本发明的另外一方面，提供一种制备疫苗的方法，所述方法包括：

（1）提供所述的重组腺病毒表达载体；

（2）将外源的抗原编码基因插入到（1）中腺病毒表达载体的酶切位点I-Ceu I和PI-SceI之间；

（3）将步骤（2）的重组表达载体转染包装病毒细胞，病毒在细胞内包装完成，从而获得具有免疫原性的疫苗。

本发明具有如下有益效果：

（1）本发明人成功地基于黑猩猩型腺病毒SAd23构建成一种新型表达载体SAd23-L，所述的疫苗载体可应用于制备高效表达且具有良好免疫原性的病毒疫苗；

（2）本发明中的重组腺病毒表达载体是以Ad5的E4编码区替换SAd23的E4编码区，提高了在人源肾胚细胞中包装病毒的成功率和包装出病毒的滴度；

（3）本发明的重组腺病毒载体，能被广泛应用于疫苗和基因治疗领域；

（4）本发明中进一步对病毒载体进行改造，以人血清型腺病毒Ad5的E4 编码区替换SAd23的E4编码区，发现在包装病毒成功之后，病毒感染HEK293细胞之后，收集细胞，然后冻融细胞液，离心得到的病毒上清，经过氯化铯梯度离心纯化得到重组病毒，发现病毒滴度显著增加。在SAd23-L-eGFP病毒感染52个75T的HEK293细胞之后，氯化铯纯化得到的病毒滴度有10¹¹PFU/ml ，不单单感染的细胞减少一半，大大的减少了工作量，节约人力物力，而且，病毒的滴度提取10³倍，因此改造之后的病毒更具有实际临床应用价值。

附图说明

图1为重组腺病毒表达载体SAd23-L的酶切鉴定结果。

图2为构建重组腺病毒SAd23-L-eGFP的鉴定结果；其中A：重组腺病毒载体SAd23-L-eGFP的酶切鉴定结果；B：重组腺病毒载体SAd23-L-eGFP的病毒噬斑形成结果。

图3为构建重组腺病毒SAd23-L-ZIKV-E的鉴定结果；其中A：SAd23-L-ZIKV-E的酶切鉴定结果；B：SAd23-L-ZIKV-E的病毒噬斑结果；C：WB检测包膜E蛋白抗原的表达。

图4为构建复制缺陷性腺病毒载体SAd23-L的流程图。

图5为SAd23-L-ZIKV-E重组病毒免疫BALB/c小鼠诱导良好的细胞免疫反应；其中，A：免疫小鼠实验分组；B：诱导良好的细胞免疫反应。

图6为氯化铯离心纯化的SAd23-L-ZIKV-E的病毒。

具体实施方式

本发明提供了一种重组腺病毒表达载体，所述表达载体包括：在野生型腺病毒SAd23的基因组基础上删除E1和E3编码区，且在E1删除区插入酶切位点I-Ceu I和PI-SceI，同时以Ad5的E4编码区替换野生型腺病毒SAd23的E4编码区，提高了在人源肾胚细胞（HEK293）中包装重组病毒的成功率和包装出重组病毒的滴度。

其中，野生型腺病毒SAd23的E1编码区的核苷酸序列如GenBank: AY530877.1中第492-3022位的碱基序列；野生型腺病毒SAd23的E3编码区的核苷酸序列如GenBank:AY530877.1中第27895-31909位的碱基序列；野生型腺病毒SAd23的E4编码区的核苷酸序列如GenBank: AY530877.1中第33841-36181位的碱基序列；腺病毒人血清型5（Ad5）型的E4编码区的核苷酸序列如GenBank: AY601635.1第33193-35526位的碱基序列。

对SAd23的基因组的深入研究，在E1编码区缺失位插入酶切位点I-Ceu I和PI-SceI作为外源基因的连接位点，此酶切位点不存在于腺病毒表达载体的其它位置。

黑猩猩型腺病毒SAd23，从黑猩猩体内分离得到。本发明以野生型SAd23基因组为基础，通过直接克隆方法，删除E1和E3编码区，在E1删除区插入酶切位点I-Ceu I和PI-SceI，同时以Ad5的E4编码区替换SAd23的E4编码区，最终获得复制缺陷性的SAd23-L重组腺病毒表达载体。

作为本发明的优选方式，克隆构建重组腺病毒载体的步骤包括：

（1）PCR扩增SAd23的基因组的LITR片段（约450bp），用PmeI和BstAPI分别双酶切pNEB193质粒和PCR产物，连接形成质粒pNEB193-PB；

（2）用SnaBI和NdeI分别双酶切PUC57-Linker和pNEB193-PB质粒，连接成质粒PNEB193-PB+Linker；

（3）用NdeI和MluI双酶切SAd23的基因组，将切下的目的片段插入到质粒pNEB193-PB+Linker的NdeI和MluI位点中，获得质粒pNEB193-PB+Linker+NM；

（4）PCR扩增SAd23的基因组从36181位至36604位，同时PCR扩增Ad5基因组从33193位至35526位的DNA片段；通过Overlapping PCR扩增连接上述获得的两段DNA片段，通过EcoRI和KpnI酶切位点，连接于pNEB193载体，获得质粒pNEB193-EK-Ad5-E4；

（5）用KpnI和PacI双酶切SAd23的基因组，将切下的目的片段插入到pNEB193-EK-Ad5-E4载体，获得质粒pNEB193-EK-Ad5-E4-KP；

（6）用PacI和XbaI双酶切SAd23的基因组，将切下的目的片段插入到pNEB193-EK-Ad5-E4载体，获得质粒pNEB193-EK-Ad5-E4-KP-PX；

（7）用PmeI和MluI分别双酶切质粒pNEB193-PB+Linker+NM和pNEB193-EK-Ad5-E4-KP-PX，连接之后，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。获得重组腺病毒表达载体之后，线性化将其转染入人源肾胚细胞，进行病毒的包装；转染一段时间后，可以收获病毒；收获的病毒可以反复感染包装病毒的细胞系，持续传代。

本发明的复制缺陷型的重组腺病毒表达载体作为一种表达载体平台，适用于表达多种抗原，从而制备病毒疫苗。

为了验证SAd23-L的有效性，本发明将绿色荧光蛋白基因克隆入SAd23-L载体，研究显示SAd23-L载体能高表达抗原基因，证明本发明获得了一种新型的腺病毒载体，可用于疫苗研发以及其它生物医学基础研究，为新型疫苗研发提供一种新型的载体平台。

下面结合具体实例，进一步阐述本发明。

1 材料

1.1 病毒株和细胞。

野生型腺病毒SAd23购于ATCC(VR-592)；HEK293细胞株本实验室保存，培养基为10%胎牛血清（FBS）的DMEM购于Gibco。

1.2 限制性内切酶、菌种和质粒。

限制性内切酶购自New England Biolabs；DH5α感受态购自于天根生化科技有限公司；E.coli HST08感受态购自于Takara。

pUC19-eGFP质粒由实验室保存。

pDC315-PreM-E (ZIKV)质粒由实验室保存。

pNEB193质粒由实验室保存。

pShuttle2-CMV-Flag载体购于Addgene。

pUC57-Linker质粒：，将由北京华大基因合成的Linker克隆至pUC57载体上，获得pUC57-Linker。所述Linker序列同CN201710814259.3中SEQ ID NO: 1；所述pUC57载体是基因克隆中的一种常用载体。

2 方法。

2.1 腺病毒的扩增与纯化。

HEK293细胞在含有10%FBS的DMEM培养基培养，SAd23腺病毒在HEK293细胞中培养增值，当细胞全部表现出病毒噬斑（CPE）后，收集感染的细胞，离心，用DMEM重悬，反复冻融细胞三次，使细胞裂解释放出病毒。病毒经过CsCl密度梯度离心纯化，加入甘油保存于液氮罐。

2.2 构建复制缺陷性的的重组腺病毒载体。

2.2.1 构建质粒pNEB193-PB。

以SAd23的基因组为模版，用含有限制性内切酶位点PmeI和BstAPI的引物PCR扩增，得到PmeI到BstAPI约450bp，然后用PmeI和BstAPI分别双酶切PCR产物和pNEB193，连接，获得质粒pNEB193-PB。所述引物序列同CN201710814259.3中SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO:5。

2.2.2 构建质粒pNEB193-PB +Linker。

用SnaBI和NdeI分别双酶切pUC57-Linker和质粒pNEB193-PB，连接成质粒pNEB193-PB +Linker。

2.2.3 构架质粒pNEB193- PB +Linker+NM。

用NdeI和MluI双酶切SAd23的基因组，将切下的目的片段插入到pNEB193-PB +Linker质粒的NdeI和MluI位点中，获得质粒pNEB193-PB +Linker+NM。

2.2.4 构建质粒pNEB193- EK-Ad5-E4

使用引物F1和R1 PCR扩增SAd23的末端36181位至36604位片段，引物F2和R2扩增Ad5的E4编码区，通过引物F2和R1 PCR扩增连接这两段DNA片段，获得EK-Ad5-E4基因片段，使用EcoRI和KpnI双酶切，克隆至pNEB193载体，获得质粒pNEB193- EK-Ad5-E4。

引物如下：

F1: 5’- ATGGC TGCCG CTGTG TAGCT TACCG AGCGG CAGC -3’ (SEQ ID NO: 1)；

R1: 5’- CGGAA TTCCG GCGAT CGCGC ATCAT CAATA ATATA CCTCC AAAC -3’ (SEQ IDNO: 2)；

F2: 5’- ATACT GGTAC CATAT AAACC TCTG -3’ (SEQ ID NO: 3)；

R2: 5’- CCGCT CGGTA AGCTA ATGGC TGCCG CTGTG GAAGC -3’ (SEQ ID NO: 4)。

2.2.5 构建质粒pNEB193- EK-Ad5-E4-KP。

用KpnI和PacI双酶切SAd23的基因组，将切下的目的片段插入到pNEB193- EK-Ad5-E4载体，获得质粒pNEB193- EK-Ad5-E4-KP。

2.2.6 构建质粒pNEB193- EK-Ad5-E4-KP-PX。

用PacI和XbaI双酶切SAd23的基因组，将切下的目的片段连接至pNEB193- EK-Ad5-E4-KP，获得质粒pNEB193- EK-Ad5-E4-KP-PX。

2.2.7 构建质粒SAd23-Ad5-E4（即SAd23-L）。

用PmeI和MluI分别双酶切质粒pNEB193-PB+Linker+NM和pNEB193- EK-Ad5-E4-KP-PX，回收目的片段，连接之后，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体(SAd23-L)。

获得的复制缺陷型的重组腺病毒表达载体SAd23-L的核苷酸序列如SEQ ID NO:5。

2.3 构建重组腺病毒SAd23-L-eGFP。

2.3.1 将eGFP基因克隆至SAd23-L。

以EcoRI和BamHI分别双酶切pUC19-eGFP和pShuttle2-CMV-Flag质粒，琼脂糖凝胶回收目的片段，连接获得载体pShuttle2-CMV-eGFP；用I-Ceu I和PI-Sce I分别双酶切pShuttle2-CMV-eGFP和SAd23-L，琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段，连接，转化，鉴定，获得载体SAd23-L-eGFP。

2.3.2 包装SAd23-L-eGFP重组腺病毒。

用SgfI酶切线性化SAd23-L-eGFP质粒；用HEK293细胞铺六孔板，当细胞融合度到80%-90%时，用X-tremeGENE(Roche)转染约2.5μg已线性化的SAd23-L-eGFP质粒至HEK293细胞，包装重组腺病毒。每天观察荧光及细胞状态，直至约第八天左右出现细胞病变（CPE），收取病变的细胞，反复冻融之后获得SAd23-L-eGFP的重组腺病毒。所述eGFP的核苷酸序列，同CN201710814259.3中SEQ ID NO: 17。

2.4 构建重组腺病毒SAd23-L-ZIKV-E。

2.4.1 将寨卡（ZIKV）的包膜蛋白（E）基因克隆至SAd23-L。

用KpnI和BamHI分别双酶切pShuttle2-CMV-Flag质粒和pDC315-PreM-E (ZIKV)质粒，胶回收载体和目的基因片段，连接，转化，鉴定，获得pShuttle2-CMV-E (ZIKV)。寨卡E抗原核苷酸序列如GenBank: MH055378.1第489-2489位的碱基序列。用I-Ceu I和PI-Sce I分别双酶切pShuttle2-CMV-E (ZIKV)和SAd23-L，琼脂糖凝胶电泳回收DNA片段，连接，转化，鉴定，获得载体SAd23-L-ZIKV-E。

2.4.2 包装SAd23-L-ZIKV-E重组腺病毒。

用SgfI酶切线性化SAd23-L-ZIKV-E质粒；用HEK293细胞铺六孔板，当细胞融合度到80%-90%时，用X-tremeGENE(Roche)转染约2.5μg已线性化的SAd23-L-ZIKV-E质粒至HEK293细胞，包装重组腺病毒。每天观察细胞状态，直至约第八天左右出现病毒噬斑（CPE）。

2.4.3 扩增与纯化重组腺病毒SAd23-L-ZIKV-E。

HEK293细胞在含有10%FBS的DMEM培养基培养，SAd23-L-ZIKV-E腺病毒在HEK293细胞中培养扩增；重组腺病毒感染HEK293细胞后，当细胞大全部出现细胞病变（CPE），收集被感染的细胞，离心；用DMEM重悬细胞，反复冻融细胞三次，使细胞裂解，释放出病毒。病毒经过CsCl密度梯度离心纯化，然后用病毒保存液冻存于-80℃冰箱。

2.4.4 Western blot 检测ZIKV的E蛋白的表达。

用HEK293细胞铺六孔板；当细胞融合度达到80-90%时，用SAd23-L-ZIKV-E病毒去感染细胞，同时用SAd23-L病毒去感染细胞，24小时之后收细胞，Western blot检测E蛋白的表达。

3 实施例。

实施例1、构建复制缺陷性的腺病毒载体。

按照图4所示的流程图，PCR扩增SAd23基因组的LITR片段（约450bp），用PmeI和BstAPI酶切pNEB193质粒和PCR产物，连接形成质粒pNEB193-PB。

用SnaBI和NdeI酶切pUC57-Linker和pNEB193-PB质粒，连接成质粒pNEB193-PB+Linker。

用NdeI和MluI酶切SAd23的基因组，将切下的目的片段插入到PNEB193-PB+Linker质粒的NdeI和MluI位点中，获得质粒pNEB193-PB+Linker+NM。

PCR扩增SAd23的末端36181位至36604位片段，同时PCR扩增Ad5的E4编码区，通过overlapping PCR扩增连接这两段DNA片段，获得EK-Ad5-E4基因片段，使用EcoRI和KpnI双酶切，克隆至pNEB193载体，获得质粒pNEB193- EK-Ad5-E4。

用KpnI和PacI双酶切SAd23的基因组，将切下的目的片段插入到pNEB193- EK-Ad5-E4载体，获得质粒pNEB193- EK-Ad5-E4-KP。

用PacI和XbaI双酶切SAd23的基因组，将切下的目的片段连接至pNEB193- EK-Ad5-E4-KP，获得质粒pNEB193- EK-Ad5-E4-KP-PX。

用PmeI和MluI分别双酶切质粒pNEB193-PB+Linker+NM和pNEB193- EK-Ad5-E4-KP-PX，回收目的片段，连接之后，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体(SAd23-L)。如图1所示，用AgeI酶切鉴定SAd23-L载体，会形成十一条大小不同的DNA条带：8144bp、5449bp、4872bp、4100bp、2994bp、2546bp、1628bp、1095bp、790bp、510bp、298bp，与Marker进行比较，均是正确的条带；同时用HindIII酶切会形成三条大小不同的DNA条带：16335bp、11789bp、4738bp，与Marker进行比较均是正确的条带。同时送条带正确的质粒测序（华大基因），测序确定正确的连接SAd23的基因与pNEB193质粒，同时删去了E1和E3编码区，SAd23的E4编码区被Ad5的E4编码区替换。

实施例2、构建重组腺病毒SAd23-L-eGFP。

将eGFP基因片段克隆至SAd23-L之后，重组腺病毒载体SAd23-L-eGFP用BglII酶切之后有十二条大小不同的DNA条带：6985bp、5235bp、4489bp、3955bp、3900bp、2334bp、2052bp、1740bp、1416bp、863bp、635bp、495bp，与Marker进行比较之后，均是正确的条带，如图2A所示。同时送酶切鉴定正确条带的质粒测序（华大基因），测序确定正确的连接SAd23的基因于pNEB193质粒，同时删去了E1和E3编码区，SAd23的E4编码区被Ad5的E4编码区替换，eGFP的外源基因连接到SAd23-L载体，形成重组载体：SAd23-L-eGFP。

重组载体SAd23-L-eGFP经过测序鉴定正确之后，进行酶切线性化转染HEK293细胞，每天观察细胞状态，如有需要换液。如图2B所示，在转染细胞第七天有微弱的病毒噬斑形成。继续观察培养至第十天，有大量的病毒噬斑，呈葡萄串状的细胞死亡。在荧光显微镜下观察，病毒噬斑出有强的绿色荧光，因此重组载体SAd23-L-eGFP构建正确，而且外源基因绿色荧光蛋白在插入E1区后，在细胞内大量的表达。

实施例3、构建重组腺病毒SAd23-L-ZIKV-E。

将ZIKV的包膜蛋白（E）基因克隆至SAd23-L载体，获得质粒：SAd23-L-ZIKV-E，通过HindIII酶切SAd23-L-ZIKV-E质粒，会形成3条DNA条带：16335bp、11789bp和6400bp，如图2A所示，与Marker进行比较，3条DNA条带的大小是完全正确的。酶切鉴定条带正确的质粒测序（华大基因），测序确定SAd23-L-ZIKV-E质粒正确的连接SAd23的基因于pNEB193质粒，同时删去了E1和E3编码区，SAd23的E4编码区被Ad5的E4编码区替换，ZIKV-E蛋白的外源基因连接到SAd23-L载体，形成重组载体：SAd23-L-ZIKV-E。

重组的腺病毒载体SAd23-L-ZIKV-E经过测序鉴定正确之后，线性化转染入HEK293细胞，每天观察细胞状态及病毒噬斑是否形成，如有需要换液。如图3B所示，在转染HEK293细胞第九天，观察到病毒噬斑的形成。继续培养包装病毒细胞至第十一天，大量的噬斑形成，离心收取包装的病毒的HEK293细胞，冻存于-80℃。

将冻存于-80℃的包装成功SAd23-L-ZIKV-E病毒的HEK293反复在室温至-80℃冻融3次之后，离心，吸取适量上清感染HEK293细胞。在感染细胞48h之后，收取感染的细胞，制备PAGE胶样品，通过蛋白印迹法（Western blotting）检测ZIKV-E蛋白的表达。如图3C所示，不同病毒滴度的SAd23-L-ZIKV-E病毒感染293A细胞之后，均检测到特异的ZIKV-E蛋白在HEK293细胞内的表达，而且不同病毒滴度感染的HEK293细胞后蛋白的表达量是基本相当的。因此重组载体SAd23-L-ZIKV-E构建正确，而且外源基因ZIKV-E蛋白在插入E1区后，在细胞内大量的表达。

实施例4、氯化铯梯度离心纯化重组腺病毒SAd23-L-ZIKV-E。

用鉴定表达的新型腺病毒载体疫苗病毒株SAd23-L-ZIKV-E接种75T培养瓶HEK293细胞（约90%的单层，含2×10⁷个细胞），6-8h后更换5% FBS培养液，继续培养至观察到大量细胞病变（约3天），收集细胞，用适量（0.5ml）的培养液重悬细胞，冻存于-80℃；反复冻融重组病毒感染的细胞三次，以7000rpm离心30min，吸取细胞冻融液上清液；每次可制备50瓶75T细胞培养瓶的HEK293感染细胞病毒液，吸取上清液，准备氯化铯离心。

在超速离心管中依次先后加入：2.5ml 1.4g的氯化铯溶液、2.5ml 1.2g的氯化铯溶液、冻融病毒液上清。液体要加满离心管，若病毒样品液不足以培养液上清填充，拧紧离心管盖子。两个配对离心管子加液量相同，用天平称重完全配平；将两个离心管套缓慢装稳在转子上，安装转子，打开电源，设置4℃、转速14000rpm、离心3.5h，启动抽真空达200以下时，启动离心；待离心完全停止后，拿出离心管，可见典型的白色病毒条带和空壳病毒体条带，如图6所示，下层白色条带为完整的病毒条带。在细胞间超净台内，用注射器（5ml）针头在蓝白色病毒条带下方0.4mm处，水平穿刺，抽取病毒条带，直至病毒条带消失（吸取体积越少越好）；两只10ml离心管共吸取1.5ml；配置透析液（将AB液混合，蔗糖过滤灭菌），加入高压灭菌的烧杯（1L）中，用高压灭菌的去离子纯净水冲洗酒精浸泡处理的透析袋，将病毒液加入透析袋内，置于4℃预冷的透析液中，然后置于4℃冰箱内，磁力搅拌透析，于第2、4小时完全换液，之后透析过夜；第二天，吸取透析袋中病毒液，分装于EP中，置-80℃冷冻保存，同时测定疫苗病毒滴度，此次纯化的SAd23-L-ZIKV-E的病毒滴度为5×10¹¹PFU/ml。

实施例5、检测重组腺病毒载体SAd23-L在小鼠体内诱导产生的免疫反应。

用5×10⁷PFU的SAd23-L-ZIKV-E病毒免疫雌性的5-6周龄的C57BL/6小鼠，如图5A所示，实验组5只C57BL/6小鼠，对照组4只C57BL/6小鼠接种等量的PBS。在大约两周之后，在加强免疫一次5×10⁷PFU的SAd23-L-ZIKV-E病毒。在加强免疫两周之后，安乐死处理小鼠，取小鼠脾脏，分离淋巴细胞，使用固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）检测SAd23-L-ZIKV-E病毒在小鼠体内诱导的特异的细胞免疫反应。淋巴细胞以50万每孔铺ELISPOT的板中，加入ZIKV-E蛋白刺激约36小时，在实验中做好阴性和阳性对照孔，最后显色确定细胞反应强弱。如图5B所示，实验组5×10⁷PFU的SAd23-L-ZIKV-E病毒免疫小鼠的特异性的针对ZIKV-E蛋白的T细胞反应相较于PBS免疫的对照组有明显的差异。说明SAd23-L载体在小鼠体内诱导产生了特异的免疫反应，SAd23-L载体是有效的安全的病毒载体。

结论

本发明通过分子克隆的方法，将野生型腺病毒SAd23构建成能稳定表达外源基因的重组腺病毒载体SAd23-L。载体SAd23-L以腺病毒人血清型Ad5的E4编码区替换SAd23的E4编码区，这种嵌合重组的腺病毒载体，其中Ad5 E4能够提高SAd23-L在包装病毒过程中对人源肾胚细胞（HEK293）中Ad5的E1的利用，更加利于包装出重组病毒，而且显著提高了包装出重组病毒的病毒滴度。因此本发明为新型疫苗的研发以及生物医学的基础研究提供了一种基于SAd23-L的新型表达载体，能在小鼠体内诱导产生强烈的特异的细胞免疫反应。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应落在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广州佰芮慷生物科技有限公司

<120> 一种重组腺病毒的表达载体SAd23-L

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctgccg ctgtgtagct taccgagcgg cagc 34

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggaattccg gcgatcgcgc atcatcaata atatacctcc aaac 44

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atactggtac catataaacc tctg 24

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccgctcggta agctaatggc tgccgctgtg gaagc 35

<210> 5

<211> 30406

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catcatcaat aatatacctc aaacttttgg tgcgcgttaa tatgcaaatg agctgtttga 60

atttggggag ggaggaaggt gattggctgc gggagcggcg accgttaggg gcggggcggg 120

tgacgttttg atgacgtggc tatgaggcgg agccggtttg caagttctcg tgggaaaagt 180

gacgtcaaac gaggtgtggt ttgaacacgg aaatactcaa ttttcccgcg ctctctgaca 240

ggaaatgagg tgtttctggg cggatgcaag tgaaaacggg ccattttcgc gcgaaaactg 300

aatgaggaag tgaaaatctg agtaatttcg cgtttatggc agggaggagt atttgccgag 360

ggccgagtag actttgaccg attacgtggg ggtttcgatt accgtatttt tcacctaaat 420

ttccgcgtac ggtgtcaaag tccggtgttt ttacgtacga tatcatttcc ccgaaagtgc 480

cacctgaccg taactataac ggtcctaagg tagcgaagca tctatgtcgg gtgcggagaa 540

agaggtaatg aaatggcatt atgggtatta tgggtctgca ttaatgaatc ggtcagatat 600

cgacatatgc tggccaccgt gcatgtggcc tcgcaccccc gcaagacatg gcccgagttc 660

gagcacaacg tcatgacccg ctgcaatgtg cacctgggct cccgccgagg catgttcatg 720

ccctaccagt gcaacatgca atttgtgaag gtgctgctgg agcccgatgc catgtccaga 780

gtgagcctga cgggggtgtt tgacatgaat gtggagctgt ggaaaattct gagatatgat 840

gaatccaaga ccaggtgccg ggcctgcgaa tgcggaggca agcacgccag gcttcagccc 900

gtgtgtgtgg aggtgacgga ggacctgcga cccgatcatt tggtgttgtc ctgcaacggg 960

acggagttcg gctccagcgg ggaagaatct gactagagtg agtagtgttt ggggctgggt 1020

gtgagcctgc atgaggggca gaatgactaa aatctgtggt tttctgtgtg ttgcagcagc 1080

atgagcggaa gcgcctcctt tgagggaggg gtattcagcc cttatctgac ggggcgtctc 1140

ccctcctggg cgggagtgcg tcagaatgtg atgggatcca cggtggacgg ccggcccgtg 1200

cagcccgcga actcttcaac cctgacctac gcgaccctga gctcctcgtc cgtggacgca 1260

gctgccgccg cagctgctgc ttccgccgcc agcgccgtgc gcggaatggc cctgggcgcc 1320

ggctactaca gctctctggt ggccaactcg agttccacca ataatcccgc cagcctgaac 1380

gaggagaagc tgctgctgct gatggcccag ctcgaggccc tgacccagcg cctgggcgag 1440

ctgacccagc aggtggctca gctgcaggcg gagacgcggg ccgcggttgc cacggtgaaa 1500

accaaataaa aaatgaatca ataaataaac ggagacggtt gttgatttta acacagagtc 1560

ttgaatcttt atttgatttt tcgcgcgcgg taggccctgg accaccggtc tcgatcattg 1620

agcacccggt ggatcttttc caggacccgg tagaggtggg cttggatgtt gaggtacatg 1680

ggcatgagcc cgtcccgggg gtggaggtag ctccattgca gggcctcgtg ctcggggatg 1740

gtgttgtaaa tcacccagtc atagcagggg cgcagggcgt ggtgctgcac gatgtccttg 1800

aggaggagac tgatggccac gggcagcccc ttggtgtagg tgttgacgaa cctgttgagc 1860

tgggagggat gcatgcgggg ggagatgaga tgcatcttgg cctggatctt gagattggcg 1920

atgttcccgc ccagatcccg ccgggggttc atgttgtgca ggaccaccag cacggtgtat 1980

ccggtgcact tggggaattt gtcatgcaac ttggaaggga aggcgtgaaa gaatttggag 2040

acgcccttgt gaccgcccag gttttccatg cactcatcca tgatgatggc gatgggcccg 2100

tgggcggcgg cctgggcaaa gacgtttcgg gggtcggaca catcgtagtt gtggtcctgg 2160

gtgagctcgt cataggccat tttaatgaat ttggggcgga gggtgcccga ctgggggacg 2220

aaggtgccct cgatcccggg ggcgtagttg ccctcgcaga tctgcatctc ccaggccttg 2280

agctcggagg gggggatcat gtccacctgc ggggcgatga aaaaaacggt ttccggggcg 2340

ggggagatga gctgggccga aagcaggttc cggagcagct gggacttgcc gcaaccggtg 2400

gggccgtaga tgaccccgat gaccggctgc aggtggtagt tgagggagag acagctgccg 2460

tcctcgcgga ggaggggggc cacctcgttc atcatctcgc gcacatgcat gttctcgcgc 2520

acgagttccg ccaggaggcg ctcgcccccc agcgagagga gctcttgcag cgaggcgaag 2580

tttttcagcg gcttgagtcc gtcggccatg ggcattttgg agagggtctg ttgcaagagt 2640

tccagacggt cccagagctc ggtgatgtgc tctagggcat ctcgatccag cagacctcct 2700

cgtttcgcgg gttggggcga ctgcgggagt agggcaccag gcgatgggcg tccagcgagg 2760

ccagggtccg gtccttccag ggccgcaggg tccgcgtcag cgtggtctcc gtcacggtga 2820

aggggtgcgc gccgggctgg gcgcttgcga gggtgcgctt caggctcatc cggctggtcg 2880

agaaccgctc ccggtcggcg ccctgcgcgt cggccaggta gcaattgagc atgagttcgt 2940

agttgagcgc ctcggccgcg tggcccttgg cgcggagctt acctttggaa gtgtgtccgc 3000

agacgggaca gaggagggac ttgagggcgt agagcttggg ggcgaggaag acggactcgg 3060

gggcgtaggc gtccgcgccg cagctggcgc agacggtctc gcactccacg agccaggtga 3120

ggtcggggcg gttggggtca aaaacgaggt ttcctccgtg ctttttgatg cgtttcttac 3180

ctctggtctc catgagctcg tgtccccgct gggtgacaaa gaggctgtcc gtgtccccgt 3240

agaccgactt tatgggccgg tcctcgagcg gggtgccgcg gtcctcgtcg tagaggaacc 3300

ccgcccactc cgagacgaag gcccgggtcc aggccagcac gaaggaggcc acgtgggagg 3360

ggtagcggtc gttgtccacc agcgggtcca ccttctccag ggtatgcaag cacatgtccc 3420

cctcgtccac atccaggaag gtgattggct tgtaagtgta ggccacgtga ccgggggtcc 3480

cggccggggg ggtataaaag ggggcgggcc cctgctcgtc ctcactgtct tccggatcgc 3540

tgtccaggag cgccagctgt tggggtaggt attccctctc gaaggcgggc atgacctcgg 3600

cactcaggtt gtcagtttct agaaacgagg aggatttgat attgacggtg ccgttggaga 3660

cgcctttcat gagcccctcg tccatttggt cagaaaagac gatctttttg ttgtcgagct 3720

tggtggcgaa ggagccgtag agggcgttgg agagcagctt ggcgatggag cgcatggtct 3780

ggttcttttc cttgtcggcg cgctccttgg cggcgatgtt gagctgcacg tactcgcgcg 3840

ccacgcactt ccattcgggg aagacggtgg tgagctcgtc gggcacgatt ctgacccgcc 3900

agccgcggtt gtgcagggtg atgaggtcca cgctggtggc cacctcgccg cgcaggggct 3960

cgttggtcca gcagaggcgc ccgcccttgc gcgagcagaa ggggggcagc gggtccagca 4020

tgagctcgtc gggggggtcg gcgtccacgg tgaagatgcc gggcaggagc tcggggtcga 4080

agtagctgat gcaggtgccc agattgtcca gcgccgcttg ccagtcgcgc acggccagcg 4140

cgcgctcgta ggggctgagg ggcgtgcccc agggcatggg gtgcgtgagc gcggaggcgt 4200

acatgccgca gatgtcgtag acgtagaggg gctcctcgag gacgccgatg taggtggggt 4260

agcagcgccc cccgcggatg ctggcgcgca cgtagtcgta cagctcgtgc gagggcgcga 4320

ggagccccgt gccgaggttg gagcgttgcg gcttttcggc gcggtagacg atctggcgga 4380

agatggcgtg ggagttggag gagatggtgg gcctttggaa gatgttgaag tgggcgtggg 4440

gcaggccgac cgagtccctg atgaagtggg cgtaggagtc ctgcagcttg gcgacgagct 4500

cggcggtgac gaggacgtcc agggcgcagt agtcgagggt ctcttggatg atgtcatact 4560

tgagctggcc cttctgcttc cacagctcgc ggttgagaag gaactcttcg cggtccttcc 4620

agtactcttc gagggggaac ccgtcctgat cggcacggta agagcccacc atgtagaact 4680

ggttgacggc cttgtaggcg cagcagccct tctccacggg gagggcgtaa gcttgcgcgg 4740

ccttgcgcag ggaggtgtgg gtgagggcga aggtgtcgcg caccatgacc ttgaggaact 4800

ggtgcttgaa gtcgaggtcg tcgcagccgc cctgctccca gagttggaag tccgtgcgct 4860

tcttgtaggc ggggttaggc aaagcgaaag taacatcgtt gaagaggatc ttgcccgcgc 4920

ggggcatgaa gttgcgagtg atgcggaaag gctggggcac ctcggcccgg ttgttgatga 4980

cctgggcggc gaggacgatc tcgtcgaagc cgttgatgtt gtgcccgacg atgtagagtt 5040

ccacgaatcg cgggcggccc ttgacgtggg gcagcttctt gagctcgtcg taggtgagct 5100

cggcggggtc gctgagcccg tgctgctcga gggcccagtc ggcgacgtgg gggttggcgc 5160

tgaggaagga agtccagaga tccacggcca gggcggtctg caagcggtcc cggtactgac 5220

ggaactgttg gcccacggcc attttttcgg gggtgacgca gtagaaggtg cgggggtcgc 5280

cgtgccagcg gtcccacttg agctggaggg cgaggtcgtg ggcgagctcg acgagcggcg 5340

ggtccccgga gagtttcatg accagcatga aggggacgag ctgcttgccg aaggacccca 5400

tccaggtgta ggtttccaca tcgtaggtga ggaagagcct ttcggtgcga ggatgcgagc 5460

cgatggggaa gaactggatc tcctgccacc agttggagga atggctgttg atgtgatgga 5520

agtagaaatg ccgacggcgc gccgagcact cgtgcttgtg tttatacaag cgtccgcagt 5580

gctcgcaacg ctgcacggga tgcacgtgct gcacgagctg tacctgggtt cctttggcga 5640

ggaatttcag tgggcagtgg agcgctggcg gctgcatctc gtgctgtact acgtcttggc 5700

catcggcgtg gccatcgtct gcctcgatgg tggtcatgct gacgagcccg cgcgggaggc 5760

aggtccagac ctcggctcgg acgggtcgga gagcgaggac gagggcgcgc aggccggagc 5820

tgtccagggt cctgagacgc tgcggagtca ggtcagtggg cagcggcggc gcgcggttga 5880

cttgcaggag cttttccagg gcgcgcggga ggtccagatg gtacttgatc tccacggcgc 5940

cgttggtggc tacgtccacg gcttgcaggg tgccgtgccc ctggggcgcc accaccgtgc 6000

cccgtttctt cttgggcgct gcttccatgt cggtcagaag cggcggcgag gacgcgcgcc 6060

gggcggcagg ggcggctcgg ggcccggagg caggggcggc aggggcacgt cggcgccgcg 6120

cgcgggcagg ttctggtact gcgcccggag aagactggcg tgagcgacga cgcgacggtt 6180

gacgtcctgg atctgacgcc tctgggtgaa ggccacggga cccgtgagtt tgaacctgaa 6240

agagagttcg acagaatcaa tctcggtatc gttgacggcg gcctgccgca ggatctcttg 6300

cacgtcgccc gagttgtcct ggtaggcgat ctcggtcatg aactgctcga tctcctcctc 6360

ctgaaggtct ccgcggccgg cgcgctcgac ggtggccgcg aggtcgttgg agatgcggcc 6420

catgagctgc gagaaggcgt tcatgccggc ctcgttccag acgcggctgt agaccacggc 6480

tccgtcgggg tcgcgcgcgc gcatgaccac ctgggcgagg ttgagctcga cgtggcgcgt 6540

gaagaccgcg tagttgcaga ggcgctggta gaggtagttg agcgtggtgg cgatgtgctc 6600

ggtgacgaag aagtacatga tccagcggcg gagcggcatc tcgctgacgt cgcccagggc 6660

ttccaagcgt tccatggcct cgtagaagtc cacggcgaag ttgaaaaact gggagttgcg 6720

cgccgagacg gtcaactcct cctccagaag acggatgagc tcggcgatgg tggcgcgcac 6780

ctcgcgctcg aaggccccgg ggggctcctc ttccatctcc tcctcttcct cctccactaa 6840

catctcttct acttcctcct caggaggcgg tggcggggga ggggccctgc gtcgccggcg 6900

gcgcacgggc agacggtcga tgaagcgctc gatggtctcc ccgcgccggc gacgcatggt 6960

ctcggtgacg gcgcgcccgt cctcgcgggg ccgcagcatg aagacgccgc cgcgcatctc 7020

caggtggccg ccgggggggt ctccgttggg cagggagagg gcgctgacga tgcatcttat 7080

caattgaccc gtagggactc cgcgcaagga cctgagcgtc tcgagatcca cgggatccga 7140

aaaccgctga acgaaggctt cgagccagtc gcagtcgcaa ggtaggctga gcccggtttc 7200

ttgttcttcg ggtatttggt cgggaggcgg gcgggcgatg ctgctggtga tgaagttgaa 7260

gtaggcggtc ctgagacggc ggatggtggc gaggagcacc aggtccttgg gcccggcttg 7320

ctggatgcgc agacggtcgg ccatgcccca ggcgtggtcc tgacacctgg cgaggtcctt 7380

gtagtagtcc tgcatgagcc gctccacggg cacctcctcc tcgcccgcgc ggccgtgcat 7440

gcgcgtgagc ccgaacccgc gctgcggctg gacgagcgcc aggtcggcga cgacgcgctc 7500

ggtgaggatg gcctgctgga tctgggtgag ggtggtctgg aagtcgtcga agtcgacgaa 7560

gcggtggtag gctccggtgt tgatggtgta ggagcagttg gccatgacgg accagttgac 7620

ggtctggtgg ccgggtcgca cgagctcgtg gtacttgagg cgcgagtagg cgcgcgtgtc 7680

gaagatgtag tcgttgcagg cgcgcacgag gtactggtat ccgacgagga agtgcggcgg 7740

cggctggcgg tagagcggcc atcgctcggt ggcgggggcg ccgggcgcga ggtcctcgag 7800

catgaggcgg tggtagccgt agatgtacct ggacatccag gtgatgccgg cggcggtggt 7860

ggaggcgcgc gggaactcgc ggacgcggtt ccagatgttg cgcagcggca ggaagtagtt 7920

catggtggcc gcggtctggc ccgtgaggcg cgcgcagtcg tggatgctct agacatacgg 7980

gcaaaaacga aagcggtcag cggctcgact ccgtggcctg gaggctaagc gaacgggttg 8040

ggctgcgcgt gtaccccggt tcgaatctcg aatcaggctg gagccgcagc taacgtggta 8100

ctggcactcc cgtctcgacc caagcctgct aacgaaacct ccaggatacg gaggcgggtc 8160

gttttttggc cttggtcgct ggtcatgaaa aactagtaag cgcggaaagc ggccgcccgc 8220

gatggctcgc tgccgtagtc tggagaaaga atcgccaggg ttgcgttgcg gtgtgccccg 8280

gttcgagcct cagcgctcgg cgccggccgg attccgcggc taacgtgggc gtggctgccc 8340

cgtcgtttcc aagacccctt agccagccga cttctccagt tacggagcga gcccctcttt 8400

ttttttcttg tgtttttgcc agatgcatcc cgtactgcgg cagatgcgcc cccaccctcc 8460

accacaaccg cccctaccgc agcagcagca acagccggcg cttctgcccc cgccccagca 8520

gcagccagcc actaccgcgg cggccgccgt gagcggagcc ggcgttcagt atgacctggc 8580

cttggaagag ggcgaggggc tggcgcggct gggggcgtcg tcgccggagc ggcacccgcg 8640

cgtgcagatg aaaagggacg ctcgcgaggc ctacgtgccc aagcagaacc tgttcagaga 8700

caggagcggc gaggagcccg aggagatgcg cgcctcccgc ttccacgcgg ggcgggagct 8760

gcggcgcggc ctggaccgaa agcgggtgct gagggacgag gatttcgagg cggacgagct 8820

gacggggatc agccccgcgc gcgcgcacgt ggccgcggcc aacctggtca cggcgtacga 8880

gcagaccgtg aaggaggaga gcaacttcca aaaatccttc aacaaccacg tgcgcacgct 8940

gatcgcgcgc gaggaggtga ccctgggcct gatgcacctg tgggacctgc tggaggccat 9000

cgtgcagaac cccacgagca agccgctgac ggcgcagctg tttctggtgg tgcagcacag 9060

tcgggacaac gagacgttca gggaggcgct gctgaatatc accgagcccg agggccgctg 9120

gctcctggac ctggtgaaca ttttgcagag catcgtggtg caggagcgcg ggctgccgct 9180

gtccgagaag ctggcggcca tcaacttctc ggtgctgagt ctgggcaagt actacgctag 9240

gaagatctac aagaccccgt acgtgcccat agacaaggag gtgaagatcg acgggtttta 9300

catgcgcatg accctgaaag tgctgaccct gagcgacgat ctgggggtgt accgcaacga 9360

caggatgcac cgcgcggtga gcgccagccg ccggcgcgag ctgagcgacc aggagctgat 9420

gcacagcctg cagcgggccc tgaccggggc cgggaccgag ggggagagct actttgacat 9480

gggcgcggac ctgcgctggc agcccagccg ccgggccttg gaagctgccg gcggttcccc 9540

ctacgtggag gaggtggacg atgaggagga ggagggcgag tacctggaag actgatggcg 9600

cgaccgtatt tttgctagat gcagcaacag ccaccgccgc cgcctcctga tcccgcgatg 9660

cgggcggcgc tgcagagcca gccgtccggc attaactcct cggacgattg gacccaggcc 9720

atgcaacgca tcatggcgct gacgacccgc aatcccgaag cctttagaca gcagcctcag 9780

gccaaccggc tctcggccat cctggaggcc gtggtgccct cgcgctcgaa ccccacgcac 9840

gagaaggtgc tggccatcgt gaacgcgctg gtggagaaca aggccatccg cggtgacgag 9900

gccgggctgg tgtacaacgc gctgctggag cgcgtggccc gctacaacag caccaacgtg 9960

cagacgaacc tggaccgcat ggtgaccgac gtgcgcgagg cggtgtcgca gcgcgagcgg 10020

ttccaccgcg agtcgaacct gggctccatg gtggcgctga acgccttcct gagcacgcag 10080

cccgccaacg tgccccgggg ccaggaggac tacaccaact tcatcagcgc gctgcggctg 10140

atggtggccg aggtgcccca gagcgaggtg taccagtcgg ggccggacta cttcttccag 10200

accagtcgcc agggcttgca gaccgtgaac ctgagccagg ctttcaagaa cttgcaggga 10260

ctgtggggcg tgcaggcccc ggtcggggac cgcgcgacgg tgtcgagcct gctgacgccg 10320

aactcgcgcc tgctgctgct gctggtggcg cccttcacgg acagcggcag cgtgagccgc 10380

gactcgtacc tgggctacct gcttaacctg taccgcgagg ccatcggaca ggcgcacgtg 10440

gacgagcaga cctaccagga gatcacccac gtgagccgcg cgctgggcca ggaggacccg 10500

ggcaacctgg aggccaccct gaacttcctg ctgaccaacc ggtcgcagaa gatcccgccc 10560

cagtacgcgc tgagcaccga ggaggagcgc atcctgcgct acgtgcagca gagcgtgggg 10620

ctgttcctga tgcaggaggg ggccacgccc agcgcggcgc tcgacatgac cgcgcgcaac 10680

atggagccca gcatgtacgc ccgcaaccgc ccgttcatca ataagctgat ggactacttg 10740

catcgggcgg ccgccatgaa ctcggactac tttaccaacg ccatcttgaa cccgcactgg 10800

ctcccgccgc ccgggttcta cacgggcgag tacgacatgc ccgaccccaa cgacgggttc 10860

ctgtgggacg acgtggacag cagcgtgttc tcgccgcgtc caggaaccaa tgccgtgtgg 10920

aagaaagagg gcggggaccg gcggccgtcc tcggcgctgt ccggtcgcgc gggtgctgcc 10980

gcggcggtgc ccgaggccgc cagccccttc ccgagcctgc ccttttcgct gaacagcgtg 11040

cgcagcagcg agctgggtcg gctgacgcga ccgcgcctgc tgggcgagga ggagtacctg 11100

aacgactcct tgttgaggcc cgagcgcgag aagaacttcc ccaataacgg gatagagagc 11160

ctggtggaca agatgagccg ctggaagacg tacgcgcacg agcacaggga cgagccccga 11220

gctagcagcg caggcacccg tagacgccag cggcacgaca ggcagcgggg actggtgtgg 11280

gacgatgagg attccgccga cgacagcagc gtgttggact tgggtgggag tggtggtaac 11340

ccgttcgctc acctgcgccc ccgtatcggg cgcctgatgt aagaatctga aaaaataaaa 11400

gacggtactc accaaggcca tggcgaccag cgtgcgttct tctctgttgt ttgtagtagt 11460

atgatgaggc gcgtgtaccc ggagggtcct cctccctcgt acgagagcgt gatgcagcag 11520

gcggtggcgg cggcgatgca gcccccgctg gaggcgcctt acgtgccccc gcggtacctg 11580

gcgcctacgg aggggcggaa cagcattcgt tactcggagc tggcaccctt gtacgatacc 11640

acccggttgt acctggtgga caacaagtcg gcagacatcg cctcgctgaa ctaccagaac 11700

gaccacagca acttcctgac caccgtggtg cagaacaacg atttcacccc cacggaggcc 11760

agcacccaga ccatcaactt tgacgagcgc tcgcggtggg gcggccagct gaaaaccatc 11820

atgcacacca acatgcccaa cgtgaacgag ttcatgtaca gcaacaagtt caaggcgcgg 11880

gtgatggtct cgcgcaagac ccccaacggg gtggatgatg attatgatgg tagtcaggac 11940

gagctgacct acgagtgggt ggagtttgag ctgcccgagg gcaacttctc ggtgaccatg 12000

accatcgatc tgatgaacaa cgccatcatc gacaactact tggcggtggg gcggcagaac 12060

ggggtgctgg agagcgacat cggcgtgaag ttcgacacgc gcaacttccg gctgggctgg 12120

gaccccgtga ccgagctggt gatgccgggc gtgtacacca acgaggcctt ccaccccgac 12180

atcgtcctgc tgcccggctg cggcgtggac ttcaccgaga gccgcctcag caacctgctg 12240

ggcatccgca agcggcagcc cttccaggag ggcttccaga tcctgtacga ggacctggag 12300

gggggcaaca tccccgcgct cttggatgtc gaagcctacg agaaaagcaa ggaggatagc 12360

accgccgcgg cgaccgcagc cgtggccacc gcctctaccg aggtgcgggg cgataatttt 12420

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gtggagaagg acagcaagga caggagctac aacgtgctcg cggacaagaa aaacaccgcc 12540

taccgcagct ggtacctggc ctacaactac ggcgaccccg agaagggcgt gcgctcctgg 12600

acgctgctca ccacctcgga cgtcacctgc ggcgtggagc aagtctactg gtcgctgccc 12660

gacatgatgc aagacccggt caccttccgc tccacgcgtc aagttagcaa ctacccggtg 12720

gtgggcgccg agctcctgcc cgtctactcc aagagcttct tcaacgagca ggccgtctac 12780

tcgcagcagc tgcgcgcctt cacctcgctc acgcacgtct tcaaccgctt ccccgagaac 12840

cagatcctcg tccgcccgcc cgcgcccacc attaccaccg tcagtgaaaa cgttcctgct 12900

ctcacagatc acgggaccct gccgctgcgc agcagtatcc ggggagtcca gcgcgtgacc 12960

gtcactgacg ccagacgccg cacctgcccc tacgtctaca aggccctggg cgtagtcgcg 13020

ccgcgcgtcc tctcgagccg caccttctaa aaaatgtcca ttctcatctc gcccagtaat 13080

aacaccggtt ggggcctgcg cgcgcccagc aagatgtacg gaggcgctcg ccaacgctcc 13140

acgcaacacc ccgtgcgcgt gcgcgggcac ttccgcgctc cctggggcgc cctcaagggc 13200

cgcgtgcgct cgcgcaccac cgtcgacgac gtgatcgacc aggtggtggc cgacgcgcgc 13260

aactacacgc ccgccgccgc gcccgtctcc accgtggacg ccgtcatcga cagcgtggtg 13320

gccgacgcgc gccggtacgc ccgcaccaag agccggcggc ggcgcatcgc ccggcggcac 13380

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cgcagggcca tgctcagggc ggccagacgc gcggcctccg gcagcagcag cgccggcagg 13500

acccgcagac gcgcggccac ggcggcggcg gcggccatcg ccagcatgtc ccgcccgcgg 13560

cgcggcaacg tgtactgggt gcgcgacgcc gccaccggtg tgcgcgtgcc cgtgcgcacc 13620

cgcccccctc gcacttgaag atgctgactt cgcgatgttg atgtgtccca gcggcgagga 13680

ggatgtccaa gcgcaaatac aaggaagaga tgctccaggt catcgcgcct gagatctacg 13740

gccccgcggc ggcggtgaag gaggaaagaa agccccgcaa actgaagcgg gtcaaaaagg 13800

acaaaaagga ggaggaagat gacggactgg tggagtttgt gcgcgagttc gccccccggc 13860

ggcgcgtgca gtggcgcggg cggaaagtga aaccggtgct gcggcccggc accacggtgg 13920

tcttcacgcc cggcgagcgt tccggctccg cctccaagcg ctcctacgac gaggtgtacg 13980

gggacgagga catcctcgag caggcggtcg agcgtctggg cgagtttgcg tacggcaagc 14040

gcagccgccc cgcgcccttg aaagaggagg cggtgtccat cccgctggac cacggcaacc 14100

ccacgccgag cctgaagccg gtgaccctgc agcaggtgct accgagcgcg gcgccgcgcc 14160

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agcgccagaa gctggaggac gtgctggagc acatgaaggt ggaccccgag gtgcagcccg 14280

aggtcaaggt gcggcccatc aagcaggtgg ccccgggcct gggcgtgcag accgtggaca 14340

tcaagatccc cacggagccc atggaaacgc agaccgagcc cgtgaagccc agcaccagca 14400

ccatggaggt gcagacggat ccctggatgc cagcaccagc ttccaccagc actcgccgaa 14460

gacgcaagta cggcgcggcc agcctgctga tgcccaacta cgcgctgcat ccttccatca 14520

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gcaagaccac cacccgccgc cgtcgtcgca gccgccgcag cagcaccgcg acttccgcct 14640

tggtgcggag agtgtatcgc agcgggcgcg agcctctgac cctgccgcgc gcgcgctacc 14700

acccgagcat cgccatttaa ctaccgcctc ctacttgcag atatggccct cacatgccgc 14760

ctccgcgtcc ccattacggg ctaccgagga agaaagccgc gccgtagaag gctgacgggg 14820

aacgggctgc gtcgccatca ccaccggcgg cggcgcgcca tcagcaagcg gttgggggga 14880

ggcttcctgc ccgcgctgat ccccatcatc gccgcggcga tcggggcgat ccccggcata 14940

gcttccgtgg cggtgcaggc ctctcagcgc cactgagaca caaaaaagca tggatttgta 15000

ataaaaaaaa aaatggactg acgctcctgg tcctgtgatg tgtgttttta gatggaagac 15060

atcaattttt cgtccctggc accgcgacac ggcacgcggc cgtttatggg cacctggagc 15120

gacatcggca acagccaact gaacgggggc gccttcaatt ggagcagtct ctggagcggg 15180

cttaagaatt tcgggtccac gctcaaaacc tatggcaaca aggcgtggaa cagcagcaca 15240

gggcaggcgc tgagggaaaa gctgaaagaa cagaacttcc agcagaaggt ggttgatggc 15300

ctggcctcag gcatcaacgg ggtggttgac ctggccaacc aggccgtgca gaaacagatc 15360

aacagccgcc tggacgcggt cccgcccgcg gggtccgtgg agatgcccca ggtggaggag 15420

gagctgcctc ccctggacaa gcgcggcgac aagcgaccgc gtcccgacgc ggaggagacg 15480

ctgctgacgc acacggacga gccgcccccg tacgaggagg cggtgaaact gggcctgccc 15540

accacgcggc ccgtggcgcc tctggccacc ggagtgctga aacccagcag cagccagccc 15600

gcgaccctgg acttgcctcc gcctcgcccc tccacagtgg ctaagcccct gccgccggtg 15660

gccgtcgcgt cgcgcgcccc ccgaggccgc ccccaggcga actggcagag cactctgaac 15720

agcatcgtgg gtctgggagt gcagagtgtg aagcgccgcc gctgctatta aaagacactg 15780

tagcgcttaa cttgcttgtc tgtgtgtata tgtatgtccg ccgaccagaa ggaggagtgt 15840

gaagaggcgc gtcgccgagt tgcaagatgg ccaccccatc gatgctgccc cagtgggcgt 15900

acatgcacat cgccggacag gacgcttcgg agtacctgag tccgggtctg gtgcagttcg 15960

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ccacgcacga tgtgaccacc gaccgcagcc agcggctgac gctgcgcttc gtgcccgtgg 16080

accgcgagga caacacctac tcgtacaaag tgcgctacac gctggccgtg ggcgacaacc 16140

gcgtgctgga catggccagc acctactttg acatccgcgg cgtgctggac cggggcccta 16200

gcttcaaacc ctactctggc accgcctaca acagcctagc tcccaaggga gctcccaatt 16260

ccagccagtg ggagcaagca aaaacaggca atgggggaac tatggaaaca cacacatatg 16320

gtgtggcccc aatgggcgga gagaatatta caaaagatgg tcttcaaatt ggaactgacg 16380

ttacagcgaa tcagaataaa ccaatttatg ccgacaaaac atttcaacca gaaccgcaag 16440

taggagaaga aaattggcaa gaaactgaaa acttttatgg cggtagagct cttaaaaaag 16500

acacaaacat gaaaccttgc tatggctcct atgctagacc caccaatgaa aaaggaggtc 16560

aagctaaact taaagttgga gatgatggag ttccaaccaa agaattcgac atagacctgg 16620

ctttctttga tactcccggt ggcaccgtga acggtcaaga cgagtataaa gcagacattg 16680

tcatgtatac cgaaaacacg tatttggaaa ctccagacac gcatgtggta tacaaaccag 16740

gcaaggatga tgcaagttct gaaattaacc tggttcagca gtctatgccc aacagaccca 16800

actacattgg gttcagggac aactttatcg gtcttatgta ctacaacagc actggcaata 16860

tgggtgtgct tgctggtcag gcctcccagc tgaatgctgt ggttgatttg caagacagaa 16920

acaccgagct gtcctaccag ctcttgcttg actctttggg tgacagaacc cggtatttca 16980

gtatgtggaa ccaggcggtg gacagttatg accccgatgt gcgcatcatc gaaaaccatg 17040

gtgtggagga tgaattgcca aactattgct tccccttgga cggctctggc actaacgccg 17100

cataccaagg tgtgaaagta aaagatggtc aagatggtga tgttgagagt gaatgggaaa 17160

atgacgatac tgttgcagct cgaaatcaat tatgtaaagg taacattttc gccatggaga 17220

ttaatctcca ggctaacctg tggagaagtt tcctctactc gaacgtggcc ctgtacctgc 17280

ccgactccta caagtacacg ccgaccaacg tcacgctgcc gaccaacacc aacacctacg 17340

attacatgaa tggcagagtg acacctccct cgctggtaga cgcctacctc aacatcgggg 17400

cgcgctggtc gctggacccc atggacaacg tcaacccctt caaccaccac cgcaacgcgg 17460

gcctgcgcta ccgctccatg ctcctgggca acgggcgcta cgtgcccttc cacatccagg 17520

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agtggaactt ccgcaaggac gtcaacatga tcctgcagag ctccctaggc aacgacctgc 17640

gcacggacgg ggcctccatc gccttcacca gcatcaacct ctacgccacc ttcttcccca 17700

tggcgcacaa caccgcctcc acgctcgagg ccatgctgcg caacgacacc aacgaccagt 17760

ccttcaacga ctacctctcg gcggccaaca tgctctaccc catcccggcc aacgccacca 17820

acgtgcccat ctccatcccc tcgcgcaact gggccgcctt ccgcggatgg tccttcacgc 17880

gcctgaagac ccgcgagacg ccctcgctcg gctccgggtt cgacccctac ttcgtctact 17940

cgggctccat cccctaccta gacggcacct tctacctcaa ccacaccttc aagaaggtct 18000

ccatcacctt cgactcctcc gtcagctggc ccggcaacga ccgcctcctg acgcccaacg 18060

agttcgaaat caagcgcacc gtcgacggag agggatacaa cgtggcccag tgcaacatga 18120

ccaaggactg gttcctggtc cagatgctgg cccactacaa catcggctac cagggcttct 18180

acgtgcccga gggctacaag gaccgcatgt actccttctt ccgcaacttc cagcccatga 18240

gccgccaggt cgtggacgag gtcaactaca aggactacca ggccgtcacc ctggcctacc 18300

agcacaacaa ctcgggcttc gtcggctacc tcgcgcccac catgcgccag ggccagccct 18360

accccgccaa ctacccctac ccgctcatcg gcaagagcgc cgtcgccagc gtcacccaga 18420

aaaagttcct ctgcgaccgg gtcatgtggc gcatcccctt ctccagcaac ttcatgtcca 18480

tgggcgcgct caccgacctc ggccagaaca tgctctacgc caactccgcc cacgcgctag 18540

acatgaattt cgaagtcgac cccatggatg agtccaccct tctctatgtt gtcttcgaag 18600

tcttcgacgt cgtccgagtg caccagcccc accgcggcgt catcgaagcc gtctacctgc 18660

gcacgccctt ctcggccggc aacgccacca cctaagccgc tcttgcttct tgcaagatga 18720

cggcgggctc cggcgagcag gagctcaggg ccatcctccg cgacctgggc tgcgggccct 18780

gcttcctggg caccttcgac aagcgcttcc ctggattcat ggccccgcac aagctggcct 18840

gcgccatcgt gaacacggcc ggccgcgaga ccgggggcga gcactggctg gccttcgcct 18900

ggaacccgcg ctcccacaca tgctacctct tcgacccctt cgggttctcg gacgagcgcc 18960

tcaagcagat ctaccagttc gagtacgagg gcctgctgcg tcgcagcgcc ctggccaccg 19020

aggaccgctg cgtcaccctg gaaaagtcca cccagaccgt gcagggtccg cgctcggccg 19080

cctgcgggct cttctgctgc atgttcctgc acgccttcgt gcactggccc gaccgcccca 19140

tggacaagaa ccccaccatg aacttactga cgggggtgcc caacggcatg ctccagtcgc 19200

cccaggtgga acccaccctg cgccgcaacc aggaagcgct ctaccgcttc ctcaatgccc 19260

actccgccta ctttcgctcc caccgcgcgc gcatcgagaa ggccaccgcc ttcgaccgca 19320

tgaatcaaga catgtaaaaa accggtgtgt gtatgtgaat gctttattca taataaacag 19380

cacatgttta tgccaccttc tctgaggctc tgactttatt tagaaatcga aggggttctg 19440

ccggctctcg gcatggcccg cgggcaggga tacgttgcgg aactggtact tgggcagcca 19500

cttgaactcg gggatcagca gcttgggcac ggggaggtcg gggaacgagt cgctccacag 19560

cttgcgcgtg agttgcaggg cgcccagcag gtcgggcgcg gagatcttga aatcgcagtt 19620

gggacccgcg ttctgcgcgc gagagttgcg gtacacgggg ttgcagcact ggaacaccat 19680

cagggccggg tgcttcacgc ttgccagcac cgtcgcgtcg gtgatgccct ccacgtccag 19740

atcctcggcg ttggccatcc cgaagggggt catcttgcag gtctgccgcc ccatgctggg 19800

cacgcagccg ggcttgtggt tgcaatcgca gtgcaggggg atcagcatca tctgggcctg 19860

ctcggagctc atgcccgggt acatggcctt catgaaagcc tccagctggc ggaaggcctg 19920

ctgcgccttg ccgccctcgg tgaagaagac cccgcaggac ttgctagaga actggttggt 19980

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gcgcccccag cggttctggg tgatcttggc ccggttgggg ttctccttca gcgcgcgctg 20100

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gtgcaggcac cgcagcttgc cctcggcttc ggtgcagccg tgcagccaca gcgcgcagcc 20220

ggtgcactcc cagttcttgt gggcgatctg ggagtgcgag tgcacgaagc cctgcaggaa 20280

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ctcctcgttc acatacaggt ggcagatgcg gcggtacacc tcgccctgct cgggcatcag 20400

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ttccatgccc ttctcccagg ccgaaacgat cggcaggctc agggggttct tcaccgccat 20520

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tcgcttgccg tccttctcga tgatgcgcac ggggggaaag ctgaagccca cggccgccag 20640

ctcctcctcg gcctgccttt cgtcctcgct gtcctggctg atgtcttgca aaggcacatg 20700

cttggtcttg cggggtttct ttttgggcgg cagaggcggc ggcgatgtgc tgggagagcg 20760

cgagttctcg ttcaccacga ctatttcttc ttcttggccg tcgtccgaga ccacgcggcg 20820

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gctggcagag ccccttccgc gttcgggggt gcgctcctgg cggcgctgct ctgactgact 20940

tcctccgcgg ccggccattg tgttctccta gggagcaaca acaagcatgg agactcagcc 21000

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tgaaagctta accgccccgc cgcccagccc cacctccgac gccgcggccc cagacatgca 21120

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ggagctggca gcgcgctttt cagccccgga agagaaccac caagagcagc cagagcagga 21240

agcagagaac gagcagaacc aggctgggca cgagcatggc gactacctga gcggggcaga 21300

ggacgtgctc atcaagcatc tggcccgcca atgcatcatc gtcaaggacg cgctgctcga 21360

ccgcgccgag gtgcccctca gcgtggcgga gctcagccgc gcctacgagc gcaacctctt 21420

ctcgccgcgc gtgcccccca agcgccagcc caacggcacc tgtgagccca acccgcgcct 21480

caacttctac ccggtcttcg cggtgcccga ggccctggcc acctaccacc tctttttcaa 21540

gaaccaaagg atccccgtct cctgccgcgc caaccgcacc cgcgccgacg ccctgctcaa 21600

cctgggcccc ggcgcccgcc tacctgatat cacctccttg gaagaggttc ccaagatctt 21660

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gcatgagcac cacagcgccc tggtggagtt ggaaggcgac aacgcgcgcc tggcggtcct 21780

caagcgcacg gtcgagctga cccacttcgc ctacccggcg ctcaacctgc cccccaaggt 21840

catgagcgcc gtcatggacc aggtgctcat caagcgcgcc tcgcccctct cggaggagga 21900

gatgcaggac cccgagagtt cggacgaggg caagcccgtg gtcagcgacg agcagctggc 21960

gcgctggctg ggagcgagta gcacccccca gagcctggaa gagcggcgca agctcatgat 22020

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gaccctgcgc aaggtcgagg agaacctgca ctacctcttc aggcacgggt tcgtgcgcca 22140

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cgagaaccgc ctggggcaaa acgtgctgca caccaccctg cgcggggagg cccgccgcga 22260

ctacatccgc gactgcgtct acctgtacct ctgccacacc tggcagacgg gcatgggcgt 22320

gtggcagcag tgcctggagg agcagaacct gaaagagctc tgcaagctcc tgcagaagaa 22380

cctcaaggcc ctgtggaccg ggttcgacga gcgtaccacc gcctcggacc tggccgacct 22440

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ctgctccgcg ctgccctcgg acttcgtgcc gctgaccttc cgcgagtgcc ccccgccgct 22620

ctggagccac tgctacttgc tgcgcctggc caactacctg gcctaccact cggacgtgat 22680

cgaggacgtc agcggcgagg gtctgctgga gtgccactgc cgctgcaacc tctgcacgcc 22740

gcaccgctcc ctggcctgca acccccagct gctgagcgag acccagatca tcggcacctt 22800

cgagttgcaa ggccccggcg acggcgaggg caaggggggt ctgaaactca ccccggggct 22860

gtggacctcg gcctacttgc gcaagttcgt gcccgaggac taccatccct tcgagatcag 22920

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cagaggaaga agcagccgcc gccagaccgt cgtcctcggc ggagaaagca agcagcacgg 23340

ataccatctc cgctccgggt cggggtcgcg gcggccgggc ccacagtagg tgggacgaga 23400

ccgggcgctt cccgaacccc accacccaga ccggtaagaa ggagcggcag ggatacaagt 23460

cctggcgggg gcacaaaaac gccatcgtct cctgcttgca agcctgcggg ggcaacatct 23520

ccttcacccg gcgctacctg ctcttccacc gcggggtgaa cttcccccgc aacatcttgc 23580

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agcagcagaa aaccagcggc agcagcagct agaaaatcca cagcggcggc aggtggactg 23700

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ctctatgcca tcttccagca gagtcggggg caggagcagg aactgaaagt caagaaccgt 23820

tctctgcgct cgctcacccg cagttgtctg tatcacaaga gcgaagacca acttcagcgc 23880

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cgaccatcat gagcaaagag attcccacgc cttacatgtg gagctaccag ccccagatgg 24060

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ccgcgatgat ctcacgggtg aatgacatcc gcgcccaccg aaaccagata ctcctagaac 24180

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tggtgtacca ggaaattccc cagcccacga ccgtactact tccgcgagac gcccaggccg 24300

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gccccgctca gggtataaag cggctggtga tccgaggcag aggcacacag ctcaacgacg 24420

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ccatcagcga gtcggtggac ggctacgatt gaatgtccca tggtggcgca gctgacctag 24720

ctcggcttcg acacctggac cactgccgcc gcttccgctg cttcgctcgg gatctcgccg 24780

agtttgccta ctttgagctg cccgaggagc accctcaggg cccagcccac ggagtgcgga 24840

tcatcgtcga agggggcctc gactcccacc tgcttcggat cttcagccag cgaccgatcc 24900

tggtcgagcg cgaacaagga cagacccttc ttactttgta ctgcatctgc aaccaccccg 24960

gcctgcatga aagtctttgt tgtctgctgt gtactgagta taataaaagc tgagatcagc 25020

gactactccg gactcgattg tggtgttcct gctatcaacc ggtccctgtt cttcaccggg 25080

aacgagaccg agctccagct ccagtgtaag ccccacaaga agtacctcac ctggctgttc 25140

cagggctccc cgatcgccgt tgtcaaccac tgcgacaacg acggagtcct gctgagcggc 25200

cctgccaacc ttactttttc cacccgcaga agcaagctcc agctcttcca acccttcctc 25260

cccgggacct atcagtgcgt ctcaggaccc tgccatcaca ccttccacct gatcccgaat 25320

accacagcgc cgctccccgc tactaacaac caaactaccc accaacgcca ccgtcgcgac 25380

ctttcctctg aatctaatac cactaccgga ggtgagctcc gaggtcgacc aacctctggg 25440

atttactacg gcccctggga ggtggtgggg ttaatagcaa ataaaaaaaa taatcatttg 25500

atttgaaata aagatacaat catattgatg atttgagttt aacaaaaata aagaatcact 25560

tacttgaaat ctgataccag gtctctgtcc atgttttctg ccaacaccac ctcactcccc 25620

tcttcccagc tctggtactg caggccccgg cgggctgcaa acttcctcca cacgctgaag 25680

gggatgtcaa attcctcctg tccctcaatc ttcattttat cttctatcag atgtccaaaa 25740

agcgcgtccg ggtggatgat gacttcgacc ccgtctaccc ctacgatgca gacaacgcac 25800

cgaccgtgcc cttcatcaac ccccccttcg tctcttcaga tggattccaa gagaagcccc 25860

tgggggtgtt gtccctgcga ctggctgacc ccgtcaccac caagaacggg gaaatcaccc 25920

tcaagctggg agagggggtg gacctcgact cgtcgggaaa actcatctcc aacacggcca 25980

ccaaggccgc cgcccctctc agtatttcaa acaacaccat ttcccttaaa actgctgccc 26040

ctttctacaa caacaatgga actttaagcc tcaatgtctc cacaccatta gcagtatttc 26100

ccacatttaa cactttaggc ataagtcttg gaaacggtct tcagacttca aataagttgt 26160

tgactgtaca actaactcat cctcttacat tcagctcaaa tagcatcaca gtaaaaacag 26220

acaaagggct atatattaac tccagtggaa acagaggact tgaggctaat ataagcctaa 26280

aaagaggact agtttttgac ggtaatgcta ttgcaacata tattggaaat ggcttagact 26340

atggatctta tgatagtgat ggaaaaacaa gacccgtaat taccaaaatt ggagcaggat 26400

taaattttga tgctaacaaa gcaatagctg tcaaactagg cacaggttta agttttgact 26460

ccgctggtgc cttgacagct ggaaacaaac aggatgacaa gctaacactt tggactaccc 26520

ctgacccaag ccctaattgt caattacttt cagacagaga tgccaaattt actctctgtc 26580

ttacaaaatg cggtagtcaa atactaggca ctgtggcagt ggcggctgtt actgtaggat 26640

cagcactaaa tccaattaat gacacagtca aaagcgccat agttttcctt agatttgatt 26700

ccgatggtgt actcatgtca aactcatcaa tggtaggtga ttactggaac tttagggagg 26760

gacagaccac tcaaagtgta gcctatacaa atgctgtggg attcatgcca aatataggtg 26820

catatccaaa aacccaaagt aaaacaccta aaaatagcat agtcagtcag gtatatttaa 26880

ctggagaaac tactatgcca atgacactaa ccataacttt caatggcact gatgaaaaag 26940

acacaacccc agttagcacc tactctatga cttttacatg gcagtggact ggagactata 27000

aggacaaaaa tattaccttt gctaccaact cattctcttt ttcctacatc gcccaggaat 27060

aatcccaccc agcaagccaa ccccttttcc caccaccttt gtctatatgg aaactctgaa 27120

acagaaaaat aaagttcaag tgttttattg aatcaacagt tttacaggac tcgagcagtt 27180

atttttcctc caccctccca ggacatggaa tacaccaccc tctccccccg cacagccttg 27240

aacatctgaa tgccattggt gatggacatg cttttggtct ccacgttcca cacagtttca 27300

gagcgagcca gtctcggatc ggtcagggag atgaaaccct ccgggcactc ccgcatctgc 27360

acctcacagc tcaacagctg aggattgtcc tcggtggtcg ggatcacgga cacacagagt 27420

acacagtcct ttctccccgg ctggccttaa aaagcatcat atcatgggta acagacatat 27480

tcttaggtgt tatattccac acggtttcct gtcgagccaa acgctcatca gtgatattaa 27540

taaactcccc gggcagctca cttaagttca tgtcgctgtc cagctgctga gccacaggct 27600

gctgtccaac ttgcggttgc ttaacgggcg gcgaaggaga agtccacgcc tacatggggg 27660

tagagtcata atcgtgcatc aggatagggc ggtggtgctg cagcagcgcg cgaataaact 27720

gctgccgccg ccgctccgtc ctgcaggaat acaacatggc agtggtctcc tcagcgatga 27780

ttcgcaccgc ccgcagcata aggcgccttg tcctccgggc acagcagcgc accctgatct 27840

cacttaaatc agcacagtaa ctgcagcaca gcaccacaat attgttcaaa atcccacagt 27900

gcaaggcgct gtatccaaag ctcatggcgg ggaccacaga acccacgtgg ccatcatacc 27960

acaagcgcag gtagattaag tggcgacccc tcataaacac gctggacata aacattacct 28020

cttttggcat gttgtaattc accacctccc ggtaccatat aaacctctga ttaaacatgg 28080

cgccatccac caccatccta aaccagctgg ccaaaacctg cccgccggct atacactgca 28140

gggaaccggg actggaacaa tgacagtgga gagcccagga ctcgtaacca tggatcatca 28200

tgctcgtcat gatatcaatg ttggcacaac acaggcacac gtgcatacac ttcctcagga 28260

ttacaagctc ctcccgcgtt agaaccatat cccagggaac aacccattcc tgaatcagcg 28320

taaatcccac actgcaggga agacctcgca cgtaactcac gttgtgcatt gtcaaagtgt 28380

tacattcggg cagcagcgga tgatcctcca gtatggtagc gcgggtttct gtctcaaaag 28440

gaggtagacg atccctactg tacggagtgc gccgagacaa ccgagatcgt gttggtcgta 28500

gtgtcatgcc aaatggaacg ccggacgtag tcatatttcc tgaagcaaaa ccaggtgcgg 28560

gcgtgacaaa cagatctgcg tctccggtct cgccgcttag atcgctctgt gtagtagttg 28620

tagtatatcc actctctcaa agcatccagg cgccccctgg cttcgggttc tatgtaaact 28680

ccttcatgcg ccgctgccct gataacatcc accaccgcag aataagccac acccagccaa 28740

cctacacatt cgttctgcga gtcacacacg ggaggagcgg gaagagctgg aagaaccatg 28800

tttttttttt tattccaaaa gattatccaa aacctcaaaa tgaagatcta ttaagtgaac 28860

gcgctcccct ccggtggcgt ggtcaaactc tacagccaaa gaacagataa tggcatttgt 28920

aagatgttgc acaatggctt ccaaaaggca aacggccctc acgtccaagt ggacgtaaag 28980

gctaaaccct tcagggtgaa tctcctctat aaacattcca gcaccttcaa ccatgcccaa 29040

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gattgcaaaa attcaggttc ctcacagacc tgtataagat tcaaaagcgg aacattaaca 29220

aaaataccgc gatcccgtag gtcccttcgc agggccagct gaacataatc gtgcaggtct 29280

gcacggacca gcgcggccac ttccccgcca ggaaccatga caaaagaacc cacactgatt 29340

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ggcggcgata taaaatgcaa ggtgctgctc aaaaaatcag gcaaagcctc gcgcaaaaaa 29460

gaaagcacat cgtagtcatg ctcatgcaga taaaggcagg taagctccgg aaccaccaca 29520

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taagcataag acggactacg gccatgccgg cgtgaccgta aaaaaactgg tcaccgtgat 29700

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taggagagaa aaacacataa acacctgaaa aaccctcctg cctaggcaaa atagcaccct 29940

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ccgctctctg ctcaatatat agccccagat ctacactgac gtaaaggcca aagtctaaaa 30120

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aaaatacgcg cacttcctca aacggccaaa ctgccgtcat ttccgggttc ccacgctacg 30240

tcatcaaaac acgactttca aattccgtcg accgttaaaa acatcacccg ccccgcccct 30300

aacggtcgcc gctcccgcag ccaatcacct tcctccctcc ccaaattcaa acagctcatt 30360

tgcatattaa cgcgcaccaa aagtttgagg tatattattg atgatg 30406

Claims (9)

1.一种重组腺病毒表达载体，其特征在于，以野生型腺病毒SAd23的全基因组为基础，通过直接克隆方法，删除E1编码区和E3编码区，在E1删除区插入I-Ceu I和PI-Sce I酶切位点，同时以腺病毒人血清型5型（Ad5）的E4编码区替换SAd23的E4编码区，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。

2.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的删除E1编码区是指删除野生型腺病毒SAd23的基因组中第492-3022位的碱基序列。

3.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的删除E3编码区是指删除野生型腺病毒SAd23的基因组中第27895-31909位的碱基序列。

4.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的SAd23的E4编码区是指野生型腺病毒SAd23的基因组中第33841-36181位的碱基序列。

5.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述的Ad5的E4编码区是指人血清型腺病毒Ad5基因组中第33193-35526位的碱基序列。

6.如权利要求1所述的表达载体，其特征在于，表达载体的酶切位点I-Ceu I和PI-SceI之间，还包括外源的抗原基因。

7.如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述的外源抗原是寨卡病毒的包膜蛋白抗原。

8.如权利要求1所述的重组腺病毒表达载体，其特征在于，所述重组腺病毒表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5所示。

9.一种制备疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括：

S1.提供权利要求1所述的重组腺病毒表达载体；

S2.将外源的抗原编码基因插入到S1表达载体的酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I之间；

S3.将S2的重组表达载体转染细胞，病毒在细胞内包装，从而获得具有免疫原性的疫苗。