KR20200066349A - 복제 가능 아데노바이러스 벡터 - Google Patents

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버지니아 아멘돌라
스테파노 콜로카
알레산드라 비텔리
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글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이.
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Abstract

복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터가 외인성 면역원의 전달을 위해 제공된다. 본 발명의 벡터는 외인성 면역원의 우수한 복제 및 발현을 입증한다. 이들은 유전자 요법에서뿐만 아니라 예방 및 치료 백신으로서도 유용하다.

Description

복제 가능 아데노바이러스 벡터
서열 목록
본 출원은 아스키(ASCII) 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하고, 그 전문이 본원에 참고로 포함되었다. 2018 년 9 월 28 일에 생성된 상기 아스키 사본은 VU66430_WO_SL.txt로 명명되고, 그 크기가 100,598 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 재조합 아데노바이러스 분야에 관한 것이다. 이는 단리된 복제 가능 아데노바이러스 벡터, 재조합 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터 및 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 서열을 포함하는 조성물을 제공한다.
발명의 배경
인간 아데노바이러스는 이들의 큰 트랜스진(transgene) 용량 및 다양한 표적 조직에서 고도로 효율적인 유전자 전달을 달성하는 능력으로 인해 유전자 전달 응용에 널리 사용되고 있다. 재조합 아데노바이러스는 유전자 요법에서 및 백신으로서 유용하다. 원숭이 아데노바이러스를 기반으로 하는 바이러스 벡터는 핵산 기반 백신의 개발을 위한 인간 유래 아데노바이러스 벡터의 사용에 대한 대안을 제공할 수 있다.
대부분의 인간은 인간 아데노바이러스에 노출되고 이에 면역을 발생시킨다. 분자를 표적에 효과적으로 전달하고, 인간 아데노바이러스 혈청형에 대한 기존 면역의 효과를 최소화하는 벡터가 요구된다. 이와 관련하여 원숭이 아데노바이러스는 효과적이고; 이들은 인간 바이러스와 충분히 밀접하게 관련되어서, 인간이 기존 면역을 거의 또는 전혀 갖지 않는 전달된 외인성 항원에 대한 면역을 유도하는 데 효과적이다.
복제 결함 아데노바이러스는 그들의 게놈(genome)을 세포의 내부로 전달하고, 이들이 복제하지 않기 때문에 트랜스진 페이로드(payload)를 증폭시키지 않는다. 전형적으로, E1 유전자는 선택된 프로모터 및 관심 유전자 또는 유전자들에 상응하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스진 카세트(cassette)로 대체되어 복제 결함 재조합 바이러스를 초래한다.
복제 결함 아데노바이러스와 달리, 복제 가능 아데노바이러스는 이들의 DNA 및 이들의 트랜스진을 복제하여, 이들의 트랜스진 발현을 훨씬 더 큰 정도로 증폭시킨다. 복제 가능 아데노바이러스는 더 큰 효능의 잠재력을 갖지만, 이들은 가족 구성원 또는 의료 서비스 종사자로의 확산 및 감염 위험을 제기한다. 잠재적 안전성 문제에도 불구하고, 호흡기 질환에 대해 면역화하기 위해 복제 가능 인간 아데노바이러스가 성공적으로 사용되어 왔다. 수십만 명의 미군 신병은 장용성 코팅된 캡슐 또는 정제로서 제제화된 전바이러스(whole virus) 인간 Ad4, Ad7 및 Ad21의 약독화되지 않은 생(live, non-attenuated) 단리물로 급성 호흡기 질환(Acute Respiratory Disease)에 대해 효과적이고 안전하게 백신 접종되었다 (Cancer Gene Therapy (2004) 11:819).
인간 및 개 복제 가능 벡터가 기재되었지만 (Vaccine (2002) 20:3485), 어떠한 원숭이 복제 가능 아데노바이러스 벡터도 아직 질환의 예방 또는 치료를 위해 면역원 또는 치료제를 전달할 수 있는 것으로 밝혀지지 않았다. 이러한 벡터는 강한 복제 가능 벡터의 이점과 원숭이 아데노바이러스의 이점을 겸비할 것이다. 또한, 원숭이 벡터는 인간 세포에서 복제하는 능력을 갖는 반면, 이들은 원숭이 세포에서보다 잘 복제하지 못하고, 따라서 그들의 효능은 원숭이에서와 비교하여 약독화된다. 따라서, 당업계에서는 강한 복제 및 인간에서 기존 면역이 없는 이점들을 겸비한 벡터에 대한 요구가 존재한다.
본 발명의 요약
본 발명의 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터는 복제 결함 원숭이 아데노바이러스 벡터보다 더 강한 유전자-기반 백신 반응을 생성한다. 본 발명의 벡터는 인간 면역화에 적합한 안전성 프로파일(profile)을 유지하면서 개선된 생체내 효능을 제공하도록 최적화되었다. 이들은 강하고 지속적인 트랜스진 발현을 유도할 수 있는 본질적으로 강한 면역조절 백본(backbone) 및 프로모터를 갖는다. 본 발명의 복제 가능 벡터는 치료 및 제조 공정에서의 사용 방법, 대상체에서 면역 반응의 유도를 위한 면역원성 조성물의 성분으로서 유용하다.
본 발명은 프로모터 및 트랜스진을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터를 제공하며, 여기서 발현 카세트는 벡터의 E3 영역, HE1 부위 또는 HE2 부위에 삽입된다.
본 발명은 또한 병원체에 의해 야기되는 질환에 대한 면역 반응을 이를 필요로 하는 대상체에서 유도하기 위해 상기 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터를 사용하는 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 원숭이는 침팬지이다. 벡터는 ChAd155 또는 ChAd83일 수 있다.
복제 가능 침팬지 아데노바이러스는 침팬지 아데노바이러스 섬유 폴리펩티드 또는 그의 기능적 유도체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 침팬지 아데노바이러스 E4 영역을 추가로 포함할 수 있다.
프로모터는 CASI 프로모터 및 증강된 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 프로모터로부터 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 발현 카세트는 전사후 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 전사후 조절 요소는 우드척 간염(Woodchuck Hepatitis) 전사후 조절 요소이다.
트랜스진은 항원일 수 있다. 항원은 광견병 바이러스 항원, 호흡기 세포융합 바이러스 항원, 인간 면역결핍 바이러스 항원, 결핵 항원, 말라리아 항원, C형 간염 바이러스 항원, 치쿤군야(Chikungunya) 항원 및 B형 간염 바이러스 항원으로부터 선택될 수 있다.
도면의 설명
도 1: 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 구축물. 반전 말단 반복부(ITR)는 3' 및 5' 말단에 플랭킹(flank)되고; E1은 초기 유전자 1이고; CMV는 시토메갈로바이러스 프로모터이고; CASI는 CASI 프로모터이고, RG는 모델 항원이고, WPRE는 우드척 간염 전사후 조절 요소이고, ΔE3은 초기 유전자 3이 결실된 것을 나타내고; 섬유는 섬유 단백질을 코딩하는 아데노바이러스 유전자를 나타내고, E4는 초기 유전자 4이다.
아데노바이러스 게놈의 E3 영역의 위치에 트랜스진 발현 카세트를 삽입함으로써 ("RC1") (상부 패널), HE1 영역에, 즉 섬유 유전자의 종결 코돈과 E4 영역 사이에 트랜스진 발현 카세트를 삽입함으로써 (중앙 패널), 또는 HE2 영역에, 즉 우측 ITR의 하류에 트랜스진 발현 카세트를 삽입함으로써 ("RC2") (하부 패널) 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터를 구축하였다.
도 2: 1 차 인간 세포주에서 RC1 및 RC2 벡터를 발현하는 복제 가능 ChAd155 및 ChAd83의 생산. 막대는 세포당 발현된 바이러스 입자 수를 나타낸다.
도 3: 1 차 인간 세포주에서 RC1 및 RC2 벡터를 발현하는 복제 가능 ChAd155 및 ChAd83의 총 바이러스 게놈 카피 수(copy number). 막대는 세포당 벡터 게놈 카피 수를 나타낸다.
도 4: 250 및 1250의 감염다중도(multiplicity of infection)에서 1 차 인간 세포주에 의한 ChAd155 복제 결함(RD) 및 복제 가능(RC1 및 RC2) 벡터의 발현 수준. 벡터는 웨스턴 블롯(Western blot)에 의해 입증되는 광견병 당단백질 트랜스진 (51 kDa)을 발현한다. 좌측 패널은 감염 후 2 일에 발현을 나타내고, 우측 패널은 감염 후 7 일에 발현을 나타낸다.
도 5: 250 및 1250의 감염다중도에서 1 차 인간 세포주에 의한 ChAd83 복제 결함(RD) 및 복제 가능(RC1 및 RC2) 벡터의 발현 수준. 벡터는 웨스턴 블롯에 의해 입증되는 광견병 당단백질 트랜스진 (51 kDa)을 발현한다. 상부 패널은 감염 후 2 일에 발현을 나타내고, 하부 패널은 감염 후 7 일에 발현을 나타낸다.
도 6: 쥐 세포주 NMuLi에서 (상부 패널) 및 베로(Vero) 비-인간 영장류 세포주에서 (하부 패널) 복제 가능 ChAd155 RC1 및 RC2와 RC1 및 RC2 벡터를 발현하는 ChAd83의 바이러스 게놈 카피 수. 50 및 250의 감염다중도에서 세포를 감염시켰다.
도 7: 감염 후 2 및 5 일에 웨스턴 블롯에 의해 입증된, 쥐 세포주에서 모델 광견병 당단백질(RG) 트랜스진을 발현하는 ChAd155 RC1 및 RC2 벡터의 발현 수준의 비교 (상부 패널). 감염 후 2 및 5 일에 웨스턴 블롯에 의해 입증된, 쥐 세포주에서 모델 광견병 당단백질(RG) 트랜스진을 발현하는 ChAd155 RC1 및 RC2 벡터와 ChAd83 RC1 및 RC2 벡터의 발현 수준의 비교 (하부 패널). 50, 250 및 1250의 감염다중도에서 세포를 감염시켰다.
도 8: 마우스에서 모델 단백질 트랜스진을 발현하고, IFN-감마 ELISpot에 의해 측정되고, 106 개 비장세포당 스팟 형성 세포(spot forming cell)로서 표현되는 ChAd155 복제 결함(RD), ChAd155 RC1 및 ChAd83 RC1 벡터의 면역원성.
도 9: 마우스에서 모델 광견병 당단백질 단백질 트랜스진을 발현하는 ChAd155 RD 및 ChAd155 RC1의 경구 및 근육내(IM) 전달에 대한 중화 항체 (상부 패널) 및 T 세포 (하부 패널) 반응. 상부 패널은 형광 항체 바이러스 중화 검정(FAVN)으로 측정된, 광견병 감염에 대한 중화 항체 보호를 나타낸다. 점선은 보호의 역치를 나타낸다. 하부 패널은 인터페론 감마 ELISpot 검정에 의해 측정된, 광견병 특이적 T 세포 반응을 나타낸다.
서열의 주석
서열 1 - 야생형 ChAd155를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열
서열 2 - 야생형 ChAd83을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열
서열 3 - CASI 프로모터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열
서열 4 - 증강된 hCMV 프로모터를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열
발명의 상세한 설명
아데노바이러스
아데노바이러스는 대략 36 kb의 선형 이중 가닥 DNA 게놈을 갖는 비외피성 이십면체 바이러스이다. 아데노바이러스는 숙주 세포의 게놈 내로 통합되지 않으면서 분열 및 비분열 세포 모두를 포함하여 여러 포유동물 종의 수많은 세포 유형을 형질도입할 수 있다. 이들은 이들의 입증된 안전성, 다양한 표적 조직에서 고도로 효율적인 유전자 전달을 달성하는 능력, 및 큰 트랜스진 용량으로 인해 유전자 전달 응용을 위해 널리 사용되고 있다. 인간 아데노바이러스 벡터는 유전자 요법 및 백신에 현재 사용되지만, 통상적인 인간 아데노바이러스에 대한 이전의 노출 후에, 기존 면역의 전세계적으로 높은 유병률이라는 단점을 갖는다.
아데노바이러스는 다수의 다른 미량 단백질, VI, VIII, IX, IIIa 및 IVa2와 함께 3 개의 주요 단백질, 헥손 (II), 펜톤 염기 (III) 및 노브(knobbed) 섬유 (IV)를 포함하는 이십면체 캡시드(capsid)를 갖는 특징적인 형태를 갖는다. 헥손은 캡시드의 구조적 성분 대부분을 차지하며, 이는 240 개의 삼량체 헥손 캡소머(capsomer) 및 12 개의 펜톤 염기로 구성된다. 헥손은 3 개의 보존 이중 배럴(conserved double barrel)을 갖고, 상부는 3 개의 타워를 갖고, 각각의 타워는 대부분의 캡시드를 형성하는 각각의 서브유닛으로부터 루프(loop)를 함유한다. 헥손의 염기는 아데노바이러스 혈청형 사이에서 고도로 보존되고, 반면에 표면 루프는 가변적이다. 펜톤은 또 다른 아데노바이러스 캡시드 단백질이고; 섬유가 부착되는 오량체 염기를 형성한다. 삼량체 섬유 단백질은 캡시드의 각각의 12 개의 정점에서 펜톤 염기로부터 돌출되고, 노브 막대형 구조이다. 섬유 단백질의 주요 역할은 노브 영역의 세포 수용체와의 상호작용을 통해 세포 표면에 바이러스 캡시드를 테더링하는 것이다. 섬유의 노브 영역뿐만 아니라 연질 샤프트(shaft)에서의 변이는 상이한 아데노바이러스 혈청형의 특징이다.
아데노바이러스 게놈은 잘 특징지어져 있다. 선형 이중 가닥 DNA는 고도로 염기성인 단백질 VII 및 소형 펩티드 pX (또한 뮤(mu)로 지칭됨)와 연관된다. 또 다른 단백질 V는 이러한 DNA-단백질 복합체로 패키징되고, 단백질 VI을 통해 캡시드에 구조적 연결을 제공한다. 특이적 개방 판독 프레임이 유사하게 위치하는 것, 예를 들어 각각의 바이러스의 E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, L2, L3, L4 및 L5 유전자의 위치와 관련하여 아데노바이러스 게놈의 전체적인 구조에 있어서 일반적인 보존이 있다. 아데노바이러스 게놈의 각각의 말단부는 반전 말단 반복부(ITR)로서 공지된 서열을 포함하며, 이는 바이러스 복제를 위해 필요하다. 아데노바이러스 게놈의 5' 말단은 패키징 및 복제를 위해 필요한 5' 시스-요소를 함유하고; 즉 5' ITR 서열 (복제 기점으로서 기능할 수 있음) 및 E1 프로모터에 대한 선형 아데노바이러스 게놈 및 인핸서(enhancer) 요소를 패키징하기 위해 필요한 서열을 함유하는 천연(native) 5' 패키징 인핸서 도메인이다. 아데노바이러스 게놈의 3' 말단은, ITR을 포함하여, 패키징 및 캡시드화(encapsidation)를 위해 필요한 3' 시스-요소를 포함한다. 바이러스는 바이러스-코딩 프로테아제를 또한 포함하고, 이는 감염성 비리온을 생산하는 데 필요한 구조 단백질의 일부를 가공하는 데 필요하다.
아데노바이러스 게놈의 구조는 바이러스 유전자가 숙주 세포 형질도입 후에 발현되는 순서를 기반으로 기재된다. 보다 구체적으로, 바이러스 유전자는, DNA 복제의 개시 이전 또는 이후에 전사가 일어나는지에 따라 초기 (E) 또는 후기 (L) 유전자로 지칭된다. 형질도입의 초기 단계에서, 아데노바이러스의 E1A, E1B, E2A, E2B, E3 및 E4 유전자를 발현시켜 바이러스 복제를 위한 숙주 세포를 제조한다. E1 유전자는 마스터 스위치로 간주되고, 이는 전사 활성화제로서 작용하고, 초기 및 후기 유전자 전사 모두에 관여한다. E2는 DNA 복제에 관여하고; E3은 면역 조절에 관여하고, E4는 바이러스 mRNA 대사를 조절한다. 감염의 후기 단계 동안, 바이러스 입자의 구조적 성분을 코딩하는 후기 유전자 L1-L5의 발현이 활성화된다. 교호 스플라이싱(alternative splicing)을 갖는 주요 후기 프로모터(MLP)로부터 후기 유전자를 전사하였다.
아데노바이러스 캡시드 단백질 및 이들의 코딩 폴리뉴클레오티드
상기 요약된 바와 같이, 아데노바이러스 캡시드는 3 개의 주요 단백질, 헥손, 펜톤 및 섬유를 포함한다. 헥손은 캡시드의 구조적 성분 대부분을 차지하며, 이는 240 개의 삼량체 헥손 캡소머 및 12 개의 펜톤 염기로 구성된다. 헥손은 3 개의 보존 이중 배럴을 갖고, 상부는 3 개의 타워를 갖고, 각각의 타워는 대부분의 캡시드를 형성하는 각각의 서브유닛으로부터 루프를 함유한다. 헥손의 염기는 아데노바이러스 혈청형 사이에서 고도로 보존되고, 반면에 표면 루프는 가변적이다.
펜톤은 섬유가 부착되는 오량체 염기를 형성하는 또 다른 아데노바이러스 캡시드 단백질이다. 삼량체 섬유 단백질은 캡시드의 각각의 12 개의 정점에서 펜톤 염기로부터 돌출되고, 노브 막대형 구조이다. 대부분의 다른 이십면체 바이러스의 것과 비교하여 아데노바이러스 캡시드의 표면에서 현저한 차이는 긴 얇은 섬유 단백질의 존재이다. 섬유 단백질의 주요 역할은 세포 수용체와의 상호작용을 통해 세포 표면에 바이러스 캡시드를 테더링하는 것이다.
많은 아데노바이러스 혈청형의 섬유 단백질은 공통적인 구조를 공유한다: N-말단 꼬리, 반복 서열로 제조된 중심 샤프트, 및 C-말단 구형 노브 도메인 (또는 "헤드"). 중심 샤프트 도메인은 가변적인 수의 베타-반복부로 구성된다. 베타-반복부는 연결되어 고도로 경질이고 안정한 3 개의 꼬인 나선형 가닥의 신장된 구조를 형성한다. 샤프트는 구형 노브 구조와 N-말단 꼬리를 연결하고, 이는 표적 세포 수용체와의 상호작용을 담당한다. 아데노바이러스 노브 도메인의 구형 성질은 측면에 및 첨단에 수용체를 결합시키기 위한 큰 표면을 제시한다. 이와 같은 구조의 효과는 바이러스 캡시드로부터 멀리 수용체-결합 부위를 위치시켜, 상대적으로 평평한 캡시드 표면에 의해 제시되는 입체적 제약으로부터 바이러스를 자유롭게 하는 것이다.
많은 아데노바이러스 혈청형의 섬유가 동일한 전체적인 구조를 갖지만, 이들은 이들의 구조뿐만 아니라 기능에 영향을 미치는 가변 아미노산 서열을 갖는다. 예를 들어, 섬유 노브의 표면 상의 많은 노출 영역은 쉽게 적응 가능한 수용체 결합 부위를 제시한다. 섬유 노브의 구형 형상은 수용체가 노브의 측면에 또는 섬유 노브의 상부에 결합할 수 있게 한다. 이들 결합 부위는 전형적으로 인간 아데노바이러스 사이에 잘 보존되지 않은 베타-가닥을 연결하는 표면-노출 루프에 놓인다. 이들 루프 상의 노출된 측쇄(side chain)는 3 차 및 4 차 구조를 보존하면서 다양한 표면 특징부를 노브에 제공한다. 예를 들어, 노브 표면에서의 정전기 전위 및 전하 분포는 섬유 노브 서열에서의 등전점의 넓은 범위로 인해 변할 수 있고, 아데노바이러스 "Ad" 8, Ad 19, 및 Ad 37에서 대략 9의 pI부터 하위군 B 아데노바이러스에서 대략 5의 pI로 변한다. 구조적으로 복잡한 바이러스 리간드로서, 섬유 단백질은 바이러스 캡시드로부터 다수의 배향 및 거리 (샤프트)의 다양한 결합 표면 (노브)을 제시하게 할 수 있다.
일부 혈청형 사이의 가장 명백한 변이 중 하나는 섬유 길이이다. 연구는 섬유 샤프트의 길이가 노브 및 바이러스와 그의 표적 수용체의 상호작용에 강하게 영향을 미친다는 것을 보여 주었다. 또한, 혈청형 사이의 섬유 단백질은 또한 구부러지는 이들의 능력에서 다양할 수 있다. 샤프트 내의 베타-반복부는 고도로 안정하고 규칙적인 구조를 형성하지만, 전자 현미경(EM) 연구는 섬유 내의 구분되는 힌지(hinge)를 보여 주었다. 여러 아데노바이러스 혈청형 섬유로부터의 단백질 서열의 분석은 N-말단 꼬리로부터 제 3 베타-반복부에서 샤프트의 반복 서열에서의 파괴를 정확히 보여주고, 이는 EM에 의해 보이는 바와 같이 샤프트 내 힌지 중 하나와 강하게 상호관련된다. 섬유 내 힌지는 노브가 바이러스 캡시드에 비해 다양한 배향을 채택하게 하고, 이는 노브 상의 수용체 결합 부위의 올바른 제시를 필요로 하는 수용체 맞물림에 입체 장애를 회피할 수 있다. 예를 들어, 하위군 D 아데노바이러스의 경질 섬유는 그 자체가 구부러질 수 없기 때문에 연질 수용체 또는 바이러스 부착을 위해 미리 위치한(prepositioned) 것을 필요로 한다.
상이한 Ad 혈청형에 대한 특이적 세포 수용체의 확인 및 이들이 어떻게 조직 굴성에 기여하는지에 대한 지식은 섬유 슈도타이핑(pseudotyping) 기술의 사용을 통해 달성되었다. 일부 하위군의 Ad가 1 차 수용체로서 콕사키바이러스(Coxsackievirus) 및 아데노바이러스 수용체("CAR")를 사용하지만, 많은 Ad가 대안적인 1 차 수용체를 사용하여 시험관내 및 생체내에서 매우 상이한 굴성을 초래한다는 것이 명백해지고 있다. 이들 혈청형의 섬유는 섬유 노브 내의 순 전하 차이와 함께, 이들의 1 차 및 3 차 구조, 예컨대 섬유 샤프트 경도, 섬유 샤프트의 길이, 및 CAR 결합 부위 및/또는 추정 HSPG 결합 모티프의 결여에서 명백한 차이를 나타낸다. 따라서, 대안적 섬유 샤프트 및 노브를 갖는 Ad 5 입자의 슈도타이핑은 중요한 세포 결합 도메인을 제거할 기회를 제공하고, 추가로, Ad 5에 의해 달성된 것과 비교하여 정의된 세포 유형으로 더 효율적인 (및 잠재적으로 더 세포-선택적인) 트랜스진 전달을 허용할 수 있다. 인간 또는 실험 모델에서 더 낮은 혈청 유병률을 갖는 Ad로부터의 섬유가 사용되면, 섬유-슈도타이핑된 Ad 입자의 중화는 또한 감소할 수 있고, 이는 벡터의 성공적인 투여에 호의적인 상황이다. 또한, 단리된 섬유 노브 영역뿐만 아니라, 전장 섬유는, 헥손 또는 펜톤 단독으로는 아니지만, 수지상 세포 성숙을 유도할 수 있고, 강한 CD8+ T 세포 반응의 유도와 연관된다. 종합하면, 아데노바이러스 섬유 단백질은 적어도 아데노바이러스 벡터의 수용체-결합 및 면역원성에서 중요한 역할을 한다.
아데노바이러스 복제
역사적으로, 아데노바이러스 백신 개발은 결함, 비-복제 벡터에 초점을 맞추었다. 이들은 복제에 필수적인 E1 영역 유전자의 결실에 의해 복제 결함이 된다. 전형적으로, 비-필수적 E3 영역 유전자는 또한 외인성 트랜스진에 대한 공간을 만들기 위해 결실된다. 이어서 외인성 프로모터의 제어하에 트랜스진을 포함하는 발현 카세트를 삽입한다. 이어서, 이들 복제-결함 바이러스는 E1-보완 세포에서 생산된다.
용어 "복제-결함" 또는 "복제-불가능" 아데노바이러스는, 적어도 기능적 결실 (또는 "기능-의-손실" 돌연변이), 즉, 유전자를 완전히 제거하지 않고 그의 기능을 손상시키는 결실 또는 돌연변이, 예를 들어, 인공 종결 코돈의 도입, 활성 부위 또는 상호작용 도메인의 결실 또는 돌연변이, 유전자 등의 조절 서열의 돌연변이 또는 결실, 또는 바이러스 복제에 필수적인 유전자 생산물을 코딩하는 유전자, 예컨대, E1A, E1B, E2A, E2B, E3 및 E4 (예컨대, E3 ORF1, E3 ORF2, E3 ORF3, E3 ORF4, E3 ORF5, E3 ORF6, E3 ORF7, E3 ORF8, E3 ORF9, E4 ORF7, E4 ORF6, E4 ORF4, E4 ORF3, E4 ORF2, 및/또는 E4 ORF1)로부터 선택되는 하나 이상의 아데노바이러스 유전자의 완전한 제거를 포함하도록 조작되었기 때문에, 복제가 불가능한 아데노바이러스를 지칭한다. 적합하게는, E1 및 임의로 E3 및/또는 E4가 결실된다. 결실된 경우, 또 다른 서열에 대해 동일성 백분율을 결정할 때 상기 언급된 결실된 유전자 영역이 정렬에서 적합하게 고려되지 않을 것이다.
용어 "복제-가능" 아데노바이러스는 세포 내에 포함된 임의의 재조합 헬퍼(helper) 단백질의 부재하에 숙주 세포에서 복제될 수 있는 아데노바이러스를 지칭한다. 적합하게는, "복제-가능" 아데노바이러스는 온전한 구조 유전자 및 하기의 온전한 또는 기능적 필수 초기 유전자: E1A, E1B, E2A, E2B 및 E4를 포함한다. 특정 동물로부터 단리된 야생형 아데노바이러스는 그 동물에서 복제 가능일 것이다.
본 발명의 벡터
비-인간 원숭이 아데노바이러스를 기반으로 하는 바이러스 벡터는 유전자 요법 및 유전자 백신을 위한 인간 유래 벡터의 사용에 대한 대안을 나타낸다. 인간 기원의 세포에서의 이들의 효율적인 증식에 의해 입증되는 바와 같이, 비-인간 원숭이로부터 단리된 특정 아데노바이러스는 인간으로부터 단리된 아데노바이러스와 밀접하게 관련된다. 인간은 원숭이 아데노바이러스에 대한 면역성이 거의 또는 전혀 발생하지 않기 때문에, 이들은 인간 아데노바이러스 사용에 대한 개선된 대안을 제공하는 것이 가능하다.
용어 "벡터"는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드, 또는 적어도 하나의 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입할 수 있는 적어도 하나의 폴리펩티드의 혼합물을 지칭한다. "낮은 혈청 유병률"은 인간 아데노바이러스 5(Ad5)와 비교하여 감소된 기존 중화 항체 수준을 갖는 것을 의미할 수 있다. 유사하게 또는 대안적으로, "낮은 혈청 유병률"은 약 35 % 미만의 혈청 유병률, 약 30 % 미만의 혈청 유병률, 약 20 % 미만의 혈청 유병률, 약 15 % 미만의 혈청 유병률, 약 10 % 미만의 혈청 유병률, 약 5 % 미만의 혈청 유병률, 약 4 % 미만의 혈청 유병률, 약 3 % 미만의 혈청 유병률, 약 2 % 미만의 혈청 유병률, 약 1 % 미만의 혈청 유병률, 또는 검출 불가능한 혈청 유병률을 의미할 수 있다. 혈청 유병률은 문헌 [Hum. Gene Ther. (2004) 15:293]에 기재된 것과 같은 방법을 사용함으로써 임상적으로 관련 있는 중화 역가(50 % 중화 역가 >200으로서 정의됨)를 갖는 개체의 백분율로서 측정될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 아데노바이러스 벡터는 "원숭이 아데노바이러스"라고도 지칭되는 비인간 원숭이 아데노바이러스로부터 유래된다. 수많은 아데노바이러스는 비인간 원숭이, 예컨대 침팬지, 보노보, 레서스 마카크(rhesus macaques), 오랑우탄 및 고릴라로부터 단리된다. 이들 아데노바이러스로부터 유래된 벡터는 이들 벡터에 의해 코딩되는 트랜스진에 대한 강한 면역 반응을 유도할 수 있다. 비인간 원숭이 아데노바이러스를 기반으로 하는 벡터의 특정 이점은 인간 표적 집단에서 이들 아데노바이러스에 대한 교차-중화 항체의 상대적인 결여를 포함하고, 따라서 이들의 사용은 인간 아데노바이러스에 대한 기존 면역을 극복한다. 예를 들어, 일부 원숭이 아데노바이러스는 기존 인간 중화 항체와 교차 반응성을 갖지 않고, 특정 후보 인간 아데노바이러스 벡터의 경우의 35 %에 비교하여, 기존 인간 중화 항체와 특정 침팬지 아데노바이러스의 교차-반응은 단지 표적 집단의 2 %에 존재한다 (Sci. Transl. Med. (2012) 4:1).
본 발명의 아데노바이러스 벡터는 비-인간 아데노바이러스로부터, 예컨대 원숭이 아데노바이러스, 예를 들어, 침팬지(판 트로글로디테스(Pan troglodytes)), 보노보(판 파니스쿠스(Pan paniscus)), 고릴라(고릴라 고릴라(Gorilla gorilla)) 및 오랑우탄(퐁고 아벨리이 및 퐁고 피그마에우스(Pongo abelii and Pongo pygmaeus))으로부터 유래될 수 있다. 이들은 군 B, 군 C, 군 D, 군 E 및 군 G로부터의 아데노바이러스를 포함한다. 침팬지 아데노바이러스는 ChAd3, ChAd15, ChAd19, ChAd25.2, ChAd26, ChAd27, ChAd29, ChAd30, ChAd31, ChAd32, ChAd33, ChAd34, ChAd35, ChAd37, ChAd38, ChAd39, ChAd40, ChAd63, ChAd83, ChAd155, ChAd157, ChAdOx1, ChAdOx2 및 SadV41을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, 아데노바이러스 벡터는 보노보로부터 단리된 비인간 원숭이 아데노바이러스, 예컨대 PanAd1, PanAd2, PanAd3, Pan5, Pan6, Pan7 (C7로서 또한 지칭됨) 및 Pan9로부터 유래될 수 있다. 벡터는, 전체적으로 또는 부분적으로, 비-인간 아데노바이러스의 섬유, 펜톤 또는 헥손을 코딩하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 원숭이는 침팬지이다. 본 발명의 일부 실시양태에서, 복제 가능 침팬지 아데노바이러스 벡터는 침팬지 아데노바이러스 섬유 폴리펩티드 또는 그의 기능적 유도체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 침팬지 아데노바이러스 E4 영역을 추가로 포함한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 벡터는 인간에서 낮은 혈청 유병률을 갖는 아데노바이러스이고, 여기서 "낮은 혈청 유병률"은 인간 대상체에서 30 % 미만이다. 본 발명의 아데노바이러스 벡터의 한 실시양태에서, 아데노바이러스는 인간 대상체에서 혈청 유병률이 30 % 미만이고, 바람직하게는 인간 대상체에서의 혈청 유병률이 없고, 더 바람직하게는 침팬지 아데노바이러스와 이전에 접촉하지 않은 인간 대상체에서 혈청 유병률이 없다.
복제 결함 벡터의 유전자 발현 카세트 삽입 부위의 선택은 바이러스 복제에 관여하는 것으로 공지된 영역을 대체하는 것에 주로 초점이 맞추어져 왔다. 복제 가능 벡터의 유전자 발현 카세트 삽입 부위의 선택은 복제 기구를 보존하여야 한다. 바이러스는 다중 프로모터 및 교호 스플라이싱에 의해 제어되는 고도로 복잡한 전사 단위를 생성함으로써 이들의 코딩 용량을 최대화한다. 결과적으로, 복제 가능 바이러스 벡터는 기능적 발현 카세트에 대한 공간을 허용하면서 복제에 필요한 서열을 보존해야 한다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 원숭이 아데노바이러스 벡터는 ChAd155 또는 ChAd83이다.
본 발명의 아데노바이러스 벡터의 실시양태에서, 아데노바이러스 DNA는 포유동물 표적 세포에 진입할 수 있고, 즉 감염성이다. 본 발명의 감염성 재조합 아데노바이러스는 예방 또는 치료 백신으로서 및 유전자 요법을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 한 실시양태에서, 재조합 아데노바이러스는 표적 세포 내로 전달하기 위한 내인성 분자를 포함한다. 표적 세포는 포유동물 세포, 예를 들어 소 세포, 개 세포, 염소 세포, 사슴 세포, 침팬지 세포, 익수목 세포, 말 세포, 고양이 세포, 인간 세포, 이리 세포, 양 세포, 돼지 세포, 설치류 세포, 곰 세포 또는 여우 세포이다. 예를 들어, 표적 세포로 전달하기 위한 내인성 분자는 발현 카세트일 수 있다.
본 발명에 따르면, 프로모터 및 트랜스진을 포함하는 발현 카세트를 포함하는 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터가 존재하며, 여기서 발현 카세트는 벡터의 E3 영역, HE1 부위 또는 HE2 부위에 삽입된다. 벡터는 복제에 필요한 E1 영역 또는 그의 단편을 포함한다.
한 실시양태에서, 프로모터는 CASI 프로모터 및 증강된 시토메갈로바이러스 프로모터로부터 선택된다.
추가의 실시양태에서, 발현 카세트는 전사후 조절 요소를 추가로 포함할 수 있고, 전사후 조절 요소는 우드척 간염 전사후 조절 요소일 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 트랜스진은 항원이다. 항원은 광견병 바이러스 항원, 호흡기 세포융합 바이러스 항원, 인간 면역결핍 바이러스 항원, 결핵 항원, 말라리아 항원, C형 간염 바이러스 항원, 치쿤군야 항원 및 B형 간염 바이러스 항원으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 실시양태에서, 복제를 위해 필요한 E1 영역 또는 그의 단편이 존재하고, 관심 외인성 서열이 완전히 또는 부분적으로 결실된 E3 영역 내로 삽입된다. 한 실시양태에서, 벡터는 좌측 ITR 영역, 뒤이어 E1 영역, 이어서 E3 영역을 포함하고, 이는 프로모터, 관심 항원, 및 임의로 추가의 인핸서 요소를 포함하는 발현 카세트로 치환되고; 뒤이어 섬유 영역, E4 영역 및 우측 ITR이고; 번역은 우측 방향으로 일어난다. 추가의 실시양태에서, 프로모터는 CMV 프로모터이다. 보다 추가의 실시양태에서, 인핸서 요소는 B형 간염 번역후 조절 요소(HPRE) 또는 우드척 간염 번역후 요소(WPRE)이다.
다른 실시양태에서, 벡터는 좌측 ITR 영역; 뒤이어 E1 영역; 완전히 또는 부분적으로 결실된 E3 영역; 섬유 영역; E4 영역; 프로모터, 관심 항원 및, 임의로, HE1 부위, 즉 섬유 유전자의 종결 코돈과 E4 영역 사이("HE1 부위")에 삽입된 하나 이상의 인핸서 요소를 포함하는 발현 카세트; 뒤이어 우측 ITR을 포함한다. ChAd155 HE1 삽입 부위는 야생형 ChAd155 서열의 bp 34611과 34612 사이이다. ChAd83 HE1 삽입 부위는 야생형 ChAd83 서열의 bp 33535와 33536 사이이다. 번역은 우측 방향으로 일어난다. 추가의 실시양태에서, 프로모터는 CASI 프로모터이다. 보다 추가의 실시양태에서, 인핸서 요소는 HPRE 또는 WPRE이다.
추가의 실시양태에서, 벡터는 좌측 ITR 영역; 뒤이어 E1 영역; 완전히 또는 부분적으로 결실된 E3 영역; 섬유 영역; E4 영역; 프로모터, 관심 항원 및, 임의로, HE2 부위, 즉 좌측 ITR의 말단과 E4 mRNA의 캡(cap) 부위 사이("HE2 부위")에 삽입된 하나 이상의 인핸서 요소를 포함하는 발현 카세트; 뒤이어 우측 ITR을 포함한다. ChAd155 HE2 삽입 부위는 야생형 ChAd155 서열의 bp 37662와 37663 사이이다. ChAd83 HE2 삽입 부위는 야생형 ChAd83 서열의 bp 36387과 36388 사이이다. 번역은 좌측 방향으로 일어난다. 추가의 실시양태에서, 프로모터는 CASI 프로모터이다. 보다 추가의 실시양태에서, 인핸서 요소는 HPRE 또는 WPRE이다.
HE1 및 HE2 부위는 트랜스진에 대한 삽입 부위로서 확인되었는데, 이는 이들 특이적 지점에서의 삽입이 ChAd155 및 ChAd83의 코딩 서열 또는 조절 서열을 방해하지 않기 때문이다. 따라서, ChAd 게놈의 HE1 또는 HE2 부위에 발현 카세트를 삽입하는 것은 바이러스 복제 주기에 영향을 주지 않는다.
본 발명의 한 실시양태에서, 벡터는 아데노바이러스 벡터의 기능적 또는 면역원성 유도체이다. "아데노바이러스 벡터의 유도체"는 예를 들어, 벡터의 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실, 삽입, 변형 또는 치환되는 벡터의 변형된 버전을 의미한다.
조절 요소
조절 요소, 즉, 발현 제어 서열은 적절한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 효율적인 RNA 가공 신호, 예컨대 스플라이싱 및 토끼 베타-글로빈 폴리A를 포함하는 폴리아데닐화(폴리 A) 신호; 테트라시클린 조절 가능 시스템, 마이크로RNA, 전사후 조절 요소, 예를 들어 WPRE, 우드척 간염 바이러스의 전사후 조절 요소; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 증강시키는 서열 (예를 들어, 코자크(Kozak) 컨센서스(consensus) 서열); 단백질 안정성을 증강시키는 서열; 및 원하는 경우에, 코딩된 생산물의 분비를 증강시키는 서열을 포함한다.
"프로모터"는 RNA 폴리머라제의 결합을 허용하고 유전자의 전사를 지시하는 뉴클레오티드 서열이다. 전형적으로, 프로모터는 전사 시작 부위에 근접한 유전자의 비-코딩 영역에 위치한다. 전사의 개시에서 기능하는 프로모터 내의 서열 요소는 종종 컨센서스 뉴클레오티드 서열을 특징으로 한다. 프로모터의 예는 박테리아, 효모, 식물, 바이러스, 및 원숭이와 인간을 포함한 포유동물로부터의 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 내부(internal), 천연, 항시성(constitutive), 유도성(inducible) 및/또는 조직-특이적인 프로모터를 포함한 다수의 발현 제어 서열이 당업계에 공지되어 있고, 사용될 수 있다.
본 발명의 프로모터는 전형적으로 이종 프로모터일 것이다. "이종"은 그것이 비교되는 나머지 개체의 것과는 유전자형으로 구분되는 개체로부터 유래됨을 의미한다. 본 발명의 프로모터는 항시성 또는 유도성일 수 있다. 항시성 프로모터는 조절 영향으로부터 독립적으로 RNA 합성을 개시한다. 유도성 프로모터는 유전자 발현의 조절을 허용하고, 외인성으로 공급되는 화합물, 온도 같은 환경 인자, 또는 특이적 생리학적 상태의 존재에 의해 조절될 수 있다.
본 발명의 프로모터는 CMV 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 예를 들어 닭 베타 액틴(CAG) 프로모터, CASI 프로모터, 인간 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, TBG 프로모터, 레트로바이러스 라우스(Rous) 육종 바이러스 LTR 프로모터, SV40 프로모터, 디히드로폴레이트 리덕타제 프로모터, 포스포글리세롤 키나제(PGK) 프로모터, EF1a 프로모터, 아연-유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex)-유도성 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 폴리머라제 프로모터 시스템, 엑디손 곤충 프로모터, 테트라시클린-억제성 시스템, 테트라시클린-유도성 시스템, RU486-유도성 시스템 및 라파마이신-유도성 시스템을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
트랜스진은 조직-특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 골격근에서의 발현을 원하는 경우, 근육에서 활성인 프로모터가 사용되어야 한다. 이들은, 천연 발생 프로모터보다 더 높은 활성을 갖는 합성 근육 프로모터뿐만 아니라 골격 베타-액틴, 미오신 경쇄(light chain) 2A, 디스트로핀, 근육 크레아틴 키나제를 코딩하는 유전자로부터의 프로모터를 포함한다. 조직-특이적인 프로모터의 예는 간, 예를 들어 알부민, B형 간염 바이러스 코어, 알파-태아 단백질(AFP); 골, 예를 들어 오스테오칼신, 골 시알로단백질; 림프구, 예를 들어 CD2, 면역글로불린 중쇄(heavy chain) 및 T 세포 수용체 사슬; 및 뉴런, 예를 들어 뉴런-특이적 에놀라제(NSE)에 대해 공지되어 있다.
임의로, 치료상 유용한 또는 면역원성 생산물을 코딩하는 트랜스진을 보유하는 벡터는 또한 선별 가능한 마커 또는 리포터 유전자를 포함할 수 있다. 리포터 유전자는 당업계에 공지된 것으로부터 선택될 수 있다. 적합한 리포터 유전자는 증강된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시퍼라제 및 분비된 배아 알칼리성 포스파타제(seAP)를 포함하나, 이에 제한되지는 않으며, 이는 무엇보다도 게네티신, 히그로미신 또는 퓨리마이신 내성을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 이러한 선별 가능한 리포터 또는 마커 유전자 (이는 바이러스 입자 내로 패키징되는 바이러스 게놈 외부에 위치할 수 있거나 그렇지 않을 수 있음)는 암피실린 내성과 같이, 박테리아 세포 내의 플라스미드의 존재를 표시하기 위해 사용될 수 있다. 벡터의 다른 성분은 복제 기점을 포함할 수 있다.
적합한 프로모터는 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 및 CASI 프로모터를 포함한다. CMV 프로모터는 강하고 편재적으로(ubiquitously) 활성이다. 이는 많은 조직 유형에서 높은 수준의 트랜스진 발현을 유도하는 능력을 갖고, 당업계에 공지되어 있다. CMV 프로모터는 CMV 인핸서와 함께 또는 이들 없이 본 발명의 벡터에서 사용될 수 있다.
CASI 프로모터는 CMV 인핸서, 닭 베타-액틴 프로모터, 및 유비퀴틴(UBC) 인핸서에 플랭킹된 스플라이스 공여자 및 스플라이스 수용자의 조합으로서 기재된 합성 프로모터이다 (US 8865881).
일부 실시양태에서, CASI 프로모터는 서열 3에 대한 서열 동일성을 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 96 %, 적어도 약 97 %, 적어도 약 98 %, 적어도 약 99 %, 또는 그 이상 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 서열 3의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 일부 실시양태에서, 증강된 hCMV 프로모터는 서열 4에 대한 서열 동일성을 적어도 약 90 % 이상, 적어도 약 95 %, 적어도 약 96 %, 적어도 약 97 %, 적어도 약 98 %, 적어도 약 99 % 또는 그 이상 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 서열 4의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
적합한 프로모터는 또한 생체내에서 트랜스진의 지속적인 발현을 생산하는, 강하게 활성이고 편재성 프로모터인 침팬지 신장 인자 1 프로모터(chEF 1)를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 프로모터는 CMV 인핸서를 갖는 인간 페리틴 경쇄 프로모터이다. 이 실시양태에서, 페리틴 중쇄 및 경쇄의 5' UTR은 페리틴에 의한 철 조절을 제거하기 위해 침팬지 신장 인자 1 알파의 5' UTR에 의해 대체된다. 한 실시양태에서, 프로모터는 CMV 인핸서를 갖는 닭 베타 액틴 프로모터이다. 한 실시양태에서, 프로모터는 하이브리드 프로모터이다. 한 실시양태에서, 하이브리드 프로모터는 CMV 인핸서 및 유비퀴틴 유전자 인핸서를 갖는 CMV 프로모터이고, 통상적인 CMV 프로모터보다 더 강한 프로모터이다.
본원에서 사용되는 "전사후 조절 요소"는 전사될 때 본 발명의 바이러스 벡터에 의해 전달되는 트랜스진(들) 또는 그의 단편의 발현을 증강시키는 DNA 서열이다. 전사후 조절 요소는 B형 간염 바이러스 전사후 조절 요소(HPRE) 및 우드척 간염 전사후 조절 요소(WPRE)를 포함하고 이로 제한되지 않는다. WPRE는 모두는 아니나, 특정 프로모터에 의해 유도되는, 트랜스진 발현을 증강시키는 것으로 입증된 3분체(tripartite) 시스 작용 요소이다.
본 발명의 실시양태에서, ChAd155 벡터는 프로모터, 인핸서, 및 리포터 유전자 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터는 임의로 테트라시클린 온/오프 전사 제어를 갖는 ChAd155-증강된 hCMV-SeAP, ChAd155-CASI-seAP 및 ChAd155-hCMV-seAP 및 테트라시클린 온/오프 전사 제어를 갖는 ChAd155 -CMV-hFerL-chEF1-seAP를 포함할 수 있다.
본 발명의 실시양태에서, ChAd83 벡터는 프로모터, 인핸서, 및 리포터 유전자 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터는 임의로 테트라시클린 온/오프 전사 제어를 갖는 ChAd83 증강된 hCMV SeAP, ChAd83 증강된 hCMV SeAP, ChAd83-CASI-seAP 및 ChAd83-hCMV-seAP 및 테트라시클린 온/오프 전사 제어를 갖는 ChAd83 -CMV-hFerL-chEF1-seAP를 포함할 수 있다.
본 발명의 벡터는 당업자에게 공지된 기술과 함께, 본원에 제공된 기술을 사용하여 생성된다. 이러한 기술은 cDNA의 통상적인 클로닝 기술, 예컨대 본 명세서에 기재된 것, 아데노바이러스 게놈의 중복 올리고뉴클레오티드 서열의 사용, 폴리머라제 연쇄 반응, 및 원하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 임의의 적합한 방법을 포함한다.
트랜스진
아데노바이러스 벡터는 생체내 발현을 위해 원하는 RNA 또는 단백질 서열, 예를 들어 이종 서열을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 벡터는 네이키드(naked) DNA, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 에피솜, 플라스미드 또는 바이러스 성분을 포함한 임의의 유전 요소를 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 원숭이 아데노바이러스 DNA 및 발현 카세트를 함유할 수 있다. "발현 카세트"는 숙주 세포에서 트랜스진의 번역, 전사 및/또는 발현에 필요한 트랜스진 및 조절 요소를 포함한다.
"트랜스진"은 관심 폴리펩티드를 코딩하는, 트랜스진에 플랭킹하는 벡터 서열에 이종인 핵산 서열이다. 핵산 코딩 서열은 숙주 세포에서 트랜스진 전사, 번역 및/또는 발현을 허용하는 방식으로 조절 성분에 작동 가능하게 연결된다. 본 발명의 실시양태에서, 벡터는 치료적 또는 예방적 수준으로 트랜스진을 발현한다. 트랜스제닉(transgenic) 폴리펩티드의 "기능적 유도체"는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 결실, 삽입, 변형 또는 치환된 폴리펩티드의 변형된 버전이다.
트랜스진은 예방 또는 치료를 위해, 예를 들어, 면역 반응을 유도하기 위한 백신으로서, 결함 또는 누락 유전자를 교정 또는 대체함으로써 유전자 결핍을 교정하기 위해, 또는 암 치료제로서 사용될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 면역 반응의 유도는 단백질에 대한 T 세포 및/또는 체액성 항체 면역 반응을 유도하는 단백질의 능력을 지칭한다.
트랜스진에 의해 유도된 면역 반응은 항원 특이적 B 세포 반응일 수 있고, 이는 중화 항체를 생산한다. 유도된 면역 반응은 항원 특이적 T 세포 반응일 수 있고, 이는 전신 및/또는 국소 반응일 수 있다. 항원 특이적 T 세포 반응은 CD4+ T 세포 반응, 예컨대 시토카인, 예를 들어 인터페론 감마(IFN 감마), 종양 괴사 인자 알파(TNF 알파) 및/또는 인터류킨 2(IL2)를 발현하는 CD4+ T 세포를 수반하는 반응을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항원 특이적 T 세포 반응은 CD8+ T 세포 반응, 예컨대 시토카인, 예를 들어 IFN 감마, TNF 알파 및/또는 IL2를 발현하는 CD8+ T 세포를 수반하는 반응을 포함한다.
본 발명의 트랜스진은 광견병 바이러스 항원, 예를 들어, 광견병 당단백질(RG), 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 항원, 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 항원, 결핵 항원, 말라리아 항원 C형 간염 바이러스(HCV) 항원, 치쿤군야 항원 및 B형 간염(HBV) 항원을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
트랜스진 서열의 조성은 생성되는 벡터가 놓인 용도에 따라 달라질 것이다. 한 실시양태에서, 트랜스진, 예컨대 예방적 트랜스진, 치료적 트랜스진 또는 면역원성 트랜스진은 생물학 및 의약에서 유용한 생산물, 예를 들어 단백질 또는 RNA를 코딩하는 서열이다. 단백질 트랜스진은 항원을 포함한다. 본 발명의 항원성 트랜스진은 질환 유발 유기체에 대한 면역원성 반응을 유도한다. RNA 트랜스진은 tRNA, dsRNA, 리보솜 RNA, 촉매 RNA 및 안티센스 RNA를 포함한다. 유용한 RNA 서열의 예는 치료된 동물에서 표적 핵산 서열의 발현을 끝내는 서열이다.
대안적으로, 트랜스진 서열은 리포터 서열을 포함할 수 있으며, 이는 발현 시 검출 가능한 신호를 생산한다. 이러한 리포터 서열은, 제한 없이, 베타-락타마제, 베타-갈락토시다제(LacZ), 알칼리성 포스파타제, 티미딘 키나제, 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 루시퍼라제, 예를 들어 CD2, CD4, CD8, 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질, 및 그를 향한 고친화도 항체가 존재하거나 통상적인 수단에 의해 생산될 수 있는, 당업계에 널리 공지된 다른 것들을 포함하는 막 결합 단백질, 및 무엇보다도 헤마글루티닌 또는 Myc로부터의 항원 태그 도메인에 적절하게 융합된 막 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 DNA 서열을 포함한다. 이들 코딩 서열은, 이들의 발현을 유도하는 조절 요소와 관련이 있을 때, 효소적, 방사선 촬영, 비색, 형광 또는 다른 분광학적 검정, 형광 활성화 세포 분류 검정, 및 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(RIA) 및 면역조직화학을 포함한 면역학적 검정을 포함한 통상적인 수단에 의해 검출 가능한 신호를 제공한다.
유전자 코드에서의 중복성의 결과로서, 폴리펩티드는 다양한 상이한 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 코딩은 일부 동의 코돈(synonymous codon), 즉 다른 것들보다 더 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈을 사용하도록 편향된다. "코돈 최적화"란, 재조합 핵산의 코돈 조성의 변형이 아미노산 서열을 변경시키지 않으면서 이루어진다는 것을 의미한다. 유기체-특이적 코돈-사용 빈도를 사용하여 상이한 유기체에서 mRNA 발현을 개선하기 위해 코돈 최적화를 사용하였다.
코돈 편향에 추가로 및 독립적으로, 일부 동의 코돈 쌍이 다른 것보다 더 빈번하게 사용된다. 이러한 코돈 쌍 편향은 일부 코돈 쌍이 과다표시되고 다른 것이 과소표시됨을 의미한다. 코돈 쌍 탈최적화는 바이러스 독성을 감소시키는 데 사용되어 왔다. 예를 들어, 과소표시된 코돈 쌍을 함유하도록 변형된 폴리오바이러스(poliovirus)가 감소된 번역 효율을 나타내고 야생형 폴리오바이러스와 비교하여 약독화되었음이 보고되었다 (Science (2008) 320:1784). 코돈 쌍 탈최적화에 의해 합성 약독화 바이러스를 조작하는 것은 야생형과 동일한 아미노산 서열을 코딩하지만, 동의 코돈의 상이한 쌍별(pairwise) 배열을 사용하는 바이러스를 생산할 수 있다. 코돈 쌍 탈최적화에 의해 약독화된 바이러스는 야생형과 비교하여 최대 1000 배 더 적은 플라크(plaque)를 생성하고, 더 적은 바이러스 입자를 생산하고, 플라크를 형성하기 위해 약 100 배 더 많은 바이러스 입자를 필요로 하였다.
대조적으로, 인간 게놈에서 과다표시된 코돈 쌍을 함유하도록 변형된 폴리오바이러스는 야생형 RNA와 유사한 방식으로 작용하고, 크기가 야생형 RNA와 동일한 플라크를 생성하였다 (Coleman et al. (2008) Science 320:1784). 이는 과다표시된 코돈 쌍을 갖는 바이러스가 과소표시된 코돈 쌍을 갖는 바이러스와 유사한 수의 돌연변이를 함유하고, 야생형과 비교하여 증강된 번역을 나타낸다는 사실에도 불구하고 발생하였다. 이러한 관찰은 코돈 쌍 최적화된 구축물이 이들의 비-코돈 쌍 최적화된 대응물과 유사한 방식으로 작용할 것으로 예상되고, 기능적 이점은 제공할 것으로 예상되지 않는다는 것을 시사한다.
본 발명의 구축물은 코돈 최적화된 핵산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 벡터는 트랜스진 또는 그의 면역원성 유도체 또는 단편의 코돈 최적화된 서열을 포함한다. 본 발명의 구축물은 코돈 쌍 최적화 핵산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 벡터는 트랜스진 또는 그의 면역원성 유도체 또는 단편의 코돈 쌍 최적화된 서열을 포함하거나 이로 구성된다.
복제 가능 아데노바이러스 벡터의 전달
일부 실시양태에서, 본 발명의 재조합 아데노바이러스는 표피 투여, 피내 투여, 근육내 주사, 복강내 주사, 정맥내 주사, 점막 투여, 비내 투여, 경구 투여, 직장 투여, 피하 주사, 경피 투여 또는 질내 투여에 의해 대상체에게 투여된다.
치료 요법이 각각 상이한 조성물로 제제화된 하나 이상의 아데노바이러스 벡터 및 추가 성분의 공동-투여를 수반하는 경우, 이들은 동일한 부위에서 또는 그 근처에서 공동-위치적(co-locationally)으로 유리하게 투여된다. 예를 들어, 성분은 동일한 측면 또는 말단부("동측성" 투여)에 또는 반대쪽 측면 또는 말단부("대측성" 투여)에 (예를 들어, 근육내, 경피, 피내, 피하로부터 선택된 투여 경로를 통해) 투여될 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 벡터는 근육내(IM), 즉, 근육 안으로 직접 주사하여 투여될 수 있다. 근육은 혈관이 많이 지나가고, 흡수는 전형적으로 신속하다.
본 발명의 실시양태에서, 벡터는 경구 투여될 수 있다. 경구 백신 전달은 근육내 전달과 비교하여, 주사 부위에서의 통증의 제거, 전달의 용이성 및 편의를 포함한 여러 이점을 제공한다. 이는 덜 숙련된 의료 서비스 종사자가 백신을 효과적으로 투여하는 것을 가능하게 하고, 예를 들어 HIV, B형 간염 및 C형 간염의 높은 유병률을 갖는 분야에서 오염된 바늘 및 주사기의 가능성을 회피한다.
구강 점막은 대부분 각질화되지 않은 층화된 편평 상피의 외부 층, 및 치밀한 결합 조직의 기저 층, 고유판으로 구성된다. 고유판은 많은 면역 세포를 포함하고, 면역 반응이 병원성 유기체로부터 내부 조직을 보호하는 장벽으로서 발생하는 부위이다. 경구/위장 경로를 통한 투여는 단순한 원주형 상피의 단일 세포층을 통한 큰 표면적에 접근하는 항원을 제공하고, 여기서 이것은 페이에르판(Peyer's Patch)을 표적으로 하고 전신 반응을 유도한다.
생 복제 가능 아데노바이러스는 수십년 동안 경구적으로 성공적으로 투여되었지만, 항원성 트랜스진을 코딩하는 바이러스 벡터의 투여는 더욱 어렵다. 면역 인식 메카니즘은 장의 내강측에 쉽게 접근 가능하지 않고; 이는 신체가 음식에서 섭취된 단백질에 대한 면역 반응을 개시(mounting)하는 것으로부터 보호한다. 따라서, 본 발명의 구축물은 경구 경로를 통해 장으로 전달될 때 단백질 항원에 대한 면역 반응을 상승시켜야 하는 장애물에 직면한다. 예를 들어, 1 상 연구에서, 인간 대상체에게 트랜스진으로서 인플루엔자 헤마글루티닌 항원을 사용하여 복제 가능 생 인간 Ad4 백신을 경구 투여하였다. 이들은 세포 면역 반응에 반응하였지만, 근육내 부스팅될 때까지 체액성 항체 반응을 개시하지 않았다 (Lancet Infect Dis (2013) 13:238). 유사하게, 통상적인 돼지에게 트랜스진으로서 돼지콜레라 바이러스 항원을 사용하여 복제 가능 생 재조합 돼지 아데노바이러스 백신을 경구 또는 피하 투여하였다. 경구 투여된 돼지 중 어느 것도 트랜스제닉 항원에 대한 항체를 발생시키지 않았으나, 피하 투여된 돼지의 75 %는 이를 발생시켰다 (Vaccine (2001) 146:1787).
본 발명의 실시양태에서, 벡터는 점막으로 투여될 수 있다. 점막 백신 전달은 또한 백신의 근육내 전달에 여러 이점을 제공한다. 점막이 신체의 외부와 인접하기 때문에, 점막 백신은 비경구 백신과 비교하여 약간 더 낮은 정도의 순도에서 효과적이고 안전할 수 있고, 따라서 이들은 생산하기가 더 용이하다. 이들은 또한 전형적으로 낮은 용량에서 효과적이며, 따라서 비용-효율적이다.
본원에서 사용되는 "점막" 전달은 모든 점막을 포괄한다. 점막은 전형적으로 상피 및 고유판을 포함하는 체강 및 통로에서 막을 형성한다. 점막은 각질화되거나 또는 각질화되지 않을 수 있다. 점막 조직은 폐포, 기관지, 협측, 피부, 자궁내막, 위, 장, 협골, 내벽(lining), 저작, 비내, 후각, 경구, 귀, 구개, 직장, 특수 (혀), 설하, 기관 및 질 점막을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
점막은 페이에르판, 장간막 림프절, 맹장, 편도 및 아데노이드와 같은 림프성 마이크로구획이 포함된 고도로 특수화된 면역계를 제공한다. 점막의 흡수성 상피 세포에 의해 흡수된 항원은 항원 제시 세포로 이동(shuttle)되거나, 직접 제시되고 T 세포에 제시될 수 있다. 점막 조직에서 면역 반응은 항원의 성질, 항원 제시 세포의 유형 및 국소 미세환경에 의해 결정된다. 감작된 점막 B 및 T 세포는 초기 항원 접촉의 부위를 떠나고, 림프를 통과하여 순환계로 진입한다. 점막 전달은, 예를 들어, 협측, 생식기, 예를 들어 질, 비강내, 안구, 예를 들어 눈 결막, 귀, 예를 들어 내이, 직장 또는 설하일 수 있다.
본 발명의 실시양태에서, 벡터는 설하 투여될 수 있다. 설하 경로를 통한 백신 전달은 각질화되지 않은 층화된 편평 상피의 매우 얇은 층을 통한 신속한 접근을 갖는 항원을 제공하고, 여기서 그것은 랑게르한스 세포를 표적으로 하고 전신 반응을 유도한다. 혀 아래에서 전달되는 항원은 설하 점막에서 수지상 세포의 치밀한 네트워크에 이용 가능해진다. 설하로 전달되는 복제 가능 벡터는 간을 우회하여, 초회 통과 대사를 피하고, 이들의 지속성을 증가시키고, 따라서 잠재적으로 더 강한 면역 반응을 생성한다.
본 발명의 한 실시양태에서, 벡터는 협측으로 투여될 수 있다. 협측 경로를 통한 백신 전달은 또한 설하 층보다 다소 두꺼운 각질화되지 않은 층화된 편평 상피의 층을 통한 접근을 갖는 항원을 제공한다. 협측 전달은 랑게르한스 세포를 또한 표적으로 하고, 전신 반응을 유도한다.
아주반트
특정 병원체에 대한 강하고 지속되는 면역을 확립하는 접근법은 백신에 대한 아주반트의 첨가를 포함한다. "아주반트"는 조성물의 활성 성분에 대한 면역 반응을 증대, 자극, 활성화, 강화 또는 조절하는 작용제를 의미한다. 아주반트 효과는 세포성 또는 체액성 수준, 또는 둘 모두에서 발생할 수 있다. 아주반트는 실제 항원에 대한 면역계의 반응을 자극하지만 그 자체로 면역학적 효과를 갖지는 않는다. 대안적으로 또는 추가로, 본 발명의 아주반트 조성물은 하나 이상의 면역자극제를 포함할 수 있다. "면역자극제"는 항원과 함께 또는 개별적으로 투여되든지 간에 대상체의 면역 반응에서 일반적인, 일시적 증가를 유도하는 작용제를 의미한다.
본 발명의 조성물은 아주반트와 함께 또는 그 없이 투여될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 조성물은 하나 이상의 아주반트 (예를 들어, 백신 아주반트)를 포함할 수 있거나 또는 이와 함께 투여될 수 있고, 특히 조성물은 트랜스진을 코딩하는 본 발명의 면역학적 유효량의 벡터를 포함한다.
사용 방법/용도
본원에 개시된 바와 같은 구축물 또는 조성물의 면역학적 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 병원체에 의해 야기되는 질환에 대한 면역 반응을 이를 필요로 하는 대상체에서 유도하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 항원에 대한 면역 반응을 이를 필요로 하는 대상체에서 유도하기 위한 본원에 개시된 구축물 또는 조성물의 용도가 제공된다. 본 발명의 벡터는 감염으로 인한 질환의 예방, 치료 또는 개선을 위해 응용될 수 있다.
본 발명의 방법은 의약에서의 본 발명의 벡터의 용도를 포함한다. 이들은 병원체에 의해 야기되는 질환의 치료를 위한 본 발명의 벡터의 용도를 포함한다. 본 발명의 벡터는 병원체에 의해 야기되는 질환을 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.
아데노바이러스 벡터로의 효과적인 면역화는 아데노바이러스 벡터 백본의 본질적인 면역조절 능력에 의존한다. 면역학적으로 덜 강한 아데노바이러스는 더 적은 항원 발현을 유도한다. 효과적인 면역화는 또한 강하고 지속적인 트랜스진 발현을 유도하는 프로모터의 능력에 의존한다. 예를 들어, 바이러스 프로모터 CMV-IE에 의해 유도되는 아데노바이러스 벡터는 이들이 발현을 감쇠시키는 시토카인을 유도하기 때문에 장기 트랜스진 발현을 지속하지 않는다.
"대상체"는 척추동물, 예컨대 포유동물, 예를 들어 인간 또는 수의학용 포유동물을 의도한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일반
본 발명의 벡터는 당업자에게 공지된 기술과 함께 본원에 제공된 기술 및 서열을 사용하여 생성된다. 이러한 기술은 cDNA의 통상적인 클로닝 기술, 예컨대 본원에 기재된 것, 아데노바이러스 게놈의 중복 올리고뉴클레오티드 서열의 사용, 폴리머라제 연쇄 반응, 및 원하는 뉴클레오티드 서열을 제공하는 임의의 적합한 방법을 포함한다.
달리 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시 내용이 속한 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 단수 용어 "한," "하나," 및 "그"는 문맥상 명백히 달리 나타나지 않는 한 복수 지시 대상을 포함한다. 유사하게, 단어 "또는"은 문맥상 명백히 달리 나타나지 않는 한 "및"을 포함하도록 의도된다. 용어 "복수"는 둘 이상을 지칭한다. 추가로, 용액 성분 농도 또는 그의 비와 같은, 물질의 농도 또는 수준, 및 온도, 압력 및 주기 시간(cycle time)과 같은, 반응 조건에 대해 주어진 수치 제한은 대략적인 것으로 의도된다. 본원에서 사용되는 용어 "약"은 ±10 %의 양을 의미하는 것으로 의도된다.
이제, 본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 기재될 것이다.
실시예
실시예 1: 복제 가능 침팬지 아데노바이러스의 구축
야생형 침팬지 아데노바이러스 유형 155(ChAd155) (WO 2016 198621) 및 유형 83(ChAd83) (WO 2010/086189)을 문헌 [Sci Transl Med (2012) 4:1] 및 WO 2010/086189에 기재된 바와 같이 표준 절차를 사용하여 건강한 침팬지로부터 단리하고, 복제 결함 바이러스로서 구축하였다.
트랜스진 발현 카세트를 삽입함으로써 복제 가능 ChAd155 및 ChAd83을 각각 구축하였다. 발현 카세트 성분은 전통적인 인간 CMV 프로모터 또는 CASI 프로모터, 모델 항원으로서의 광견병 당단백질, 및 임의로 WPRE 인핸서를 사용하였다. 트랜스진 카세트를 위한 삽입 부위는 E3 영역을 대체하는 것, 섬유와 E4 영역 사이 (HE1 부위)에 삽입하는 것, 및 우측 ITR의 하류 (HE2 부위)에 삽입하는 것을 포함하였다.
도 1의 상부 패널은 트랜스진 카세트가 E3 영역을 대체하는 RC1 벡터를 도시한다. 중앙 패널은 트랜스진 카세트가 섬유 유전자의 종결 코돈과 E4 영역 사이 (HE1 부위)에 삽입된 구축물을 도시한다. 트랜스진 카세트가 HE1 부위에 삽입되었을 때, ChAd155는 복제에 실패하였다. 그러나, ChAd83의 HE1 부위 내로 트랜스진을 삽입하면 생존 벡터가 생산되었다. 하부 패널은 트랜스진 카세트가 우측 ITR의 하류 (HE2 부위)에 삽입된 RC2 벡터를 도시한다. E1 영역은 RC1 및 RC2 배열 모두에서 온전하게 유지된다. 트랜스진을 서열 1 및 서열 2의 하기 위치의 상동 재조합 기술에 의해 삽입하였다:
HE1 ChAd155: 서열 1의 bp 34611과 34612 사이의 삽입 부위;
HE2 ChAd155: 서열 1의 bp 37662와 37663 사이의 삽입 부위;
HE1 ChAd83: 서열 2의 bp 33535와 33536 사이의 삽입 부위;
HE2 ChAd83: 서열 2의 bp 36387과 36388 사이의 삽입 부위.
실시예 2: 바이러스 생산, 벡터 역가 및 발현
벡터 복제를 평가하기 위한 동물 모델을 확인하기 위해, 유형 C 복제 가능 아데노바이러스 ChAd155 RC2 및 유형 E 복제 가능 아데노바이러스 ChAd83 RC2 벡터를 다양한 동물 유래 세포에서 벡터 역가 및 게놈 카피 수에 의해 측정된 이들의 복제 능력에 대해 평가하였다. 결과를 표 1에 제시하였다.
표 1. 복제 가능 ChAd155 및 ChAd83의 복제 및 발현
Figure pct00001
표 1에 제시한 바와 같이, 인간 MRC5 세포 및 돼지 PK15 세포는 복제 가능 ChAd155 및 ChAd83 둘 모두 높은 벡터 역가 및 높은 게놈 카피 수를 생산하였다. 쥐 NMuLi 및 비-인간 영장류 베로 세포는 또한 RC ChAd155를 생산하였지만, 인간 또는 돼지 세포보다 더 적은 정도였다. RC ChAd83은 쥐 NMuLi 세포에서, 및 놀랍게도 비-인간 영장류 베로 세포에서 잘 성장하는 데 실패했다.
인간 MRC5, 마우스 NMuLi 및 비-인간 영장류 베로 세포는 7 일까지 RC ChAd155의 발현을 지지하였다. 인간 MRC5 세포는 7 일까지 RC ChAd83의 발현을 지지하였고, 마우스 NMuLi 및 비-인간 영장류 베로 세포도 그러하였으나, 인간 세포보다 더 적은 정도였다.
바이러스 생산
도 2는 각각 RC1 또는 RC2를 포함하는, 복제 가능 ChAd155 또는 ChAd83으로 감염된 인간 1 차 MRC5 세포에 의해 생산된 바이러스의 양을 제시한다. 세포를 감염 7 일 후에 수확하고, 3 회 동결-해동 주기 후에 수득된 세포 용해물에서 벡터 역가를 평가하였다. 각각의 프로모터 영역에 대해 설계된 프라이머를 사용한 정량적 PCR(QPCR) 분석에 의해 벡터 역가를 측정하였다. 감염다중도(moi)는 세포당 1250 개의 바이러스 입자였다. 바이러스 생산은 벡터 입자/세포로서 막대 위에 표시된다.
인간 MRC5 세포는 RC1 (2.17 x 103 vp/세포) 또는 RC2 (4.40 x 103 vp/세포)를 포함하는 ChAd155의 생산을 지지하고, 또한 RC1 (1.18 x 104 vp/세포) 또는 RC2 (1.06 x 105 vp/세포)를 포함하는 ChAd83의 생산을 지지하였다. 도 2에 제시한 바와 같이, ChAd83은 ChAd155보다 더 높은 수준으로 생산되었고; RC2를 포함하는 ChAd83 벡터는 4 개의 바이러스/벡터 조합 중 가장 강력하였다.
벡터 게놈 카피 수
감염 후, 벡터는 세포 내에서 복제되고, 벡터 게놈 카피 수는 QPCR에 의해 측정될 수 있다. 벡터 DNA 복제는 심지어 바이러스 복제 및 증식을 완전히 허용하지 않는 세포에서도 발생할 수 있다. 벡터 DNA의 QPCR은 바이러스가 복제 주기를 완료하고 성숙한 바이러스 자손으로서 방출되는 능력과 독립적으로, 감염된 세포 내에서 벡터 복제의 척도를 제공한다. 따라서, 벡터 복제는 ChAd 바이러스 복제 또는 증식을 허용하지 않는 동물 종, 조직 유형 및 세포 유형에서 정량화될 수 있다.
벡터 게놈 카피 수를 벡터 역가와 병행하여 측정하고, 결과를 도 3에 제시하였다. 인간 MRC5 세포를 각각 RC1 또는 RC2를 포함하는 ChAd155 또는 ChAd83으로 감염시켰다. 세포를 감염 7 일 후에 수확하고, 총 DNA를 추출하고, QPCR에 의해 바이러스 게놈을 정량화하고, 결과를 세포당 벡터 게놈 카피로서 표현하였다. Moi는 세포당 250 개의 바이러스 입자이고, 세포당 바이러스 입자의 수는 세포당 바이러스 게놈 카피를 나타내는 막대 위에 표시된다. 카피 수는 트랜스진 발현의 수준에 정비례한다.
도 3에 제시한 바와 같이, ChAd155에 의한 RC1 (6.21 x 103 vp/세포) 및 RC2 (6.71 x 103 vp/세포)의 바이러스 DNA 복제의 양은 유사하였다. ChAd83은 ChAd155보다 더 많은 RC1 (2.76 x 104 vp/세포) 및 RC2 (9.19 x 104 vp/세포) 바이러스 DNA를 생산하였다. 최고 수준의 바이러스 DNA 복제는 ChAd83 RC2에 의해 관찰되었다.
실시예 3: 인간 세포로부터의 바이러스 트랜스진 발현
복제 결함 및 복제 가능 ChAd155 (도 4) 및 ChAd83 (도 5) 바이러스 벡터에서의 트랜스진 발현의 수준을 비교하기 위해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. MRC5 세포를 세포당 250 또는 1250 개의 바이러스 입자의 moi에서 ChAd155 RC1 또는 ChAd155 RC2 벡터로 형질도입하였다. 세포를 감염 후 2 및 7 일에 수확하고, 표준 방법을 사용하여 추출물을 제조하고, 등가량의 추출물을 SDS-PAGE 겔 상에 로딩하였다. 전기영동 분리 후, 단백질을 니트로셀룰로스 막 상에 전달하고, 이어서 이를 시판되는 모노클로날(monoclonal) 항체로 광견병 당단백질 트랜스진에 대해 프로빙하였다.
도 4 및 도 5는 감염 후 2 및 7 일 모두에서, 복제 가능 ChAd155 RC (도 4) 및 ChAd83 RC (도 5) 벡터가 복제 결함 ChAd155 RD 및 ChAd83 RD 벡터 각각보다 더 높은 수준으로 트랜스진을 발현한다는 것을 입증한다. 광견병 당단백질에 대한 항체로 프로빙하였을 때, 블롯의 좌측에 막대에 의해 표시되는 바와 같이, 광견병 당단백질의 예상 분자량에 상응하는 약 51 kDa의 밴드가 관찰되었다.
시험된 모든 벡터에 대해 2 일째 및 7 일째 모두에서 moi의 증가는 트랜스진 발현의 증가를 초래하였다. ChAd155와 관련하여, RC2 벡터는 최고 수준의 트랜스진 발현을 생산하였고, 이어서 ChAd155 RC1, 이어서 ChAd155 RD이었다. ChAd83과 관련하여, RC2 벡터는 최고 수준의 트랜스진 발현을 생산하였고, 이어서 ChAd155 RD 벡터, 이어서 ChAd155 RC1이었다.
감염 후 2 일에, ChAd155에 의한 낮은 수준의 발현이 hCMV (RC1) 또는 CASI (RC2) 프로모터로부터 유도되었을 때 웨스턴 블롯에 의해 관찰되었다. ChAd83에 의한 트랜스진의 피크 발현은 감염 2 일 후에 관찰되었는데, 이는 ChAd83 벡터가 MRC5 세포에서 세포변성이기 때문에 이러한 초기 시점에서 발생하였을 가능성이 높다. 또한, MRC5 세포에서 CMV 프로모터에 의해 유도된 ChAd83 발현은, 아데노 백본 E가 프로모터 차단/전사 침묵을 증강시키기 때문에 2 일보다 오래 지속되지 않았다.
7 일에, hCMV 프로모터에 의해 유도된 발현은 적은 정도로 증가하였고, CASI 프로모터에 의해 유도된 발현은 크게 증가하였고, hCMV 프로모터에 의해 유도된 발현보다 더 강력하였다. 대조적으로, 감염 후 2 일에, hCMV 및 CASI 둘 모두에 의해 유도된 ChAd83 발현은 ChAd155로 관찰된 것보다 훨씬 더 높았다. 그러나, 7 일에, hCMV 프로모터에 의해 유도된 발현은 거의 검출 불가능한 수준으로 떨어졌고, 반면에 CASI 프로모터에 의해 유도된 발현은 일정하게 유지되었다. 이론에 의해 제약되지 않으면서, 이는 ChAd83의 아데노 백본 (E형 아데노바이러스)이 프로모터 차단을 증강시키는 반면에, CASI 프로모터는 전사 침묵을 극복할 수 있음을 시사한다.
이들 연구는, HE2 유전자좌 내에 위치한, 좌측 배향으로 CASI 프로모터를 포함하는 RC2 벡터가 우측 배향으로 CMV 프로모터를 위치시키고, 결실된 E3 영역에 위치한 RC1 벡터보다 더 강력하게 트랜스진을 발현한다는 것을 입증한다 (도 1).
실시예 4: 복제 가능 아데노바이러스 게놈 카피 수
세포당 벡터 카피로서 표현된 본 발명의 복제 가능 아데노바이러스 벡터의 효율을 마우스 및 비-인간 영장류 모두로부터 유래된 세포 배양물에서 평가하였다. 도 6 (상부 패널)은 세포당 250 개 바이러스 입자의 moi에서, 단층으로 성장되고 ChAd155 RC1, ChAd155 RC2, ChAd83 RC1 또는 ChAd83 RC2로 감염된 쥐 간 NMuLi 세포에서 성장한 복제 가능 벡터의 게놈 카피 수를 제시한다. 총 DNA를 감염 후 5 일에 추출하고 벡터의 프로모터 영역에 어닐링(annealing)하는 프라이머를 사용하여 QPCR에 의해 벡터 복제를 측정하였다.
세포당 벡터 카피로서 표현된 결과를 도 6에 제시하였다 (상부 패널). ChAd155는 NMuLi 세포에서 높은 효율로 RC1 및 RC2 벡터 둘 모두를 증폭시켰다. ChAd155는 대략 동일한 정도로 RC1 (1.73 x 104) 및 RC2 (1.92 x 104) 벡터를 복제하였다. ChAd83은 RC1 및 RC2 벡터를 복제하는 데 있어서 ChAd155보다 덜 효율적이었다. ChAd83은 쥐 세포에서 소량으로만 벡터 DNA를 복제하였다. RC1 벡터는 세포당 5.47 x 102 카피의 수준으로, 및 RC2 벡터는 세포당 6.74 x 102 카피의 수준으로 복제되었다.
비-인간 영장류 베로 세포를 또한 단층으로 성장시키고, ChAd155 RC1, ChAd155 RC2, ChAd83 RC1 또는 ChAd83 RC2로 감염시켰다 (도 6 하부 패널). 감염의 2 가지 상이한 다중도를 사용하였다: 세포당 50 및 250 개의 바이러스 입자. 총 DNA를 감염 후 5 일에 추출하고 벡터의 프로모터 영역에 어닐링하는 프라이머를 사용하여 QPCR에 의해 벡터 복제를 측정하였다.
세포당 벡터 카피로서 표현된 결과를 도 6에 제시하였다 (하부 패널). 베로 영장류 세포주는 ChAd155 RC1 (50의 moi에서 세포당 3.71 x 103 카피 및 250의 moi에서 세포당 4.93 x 104 카피) 및 ChAd155 RC2 (50의 moi에서 세포당 8.15 x 103 카피 및 250의 moi에서 세포당 7.05 x 104 카피)에 대해 허용하였다. 베로 영장류 세포주는, 한다 하더라도, ChAd83 RC1 또는 ChAd83 RC2에 대해 잘 허용하지 않았다. ChAd83 RC1 또는 ChAd83 RC2 벡터는 50의 moi에서 베로 세포로부터 발현되는 것으로 검출되지 않았다. 250의 moi에서, ChAd83은 세포당 1.13 x 102 카피의 수준으로 RC1 벡터를, 및 세포당 1.29 x 103 카피의 수준으로 RC2 벡터를 복제하였다.
실시예 5: 쥐 및 비-인간 영장류 세포로부터의 트랜스진 발현
웨스턴 블롯 분석을 수행하여 쥐 NMuLi 세포에서 ChAd155 RC1 및 ChAd155 RC2에 의한 트랜스진 발현의 수준을 비교하였다 (도 7 상부 패널). 세포를 세포당 50, 250 또는 1250 개의 바이러스 입자의 moi에서 ChAd155 RC1 또는 ChAd155 RC2로 감염시켰다. 세포를 감염 후 2 일 및 5 일에 수확하고, 표준 방법을 사용하여 추출물을 제조하고, 등가량의 총 세포 추출물을 SDS-PAGE 겔 상에 로딩하였다. 전기영동 분리 후, 단백질을 니트로셀룰로스 막 상에 전달하고, 이어서 이를 시판되는 모노클로날 항체로 광견병 당단백질 트랜스진에 대해 프로빙하였다.
도 7 (상부 패널)은 ChAd155 RC1 및 ChAd155 RC2 둘 모두가 쥐 NMuLi 세포에서 트랜스진을 발현함을 입증한다. 감염 후 2 및 5 일 둘 모두에서 발현이 관찰되었고, 약 51 kDa의 밴드로 나타났고, 이는 광견병 당단백질(RG)의 예상 분자량에 상응한다. 감염 후 2 및 5 일 둘 모두에서 ChAd155 RC2 벡터는 ChAd155 RC1 벡터보다 더 높은 수준의 트랜스진 발현을 생산하였다.
이어서, 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 쥐 NMuLi 세포에서 ChAd155 RC1, ChAd155 RC2, ChAd83 RC1 및 ChAd83 RC2에 의한 트랜스진 발현의 수준을 비교하였다 (도 7 하부 패널). 세포를 세포당 50, 250 또는 1250 개의 바이러스 입자의 moi에서 (ChAd83 RC1에서는 250 및 1250) ChAd155 RC1, ChAd155 RC2, ChAd83 RC1 또는 ChAd83 RC2로 감염시켰다. 세포를 도 4에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯을 위해 가공하였다.
도 7 (하부 패널)은 ChAd155 RC1, ChAd155 RC2, ChAd83 RC1 및 ChAd83 RC2가 쥐 NMuLi 세포에서 트랜스진을 발현함을 입증한다. 감염 후 2 및 5 일 둘 모두에서 발현이 관찰되었고, 약 51 kDa의 밴드로 나타났고, 이는 광견병 당단백질(RG)의 예상 분자량에 상응한다. ChAd155는 ChAd83보다 트랜스진의 더 효율적인 발현을 입증하였다. 감염 2 일 후에, ChAd155 RC2에 의한 강력한 트랜스진 발현이 심지어 50 vp/세포의 낮은 moi에서도 관찰되었고, 반면에 ChAd155 RC1에 의한 강력한 트랜스진 발현은 더 높은 moi에서 처음 관찰되었다. 또한, RC2는 ChAd155 및 ChAd83 바이러스 혈청형 둘 모두에서 RC1보다 더 효율적인 트랜스진 발현을 입증하였다. 각각의 직접 비교에서 RC2는 RC1보다 더 강력하게 발현되었다.
실시예 6: 마우스에서 RD 및 RC1 벡터의 면역원성
T 세포 반응을 유도하기 위한 ChAd155 RD 벡터의 면역학적 효능을 Balb/c 마우스, 군당 6 마리 마우스에서의 ChAd155 RC1 및 ChAd83 RC1 벡터의 것과 비교하였다. 벡터를 105 및 106 바이러스 입자의 용량으로 근육내 주사하였다. 면역화 3 주 후에, 동물을 희생시키고, 면역화된 마우스의 비장세포를 단리하고, 광견병 당단백질 T 세포 에피토프(epitope)를 사용하여 IFN-감마-ELISpot에 의해 분석하였다. 백만 개 비장세포당 IFN-감마 스폿 형성 세포(SFC)로서 표현된 결과를 도 8에 제시하였다. 각각의 점은 단일 마우스에서의 반응을 나타내고, 수평선은 각각의 용량 군에 대한 기하평균에 상응한다.
106 vp의 용량에서, 모든 마우스는 양성으로 반응하였고, 항원성 트랜스진에 대한 면역 반응을 개시하였다 (도 8). 예상된 바와 같이, 면역 반응은 각각의 3 개의 벡터에 대해 더 높은 용량에서 더 강력하였다. ChAd155 RC1은 등가의 ChAd155 RD 또는 ChAd83 RC1 벡터 용량보다 면역 반응을 유도하는 데 더 강하였다. 이들 결과는 실시예 4 및 도 6에 제시한 데이터와 일치하였고, 이는 ChAd155 RC1 벡터와 비교하여 마우스 NMuLi 세포에서의 ChAd83의 복제 및 더 낮은 수준의 항원 발현을 거의 또는 전혀 나타내지 않는다.
실시예 7: 마우스에게 경구 투여된 RD 및 RC1 벡터의 면역원성
ChAd155-RD 및 ChAd155 RC1 벡터의 면역학적 효능을 마우스에서 평가하고; 복제 결함 및 복제 가능 ChAd155 벡터를 비교하고, 결과를 도 9에 제시한다. 동물 (군당 6 마리)을 경구 또는 근육내 경로에 의해 면역화시킨 다음, 트랜스제닉 항원에 대한 중화 항체 반응 (상부 패널) 및 T 세포 반응 (하부 패널)에 대해 평가하였다.
도 9 (상부 패널)는 경구 5 x 108 개 바이러스 입자 또는 근육내 1 x 107 개 바이러스 입자가 투여된 마우스의 체액성 중화 항체 면역 반응을 기재한다. 면역화 8 주 후에, 중화 항체 역가를 시판되는 모노클로날 항체를 사용하여 광견병 G 단백질에 대해 형광 항체 바이러스 중화 검정(FAVN)으로 측정하였다.
바이러스 중화 역가, B 세포 (항체) 반응의 척도가 도 9에 제시되어 있다 (상부 패널). 각각의 점은 단일 마우스의 반응을 나타낸다. 도 9의 상부 패널은 ChAd155 RD 또는 ChAd155 RC1의 단일 투여 이후 8 주 내에 혈청에서 기능적 중화 항체가 검출되었음을 입증한다. ChAd155 RC1을 경구 투여할 때, 6 마리의 마우스 모두는 보호 역치 초과의 중화 항체 역가를 가졌다 (점선). ChAd155 RD의 경구 투여는 6 마리의 마우스 중 4 마리가 보호 역치 초과의 중화 항체 역가를 생산하는 결과를 초래하였다.
ChAd155 RC1을 근육내 투여할 때, 모든 6 마리의 마우스는 보호 역치 초과의 중화 항체 역가를 가졌다. ChAd155 RD의 근육내 투여는 6 마리 마우스 중 5 마리가 보호 역치 초과의 중화 항체 역가를 생성하는 결과를 초래하였다.
ChAd155 RC1 벡터로 면역화된 마우스의 중화 역가는 경구 또는 IM 투여되는지 관계 없이 ChAd155 RD 벡터로 면역화된 것보다 더 높았다. 이는 본 발명의 복제 가능 ChAd155 벡터가 경구 또는 근육내 투여되든지 간에 트랜스제닉 항원에 대한 항체 반응을 유도하는 데 있어서 복제 결함 ChAd155 벡터보다 더 효과적이라는 것을 입증한다.
트랜스제닉 항원으로 백신 접종된 동물의 비장세포에서 ELISpot에 의해 IFN-감마 분비에 의한 T 세포 반응을 측정하였고, 이를 도 9에 제시하였다 (하부 패널). 마우스에게 경구 5 x 108 개 바이러스 입자 또는 근육내 1 x 107 개 바이러스 입자를 투여하였다. 면역화 3 주 후에, T 세포 반응을 실시예 6에 기재된 바와 같이 ELISpot에 의해 측정하였다. 각각의 점은 단일 마우스의 반응을 나타낸다.
T 세포 (세포 면역) 반응의 척도인, IFN-감마 분비를 도 9에 제시하였다 (하부 패널). 각각의 점은 단일 마우스의 반응을 나타낸다. 도 9는 ChAd155 RD 또는 ChAd155 RC1의 단일 투여 이후 면역화 후 3 주 이내에 T 세포 면역 반응이 검출되었음을 입증한다. ChAd155 RC1을 경구 투여하는 경우, 모든 6 마리의 마우스는 T 세포 반응을 개시하였다. ChAd155 RD의 경구 투여는 6 마리 마우스 중 4 마리가 T 세포 반응을 개시하는 결과를 초래하였다.
ChAd155 RC1 벡터로 면역화된 마우스의 T 세포 반응은 경구 또는 IM 투여되는지 관계 없이 ChAd155 RD 벡터로 면역화된 것보다 더 높았다. 이는 본 발명의 복제 가능 ChAd155 벡터가 경구 또는 근육내 투여되든지 간에 트랜스제닉 항원에 대한 세포성 면역 반응을 유도하는 데 있어서 복제 결함 ChAd155 벡터보다 더 효과적이라는 것을 입증한다.
실시예 8: 돼지에서의 복제 가능 벡터의 면역원성
통상 돼지 또는 멧돼지로서 공지된 멧돼지 속(genus Sus)의 동물은 PK1 돼지 세포에서 시험관내 데이터를 기반으로 하여, 이들이 ChAd 복제를 허용할 가능성이 있기 때문에 관련 모델을 제공한다. 면역원성을 입증하기 위해, 돼지, 예를 들어, 집돼지(Sus scrofa domesticus)는 대략 1 x 1010 - 1 x 1012 개 바이러스 입자의 용량으로 근육내 또는 비강내 전달되는 복제 가능 ChAd155 또는 ChAd83 벡터로 면역화될 수 있다. 수집된 혈청 샘플을 중화 항체, T 세포 반응 및 B 세포 반응에 대해 분석할 수 있다. 백신 접종 후 쉐딩(shedding)은 비내 분비물, 타액 또는 분변을 수집함으로써 모니터링할 수 있다. 바이러스가 쉐딩되는 부위는 그의 생체분포를 나타낼 수 있고, 예를 들어 쉐딩이 비내 분비물로부터 우세하게 발생하는 경우에, 바이러스가 상기도에서 복제하는 선호도를 갖는 것으로 추론될 수 있다. 안전성의 지표는 체중, 체온, 음식물 소비, 혈액학적 파라미터 및 혈청 화학의 측정을 포함할 수 있다.
일단 본 발명의 벡터의 면역원성이 근육내 및 비강내 투여를 통해 돼지 모델에서 입증되면, 설하 투여를 포함한 다른 경로를 통해 면역원성을 시험할 수 있다. 실험 설계는 복제 가능 및 복제 결함 벡터의 비교, ChAd155 및 ChAd83 벡터의 비교, 구축물 내의 다양한 위치에서의 CASI 및 CMV 프로모터를 포함한 프로모터의 비교, 다양한 인핸서 요소, 예를 들어 WPRE의 효과의 비교, 및 설하 경로와 다른 면역화 경로의 비교를 포함할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> GSK BIOLOGICALS S.A. <120> REPLICATION COMPETENT ADENOVIRAL VECTORS <130> VU66430 WO <140> <141> <150> 62/572,927 <151> 2017-10-16 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 37830 <212> DNA <213> Chimpanzee adenovirus <400> 1 catcatcaat aatatacctt attttggatt gaagccaata tgataatgag atgggcggcg 60 cggggcggga ggcgggtccg ggggcgggcc ggcgggcggg gcggtgtggc ggaagtggac 120 tttgtaagtg tggcggatgt gacttgctag tgccgggcgc ggtaaaagtg acgttttccg 180 tgcgcgacaa cgcccacggg aagtgacatt tttcccgcgg tttttaccgg atgttgtagt 240 gaatttgggc gtaaccaagt aagatttggc cattttcgcg ggaaaactga aacggggaag 300 tgaaatctga ttaatttcgc gttagtcata ccgcgtaata tttgtcgagg gccgagggac 360 tttggccgat tacgtggagg actcgcccag gtgttttttg aggtgaattt ccgcgttccg 420 ggtcaaagtc tccgttttat tattatagtc agctgacgcg gagtgtattt ataccctctg 480 atctcgtcaa gtggccactc ttgagtgcca gcgagtagag ttttctcctc tgccgctctc 540 cgctccgctc cgctcggctc tgacaccggg gaaaaaatga gacatttcac ctacgatggc 600 ggtgtgctca ccggccagct ggctgctgaa gtcctggaca ccctgatcga ggaggtattg 660 gccgataatt atcctccctc gactcctttt gagccaccta cacttcacga actctacgat 720 ctggatgtgg tggggcccag cgatccgaac gagcaggcgg tttccagttt ttttccagag 780 tccatgttgt tggccagcca ggagggggtc gaacttgaga cccctcctcc gatcgtggat 840 tcccccgatc cgccgcagct gactaggcag cccgagcgct gtgcgggacc tgagactatg 900 ccccagctgc tacctgaggt gatcgatctc acctgtaatg agtctggttt tccacccagc 960 gaggatgagg acgaagaggg tgagcagttt gtgttagatt ctgtggaaca acccgggcga 1020 ggatgcaggt cttgtcaata tcaccggaaa aacacaggag actcccagat tatgtgttct 1080 ctgtgttata tgaagatgac ctgtatgttt atttacagta agtttatcat ctgtgggcag 1140 gtgggctata gtgtgggtgg tggtctttgg ggggtttttt aatatatgtc aggggttatg 1200 ctgaagactt ttttattgtg atttttaaag gtccagtgtc tgagcccgag caagaacctg 1260 aaccggagcc tgagccttct cgccccagga gaaagcctgt aatcttaact agacccagcg 1320 caccggtagc gagaggcctc agcagcgcgg agaccaccga ctccggtgct tcctcatcac 1380 ccccggagat tcaccccctg gtgcccctgt gtcccgttaa gcccgttgcc gtgagagtca 1440 gtgggcggcg gtctgctgtg gagtgcattg aggacttgct ttttgattca caggaacctt 1500 tggacttgag cttgaaacgc cccaggcatt aaacctggtc acctggactg aatgagttga 1560 cgcctatgtt tgcttttgaa tgacttaatg tgtatagata ataaagagtg agataatgtt 1620 ttaattgcat ggtgtgttta acttgggcgg agtctgctgg gtatataagc ttccctgggc 1680 taaacttggt tacacttgac ctcatggagg cctgggagtg tttggagaac tttgccggag 1740 ttcgtgcctt gctggacgag agctctaaca atacctcttg gtggtggagg tatttgtggg 1800 gctctcccca gggcaagtta gtttgtagaa tcaaggagga ttacaagtgg gaatttgaag 1860 agcttttgaa atcctgtggt gagctattgg attctttgaa tctaggccac caggctctct 1920 tccaggagaa ggtcatcagg actttggatt tttccacacc ggggcgcatt gcagccgcgg 1980 ttgcttttct agcttttttg aaggatagat ggagcgaaga gacccacttg agttcgggct 2040 acgtcctgga ttttctggcc atgcaactgt ggagagcatg gatcagacac aagaacaggc 2100 tgcaactgtt gtcttccgtc cgcccgttgc tgattccggc ggaggagcaa caggccgggt 2160 cagaggaccg ggcccgtcgg gatccggagg agagggcacc gaggccgggc gagaggagcg 2220 cgctgaacct gggaaccggg ctgagcggcc atccacatcg ggagtgaatg tcgggcaggt 2280 ggtggatctt tttccagaac tgcggcggat tttgactatt agggaggatg ggcaatttgt 2340 taagggtctt aagagggaga ggggggcttc tgagcataac gaggaggcca gtaatttagc 2400 ttttagcttg atgaccagac accgtccaga gtgcatcact tttcagcaga ttaaggacaa 2460 ttgtgccaat gagttggatc tgttgggtca gaagtatagc atagagcagc tgaccactta 2520 ctggctgcag ccgggtgatg atctggagga agctattagg gtgtatgcta aggtggccct 2580 gcggcccgat tgcaagtaca agctcaaggg gctggtgaat atcaggaatt gttgctacat 2640 ttctggcaac ggggcggagg tggagataga gaccgaagac agggtggctt tcagatgcag 2700 catgatgaat atgtggccgg gggtgctggg catggacggg gtggtgatta tgaatgtgag 2760 gttcacgggg cccaacttta acggcacggt gtttttgggg aacaccaacc tggtcctgca 2820 cggggtgagc ttctatgggt ttaacaacac ctgtgtggag gcctggaccg atgtgaaggt 2880 ccgcggttgc gccttttatg gatgttggaa ggccatagtg agccgcccta agagcaggag 2940 ttccattaag aaatgcttgt ttgagaggtg caccttgggg atcctggccg agggcaactg 3000 cagggtgcgc cacaatgtgg cctccgagtg cggttgcttc atgctagtca agagcgtggc 3060 ggtaatcaag cataatatgg tgtgcggcaa cagcgaggac aaggcctcac agatgctgac 3120 ctgcacggat ggcaactgcc acttgctgaa gaccatccat gtaaccagcc acagccggaa 3180 ggcctggccc gtgttcgagc acaacttgct gacccgctgc tccttgcatc tgggcaacag 3240 gcggggggtg ttcctgccct atcaatgcaa ctttagtcac accaagatct tgctagagcc 3300 cgagagcatg tccaaggtga acttgaacgg ggtgtttgac atgaccatga agatctggaa 3360 ggtgctgagg tacgacgaga ccaggtcccg gtgcagaccc tgcgagtgcg ggggcaagca 3420 tatgaggaac cagcccgtga tgctggatgt gaccgaggag ctgaggacag accacttggt 3480 tctggcctgc accagggccg agtttggttc tagcgatgaa gacacagatt gaggtgggtg 3540 agtgggcgtg gcctggggtg gtcatgaaaa tatataagtt gggggtctta gggtctcttt 3600 atttgtgttg cagagaccgc cggagccatg agcgggagca gcagcagcag cagtagcagc 3660 agcgccttgg atggcagcat cgtgagccct tatttgacga cgcggatgcc ccactgggcc 3720 ggggtgcgtc agaatgtgat gggctccagc atcgacggcc gacccgtcct gcccgcaaat 3780 tccgccacgc tgacctatgc gaccgtcgcg gggacgccgt tggacgccac cgccgccgcc 3840 gccgccaccg cagccgcctc ggccgtgcgc agcctggcca cggactttgc attcctggga 3900 ccactggcga caggggctac ttctcgggcc gctgctgccg ccgttcgcga tgacaagctg 3960 accgccctgc tggcgcagtt ggatgcgctt actcgggaac tgggtgacct ttctcagcag 4020 gtcatggccc tgcgccagca ggtctcctcc ctgcaagctg gcgggaatgc ttctcccaca 4080 aatgccgttt aagataaata aaaccagact ctgtttggat taaagaaaag tagcaagtgc 4140 attgctctct ttatttcata attttccgcg cgcgataggc cctagaccag cgttctcggt 4200 cgttgagggt gcggtgtatc ttctccagga cgtggtagag gtggctctgg acgttgagat 4260 acatgggcat gagcccgtcc cgggggtgga ggtagcacca ctgcagagct tcatgctccg 4320 gggtggtgtt gtagatgatc cagtcgtagc aggagcgctg ggcatggtgc ctaaaaatgt 4380 ccttcagcag caggccgatg gccaggggga ggcccttggt gtaagtgttt acaaaacggt 4440 taagttggga agggtgcatt cggggagaga tgatgtgcat cttggactgt atttttagat 4500 tggcgatgtt tccgcccaga tcccttctgg gattcatgtt gtgcaggacc accagtacag 4560 tgtatccggt gcacttgggg aatttgtcat gcagcttaga gggaaaagcg tggaagaact 4620 tggagacgcc tttgtggcct cccagatttt ccatgcattc gtccatgatg atggcaatgg 4680 gcccgcggga ggcagcttgg gcaaagatat ttctggggtc gctgacgtcg tagttgtgtt 4740 ccagggtgag gtcgtcatag gccattttta caaagcgcgg gcggagggtg cccgactggg 4800 ggatgatggt cccctctggc cctggggcgt agttgccctc gcagatctgc atttcccagg 4860 ccttaatctc ggagggggga atcatatcca cctgcggggc gatgaagaaa acggtttccg 4920 gagccgggga gattaactgg gatgagagca ggtttctaag cagctgtgat tttccacaac 4980 cggtgggccc ataaataaca cctataaccg gttgcagctg gtagtttaga gagctgcagc 5040 tgccgtcgtc ccggaggagg ggggccacct cgttgagcat gtccctgacg cgcatgttct 5100 ccccgaccag atccgccaga aggcgctcgc cgcccaggga cagcagctct tgcaaggaag 5160 caaagttttt cagcggcttg aggccgtccg ccgtgggcat gtttttcagg gtctggctca 5220 gcagctccag gcggtcccag agctcggtga cgtgctctac ggcatctcta tccagcatat 5280 ctcctcgttt cgcgggttgg ggcgactttc gctgtagggc accaagcggt ggtcgtccag 5340 cggggccaga gtcatgtcct tccatgggcg cagggtcctc gtcagggtgg tctgggtcac 5400 ggtgaagggg tgcgctccgg gctgagcgct tgccaaggtg cgcttgaggc tggttctgct 5460 ggtgctgaag cgctgccggt cttcgccctg cgcgtcggcc aggtagcatt tgaccatggt 5520 gtcatagtcc agcccctccg cggcgtgtcc cttggcgcgc agcttgccct tggaggtggc 5580 gccgcacgag gggcagagca ggctcttgag cgcgtagagc ttgggggcga ggaagaccga 5640 ttcgggggag taggcgtccg cgccgcagac cccgcacacg gtctcgcact ccaccagcca 5700 ggtgagctcg gggcgcgccg ggtcaaaaac caggtttccc ccatgctttt tgatgcgttt 5760 cttacctcgg gtctccatga ggtggtgtcc ccgctcggtg acgaagaggc tgtccgtgtc 5820 tccgtagacc gacttgaggg gtcttttctc caggggggtc cctcggtctt cctcgtagag 5880 gaactcggac cactctgaga cgaaggcccg cgtccaggcc aggacgaagg aggctatgtg 5940 ggaggggtag cggtcgttgt ccactagggg gtccaccttc tccaaggtgt gaagacacat 6000 gtcgccttcc tcggcgtcca ggaaggtgat tggcttgtag gtgtaggcca cgtgaccggg 6060 ggttcctgac gggggggtat aaaagggggt gggggcgcgc tcgtcgtcac tctcttccgc 6120 atcgctgtct gcgagggcca gctgctgggg tgagtattcc ctctcgaagg cgggcatgac 6180 ctccgcgctg aggttgtcag tttccaaaaa cgaggaggat ttgatgttca cctgtcccga 6240 ggtgatacct ttgagggtac ccgcgtccat ctggtcagaa aacacgatct ttttattgtc 6300 cagcttggtg gcgaacgacc cgtagagggc gttggagagc agcttggcga tggagcgcag 6360 ggtctggttc ttgtccctgt cggcgcgctc cttggccgcg atgttgagct gcacgtactc 6420 gcgcgcgacg cagcgccact cggggaagac ggtggtgcgc tcgtcgggca ccaggcgcac 6480 gcgccagccg cggttgtgca gggtgaccag gtccacgctg gtggcgacct cgccgcgcag 6540 gcgctcgttg gtccagcaga gacggccgcc cttgcgcgag cagaaggggg gcagggggtc 6600 gagctgggtc tcgtccgggg ggtccgcgtc cacggtgaaa accccggggc gcaggcgcgc 6660 gtcgaagtag tctatcttgc aaccttgcat gtccagcgcc tgctgccagt cgcgggcggc 6720 gagcgcgcgc tcgtaggggt tgagcggcgg gccccagggc atggggtggg tgagtgcgga 6780 ggcgtacatg ccgcagatgt catagacgta gaggggctcc cgcaggaccc cgatgtaggt 6840 ggggtagcag cggccgccgc ggatgctggc gcgcacgtag tcatacagct cgtgcgaggg 6900 ggcgaggagg tcggggccca ggttggtgcg ggcggggcgc tccgcgcgga agacgatctg 6960 cctgaagatg gcatgcgagt tggaagagat ggtggggcgc tggaagacgt tgaagctggc 7020 gtcctgcagg ccgacggcgt cgcgcacgaa ggaggcgtag gagtcgcgca gcttgtgtac 7080 cagctcggcg gtgacctgca cgtcgagcgc gcagtagtcg agggtctcgc ggatgatgtc 7140 atatttagcc tgccccttct ttttccacag ctcgcggttg aggacaaact cttcgcggtc 7200 tttccagtac tcttggatcg ggaaaccgtc cggttccgaa cggtaagagc ctagcatgta 7260 gaactggttg acggcctggt aggcgcagca gcccttctcc acggggaggg cgtaggcctg 7320 cgcggccttg cggagcgagg tgtgggtcag ggcgaaggtg tccctgacca tgactttgag 7380 gtactggtgc ttgaagtcgg agtcgtcgca gccgccccgc tcccagagcg agaagtcggt 7440 gcgcttcttg gagcgggggt tgggcagagc gaaggtgaca tcgttgaaga ggattttgcc 7500 cgcgcggggc atgaagttgc gggtgatgcg gaagggcccc ggcacttcag agcggttgtt 7560 gatgacctgg gcggcgagca cgatctcgtc gaagccgttg atgttgtggc ccacgatgta 7620 gagttccagg aagcggggcc ggccctttac ggtgggcagc ttctttagct cttcgtaggt 7680 gagctcctcg ggcgaggcga ggccgtgctc ggccagggcc cagtccgcga ggtgcgggtt 7740 gtctctgagg aaggacttcc agaggtcgcg ggccaggagg gtctgcaggc ggtctctgaa 7800 ggtcctgaac tggcggccca cggccatttt ttcgggggtg atgcagtaga aggtgagggg 7860 gtcttgctgc cagcggtccc agtcgagctg cagggcgagg tcgcgcgcgg cggtgaccag 7920 gcgctcgtcg cccccgaatt tcatgaccag catgaagggc acgagctgct ttccgaaggc 7980 ccccatccaa gtgtaggtct ctacatcgta ggtgacaaag aggcgctccg tgcgaggatg 8040 cgagccgatc gggaagaact ggatctcccg ccaccagttg gaggagtggc tgttgatgtg 8100 gtggaagtag aagtcccgtc gccgggccga acactcgtgc tggcttttgt aaaagcgagc 8160 gcagtactgg cagcgctgca cgggctgtac ctcatgcacg agatgcacct ttcgcccgcg 8220 cacgaggaag ccgaggggaa atctgagccc cccgcctggc tcgcggcatg gctggttctc 8280 ttctactttg gatgcgtgtc cgtctccgtc tggctcctcg aggggtgtta cggtggagcg 8340 gaccaccacg ccgcgcgagc cgcaggtcca gatatcggcg cgcggcggtc ggagtttgat 8400 gacgacatcg cgcagctggg agctgtccat ggtctggagc tcccgcggcg gcggcaggtc 8460 agccgggagt tcttgcaggt tcacctcgca gagtcgggcc agggcgcggg gcaggtctag 8520 gtggtacctg atctctaggg gcgtgttggt ggcggcgtcg atggcttgca ggagcccgca 8580 gccccggggg gcgacgacgg tgccccgcgg ggtggtggtg gtggtggcgg tgcagctcag 8640 aagcggtgcc gcgggcgggc ccccggaggt agggggggct ccggtcccgc gggcaggggc 8700 ggcagcggca cgtcggcgtg gagcgcgggc aggagttggt gctgtgcccg gaggttgctg 8760 gcgaaggcga cgacgcggcg gttgatctcc tggatctggc gcctctgcgt gaagacgacg 8820 ggcccggtga gcttgaacct gaaagagagt tcgacagaat caatctcggt gtcattgacc 8880 gcggcctggc gcaggatctc ctgcacgtct cccgagttgt cttggtaggc gatctcggcc 8940 atgaactgct cgatctcttc ctcctggagg tctccgcgtc cggcgcgttc cacggtggcc 9000 gccaggtcgt tggagatgcg ccccatgagc tgcgagaagg cgttgagtcc gccctcgttc 9060 cagactcggc tgtagaccac gcccccctgg tcatcgcggg cgcgcatgac cacctgcgcg 9120 aggttgagct ccacgtgccg cgcgaagacg gcgtagttgc gcagacgctg gaagaggtag 9180 ttgagggtgg tggcggtgtg ctcggccacg aagaagttca tgacccagcg gcgcaacgtg 9240 gattcgttga tgtcccccaa ggcctccagc cgttccatgg cctcgtagaa gtccacggcg 9300 aagttgaaaa actgggagtt gcgcgccgac acggtcaact cctcctccag aagacggatg 9360 agctcggcga cggtgtcgcg cacctcgcgc tcgaaggcta tggggatctc ttcctccgct 9420 agcatcacca cctcctcctc ttcctcctct tctggcactt ccatgatggc ttcctcctct 9480 tcggggggtg gcggcggcgg cggtggggga gggggcgctc tgcgccggcg gcggcgcacc 9540 gggaggcggt ccacgaagcg cgcgatcatc tccccgcggc ggcggcgcat ggtctcggtg 9600 acggcgcggc cgttctcccg ggggcgcagt tggaagacgc cgccggacat ctggtgctgg 9660 ggcgggtggc cgtgaggcag cgagacggcg ctgacgatgc atctcaacaa ttgctgcgta 9720 ggtacgccgc cgagggacct gagggagtcc atatccaccg gatccgaaaa cctttcgagg 9780 aaggcgtcta accagtcgca gtcgcaaggt aggctgagca ccgtggcggg cggcgggggg 9840 tggggggagt gtctggcgga ggtgctgctg atgatgtaat tgaagtaggc ggacttgaca 9900 cggcggatgg tcgacaggag caccatgtcc ttgggtccgg cctgctggat gcggaggcgg 9960 tcggctatgc cccaggcttc gttctggcat cggcgcaggt ccttgtagta gtcttgcatg 10020 agcctttcca ccggcacctc ttctccttcc tcttctgctt cttccatgtc tgcttcggcc 10080 ctggggcggc gccgcgcccc cctgcccccc atgcgcgtga ccccgaaccc cctgagcggt 10140 tggagcaggg ccaggtcggc gacgacgcgc tcggccagga tggcctgctg cacctgcgtg 10200 agggtggttt ggaagtcatc caagtccacg aagcggtggt aggcgcccgt gttgatggtg 10260 taggtgcagt tggccatgac ggaccagttg acggtctggt ggcccggttg cgacatctcg 10320 gtgtacctga gtcgcgagta ggcgcgggag tcgaagacgt agtcgttgca agtccgcacc 10380 aggtactggt agcccaccag gaagtgcggc ggcggctggc ggtagagggg ccagcgcagg 10440 gtggcggggg ctccgggggc caggtcttcc agcatgaggc ggtggtaggc gtagatgtac 10500 ctggacatcc aggtgatacc cgcggcggtg gtggaggcgc gcgggaagtc gcgcacccgg 10560 ttccagatgt tgcgcagggg cagaaagtgc tccatggtag gcgtgctctg tccagtcaga 10620 cgcgcgcagt cgttgatact ctagaccagg gaaaacgaaa gccggtcagc gggcactctt 10680 ccgtggtctg gtgaatagat cgcaagggta tcatggcgga gggcctcggt tcgagccccg 10740 ggtccgggcc ggacggtccg ccatgatcca cgcggttacc gcccgcgtgt cgaacccagg 10800 tgtgcgacgt cagacaacgg tggagtgttc cttttggcgt ttttctggcc gggcgccggc 10860 gccgcgtaag agactaagcc gcgaaagcga aagcagtaag tggctcgctc cccgtagccg 10920 gagggatcct tgctaagggt tgcgttgcgg cgaaccccgg ttcgaatccc gtactcgggc 10980 cggccggacc cgcggctaag gtgttggatt ggcctccccc tcgtataaag accccgcttg 11040 cggattgact ccggacacgg ggacgagccc cttttatttt tgctttcccc agatgcatcc 11100 ggtgctgcgg cagatgcgcc ccccgcccca gcagcagcaa caacaccagc aagagcggca 11160 gcaacagcag cgggagtcat gcagggcccc ctcacccacc ctcggcgggc cggccacctc 11220 ggcgtccgcg gccgtgtctg gcgcctgcgg cggcggcggg gggccggctg acgaccccga 11280 ggagcccccg cggcgcaggg ccagacacta cctggacctg gaggagggcg agggcctggc 11340 gcggctgggg gcgccgtctc ccgagcgcca cccgcgggtg cagctgaagc gcgactcgcg 11400 cgaggcgtac gtgcctcggc agaacctgtt cagggaccgc gcgggcgagg agcccgagga 11460 gatgcgggac aggaggttca gcgcagggcg ggagctgcgg caggggctga accgcgagcg 11520 gctgctgcgc gaggaggact ttgagcccga cgcgcggacg gggatcagcc ccgcgcgcgc 11580 gcacgtggcg gccgccgacc tggtgacggc gtacgagcag acggtgaacc aggagatcaa 11640 cttccaaaag agtttcaaca accacgtgcg cacgctggtg gcgcgcgagg aggtgaccat 11700 cgggctgatg cacctgtggg actttgtaag cgcgctggtg cagaacccca acagcaagcc 11760 tctgacggcg cagctgttcc tgatagtgca gcacagcagg gacaacgagg cgtttaggga 11820 cgcgctgctg aacatcaccg agcccgaggg tcggtggctg ctggacctga ttaacatcct 11880 gcagagcata gtggtgcagg agcgcagcct gagcctggcc gacaaggtgg cggccatcaa 11940 ctactcgatg ctgagcctgg gcaagtttta cgcgcgcaag atctaccaga cgccgtacgt 12000 gcccatagac aaggaggtga agatcgacgg tttttacatg cgcatggcgc tgaaggtgct 12060 caccctgagc gacgacctgg gcgtgtaccg caacgagcgc atccacaagg ccgtgagcgt 12120 gagccggcgg cgcgagctga gcgaccgcga gctgatgcac agcctgcagc gggcgctggc 12180 gggcgccggc agcggcgaca gggaggcgga gtcctacttc gatgcggggg cggacctgcg 12240 ctgggcgccc agccggcggg ccctggaggc cgcgggggtc cgcgaggact atgacgagga 12300 cggcgaggag gatgaggagt acgagctaga ggagggcgag tacctggact aaaccgcggg 12360 tggtgtttcc ggtagatgca 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tctatataag gcgaagcgct 660 ccctatcagt gatagagatc tccctatcag tgatagagat cgtcgacgag ctcgcggcgg 720 gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct ccgccgccgc ctcgcgccgc 780 ccgccccggc tctgactgac cgcgttacta aaacaggtaa gtccggcctc cgcgccgggt 840 tttggcgcct cccgcgggcg cccccctcct cacggcgagc gctgccacgt cagacgaagg 900 gcgcagcgag cgtcctgatc cttccgcccg gacgctcagg acagcggccc gctgctcata 960 agactcggcc ttagaacccc agtatcagca gaaggacatt ttaggacggg acttgggtga 1020 ctctagggca ctggttttct ttccagagag cggaacaggc gaggaaaagt agtcccttct 1080 cggcgattct gcggagggat ctccgtgggg cggtgaacgc cgatgatgcc tctactaacc 1140 atgttcatgt tttctttttt tttctacagg tcctgggtga cgaacag 1187

Claims (22)

  1. 프로모터 및 트랜스진을 포함하고, 벡터의 E3 영역, HE1 부위 또는 HE2 부위에 삽입되는 발현 카세트를 포함하는 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 원숭이는 침팬지인 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 침팬지 아데노바이러스 섬유 폴리펩티드 또는 그의 기능적 유도체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 침팬지 아데노바이러스 E4 영역을 추가로 포함하는 복제 가능 침팬지 아데노바이러스 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 벡터는 인간에서 낮은 혈청 유병률을 갖는 아데노바이러스인 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 벡터는 ChAd155인 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  6. 제4항에 있어서, 벡터는 ChAd83인 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  7. 제1항에 있어서, 프로모터는 CASI 프로모터 및 증강된 시토메갈로바이러스 프로모터로부터 선택되는 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 프로모터는 CASI 프로모터인 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  9. 제7항에 있어서, 프로모터는 증강된 시토메갈로바이러스 프로모터인 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  10. 제1항에 있어서, 발현 카세트는 전사후 조절 요소를 추가로 포함하는 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 전사후 조절 요소는 우드척 간염 전사후 조절 요소인 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  12. 제1항에 있어서, 트랜스진은 항원인 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 항원은 광견병 바이러스 항원, 호흡기 세포융합 바이러스 항원, 인간 면역결핍 바이러스 항원, 결핵 항원, 말라리아 항원, C형 간염 바이러스 항원, 치쿤군야 항원 및 B형 간염 바이러스 항원으로부터 선택되는, 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  14. 제1항에 있어서, 발현 카세트는 E3 영역 내에 삽입되는 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  15. 제1항에 있어서, 발현 카세트는 HE1 영역 내에 삽입되는 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  16. 제1항에 있어서, 발현 카세트는 HE2 영역 내에 삽입되는 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  17. 병원체에 의해 야기되는 질환에 대한 면역 반응을 이를 필요로 하는 대상체에서 유도하기 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터의 사용 방법.
  18. 질환의 예방 또는 치료를 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터의 용도.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 근육내 주사에 의해 투여되는 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터는 경구 투여되는 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터.
  21. 벡터는 근육내 주사에 의해 투여되는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터의 사용 방법.
  22. 벡터는 경구 투여되는, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 복제 가능 원숭이 아데노바이러스 벡터의 사용 방법.

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