RU2805173C1 - Способ получения генно-модифицированных лабораторных животных с нуль-аллелем гена P2rx3 - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к плазмидной конструкции px330+P2rx3-sg1 для получения трансгенных мышей, гомозиготных по нуль-аллелю гена P2rx3. Также раскрыта линия мышей, гомозиготных по нуль-аллелю гена P2rx3, а также способ ее получения. Изобретение эффективно для тестирования веществ на роль блокатора P2X3. 5 н.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.

Description

Область техники

Изобретение относится к областям молекулярных биотехнологии и медицины и касается двух линий животных, гомозиготных по нуль-аллелю гена P2rx3, с полным отсутствием экспрессии пуринергического рецептора P2X_3, а также способа их получения. Изобретение может быть использовано для тестирования возможных веществ-кандидатов на роль блокатора P2X₃.

Изобретение создано при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2019-1661 от 31.10.2019 на базе Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины (ЦВРГТБ) ИБГ РАН.

Уровень техники

Одним из основных пуринергических рецепторов, вовлеченных в процесс патогенеза хронических болевых ощущений, является P2X₃ (Bernier L.-P., Ase A. R., Séguéla P. P2X receptor channels in chronic pain pathways. British Journal of Pharmacology (2018) 175 2219-2230). Гомомеры P2X3 и гетеромеры P2X2/3 преимущественно локализованы на периферических первичных сенсорных афферентах, в немиелинизированных С-волокнах малого диаметра. Особое значение при хронических болевых заболеваниях имеет экспрессия рецепторов Р2Х3 в центральных окончаниях задних корешковых ганглиев (ДРГ) (или тройничных ганглиев), оканчивающихся во внутренней пластинке II (желатинозной субстанции) задних рогов спинного мозга. Поскольку рецепторы P2X3 могут усиливать ноцицепцию за счет прямой сенсибилизации болевых волокон, нарушение регуляции этого пуринергического пути связано с патологической болью. Таким образом, разработка обезболивающих препаратов, воздействующих непосредственно на P2X₃, является одной из важных задач современной фармакологии (Krajewski J. L. P2X3-Containing Receptors as Targets for the Treatment of Chronic Pain. Neurotherapeutics (2020) 17:826-838). В исследованиях возможных веществ-кандидатов на роль блокатора P2X₃ незаменимы лабораторные животные с инактивированным геном P2rx3, поскольку эксперименты с их использованием позволяют однозначно установить, является ли молекула P2X₃ мишенью исследуемого вещества.

Мыши с инактивированным геном P2rx3 описаны в литературе, однако они получены с помощью инъекции генетически модифицированных эмбриональных стволовых клеток в полость бластоцисты (Cockayne DA, Dunn PM, Zhong Y, et al. P2X2 knockout mice and P2X2/P2X3 double knockout mice reveal a role for the P2X2 receptor subunit in mediating multiple sensory effects of ATP. J Physiol. 2005; 567(Pt 2):621-639) и недоступны для заказа в России. Таким образом, создание мышей, несущих в геноме нуль-аллель (нефункциональную копию) гена P2rx3, является актуальной задачей для развития современной фармакологии в России.

Краткое описание изобретения

Для получения нокаута по гену P2rx3 мы использовали систему CRISPR/Cas9, состоящую из белка spCas9 и гидовой РНК, ПАМ-сайт которой расположен в первом экзоне гена P2rx3. Нокаут образуется благодаря микроинъекциям в пронуклеус эмбрионов системы CRISPR/Cas9 в форме плазмид, кодирующих белок spCas9 и две гидовые РНК.

Задачей заявляемого изобретения является создание линии генетически модифицированных мышей, гомозиготных по нуль-аллелю гена P2rx3.

Задача решается тем, что с использованием системы CRISPR/Cas9 получена новая линия генетически модифицированных мышей с нуль-аллелем гена P2rx3, для чего:

1. На основе вектора px330 (SEQ ID NO: 1) были получены плазмидные конструкции px330+P2rx3-sg1 и px330+P2rx3-sg2, содержащая гидовые РНК sg1 и sg2 (SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно) против соответствующего участка гена P2rx3 под контролем U6 промотора и ОРС гена spCas9 под контролем CAG промотора.

2. Был разработан способ получения линии мышей с нуль-аллелем гена P2rx3, характеризующийся следующими стадиями:

а) микроинъекция конструкции px330+P2rx3-sg1 и px330+P2rx3-sg2, содержащая гидовые РНК sg1 и sg2 из п. 1 в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши гибрида F₁(CBA×C57BL/6);

б) выявление жизнеспособных зигот;

в) пересадка выживших зигот из пункта (б) псевдобеременным самкам-реципиентам, имеющим копулятивную пробку после ссаживания с вазэктомированными самцами;

г) получение новорожденных мышей на 19 день после пересадки зигот из пункта (в);

д) проведение анализа наличия сдвига рамки считывания в первом экзоне гена P2rx3 через 8-14 дней после рождения мышей (г), путем амплификации целевого участка гена P2rx3 с праймерами SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 с последующим секвенированием фрагмента с использованием праймера SEQ ID NO: 6;

е) отбор мышей, несущих целевую мутацию;

ж) проведение скрещивания мышей из пункта (е) с мышами дикого типа для получения самок-гетерозигот или мутантных самцов, несущих целевую мутацию.

з) проведение скрещивания мышей из пункта (ж) для получения итоговой линии мышей, гомозиготных по нуль-аллелю гена P2rx3.

Технический результат изобретения: разработан способ получения генетически модифицированных мышей с нуль-аллелем гена P2rx3 и выведены соответствующие линии мышей.

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Схема расположения промотора (5’utr) и первого экзона p2rx3, а также подобранных сгРНК и праймеров для генотипирования. Ген расположен на (-) цепи. Указаны места посадки гидовых РНК, ПАМ-сайт, праймеры для генотипирования, 1-й экзон и его кодирующая белок часть.

Фигура 2. Хроматограмма, полученная в результате секвенирования образцов тканей мозаичной мыши поколения F0.

Фигура 3. Хроматограммы, полученные в результате секвенирования образцов тканей мышей F1 (верхняя панель) и F2 (нижняя панель) линии delACTT.

Фигура 4. Хроматограмма, полученные в результате секвенирования образцов тканей мышей F1 (верхняя панель) и F2 (нижняя панель) линии insT.

Фигура 5. Суммарные амплификационные кривые с образцов эмбрионов линии delACTT и эмбрионов дикого типа, а также эмбриональных фибробластов дикого типа. Синий - дикий вариант, оранжевый - пробы эмбрионов линии delACTT.

Осуществление изобретения

Способ осуществляется следующим образом:

1. Подбор гидовых РНК для внесения разреза в первый экзон гена P2rx3 с целью внесения стоп-кодона осуществлялся с использованием онлайн инструмента CRISPOR TEFOR (http://crispor.tefor.net/) с учетом последующего использования нуклеазы SpCas9. Были подобраны две разнонаправленных гидовых РНК (sg1 и sg2, последовательности SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3, соответственно) к первому экзону гена P2rx3. В результате NHEJ-репарации после их разрезания должен образовываться сдвиг рамки считывания в первом экзоне, приводящий к изменению аминокислотной последовательности белка и преждевременному образованию стоп-кодона (фиг. 1). Выбранную сгРНК мы заклонировали в плазмидный вектор px330, предназначенный для одновременной экспрессии белка spCas9 и сгРНК. Последовательности каждой гидовой РНК были синтезированы с использованием двух олигонуклеотидов SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10.

Разрезание вектора проводили с использованием рестриктазы BbsI-HF (New England Biolabs), дефосфорилирование вектора с помощью фермента FastAP (Thermofisher Scientific), затем очистка в агарозном геле и последующее выделение с помощью набора Monarch DNA Gel Extraction Kit.

Олигонуклеотиды фосфорилировались с использованием фермента PNK kinase (Thermofisher Scientific), отжигались друг с другом и лигировались с приготовленным ранее вектором и использованием фермента T4 DNA ligase (Thermofisher Scientific). Лигазная смесь трансформировалась в компетентные клетки штамма XL1blue (Евроген). Скрининг колоний осуществлялся с использованием пцр-наборов компании Изоген и праймеров U6-forv (SEQ ID NO: 11) и реверсного праймера, использовавшегося для клонирования. По две колонии, содержащие сгРНК, наращивались в ночной культуре и выделялись с помощью набора Monarch Plasmid Miniprep Kit. Анализ полученных плазмид проводили методом секвенирования по Сэнгеру. Сиквенс полученных плазмид осуществлялся с использованием праймера U6-forv (SEQ ID NO: 11) компанией Евроген. Анализ сиквенсов проводился с использованием программного обеспечения Chromas.

Проверенную конструкцию разводили до концентрации, используемой при микроинъекциях - 1нг/мкл.

2. Получение яйцеклеток мышей. Яйцеклетки для микроинъекции получали методом индукции суперовуляции. Для этого неполовозрелым самкам гибридам F₁(CBA×C57BL/6) весом 12-13 г внутрибрюшинно вводили 8 ед. гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (ГСЖК) и через 48 час - 8 ед. хорионического гонадотропина человека (ХгЧ). После такой обработки самок ссаживали с самцами-производителями F₁(CBA×C57BL/6). Факт спаривания констатировали на следующее утро по наличию копулятивной пробки.

Схема индукции суперовуляции: 12:00 - ГСЖК, через 48 часов - ХгЧ. В 17:00 этого же дня - подсадка к самцам-производителям. Отбор доноров производили на следующий день в 9:00. Световой режим в виварии был установлен с 7:00 до 19:00.

Отобранных самок-доноров умерщвляли, извлекали яйцеводы, затем вымывали яйцеклетки в среде HEPES-KSOM с добавлением гиалуронидазы. Процедуру проводили под бинокуляром (Zeiss Stemi DV4) с увеличением в 32 раза. Для вымывания яйцеклеток использовали стеклянные капилляры с внутренним диаметром примерно 100 мкм, изготовленные на пуллере Narishige PC-10 (Япония) и микрокузнице Narishige MF-900 (Япония).

3. Микроинъекции. Полученные зиготы культивировали в течение двух часов при t=37°C и 5% СО₂ в капле среды KSOM под минеральным маслом (Sigma, США), затем помещали в микроинъекционную камеру. Микроинъекции проводили в среде HEPES-KSOM под микроскопом Zeiss Axiovert 200М при увеличении в 400-600 раз, используя микроманипуляторы Narishige. Для изготовления игл для микроинъекций использовали пуллер Sutter instrument Со Р-97 (США), для изготовления удерживающей пипетки использовали пуллер Narishige PC-10 и микрокузницу Narishige MF-900.

После окончания микроинъекций выжившие зиготы переносили в каплю среды KSOM под минеральное масло (Sigma) и культивировали в течение 1 часа для выявления жизнеспособных эмбрионов.

4. Получение самок-реципиентов. Самок-реципиентов яйцеклеток получали следующим образом: половозрелых самок F₁(CBA×C57BL/6) весом не менее 24 г ссаживали с вазэктомированными самцами той же линии. Через 18 часов псевдобеременных реципиентов отбирали по наличию копулятивных пробок. Выжившие после микроинъекции зиготы трансплантировали в яйцеводы псевдобеременной самки. Одной псевдобеременной самке пересаживали 6-10 эмбрионов. Операцию проводили под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно).

5. Операция вазэктомирования. Операцию вазэктомирования проводили заранее под наркозом (смесь золетила и рометара, вводился внутрибрюшинно). Через надрез в коже и брюшной стенке вытягивали из брюшной полости семенник, придатки семенника и семявыносящий проток, после чего раскаленным пинцетом разрушали семявыносящий проток. Органы возвращали в брюшную полость, и повторяли всю процедуру на другом семявыносящем протоке. На завершающем этапе на брюшную стенку и на кожу накладывали швы с последующей антисептической обработкой операционного поля.

6. Получение новорожденных мышей. На 19 день после пересадки микроинъецированных эмбрионов реципиента умерщвляли путем цервикальной дислокации и проводили кесарево сечение, после чего выживших детенышей помещали к заранее подготовленной кормилице. Через 8-14 дней после рождения у мышат брали образец ткани, выделяли ДНК и анализировали наличие сдвига рамки считывания в целевой области генома методом секвенирования.

7. Для получения животных, гомозиготных по нокауту гена P2rx3, сначала скрещивали мышей F0 со сдвигом рамки считывания в целевой области генома с мышами дикого типа, а полученное F1 скрещивали между собой для получения животных поколения F2.

Анализ наличия сдвига рамки считывания в целевой области генома мышей производили методом секвенирования ПЦР-фрагмента. ДНК для ПЦР выделяли из тканей по стандартному протоколу. Амплификацию фрагментов ДНК проводили с помощью набора GenPak™ PCR Core (Isogene) в присутствии 10 пМ праймеров SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 в следующих режимах: денатурация 95°С - 3 мин; далее следовало 35 циклов: 95°С - 40 сек, 58°С - 40 сек; 72°С - 40 сек; и последний синтез 72°С - 2 мин. После прохождения реакции ПЦР-смесь очищали в 1,5% агарозном геле, полученный продукт выделяли набором Monarch DNA Gel Extraction Kit и секвенировали в компании Евроген и использованием праймера SEQ ID NO: 5. Полученные сиквенсы можно подразделить на три категории: сиквенсы дикого типа, последовательность в которых соответствует дикому типу, двоящиеся сиквенсы (фиг. 2), соответствующие мозаичным животным F0 и гетерозиготным трансгенным животным последующих поколений, и сиквенсы, на которых присутствует только мутантный вариант ДНК, соответствующие гомозиготным трансгенным животным последующих поколений.

Пример 1. Получение линии мышей с нуль-аллелем гена P2rx3, получившей название delACTT. Среди животных F0 по результатам секвенирования по Сэнгеру был выбран вариант с делецией 4х нуклеотидов в позициях 40-43, затем его скрестили с диким типом для получения генетически модифированных животных F1, полученных животных F1 скрещивали между собой для получения гомозиготных по нуль-аллелю гена P2rx3 животных (согласно п.7). Результаты секвенирования по Сэнгеру мышей поколений F1 и F2 линии delACTT представлены на фигуре 3.

Пример 2. Получение линии мышей с нуль-аллелем гена P2rx3, получившей название insT. Среди животных F0 по результатам секвенирования по Сэнгеру был выбран вариант с вставкой одного нуклеотида в позиции 40, его скрестили с диким типом для получения генетически модифированных животных F1, полученных животных F1 скрещивали между собой для получения гомозиготных по нуль-аллелю гена P2rx3 животных (согласно п.7). Результаты секвенирования по Сэнгеру мышей поколений F1 и F2 линии insT представлены на фигуре 4.

Пример 3. Тест-система для детекции отсутствия экспрессии гена P2rx3 у мышей линии delACTT на основе праймеров и флуоресцентных зондов для дискриминирования вариантов кДНК.

Исследование экспрессии P2rx3 проводилось с помощью количественного ПЦР с обратной транскрипцией с флуоресцентными зондами. Тотальная РНК была выделена из головной части эмбрионов мышей на E10-E14 линии delACTT, а также мышей дикого типа (wt) набором ExtractRNA (Евроген). Кроме того, РНК была выделена из эмбриональных (E17.5) фибробластов мыши дикого типа. Была синтезирована кДНК с использованием праймеров oligo(dT) ((SEQ ID NO: 12) ревертазой MMLV (Евроген) с 1 мкг РНК.

С кДНК была поставлена рутинная ПЦР с праймерами к началу первого экзона и перекрытию первого и второго экзонов кДНК P2rx3 (P2rx3 expr f (SEQ ID NO: 13), P2rx3 expr r (SEQ ID NO: 14). для предамплификации целевого фрагмента, поскольку проведение ПЦР в реальном времени без предамплификации давало неудовлетворительные результаты: подъем фрагмента на поздних циклах, неспецифические продукты, нестабильность фоновых линий флуоресценции. Ампликоны были использованы как матрица для дальнейшего qPCR после разведения в 200000 раз.

Для ПЦР в реальном времени использовались те же праймеры зонды ROX-delACTT и FAM-wt (SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16), комплементарные соответствующим аллелям. Реакция проводилась при температуре отжига 60.5° длительностью 20 секунд и элонгации 71° длительностью 25 секунд на полимеразе qPCR-HS (Евроген) в течение 40 циклов. Выбор температуры обусловлен повышением специфичности без снижения чувствительности метода.

Была подтверждена экспрессия мутантного P2rx3 одновременно с отсутствием экспрессии гена дикого типа в эмбрионах линии delACTT (фиг. 5).

--->

Информация о перечнях последовательностей:

Версия DTD: V1_3

Название файла: Способ получения генно-модифицированных лабораторных

животных с нуль-аллелем гена P2rx3.xml

Название программного обеспечения: WIPO Sequence

Версия программного обеспечения: 2.1.2

Дата производства: 2022-09-08

Общая информация:

Текущая заявка / Номер дела заявителя: non

Имя заявителя: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биологии гена Российской академии наук

Имя заявителя / Язык: ru

Имя заявителя / Имя латиницей: Institute of Gene Biology Russian

Academy of Sciences

Название изобретения: Способ получения генно-модифицированных

лабораторных животных с нуль-аллелем гена P2rx3 ( ru )

Общее количество последовательностей: 16

Последовательности:

Номер последовательности (ID): 1

Длина: 8484

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..8484

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

gagggcctat ttcccatgat tccttcatat ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag 60

ataattggaa ttaatttgac tgtaaacaca aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga 120

aagtaataat ttcttgggta gtttgcagtt ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat 180

atgcttaccg taacttgaaa gtatttcgat ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga 240

cgaaacaccg ggtcttcgag aagacctgtt ttagagctag aaatagcaag ttaaaataag 300

gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttg ttttagagct 360

agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gtttttagcg cgtgcgccaa ttctgcagac 420

aaatggctct agaggtaccc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc 480

ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc 540

aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc 600

caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tgtgcccagt 660

acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta 720

ccatggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 780

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 840

ggggggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg gcagccaatc 900

agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg cggccctata 960

aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgcgctg ccttcgcccc gtgccccgct 1020

ccgccgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc ccacaggtga 1080

gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagct gagcaagagg taagggttta 1140

agggatggtt ggttggtggg gtattaatgt ttaattacct ggagcacctg cctgaaatca 1200

ctttttttca ggttggaccg gtgccaccat ggactataag gaccacgacg gagactacaa 1260

ggatcatgat attgattaca aagacgatga cgataagatg gccccaaaga agaagcggaa 1320

ggtcggtatc cacggagtcc cagcagccga caagaagtac agcatcggcc tggacatcgg 1380

caccaactct gtgggctggg ccgtgatcac cgacgagtac aaggtgccca gcaagaaatt 1440

caaggtgctg ggcaacaccg accggcacag catcaagaag aacctgatcg gagccctgct 1500

gttcgacagc ggcgaaacag ccgaggccac ccggctgaag agaaccgcca gaagaagata 1560

caccagacgg aagaaccgga tctgctatct gcaagagatc ttcagcaacg agatggccaa 1620

ggtggacgac agcttcttcc acagactgga agagtccttc ctggtggaag aggataagaa 1680

gcacgagcgg caccccatct tcggcaacat cgtggacgag gtggcctacc acgagaagta 1740

ccccaccatc taccacctga gaaagaaact ggtggacagc accgacaagg ccgacctgcg 1800

gctgatctat ctggccctgg cccacatgat caagttccgg ggccacttcc tgatcgaggg 1860

cgacctgaac cccgacaaca gcgacgtgga caagctgttc atccagctgg tgcagaccta 1920

caaccagctg ttcgaggaaa accccatcaa cgccagcggc gtggacgcca aggccatcct 1980

gtctgccaga ctgagcaaga gcagacggct ggaaaatctg atcgcccagc tgcccggcga 2040

gaagaagaat ggcctgttcg gaaacctgat tgccctgagc ctgggcctga cccccaactt 2100

caagagcaac ttcgacctgg ccgaggatgc caaactgcag ctgagcaagg acacctacga 2160

cgacgacctg gacaacctgc tggcccagat cggcgaccag tacgccgacc tgtttctggc 2220

cgccaagaac ctgtccgacg ccatcctgct gagcgacatc ctgagagtga acaccgagat 2280

caccaaggcc cccctgagcg cctctatgat caagagatac gacgagcacc accaggacct 2340

gaccctgctg aaagctctcg tgcggcagca gctgcctgag aagtacaaag agattttctt 2400

cgaccagagc aagaacggct acgccggcta cattgacggc ggagccagcc aggaagagtt 2460

ctacaagttc atcaagccca tcctggaaaa gatggacggc accgaggaac tgctcgtgaa 2520

gctgaacaga gaggacctgc tgcggaagca gcggaccttc gacaacggca gcatccccca 2580

ccagatccac ctgggagagc tgcacgccat tctgcggcgg caggaagatt tttacccatt 2640

cctgaaggac aaccgggaaa agatcgagaa gatcctgacc ttccgcatcc cctactacgt 2700

gggccctctg gccaggggaa acagcagatt cgcctggatg accagaaaga gcgaggaaac 2760

catcaccccc tggaacttcg aggaagtggt ggacaagggc gcttccgccc agagcttcat 2820

cgagcggatg accaacttcg ataagaacct gcccaacgag aaggtgctgc ccaagcacag 2880

cctgctgtac gagtacttca ccgtgtataa cgagctgacc aaagtgaaat acgtgaccga 2940

gggaatgaga aagcccgcct tcctgagcgg cgagcagaaa aaggccatcg tggacctgct 3000

gttcaagacc aaccggaaag tgaccgtgaa gcagctgaaa gaggactact tcaagaaaat 3060

cgagtgcttc gactccgtgg aaatctccgg cgtggaagat cggttcaacg cctccctggg 3120

cacataccac gatctgctga aaattatcaa ggacaaggac ttcctggaca atgaggaaaa 3180

cgaggacatt ctggaagata tcgtgctgac cctgacactg tttgaggaca gagagatgat 3240

cgaggaacgg ctgaaaacct atgcccacct gttcgacgac aaagtgatga agcagctgaa 3300

gcggcggaga tacaccggct ggggcaggct gagccggaag ctgatcaacg gcatccggga 3360

caagcagtcc ggcaagacaa tcctggattt cctgaagtcc gacggcttcg ccaacagaaa 3420

cttcatgcag ctgatccacg acgacagcct gacctttaaa gaggacatcc agaaagccca 3480

ggtgtccggc cagggcgata gcctgcacga gcacattgcc aatctggccg gcagccccgc 3540

cattaagaag ggcatcctgc agacagtgaa ggtggtggac gagctcgtga aagtgatggg 3600

ccggcacaag cccgagaaca tcgtgatcga aatggccaga gagaaccaga ccacccagaa 3660

gggacagaag aacagccgcg agagaatgaa gcggatcgaa gagggcatca aagagctggg 3720

cagccagatc ctgaaagaac accccgtgga aaacacccag ctgcagaacg agaagctgta 3780

cctgtactac ctgcagaatg ggcgggatat gtacgtggac caggaactgg acatcaaccg 3840

gctgtccgac tacgatgtgg accatatcgt gcctcagagc tttctgaagg acgactccat 3900

cgacaacaag gtgctgacca gaagcgacaa gaaccggggc aagagcgaca acgtgccctc 3960

cgaagaggtc gtgaagaaga tgaagaacta ctggcggcag ctgctgaacg ccaagctgat 4020

tacccagaga aagttcgaca atctgaccaa ggccgagaga ggcggcctga gcgaactgga 4080

taaggccggc ttcatcaaga gacagctggt ggaaacccgg cagatcacaa agcacgtggc 4140

acagatcctg gactcccgga tgaacactaa gtacgacgag aatgacaagc tgatccggga 4200

agtgaaagtg atcaccctga agtccaagct ggtgtccgat ttccggaagg atttccagtt 4260

ttacaaagtg cgcgagatca acaactacca ccacgcccac gacgcctacc tgaacgccgt 4320

cgtgggaacc gccctgatca aaaagtaccc taagctggaa agcgagttcg tgtacggcga 4380

ctacaaggtg tacgacgtgc ggaagatgat cgccaagagc gagcaggaaa tcggcaaggc 4440

taccgccaag tacttcttct acagcaacat catgaacttt ttcaagaccg agattaccct 4500

ggccaacggc gagatccgga agcggcctct gatcgagaca aacggcgaaa ccggggagat 4560

cgtgtgggat aagggccggg attttgccac cgtgcggaaa gtgctgagca tgccccaagt 4620

gaatatcgtg aaaaagaccg aggtgcagac aggcggcttc agcaaagagt ctatcctgcc 4680

caagaggaac agcgataagc tgatcgccag aaagaaggac tgggacccta agaagtacgg 4740

cggcttcgac agccccaccg tggcctattc tgtgctggtg gtggccaaag tggaaaaggg 4800

caagtccaag aaactgaaga gtgtgaaaga gctgctgggg atcaccatca tggaaagaag 4860

cagcttcgag aagaatccca tcgactttct ggaagccaag ggctacaaag aagtgaaaaa 4920

ggacctgatc atcaagctgc ctaagtactc cctgttcgag ctggaaaacg gccggaagag 4980

aatgctggcc tctgccggcg aactgcagaa gggaaacgaa ctggccctgc cctccaaata 5040

tgtgaacttc ctgtacctgg ccagccacta tgagaagctg aagggctccc ccgaggataa 5100

tgagcagaaa cagctgtttg tggaacagca caagcactac ctggacgaga tcatcgagca 5160

gatcagcgag ttctccaaga gagtgatcct ggccgacgct aatctggaca aagtgctgtc 5220

cgcctacaac aagcaccggg ataagcccat cagagagcag gccgagaata tcatccacct 5280

gtttaccctg accaatctgg gagcccctgc cgccttcaag tactttgaca ccaccatcga 5340

ccggaagagg tacaccagca ccaaagaggt gctggacgcc accctgatcc accagagcat 5400

caccggcctg tacgagacac ggatcgacct gtctcagctg ggaggcgaca aaaggccggc 5460

ggccacgaaa aaggccggcc aggcaaaaaa gaaaaagtaa gaattcctag agctcgctga 5520

tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct 5580

tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca 5640

tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag 5700

ggggaggatt gggaagagaa tagcaggcat gctggggagc ggccgcagga acccctagtg 5760

atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 5820

gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 5880

ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc 5940

atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 6000

tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgcctt agcgcccgct cctttcgctt 6060

tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 6120

tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg 6180

gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 6240

agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aactctatct 6300

cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggtctattgg ttaaaaaatg 6360

agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat 6420

ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc 6480

caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag 6540

ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg 6600

cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg 6660

tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat 6720

ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc 6780

aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct 6840

tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag 6900

atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta 6960

agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc 7020

tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca 7080

tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg 7140

atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg 7200

ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca 7260

tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa 7320

acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa 7380

ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata 7440

aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat 7500

ctggagccgg tgagcgtgga agccgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc 7560

cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata 7620

gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt 7680

actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga 7740

agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag 7800

cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa 7860

tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag 7920

agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg 7980

ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat 8040

acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta 8100

ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg 8160

gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc 8220

gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa 8280

gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc 8340

tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt 8400

caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct 8460

tttgctggcc ttttgctcac atgt 8484

Номер последовательности (ID): 2

Длина: 23

Тип молекулы: RNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..23

> mol_type, other RNA

> organism, Mus musculus

Остатки:

caccgacttg gtagtctcgt agg 23

Номер последовательности (ID): 3

Длина: 23

Тип молекулы: RNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..23

> mol_type, other RNA

> organism, Mus musculus

Остатки:

ctacgagact accaagtcgg tgg 23

Номер последовательности (ID): 4

Длина: 20

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

gaaatgtggg gaggggtctg 20

Номер последовательности (ID): 5

Длина: 20

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

agctggtgag ctgggataga 20

Номер последовательности (ID): 6

Длина: 20

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

cggtgcttgt ggctttaacc 20

Номер последовательности (ID): 7

Длина: 25

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..25

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

caccgcaccg acttggtagt ctcgt 25

Номер последовательности (ID): 8

Длина: 25

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..25

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

aaacacgaga ctaccaagtc ggtgc 25

Номер последовательности (ID): 9

Длина: 25

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..25

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

caccgctacg agactaccaa gtcgg 25

Номер последовательности (ID): 10

Длина: 24

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..24

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

aaacccgact tggtagtctc gtag 24

Номер последовательности (ID): 11

Длина: 21

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..21

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

gagggcctat ttcccatgat t 21

Номер последовательности (ID): 12

Длина: 15

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..15

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

tttttttttt ttttt 15

Номер последовательности (ID): 13

Длина: 21

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..21

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

ccattaagca gcccactcca g 21

Номер последовательности (ID): 14

Длина: 21

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..21

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

gtgcaagaaa acccacccca c 21

Номер последовательности (ID): 15

Длина: 21

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..21

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

ctacgagact acccggtggt t 21

Номер последовательности (ID): 16

Длина: 25

Тип молекулы: DNA

Характеристики Местоположение/Квалификаторы:

- source, 1..25

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Остатки:

ctacgagact accaagtcgg tggtt 25

END

<---

Claims (13)

1. Плазмидная конструкция px330+P2rx3-sg1 для получения трансгенных мышей, гомозиготных по нуль-аллелю гена P2rx3, полученная на основе вектора px330 последовательностью SEQ ID NO: 1, кодирующая ОРС гена spCas9 под контролем CAG промотора и экспрессирующая гидовую РНК sg1 последовательностью SEQ ID NO: 2 против соответствующего участка гена P2rx3, под контролем U6 промотора.

2. Плазмидная конструкция px330+P2rx3-sg2 для получения трансгенных мышей, гомозиготных по нуль-аллелю гена P2rx3, полученная на основе вектора px330 последовательностью SEQ ID NO: 1, кодирующая ОРС гена spCas9 под контролем CAG промотора и экспрессирующая гидовую РНК sg2 последовательностью SEQ ID NO: 3 против соответствующего участка гена P2rx3, под контролем U6 промотора.

3. Линия мышей, гомозиготных по нуль-аллелю гена P2rx3, с полным отсутствием экспрессии пуринергического рецептора P2X3 для тестирования веществ на роль блокатора P2X3, трансформированная плазмидной конструкцией по пп.1, 2 и несущая нуль-аллель гена P2rx3, отличающаяся тем, что ген P2rx3 несет делецию четырех нуклеотидов в позициях 40-43.

4. Линия мышей, гомозиготных по нуль-аллелю гена P2rx3, с полным отсутствием экспрессии пуринергического рецептора P2X3 для тестирования веществ на роль блокатора P2X3, трансформированная плазмидной конструкцией по пп.1, 2 и несущая нуль-аллель гена P2rx3, отличающаяся тем, что ген P2rx3 несет вставку одного нуклеотида в позиции 40.

5. Способ получения двух линий мышей по пп.3 и 4, гомозиготных по нуль-аллелю гена P2rx3, с полным отсутствием экспрессии пуринергического рецептора P2X3 для тестирования веществ на роль блокатора P2X3, характеризующийся следующими стадиями:

а) микроинъекция одновременно двух плазмидных конструкций по пп.1, 2 в пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки мыши гибрида первого поколения CBA×C57BL/6;

б) выявление жизнеспособных зигот;

в) пересадка выживших зигот из пункта (б) псевдобеременным самкам-реципиентам, имеющим копулятивную пробку после ссаживания с вазэктомированными самцами;

г) получение новорожденных мышей на 19 день после пересадки зигот из пункта (в);

д) проведение анализа наличия сдвига рамки считывания в первом экзоне гена P2rx3 через 8-14 дней после рождения мышей (г) путем амплификации целевого участка гена P2rx3 с праймерами, имеющими последовательности SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, с последующим секвенированием фрагмента с использованием праймера последовательностью SEQ ID NO: 6;

е) отбор мышей, несущих целевую мутацию;

ж) проведение скрещивания мышей из пункта (е) с мышами дикого типа для получения самок-гетерозигот или мутантных самцов, несущих целевую мутацию.

з) проведение скрещивания мышей из пункта (ж) для получения итоговой линии мышей, гомозиготных по нуль-аллелю гена P2rx3.