CN114107390B - 一种用于表达抗体IgG1的rAAV载体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于表达抗体IgG1的rAAV载体及其应用。所述rAAV载体ITR核心表达元件由广谱强启动子CMV、IgG1重链分泌信号肽序列、IgG1重链编码区、连接多肽编码序列、IgG1轻链分泌信号肽序列、IgG1轻链编码区和人血清白蛋白多聚腺苷酸序列构成。通过上述rAAV载体上的酶切位点可以方便快速地对重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）进行操作。利用包装获得的抗体IgG1‑rAAV病毒感染体外培养的HEK293T细胞或C57小鼠等，能够表达具有不同抗原识别活性的各种抗体IgG1。
Description
技术领域
本发明属于病毒载体技术领域，更具体地，涉及一种可长效表达抗体的rAAV载体及其应用。
背景技术
单克隆抗体(mAb)的疗法是治疗免疫疾病，癌症和传染病的非常成熟的策略之一。当前获得许可的治疗性mAb大部分都是IgG1型抗体，它由两个二聚体组成的四聚体形成，每个二聚体包含通过二硫键组装在一起的轻链(Light Chain，LC)和重链(Heavy Chain，HC)。MAb具有赋予抗原结合特性的可变片段(Fab)和恒定片段(Fc)。除了结合外，mAb还可以通过Fab相互作用中和病毒，也可以参与针对特定抗原的免疫应答。Fc与Fc细胞受体的作用可以触发不同的机制，包括程序性细胞死亡，免疫细胞募集和补体级联的激活(Vidarsson等,Front Immunol,2014,5:520.)。因此，mAb的双重功能对于实现其治疗效果非常重要。
重组腺相关病毒载体(rAAV)具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、病毒血清型种类多、可感染分裂和非分裂细胞、能介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点，是一种用于携载外源基因表达的重要病毒载体工具。rAAV载体一般是用外源基因表达元件替换AAV编码基因，仅保留病毒复制和包装所需的ITR序列。通过反式补偿Rep、Cap基因和辅助病毒功能因子，就可在某些细胞系中包装产生出携带外源基因的rAAV载体。rAAV载体已被用于介导编码单克隆抗体(mAb)基因，在体内获得长期表达，从而减少了传统单克隆抗体注射液给药次数，可在数月至数年内有效抵抗慢性和感染性疾病，如：呼吸道合胞病毒，人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)和流感病毒等(Robert等，Current Gene Therapy,2016,16,363-374)。rAAV携载外源基因片段的大小的能力一般不超过5Kb。使用两个rAAV病毒分别表达IgG1的轻链和重链虽然受rAAV包装容量的限制较小，但两个rAAV共感染单个靶细胞表达产生完整IgG1抗体的水平往往并不理想。因此，利用单个rAAV表达IgG1抗体的策略成为了更好的选择。利用两套启动子与polyA表达框分别表达IgG1的轻链和重链，但容易造成片段长度超限导致rAAV产率下降。利用核糖体内部进入位点(IRES)表达IgG1的轻链，省去了一套启动子与polyA表达框，降低片段的长度，但由于IgG1的重链和轻链的表达受不同的启动子或IRES调节元件控制，往往造成重链和轻链的起始表达不是相同的比例，这并不是产生IgG1的最佳选择。有研究者利用口蹄疫病毒(FMDV)的自剪切多肽(F2A)替代IRES，可以使IgG1的重链和轻链等比例表达。进一步还有使用氟林蛋白酶切位点(Furin)去除F2A自剪切多肽链切割后残留多余氨基酸可以改善抗体的稳定性，通过该策略获得的抗体最高血清浓度可达到1mg/ml的治疗水平(Fang等，Nat Biotechnol 2005；23:584-90.)。然而，上述连接多肽的剪切效率并不是很高，IgG1的表达水平也仍有待进一步提高。目前，仍然缺乏有效的表达识别不同抗原IgG1的通用IgG1-rAAV载体。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明一方面提供了一种用于表达抗体IgG1的rAAV载体，rAAV载体ITR核心表达元件由广谱强启动子CMV、IgG1重链分泌信号肽序列、IgG1重链编码区、连接多肽编码序列(linker)、IgG1轻链分泌信号肽序列、IgG1轻链编码区和人血清白蛋白多聚腺苷酸(HGHpA)序列构成。
优选地，所述的连接多肽编码序列由优化的弗林蛋白酶切割位点(Opt-Furin)序列RRKR与自剪切肽2A(T2A)组成，序列如SEQ ID NO.4所示。
优选地，所述的IgG1重链分泌信号肽序列如SEQ ID NO.2所示，IgG1轻链分泌信号肽序列如SEQ ID NO.3所示。
优选地，所述的IgG1重链编码区包括重链保守区编码序列CH和重链可变区编码序列VH，IgG轻链编码区包括轻链保守区编码序列CL和轻链可变区编码序列VL。
优选地，优选2型AAV的ITR序列，其骨架基于pAAV-ITR-MCS质粒。
另一方面，上述rAAV载体在体外培养的细胞水平或动物活体水平表达抗体IgG1，包括以下步骤：
(1)利用三质粒转染HEK293T细胞的方法制备获得抗体IgG1-rAAV病毒；
(2)将抗体IgG1-rAAV病毒感染HEK293T细胞，收集细胞培养上清液即可获得相应的抗体IgG1；或将抗体IgG1-rAAV病毒注射感染小鼠，收集小鼠血清即可获得相应的抗体IgG1。
总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术对比，能够取得以下有益效果：仅仅需要合成识别抗原的抗体IgG1的重链可变区序列VH和轻链可变区序列VL序列，分别克隆到抗体IgG1-rAAV载体骨架的CH和CL保守区插入位点，就可以快速构建抗体IgG1-rAAV表达载体，通过感染体外培养的HEK293T细胞或C57小鼠等长效表达抗体IgG1。
附图说明
图1：抗体IgG1-rAAV载体序列结构及其表达产物抗体IgG1结构示意图。采用一种单链AAV(ssAAV)载体，并从一个开放读码框中表达抗体IgG1的重链和轻链，两条多肽链由介导切割的费林蛋白酶肽(Furin)和T2A自剪切多肽分离。重链和轻链N端在信号肽(SP)介导的切割后获得真实序列。ITR为末端重复序列，VL为轻链可变区，VH为重链可变区，CH为恒定重链，CL为恒定轻链，HGHpA为多聚腺苷酸化信号。
图2：A.抗体IgG1-rAAV载体质粒转染HEK293T细胞表达产物的蛋白免疫印迹检测；B.纯化的抗体IgG1-rAAV9病毒银染检测。
图3：A.抗体IgG1-rAAV9病毒感染HEK293T细胞表达产物的蛋白免疫印迹检测；B.抗体IgG1-rAAV9病毒尾静脉注射感染C57小鼠后血清中表达产物的蛋白免疫印迹检测。
具体实施方式
实施例1.构建抗体IgG1-rAAV载体质粒并验证其功能
我们选择利用单个rAAV载体表达IgG1抗体的策略进行优化设计。在pAAV-ITR-MCS质粒骨架的基础上构建抗体的表达框。其中，rAAV末端重复序列(ITR)采用的是2型AAV的ITR序列，如SEQ ID NO.1所示。在两端ITR序列之间是抗体IgG1的表达框。我们选用的是广谱性强启动子的人巨细胞病毒(CMV)启动子，接着是IgG1抗体重链(Heavy Chain,HC)编码区，然后通过连接序列(linker)连接IgG1抗体轻链(Light Chain，LC)编码区，最后是人血清白蛋白多聚腺苷酸(HGHpA)序列。
由于不同IgG1抗体的差异主要是在识别抗原的重链HC可变区VH和重链LC可变区VL，其他区域序列相对保守。我们选用较为成熟的商业化单克隆抗体药物赫塞汀(herceptin)作为参考，它是一种人源化的抗Her2受体单克隆抗体，用于治疗乳腺癌。Anti-Her2抗体IgG1的重链和轻链编码区序列参考GenBank:KY199430.1。
为了使我们设计的抗体IgG1-rAAV载体能够快速灵活的适应各种不同IgG1抗体的表达需求，我们经过序列分析和优化设计出pAAV-ITR-CMV-CH-Linker-CL-HGHpA骨架载体质粒(图1)，其序列优选如SEQ ID NO.7所示。我们将抗体IgG1的主要编码框(CMV启动子、重链保守区CH、连接序列linker、轻链保守区CL和HGHpA)预置其中。
为了进一步获得完整抗体IgG1表达载体质粒pAAV-ITR-CMV-IgG1-HGHpA(图1)。我们在CMV启动子与CH编码区之间可通过BamH1和Nhe1酶切位点插入重链分泌信号肽(Signalpeptide，SP，优选SEQ ID NO.2所示序列)与重链可变区VH(优选SEQ ID NO.5所示序列)。在linker序列与CL编码区之间可通过BmgB1和BsiW1酶切位点插入轻链分泌信号肽(优选SEQID NO.3所示序列)与轻链可变区VL(优选SEQ ID NO.6所示序列)。由于T2A的剪切效率要高于F2A，我们优选的连接序列(linker)由优化的弗林蛋白酶切割位点(Opt-Furin)RRKR与自剪切肽2A(T2A)组成，序列如SEQ ID NO.4所示。最终，我们构建了可表达人源化的抗Her2受体的抗体IgG1-rAAV载体质粒pAAV-ITR-CMV-IgG1-HGHpA。经过上述优化设计，IgG1-rAAV所携带的外源基因片段的长度被控制在4.2Kb左右，远低于rAAV能够携载外源基因片段长度5Kb的上限。
为了快速验证所构建抗体IgG1表达载体质粒pAAV-ITR-CMV--IgG1-HGHpA表达IgG1的能力，我们直接将其转染6孔板中培养的HEK293T细胞(约70％汇合度)，转染3天后，我们分别收集HEK293T细胞和培养液上清。然后，将细胞和上清样品处理后SDS-PAGE电泳并进行蛋白免疫印迹检测，采用HRP标记的羊抗人IgG抗体(Goat Anti-Human IgG(H+L))识别表达产物IgG1。实验结果显示，阴性对照组细胞和上清中均没有检测信号，而质粒转染后的HEK293T细胞和上清中有明显的抗体IgG1重链和轻链的特异性检测信号(如图2A)。综上所述，我们成功构建了抗体IgG1-rAAV载体质粒，其能够表达出较高水平的抗体IgG1。
实施例2.包装纯化抗体IgG1-rAAV病毒
我们采用经典的三质粒转染HEK 293T细胞的方法制备抗体IgG1-rAAV。为了便于包装和活体测试，我们选用9型AAV的血清型质粒pAAV-RC9进行实验。首先，将HEK293T细胞铺10cm培养皿，当细胞生长到汇合度80％左右时用PEI转染试剂将pAAV-ITR-CMV-IgG1-HGHpA核心质粒、pAAV-RC9质粒和pAAV-Ad-helper质粒以等摩尔比转染HEK293T细胞。转染3天后，收集细胞和培养上清液，包装出来的IgG1-rAAV9就存在其中。然后，我们利用碘克沙醇(idox)密度梯度超速离心的方法对rAAV进行纯化(参考Grieger等，Nat Protoc.2006；1(3):1412-28.)。荧光定量PCR检测纯化后的IgG1-rAAV9滴度约为6.5E+12VG/ml。进一步，利用银染的方法对rAAV的纯度进行分析，我们可以清晰的观察到AAV病毒粒子衣壳蛋白3种亚基VP1、VP2、VP3的特异性条带，纯度较高(如图2B)。
实施例3.检测抗体IgG1-rAAV感染HEK293T细胞和C57小鼠中的表达情况
我们利用实例2中获得的抗体IgG1-rAAV9病毒感染体外培养的HEK293T细胞。感染3天后，收集细胞和培养上清液。然后，将细胞和上清样品处理后SDS-PAGE电泳并进行蛋白免疫印迹检测，采用HRP标记的羊抗人IgG抗体识别表达产物IgG1。实验结果显示，HEK293T细胞和上清中有明显的抗体IgG1重链和轻链的特异性检测信号(如图3A)。
我们利用实例2中获得的抗体IgG1-rAAV9病毒尾静脉注射感染C57小鼠。在感染后的14天(2周)、21天(3周)和28天(4周)尾静脉取血液。我们将血液样品在37℃放置1小时，接着4℃放置12小时，然后1000rpm离心10分钟，取上层小鼠血清。rAAV表达的人IgG1抗体就存在于血清中。然后，将血清样品处理后SDS-PAGE电泳并进行蛋白免疫印迹检测，采用HRP标记的羊抗人IgG抗体识别表达产物IgG1。实验结果显示，样品中有明显的抗体IgG1重链和轻链的特异性检测信号，且随着感染后时间的增加IgG1的表达量也明显增加，两只小鼠的结果重复性较好(如图3B)。综上所述，我们制备获得的抗体IgG1-rAAV病毒感染体外培养的HEK293T细胞或C57小鼠能够有效表达出抗体IgG1。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院
<120> 一种用于表达抗体IgG1的rAAV载体及其应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc t 141
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggagttgg gactgagctg gattttcctt ttggctattt taaaaggtgt ccagtgt 57
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggacatga gggtccctgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct ctcaggtgcc 60
agatgt 66
<210> 4
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agaaggaaga gaggcagcgg agagggcaga ggaagccttc tgacctgcgg cgacgtggag 60
gagaaccccg gccct 75
<210> 5
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaagttcagc tggttgaatc tggtggtggt ctggttcagc cgggtggttc tctgcgtctg 60
tcttgcgctg cttctggttt caacatcaaa gacacctaca tccactgggt tcgtcaggct 120
ccgggtaaag gtctggaatg ggttgctcgt atctacccga ccaacggtta cacccgttac 180
gctgactctg ttaaaggtcg tttcaccatc tctgctgaca cctctaaaaa caccgcttac 240
ctgcagatga actctctgcg tgctgaagac accgctgttt actactgctc tcgttggggt 300
ggtgacggtt tctacgctat ggactactgg ggtcagggta ccctggttac cgtttcttct 360
<210> 6
<211> 321
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gacatccaga tgacccagtc tccgtcttct ctgtctgctt ctgttggtga ccgtgttacc 60
atcacctgcc gtgcttctca ggacgttaac accgctgttg cttggtacca gcagaaaccg 120
ggtaaagctc cgaaactgct gatctactct gcttctttcc tgtactctgg tgttccgtct 180
cgtttctctg gttctcgttc tggtaccgac ttcaccctga ccatctcttc tctgcagccg 240
gaagacttcg ctacctacta ctgccagcag cactacacca ccccgccgac cttcggtcag 300
ggtaccaaag ttgaaatcaa a 321
<210> 7
<211> 5984
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct gcggccgcac gcgtctagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag 180
ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct 240
gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgt 300
caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg 360
cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat 420
ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca 480
tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc 540
gtggatagcg gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga 600
gtttgttttg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt 660
gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt 720
gaaccgtcag atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg 780
ggaccgatcc agcctccgcg gattcgaatc ccggccggga acggtgcatt ggaacgcgga 840
ttccccgtgc caagagtgac gtaagtaccg cctatagagt ctataggccc acaaaaaatg 900
ctttcttctt ttaatatact tttttgttta tcttatttct aatactttcc ctaatctctt 960
tctttcaggg caataatgat acaatgtatc atgcctcttt gcaccattct aaagaataac 1020
agtgataatt tctgggttaa ggcaatagca atatttctgc atataaatat ttctgcatat 1080
aaattgtaac tgatgtaaga ggtttcatat tgctaatagc agctacaatc cagctaccat 1140
tctgctttta ttttatggtt gggataaggc tggattattc tgagtccaag ctaggccctt 1200
ttgctaatca tgttcatacc tcttatcttc ctcccacagc tcctgggcaa cgtgctggtc 1260
tgtgtgctgg cccatcactt tggcaaagaa ttgggattcg aacatcgatt gaattccccg 1320
gggatccgct agcaccaaag gtccgtctgt tttcccgctg gctccgtctt ctaaatctac 1380
tagtggtggt accgctgctc tgggttgcct ggttaaagac tacttcccgg aaccggttac 1440
cgtttcttgg aactctggtg ctctgacctc tggtgttcac accttcccgg ctgttctgca 1500
gtcttctggt ctgtactctc tgtcttctgt tgttaccgtt ccgtcttctt ctctgggtac 1560
ccagacctac atctgcaacg ttaaccacaa accgtctaac accaaagttg acaaaaaagt 1620
tgaaccgaaa tcttgcgaca ccccgccgcc gtgcccgcgt tgcccggctc cggaactgct 1680
gggtggcccg agcgtgtttc tgttcccgcc gaaaccgaaa gacaccctga tgatctctcg 1740
taccccggaa gttacctgcg ttgttgttga cgtttctcac gaagacccgg aagttaaatt 1800
caactggtac gttgacggtg ttgaagttca caacgctaaa accaaaccgc gtgaagaaca 1860
gtacaactct acctaccgtg ttgtttctgt tctgaccgtt ctgcaccagg actggctgaa 1920
cggtaaagaa tacaaatgca aagtttctaa caaagctctg ccggctccga tcgaaaaaac 1980
catctctaaa gctaaaggtc agccgcgtga accgcaggtt tacaccctgc cgccgtctcg 2040
tgacgaactg accaaaaacc aggtttctct gacctgcctg gttaaaggtt tctacccgtc 2100
tgacatcgct gttgaatggg aatctaacgg tcagccggaa aacaactaca aaaccacccc 2160
gccggttctg gactctgacg gttctttctt cctgtactct aagcttaccg ttgacaaatc 2220
tcgttggcag cagggtaacg ttttctcttg ctctgttatg cacgaagctc tgcacaacca 2280
ctacacccag aaatctctgt ctctgtctcc gggtaaaaga aggaagagag gcagcggaga 2340
gggcagagga agccttctga cctgcggcga cgtggaggag aaccccggcc ctcgtacggt 2400
tgctgctccg tctgttttca tcttcccgcc gtctgacgaa cagctgaaat ctggtaccgc 2460
ttctgttgtt tgcctgctga acaacttcta ccctagggaa gctaaagttc agtggaaagt 2520
tgacaacgct ctgcagtctg gtaactctca ggaatctgtt accgaacagg actctaaaga 2580
ctctacctac tctctgtctt ctaccctgac cctgtctaaa gctgactacg aaaaacacaa 2640
agtttacgct tgcgaagtta cccaccaggg tctgtcttct ccggttacca aatctttcaa 2700
ccgtggtgaa tgctaactcg agagatctac gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg 2760
cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta 2820
agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc ttctataata ttatggggtg gaggggggtg 2880
gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa 2940
ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa 3000
gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc 3060
agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg ggtttcacca tattggccag gctggtctcc 3120
aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct tggcctccca aattgctggg attacaggcg 3180
tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg attttgtagg taaccacgtg cggaccgagc 3240
ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca 3300
ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga 3360
gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc 3420
tgtgcggtat ttcacaccgc atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc 3480
attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 3540
agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 3600
tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 3660
ccccaaaaaa cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 3720
ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg 3780
aacaacactc aaccctatct cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc 3840
ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat 3900
attaacgttt acaattttat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt 3960
aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc 4020
ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc 4080
accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt 4140
taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg 4200
cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca 4260
ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt 4320
ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga 4380
aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga 4440
actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat 4500
gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca 4560
agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt 4620
cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac 4680
catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct 4740
aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga 4800
gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac 4860
aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat 4920
agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg 4980
ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc 5040
actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc 5100
aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg 5160
gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta 5220
atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg 5280
tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga 5340
tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt 5400
ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag 5460
agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa 5520
ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag 5580
tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca 5640
gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac 5700
cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa 5760
ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc 5820
agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg 5880
tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc 5940
ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgt 5984
Claims (4)
1.一种表达抗体IgG1的rAAV载体的构建方法，其特征在于，构建pAAV-ITR-CMV-CH-Linker-CL-HGHpA骨架载体质粒，其序列如SEQ ID NO.7所示；在CMV启动子与重链保守区编码序列CH之间通过BamH1和Nhe1酶切位点插入IgG1重链分泌信号肽与重链可变区，在连接多肽编码序列linker与轻链保守区编码序列CL之间通过BmgB1和BsiW1酶切位点插入IgG1轻链分泌信号肽与轻链可变区VL，所述的IgG1重链分泌信号肽序列如SEQ ID NO.2所示，所述的IgG1轻链分泌信号肽序列如SEQ ID NO.3所示。
2.权利要求1所述的方法构建的rAAV载体。
3.权利要求2所述的rAAV载体在体外培养的细胞水平表达抗体IgG1中的应用。
4.利用权利要求2所述的rAAV载体制备抗体IgG1的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用三质粒转染HEK293T细胞的方法制备获得抗体IgG1-rAAV病毒；
（2）将抗体IgG1-rAAV病毒感染HEK293T细胞，收集细胞培养上清液即可获得相应的抗体IgG1；或将抗体IgG1-rAAV病毒注射感染小鼠，收集小鼠血清即可获得相应的抗体IgG1。
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Also Published As
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