CN103492574B - 使用腺相关病毒(aav)载体递送蛋白 - Google Patents
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Abstract
本文公开了用于使用腺相关病毒(AAV)载体递送感兴趣的蛋白的组合物、系统和方法。公开了包括5’和3’反向重复序列(ITR)、启动子、用于多核苷酸的插入的限制性酶切位点和转录后调节元件的AAV载体。还公开了AAV载体用于表达中和抗体的用途。
Description
相关申请
根据35U.S.C.§119(e),本申请要求以下的美国临时申请号的优先权:2011年2月22日提交的61/445,449;2011年10月21日提交的61/550,123;和2012年2月14日提交的61/598,728。这些优先权申请通过引用整体明确并入本文。
关于联邦政府赞助R&D的声明
本发明根据美国国立卫生研究院(theNationalInstitutesofHealth)授予的HHSN266200500035C,在政府的支持下完成的。政府在本发明中具有某些权利。
序列表的引用
本申请与电子格式的序列表一起提交。提供序列表作为2012年2月21日创建的、大小为148Kb、命名为SEQLISTING.TXT的文件。序列表的电子格式中的信息通过引用整体并入本文。
背景
发明领域
本申请一般涉及免疫学和基因递送领域。更具体地,本申请涉及用于生产感兴趣的蛋白诸如抗体的组合物、系统和方法。
相关技术的描述
尽管巨大的努力,至今还没有开发用于人类免疫缺陷病毒(HIV)的有效的疫苗。已鉴定出许多抗体为能够中和大部分循环的HIV毒株。尽管大量的努力集中在设计能够从头(denovo)诱发将针对相似表位的抗体的免疫原上,但传统的疫苗是否将能够诱发现有的广泛中和抗体的类似物仍然不清楚。作为免疫的替代,本文描述的载体介导的基因转移能够被用于设计现有的广泛中和抗体的分泌进入循环。
现有的目标为生产遗传编码的治疗蛋白的方法仅导致有限水平的基因表达。例如,先前使用基于腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)的载体设计体液免疫的努力导致中度的抗体生产(Lewis等人,J.Virol.76:8769–8775(2002)),其随后通过使用替代的衣壳(Fang等人NatureBiotechnol.,23:584–590(2005))和以运载能力为代价的增加表达的自身互补AAV(scAAV)载体(McCarty.,Mol.Ther.,16:1648–1656(2008))被改进。近来,将scAAV载体用于由小的、人工融合的抗体片段组成的猿猴免疫缺陷病毒(SIV)-中和免疫粘附素的直接表达(Johnson等人,NatureMed.,15(8):901–906(2009))。然而,该预防的功效被针对免疫粘附素蛋白的内源免疫应答所限制。另外,现有的基于AAV方法的效力的缺乏可追溯到AAV载体无能力传递长度大于约4800碱基对的序列。Dong等人,HumanGeneTherapy,7:2101-2112(1996)。AAV载体的该限制已使得难以设计包含编码治疗蛋白的基因和表达促进元件以允许用于特别是体内(invivo)高水平生产的载体。因此,对能够有效表达基因的紧凑型载体和系统的开发具有迫切的需求。
概述
本文公开的一些实施方案提供了病毒载体,其中该病毒载体包括:腺相关病毒(AAV)的5’末端反向重复序列(invertedterminalrepeat,ITR)和3’AAVITR;启动子;启动子下游的限制性酶切位点以允许编码一个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸的插入,和限制性酶切位点下游的转录后调节元件,其中启动子、限制性酶切位点和转录后调节元件位于5’AAVITR的下游和3’AAVITR的上游。
在一些实施方案中,该病毒载体还包括插入在限制性酶切位点并与启动子可操作地连接的多核苷酸,其中多核苷酸包括感兴趣的蛋白的编码区。
在一些实施方案中,多核苷酸包括感兴趣的蛋白的编码区的直接上游的信号肽序列。在一些实施方案中,信号肽选自以下组成的组:干扰素的信号肽、人生长激素的信号肽、红细胞生成素(EPO)的信号肽、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的信号肽、胰岛素的信号肽、和其任何组合。
在一些实施方案中,病毒载体包括与Kozak共有序列具有至少约70%、至少约80%、至少约90%序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中,感兴趣的蛋白选自以下组成的组:全长抗体、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF)、G-CSF、红细胞生成素(EPO)、胰岛素、抗体Fab片段、抗体scFV片段、血友病相关的凝血蛋白、抗肌萎缩蛋白、溶酶体酸性脂肪酶、苯丙氨酸羟化酶(PAH)、糖原贮积病相关的酶、和其任何变体。
在一些实施方案中,感兴趣的蛋白是病毒的中和抗体。在一些实施方案中,病毒的中和抗体是人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、或流感病毒的中和抗体。在一些实施方案中,HIV的中和抗体选自以下组成的组:b12抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、2F5抗-HIV抗体、和其任何变体。在一些实施方案中,HCV的中和抗体选自以下组成的组:AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、AR4A抗-HCV抗体、和其任何变体。在一些实施方案中,流感病毒的中和抗体选自以下组成的组:F10抗-流感抗体、CR6261抗-流感抗体、FI6抗-流感抗体、TCN32抗-流感抗体、和其任何变体。
在一些实施方案中,感兴趣的蛋白是疟疾的中和抗体。
在一些实施方案中,启动子包括巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子、泛素C(UBC)启动子、或其任何变体。在一些实施方案中,启动子包括剪接供体、剪接受体、或其任何变体。在一些实施方案中,剪接供体包括与SEQIDNO:5具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中,剪接受体包括与SEQIDNO:6具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中,启动子包括与SEQIDNO:1具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中,启动子包括与SEQIDNO:2-4中任一个具有至少90%序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中,转录后调节元件是病毒转录后调节元件。在一些实施方案中,病毒转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、乙型肝炎病毒转录后调节元件(HBVPRE)、RNA转运元件(RNAtransportelement,RTE)、或其任何变体。
在一些实施方案中,病毒载体还包括转录后调节元件下游的转录终止区。在一些实施方案中,转录终止区包括SV40晚期poly(A)序列、兔β-珠蛋白poly(A)序列、牛生长激素poly(A)序列、或其任何变体。
在一些实施方案中,启动子包括内含子。在一些实施方案中,内含子是包括与SEQIDNO:8具有至少90%序列同一性的核苷酸序列的合成的内含子。
在一些实施方案中,多核苷酸包括免疫球蛋白的重链可变区的第一编码区和免疫球蛋白的轻链可变区的第二编码区。在一些实施方案中,第一编码区和第二编码区被2A序列分开。在一些实施方案中,2A序列是F2A序列。
在一些实施方案中,将第一编码区的5’与第一信号肽序列融合并将第二编码区的5’与第二信号肽序列融合。在一些实施方案中,第一信号肽序列和第二信号肽序列是不同的。
在一些实施方案中,起始于5’ITR并终止于3’ITR的区是至少约2.5kb。
本文的一些实施方案提供了用于体内生产感兴趣的蛋白的方法,其中该方法包括:提供包括编码感兴趣的蛋白的核苷酸序列的重组腺相关病毒(AAV);并将重组AAV施用至受试对象,据此重组AAV在受试对象中表达抗体,其中核苷酸是至少约1.4kb。
在一些实施方案中,感兴趣的蛋白是抗体。在一些实施方案中,抗体是全长抗体。在一些实施方案中,抗体选自以下组成的组:b12抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、2F5抗-HIV抗体、F10抗-流感抗体、FI6抗-流感抗体、TCN32流感抗体、CR6261抗-流感抗体、AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、AR4A抗-HCV抗体、抗-疟疾抗体、和其任何变体。
在一些实施方案中,感兴趣的蛋白在受试对象的血清中以至少约9μg/ml的量表达。在一些实施方案中,感兴趣的蛋白在受试对象的血清中以至少约100μg/ml的量表达。在一些实施方案中,感兴趣的蛋白在受试对象的血清中以至少约500μg/ml的量表达。
在一些实施方案中,通过以下步骤产生重组AAV:提供具有病毒载体、用于产生生产性AAV感染的辅助功能、和AAVcap基因的包装细胞系,其中病毒载体包括5’AAV末端反向重复序列(ITR)、3’AAVITR和编码感兴趣的蛋白的核苷酸序列;和从包装细胞系的上清液中回收重组AAV病毒。
在一些实施方案中,病毒载体是本文公开的任一病毒载体的病毒载体。
本文公开的一些实施方案提供了用于减少或抑制受试对象中病毒感染风险的方法,其中该方法包括:提供包括编码病毒的中和抗体的核苷酸序列的重组腺相关病毒(AAV);并将重组AAV施用至受试对象,据此重组AAV在受试对象中表达抗体。
在一些实施方案中,该方法还包括提供包括编码病毒的第二中和抗体的核苷酸序列的第二重组AAV。
在一些实施方案中,受试对象是哺乳动物。在一些实施方案中,受试对象是人。
在一些实施方案中,中和抗体是全长抗体。
在一些实施方案中,与没有用病毒载体处理的受试对象相比,该方法减少受试对象中感染风险至少约5倍。在一些实施方案中,与没有用病毒载体处理的受试对象相比,该方法减少受试对象中感染风险至少约20倍。在一些实施方案中,该方法抑制受试对象中病毒感染。
在一些实施方案中,抗体在受试对象的血清中以至少约9μg/ml的量表达。在一些实施方案中,抗体在受试对象的血清中以至少约100μg/ml的量表达。在一些实施方案中,抗体在受试对象的血清中以至少约500μg/ml的量表达。
在一些实施方案中,病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、或流感病毒。
在一些实施方案中,中和抗体选自以下组成的组:b12抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、2F5抗-HIV抗体、F10抗-流感抗体、CR6261抗-流感抗体、TCN32流感抗体、FI6抗-流感抗体、AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、AR4A抗-HCV抗体、和其任何变体。
在一些实施方案中,通过肌内注射、阴道内注射、静脉注射、腹腔内注射、皮下注射、表皮给药、皮内给药、或鼻腔给药将重组AAV施用至受试对象。
在一些实施方案中,至多每年一次将重组AAV施用至受试对象。在一些实施方案中,至多每5年一次将重组AAV施用至受试对象。在一些实施方案中,至多每10年一次将重组AAV施用至受试对象。
本文公开的一些实施方案提供了生产重组腺相关病毒(AAV)的方法,其中该方法包括:提供具有包括5’AAV末端反向重复序列(ITR)和3’AAVITR、用于产生生产性AAV感染的辅助功能、和AAVcap基因的病毒构建体的包装细胞系;和从包装细胞系的上清液中回收重组AAV病毒。
在一些实施方案中,AAVcap基因编码来自血清型1、血清型2、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9的衣壳、或其变体。
在一些实施方案中,病毒构建体是本文公开的任何病毒载体。
在一些实施方案中,重组AAV不是自身互补的AAV(scAAV)。
本文公开的一些实施方案提供了一种分离的、合成的或重组的多核苷酸,其中该多核苷酸包括:与SEQIDNO:1具有至少约90%或更多的序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中,多核苷酸包括选自SEQIDNO:2-4的核苷酸序列。
附图简述
图1A是显示在肌内注射2×109GC的从一组启动子表达荧光素酶的AAV2/8载体后15周的荧光素酶活性的图(n=2)。图1B是组合CMV增强子和鸡β-肌动蛋白启动子、之后是位于泛素增强子区两侧的剪接供体(SD)和剪接受体(SA)的CASI启动子的实施方案的示意图展示。图1C是显示肌内注射1×109GC的编码由指示的启动子驱动的荧光素酶的AAV2/8后8周,与传统的CMV和CAG启动子相比,来自由CASI驱动的AAV载体的荧光素酶活性的图(n=2)。图1D是显示CMV驱动的具有或不具有WPRE、由指示的聚腺苷酸化信号终止的AAV载体的施用后6周的荧光素酶活性的图(n=2)。图1E是用于抗体表达的表达盒的示意图展示,包括反向重复序列(ITR)、CASI启动子、与被自加工(self-processing)2A序列分开的k轻链连接的IgG1重链、用于改善表达的WPRE、和SV40晚期-聚腺苷酸化信号。将抗体重链和轻链的V-区克隆入载体的以实心的方框指示的位置处。
图2是本申请的范围内的AAV载体的实施方案的示意图展示。
图3A是显示用携带具有包括弗林蛋白酶裂解位点的标准的或优化的F2A序列的以上显示的抗体转基因的载体转染后,通过ELISA比较抗体体外(invitro)表达的柱形图。图3B是显示用携带具有天然的或人生长激素(HGH)衍生的融合至重链基因、轻链基因或两种基因的信号肽的4E10的载体转染之后,通过ELISA比较4E10抗体的体外表达的柱形图。图3C是显示用携带在标准表达盒中的或其中剪接供体和受体被突变以减少外来的剪接的可能的盒中的4E10的载体转染之后,通过ELISA比较4E10抗体的体外表达的柱形图。图3D是优化用于体外表达的示例性的IgG1转基因的示意图展示。突出的是重链和轻链信号序列(“SS”)、F2A自加工肽(“F2A”)和预测的剪接供体和受体位点(“重链恒定区”和“k恒定”中的实线)。
图4A-D显示HIV被从优化表达的转基因:b12(图4A)、2G12(图4B)、4E10(图4C)和2F5(图4D)表达的抗体中和(n=3,RLU=相对荧光素酶单位)。
图5A显示肌内注射1×1010基因组拷贝的表达荧光素酶的AAV2/8后15周的代表性的Rag2/γc小鼠的Xenogen图像。图5B是显示通过接受1×1010或1×1011GC的编码荧光素酶的AAV2/8的肌内注射的Rag2-/-γc-/-小鼠的Xenogen成像的荧光素酶活性的定量说明长期剂量依赖性的表达的图(n=2)。图5C是显示循环中人IgG的浓度的图,如通过对取自肌内注射1×1010或1×1011GC的表达4E10-IgG1的AAV2/8进入Rag2-/-γc-/-小鼠后的血清样品的总的人IgGELISA测量的(n=2)。
图6是显示在免疫缺陷的NOD/SCID/γc(NSG)Rag2/γc(Rag2)或免疫活性的C57BL/6(B6)和Balb/C小鼠中肌内注射产生b12-IgG的优化的表达载体的1×1011基因组拷贝后,通过ELISA定量人IgG的绘图(绘图显示平均值和标准误差,n=4)。
图7是显示HIV攻击后HuPBMC-NSG人源化的小鼠中CD4细胞的消耗的图。
图8A是显示循环中人IgG的浓度的图,如通过对取自肌内注射表达荧光素酶或b12-IgG的载体后6周的血清样品的ELISA测量的(ND,未检出)。图8B显示用10ngp24NL4-3腹腔内攻击进入6周前接受表达荧光素酶(左图)或b12-IgG1(右图)的AAV2/8载体的动物后的人源化的小鼠中CD4T细胞的消耗(n=6)。
图9显示由不同的广泛中和HIV抗体介导的保护的比较。图9A显示循环中的抗体的浓度,如通过对取自肌内注射表达4种广泛中和HIV抗体的载体后的血清样品的总的人IgGELISA测量的(n=8)。图9B显示用5ngp24NL4-3的静脉HIV攻击后的4种广泛中和HIV抗体在保护huPBMC-NSG人源化的小鼠免受CD4细胞消耗方面的相对效力的比较(n=8)。图9C显示取自攻击后8周的脾的切片的免疫组化染色检测的HIVp24。箭头指示被列为p24表达阳性的细胞。比例尺,40mm。图9D显示指示被感染的动物的脾中的表达p24细胞的相对频率的脾的免疫组化染色的定量。ND,未检出。星号指示通过双侧t检验的来自荧光素酶对照小鼠对表达抗体的小鼠的显著差异的结果(n=4-6)**P,0.01,***P,0.0001。图9A-B显示平均值和标准误差均值(s.e.m.);图9D显示平均值和标准差(s.d.)。
图10显示在HIV攻击之前总的人IgG和结合gp120的IgG的血清浓度。图10A是显示由移植细胞和VIP产生的总的人抗体浓度的图,如通过对取自肌内注射表达荧光素酶或b12抗体的载体后5周的和人PBMC的过继转移后3周的和IVHIV攻击之前的当天的血清样品的人IgGELISA测量的(n=8)。图10B是显示使用gp120特异性的ELISA测量HIV特异性的抗体的浓度定量的相同时间点的抗体的浓度的图(n=8)。
图11是显示b12抗体介导CD4细胞的保护随时间推移的图。作为NL4-3的剂量的静脉攻击的结果的在huPBMC-NSG人源化的小鼠中的CD4细胞消耗显示在最右边。表达荧光素酶的小鼠(左图)易于CD4细胞丧失,而表达b12的小鼠(右图)显示在所有剂量下被保护免受HIV(n=8)。
图12A是显示b12的表达随时间推移作为剂量的函数的绘图,如由对取自AAV施用后的血清样品的总的人IgGELISA确定的(n=8)。接受表达荧光素酶载体的小鼠没有呈现出可检测的人抗体(n=12)。图12B是显示在攻击之前1天、人PBMC的过继转移后3周和肌内注射指示剂量的AAV后15周的血清中b12的浓度的图,如通过gp120特异性的ELISA测量能够结合HIV的抗体的部分确定的(n=8-12)。图12C是显示在HuPBMC-NSG人源化的小鼠中的CD4细胞消耗作为用10ng的NL4-3静脉攻击进入表达一系列b12的动物的结果的绘图,显示保护免受感染必需的抗体的最小剂量。图12A和12C显示平均值和标准误差,且图12B显示个体动物和平均值(n=8-12)。
图13A是显示VRC01的表达随时间推移作为剂量的函数的图,如由对取自AAV施用后的血清样品的总的人IgGELISA确定的(n=8)。接受表达荧光素酶的载体的小鼠没有呈现出可检测的人抗体(n=12)。图13B是在攻击之前1天、人PBMC的过继转移后3周和肌内注射AAV的指示剂量后15周的血清中VRC01的浓度的图,如由gp120特异性的ELISA测量能够结合HIV的抗体的部分确定的(n=8-12)。图13C是显示作为用10ng的NL4-3静脉内攻击进入表达一系列VRC01的动物的结果的在huPBMC-NSG人源化的小鼠中的CD4细胞消耗的图,显示保护免受感染必需的抗体的最小剂量。图13A和13C显示平均值和标准误差,及图13B显示个体动物和平均值(n=8-12)。
图14是显示在Balb/C小鼠中肌内注射1×1011基因组拷贝(GC)的表达未被修饰的b12、F10、或CR6261抗体的重组AAV病毒后,由ELISA定量血清中人IgG的图(绘图显示平均值和标准误差,n=8)。
图15显示被修饰的F10和CR6261抗体增加的表达。图15A是比较b12抗体和F10和CR6261WT序列,并与由F10或CR6261重链与b12轻链构成的嵌合构建体相比的柱形图。图15B是列出在AAV载体中使用的不同的被修饰的b12和/或4E10抗体轻链的表。图15C是比较由融合至b12和/或4E10抗体轻链序列的F10VL序列组成的F10抗体轻链变体的表达水平的柱形图。图15D是比较由融合至b12和/或4E10抗体轻链序列的CR6261VL序列组成的CR6261抗体轻链变体的表达水平的柱形图。
图16A是显示在Balb/C小鼠中肌内注射1×1011GC的产生b12、F10、或CR6261抗体的优化表达载体后,由ELISA定量血清中人IgG的图(绘图显示平均值和标准误差,n=6)。图16B是显示取自被给予表达b12、F10或CR6261抗体的VIP的小鼠的血清的中和活性的绘图,如使用GFP报告测定针对5种流感毒株(PR/8、CA/09、SI/06、VN/04、JP/57)测量的。值根据导致50%的流感感染的中和的血清稀释倍数计算。虚线代表检验的最低稀释(20倍)并将低于这个线的值从曲线拟合外推或沿着轴绘制以代表无可检测的中和活性。
图17A是显示循环中人IgG的浓度的图,如通过取自肌内注射表达b12、F10、或CR6261的载体后5周和在病毒攻击之前2天的血清样品中由总的人IgGELISA测量的。图17B是显示在接受表达VIP对照(b12)或F10-IgG的动物中用1x104PFU的CA/09流感鼻内攻击后,在Balb/C小鼠中观察到的体重下降的图(n=8)。图17C是显示用CA/09攻击后4天的体重下降和CR6261-IgG浓度的相关性d,用5x104PFU的SI06在接受表达VIP对照(b12)或F10-IgG的动物中鼻内攻击后,在Balb/C小鼠中观察到的体重下降的图(n=8)(Figure17Cisagraphshowingcorrelationofweightloss4dayspostchallengewithCA/09andCR6261-IgGconcentration.d,WeightlossobservedinBalb/Cmicefollowingintranasalchallengewith5x104PFUofSI06inanimalsthatreceivedVIPexpressingcontrol(b12)orF10-IgG(n=8))。图17D是显示PR/8的鼻内攻击后,表达b12和F10的Balb/C小鼠中的存活率的图。图17E是显示在接受表达VIP对照(b12)或F10的动物中用1000PFU的PR/8鼻内攻击后,在Balb/C小鼠中观察到的体重下降的图(n=8)。图17F-G是显示5种流感毒株(PR/8、CA/09、SI/06、VN/04、JP/57)的体外中和的绘图,如通过使用取自CA/09(图17F)或SI06(图17G)攻击后接受表达b12、F10或CR6261的重组AAV的动物的血清的GFP报告分析检测的。值根据导致50%的流感感染的中和的稀释倍数计算。虚线代表检验的最低稀释(20倍稀释)并将低于这个线的值从曲线拟合外推或沿着轴绘制以代表无可检测的中和活性。
图18A是显示在肌内注射1×1011GC的表达荧光素酶的载体之后,由年幼(3个月)的或年老(12个月)的NOD/SCID/γc-/-(NSG)小鼠的Xenogen成像定量荧光素酶的表达的图(n=8)。图18B是显示在肌内注射1×1011GC的表达F10-IgG的载体之后,通过年幼的(3个月)或年老的(12个月)NSG小鼠的血清中的ELISA定量人IgG的图(n=8)。图18C是显示用1000PFU的PR/8流感鼻内攻击后接受表达荧光素酶或F10-IgG的重组AAV的3个月大的NSG小鼠的存活(左)和体重下降(右)的图(n=6-8)。图18D是显示用1000PFU的PR/8流感鼻内攻击后接受表达荧光素酶或F10-IgG的重组AAV的12个月大的NSG小鼠的存活(左)和体重下降(右)的图(n=4-6)。图18E显示取自用1000PFU的PR/8流感攻击后5天接受表达荧光素酶或F10-IgG的VIP的3个月大的NSG小鼠的代表性的肺切片的苏木精-伊红染色(比例尺=100微米)。图18F是显示由训练有素的病理学家量化的指示炎症的顺序分数(ordinalscore)的绘图(0=无炎症,5=最大炎症)。图18G是显示肺组织中流感RNA的定量随着处死动物用于分析的时间而变化的绘图。
图19A是实施例12中采用的低剂量粘膜HIV攻击方案的示意图展示。每周,从小鼠取血并随后通过接种物的非腐蚀性阴道内施用用50ngJR-CSF的p24攻击,如由实线箭头指示的。图19B是显示作为HIV感染的结果的循环中CD4细胞随时间推移的消耗的图,如通过流式细胞术测量的。图19C是显示13次阴道内攻击后在处死时的HIV血浆病毒载量的绘图,如通过AbbottRealTimeHIV-1ViralLoadqPCR测定测量的。这种测定的检测极限是200拷贝/mL。在检测极限处绘制了不可检测的样品。
图20是显示在施用表达B12、AR3A和AR3B抗体的重组AAV病毒之后,通过ELISA定量血清中人IgG的图。
详述
在下面的详述中,参考形成本文一部分的附图。在详述、附图、和权利要求书中描述的阐述性实施方案不是旨在限制。可利用其他实施方案并可作出其他改变,而不偏离此处呈现的主题的精神或范围。将容易理解的是本公开的各方面,如本文通常描述的,及附图中阐述的,在多种多样的不同的布局中可被排列、替换、组合、和设计,其所有的都明确地涉及并构成本公开内容的部分。
本申请提供了可用于生产重组腺相关病毒(AAV)的病毒载体,和能够在合适的环境中表达一种或多种感兴趣的蛋白的重组AAV,所述环境例如,在用重组AAV转染的细胞、组织、器官、或受试对象中。本文还公开了用于制造和使用重组AAV的方法。例如,可将重组AAV用于体内、离体(exvivo)、或体外生产感兴趣的蛋白。在一些实施方案中,感兴趣的蛋白的表达能够被用于诊断、预防、或治疗一种或多种疾病或障碍,诸如减少或抑制病毒感染的风险。
在一些实施方案中,病毒载体包括:AAV的5’末端反向重复序列(ITR)和3’AAVITR、启动子、启动子下游的限制性酶切位点以允许编码一个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸的插入、和限制性酶切位点下游的转录后调节元件,其中启动子、限制性酶切位点和转录后调节元件位于5’AAVITR的下游和3’AAVITR的上游。可将病毒载体用于,例如,表达一种或多种感兴趣的蛋白(例如,抗体)。例如,病毒载体可包括编码一种或多种抗-HIV抗体、抗-HCV抗体、抗-流感抗体、或其组合的多核苷酸。可将病毒载体用于,例如,为了诊断或治疗目的在受试对象中生产高水平的感兴趣的蛋白(例如,抗体)。
定义
除非另有定义,本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。见,例如Singleton等人,DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology第2版,J.Wiley&Sons(NewYork,N.Y.1994);Sambrook等人,MolecularCloning,ALaboratoryManual,ColdSpringsHarborPress(ColdSpringsHarbor,N.Y.1989)。为了本发明的目的,下面定义了以下的术语。
如本文所用的,术语“载体”指的是多核苷酸构建体,典型是被用于传递遗传物质至宿主细胞的质粒或病毒。载体可以是,例如,病毒、质粒、粘粒、或噬菌体。如本文所用的载体可由DNA或RNA构成。在一些实施方案中,载体由DNA构成。“表达载体”是当它存在于合适的环境时,能够指导由该载体携带的一个或多个基因编码的蛋白的表达的载体。载体优选能够自主复制。典型地,表达载体包括转录启动子、基因、和转录终止子。通常将基因表达放置在启动子的控制下,且基因被称为是“可操作地连接至”启动子。
如本文所用的,将术语“可操作地连接”用于描述调节元件和基因或其编码区之间的连接。典型地,将基因表达放置在一个或多个调节元件的控制下,所述调节元件例如而不限于,组成型或诱导型启动子、组织特异性调节元件、和增强子。基因或编码区被称为是“可操作地连接至”或“操作地连接至”或“可操作地联合”调节元件,意味着该基因或编码区由该调节元件控制或影响。例如,如果启动子实现编码序列的转录或表达,则启动子可操作地连接至编码序列。
如本文所用的术语“构建体”,指的是为了特定核苷酸序列的表达的目的被产生、或将在其他重组核苷酸序列的构建中被使用的重组核酸。
如本文所用的术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的且指的是任何核酸,不论是由磷酸二酯键或被修饰的键诸如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧酸甲酯、氨基乙酸酯(acetamidate)、氨基甲酸酯、硫醚、桥接的氨基磷酸酯、桥接的亚甲基膦酸酯、桥接的氨基磷酸酯、桥接的氨基磷酸酯、桥接的亚甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、桥接的硫代磷酸酯或磺内酯键、和此类键的组合构成的。术语“核酸”和“多核苷酸”还具体地包括由除了5个生物存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)之外的碱基构成的核酸。
术语“调节元件”和“表达控制元件”可互换地被使用并指的是能够在特定宿主生物体中影响可操作地连接的编码序列的表达的核酸分子。这些术语被广泛使用并覆盖促进或调节转录的所有元件,包括启动子、RNA聚合酶和转录因子的基本互作所需的核心元件、上游元件、增强子、和应答元件(见,例如,Lewin,“GenesV”(OxfordUniversityPress,Oxford)847-873页)。原核生物中示例性的调节元件包括启动子、操纵基因序列和核糖体结合位点。在真核细胞中使用的调节元件可包括而不限于,转录和翻译控制序列,诸如启动子、增强子、剪接信号、聚腺苷酸化信号、终止子、蛋白降解信号、内部核糖体进入元件(IRES)、2A序列、和类似的,其在宿主细胞中提供和/或调节编码序列的表达和/或编码的多肽的生产。
如本文所用的,2A序列或元件指的是在两个蛋白之间引入的作为接头的小肽,允许聚蛋白的自主核糖体内自加工(见,例如,deFelipe.GeneticVaccinesandTher.2:13(2004);deFelipe等人Traffic5:616-626(2004))。这些短肽允许多个蛋白从单个载体上共表达。许多2A元件是本领域已知的。可在本文公开的方法和体系中使用的2A序列的示例,不限制,包括来自口蹄疫病毒(F2A)、马鼻炎A病毒(E2A)、一点褐翅蛾(Thoseaasigna)病毒(T2A)、和猪捷申病毒-1(P2A)的2A序列,如美国专利公布号20070116690中描述的。
如本文所用的,术语“启动子”是允许结合RNA聚合酶并指导基因转录的核苷酸序列。典型地,启动子位于基因的5’非编码区中,临近基因的转录起始位点。在转录起始中起作用的启动子内的序列元件通常特征为共有核苷酸序列。启动子的示例包括,但不限于,来自细菌、酵母、植物、病毒、和哺乳动物(包括人)的启动子。启动子可以是诱导型的、阻抑型的、和/或组成型的。诱导型启动子响应培养条件中的一些变化,诸如温度的变化,启动从在它们的控制下的DNA的增加的转录水平。
如本文所用的,术语“增强子”指的是能够增加转录效率的调节元件的类型,无论增强子相对于转录起始位点的距离或方向。
如本文所用的,术语“抗体”以最广义被使用并具体地覆盖人、非人(例如,鼠科动物)和人源化的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如,双特异性抗体)、和抗体片段,只要它们呈现所需的生物活性。可使用本文公开的系统和方法表达多种抗体。“抗体”和“免疫球蛋白”通常是异四聚体糖蛋白,由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成。每一条轻链通过二硫键连接至重链。二硫键的数目在不同的免疫球蛋白同种型的重链之间不同。每一条重链包括可变域(VH)、之后的一些恒定域。每一条轻链包括在一端的可变域(VL)和在它的另一端的恒定域。将轻链的恒定域与重链的第一恒定域对齐,并将轻链可变域与重链可变域对齐。尽管抗体呈现与特定抗原的结合特异性,免疫球蛋白包括抗体和缺少抗原特异性的其他抗体样分子。后一种的多肽,例如,由淋巴系统以低水平并由骨髓瘤以增加的水平生产。
如本文所用的,术语“变体”指的是具有与参考多核苷酸(或多肽)基本上相似的序列的多核苷酸(或多肽)。在多核苷酸的情况下,与参考多核苷酸相比,变体可具有在5’末端、3’末端、和/或一个或多个内部位点的一个或多个核苷酸的缺失、替换、添加。变体和参考多核苷酸之间的序列相似性和/或差异可使用本领域已知的常规技术检测,例如聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术。变体多核苷酸还包括经合成衍生的多核苷酸,诸如例如通过使用定点诱变产生的多核苷酸。通常,多核苷酸的变体,包括,但不限于DNA,可与参考多核苷酸具有至少约50%、约55%、约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更多的序列同一性,如通过由技术人员已知的序列比对程序确定的。在多肽的情况下,变体可具有与参考多肽相比的一个或多个氨基酸的缺失、替换、添加。变体和参考多肽之间的序列相似性和/或差异可使用本领域已知的常规技术检测,例如蛋白质印迹。通常,多肽的变体与参考多肽可具有至少约60%、约65%、约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或更多的序列同一性,如通过由技术人员已知的序列比对程序确定的。
如本文所用的,术语“转染”指的是将核酸引入宿主细胞内,诸如根据以下描述的通过将细胞与重组AAV病毒接触。
如本文所用的,术语“转基因”指的是通过人为干涉整合进入靶细胞的一个或多个染色体的任何核苷酸或DNA序列。在一些实施方案中,转基因包括编码感兴趣的蛋白的多核苷酸。编码蛋白的多核苷酸通常操作地连接至可用于获得感兴趣的基因的所需表达的其他序列,诸如转录调节序列。在一些实施方案中,转基因可另外包括被用于标记其已整合入的染色体的核酸或其他分子。
如本文所用的,“治疗”指的是响应由患者体现的或患者可能易感的疾病、障碍或生理状况作出的临床干预。治疗的目的包括,但不限于,缓和或预防症状、减缓或停止疾病、障碍、或状况的进展或恶化和/或缓解疾病、障碍或状况。“治疗(treatment)”指的是治疗性处理和预防或防治性措施的之一或两者。需要治疗的受试对象包括已被疾病或障碍或不想要的生理状况影响的受试对象和其中疾病或障碍或不想要的生理状况待被预防的受试对象。
如本文所用的,术语“有效量”指的是足够实现有益的或令人满意的生物和/或临床结果的量。
如本文所用的,“受试对象”指的是为处理、观察或实验的客体的动物。“动物”包括冷血和温血脊椎动物和无脊椎动物诸如鱼、贝类、爬行动物、和特别是哺乳动物。如本文所用的“哺乳动物”指的是属于哺乳纲(Mammalia)的个体并包括,但不限于,人、家养和农场动物、动物园动物、体育和宠物动物。哺乳动物的非限制性的示例包括小鼠、大鼠;兔;豚鼠;狗;猫;绵羊;山羊;牛;马;灵长类,诸如猴、黑猩猩和猿、和特别是人。在一些实施方案中,哺乳动物是人。然而,在一些实施方案中,哺乳动物不是人。
腺相关病毒(AAV)载体
腺相关病毒(AAV)是复制缺陷型细小病毒,其单链DNA基因组长度约4.7kb,包括145个核苷酸的末端反向重复序列(ITR)。ITR在AAV的DNA整合进入宿主细胞基因组中发挥作用。当AAV感染宿主细胞时,病毒基因组整合进入宿主的染色体,导致细胞的潜伏感染。在自然系统中,辅助病毒(例如,腺病毒或疱疹病毒)提供允许AAV病毒在被感染的细胞中生产的基因。在腺病毒的情况下,基因E1A、E1B、E2A、E4和VA提供辅助功能。当用辅助病毒感染时,AAV前病毒被拯救并扩增,且AAV和腺病毒都被生产。在不具有Rep和/或Cap基因的重组AAV载体的情况中,AAV可以是非整合的。
提供了包括一个或多个感兴趣的蛋白的编码区的AAV载体,所述蛋白例如长度超过500个氨基酸的蛋白。AAV载体可包括AAV的5’末端反向重复序列(ITR)、3’AAVITR、启动子、和启动子下游的限制性酶切位点以允许编码一个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸的插入,其中启动子和限制性酶切位点位于5’AAVITR的下游和3’AAVITR的上游。在一些实施方案中,重组AAV载体包括限制性酶切位点下游和3’AAVITR上游的转录后调节元件。在一些实施方案中,本文公开的AAV载体可被使用作为携带编码感兴趣的蛋白的转基因的AAV转移载体,用于产生能够在宿主细胞中表达感兴趣的蛋白的重组AAV病毒。
可使用本领域众所周知的任何合适的遗传工程技术实现病毒载体的产生,所述技术包括而不限于,限制性内切酶消化、连接、转化、质粒纯化、和DNA测序的标准技术,例如在Sambrook等人(MolecularCloning:ALaboratoryManual.ColdSpringHarborLaboratoryPress,N.Y.(1989))中描述的。
病毒载体可合并来自任何已知生物体的基因组的序列。序列可以以它们的自然形式被合并或可以以任何方式被修饰以获得所需的活性。例如,序列可包括插入、缺失或替换。
启动子
在本文公开的病毒载体中,多种启动子可与包括感兴趣的蛋白的编码区的核酸可操作地连接。在一些实施方案中,启动子可驱动感兴趣的蛋白在用源自病毒载体的病毒感染的细胞中表达,所述细胞诸如靶细胞。启动子可以是天然存在的或非天然存在的。
启动子的示例,包括,但不限于,病毒启动子、植物启动子和哺乳动物启动子。病毒启动子的示例包括,但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、CAG启动子(其是CMV早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子的组合,在Alexopoulou等人BMCCellBiology9:2,(2008)中描述)、猿猴病毒40(SV40)启动子、在Brisson等人,Nature1984,310:511-514中描述的花椰菜花叶病毒(CaMV)的35SRNA和19SRNA启动子、烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白启动子、和其任何变体。植物启动子的示例包括,但不限于,热休克启动子,诸如在Gurley等人,Mol.Cell.Biol.1986,6:559-565中描述的大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B,和其任何变体。哺乳动物启动子的示例包括,但不限于,人延伸因子1α-亚基(EF1-1α)启动子、人泛素C(UCB)启动子、小鼠磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子、和其任何变体。
在一些实施方案中,启动子是包括至少CAG启动子的部分的合成启动子。CAG启动子的部分可包括与SEQIDNO:3具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中,启动子包括CMV增强子。在一些实施方案中,启动子包括UBC增强子。在一些实施方案中,启动子包括至少CMV增强子的部分。例如,CMV增强子可包括与SEQIDNO:2具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中,启动子包括至少UCB增强子的部分。UCB增强子可包括与SEQIDNO:4具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核酸序列。
在一些实施方案中,启动子是具有SEQIDNO:1的核苷酸序列的合成的CASI启动子。合成的CASI启动子包含CMV增强子的部分、鸡β-肌动蛋白启动子的部分、和UBC增强子的部分。在一些实施方案中,启动子可包括与SEQIDNO:1具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中,启动子包括与SEQIDNO:1至少90%相同的核酸序列。在一些实施方案中,启动子包括与SEQIDNO:1至少95%相同的核酸序列。在一些实施方案中,启动子包括SEQIDNO:1的核酸序列。
在一些实施方案中,载体可包括一个或多个内含子以促进RNA转录本在哺乳动物宿主细胞中的加工。此内含子的非限制性示例是兔β-珠蛋白内含子。在一些实施方案中,内含子是合成的内含子。例如,合成的内含子可包括与SEQIDNO:8具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核苷酸序列。内含子在载体中的位置可以不同。在一些实施方案中,内含子位于启动子和限制性酶切位点之间。在一些实施方案中,内含子位于启动子内。在一些实施方案中,内含子包括UCB增强子。UCB增强子可包括与SEQIDNO:4具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中,将启动子与编码一个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸可操作地连接。在一些实施方案中,将启动子与编码感兴趣的抗体的重链和/或轻链(诸如抗体的重和轻可变区)的多核苷酸可操作地连接。在一些实施方案中,将启动子与编码感兴趣的抗体的重链和轻链的多核苷酸可操作地连接以允许重链和轻链基因的多顺反子表达。在一些实施方案中,2A序列或IRES元件位于载体中重链可变区的编码区和轻链可变区的编码区之间以促进每一个亚基的等效表达。可选地,可将编码重链和轻链的多核苷酸每一个在合适的病毒载体中分别引入靶细胞。
启动子的大小可不同。由于AAV的有限的包装能力,优选使用大小是小的、但是同时允许感兴趣的蛋白在宿主细胞中高水平生产的启动子。例如,在一些实施方案中启动子是至多约1.5kb、至多约1.4kb、至多约1.35kb、至多约1.3kb、至多约1.25kb、至多约1.2kb、至多约1.15kb、至多约1.1kb、至多约1.05kb、至多约1kb、至多约800碱基对、至多约600碱基对、至多约400碱基对、至多约200碱基对或至多约100碱基对。
启动子的核苷酸序列还可被修饰用于改善表达效率。例如,启动子可包括一个或多个剪接供体、一个或多个剪接受体、和/或其组合。在一些实施方案中,启动子包括剪接供体和剪接受体。在一些实施方案中,启动子包括一个或多个剪接供体且不包含剪接受体。在一些实施方案中,启动子不包括剪接供体,且包括一个或多个剪接受体。例如,在一些实施方案中,剪接供体可包括与SEQIDNO:5具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核酸序列。在一些实施方案中,剪接受体可包括与SEQIDNO:6具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核酸序列。
调节元件
可将多种转录后调节元件用于病毒载体中,例如以增加感兴趣的蛋白在宿主细胞中的表达水平。在一些实施方案中,转录后调节元件可以是病毒转录后调节元件。病毒转录后调节元件的非限制性示例包括土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、乙型肝炎病毒转录后调节元件(HBVPRE)、RNA转运元件(RTE)、和其任何变体。WPRE可包括与SEQIDNO:7具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核酸序列。RTE可以是rev应答元件(RRE),例如,慢病毒RRE。非限制性的示例是牛免疫缺陷病毒rev应答元件(RRE)。在一些实施方案中,RTE是组成型转运元件(CTE)。CTE的示例包括,但不限于梅森-普菲策尔猴病毒(Mason-PfizerMonkeyVirus)CTE和鸟类白血病病毒(AvianLeukemiaVirus)CTE。
本文描述的病毒载体可包括原核复制子(即,具有在原核宿主细胞中的指导重组DNA分子染色体外的自主复制和维持的能力的DNA序列),诸如用其转化的细菌宿主细胞。此类复制子是本领域众所周知的。另外,包括原核复制子的载体还可包括其表达给予可检测的标记诸如药物抗性的基因。典型的细菌药物抗性基因是给予对氨苄青霉素或四环素抗性的基因。
在一些实施方案中,AAV载体可包括用于真核细胞中有效的选择标记的基因,诸如药物抗性选择标记。这种选择标记基因可编码对于生长在选择培养基中的被转化的宿主细胞的存活或生长必要的因子。未用包含选择基因的载体转化的宿主细胞将不会在培养基中存活。典型的选择基因编码给予对抗生素或其他毒素的抗性、补充营养缺陷型的缺陷、或供给从培养基中扣留的关键营养元素的蛋白,所述抗生素或其他毒素例如,氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤、卡那霉素、庆大霉素、Zeocin、或四环素。
本文公开的病毒载体可包括多种调节元件,诸如转录起始区和/或转录终止区。转录终止区的示例包括,但不限于,聚腺苷酸化信号序列。聚腺苷酸化信号序列的示例包括,但不限于,牛生长激素(BGH)poly(A)、SV40晚期poly(A)、兔β-珠蛋白(RBG)poly(A)、胸苷激酶(TK)poly(A)序列、和其任何变体。在一些实施方案中,转录后终止区位于转录后调节元件的下游。在一些实施方案中,转录后终止区是聚腺苷酸化信号序列。在一些实施方案中,转录后终止区是SV40晚期poly(A)序列。
本文公开的病毒载体还可包括直接在启动子下游的限制性酶切位点之后的一个或多个A核苷酸,其中限制性酶切位点允许编码感兴趣的蛋白的多核苷酸的插入。例如,一个或多个A核苷酸在编码感兴趣的蛋白的多核苷酸插入载体后,直接位于感兴趣的蛋白的TAA终止密码子之后。在一些实施方案中,一个A核苷酸、两个A核苷酸、三个A核苷酸、或多个直接位于限制性酶切位点之后。在一些实施方案中,一个A核苷酸、两个A核苷酸、三个A核苷酸、或多个直接位于感兴趣的蛋白的TAA终止密码子之后。
在一些实施方案中,病毒载体可包括使得载体适于在真核生物中复制和整合的另外的序列。在其他实施方案中,本文公开的病毒载体可包括使得载体适于在原核生物和真核生物中复制和整合的穿梭元件。在一些实施方案中,病毒载体可包括另外的转录和翻译起始序列,诸如启动子和增强子;和另外的转录和翻译终止子,诸如聚腺苷酸化信号。
在一些实施方案中,病毒载体可包括允许,例如,从单个mRNA翻译多个蛋白的调节序列。此类调节序列的非限制性示例包括内部核糖体进入位点(IRES)和2A自加工序列。在一些实施方案中,2A序列是来自口蹄疫病毒的2A肽位点(F2A序列)。在一些实施方案中,F2A序列具有标准的弗林蛋白酶裂解位点。例如,具有标准的弗林蛋白酶裂解位点的F2A序列可包括与SEQIDNO:9具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中,F2A序列具有被修饰的弗林蛋白酶裂解位点。例如,具有被修饰的弗林蛋白酶裂解位点的F2A序列可包括与SEQIDNO:10具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中,病毒载体还可具有位于靠近启动子序列的一个或多个限制性酶切位点以提供编码一个或多个感兴趣的蛋白和其他蛋白的核酸序列的插入。
感兴趣的蛋白
如本文所用的,“感兴趣的蛋白”可以是任何蛋白,包括天然存在的和非天然存在的蛋白。在一些实施方案中,可将编码一个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸插入本文公开的病毒载体中,其中多核苷酸与启动子可操作地连接。在某些情况下,启动子可驱动感兴趣的蛋白在宿主细胞(例如,人肌细胞)中表达。
感兴趣的蛋白的示例包括,但不限于,荧光素酶;荧光蛋白(例如,GFP);生长激素(GH)和其变体;胰岛素样生长因子(IGF)和其变体;粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和其变体;红细胞生成素(EPO)和其变体;胰岛素,诸如胰岛素原、前胰岛素原、胰岛素、胰岛素类似物、和类似的;抗体和其变体,诸如杂交抗体、嵌合抗体、人源化抗体、单克隆抗体;抗体的抗原结合片段(Fab片段)、抗体的单链可变片段(scFV片段);抗肌萎缩蛋白和其变体;凝血因子和其变体;囊性纤维化跨膜传导调节子(cysticfibrosistransmembraneconductanceregulator,CFTR)和其变体;和干扰素及其变体。
在一些实施方案中,感兴趣的蛋白是治疗蛋白或其变体。治疗蛋白的非限制性示例包括血液因子,诸如β-珠蛋白、血红蛋白、组织型纤溶酶原激活因子、和凝血因子(coagulationfactor);集落刺激因子(CSF);白介素,诸如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9等;生长因子,诸如角质形成细胞生长因子(KGF)、干细胞因子(SCF)、纤维母细胞生长因子(FGF,诸如碱性FGF和酸性FGF)、肝细胞生长因子(HGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、骨形态发生蛋白(BMP)、表皮生长因子(EGF)、生长分化因子-9(GDF-9)、肝癌衍生生长因子(HDGF)、肌肉生长抑制素(GDF-8)、神经生长因子(NGF)、神经营养因子、血小板源生长因子(PDGF)、血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、和类似的;可溶性受体,诸如可溶性TNF-α受体、可溶性VEGF受体、可溶性白介素受体(例如,可溶性IL-1受体和可溶性II型IL-1受体)、可溶性γ/δT细胞受体、可溶性受体的配体结合片段,和类似的;酶,诸如α-葡萄糖苷酶、伊米苷酶、β-葡糖脑苷脂酶、和阿糖脑苷酶;酶激活因子,诸如组织型纤溶酶原激活因子;趋化因子,诸如IP-10、γ干扰素诱导的单核因子(Mig)、Groα/IL-8、RANTES、MIP-1α、MIP-1β、MCP-1、PF-4、和类似的;血管生成剂,诸如血管内皮生长因子(VEGF,例如,VEGF121、VEGF165、VEGF-C、VEGF-2)、转化生长因子-β、碱性成纤维细胞生长因子、胶质瘤源性生长因子、血管生成素、血管生成素-2;和类似的;抗血管生成剂,诸如可溶性VEGF受体;蛋白疫苗;神经活性肽,诸如神经生长因子(NGF)、缓激肽、缩胆囊素、胃泌素、促胰液素、催产素、促性腺激素释放激素、β-内啡肽、脑啡肽、P物质、生长抑素、催乳素、甘丙肽、生长激素释放激素、铃蟾肽、强啡肽、华法林、神经降压肽、胃动素、促甲状腺素、神经肽Y、黄体生成素、降钙素、胰岛素、胰高血糖素、血管升压素、血管紧张素II、促甲状腺激素释放激素、血管活性肠肽、睡眠肽、和类似的;血栓溶解剂;心房钠尿肽;松弛素;胶质原纤维酸性蛋白;卵泡刺激素(FSH);人α-1抗胰蛋白酶;白血病抑制因子(LIF);转化生长因子(TGF);组织因子、黄体生成素;巨噬细胞活化因子;肿瘤坏死因子(TNF);嗜中性白细胞趋化因子(NCF);神经生长因子;组织金属蛋白酶抑制剂;血管活性肠肽;血管生成素;血管趋向肽(angiotropin);血纤蛋白;蛭素;IL-1受体拮抗剂;和类似的。感兴趣的蛋白的一些其他非限制性示例包括睫状神经营养因子(CNTF);脑源性神经营养因子(BDNF);神经营养因子3和4/5(NT-3和4/5);胶质细胞源性神经营养因子(GDNF);芳香氨基酸脱羧酶(AADC);血友病相关的凝血蛋白,诸如因子Ⅷ、因子IX、因子X;抗肌萎缩蛋白或nini-抗肌萎缩蛋白;溶酶体酸性脂肪酶;苯丙氨酸羟化酶(PAH);糖原贮积病相关酶,诸如葡萄糖-6-磷酸酶、酸性麦芽糖酶、糖原脱支酶、肌糖原磷酸化酶、肝糖原磷酸化酶、肌肉磷酸果糖激酶、磷酸化酶激酶(例如PHKA2)、葡萄糖转运蛋白(例如,GLUT2)、醛缩酶A、β-烯醇酶、和糖原合成酶;溶酶体酶类(例如,β-N-乙酰氨基己糖苷酶A);和其任何变体。
在一些实施方案中,感兴趣的蛋白是蛋白的活性片段,所述蛋白诸如任何上述的蛋白。在一些实施方案中,感兴趣的蛋白是包括两种或多种蛋白的一些或全部的融合蛋白。在一些实施方案中,融合蛋白可包括任何上述蛋白的全部或部分。
在一些实施方案中,病毒载体包括多核苷酸,所述多核苷酸包括两种或多种感兴趣的蛋白的编码区。两种或多种感兴趣的蛋白可以是彼此相同的或不同的。在一些实施方案中,两种或多种感兴趣的蛋白是相关肽,例如用于相同病毒的中和抗体。
在一些实施方案中,感兴趣的蛋白是多亚基蛋白。例如,感兴趣的蛋白可包括两个或多个亚基、或两个或多个独立的多肽链。在一些实施方案中,感兴趣的蛋白可以是抗体。抗体的示例包括,但不限于,多种同种型的抗体(例如,IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE、和IgM);通过由本领域技术人员已知的任何方式产生的单克隆抗体,包括单克隆抗体的抗原结合片段;人源化抗体;嵌合抗体;单链抗体;抗体片段诸如Fv、F(ab’)2、Fab’、Fab、Facb、scFv和类似的;只要抗体能够结合抗原。在一些实施方案中,抗体是全长抗体。在一些实施方案中,感兴趣的蛋白不是免疫粘附素。
在一些实施方案中,抗体是抗-疟疾抗体。抗-疟疾的非限制性示例包括2A10抗-疟疾抗体和2C11抗-疟疾抗体。
在一些实施方案中,抗体是病毒的中和抗体。例如,抗体可以是HIV、HCV或流感病毒的中和抗体。在一些实施方案中,抗体是中和抗-HIV抗体。在一些实施方案中,中和抗-HIV抗体可以是,例如,中和HIV-1的不同基因亚型的许多原代分离株的人单克隆中和抗体。
在一些实施方案中,抗体是中和抗-HCV抗体。
在一些实施方案中,抗体是中和抗-流感抗体。中和病毒抗体的非限制性示例包括b12抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、2F5抗-HIV抗体、VRC01抗-HIV抗体、3BNC60抗-HIV抗体、3BNC117抗-HIV抗体、NIH45-46抗-HIV抗体、NIH45-46W抗-HIV抗体、VRC-PG04抗-HIV抗体、VRC-CH31抗-HIV抗体、PGT121抗-HIV抗体、PGT128抗-HIV抗体、F10抗-流感抗体、CR6261抗-流感抗体、TCN32流感抗体、FI6抗-流感抗体、FI6v3抗-流感抗体、AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、AR4A抗-HCV抗体、和其任何变体。
如本文描述的,编码感兴趣的蛋白的核苷酸序列可被修饰以改善蛋白的表达效率。能够被用于改善本文的基因的转录和/或翻译的方法不具体限制。例如,核苷酸序列可被修饰以更好反映宿主密码子使用以提高宿主(例如,哺乳动物)中的基因表达(例如,蛋白生产)。作为修饰的另外的非限制示例,感兴趣的蛋白的核苷酸序列中的一个或多个剪接供体和/或剪接受体被修饰以减少外来剪接的可能性。
感兴趣的蛋白可以是不同的长度。例如,感兴趣的蛋白的长度可以是至少约200个氨基酸、至少约250个氨基酸、至少约300个氨基酸、至少约350个氨基酸、至少约400个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约800个氨基酸、或更长。在一些实施方案中,感兴趣的蛋白长度是至少约480个氨基酸。在一些实施方案中,感兴趣的蛋白长度是至少约500个氨基酸。在一些实施方案中,感兴趣的蛋白长度是约750个氨基酸。
当要求在一个病毒载体中包括两种或多种感兴趣的蛋白、两个或多个单独的多肽链、或感兴趣的蛋白的两个或多个亚基的编码区时,第一个以外的每一个另外的编码区优选连接至促进蛋白在宿主细胞中共表达的元件,诸如内部核糖体进入序列(IRES)元件(美国专利号4,937,190)、或2A元件。例如,IRES或2A元件优选当单个载体包括编码多亚基蛋白的每一个亚基的序列时被使用。在感兴趣的蛋白是具有所需的特异性的免疫球蛋白的情况下,例如,第一编码区(编码免疫球蛋白的重链或轻链)位于启动子的下游。第二编码区(编码免疫球蛋白的剩余链)可位于第一编码区的下游,并可将IRES或2A元件放置在两个编码区之间,优选直接在第二编码区之前。IRES或2A元件被包含在第一和第二基因的序列(分别编码重链和轻链)之间能够允许两个链在细胞中以约相同的水平从相同的启动子被表达。
在一些实施方案中,感兴趣的蛋白包括两个或多个亚基,例如免疫球蛋白(Ig)。病毒载体可包括每一个亚基的编码区。例如,病毒载体可包括Ig重链(或Ig重链的可变区)的编码区和Ig轻链(或Ig轻链的可变区)的编码区两者。在一些实施方案中,载体包括抗体的重链可变区的第一编码区和抗体的轻链可变区的第二编码区。两个编码区可以例如被2A自加工序列分开以允许两个编码区的多顺反子转录。
病毒载体可包括两种或多种感兴趣的蛋白的编码区。例如,病毒载体可包括第一感兴趣的蛋白的编码区和第二感兴趣的蛋白的编码区。第一感兴趣的蛋白和第二感兴趣的蛋白可以是相同的或不同的。在一些实施方案中,病毒载体可包括第三或第四感兴趣的蛋白的编码区。第三和第四感兴趣的蛋白可以是相同的或不同的。由一个病毒载体编码的两种或多种感兴趣的蛋白的总长可以不同。例如,两种或多种蛋白的总长可以是至少约400个氨基酸、至少约450个氨基酸、至少约500个氨基酸、至少约550个氨基酸、至少约600个氨基酸、至少约650个氨基酸、至少约700个氨基酸、至少约750个氨基酸、至少约800个氨基酸、或更长。
Kozak共有序列、Kozak共有区或Kozak序列,是已知作为在真核mRNA上存在的并具有共有区(gcc)gccRccAUGG的序列,其中R是起始密码子(AUG)上游三个碱基的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤),其之后是另外的“G”。在一些实施方案中,载体包括与Kozak共有序列具有至少约70%、至少约80%、至少约90%序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中,载体包括Kozak共有序列。在一些实施方案中,载体包括在插入载体的编码一个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸之后的Kozak共有序列,例如,在启动子下游的限制性酶切位点处。例如,载体可包括GCCGCCATG(SEQIDNO:41)的核苷酸序列,其中ATG是感兴趣的蛋白的起始密码子。在一些实施方案中,载体包括GCGGCCGCCATG(SEQIDNO:42)的核苷酸序列,其中ATG是感兴趣的蛋白的起始密码子。
如果有需要,可根据本领域技术人员已知的常规方法分离并纯化感兴趣的蛋白。例如,可制备表达宿主细胞的裂解物并可使用HPLC、疏水相互作用色谱(HIC)、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、超滤、凝胶电泳、亲和色谱、和/或其他纯化技术纯化裂解物。
信号肽序列
本文公开的病毒载体中可使用多种信号肽序列。信号肽序列可以是天然存在的或非天然存在的。
在一些实施方案中,信号肽可提供从哺乳动物细胞中分泌。信号肽的示例包括,但不限于,HGH的内源信号肽和其变体;干扰素的内源信号肽和其变体,包括I、II和III型干扰素的信号肽和其变体;和已知的细胞因子的内源信号肽和其变体,诸如红细胞生成素(EPO)、胰岛素、TGF-β1、TNF、IL1-α、和IL1-β的信号肽和其变体。在一些实施方案中,信号肽是被修饰的HGH信号肽。在一些实施方案中,编码信号肽的核苷酸序列包括与SEQIDNO:11具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中,编码信号肽的核苷酸序列包括与SEQIDNO:12具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中,可使用与感兴趣的蛋白不同的蛋白的信号肽。在一些实施方案中,使用感兴趣的蛋白的本身的信号肽。在某些情况下,可使用非天然存在的信号肽。
典型地,载体中信号肽的核苷酸序列直接位于感兴趣的蛋白的编码区上游(例如,融合在感兴趣的蛋白的编码区的5’)。在病毒载体包含两种或多种感兴趣的蛋白的编码区的情况下,可将信号肽直接插入一个或多个编码区的上游。在一些实施方案中,每一个编码区具有融合在5’末端的信号肽序列。添加至每一个编码区的信号肽序列可以是相同的或不同的。例如,当感兴趣的蛋白具有两个亚基时,病毒载体可包括一个亚基的编码区和另一个亚基的编码区,并可将信号肽序列直接插入任一个编码区或两个编码区的上游。作为另一个非限制性的示例,病毒载体可包括免疫球蛋白的重链可变区的编码区和免疫球蛋白的轻链可变区的编码区,并将每一个编码区在5’末端与信号肽序列融合。在一些实施方案中,两个信号肽序列是相同的。在一些实施方案中,两个信号肽序列是不同的。
在一些实施方案中,在蛋白表达和/或分泌之后,信号肽可从前体蛋白裂解,产生成熟蛋白。
在一些实施方案中,可将病毒载体中起始于5’AAVITR并终止于3’AAVITR的区递送至宿主细胞并整合进入宿主细胞基因组。该区的长度可以不同。例如,该区的长度可以是至少约2kb、至少约2.25kb、至少约2.5kb、至少约2.75kb、至少约3kb、至少约3.25kb、至少约3.5kb、至少约3.75kb、至少约4kb、至少约4.25kb、或至少约4.5kb。在一些实施方案中,该区是至少约2.5kb。在一些实施方案中,该区是约4.5kb。在一些实施方案中,病毒载体不是自身互补的AAV(scAAV)载体。
如以上公开的,病毒载体可包括多种元件,例如,但不限于,启动子、编码感兴趣的蛋白的转基因、信号肽序列、转录后调节元件、转录终止元件、和允许多个蛋白从单个mRNA翻译的调节序列。技术人员将领会,病毒载体可包括这些元件的一个,或这些元件的两个或多个的任何组合。例如,病毒载体可包括至少一个元件或表1中列出的元件的组合。表1中使用的约定如下:
A=启动子
B=转基因
C=信号肽序列
D=转录后调节元件
E=转录终止元件
F=允许多个蛋白从单个mRNA翻译的调节序列
G=Kozak共有序列
表1.病毒载体的一些实施方案中包括的元件或元件的组合
A | B | C | D | E |
F | G | A+B | A+C | A+D |
A+E | A+F | A+G | B+C | B+D |
B+E | B+F | B+G | C+D | C+E |
C+F | C+G | D+E | D+F | D+G |
E+F | E+G | F+G | A+B+C | A+B+D |
A+B+E | A+B+F | A+B+G | A+C+D | A+C+E |
A+C+F | A+C+G | A+D+E | A+D+F | A+D+G |
A+E+F | A+E+G | A+F+G | B+C+D | B+C+E |
B+C+F | B+C+G | B+D+E | B+D+F | B+D+G |
B+E+F | B+E+G | C+D+E | C+D+F | C+D+G |
C+E+F | C+E+G | C+F+G | D+E+F | D+E+G |
E+F+G | A+B+C+D | A+B+C+E | A+B+C+F | A+B+C+G |
A+B+D+E | A+B+D+F | A+B+D+G | A+B+E+F | A+B+E+G |
A+B+F+G | A+C+D+E | A+C+D+F | A+C+D+G | A+C+E+F |
A+C+E+G | A+C+F+G | A+D+E+F | A+D+E+G | A+D+F+G |
A+E+F+G | B+C+D+E | B+C+D+F | B+C+D+G | B+C+E+F |
B+C+E+G | B+C+F+G | B+D+E+F | B+D+E+G | B+D+F+G |
B+E+F+G | C+D+E+F | C+D+E+G | C+D+F+G | C+E+F+G |
D+E+F+G | A+B+C+D+E | A+B+C+D+F | A+B+C+D+G | A+B+C+E+F |
A+B+C+E+G | A+B+C+F+G | A+B+D+E+F | A+B+D+E+G | A+B+D+F+G |
A+B+E+F+G | A+C+D+E+F | A+C+D+E+G | A+C+D+F+G | A+C+E+F+G |
A+D+E+F+G | B+C+D+E+F | B+C+D+E+G | B+C+D+F+G | B+C+E+F+G |
B+D+E+F+G | C+D+E+F+G | A+B+C+D+E+F | A+B+C+D+E+G | A+B+C+D+F+G |
A+B+C+E+F+G | A+B+D+E+F+G | A+C+D+E+F+G | B+C+D+E+F+G | A+B+C+D+E+F+G |
如以上描述的,以上列出的每一个元件的核苷酸序列可被修饰以增加感兴趣的蛋白在宿主细胞中的表达效率。在一些实施方案中,其中多于一个转基因存在于病毒载体中,可使用能够促进转基因的共表达的序列。此序列的非限制性示例包括IRES、2A序列、和其变体。
在SEQIDNO:13-30中提供了AAV载体的非限制性示例序列。例如,在SEQIDNO:13中列出包括CMV启动子、b12抗-HIV抗体的编码序列和SV40晚期poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:14中列出包括CASI合成启动子、荧光素酶蛋白的编码序列、WPRE、和SV40晚期poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:15中列出包括CASI合成启动子、荧光素酶蛋白的编码序列、WPRE、和兔β-珠蛋白(RBG)poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:16中列出包括CASI合成启动子、荧光素酶蛋白的编码序列、WPRE、和牛生长激素(BGH)poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:17中列出包括CASI合成启动子、b12抗-HIV抗体的编码序列、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:18中列出包括CASI合成启动子、4E10AB抗-HIV抗体的编码序列、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:19中列出包括CASI合成启动子、2G12抗-HIV抗体的编码序列、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:20中列出包括CASI合成启动子、2F5AB抗-HIV抗体的编码序列、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:21中列出包括CASI合成启动子、b12抗-HIV抗体的编码序列、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:22中列出包括CASI合成启动子、AR3抗体的编码序列、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:23中列出包括CASI合成启动子、AR3抗体的编码序列、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:24中列出包括CASI合成启动子、VRC01抗-HIV抗体的编码序列、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:25中列出包括CASI合成启动子、TCN32抗-流感抗体的编码序列、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:26中列出包括CASI合成启动子、CR6261抗体的编码序列、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:27中列出包括CASI合成启动子、F10抗体的编码序列、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:28中列出包括CASI合成启动子、AR4抗体的编码序列、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:29中列出包括CASI合成启动子、FI6抗体的编码序列、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列;在SEQIDNO:30中列出包括CASI合成启动子、FI6抗体的编码序列、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列。在一些实施方案中,抗体的编码序列是抗体的野生型编码序列的变体。作为另外的示例,在SEQIDNO:40中列出包括CASI启动子、WPRE、和SV40poly(A)序列的AAV载体的核苷酸序列。技术人员将领会,以上描述的每一个病毒载体中,编码抗体的核苷酸序列可以用任何其他编码感兴趣的蛋白的核酸序列替换,诸如任何其他编码抗体的核酸序列,例如任何已知的抗-HIV、抗-HCV、和/或抗-流感抗体。
在一些实施方案中,AAV载体包括与SEQIDNO:13-30具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中,AAV载体包括与SEQIDNO:40具有至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%、或更多的序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中,病毒载体包括CMV启动子和SV40晚期poly(A)序列。在一些实施方案中,AAV载体包括CASI合成启动子、WPRE和SV40晚期poly(A)序列。在一些实施方案中,AAV载体包括CASI合成启动子、WPRE和兔β-珠蛋白(RBG)poly(A)序列。在一些实施方案中,AAV载体包括CASI合成启动子、WPRE和牛生长激素(BGH)poly(A)序列。在一些实施方案中,AAV载体包括。在一些实施方案中,病毒载体包括CAG启动子和SV40晚期poly(A)序列。在一些实施方案中,病毒载体包括CAG启动子、WPRE和SV40晚期poly(A)序列。
用于生产重组AAV的方法
本申请提供了用于生产能够在宿主细胞中表达一个或多个感兴趣的蛋白的重组AAV的方法和材料。如本文描述的,本文公开的方法和材料允许感兴趣的蛋白的大量生产,所述感兴趣的蛋白例如,抗体,诸如全长抗体。
在一些实施方案中,用于生产重组AAV的方法包括提供具有包括诸如本文描述的AAV的5’末端反向重复序列(ITR)和3’AAVITR、用于产生生产性AAV感染的辅助功能、和AAVcap基因的病毒构建体的包装细胞系;和从包装细胞系的上清液中回收重组AAV。可使用多种类型的细胞作为包装细胞系。例如,可使用的包装细胞系包括,但不限于,HEK293细胞、HeLa细胞、和Vero细胞,例如在美国专利公布号20110201088中公开的。
在一些实施方案中,通过用于浓缩病毒的PEG沉淀处理包装细胞系的上清液。在一些实施方案中,沉淀在不超过约4℃(例如约3℃、约2℃、约1℃、或约1℃)发生至少约2小时、至少约3小时、至少约4小时、至少约6小时、至少约9小时、至少约12小时、或至少约24小时。在一些实施方案中,通过低速离心及之后CsCl梯度将重组AAV从PEG沉淀的上清液中分离。低速离心可以以约4000rpm、约4500rpm、约5000rpm、或约6000rpm持续约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟或约60分钟。在一些实施方案中,通过以约5000rpm持续约30分钟离心及之后CsCl梯度将重组AAV从PEG沉淀的上清液中分离。
在一些实施方案中,病毒构建体还包括启动子和启动子下游的限制性酶切位点以允许编码一个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸的插入,其中启动子和限制性酶切位点位于5’AAVITR的下游和3’AAVITR的上游。在一些实施方案中,病毒构建体还包括限制性酶切位点下游和3’AAVITR上游的转录后调节元件。在一些实施方案中,病毒构建体还包括插入在限制性酶切位点并与启动子可操作地连接的多核苷酸,其中多核苷酸包括感兴趣的蛋白的编码区。如技术人员将领会的,可将本申请公开的任一AAV载体在方法中作为生产重组AAV的病毒构建体使用。
在一些实施方案中,辅助功能由一个或多个包括腺病毒辅助基因的辅助质粒或辅助病毒提供。腺病毒辅助基因的非限制性示例包括E1A、E1B、E2A、E4和VA,其可以提供AAV包装的辅助功能。
在一些实施方案中,AAVcap基因存在于质粒中。质粒还可包括AAVrep基因。本申请涵盖,本文可使用来自任何AAV血清型(包括,但不限于,AAV1、AAV2、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9,和其任何变体)的cap基因和/或rep基因以产生本文公开的重组AAV以表达一个或多个感兴趣的蛋白。在一些实施方案中,AAVcap基因编码来自血清型1、血清型2、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、血清型9的衣壳、或其变体。
在一些实施方案中,可用编码AAVcap基因的辅助质粒或辅助病毒、病毒构建体和质粒转染包装细胞系;并可在共转染后的不同时间点收集重组AAV病毒。例如,重组AAV病毒可在共转染后约12小时、约24小时、约36小时、约48小时、约72小时、约96小时、约120小时、或任何这些两个时间点之间的时间被收集。
AAV的辅助病毒在本领域是已知的并包括,例如,来自腺病毒科(Adenoviridae)和疱疹病毒科(Herpesviridae)的病毒。AAV的辅助病毒的示例包括,但不限于,美国公布号20110201088中描述的SAdV-13辅助质粒和SAdV-13样辅助病毒、辅助载体pHELP(AppliedViromics)。技术人员将领会,本文可使用能够提供AAV足够的辅助功能的AAV的任何辅助病毒或辅助质粒。
还可使用本领域已知的适于生产感染性重组AAV的任何常规方法生产本文公开的重组AAV病毒。在某些情况下,可通过稳定表达AAV颗粒生产必要的一些组分的细胞系生产重组AAV。例如,包括AAVrep和cap基因、和选择标记诸如新霉素抗性基因的质粒(或多个质粒)可被整合进入细胞(包装细胞)的基因组。随后可用辅助病毒(例如,提供辅助功能的腺病毒)和包括5’和3’AAVITR及编码感兴趣的蛋白的核苷酸序列的病毒载体一起共感染包装细胞系。此方法的优点是细胞是可选择的并适于重组AAV的大规模生产。作为另外的非限制性示例,可使用腺病毒或杆状病毒而非质粒以将rep和cap基因引入包装细胞。作为又另外的非限制性示例,包含5’和3’AAVITR的病毒载体和rep-cap基因都能够稳定整合入生产细胞的DNA中,并可由野生型腺病毒提供辅助功能以生产重组AAV。
在一些实施方案中,重组AAV不是自身互补的AAV(scAAV)。
如将被技术人员领会的,可将适于纯化AAV的任何常规方法用于本文描述的实施方案中以纯化重组AAV。例如,可将重组体从包装细胞和/或包装细胞的上清液中分离和纯化。在一些实施方案中,可通过使用CsCl梯度的分离方法纯化AAV。而且,美国专利公布号20020136710描述了用于纯化AAV的方法的另外的非限制性示例,其中使用包括固定有介导AAV吸附的人工受体或受体样分子的基质的固相支持体将AAV从样品中分离并纯化。
病毒载体和重组AAV的应用
可将本文公开的病毒载体用于产生表达感兴趣的蛋白的重组AAV。由本文描述的方法和系统产生的重组AAV生产的蛋白具有多种多样的用途,例如,它们可在诸如诊断、治疗、研究、化合物筛选和药物发现的应用中是有用的。
蛋白体外生产
作为非限制性的示例,本文公开的重组AAV可被用于体外生产感兴趣的蛋白,例如,在细胞培养物中。作为一个非限制性的示例,在一些实施方案中,用于体外生产感兴趣的蛋白的方法,其中该方法包括提供包含编码感兴趣的蛋白的核苷酸序列的重组AAV;并将重组AAV与细胞培养物中的细胞接触,据此重组AAV在细胞中表达感兴趣的蛋白。编码感兴趣的蛋白的核苷酸序列的大小可以不同。例如,核苷酸序列的长度可以是至少约1.4kb、至少约1.5kb、至少约1.6kb、至少约1.7kb、至少约1.8kb、至少约2.0kb、至少约2.2kb、至少约2.4kb、至少约2.6kb、至少约2.8kb、至少约3.0kb、至少约3.2kb、至少约3.4kb、或至少约3.5kb。在一些实施方案中,核苷酸的长度是至少约1.4kb。
如以上公开的,感兴趣的蛋白不以任何方式被限制。例如,感兴趣的蛋白可以是抗体,例如病毒的中和抗体。此处公开的重组AAV可体外生产高水平的感兴趣的蛋白。
在一些实施方案中,感兴趣的蛋白是荧光素酶或荧光蛋白(例如,GFP)。可将表达荧光蛋白的重组AAV用于用允许显现被感染的细胞的荧光标记细胞,所述被感染的细胞例如肌细胞。
蛋白体内生产
作为非限制性的示例,本文公开的重组AAV可被用于体内生产感兴趣的蛋白,例如,在动物诸如哺乳动物中。一些实施方案提供了用于体内生产感兴趣的蛋白的方法,其中该方法包括提供包含编码感兴趣的蛋白的核苷酸序列的重组AAV;并对受试对象施用重组AAV,据此重组AAV在受试对象中表达感兴趣的蛋白。在一些实施方案中,受试对象可以是非人哺乳动物,例如,猴、狗、猫、小鼠、或牛(cow)。编码感兴趣的蛋白的核苷酸序列的大小可以不同。例如,核苷酸序列的长度可以是至少约1.4kb、至少约1.5kb、至少约1.6kb、至少约1.7kb、至少约1.8kb、至少约2.0kb、至少约2.2kb、至少约2.4kb、至少约2.6kb、至少约2.8kb、至少约3.0kb、至少约3.2kb、至少约3.4kb、或至少约3.5kb。在一些实施方案中,核苷酸的长度是至少约1.4kb。
如以上公开的,感兴趣的蛋白不以任何方式被限制。例如,感兴趣的蛋白可以是抗体,例如病毒的中和抗体。此处公开的重组AAV可体内生产高水平的感兴趣的蛋白。例如,感兴趣的蛋白可在受试对象的血清中以至少约9μg/ml、至少约10μg/ml、至少约50μg/ml、至少约100μg/ml、至少约200μg/ml、至少约300μg/ml、至少约400μg/ml、至少约500μg/ml、至少约600μg/ml、至少约700μg/ml、至少约800μg/ml、至少约900μg/ml、或至少约1000μg/ml的量表达。在一些实施方案中,感兴趣的蛋白在受试对象的血清中以约9μg/ml、约10μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml、约200μg/ml、约300μg/ml、约400μg/ml、约500μg/ml、约600μg/ml、约700μg/ml、约800μg/ml、约900μg/ml、约1000μg/ml、约1500μg/ml、约2000μg/ml、约2500μg/ml、或任何两个这些值之间的范围的量表达。在一些实施方案中,感兴趣的蛋白在受试对象的血清中以至少约9μg/ml的量表达。在一些实施方案中,感兴趣的蛋白在受试对象的血清中以至少约100μg/ml的量表达。在一些实施方案中,感兴趣的蛋白在受试对象的血清中以至少约500μg/ml的量表达。
我们或许还想要具有仅用于抗体在动物中一般表达的明确的支持-想要确定我们拥有一个很好的描述部分,并也许是关于表达水平的某事?我在思考我们可能想要拥有在动物中(以某个水平?)表达例如HCV或HIV或流感抗体的权利要求-不涉及治疗-仅使用特定的环境中表达(并可能以某个水平),如此它将很好的具有的涉及那个的特定描述。
诊断应用
在一些实施方案中,可将病毒载体用于产生表达在检测疾病或障碍和/或监测疾病或障碍的进展中有用的一个或多个感兴趣的蛋白的重组AAV。如本文公开的,术语“诊断”指鉴定疾病或障碍的存在或不存在或性质。例如,当感兴趣的蛋白是抗体时,可使用重组AAV病毒检测抗原。与疾病或障碍相关的抗原(例如,抗原蛋白、抗原核酸序列、抗原肽、抗原脂质、抗原碳水化合物、和抗原小分子)的检测提供了诊断疾病或障碍的手段。此诊断方法可被使用,例如,用于状况的早期诊断以确定受试对象是否易患疾病或障碍、以监测疾病或障碍的进展或治疗方案的进展、以评价疾病或障碍的严重程度、以预测疾病或障碍的结果和/或恢复前景,或以帮助确定适用于受试对象的治疗。可体外或体内进行检测。
本文描述的实施方案中的诊断涉及的疾病包括,但不限于,其中抗原,诸如与疾病相关的抗原能够特异结合至感兴趣的抗体的任何疾病。例如,抗原可以是肿瘤抗原、病毒抗原、微生物抗原、过敏原、和自身抗原。在一些实施方案中,抗原是病毒抗原,诸如HIV抗原。在一些实施方案中,抗原是肿瘤相关抗原(TAA)。
许多疾病的抗体是已知的并在本文可被用作感兴趣的蛋白。例如,可将抗-环瓜氨酸肽抗体(抗-CCP2)用作感兴趣的蛋白以检测风湿性关节炎。
在一些实施方案中,待被诊断的疾病是一种类型的肿瘤,诸如,例如,白血病、癌、淋巴瘤、星细胞瘤、肉瘤、及特别是尤因氏肉瘤(Ewing’ssarcoma)、神经胶质瘤、成视网膜细胞瘤、黑色素瘤、肾胚细胞瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌、胰腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌、睾丸癌、肾细胞癌、和脑癌。
在一些实施方案中,待被诊断的疾病与细胞内寄生物的感染相关。例如,细胞内寄生物可以是病毒,诸如,例如,腺病毒、巨细胞病毒、Epstein-Barr病毒、单纯性疱疹病毒(HSV)、人类疱疹病毒6、水痘带状疱疹病毒、肝炎病毒、乳头瘤病毒、细小病毒、多瘤病毒、麻疹病毒、风疹病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)、或人类T细胞白血病病毒。在一些实施方案中,细胞内寄生物可以是细菌、原生动物、真菌、或朊病毒。更特别的是,细胞内寄生物可以是,例如,衣原体、李斯特菌属(Listeria)、沙门氏菌属(Salmonella)、军团菌属(Legionella)、布鲁氏菌属(Brucella)、柯克斯氏体属(Coxiella)、立克次氏体、分枝杆菌属(Mycobacterium)、利什曼原虫(Leishmania)、锥虫属(Trypanasoma)、弓形虫、和疟原虫。在一些实施方案中,疾病是疟疾。
在一些实施方案中,检测受试对象中的疾病的方法包括选择待被检测的疾病的抗体,将包括抗体的编码区的多核苷酸插入本文公开的病毒载体中,从病毒载体产生重组AAV,将重组AAV感染至受试对象,和基于抗体和其特异性抗原之间的特异性结合的存在或不存在确定受试对象中疾病的存在或不存在。
抗体的许多其他用途在本领域是众所周知的,包括治疗、诊断、法医学、环境、和商业应用。例如,抗原可体外或体内地结合至感兴趣的抗体。因此,可将本文公开的方法用于检测法医/环境样品或组织/细胞中生物体和/或抗原(例如,多肽、碳水化合物、脂质或核酸)的存在。在一些实施方案中,该方法可用于生产能够允许酶的激活状态的检测的抗体。
在一些实施方案中,该方法可被用于纯化蛋白,例如以实验室或工业规模。
治疗应用
可将本文描述的重组AAV和方法用于表达一种或多种治疗蛋白以预防或治疗受试对象中一种或多种疾病或障碍。
可将本文描述的重组的AAV和方法用于抑制或减少多种病毒感染的风险。一些实施方案公开了用于减少或抑制受试对象中病毒感染风险的方法,其中该方法包括:提供包括编码病毒的中和抗体的核苷酸序列的重组AAV;并将重组AAV施用至受试对象,据此重组AAV在受试对象中表达抗体。重组AAV可产生高水平的病毒中和抗体。例如,在一些实施方案中,重组AAV可在受试对象的血清中以至少约9μg/ml、至少约10μg/ml、至少约50μg/ml、至少约100μg/ml、至少约200μg/ml、至少约300μg/ml、至少约400μg/ml、至少约500μg/ml、至少约600μg/ml、至少约700μg/ml、至少约800μg/ml、至少约900μg/ml、或至少约1000μg/ml的量表达病毒中和抗体。在一些实施方案中,病毒中和抗体在受试对象的血清中以约9μg/ml、约10μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml、约200μg/ml、约300μg/ml、约400μg/ml、约500μg/ml、约600μg/ml、约700μg/ml、约800μg/ml、约900μg/ml、约1000μg/ml、约1500μg/ml、约2000μg/ml、约2500μg/ml、或任何两个这些值之间的范围的量表达。
与没有用病毒治疗的受试对象相比,本文公开的方法能够,例如,减少受试对象中的感染风险至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约8倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、或至少约30倍。在一些实施方案中,与没有用病毒治疗的受试对象相比,该方法可减少受试对象中感染风险约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约8倍、约10倍、约15倍、约20倍、约25倍、约30倍、或任何两个这些值之间的范围。在一些实施方案中,与没有用病毒治疗的受试对象相比,该方法减少使用病毒治疗的受试对象中感染风险至少约5倍。在一些实施方案中,与没有用病毒治疗的受试对象相比,该方法减少使用病毒治疗的受试对象中感染风险至少约20倍。在一些实施方案中,该方法阻止受试对象中发生病毒感染。在一些实施方案中,该方法抑制受试对象中的病毒感染。
病毒感染的非限制性示例包括由选自以下的病毒造成的感染:腺病毒、α-病毒科(Alphaviridae)、虫媒病毒、星状病毒、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、α-疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)、β-疱疹病毒亚科(Betaherpesvirinae)、γ-疱疹病毒亚科(Gammaherpesvirinae)、诺沃克病毒、星状病毒科(Astroviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、副粘病毒、腮腺炎病毒属(Rubulavirus)、麻疹病毒属(Morbillivirus)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、细小病毒科(Parvoviridae)、小RNA病毒科(Picornaviridae)、口蹄疫病毒科(Aphthoviridae)、心病毒科(Cardioviridae)、肠病毒科(Enteroviridae)、柯萨奇病毒、脊髓灰质炎病毒、鼻病毒科(Rhinoviridae)、藻DNA病毒科(Phycodnaviridae)、痘病毒科(Poxviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、轮状病毒、逆转录病毒科(Retroviridae)、A型逆转录病毒、免疫缺陷病毒、白血病病毒、禽肉瘤病毒、弹状病毒、风疹病毒科(Rubiviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、和其任何组合。病毒感染的非限制性示例包括人免疫缺陷病毒(HIV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、乙型肝炎病毒(HBC)感染、EpsteinBarr病毒感染、流感病毒感染、呼吸道合胞体病毒感染。在一些实施方案中,病毒感染是丙型肝炎病毒感染。在一些实施方案中,病毒感染是HIV感染。在一些实施方案中,病毒感染是流感感染。
一些实施方案提供了减少已暴露于病毒的受试对象(例如,已接触到被病毒感染的另外的受试对象的受试对象)的病毒感染的风险的方法。一些实施方案提供了减少将暴露于病毒的受试对象(例如,将接触到被病毒感染的另外的受试对象的受试对象)的病毒感染的风险的方法。在一些实施方案中,提供了预防病毒感染的方法。
本文描述的病毒载体、重组AAV和方法可被用于表达一种或多种治疗蛋白以治疗多种疾病。疾病的非限制性示例包括肿瘤诸如癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤;和自身免疫病诸如多发性硬化。癌的非限制性示例包括食管癌;肝细胞癌;基底细胞癌、鳞状细胞癌(各种组织);膀胱癌,包括移行细胞癌;支气管癌;结肠癌;结肠直肠癌;胃癌;肺癌,包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌;肾上腺皮质癌;甲状腺癌;胰腺癌;乳腺癌;卵巢癌;前列腺癌;腺癌;汗腺癌;皮脂腺癌;乳头状癌;乳头状腺癌;囊腺癌;髓样癌;肾细胞癌;导管原位癌或胆管癌;绒毛膜癌;精原细胞瘤;胚胎性癌;肾胚细胞瘤;宫颈癌;子宫癌;睾丸癌;成骨细胞癌;上皮癌;和鼻咽癌。肉瘤的非限制性示例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、脊索瘤、骨源性肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肉瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、和其他软组织肉瘤。实体瘤的非限制性示例包括神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、成神经细胞瘤、和成视网膜细胞瘤。白血病的非限制性示例包括慢性骨髓增生异常综合征;急性骨髓性白血病;慢性淋巴细胞白血病,包括B-细胞CLL、T-细胞CLL幼淋巴细胞白血病、和毛细胞白血病;和急性成淋巴细胞白血病。淋巴瘤的示例包括,但不限于,B-细胞淋巴瘤,诸如Burkitt淋巴瘤、Hodgkin淋巴瘤;和类似的。使用本文公开的AAV载体、重组病毒和方法能够治疗的疾病的其他非限制性示例包括遗传疾病,包括镰状细胞性贫血、囊性纤维化、溶酶体酸性脂肪酶(LAL)缺陷1、泰-萨病(Tay-Sachsdisease)、苯丙酮酸尿症、粘多糖贮积病、糖原贮积病(GSD,例如,GSD型I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII、XIII、和XIV)、半乳糖血症、肌肉萎缩症(例如,杜氏肌肉萎缩症)、和血友病。
感兴趣的蛋白在受试对象(例如,受试对象的血清)中表达的量可以不同。例如,在一些实施方案中,蛋白可在受试对象的血清中以至少约9μg/ml、至少约10μg/ml、至少约50μg/ml、至少约100μg/ml、至少约200μg/ml、至少约300μg/ml、至少约400μg/ml、至少约500μg/ml、至少约600μg/ml、至少约700μg/ml、至少约800μg/ml、至少约900μg/ml、或至少约1000μg/ml的量表达。在一些实施方案中,感兴趣的蛋白在受试对象的血清中以约9μg/ml、约10μg/ml、约50μg/ml、约100μg/ml、约200μg/ml、约300μg/ml、约400μg/ml、约500μg/ml、约600μg/ml、约700μg/ml、约800μg/ml、约900μg/ml、约1000μg/ml、约1500μg/ml、约2000μg/ml、约2500μg/ml、或任何两个这些值之间的范围的量表达。技术人员将理解,用于本方法有效的所需的感兴趣的蛋白的表达水平可取决于非限制性因素诸如具体的感兴趣的蛋白和接受治疗的受试对象而不同,并可由技术人员使用本领域已知的常规方法容易确定蛋白的有效量而没有过度实验。
技术人员将领会,可将一种或多种病毒载体和重组AAV一起用于本文描述的应用。例如,为了诊断和/或治疗的目的,可将表达不同的感兴趣的蛋白或感兴趣的蛋白的不同亚基的重组AAV病毒施用于相同的受试对象。在一些实施方案中,将重组病毒共施用至受试对象。在一些实施方案中,将重组病毒分别施用至受试对象。在一些实施方案中,可将表达第一感兴趣的蛋白的第一重组AAV和表达第二感兴趣的蛋白的第二重组AAV一起或分别施用至受试对象,其中第一感兴趣蛋白和第二感兴趣蛋白可以是相同的或不同的。在一些实施方案中,第一感兴趣蛋白是抗-HIV中和抗体且第二感兴趣蛋白是不同的抗-HIV中和抗体。在一些实施方案中,第一感兴趣蛋白是抗-流感中和抗体且第二感兴趣蛋白是不同的抗-流感中和抗体。在一些实施方案中,可将表达感兴趣的蛋白的第一亚基的第一重组AAV和表达感兴趣的蛋白的第二亚基的第二重组AAV一起或分别施用至受试对象。
药物组合物和给药方法
本文还公开了包括本文公开的重组AAV病毒和药学上可接受的载体的药物组合物。组合物还可包括另外的成分诸如稀释剂、稳定剂、赋形剂、和佐剂。如本文所用的,“药学上可接受的”载体、赋形剂、稀释剂、佐剂、或稳定剂以采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或受试对象是无毒的(优选惰性的)或具有由熟练从业人员确定的可接受的毒性水平的那些。
载体、稀释剂和佐剂可包括缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐、或其他有机酸;抗氧化剂诸如抗坏血酸;低分子量多肽(例如,少于约10个残基);蛋白诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白;亲水聚合物诸如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、或赖氨酸;单糖、双糖、和其他碳水化合物,包括葡萄糖、甘露糖、或糊精;螯合剂诸如EDTA;糖醇诸如甘露醇或山梨醇;成盐平衡离子(counterions)诸如钠;和/或非离子型表面活性剂诸如TweenTM、PluronicsTM或聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中,生理上可接受的载体是pH缓冲水溶液。
待施用的重组AAV病毒的滴度将取决于例如,具体的重组AAV病毒、给药方式、治疗目标、个体、和靶细胞类型而不同,并可通过本领域标准方法确定。
如将对本领域技术人员明显的,待被施用的重组病毒的体内有用的剂量和具体的给药方式将取决于年龄、体重、痛苦的严重程度、和治疗的动物种类、所用的表达感兴趣的蛋白的具体的重组病毒、和采用重组病毒用于的特定用途而不同。有效剂量水平,即获得所需结果必需的剂量水平的确定,可由本领域技术人员使用常规药理方法实现。典型地,产品的人临床应用以较低的剂量水平开始,增加剂量水平直到获得预期效果。可选地,可使用体外可接受的研究以使用已建立的药理方法确立通过本发明方法鉴定的组合物的有用的剂量和给药途径。
尽管将在不同药物(drug-by-drug)基础上确定确切的剂量,在大部分情况下,可作出一些关于剂量的概括。在一些实施方案中,通过以每kg受试对象的1x1011基因组拷贝(GC)的重组病毒和每kg1x1013GC之间的剂量注射至受试对象,例如在5x1011GC/kg和5x1012GC/kg之间,可施用表达感兴趣的蛋白的重组AAV。
可将本文公开的重组病毒施用至需要其的受试对象(例如,人)。不具体限制给药的途径。例如,可通过本领域标准的途径将重组病毒的治疗有效的量施用至受试对象。途径的非限制性示例包括肌内的、阴道内的、静脉内的、腹膜内的、皮下的、表皮的、皮内的、直肠的、眼内的、肺的、颅内的、骨内的、口内的、颊的、或鼻的。在一些实施方案中,通过肌内注射将重组病毒施用至受试对象。在一些实施方案中,通过阴道内注射将重组病毒施用于受试对象。在一些实施方案中,通过非肠道途径(例如,通过静脉内的、肌内的或皮下的注射)、通过表面划破(surfacescarification)或通过接种到受试对象的体腔内将重组AAV施用至受试对象。给药途径和重组AAV病毒的AAV成分的血清型可由本领域技术人员考虑到被治疗的感染和/或疾病病情和待表达感兴趣的蛋白的靶细胞/组织容易确定。在一些实施方案中,将重组病毒施用于肌细胞。
重组AAV病毒的实际施用可通过使用将运输重组AAV病毒进入受试对象的靶组织内的任何物理方法实现。例如,可将重组AAV病毒注射进入肌肉、血流、和/或直接进入肝脏。重组AAV病毒的衣壳蛋白可被修饰以致重组AAV病毒靶向特定的感兴趣的靶组织诸如肌肉和阴道。可制备药物组合物作为注射剂型或作为局部剂型以通过经皮运输递送至肌肉。
关于肌内注射,可采用佐剂诸如芝麻或花生油中的溶液或丙二醇的水溶液中的溶液、和无菌水溶液。如果需要的话,此类水溶液可被缓冲,并首先用生理盐水或葡萄糖使得液体稀释剂等渗。可在水与表面活性剂诸如羟丙纤维素适当混合中制备作为游离酸(DNA含有酸性磷酸基团)或药学上可接受的盐的重组AAV病毒的溶液。还可在甘油、液态聚乙二醇及其混合物和油中制备重组AAV病毒的分散体。在储存和使用的一般条件下,这些制剂包含防止微生物生长的防腐剂。
将被使用的重组病毒可以以液态或冷冻干燥形式(与一种或多种合适的防腐剂和/或在冷冻干燥过程中保护病毒的保护剂组合)被利用。关于基因治疗(例如,可通过特定的基因产物被改善的神经障碍),将表达治疗蛋白的重组病毒的治疗有效剂量施用至需要此治疗的宿主。本文公开的重组病毒在制造用于诱导宿主中的免疫力或提供基因治疗至宿主的药剂中的用途在本申请的范围内。
在重组AAV病毒的人的剂量已对至少一些病症确立的情况下,可使用那些相同的剂量,或在确立的人的剂量的约0.1%和500%之间、更优选在约25%和250%之间的剂量。在没有人的剂量被确立的情况下,如对于新发现的药物组合物的情况,可从ED50或ID50值或源自体外或体内研究,如动物中的毒性研究和功效研究证明合格的其他合适的值推断合适的人的剂量。
可在不同的时间点将重组AAV的治疗有效量施用至受试对象。例如,可在被病毒感染之前、期间、或之后将重组AAV施用至受试对象。还可在疾病(例如,癌症)发生之前、期间、或之后将重组AAV施用至受试对象。在一些实施方案中,在癌症缓解期将重组AAV施用至受试对象。在一些实施方案中,在被病毒感染之前施用重组AAV用于免疫预防。
重组AAV病毒的给药频率可以不同。例如,可约每周一次、约每两周一次、约每月一次、约每六个月一次、约每年一次、约每两年一次、约每三年一次、约每四年一次、约每五年一次、约每六年一次、约每七年一次、约每八年一次、约每九年一次、约每十年一次、或约每十五年一次将重组AAV病毒施用至受试对象。在一些实施方案中,至多约每周一次、至多约每两周一次、至多约每月一次、至多约每六个月一次、至多约每年一次、至多约每两年一次、至多约每三年一次、至多约每四年一次、至多约每五年一次、至多约每六年一次、至多约每七年一次、至多约每八年一次、至多约每九年一次、至多约每十年一次、或至多约每十五年一次将重组AAV病毒施用至受试对象。
实施例
在以下的实施例中更详细地公开了另外的实施方案,其不以任何方式意图限制权利要求的范围。
实验材料与方法
下面的实验材料和方法被用于以下描述的实施例1-9。
AAV定量和功能验证
使用下面的一般程序通过qPCR定量纯化的AAV。将AAV的冷冻等份解冻并在包含10个单位的DNaseI(Roche)的消化缓冲液中稀释10倍并在37℃孵育30分钟。将经DNase消化的病毒连续稀释并将5ml的每一种稀释液用于与PerfeCTaSYBRGreenSuperMix,ROX(QuantaBiosciences)和针对CMV增强子(5’CMV:AACGCCAATAGGGACTTTCC(SEQIDNO:31)和3’CMV:GGGCGTACTTGGCATATGAT(SEQIDNO:32))或荧光素酶转基因(5’Luc:ACGTGCAAAAGAAGCTACCG(SEQIDNO:33)和3’Luc:AATGGGAAGTCACGAAGGTG(SEQIDNO:34))设计的引物的15μlqPCR反应中。将样品一式两份在AppliedBiosystems7300实时PCRSystem上运行。使用以下的循环条件:50℃持续2分钟的一个循环、95℃持续10分钟的一个循环、95℃持续15秒的40个循环和60℃持续60秒。通过与使用以下产生的标准曲线比较来确定病毒滴度:用XhoI/NheI从pVIP荧光素酶表达载体切下的纯化的DNA片段或由先前针对DNA标准测定滴度的表达4E10抗体的纯化的AAV2/8组成的参考标准。
为了验证每批被测定滴度的病毒的功能活性,使用293T细胞执行体外感染测定并在细胞悬浮液中测量抗体的浓度。在感染之前24小时,使用1ml培养基中的500K细胞接种12孔的平板。在感染之前2小时,用500μl每孔的新鲜培养基替换培养基。将每一个病毒的基因组拷贝(1011)添加至每一个孔中并允许感染6天。移出上清液并通过ELISA定量总的IgG的产量。
小鼠品系
从JacksonLaboratory获得免疫缺陷NOD/SCID/γc(NSG)、免疫活性的C57BL/6(B6)和Balb/C小鼠。从A.Berns获得免疫缺陷的Rag2/γc小鼠。
AAV肌内注射和生物发光成像
将之前被测定滴度的病毒的等份在冰上缓慢解冻并在TFB2中稀释以获得40μl体积中预定的剂量。通过异氟烷吸入麻醉小鼠并用28G胰岛素注射器将单一的40μl注射剂施用进入腓肠肌。在载体施用之后的不同时间,小鼠被取血以确定血清中抗体浓度或使用XenogenIVIS200Series成像系统(CaliperLifesciences)被成像。为了成像,通过异氟烷吸入麻醉小鼠并通过腹膜内注射给予100μl的15mgml-1的D-荧光素(GoldBiotechnology)。在D-荧光素注射后5和10分钟之间拍摄图像。
通过ELISA定量抗体产量
关于总的人IgG的检测,用1μg每孔的山羊抗-人IgG-Fc抗体(Bethyl)包被ELISA板1小时。用TBS中1%BSA(KPL)封闭板至少2小时。将样品于室温在含有1%BSA(KPL)的TBST中孵育1小时,随后与HRP轭合的山羊抗-人k轻链抗体(Bethyl)一起孵育30分钟。用TMBMicrowellPeroxidaseSubstrateSystem(KPL)检测样品。使用人参考血清(HumanReferenceSerum)(Lot3,Bethyl)或纯化的人IgG/Kappa(Bethyl)产生标准曲线。
关于结合gp120的IgG的检测,用0.04-0.10μg每孔的HIV-1gp120MN蛋白(ProteinSciences)包被ELISA板1小时。用TBS中1%BSA(KPL)封闭板至少2小时。将样品于室温在含有1%BSA(KPL)的TBST中孵育1小时,随后与HRP轭合的山羊抗人IgG-Fc抗体(Bethyl)一起孵育30分钟。用TMBMicrowellPeroxidaseSubstrateSystem(KPL)检测样品。使用适于样品的纯化的b12或VRC01蛋白产生标准曲线。
HIV病毒生产和滴度测定
于37℃在5%CO2的培养箱中,在补充10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合物(Mediatech)、1%谷氨酰胺(Mediatech)的DMEM培养基中维持293T细胞。在转染前3天,用25ml培养基中的3.75×106细胞接种两个15cm平板的每一个。转染前2小时,将培养基更换为15ml的新的培养基。根据制造商的说明,使用Trans-IT试剂(Mirus)转染40微克的编码HIV的感染性分子克隆的pNL4-3质粒36。转染后在24、48和72小时执行上清液收集并在每一次收获之后将15ml的新鲜培养基温和地添加回平板。使用0.45μm过滤器过滤合并的上清液以去除细胞碎片并等分用于在–80℃储存。使用AllianceHIV-1p24抗原ELISA试剂盒(Perkin-Elmer),遵循制造商的说明定量HIV。
体外HIV保护测定
根据以下描述的典型的步骤执行荧光素酶报告细胞中的体外中和测定。于37℃在5%CO2的培养箱中,在补充10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合物(Mediatech)、1%谷氨酰胺(Mediatech)的DMEM培养基中保持来自美国国立卫生研究院AIDS研究和参考试剂项目(NationalInstitutesofHealthAIDSResearchandReferenceReagentProgram)的TZM-bl细胞。在测定之前,用胰蛋白酶消化、计数并以每毫升105个细胞的浓度在15ml的总体积中重悬TZM-bl细胞。将细胞与75μgml-1的DEAE-葡聚糖和如指示的不同浓度的每一种抗体一起混合并允许在病毒制备期间在冰上孵育。为制备病毒稀释液,将储存的NL4-3在生长培养基中稀释至250ngml-1并在测定板中顺序地4倍连续稀释。将100微升含有10,000细胞的与抗体预孵育的培养基添加至含有之前被稀释的病毒的孔中。感染被允许于37℃在5%CO2的培养箱中进行48小时。在读板之前,将100ml的BriteLite试剂(PerkinElmer)添加到每一个孔中,并将板在室温孵育2分钟。每一个孔的120微升随后被转移至不透明板并通过VICTOR3(Wallac1420VICTOR3读板机,PerkinElmer)读取。
用于体内攻击的人源化小鼠的产生
基本上根据以下描述的步骤产生人源化的小鼠。从–80℃解冻人外周血单核细胞(AllCells),于37℃在5%CO2的培养箱中,在补充10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合物(Mediatech)、1%谷氨酰胺(Mediatech)、50μM的β-巯基乙醇、10mM的HEPES(Gibco)、13种非必需氨基酸(Gibco)、13丙酮酸钠(Gibco)的RPMI培养基中扩繁并用5μgml-1植物凝血素(Sigma)和10ngml-1的人IL-2(Peprotech)刺激用于T细胞的扩繁。将细胞在使用之前扩繁7-13天。关于移植,将300ml体积的培养基中的2百万至4百万细胞腹膜内注射进入NSG小鼠。
HIV保护实验
在HIV攻击前1天,来自每一只小鼠的血液样品经过用于抗体定量的ELISA和流式细胞术以确定基线CD4/CD8比率。第二天,通过100μl含有被在PBS中稀释的HIV的指定剂量的腹膜内或静脉内注射攻击小鼠。通过流式细胞术,被感染的小鼠经过每周血液取样以确定T细胞亚群中CD4与CD8细胞的比率。
流式细胞术
通过眼窝采血从小鼠取血液样品并在微型离心机中以1,150g离心5分钟以从细胞沉淀中分离血浆。将血浆移出并冷冻用于以后的分析并将细胞沉淀重悬在1.1ml的1×RBC裂解缓冲液(Biolegend)中并在冰上孵育至少10分钟以去除红细胞。在裂解之后,将样品于室温在微型离心机中以1,150g沉淀5分钟,并用补充2%胎牛血清(PBS1)的65μl的包含5μl抗-人CD3-FITC、5μl抗-人CD4-PE、5μl抗-人CD8a-APC抗体(Biolegend)和50μl磷酸盐缓冲盐水的混合物染色。用1mlPBS+冲洗样品并再次在微型离心机中以1,150g沉淀5分钟。将所沉淀的细胞重悬在200μl补充2μgml-1的碘化丙啶(Invitrogen)的PBS+中并在FACSCalibur流式细胞仪(Beckton-Dickinson)上分析。样品在确定该亚群中CD4与CD8细胞的比率之前首先通过CD3表达门控(gated)。将包含少于20CD3+事件的样品从分析中排除。
HIVp24的组织学染色。
在体内攻击实验结束时,将脾从小鼠中移出并浸入10%中性缓冲福尔马林中24小时。固定之后,将组织移出并放置在70%乙醇中直至标准的石蜡包埋和处理。随后取切片(4mm厚)并执行免疫组化染色用于使用Kal-1小鼠单克隆抗体和标准的抗原修复技术检测HIV-p24。由病理学家(D.S.R.)在OlympusBX51光学显微镜上检查载玻片并使用SPOTInsightDigitalCamera(DiagnosticInstruments)获得图像。
实施例1
模块化(modular)AAV转移载体的构建和克隆
为了构建AAV转移载体,合成了编码在‘flip’方向的145对碱基对(bp)的源自AAV2的末端反向重复序列1(ITR1)和在‘flop’方向的侧翼为特定的限制性酶切位点的ITR2的寡核苷酸(IntegratedDNATechnologies)并在连入PBR322质粒载体之前退火。随后,通过PCR扩增侧翼为兼容的位点的启动子、转基因和聚腺苷酸化信号并克隆在ITR之间,产生模块化的AAV转移载体,其中限制性酶切位点的独特组合在每个元件的侧翼。
为了评价不同的启动子在肌肉表达中的表达潜力,构建了一系列携带由一组普遍存在的和组织特异性启动子驱动的荧光素酶基因的载体。通过单一的注射将这些载体肌内施用入腓肠肌并监测荧光素酶的表达以确定在该靶组织中每一个启动子的相对表达潜力。巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)、嵌合的鸡-β-肌动蛋白(CAG)、和泛素C(UBC)启动子提供了牢固的肌肉表达(图1A)。
产生了新的合成的CASI启动子(长度约1.05kb)(图1B)。CASI启动子由巨细胞病毒立即早期启动子(CMV)及其后的包含转录起始位点的鸡-β-肌动蛋白(CAG)启动子的片段组成。该融合体之后直接是利用在人泛素C(UBC)启动子的增强区侧翼的共有剪接供体和剪接受体序列的合成设计的内含子。体内试验说明,CASI启动子在肌肉中比CAG启动子相当高的活性,尽管34%更紧凑(图1C)。随后将土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)并入AAV转移载体,其显著增强转基因的表达(图1D)。
还检查了源自肌肉的表达的不同的聚腺苷酸化信号的效率。SV40晚期poly(A)、兔β-珠蛋白(RBG)poly(A)和牛生长激素(BGH)poly(A)都说明了表达的类似水平(图1D)。
图1E显示编码IgG1支架的源自单克隆抗体的重链和轻链V区可被插入其中的优化的肌肉表达载体的部分的示意图。
图2显示具有荧光素酶转基因插入的优化的肌肉表达载体的图的示意图展示。如在补充的图2中显示的,载体具有在每一个模块化元件侧翼的独特的限制性酶切位点(例如,XhoI、SpeI、NotI、BamHI、Acc65I、HindIII、和NheI)。在该载体中,AAV序列直接在XhoI限制性酶切位点之后开始于来自AAV2的145bp的“flip”-末端反向重复序列(ITR),其后是SpeI限制性酶切位点和CASI启动子。CASI启动子之后是NotI限制性酶切位点和在GCGGCCGC(SEQIDNO:35)裂解位点的共有识别序列之后的一个另外C残基以在荧光素酶转基因的ATG之前模拟Kozak共有序列。转基因的3’末端终止于TAA终止密码子,其后是一个另外的A残基,随后是BamHI位点。WPRE元件在该限制性酶切位点之后并继续直至在SV40晚期聚腺苷酸化信号和HindIII限制性酶切位点之前的Acc65I限制性酶切位点。另外,第二个145bp的AAV2“flop”-ITR位于NheI位点之前。
实施例2
重组AAV病毒的生产和纯化
根据下面描述的过程,从培养物上清液中生产并纯化重组AAV病毒。
于37℃在5%CO2的培养箱中,在补充10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素混合物(Mediatech)和1%谷氨酰胺(Mediatech)的DMEM培养基中维持293T细胞。在转染前3天,用25ml培养基中的3.75×106细胞接种四个15cm平板的每一个。可选地,在转染当天之前四天可将1.875×106个细胞涂布每一个平板(每种病毒涂布7.5×106个细胞)。转染前2小时,将培养基更换为15ml的新鲜培养基。
使用BioT转染试剂(BiolandScientific)以0.25:1:2的比例将AAV转移载体与腺病毒辅助载体(pHELP(AppliedViromics)或pAd-delta-F6)和表达AAV的Rep和Cap基因产物的辅助质粒(pAAV2/8SEED)一起共转染。每次转染所用的DNA的总量为80μg。转染后36、48、72、96、和120小时执行5次AAV病毒收集。关于每一个时间点,将培养基通过0.2μm过滤器过滤并将15ml的新鲜培养基温和添加至平板。
在收集之后,将约75ml的5×PEG溶液(40%聚乙二醇、2.5MNaCl)添加至收集的上清的总体积中(~300ml)并将病毒在冰上沉淀至少2小时。将沉淀的病毒以7,277g沉淀30分钟(SorvallRC3BPlus,H-6000A转子)并重悬在1.37gml-1氯化铯中。将重悬的病毒均匀地分入两个Quick-Seal管子(Beckman)中并以329,738g在20℃旋转24小时(BeckmanCoulter,OptimaLE-80K,70Ti转子)。将100-200ml的部分收集在96孔平底组织培养平板中,并使用折光仪定量5ml的每个部分的折光率。将呈现在1.3755和1.3655之间的折光率的孔组合并使用TestFormulationBuffer2(TFB2,100mM柠檬酸钠,10mMTris,pH8)稀释至15ml的终体积。将病毒装载到100kDa的MWCO离心过滤器(Millipore)上并经过在4℃以500g的离心直至形成1ml的滞留物。随后将保留的病毒再次在TFB2中稀释至15ml的总体积并重复此过程以致病毒被冲洗3次。最终的保留体积在共500-1000ml之间,将其等分并储存在–80℃。
实施例3
优化抗体转基因
为了创建用于抗体表达的优化的骨架,将由F2A自加工肽序列分开的一些广泛中和HIV抗体的重链和轻链克隆入哺乳动物表达载体中的CMV启动子的控制下。用这些载体转染的293T细胞说明人IgG分泌进入培养物上清液中可被ELISA检测(图3A)。为了改善表达,将F2A序列重新改造以更好的反映哺乳动物密码子利用并在N-末端并入弗林蛋白酶裂解位点用于优化加工。通过转染将具有优化的F2A序列(SEQIDNO:9)的载体与具有标准F2A序列(SEQIDNO:10)载体的比较显示具有优化的F2A序列的载体产生较高水平的所有4种被试验的抗体。
为了改善抗体的分泌,用源自人生长激素(HGH)的密码子优化序列替换内源信号序列并创建4E10表达载体的版本,其中重链、轻链、或两条链由单独的HGH信号序列驱动并通过转染比较它们的表达。为了最小化载体中的重复序列,合成了两条HGH序列(SEQIDNO:11和12),其具有不同的核苷酸序列但编码相同的氨基酸,并将每一条专门用于重链或轻链。在重链或轻链处用HGH序列替换内源信号序列导致较高水平的抗体产生,且两条链的信号序列的替换都产生了最好的结果(图3B)。
为了去除编码抗体的转录本的不适当的剪接的潜力,将序列经过计算机模拟剪接预测并通过至位点的保守突变或,当这个不可能时,至附近序列的保守突变的使用去除所有潜在剪接供体和受体序列。当放置在这个剪接-优化的骨架中时观察到4E10抗体的改善的表达(图3C)。
最终抗体转基因的结构示意图在图3D中显示。如图3D中显示的,抗体转基因由HGH信号序列、其之后的可交换的VH区、剪接优化的重链恒定区、连接至优化的融合至第二HGH信号序列的F2A肽的弗林蛋白酶裂解位点、可交换的VL区、和剪接优化的k轻链恒定区组成。
为了确认以上描述的针对改善基因表达作出的优化没有影响抗体的中和效力,将一些被研究充分的广泛中和抗体(例如,b12、2G12、4E10、和2F5抗-HIV抗体)从优化的表达载体中表达。将产生的抗体纯化并使用TZM-bl荧光素酶报告细胞在体外保护测定中试验。将携带在HIV诱导转录元件控制下的荧光素酶基因的细胞(TZM-bl细胞)与每一种抗体的稀释液孵育,随后用递增量的HIV攻击。将细胞用不同浓度的抗体铺板,随后用递增滴度的NL4-3HIV毒株攻击。攻击之后两天,裂解细胞并在添加荧光素底物之后定量荧光素酶活性。在与先前确立的针对该毒株试验的所有四种抗体的IC50和IC90值充分相关的抗体浓度观察到TZM-bl细胞感染中强烈的减少(图4A-D)。
实施例4
抗体转基因的体内表达
通过腓肠肌的单一注射,将具有来自血清型8的衣壳的表达由巨细胞病毒(CMV)启动子驱动的荧光素酶或4E10HIV中和抗体的重组AAV病毒施用至小鼠。在(图5A)中显示1×1010基因组拷贝的表达荧光素酶的AAV2/8的肌内注射后15周的代表性的Rag2/γc小鼠的Xenogen图像。给药后一周内,荧光素酶或抗体基因表达是可检测的(分别为图5B和5C)。表达持续增加,在12-16周之后获得最大水平并随后在稳定用于64周研究的持续期间之前下降2-至3-倍。图5B-C显示抗体生产是剂量依赖性的并持续至少64周。
将HIV中和b12抗体的重-链和轻-链可变区克隆入AAV转移载体,并生产重组AAV储备(stock)用于肌内施用1×1011基因组拷贝进入两个免疫缺陷和两个免疫活性的小鼠品系中的腓肠肌中:NOD/SCID/γc(NSG)、Rag2/γc(RAG)、C57BL/6(B6)和Balb/C。小鼠以高于用非优化的载体获得的水平100倍的血清浓度生产编码的抗体,且该表达水平持续了至少52周(与图5C比较的图6)。在B6小鼠中,针对人b12-IgG产生非常有限的小鼠抗体,而Balb/C动物产生的可检测的抗转基因的小鼠抗体似乎没有影响人IgG水平。
实施例5
预防由HIV攻击造成的CD4细胞的丢失
HuPBMC-NSG人源化小鼠在用具有复制能力的HIV攻击之后呈现CD4细胞消耗(20ngp24NL4-3,n=4,图7)。使用该小鼠模型以试验本文描述的载体保护小鼠免受体内攻击的能力。
将表达荧光素酶或b12抗体的重组AAV病毒施用至NSG小鼠,在6周内产生约100μgml-1的稳定的血清b12抗体浓度(图8A)。用扩繁的人外周血单核细胞(huPBMC)过继植入(adoptivelypopulated)这些小鼠,其移植超过2周的时间。随后通过HIV的NL4-3毒株的腹膜内注射攻击小鼠。
在HIV攻击之后,大部分表达荧光素酶的小鼠显示急剧的CD4细胞丢失而表达b12抗体的小鼠没有显示CD4细胞消耗(图8B)。
该实施例说明,表达抗-HIV抗体的重组AAV病毒能够保护小鼠免受由HIV感染造成的CD4细胞丢失。
实施例6
使用不同的HIV中和抗体的保护
为了比较不同的广泛中和HIV抗体的保护能力,分别产生表达b12、2G12、4E10和2F5的重组AAV病毒并施用至NSG小鼠。在施用之后7周,NSG小鼠产生20–250μgml-1的所示的抗体(图9A)。测量了每一种HIV抗体的体内血清浓度。结果显示在(图3A)。
用huPBMC过继植入被转导的小鼠,通过用HIV的静脉内注射攻击并每周取样以定量CD4细胞随时间推移的消耗(图9B)。如图9B中显示的,表达b12的动物被完全保护免受感染,且表达2G12、4E10和2F5的动物被部分地保护。显示部分保护的组由具有推迟的CD4细胞消耗的动物和整个实验过程中保持高CD4细胞水平的动物组成。
攻击后8周,杀死小鼠并将石蜡包埋的脾切片经过表达HIV的p24抗原的免疫组化染色以定量感染的程度(图9C)。如在图9D中显示的,表达b12的小鼠不具有可检测的表达p24的细胞。
实施例7
抗-HIV保护的牢固性的确定
用huPBMC过继植入一大组表达b12抗体的小鼠。在攻击之前,所有小鼠表达高水平的人IgG,推测由于移植人B细胞(图10A),但只有接受表达b12载体的小鼠产生gp120特异性的IgG,其达到100μgml-1(图10B)。
模拟被感染的表达荧光素酶或b12的小鼠在整个实验过程中显示一致的高水平CD4细胞移植,显示转基因毒性没有造成CD4细胞丢失(图11)。相比之下,表达荧光素酶的接受1ng的HIV的小鼠经历快速并大量的CD4细胞消耗。在较高剂量下,表达荧光素酶的小鼠中的感染变得更一致并导致在某些情况下CD4细胞的消耗在检测水平之下(25、125ng剂量)。显著地,所有表达b12的小鼠显示保护免受CD4细胞丢失,尽管接受超过高于消耗8只对照动物中的7只所必需的100倍的HIV剂量(图11)。
该实施例显示,可使用本文公开的重组AAV病毒提供抗HIV感染的有效的且强大的免疫预防。
实施例8
b12抗-HIV抗体的表达
图12A是显示b12随时间推移的表达作为通过由取自AAV施用后的血清样品上的总的人IgGELISA确定的剂量的函数的绘图(n=8)。接受表达荧光素酶的载体的小鼠没有呈现可检测的人抗体(n=12)。图12B显示在攻击之前1天、人PBMC的过继转移后3周和由gp120特异性的ELISA测量能够结合HIV的抗体的部分确定的AAV的指示剂量的肌内注射后15周,血清中b12的浓度(n=8-12)。图12C显示HuPBMC-NSG人源化的小鼠中的CD4细胞消耗作为用10ng的NL4-3静脉攻击进入表达显示保护免受感染必要的抗体的最小剂量的一系列b12的动物的结果。图12A和C显示平均值和标准误差,绘图b显示个体动物和平均值(n=8-12)。
实施例9
b12和VRC01抗体在抗-HIV保护中的比较
在该实施例中,将b12抗体与被发现体外中和超过90%的循环的HIV毒株的抗-HIV抗体即VRC01抗体比较。将表达b12或VRC01的载体的渐减的剂量施用至NSG小鼠,并监测抗体随时间推移的表达。
关于两个抗体,在被分析的所有时间点都观察到剂量依赖性的表达(图12A和图13A)。用huPBMC过继植入以不同水平表达荧光素酶或抗体的小鼠。仅仅在攻击之前,gp120特异性的酶联免疫吸附测定(ELISA)确认每一个组中的有效抗体浓度(图12B和图13B)。在10ng的HIV的静脉攻击之后,监测CD4细胞以确定抗体浓度的影响。34μgml-1的平均b12浓度和8.3μgml-1的VRC01浓度保护小鼠免受感染(图12C和图13C)。表达b12和VRC01的较低浓度的组部分地被保护,一些动物显示无可检测的CD4细胞的丢失,其他呈现推迟的CD4细胞消耗。
实施例10
保护免受流感感染
在该实施例中,将本文公开的AAV载体用于产生表达抗-流感抗体的重组AAV病毒,并发现重组AAV病毒在保护小鼠免受流感病毒感染方面是有效的。
实验材料与方法
流感病毒产生和定量
在该实施例中用于小鼠感染的所有流感病毒从A/PuertoRico/8/1934(H1N1)毒株获得它们的6个内部基因(PB2、PB1、PA、NP、M、和NS)。HA和NA基因源自下面3株毒株并给出以下的名称缩写:
(1)PR8:源自广泛使用的实验室适应的毒株A/PuertoRico/8/1934(H1N1)的HA和NA。
(2)CA/09:源自在2009年猪源H1N1流感在人中出现大流行期间早期分离的毒株A/California/07/2009(H1N1)的HA和NA。
(3)SI/06:源自人类季节性H1N1疫苗毒株A/SolomonIslands/3/2006(H1N1)的HA和NA。
使用8质粒双向反向遗传学系统产生流感病毒。简要地,在补充10%胎牛血清(OmegaScientific)、100IU/mL的青霉素(Mediatech)、100μg/mL链霉素(Mediatech)、和1%的L-谷氨酰胺(Mediatech)的DMEM(Mediatech)中维持293T和MDCK细胞。用250ng的8种质粒的每一种共转染包含293T和MDCK细胞的共培养物的6孔组织培养皿(Corning)。在转染后14小时,吸出培养基,用PBS将细胞洗涤1次,并将加上3μg/mL的TPCK-处理的胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)的流感生长培养基添加至细胞。流感生长培养基由具有0.01%的胎牛血清、0.3%的牛血清白蛋白(Invitrogen)、100IU/mL的青霉素、100μg/mL链霉素、和100μg/mL氯化钙的Opti-MEMI(Invitrogen)组成。72小时后,收集上清液并传代至包含加上3μg/mL胰蛋白酶的流感生长培养基中几乎汇合的MDCK细胞的15cm的皿(Corning)。72小时后,收获病毒上清液并在2,000xg离心5分钟。将病毒上清液移出并等分,并将等分部分在-80℃冷冻。
噬菌斑测定
使用Avicel微晶纤维素覆盖通过对MDCK细胞的噬菌斑测定定量流感病毒。简要地,将MDCK细胞接种进入6孔组织培养皿。当细胞是95%汇合时,将培养基移出并将病毒接种物的连续10倍稀释物添加至1ml流感生长培养基的终体积。40分钟后,通过抽吸将接种物移出并由4ml具有2.4%的Avicel微晶纤维素和3μg/ml的TPCK-处理的胰蛋白酶的流感生长培养基替代。平板在37℃静置生长3天。随后通过抽吸将覆盖移出,用PBS将细胞层冲洗2次,并将细胞用20%乙醇中的0.1%的结晶紫染色15分钟。随后通过抽吸将染色溶液移出,再次用PBS冲洗细胞,并将噬菌斑目视地计数以确定根据噬菌斑形成单位(PFU)的病毒滴度。
小鼠品系
从JacksonLaboratory(JAX)获得约4-5周大的免疫活性BALB/cJ(BALB/c)和免疫缺陷NOD/SCID/γ-/-(NSG)小鼠。对于包括年老的小鼠的实验,在流感攻击之前将这些动物饲养并安置在屏障(barrier)条件下一段时间。
将流感中和抗体克隆进入AAV载体
合成对应于不同流感抗体的重链和轻链可变区的序列(IntegratedDNATechnologies)并克隆进入包含IgG1恒定区骨架的AAV转移载体中。在某些情况下,优化抗体基因以改善抗体的体内生产。
AAV生产并施用至小鼠
根据下面描述的过程执行AAV生产和肌内注射。简要地,用80μg编码感兴趣的抗体的载体、pHELP(AppliedViromics)、和pAAV2/8SEED(UniversityofPennsylvaniaVectorCore)以0.25:1:2的比例转染1.2×108293T细胞。随120小时过程的推移,收集上清液5次。通过PEG沉淀和氯化铯分级纯化病毒,随后渗滤、浓缩、和通过100kMWCO的离心过滤器(Millipore)缓冲液交换进入由100mM柠檬酸钠和10mMTrispH8组成的缓冲液中,随后等分并储存在-80℃。为了定量等分部分,解冻病毒,用DNAse处理,并如之前描述的(13)通过qPCR测定滴度。简要地,使用从先前测定滴度的、纯化的、编码4E10抗体的AAV2/8产生的标准曲线,通过定量PCR确定病毒滴度。病毒等分部分的感染性通过转导293T细胞并通过ELISA定量细胞悬浮液中的抗体浓度体外确定。
小鼠AAV转导和基因表达的定量
在肌内注射之前,解冻重组AAV病毒并用缓冲液(100mM柠檬酸钠、10mM的TrispH8)在40μL体积中稀释至指示的剂量。通过异氟烷吸入麻醉小鼠,并将病毒施用作为40uL的单一注射进入腓肠肌。
基本上如先前描述的并带有以下修改,使用IVIS200仪器执行生物发光成像:在腹膜内注射1.5mg的D-荧光素(GoldBiotechnology)后10分钟拍摄生物发光图像。使用从纯化的人IgG/Kappa(Bethyl)产生的标准曲线通过执行ELISA确定小鼠血清中人IgG的浓度。
用流感攻击小鼠
解冻流感病毒并在PBS中稀释以在20μL体积中递送指示的剂量。在接种之前,称重并通过腹膜内注射200μL的包含在PBS中被稀释的2mg氯胺酮和0.2mg甲苯噻嗪的混合物麻醉小鼠。通过用20μL的稀释的病毒、10μL每个鼻孔的鼻内接种用流感攻击小鼠。被感染的小鼠在每一天的相同时间被称重。
GFP流感病毒生产和定量
根据在Bloom等人Science328:1272(2010)中描述的方法产生PB1flank-GFP流感病毒,其中GFP被包装在PB1区段中。如Bloom等人描述的,PB1flank-GFP病毒在反式(intrans)供给缺失的PB1蛋白的293T-CMV-PB1和MDCK-SIAT1-CMV-PB1细胞中生长并测定。使用8质粒双向反向遗传学系统产生PB1flank-GFP病毒,但用pHH-PB1flank-eGFP替代标准的PB1质粒。关于这些病毒,另外的5个内部基因(PB2、PA、NP、M、和NS)源自PR8毒株,如在小鼠感染中使用的病毒。除了具有来自PR8、CA/09、和SI/06的HA和NA的病毒,两个另外的病毒被用于这些测定:
(1)JP/57:源自来自亚洲流感大流行的早期毒株A/Japan/305/1957(H2N2)的HA和NA。
(2)Viet/04:来自高致病性禽流感毒株A/Vietnam/1203/2004(H5N1)的HA。该病毒的NA源自实验室适应的A/WSN/1933(H1N1)毒株。将多碱基裂解位点从HA去除。
通过流式细胞术定量PB1flank-GFP病毒。以每孔1ml流感生长培养基中105个细胞将MDCK-SIAT1-CMV-PB1细胞接种到12孔的皿(Corning)中。接种后8小时,在培养基中将病毒1:10、1:100、和1:1000稀释。用50μL的这些稀释液的每一种感染孔。感染后16.5h通过与250uL的胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)一起孵育5分钟来收获细胞,通过抽吸去除胰蛋白酶,并重悬在250μL的补充2%胎牛血清和2μg/mL碘化丙啶(Invitrogen)的PBS中。将样品在FACSCalibur流式细胞仪(Beckton-Dickinson)上分析,并将具有GFP阳性细胞的百分比在0.3-3%之间的样品用于定量病毒滴度。从GFP阳性细胞的百分比、稀释因子、和每个孔105个细胞的总的计数计算滴度。
中和测定
使用PB1flank-GFP流感病毒和MDCK-SIAT1-CMV-PB1细胞执行中和测定。将40μL的流感生长培养基添加至平底96孔组织培养皿(Corning)的所有孔中,除了接受57μL培养基的A行。通过添加3μL的血清至A行中的57μL的流感生长培养基连续稀释小鼠血清样品,随后执行1:3连续稀释直到G行,导致起始稀释为1:20且最终稀释为1:4.374×104。将PB1flank-GFP病毒的2×104感染性颗粒(由通过流式细胞术测定滴度所确定的)添加至20μL体积的流感生长培养基中的样品。将被稀释的血清和病毒的混合物于37℃在5%CO2培养箱中孵育1h。孵育之后,将20μL体积的流感生长培养基中的2×104的MDCK-SIAT1-CMV-PB1细胞添加至所有孔中,MOI为1。对每一种病毒包括:只有细胞的对照,其接受天然的BALB/c小鼠血清并不接受病毒,和病毒对照,其接受天然的BALB/c小鼠血清。将平板于37℃在5%CO2培养箱中孵育18小时。孵育后,将40μL的PBS中的1.5%TritonX-100(Sigma-Aldrich)添加至每个孔以给出0.5%TritonX-100的终浓度,并将平板在室温孵育5分钟。将100μL的每一个样品转移入不透明的96孔平板(Corning)中用于读取。使用被配置从顶部读取的具有485nm的激发、515nm的发射、激发和发射的缝宽均为12nm、增益设置为“最佳”、500μs的积分时间、及每个孔5次读取的Safire2平板读取器(Tecan)定量GFP荧光。从所有的读数减去来自只有细胞的对照的基线荧光。将样品归一化至病毒对照。
组织学
在体内攻击实验结束时,将肺从小鼠中移出并将该组织的一半浸入10%中性缓冲福尔马林中24小时。固定之后,将组织从福尔马林中移出并放置在70%乙醇中直至标准的石蜡包埋和处理。随后取4微米厚的切片,并执行苏木精-伊红染色(H&E)染色。由病理学家(D.S.R.)在OlympusBX51光学显微镜上检查载玻片并使用SPOTInsightDigitalCamera(DiagnosticInstruments)获得图像。炎症按以下评分:0=无至最小炎症;1=细支气管中的偶尔浸润(少于10%的细支气管);2=容易被鉴定的细支气管中的浸润(10-50%的细支气管);3=容易被鉴定的具有实质浸润的和/或早期片状纤维化的细支气管中的浸润;4=>50%的具有浸润的细支气管、或10-50%的细支气管涉及具有细支气管中广泛坏死的上皮、血管坏死、或广泛纤维化。以盲式进行评分并对任何统计检验假定顺序尺度。
通过RT-qPCR的相对病毒定量
将肺组织在100μL的PBS中匀质化。将25μL的匀浆用于通过TRIzol试剂(Invitrogen)提取RNA。将纯化的RNA重悬在无核酸酶的水中,并将RNA浓度标准化为150ng/μL。使用qScriptOne-StepSYBRGreenqRT-PCRKit,Rox(QuantaBiosciences)和针对PR8M和由小鼠核糖体蛋白L32组成的内源对照设计的引物执行实时RT-qPCR。正向-M:CAAGCAGCAGAGGCCATGGA(SEQIDNO:36),反向-M:GACCAGCACTGGAGCTAGGA(SEQIDNO:37),正向-L32:AAGCGAAACTGGCGGAAAC(SEQIDNO:38),反向-L32:TAACCGATGTTGGGCATCAG(SEQIDNO:39)。使用TurboDNAse试剂盒(Invitrogen)将样品用DNAse处理并在ABI7300实时PCRSystem(LifeTechnologies)上以以下的程序一式三份运行:50℃持续10分钟、95℃持续5分钟、95℃持续15秒的40个循环和55℃持续30秒,之后为溶解曲线分析。通过L32信号将每一个样品单独地归一化以解释输入RNA中的变化。
抗-流感抗体的体内表达
产生了表达未被修饰的全长F10或CR6261抗-流感抗体的重组AAV病毒。将1×1011基因组拷贝(GC)的重组AAV病毒的单一肌内注射施用于Balb/c小鼠的腓肠肌中。每周获取血清样品并通过ELISA定量人IgG(图14)。观察到b12抗体超过100μg/mL的显著表达。相比之下,F10和CR6261抗体在一周时都显示约1μg/mL的表达,在随后的时间点变得不可检测,随后在7周时缓慢上升至几微克每mL。
为了改善F10和CR6251抗体的体内表达,构建了嵌合抗体,其中用b12的轻链代替F10和CR6251抗体的每一种的轻链。在293T细胞转染之后,当与b12轻链配对时观察到两种抗体的实质上较高的表达,显示非天然的轻链改善了抗体表达(图15A)。为了改善天然的轻链的表达,创建了一组包含源自b12或4E10抗体的轻链的5’端和3’端接合序列的被修饰的轻链可变区。所用的被修饰的轻链可变区在图15B中列出。在293T细胞转染后,包含来自b12和4E10的序列的F10LO24轻链呈现多达12倍更高的体外表达(图15C])。同样地,包含具有来自b12抗体的序列的CR6261LO13轻链的构建体转染,呈现多达20倍更高的体外表达(图15D)。使用体外中和测定检测这些被修饰的抗体,且结果证实包含被修饰的轻链的抗体保持了它们中和流感的两条链的能力。鉴于对被修饰的轻链观察到的本质上改善的抗体表达,用F10LO24和CR6261LO13被修饰的序列实施所有后续实验并分别被称为F10和CR6261。在SEQIDNO:40-43中提供了所用的完整的可变区序列,包括嵌合轻链可变区。
如图16A中显示的,1x1011基因组拷贝(GC)的AAV的单一肌内注射进入BALB/c小鼠中在注射的一周内产生可检测的抗体。抗体的浓度短暂下降,随后在跨随后的6-8周增加,达到50-200μg/mL之间的稳定水平,在40周研究期间保持。
体外中和测定
为了确定来自用重组AAV病毒处理的动物的血清的中和潜力的宽度,使用包含来自3个不同的HA亚型(H1、H2、和H5)的5个不同的血凝素的GFP报告流感病毒粒子执行体外中和测定。如图16B中显示的,来自表达阴性对照抗体(b12,抗HIV抗体)的小鼠的血清没有显示对任何5株被检测的毒株的可观的中和。相比之下,来自接受表达F10或CR6261的重组AAV病毒的动物的血清显示中和所有5株毒株的显著的能力。
体内保护
为了确定重组AAV病毒保护小鼠免受流感感染的能力,将重组病毒施用至动物并允许抗体表达5周。仅仅在流感攻击之前,在小鼠的循环中观察到约100-200μg/mL的b12和F10抗体和从0.1μg/mL至100μg/mL的范围的CR6261浓度的宽范围(图17A)。在CA/09毒株的鼻内给药之后,在表达对照b12抗体的动物中观察到急剧下降的体重,但在表达F10抗体的小鼠中没有可观的下降(图17B)。表达CR6261的小鼠显示与血清IgG浓度成反比的一定范围的体重下降,表明需要约7.5μg/mL的该抗体的最小血清浓度以预防免受CA/09感染的疾病。
为了检查VIP针对其他毒株的体内保护的能力,用SI/06毒株攻击表达b12对照或F10抗体的动物(图17C)。表达对照抗体的小鼠呈现跨两周的时间的体重下降。相比之下,表达F10的小鼠在SI/06攻击之后不显示疾病的征象。
为了确定VIP保护动物免受致死的流感攻击的能力,将1000PFU的小鼠致死的PR/8毒株鼻内施用至动物。表达b12对照的小鼠经历了急剧的体重下降并在4天内达到我们的研究的终点(图17D-E)。相比之下,表达F10的小鼠没有显示显著的疾病征象或体重下降,说明用重组AAV病毒处理的动物被保护抗至少3株不同的流感毒株。
为了确定CA/09和SI/06攻击对被流感攻击的小鼠的内源免疫应答的影响,使用中和测定分析了来自此类动物的血清样品。来自先前被攻击的表达对照b12抗体的小鼠的血清显示强的抗攻击毒株的中和活性,但没有抗异源毒株的可检测的活性(图17F-G)。相比之下,用重组AAV病毒处理的表达F10或CR6261的小鼠继续显示抗所有被检测的毒株的广泛的血清中和活性。同样,尽管抗PR8、VN/04和JP/57的血清中和活性没有被CA/09或SI/06攻击差异影响,在用重组AAV病毒处理的小鼠中观察到针对攻击毒株的增强的血清中和活性(比较图17F和17G)。这些结果表明,广泛中和抗体的表达保护抗疾病,但是仍然允许另外的、甚至更有效的、内源体液免疫的形成。
该实施例显示,可使用本文公开的重组AAV病毒提供针对多种流感病毒造成的感染的有效的免疫预防。
实施例11
保护年老的且免疫功能低下的动物免受流感感染
产生表达来自F10和CR6261广泛中和流感抗体的可变区的重组AAV病毒。
免疫缺陷的NOD/SCID/γ-/-(NSG)小鼠是完全缺少适应性免疫并呈现明显受损的先天免疫应答的小鼠。将表达F10和CR6261抗体的重组AAV病毒以5×1012GC每kg的标准化的剂量施用至相对年幼的(14-19周大)或高龄(46-55周大)的NSG动物。使用Xenogen成像或ELISA定量超过4周的基因表达(分别为图18A和18B)。两个动物组在所有时间点都显示非常相似的基因表达水平,表明年龄没有影响基于肌肉的来自AAV的基因表达的能力。为了确定体内抗体表达是否足够保护这些免疫功能低下的动物免受流感攻击,将1000PFU的致死的PR8毒株施用至年幼的和年老组的小鼠(分别为图18C和18D)。
在两种情况下,在表达荧光素酶的对照小鼠中观察到疾病和体重下降,其导致所有此类动物在研究过程的死亡。相比之下,表达F10的年幼的和年老的NSG动物完全被保护免受流感引起的体重下降,表明单独的F10抗体的这些浓度在不存在内源免疫应答时是足够保护小鼠的。为了进一步表征F10能够在NSG小鼠中预防疾病的程度,在整个研究期间处死动物并评分肺组织的组织学样品中的炎症水平。表达荧光素酶的被感染的小鼠显示感染后5天的大量的细支气管腔浸润(图18E左)。相比之下,被F10保护的动物显示非常低水平的炎症及与这些小鼠中本质上较低水平的病理学一致的清晰的细支气管(图18E右)。组织学样品中肺炎症随时间推移的评分显示动物在早期时间点呈现最严重的炎症(图18F)。与荧光素酶对照小鼠相比,表达F10抗体的小鼠在被分析的所有时间点都呈现显著较少的炎症。
为了直接定量重组AAV病毒控制病毒复制的能力,通过从处死时获得的肺组织中提取总RNA并通过定量RT-PCR测量病毒RNA,我们确定NSG小鼠中病毒的量。如图18G中显示的,来自表达荧光素酶的小鼠的肺在整个实验过程中呈现高病毒载量。相比之下,在早期时间点被分析的表达F10的动物包含中等水平的随时间推移大幅度下降的病毒RNA,作为在F10抗体存在时急剧减少的病毒复制的结果,尽管缺少内源适应性免疫。
实施例12
保护骨肝胸腺(BLT)人源化的小鼠免受HIV感染
骨肝胸腺(BLT)人源化的小鼠模型是用于预防阴道内HIV感染的充分建立的模型。通过胚胎组织的手术植入免疫缺陷的NOD/SCID/γC(NSG)接受者、之后通过造血干细胞的移植产生BLT人源化小鼠。这些被移植的细胞在小鼠中产生被训练的能够在HIV感染之后产生功能性免疫应答的免疫细胞的完整的所有组成成分。已发现BLT模型呈现粘膜组织包括阴道和结肠的显著的人细胞移植,并已显示在粘膜暴露于浓缩的CCR5-tropicJR-CSFHIV病毒之后支持HIV的传播。在这个实施例中,将BLT小鼠用于检测表达抗-HIV抗体的重组AAV病毒以预防HIV通过粘膜途径传播的能力。
根据本文公开的方法产生表达VRC01抗-HIV抗体或荧光素酶蛋白的重组AAV病毒。为了检测VRC01抗体预防HIV在粘膜表面传播的效力,产生了一组BLT动物并将表达VRC01的重组AAV病毒施用至BLT小鼠以产生以100μg/mL的血清浓度表达VRC01中和抗体或荧光素酶蛋白作为阴性对照的动物。
为了模拟人粘膜HIV传播的相对少见的性质,采用了未浓缩的JR-CSFHIV病毒的每周非腐蚀性阴道施用的低剂量重复攻击方案。HIV攻击方案的示意图展示在图19A中显示。在14周的期间中,将小鼠放血并随后用50ngJR-CSFHIV病毒的p24通过接种物的非腐蚀性的阴道内施用每周攻击。使用流式细胞术每周测量CD4细胞水平(图19B)。如在图17B中显示的,相对于产生VCR01的动物,在表达荧光素酶的动物中具有中度的但统计显著的下降的CD4+细胞水平。13周的重复阴道HIV攻击之后,通过AbbottRealTimeHIV-1ViralLoadqPCR测定(该测定的检测限是200拷贝/mL)测量了在处死时的HIV血清病毒载量。结果在图19C中显示,其显示当表达荧光素酶的所有动物变为被感染时,只有表达VRC01的8只小鼠中的2只显示病毒复制的显著证据。这些结果显示,表达抗-HIV抗体的重组AAV病毒能够预防BLT小鼠中的粘膜HIV传播。
实施例13
FVB小鼠中丙型肝炎病毒(HCV)抗体的生产
该实施例阐述,重组AAV病毒能够被用于体内生产高水平的HCV抗体。
构建了包括B12、AR3A和AR3B抗体的编码序列的AAV载体。将AAV载体分别用于生产表达B12、AR3A和AR3B抗体的重组AAV病毒。将重组AAV病毒施用至FVB小鼠。每周测量动物血清中相应抗体的表达水平。将结果显示在图20中。如在图20中显示的,在动物中已经产生显著水平的HCV抗体。
实施例14
HIV感染的预防
该实施例阐述处于形成HIV感染风险的患者的免疫预防。
使用包括编码抗-HIV中和抗体的多核苷酸的AAV转移载体产生重组AAV。可使用任何已知的抗-HIV中和抗体,包括但不限于,b12抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、2F5抗-HIV抗体、和其任何变体。例如,可使用具有CASI启动子、抗-HIV中和抗体的编码序列、WPRE和SV40poly(A)序列的AAV转移载体。此类AAV转移载体的示例包括在SEQIDNO:17-21和24中提供的载体。一名患者被鉴定为处于形成HIV感染的风险并被施用有效量的重组AAV。通过肌内注射将重组AAV施用于患者。重组AAV在患者中表达抗-HIV抗体,因此减少患者形成HIV注射的风险。在患者被施用重组AAV之后的不同的时间点,可确定患者中的HIV病毒载量。可由技术人员基于一些因素包括,但不限于,施用的途径和患者HIV暴露的程度容易确定合适的剂量(即,抗-HIV抗体的表达水平)和治疗方案。通过观察与没有接受AAV治疗的患者相比降低HIV感染风险评价免疫预防的效力。
实施例15
结肠癌的治疗
该实施例阐述遭受或处于形成结肠癌风险的患者的治疗。
使用包括编码IMC-C225抗体(CetuximabTM,表皮生长因子受体(EGFR)抗体)的多核苷酸的AAV转移载体产生重组AAV。例如,可将IMC-C225抗体的编码序列插入具有CASI启动子、WPRE和SV40poly(A)序列的AAV转移载体中。鉴定了正遭受或处于形成结肠癌的风险的患者并施用有效量的重组AAV。通过肌内注射将重组AAV施用至患者。重组AAV在患者中表达IMC-C225抗体,因此抑制癌症在患者中的发展。可由技术人员基于一些因素包括,但不限于,施用的途径和患者的疾病状态容易确定合适的剂量(即,IMC-C225抗体的表达水平)和治疗方案。通过观察疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或减轻、和缓解来评价疗效。
实施例16
HCV感染的预防
该实施例阐述处于形成HCV感染风险的患者的免疫预防。
使用包括编码抗-HCV中和抗体的多核苷酸的AAV转移载体产生重组AAV。可使用任何已知的抗-HCV中和抗体,包括但不限于,AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、AR4A抗-HCV抗体、和其任何变体。例如,可使用具有CASI启动子、抗-HCV中和抗体的编码序列、WPRE和SV40poly(A)序列的AAV转移载体。此类AAV转移载体的示例包括在SEQIDNO:22、23和28中提供的载体。
患者被鉴定为处于形成HCV感染的风险并被施用有效量的重组AAV。通过肌内注射将重组AAV施用于患者。重组AAV在患者中表达AR3A抗体,因此减少患者形成HCV注射的风险。可由技术人员基于一些因素包括,但不限于,施用的途径和患者HCV暴露的程度容易确定合适的剂量(即,抗-HCV抗体的表达水平)和治疗方案。在患者被施用重组AAV之后的不同的时间点,可确定患者中的HCV病毒载量。通过观察与没有接受AAV治疗的患者相比降低HCV感染风险来评价免疫预防的效力。
实施例17
流感病毒感染的预防
该实施例阐述处于形成流感病毒感染风险的患者的免疫预防。
使用包括编码抗-流感中和抗体的多核苷酸的AAV转移载体产生重组AAV。可使用任何已知的抗-流感中和抗体,包括但不限于,F10抗-流感抗体、CR6261抗-流感抗体、FI6抗-流感抗体、TCN32抗-流感抗体、和其任何变体。例如,可使用具有CASI启动子、抗-流感中和抗体的编码序列、WPRE和SV40poly(A)序列的AAV转移载体。此类AAV转移载体的示例包括在SEQIDNO:25-27、29和30中提供的载体。
患者被鉴定为处于形成流感感染的风险并被施用有效量的重组AAV。通过肌内注射将重组AAV施用于患者。重组AAV在患者中表达F10抗体,因此减少患者形成流感病毒注射的风险。可由技术人员基于一些因素包括,但不限于,施用的途径和患者的流感病毒暴露的程度容易确定合适的剂量(即,抗-流感中和抗体的表达水平)和治疗方案。在患者被施用重组AAV之后的不同的时间点,可确定患者中的流感病毒载量。通过观察与没有接受AAV治疗的患者相比降低流感感染风险来评价免疫预防的效力。
在至少一些先前描述的实施方案中,一个实施方案中使用的一个或多个元素可互换地在另一个实施方案中被使用,除非此替换不是技术上可行的。将被本领域技术人员领会的是,可对以上描述的方法和结构进行多种其他的删减、添加与修改,而不偏离请求保护的主题的范围。所有的此类修改和改变旨在落入主题的范围内,如由所附权利要求书限定的。
关于本文使用的基本上任何复数和/或单数术语,本领域技术人员可从复数理解为单数和/或从单数理解为复数,只要对上下文和/或申请是合适的。为清楚起见,可在本文清楚阐述多种单数/复数排列。
将被本领域人员理解的是,一般而言,本文、及尤其是在所附权利要求书中使用的术语(例如,所附权利要求书的主体部分)通常预期作为“开放”术语(例如,术语“包括(including)”应该被解读为“包括(including)但不限于”、术语“具有”应该被解读为“具有至少”、术语“包括(includes)”应该被解读为“包括(includes)但不限于”、等)。还将被本领域人员理解的是,如果意在引入的权利要求列举(recitation)的特定的数量,这样的意图将在权利要求中清楚地列举,且不存在此列举时无此意图存在。例如,作为帮助理解,以下所附权利要求书可包含引导的短语“至少一个”和“一个或多个”的使用以引入权利要求的列举。然而,此类短语的使用不应被解释为暗示由不定冠词“一个(a)”或“一个(an)”引入的权利要求列举将包含此引入的权利要求列举的任何特定权利要求限制到只包含一个此列举的实施方案,即使是当相同的权利要求包括引导的短语“一个或多个”或“至少一个”和不定冠词诸如“一个(a)”或“一个(an)”(例如,“一个(a)”和/或“一个(an)”应该被解释为意味着“至少一个”或“一个或多个”);同样适用于使用定冠词引入权利要求列举。另外,即使将特定数量的被引入的权利要求列举清楚地列举,本领域技术人员将认识到,此陈述应被解读为意味着至少的列举数量(例如,仅仅“两个列举”的列举,没有其他修饰的情况下,意味着至少两个列举、或两个或多个列举)。此外,在使用的类似于“至少一个A、B、和C,等”惯例的那些情况下,一般而言,此结构意在从本领域技术人员将理解该惯例的意义上讲(例如,“具有至少一个A、B、和C的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、和/或A、B、和C一起的系统,等)。在使用了类似于“至少一个A、B、或C,等”惯例的那些情况下,一般而言,此结构意在从本领域技术人员将理解该惯例的意义上讲(例如,“具有至少一个A、B、或C的系统”将包括但不限于具有单独的A、单独的B、单独的C、A和B一起、A和C一起、B和C一起、和/或A、B、和C一起的系统,等)。将被本领域人员进一步理解的是,几乎任何代表两个或多个可选的术语的转折性词语和/或短语,不论在说明书、权利要求书、或附图中,应被理解为涉及包括一个术语、术语之一、和两个术语的可能性。例如,短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或“A和B”的可能性。
另外,当按照马库什组描述本公开内容的特征或方面时,本领域技术人员将认识到该公开内容还因此根据马库什组的任何单独的成员或成员亚组被描述。
将被本领域技术人员理解的是,为了任何和所有目的,诸如根据提供书面说明,本文公开的所有范围还包含任何和所有可能的子范围和其子范围的组合。可将任何所列的范围容易认识作为充分描述并使得相同的范围能够被分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一、等。作为非限制性的示例,可将本文讨论的每一个范围容易分解为下部三分之一、中间三分之一和上部三分之一、等。如将被本领域技术人员理解的是,所有语言诸如“至多”、“至少”、“大于”、“少于”、和类似的包括列举的数量并指的是能够如以上讨论的被随后分解为子范围的范围。最后,如将被本领域技术人员理解的是,范围包括每一个单独的成员。因此,例如,具有1-3个物品的组指的是具有1个、2个或3个物品的组。相似地,具有1-5个物品的组指的是具有1个、2个、3个、4个、或5个物品的组,等等。
尽管本文已公开了不同的方面和实施方案,其他方面和实施方案将对本领域技术人员是明显的。本文公开的不同的方面和实施方案是为了阐述的目的且不意图限制,真实的范围和精神由下面的权利要求书指示。
Claims (52)
1.一种病毒载体,包括:
腺相关病毒(AAV)的5’末端反向重复序列(ITR)和3’AAVITR;
合成的启动子,其中所述合成的启动子是SEQIDNO:1的核苷酸序列;
所述合成的启动子下游的限制性酶切位点以允许编码一个或多个感兴趣的蛋白的多核苷酸的插入,和
所述限制性酶切位点下游的转录后调节元件,
其中所述合成的启动子、所述限制性酶切位点和所述转录后调节元件位于所述5’AAVITR的下游和所述3’AAVITR的上游。
2.根据权利要求1所述的病毒载体,还包括插入在所述限制性酶切位点并与所述合成的启动子可操作地连接的多核苷酸,其中所述多核苷酸包括感兴趣的蛋白的编码区。
3.根据权利要求2所述的病毒载体,其中所述多核苷酸包括所述感兴趣的蛋白的所述编码区的直接上游的信号肽序列。
4.根据权利要求3所述的病毒载体,其中所述信号肽选自由以下组成的组:干扰素的信号肽、人生长激素的信号肽、红细胞生成素(EPO)的信号肽、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的信号肽、胰岛素的信号肽、和其任何组合。
5.根据权利要求1所述的病毒载体,其中所述病毒载体包括与Kozak共有序列具有至少70%、至少80%、至少90%序列同一性或更多的序列同一性的核苷酸序列。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的病毒载体,其中所述感兴趣的蛋白选自由以下组成的组:全长抗体、生长激素(GH)、胰岛素样生长因子(IGF)、G-CSF、红细胞生成素(EPO)、胰岛素、抗体Fab片段、抗体scFV片段、血友病相关的凝血蛋白、抗肌萎缩蛋白、溶酶体酸性脂肪酶、苯丙氨酸羟化酶(PAH)、和糖原贮积病相关的酶。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的病毒载体,其中所述感兴趣的蛋白是病毒的中和抗体。
8.根据权利要求7所述的病毒载体,其中所述病毒的中和抗体是人类免疫缺陷病毒(HIV)、丙型肝炎病毒(HCV)、或流感病毒的中和抗体。
9.根据权利要求8所述的病毒载体,其中所述HIV的中和抗体选自由以下组成的组:b12抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、和2F5抗-HIV抗体。
10.根据权利要求8所述的病毒载体,其中所述HCV的中和抗体选自由以下组成的组:AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、和AR4A抗-HCV抗体。
11.根据权利要求1-5中任一项所述的病毒载体,其中所述感兴趣的蛋白是疟疾的中和抗体。
12.根据权利要求1-5中任一项所述的病毒载体,其中所述转录后调节元件是病毒转录后调节元件。
13.根据权利要求12所述的病毒载体,其中所述病毒转录后调节元件是土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、乙型肝炎病毒转录后调节元件(HBVPRE)、或RNA转运元件(RTE)。
14.根据权利要求1-5中任一项所述的病毒载体,还包括所述转录后调节元件下游的转录终止区。
15.根据权利要求14所述的病毒载体,所述转录终止区包括SV40晚期poly(A)序列、兔β-珠蛋白poly(A)序列、或牛生长激素poly(A)序列。
16.根据权利要求2所述的病毒载体,其中所述多核苷酸包括免疫球蛋白的重链可变区的第一编码区和所述免疫球蛋白的轻链可变区的第二编码区。
17.根据权利要求16所述的病毒载体,其中所述第一编码区和所述第二编码区被2A序列分开。
18.根据权利要求17所述的病毒载体,其中所述2A序列是F2A序列。
19.根据权利要求16-18中任一项所述的病毒载体,其中将所述第一编码区的5’与第一信号肽序列融合并将所述第二编码区的5’与第二信号肽序列融合。
20.根据权利要求19所述的病毒载体,其中所述第一信号肽序列和所述第二信号肽序列是不同的。
21.根据权利要求1-5、16、17或18中任一项所述的病毒载体,其中起始于所述5’AAVITR并终止于所述3’AAVITR的区是至少2.5kb。
22.包括合成的启动子和在受试对象中编码感兴趣的蛋白的核苷酸序列的重组腺相关病毒(AAV)在制备用于在所述受试对象体内产生所述感兴趣的蛋白的药剂中的用途,其中所述合成的启动子是SEQIDNO:1的核苷酸序列且所述编码感兴趣的蛋白的核苷酸序列是至少1.4kb。
23.根据权利要求22所述的用途,其中所述感兴趣的蛋白是抗体。
24.根据权利要求23所述的用途,其中所述抗体是全长抗体。
25.根据权利要求23所述的用途,其中所述抗体选自由以下组成的组:b12抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、2F5抗-HIV抗体、AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、AR4A抗-HCV抗体、和抗-疟疾抗体。
26.根据权利要求22-25中任一项所述的用途,其中所述感兴趣的蛋白在所述受试对象的血清中以至少9μg/ml的量表达。
27.根据权利要求22-25中任一项所述的用途,其中所述感兴趣的蛋白在所述受试对象的血清中以至少100μg/ml的量表达。
28.根据权利要求22-25中任一项所述的用途,其中所述感兴趣的蛋白在所述受试对象的血清中以至少500μg/ml的量表达。
29.根据权利要求22-25中任一项所述的用途,其中所述重组AAV通过以下步骤产生:
提供具有病毒载体、用于产生生产性AAV感染的辅助功能、和AAVcap基因的包装细胞系,其中所述病毒载体包括5’AAV末端反向重复序列(ITR)、3’AAVITR和编码所述感兴趣的蛋白的核苷酸序列;和
从所述包装细胞系的上清液中回收重组AAV病毒。
30.根据权利要求29所述的用途,其中所述病毒载体是权利要求1-21中任一项所述的病毒载体。
31.重组腺相关病毒(AAV)在制备用于减少或抑制受试对象中病毒感染风险的药剂中的用途,其中所述AAV包括编码所述病毒的中和抗体的核苷酸序列和合成的启动子,所述合成的启动子是SEQIDNO:1的核苷酸序列。
32.第一重组腺相关病毒(AAV)和第二重组AAV在制备用于减少或抑制受试对象中病毒感染风险的药剂中的用途,其中所述第一重组AAV包括第一合成的启动子和编码所述病毒的中和抗体的核苷酸序列,所述第一合成的启动子是SEQIDNO:1的核苷酸序列,且其中所述第二重组AAV包括第二合成的启动子和编码所述病毒的第二中和抗体的核苷酸序列,所述第二合成的启动子是SEQIDNO:1的核苷酸序列。
33.根据权利要求32所述的用途,其中所述受试对象是哺乳动物。
34.根据权利要求32所述的用途,其中所述受试对象是人。
35.根据权利要求32所述的用途,其中所述中和抗体是全长抗体。
36.根据权利要求32所述的用途,其中与没有用所述重组AAV处理的所述受试对象相比,所述药剂减少所述受试对象中的感染风险至少5倍。
37.根据权利要求36所述的用途,其中与没有用所述重组AAV处理的所述受试对象相比,所述药剂减少所述受试对象中的感染风险至少20倍。
38.根据权利要求32-37中任一项所述的用途,其中所述药剂抑制所述受试对象中的病毒感染。
39.根据权利要求32-37中任一项所述的用途,其中所述中和抗体在所述受试对象的血清中以至少9μg/ml的量表达。
40.根据权利要求32-37中任一项所述的用途,其中所述中和抗体在所述受试对象的血清中以至少100μg/ml的量表达。
41.根据权利要求32-37中任一项所述的用途,其中所述中和抗体在所述受试对象的血清中以至少500μg/ml的量表达。
42.根据权利要求32-37中任一项所述的用途,其中所述病毒是人类免疫缺陷病毒(HIV)或丙型肝炎病毒(HCV)。
43.根据权利要求32-37中任一项所述的用途,其中所述中和抗体选自由以下组成的组:b12抗-HIV抗体、2G12抗-HIV抗体、4E10抗-HIV抗体、2F5抗-HIV抗体、AR3A抗-HCV抗体、AR3B抗-HCV抗体、和AR4A抗-HCV抗体。
44.根据权利要求32-37中任一项所述的用途,其中所述药剂用于肌内注射、阴道内注射、静脉注射、腹腔内注射、皮下注射、表皮给药、皮内给药、或鼻腔给药。
45.根据权利要求32-37中任一项所述的用途,其中所述药剂用于至多每年一次施用至所述受试对象。
46.根据权利要求45所述的用途,其中所述药剂用于至多每5年一次施用至所述受试对象。
47.根据权利要求45所述的用途,其中所述药剂用于至多每10年一次施用至所述受试对象。
48.一种生产重组腺相关病毒(AAV)的方法,包括:
提供具有病毒构建体、用于产生生产性AAV感染的辅助功能、和AAVcap基因的包装细胞系,所述病毒构建体包括合成的启动子、5’AAV末端反向重复序列(ITR)和3’AAVITR,所述合成的启动子是SEQIDNO:1的核苷酸序列;和
从所述包装细胞系的上清液中回收重组AAV病毒。
49.根据权利要求48所述的方法,其中所述AAVcap基因编码来自血清型1、血清型2、血清型4、血清型5、血清型6、血清型7、血清型8、或血清型9的衣壳。
50.根据权利要求48所述的方法,其中所述病毒构建体是权利要求1-21中任一项所述的病毒载体。
51.根据权利要求48或49所述的方法,其中所述重组AAV不是自身互补AAV(scAAV)。
52.一种分离的、合成的或重组的启动子多核苷酸,所述启动子多核苷酸是SEQIDNO:1的核酸序列。
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AU2012236099A1 (en) | 2011-03-31 | 2013-10-03 | Moderna Therapeutics, Inc. | Delivery and formulation of engineered nucleic acids |
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EP3682905B1 (en) | 2011-10-03 | 2021-12-01 | ModernaTX, Inc. | Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof |
RS63244B1 (sr) | 2011-12-16 | 2022-06-30 | Modernatx Inc | Kompozicije modifikovane mrna |
WO2013130393A1 (en) * | 2012-02-28 | 2013-09-06 | Cornell University | Aav-directed persistent expression of an anti-nicotine antibody gene for smoking cessation |
US9572897B2 (en) | 2012-04-02 | 2017-02-21 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins |
EP2833892A4 (en) | 2012-04-02 | 2016-07-20 | Moderna Therapeutics Inc | MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS AND PEPTIDES ASSOCIATED WITH ONCOLOGY |
US9283287B2 (en) | 2012-04-02 | 2016-03-15 | Moderna Therapeutics, Inc. | Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins |
US10501512B2 (en) | 2012-04-02 | 2019-12-10 | Modernatx, Inc. | Modified polynucleotides |
WO2013154744A1 (en) * | 2012-04-13 | 2013-10-17 | Cornell University | Development of a highly efficient second generation nicotine-conjugate vaccine to treat nicotine addiction |
WO2014052693A2 (en) | 2012-09-29 | 2014-04-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Veterinary composition and methods for non-surgical neutering and castration |
US9943611B2 (en) | 2012-11-01 | 2018-04-17 | California Institute Of Technology | Reversible gene expression |
ES2921623T3 (es) | 2012-11-26 | 2022-08-30 | Modernatx Inc | ARN modificado terminalmente |
US9994629B2 (en) * | 2012-12-13 | 2018-06-12 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for generating a synthetic antibody |
WO2014120975A1 (en) | 2013-02-01 | 2014-08-07 | California Institute Of Technology | Antibody-mediated immunocontraception |
US11332719B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-05-17 | The Broad Institute, Inc. | Recombinant virus and preparations thereof |
US8980864B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-03-17 | Moderna Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of altering cholesterol levels |
US9597658B2 (en) | 2013-04-01 | 2017-03-21 | Savannah River Nuclear Solutions, Llc | Metal-organic framework templated synthesis of porous inorganic materials as novel sorbents |
US10006049B2 (en) | 2013-05-16 | 2018-06-26 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Hairpin mRNA elements and methods for the regulation of protein translation |
WO2015048744A2 (en) | 2013-09-30 | 2015-04-02 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides |
AU2014329452B2 (en) | 2013-10-03 | 2019-06-20 | Moderna Therapeutics, Inc. | Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor |
SG11201604719WA (en) | 2013-12-13 | 2016-07-28 | Univ Pennsylvania | Dna antibody constructs and method of using same |
US9884075B2 (en) | 2014-01-16 | 2018-02-06 | California Institute Of Technology | Domain-swap T cell receptors |
MX2016011690A (es) | 2014-03-21 | 2016-11-07 | Univ Leland Stanford Junior | Edicion del genoma sin nucleasas. |
MA44179B1 (fr) | 2014-05-13 | 2020-10-28 | Univ Pennsylvania | Compositions comprenant un virus adeno-associe exprimant des constructions a double anticorps et leurs utilisations |
CN104212802B (zh) * | 2014-09-25 | 2017-09-12 | 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 | 一种肿瘤细胞广谱高活性启动子及其用途 |
EP3215191A4 (en) * | 2014-11-05 | 2018-08-01 | Voyager Therapeutics, Inc. | Aadc polynucleotides for the treatment of parkinson's disease |
JP6863891B2 (ja) | 2014-11-14 | 2021-04-21 | ボイジャー セラピューティクス インコーポレイテッドVoyager Therapeutics,Inc. | 調節性ポリヌクレオチド |
BR112017011556A2 (pt) | 2014-12-01 | 2018-03-06 | Inovio Pharmaceuticals Inc | métodos para gerar um anticorpo sintético, prevenir ou tratar uma doença, tratar um sujeito de infecção por um patógeno e um sujeito com câncer, produto, molécula de ácido nucleico, e, composição. |
US11033638B2 (en) | 2015-01-07 | 2021-06-15 | Universität Autonoma De Barcelona | Single-vector gene construct comprising insulin and glucokinase genes |
CN107427666B (zh) | 2015-01-30 | 2022-11-04 | 加利福尼亚大学校董 | 脊髓软膜下基因递送系统 |
CN115094062A (zh) | 2015-04-16 | 2022-09-23 | 埃默里大学 | 用于肝脏中蛋白质表达的重组启动子和载体及其用途 |
MX2017014075A (es) | 2015-05-01 | 2018-07-06 | Onl Therapeutics Inc | Composiciones de peptido y metodos de uso. |
EP3291843B1 (en) * | 2015-05-07 | 2023-03-22 | University of South Florida | Modified ube3a gene for a gene therapy approach for angelman syndrome |
CN108135994B (zh) | 2015-05-13 | 2022-01-25 | 宾夕法尼亚州大学信托人 | Aav-介导的抗-流感抗体的表达及其使用方法 |
US10016514B2 (en) | 2015-05-15 | 2018-07-10 | New Hope Research Foundation | Polynucleotides, vectors and methods for insertion and expression of transgenes |
US10266844B2 (en) | 2015-07-31 | 2019-04-23 | California Institute Of Technology | Activity-dependent expression of nucleic acids |
ES2869284T3 (es) | 2015-12-11 | 2021-10-25 | California Inst Of Techn | Péptidos de diana para dirigir virus adenoasociados (AAV) |
US10137144B2 (en) | 2016-01-15 | 2018-11-27 | American Gene Technologies International Inc. | Methods and compositions for the activation of gamma-delta T-cells |
EP4310500A3 (en) | 2016-01-15 | 2024-04-03 | American Gene Technologies International Inc. | Methods and compositons for the activation of gamma-delta t-cells |
WO2017139065A1 (en) | 2016-02-08 | 2017-08-17 | American Gene Technologies International Inc. | Hiv vaccination and immunotherapy |
US10767183B2 (en) | 2016-03-09 | 2020-09-08 | American Gene Technologies International Inc. | Combination vectors and methods for treating cancer |
KR102574810B1 (ko) * | 2016-04-15 | 2023-09-08 | 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아 | 습성 연령 관련 황반 변성의 치료를 위한 조성물 |
WO2017189963A1 (en) * | 2016-04-29 | 2017-11-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
US11299751B2 (en) | 2016-04-29 | 2022-04-12 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions for the treatment of disease |
EP3448874A4 (en) | 2016-04-29 | 2020-04-22 | Voyager Therapeutics, Inc. | COMPOSITIONS FOR TREATING A DISEASE |
AU2017292582C1 (en) | 2016-07-08 | 2021-11-11 | American Gene Technologies International Inc. | HIV pre-immunization and immunotherapy |
WO2018017882A1 (en) | 2016-07-21 | 2018-01-25 | American Gene Technologies International Inc. | Viral vectors for treating parkinson's disease |
WO2018022783A1 (en) * | 2016-07-26 | 2018-02-01 | Cornell University | Gene therapy for the treatment of aldehyde dehydrogenase deficiency |
CN106434575A (zh) * | 2016-09-26 | 2017-02-22 | 中国动物卫生与流行病学中心 | 流感病毒作为表达载体的构建方法 |
WO2018064098A1 (en) | 2016-09-28 | 2018-04-05 | Cohbar, Inc. | Therapeutic mots-c related peptides |
WO2018060288A1 (en) | 2016-09-29 | 2018-04-05 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Compositions and methods of treatment of persistent hpv infection |
US11339209B2 (en) | 2016-11-14 | 2022-05-24 | Novartis Ag | Compositions, methods, and therapeutic uses related to fusogenic protein minion |
BR112019010275A2 (pt) | 2016-12-09 | 2019-09-17 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | adenovírus recombinante, composição, uso do adenovírus ou composição, método de induzir uma resposta imune em um paciente, e, adenovírus de símio não humano |
GB201620968D0 (en) | 2016-12-09 | 2017-01-25 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Adenovirus polynucleotides and polypeptides |
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MX2019012113A (es) | 2017-04-14 | 2020-09-10 | Univ Nat Taiwan | Terapia génica para la deficiencia de la aadc. |
US20230137562A1 (en) | 2017-06-07 | 2023-05-04 | Adrx, Inc. | Tau aggregation inhibitors |
JOP20190269A1 (ar) | 2017-06-15 | 2019-11-20 | Voyager Therapeutics Inc | بولي نوكليوتيدات aadc لعلاج مرض باركنسون |
US20200377906A1 (en) * | 2017-06-20 | 2020-12-03 | The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services | Codon-optimized human npc1 genes for the treatment of niemann-pick type c1 deficiency and related conditions |
CN110869031A (zh) * | 2017-06-28 | 2020-03-06 | 南佛罗里达大学 | 用于天使人综合征的基因治疗方法的修饰的ube3a基因 |
EP3655539A1 (en) | 2017-07-21 | 2020-05-27 | GlaxoSmithKline Biologicals S.A. | Chikungunya virus antigen constructs |
JP2020530986A (ja) | 2017-07-27 | 2020-11-05 | ノバルティス アーゲー | シェダーゼ耐性trem2変異体 |
MX2020001187A (es) | 2017-08-03 | 2020-10-05 | Voyager Therapeutics Inc | Composiciones y métodos para la administración de virus adenoasociados. |
JP7374883B2 (ja) * | 2017-08-09 | 2023-11-07 | バイオベラティブ セラピューティクス インコーポレイテッド | 核酸分子およびその使用 |
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BR112020008033A2 (pt) * | 2017-10-23 | 2020-10-27 | Prevail Therapeutics, Inc. | terapias gênicas para doença neurodegenerativa |
US20200283800A1 (en) * | 2017-10-23 | 2020-09-10 | Prevail Therapeutics, Inc. | Gene therapies for neurodegenerative diseases |
KR20200090927A (ko) | 2017-12-19 | 2020-07-29 | 아카우오스, 인크. | 내이에 대한 치료적 항체의 aav-매개 전달 |
MX2020006225A (es) | 2017-12-20 | 2020-12-07 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Constructos antigenicos del virus de epstein-barr. |
CN108103104B (zh) * | 2017-12-21 | 2021-07-06 | 北京锦篮基因科技有限公司 | 一种预防和治疗脉络膜新生血管相关眼部疾病的基因药物 |
JP2021511020A (ja) | 2018-01-17 | 2021-05-06 | アドリーナス セラピューティクス, インコーポレイテッド | 21−ヒドロキシラーゼ欠損症のためのアデノ随伴ウイルス遺伝子療法 |
SG11202006431WA (en) * | 2018-02-14 | 2020-08-28 | Generation Bio Co | Non-viral dna vectors and uses thereof for antibody and fusion protein production |
WO2019199841A1 (en) * | 2018-04-09 | 2019-10-17 | Cure Ahc, Inc. | Aav-mediated delivery of atp1a3 genes to central nervous system |
EA202092457A1 (ru) * | 2018-05-08 | 2021-08-10 | Ньюракл Сайенс Ко., Лтд. | Доставка антител к fam19a5 с помощью аденоассоциированного вируса (aav) |
US20210230632A1 (en) | 2018-05-15 | 2021-07-29 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivery of aav |
BR112020023082A2 (pt) | 2018-05-15 | 2021-02-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | composições e métodos para o tratamento de doença de parkinson |
WO2019222444A2 (en) | 2018-05-16 | 2019-11-21 | Voyager Therapeutics, Inc. | Directed evolution |
US11702674B2 (en) | 2018-06-12 | 2023-07-18 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Simian adenovirus vectors comprising the ChAd-157 fiber protein |
WO2020061079A1 (en) | 2018-09-18 | 2020-03-26 | California Institute Of Technology | Engineered light-sensitive proteins |
WO2020069461A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Voyager Therapeutics, Inc. | Frataxin expression constructs having engineered promoters and methods of use thereof |
WO2020077165A1 (en) | 2018-10-12 | 2020-04-16 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for delivery of aav |
JP2022506515A (ja) | 2018-11-05 | 2022-01-17 | アメリカン ジーン テクノロジーズ インターナショナル インコーポレイテッド | 制御性rnaを発現させるためのベクターシステム |
US20200148762A1 (en) * | 2018-11-09 | 2020-05-14 | Avamab Pharma Inc. | Methods for regulating endogenous production of antibodies against infectious diseases |
WO2020142752A1 (en) * | 2019-01-04 | 2020-07-09 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for the treatment of fabry disease |
WO2020150065A1 (en) | 2019-01-14 | 2020-07-23 | California Institute Of Technology | Methods and compositions for modulating appetite and intake of sodium |
US20220064671A1 (en) | 2019-01-18 | 2022-03-03 | Voyager Therapeutics, Inc. | Methods and systems for producing aav particles |
EP3917944A1 (en) | 2019-01-28 | 2021-12-08 | Cohbar Inc. | Therapeutic peptides |
US20220227875A1 (en) * | 2019-05-31 | 2022-07-21 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Vector-based therapy for thyroid disease |
TW202115126A (zh) | 2019-06-11 | 2021-04-16 | 美商舒爾人類基因療法公司 | 用於治療血漿激肽釋放酶失調所介導之疾病的抗體腺相關病毒載體遞送 |
MX2021014936A (es) | 2019-06-11 | 2022-01-24 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Formulaciones de vacunas a traves de la mucosa. |
CN110423778B (zh) * | 2019-07-26 | 2023-04-21 | 上海科技大学 | 一种逆行性重组2型腺相关病毒在感染螺旋神经元中的应用 |
WO2021046155A1 (en) | 2019-09-03 | 2021-03-11 | Voyager Therapeutics, Inc. | Vectorized editing of nucleic acids to correct overt mutations |
JP2022553083A (ja) | 2019-10-23 | 2022-12-21 | シャイアー ヒューマン ジェネティック セラピーズ インコーポレイテッド | アデノ随伴ウイルスベクターに基づく遺伝性血管浮腫のための遺伝子治療 |
CA3166374A1 (en) * | 2019-12-31 | 2021-07-08 | Swanbio Therapeutics Limited | Improved aav-abcd1 constructs and use for treatment or prevention of adrenoleukodystrophy (ald) and/or adrenomyeloneuropathy (amn) |
WO2021169167A1 (en) * | 2020-02-29 | 2021-09-02 | Nanjing GenScript Biotech Co., Ltd. | Method for treating coronavirus infections |
WO2021247995A2 (en) | 2020-06-04 | 2021-12-09 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating neuropathic pain |
CN111705069A (zh) * | 2020-06-19 | 2020-09-25 | 武汉纽福斯生物科技有限公司 | 一种多神经营养因子联合表达载体及其应用 |
US20230285596A1 (en) | 2020-07-27 | 2023-09-14 | Voyager Therapeutics, Inc | Compositions and methods for the treatment of niemann-pick type c1 disease |
CA3190309A1 (en) | 2020-07-27 | 2022-02-03 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency |
EP4214242A1 (en) * | 2020-09-15 | 2023-07-26 | RegenxBio Inc. | Vectorized antibodies for anti-viral therapy |
US20220186252A1 (en) | 2020-12-16 | 2022-06-16 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Adeno associated viral vector delivery of antibodies for the treatment of disease mediated by dysregulated plasma kallikrein |
IL303969A (en) | 2021-01-24 | 2023-08-01 | David Forrest Michael | ugh |
KR20230154074A (ko) | 2021-03-08 | 2023-11-07 | 난징 진스크립트 바이오테크 컴퍼니 리미티드 | 이중 바이러스 벡터 시스템을 이용한 항체 전달 |
CA3212876A1 (en) | 2021-03-19 | 2022-09-22 | Adrenas Therapeutics, Inc. | Gene therapies for 21-hydroxylase deficiency |
CA3228169A1 (en) * | 2021-08-06 | 2023-02-09 | The Trustees Of The Univeristy Of Pennsylvania | Compositions and methods for treatment and prevention of misfolded proteins |
AU2022337291A1 (en) * | 2021-09-01 | 2024-04-18 | Jaguar Gene Therapy, Llc | Adeno-associated vectors and virions to treat galactosemia and methods of use and manufacture |
CN117535291A (zh) * | 2021-09-08 | 2024-02-09 | 北京锦篮基因科技有限公司 | 一种高表达活性的组成型启动子及其应用 |
CA3235145A1 (en) | 2021-10-12 | 2023-04-20 | Bridgebio Gene Therapy Llc | Methods and compositions for treating leukodystrophies |
CN114085816B (zh) * | 2021-10-26 | 2023-05-26 | 四川大学华西医院 | 一种标记临近星形胶质细胞的方法 |
CN114107390B (zh) * | 2021-11-05 | 2023-10-24 | 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 | 一种用于表达抗体IgG1的rAAV载体及其应用 |
WO2023091949A2 (en) | 2021-11-17 | 2023-05-25 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency |
WO2023198828A1 (en) | 2022-04-13 | 2023-10-19 | Universitat Autònoma De Barcelona | Treatment of neuromuscular diseases via gene therapy that expresses klotho protein |
WO2023240236A1 (en) | 2022-06-10 | 2023-12-14 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of spinal muscular atrophy related disorders |
WO2023248145A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Crispr Therapeutics Ag | Compositions and methods for treating human immunodeficiency virus |
WO2023248147A1 (en) | 2022-06-21 | 2023-12-28 | Crispr Therapeutics Ag | Methods and compositions for in vivo editing of stem cells |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4937190A (en) | 1987-10-15 | 1990-06-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Translation enhancer |
US6410300B1 (en) | 1998-01-12 | 2002-06-25 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and formulations for mediating adeno-associated virus (AAV) attachment and infection and methods for purifying AAV |
AU6254799A (en) * | 1998-09-16 | 2000-04-03 | Tanox, Inc. | Anti-ige gene therapy |
US6825945B1 (en) | 1999-05-25 | 2004-11-30 | Silverbrook Research Pty Ltd | Method and system for delivery of a brochure |
CA2413156C (en) * | 2000-07-03 | 2009-08-18 | Gala Design, Inc. | Expression vectors |
US7939059B2 (en) | 2001-12-10 | 2011-05-10 | California Institute Of Technology | Method for the generation of antigen-specific lymphocytes |
EP2278020A3 (en) * | 2002-04-09 | 2011-05-11 | Nationwide Children's Hospital, Inc. | Antibody gene transfer and recombinant AAV therefor |
US20040156828A1 (en) * | 2003-01-07 | 2004-08-12 | Ruian Xu | Adeno-associated virus mediated B7.1 vaccination synergizes with angiostatin to eradicate disseminated liver metastatic cancers |
US7485291B2 (en) * | 2003-06-03 | 2009-02-03 | Cell Genesys, Inc. | Compositions and methods for generating multiple polypeptides from a single vector using a virus derived peptide cleavage site, and uses thereof |
EP1636360A4 (en) | 2003-06-03 | 2006-11-08 | Cell Genesys Inc | COMPOSITIONS AND METHODS FOR ENHANCED EXPRESSION OF RECOMBINANT POLYPEPTIDES FROM A SINGLE VECTOR USING A PEPTIDE CLEAVAGE SITE |
US7186699B2 (en) * | 2003-06-03 | 2007-03-06 | Cell Genesys, Inc. | Method for treating cancer by vector-mediated delivery of one or more anti-angiogenic or pro-apoptotic genes |
WO2005056762A2 (en) * | 2003-12-05 | 2005-06-23 | University Of Iowa Research Foundation | Truncated cmv promoters and vectors containing same |
JP2008506389A (ja) * | 2004-07-13 | 2008-03-06 | セル ジェネシス インコーポレイテッド | Aavベクター組成物および免疫グロブリンの発現の増強のための方法ならびにその使用方法 |
EP1807157A2 (en) | 2004-10-22 | 2007-07-18 | Neurologix, Inc. | Use of apoptosis inhibiting compounds in degenerative neurological disorders |
US7943374B2 (en) * | 2005-08-21 | 2011-05-17 | Markus Hildinger | Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb |
BRPI0617373B1 (pt) * | 2005-10-14 | 2022-04-05 | The Goverment of The United States of America, Representado por, The Secretary of The Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention | Composições e métodos do vírus da raiva |
WO2009120339A2 (en) * | 2008-03-24 | 2009-10-01 | President And Fellows Of Harvard College | Vectors for delivering disease neutralizing agents |
EP2108706A1 (en) * | 2008-04-10 | 2009-10-14 | Institut Pasteur | New method for selecting compounds useful for treating and/or preventing microbial Shigella infection |
US7943379B2 (en) | 2008-04-30 | 2011-05-17 | Nationwide Children's Hospital, Inc. | Production of rAAV in vero cells using particular adenovirus helpers |
EP2627359B1 (en) * | 2010-10-15 | 2015-12-30 | INSERM - Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale | Expression vector for cholesterol 24-hydrolase in therapy of huntington's disease |
CN103492574B (zh) | 2011-02-22 | 2015-12-09 | 加州理工学院 | 使用腺相关病毒(aav)载体递送蛋白 |
-
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