CN112301058A - 一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用 - Google Patents

一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明人涉及一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用。具体地,本发明对XCT/SLC7A11基因编码序列进行了针对性特殊优化设计,从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞中高效表达XCT/SLC7A11蛋白的核苷酸序列,并构建了一种表达XCT/SLC7A11蛋白的重组AAV病毒。本发明的重组AAV病毒在小鼠细胞内的感染效果优异,且在细胞核内稳定表达,是一种稳定的重组腺相关病毒载体,能显著降低小鼠眼压,增加小鼠RGCs的存活率,因此可用于制备治疗青光眼视网膜神经节细胞变性的药物,具有广泛的市场前景。

Description

一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体地说,是一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用。
背景技术
青光眼(glaucoma)是一组以特征性视神经萎缩和视野缺损为共同特征的疾病,病理性眼压增高是其主要危险因素。目前已经认识到,青光眼属于一种神经变性性疾病,其病理特征是视网膜神经节细胞(retinal ganglion cell,RGC)的凋亡及其轴突的变性,以及伴随而来的视功能进行性丧失。RGC负责向大脑输出由视网膜捕捉到的视觉信号,由于高眼压、多种遗传因素或神经退行性病变等引起的RGC持续变性或凋亡,可导致视神经乳头病变、视野缺失,进而发展为青光眼。
青光眼病理机制复杂,有遗传和环境等因素参与,但其确切分子机制尚不明确。部分青光眼患者表现为高眼压,在临床可采取降眼压等对症治疗手段,但在长期无法逆转或延缓青光眼的发展。有研究发现,氧化应激损伤是青光眼高眼压损伤发生发展的一个重要病理机制,近年研究认为xCT/slc7a11调节细胞内GSH合成从而维持细胞内氧化还原平衡可能是RGCs细胞的重要抗氧化保护信号通路。xCT/slc7a11为Na+非依赖性谷氨酸/胱氨酸转运蛋白,位于RGCs细胞膜上,xCT/slc7a11的表达受到复杂信号分子网络调控,包括Nrf2、REST等转录调控,以及H3K27表观遗传调控等。
研究发现在氧化应激环境下,xCT/slc7a11合成增加,并转移、定位于RGCs细胞膜上,发挥1:1反向转运谷氨酸、胱氨酸功能,即将1个谷氨酸转运至细胞外同时将1个胱氨酸转运至细胞内。转运进入细胞内的胱氨酸经过一系列酶促反应,最终在谷胱甘肽合成酶催化下生成GSH,发挥强效抗氧化作用,维持细胞内氧化还原平衡。xCT/slc7a11信号通路在正常RGC中处于静默状态,而轴突损伤后大部分RGC无法有效激活xCT/slc7a11通路而最终凋亡,有研究证实激活xCT/slc7a11通路可促进RGC在轴突损伤后存活,提示xCT/slc7a11通路对RGC在轴突损伤后存活很关键。因此,在各种视神经变性疾病中,增强RGC中xCT/slc7a11信号通路可能是防止RGC变性,促进RGC存活及轴突再生的有效治疗措施。
然而,目前利用xCT/slc7a11信号通路治疗眼部疾病的研究还有许多限制和不足,本领域迫切需要开发有效治疗视网膜神经节细胞变性疾病的方法和治疗药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组腺相关病毒载体及其制备方法和治疗视网膜神经节细胞变性疾病的应用。
具体地,本发明的第一个目的是,针对现有技术中的不足,提供一种重组腺相关病毒载体。
本发明的第二个目的是,提供一种所述重组腺相关病毒载体的制备方法。
本发明的第三个目的是,提供一种药物组合物。
本发明的第四个目的是,提供一种所述重组腺相关病毒载体的应用。
本发明的第五个目的是,提供一种治疗青光眼的方法。
为实现上述第一个目的,本发明采取的技术方案是:
一种重组腺相关病毒载体,所述的腺相关病毒载体含有增强子、特异性或非特异性启动子、表达xCT/slc7a11蛋白的基因序列,xCT/slc7a11蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地,所述表达xCT/slc7a11蛋白的基因序列选自与SEQ ID NO:1有至少96%、97%、98%、99%、100%同源性的核苷酸序列。
更优选地,所述表达xCT/slc7a11蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地,所述增强子/启动子为CMV,选自与SEQ ID NO:4有至少95%同源性的核苷酸序列。
更优选地,所述增强子/启动子为CMV的序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地,所述腺相关病毒可以选自AAV1,AAV2,AAV3,AAV4,AAV5,AAV6,AAV7,AAV8,AAV9,AAV10,AAV2-AAV3,AAVrh.10,AAVhu.14,AAV3a/3b,AAVrh32.33,AAVHSC15,AAV-HSC17,AAVhu.37,AAVrh.8,CHt-P6,AAV2.5,AAV6.2,AAV2i8,AAV-HSC15/17,AAVM41,AAV9.45,AAV6(Y445F/Y731F),AAV2.5T,AAV-HAE1/2,AAVclone 32/83,AAVShH10,AAV2(Y->F),AAV8(Y733F),AAV2.15,AAV2.4,AAVM41,AAVr3.45,AAV2或AAV5。
更优选地,所述腺相关病毒为AAV2。
更优选地,所述腺相关病毒为单链AAV2。
优选地,所述的重组腺相关病毒载体还含有一段缩短的嵌合内含子,所述的嵌合内含子序列选自与SEQ ID NO:5有至少90%同源性的核苷酸序列。
优选地,所述重组腺相关病毒载体含有CMV增强子/启动子、表达xCT/slc7a11的基因序列、β-globin内含子、hGHpA(human growth hormone poly(A)tail)、L-ITR、R-ITR、Ampicillin、f1ori。
更优选地,所述表达xCT/slc7a11蛋白的基因序列如SEQ ID NO:1所示,所述L-ITR序列如SEQ ID NO:3所示,所述CMV增强子/启动子序列SEQ ID NO:4所示,所述β-globin内含子序列如SEQ ID NO:5所示,所述hGHpA序列如SEQ ID NO:7所示,所述R-ITR序列如SEQID NO:8所示,所述Ampicill in序列如SEQ ID NO:9所示,所述f1ori序列如SEQID NO:11所示。
优选地,所述的重组腺相关病毒载体序列含有SEQ ID NO:10。
更优选地,所述的重组腺相关病毒载体序列如SEQ ID NO:12所示。
为实现上述第二个目的,本发明采取的技术方案是:
一种如上任一所述的重组腺相关病毒载体的制备方法,包括如下步骤:
1)构建重组质粒AAV_xCT/slc7a11,主要元件包括CMV增强子/启动子及xCT/slc7a11基因序列;
2)将含有AAV外壳蛋白基因和能帮助AAV复制的基因的辅助质粒和AAV_xCT/slc7a11质粒与HEK 293T细胞共转染,初步形成重组腺相关病毒载体;
3)将上述重组腺相关病毒载体经碘克丁醇初步纯化后,经过以5ml-Hitrp Q琼脂糖凝胶作为填料的快速蛋白液相色谱仪通过离子交换层析进一步纯化;
4)之后用pH=8.0,215mM的NaCl淋洗琼脂糖凝胶柱,对峰值的重组腺相关病毒载体进行收集;
5)收集的液体通过浓缩器后,用含0.014%的吐温20淋洗浓缩器对重组腺相关病毒载体进行浓缩,用DNase I消化掉浓缩液中病毒颗粒以外DNA,并通过实时荧光定量PCR的方法确定病毒的滴度;
6)最后用硝酸银染色-SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳法确保重组腺相关病毒载体颗粒没被污染且不含内毒素,并分装零下80℃储存。
为实现上述第三个目的,本发明采取的技术方案是:
一种治疗青光眼视网膜神经节细胞变性的药物组合物,所述的药物组合物含有如上任一所述的重组腺相关病毒载体和药学上可接受的载体,所述的药物组合物表达xCT/slc7a11蛋白。
为实现上述第四个目的,本发明采取的技术方案是:
如上任一所述的腺相关病毒载体在制备治疗青光眼视网膜神经节细胞变性的药物中的应用。
为实现上述第五个目的,本发明采取的技术方案是:
一种治疗青光眼的方法,将如上任一所述的腺相关病毒载体给予需要治疗的个体。
优选地,给药方法为眼内注射。
更优选地,所述的眼内注射为视网膜下腔注射或玻璃体腔注射。
在本发明的第一方面,提供了一种表达盒,所述表达盒从5’-3’端具有式I结构:
Z1-Z2-Z3-Z4(I)
式中,各“-”独立地为键或核苷酸连接序列;
Z1为增强子和/或启动子;
Z2为无或内含子;
Z3为编码XCT/SLC7A11蛋白的核苷酸序列;和
Z4为任选的hGHpA(human growth hormone poly(A)tail)序列。
在另一优选例中,所述的核苷酸序列选自下组:
(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示;和
(b)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95%相同性,优选地≥98%,更优选地≥99%;
(c)与(a)或(b)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在另一优选例中,所述核苷酸序列包括DNA序列、cDNA序列、或mRNA序列。
在另一优选例中,所述核苷酸序列包括单链序列和双链序列。
在另一优选例中,所述核苷酸序列包括与SEQ ID NO.:1完全互补的核苷酸序列。
在另一优选例中,所述XCT/SLC7A11蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
在另一优选例中,所述的启动子包括组织特异性启动子。
在另一优选例中,所述增强子和/或启动子为CMV增强子/启动子。
在另一优选例中,所述CMV增强子/启动子的核苷酸序列与SEQ ID NO.:4所示的核苷酸序列有≥95%相同性,优选地≥98%,更优选地≥99%。
在另一优选例中,所述CMV增强子/启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示。
在另一优选例中,所述内含子为β-globin内含子。
在另一优选例中,所述内含子的核苷酸序列与SEQ ID NO.:5所示的核苷酸序列有≥95%相同性,优选地≥98%,更优选地≥99%。
在另一优选例中,所述内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示。
在另一优选例中,所述hGHpA的核苷酸序列与SEQ ID NO.:7所示的核苷酸序列有≥95%相同性,优选地≥98%,更优选地≥99%。
在另一优选例中,所述hGHpA的核苷酸序列如SEQ ID NO.:7所示。
在另一优选例中,各个核苷酸连接序列的长度为0-30nt,较佳地1-15nt。
在本发明的第二方面,提供了一种载体,所述载体含有如本发明第一方面所述的表达盒。
在另一优选例中,所述载体包含一个或多个启动子,所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、内含子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。
在另一优选例中,所述的载体包括质粒、病毒载体。
在另一优选例中,所述的载体包括DNA病毒、逆转录病毒载体。
在另一优选例中,所述的载体选自下组:慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、或其组合。较佳地,所述载体为AAV载体。
在另一优选例中,所述载体为含有或插入有编码XCT/SLC7A11蛋白的核苷酸序列的AAV载体。
在另一优选例中,所述载体用于表达人XCT/SLC7A11蛋白。
在本发明的第三方面,提供了一种腺相关病毒载体,所述腺相关病毒载体含有如在本发明的第一方面所述的表达盒。
在另一优选例中,所述腺相关病毒的血清型选自下组:AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV2-AAV3、AAVrh.10、AAVhu.14、AAV3a/3b、AAVrh32.33、AAVHSC15、AAV-HSC17、AAVhu.37、AAVrh.8、CHt-P6、AAV2.5、AAV6.2、AAV2i8、AAV-HSC15/17、AAVM41、AAV9.45、AAV6(Y445F/Y731F)、AAV2.5T、AAV-HAE1/2、AAV clone32/83、AAVShH10、AAV2(Y->F)、AAV8(Y733F)、AAV2.15、AAV2.4、AAVM41、AAVr3.45、AAV2或AAV5、或其组合。
在另一优选例中,所述腺相关病毒为AAV2,较佳地,所述腺相关病毒为单链AAV2。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体用于治疗眼部疾病。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体具有式II结构:
A1-Z1-Z2-Z3-Z4-A2-A3(I)
式中,各“-”独立地为键或核苷酸连接序列;
A1为L-ITR序列;
Z1为CMV增强子/启动子;
Z2为β-globin内含子;
Z3为编码XCT/SLC7A11蛋白的核苷酸序列;
Z4为hGHpA序列;
A2为R-ITR序列;
A3为任选的标签序列;和
A4为任选的f1ori序列。
在另一优选例中,所述L-ITR序列如SEQ ID NO.:3所示。
在另一优选例中,所述R-ITR序列如SEQ ID NO.:8所示。
在另一优选例中,所述的标签包括抗性标记和荧光素标记。
在另一优选例中,所述的标签序列为Ampici llin序列,较佳地,所述标签序列如SEQ ID NO.:9所示。
在另一优选例中,所述f1ori序列如SEQ ID NO.:11所示。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体的序列包含SEQ ID NO.:10所示的序列(SEQ ID NO.:10是未插入目的基因的载体的核苷酸序列)。
在另一优选例中,所述腺相关病毒载体的序列如SEQ ID NO.:12所示(SEQ IDNO.:12是插入目的基因后的载体的核苷酸序列)。
在本发明的第四方面,提供了一种宿主细胞,所述宿主细胞含有本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的腺相关病毒载体,或其染色体中整合有外源的本发明第一方面所述的表达盒。
在另一优选例中,所述宿主细胞为哺乳动物细胞,所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。
在另一优选例中,所述宿主细胞选自下组:HEK细胞、感光细胞(包括视锥细胞和/或视杆细胞)、其他视觉细胞(如双极细胞、水平细胞)、(视)神经细胞、或其组合。
在另一优选例中,所述宿主细胞选自下组:视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。
在本发明的第五方面,提供了一种本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的腺相关病毒载体的用途,用于制备一制剂或组合物,所述制剂或组合物用于治疗眼部疾病。
在另一优选例中,所述制剂或组合物用于治疗视网膜神经节细胞变性疾病。
在另一优选例中,所述制剂或组合物用于降低眼压和/或增加RGCs存活率。
在另一优选例中,所述视网膜神经节细胞变性疾病选自下组:青光眼、遗传性视神经病变、视网膜色素变性、或其组合。
在本发明的第三六方面,提供了一种药物制剂,所述的制剂含有(a)本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的腺相关病毒载体,以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中,所述药物制剂的剂型选自下组:冻干制剂、液体制剂、或其组合。
在另一优选例中,所述药物制剂中载体的含量为1×109-1×1016个病毒/毫升,较佳地1×1012-1×1013个病毒/毫升。
在另一优选例中,所述药物制剂用于治疗眼部疾病。
在另一优选例中,所述药物制剂用于治疗视网膜神经节细胞变性疾病。
在另一优选例中,所述药物制剂用于降低眼压和/或增加RGCs存活率。
在本发明的第七方面,提供了一种治疗方法,所述方法包括将本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的腺相关病毒载体施用于需要的对象。
在另一优选例中,将所述腺相关病毒载体注射到需要的对象的眼睛内。
在另一优选例中,所述的注射包括视网膜下腔注射、玻璃体腔注射。
在另一优选例中,所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。
在另一优选例中,所述治疗方法为治疗眼部疾病的方法。
在本发明的第八方面,提供了一种XCT/SLC7A11蛋白的制备方法,包括培养本发明第四方面所述的宿主细胞,从而得到XCT/SLC7A11蛋白。
在本发明的第九方面,提供了一种制备本发明第二方面所述的载体或本发明第三方面所述的腺相关病毒载体的方法,包括步骤:
1)构建重组质粒AAV_xCT/slc7a11,主要元件包括CMV增强子/启动子及xCT/slc7a11基因序列;
2)将含有AAV外壳蛋白基因和能帮助AAV复制的基因的辅助质粒和AAV_xCT/slc7a11质粒与HEK 293T细胞共转染,初步形成重组腺相关病毒载体;
3)将上述重组腺相关病毒载体经碘克丁醇初步纯化后,经过以5ml-Hitrp Q琼脂糖凝胶作为填料的快速蛋白液相色谱仪通过离子交换层析进一步纯化;
4)之后用pH=8.0,215mM的NaCl淋洗琼脂糖凝胶柱,对峰值的重组腺相关病毒载体进行收集;
5)收集的液体通过浓缩器后,用含0.014%的吐温20淋洗浓缩器对重组腺相关病毒载体进行浓缩,用DNase I消化掉浓缩液中病毒颗粒以外DNA,并通过实时荧光定量PCR的方法确定病毒的滴度;
6)最后用硝酸银染色-SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳法确保重组腺相关病毒载体颗粒没被污染且不含内毒素,并分装-80℃储存。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了病毒载体AAV_xCT/slc7a11的特征图谱及各元件的起止位点。
图2显示了C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射AAV_xCT/slc7a11两周后视网膜铺片的免疫荧光染色图。
图3显示了实验小鼠视网膜铺片的免疫荧光染色图。具体地,C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射AAV_xCT/slc7a11或AAV-GFP,并同时在注射眼前方注射磁珠微粒造成青光眼,分别于2周、4周、8周后视网膜铺片的免疫荧光染色图。
图4显示了免疫荧光染色后进行RGC计数和存活率的分析结果图。C57BL/6J小鼠玻璃体腔注射AAV_xCT/slc7a11或AAV-GFP并同时在注射眼前方注射磁珠微粒造成青光眼,分别于2周、4周、8周后视网膜铺片。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究,对XCT/SLC7A11基因编码序列进行了针对性特殊优化设计,从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞中高效表达XCT/SLC7A11蛋白的核苷酸序列,并构建了一种表达XCT/SLC7A11蛋白的重组AAV病毒。实验结果表明,本发明的重组AAV病毒在小鼠细胞内的感染效果优异,且在细胞核内稳定表达,是一种稳定的重组腺相关病毒载体,能显著降低小鼠眼压,增加小鼠RGCs的存活率,因此可用于制备治疗青光眼视网膜神经节细胞变性的药物,具有广泛的市场前景。
术语
为了可以更容易地理解本公开,首先定义某些术语。如本申请中所使用的,除非本文另有明确规定,否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。
术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成,其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用,术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之,所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%)比较两个对齐的序列,并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地,这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。
如本文使用的,术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。
xCT/slc7a11
xCT/slc7a11为Na+非依赖性谷氨酸/胱氨酸转运蛋白,位于RGCs细胞膜上,xCT/slc7a11的表达受到复杂信号分子网络调控,包括Nrf2、REST等转录调控,以及H3K27表观遗传调控等。
研究发现在氧化应激环境下,xCT/slc7a11合成增加,并转移、定位于RGCs细胞膜上,发挥1:1反向转运谷氨酸、胱氨酸功能,即将1个谷氨酸转运至细胞外同时将1个胱氨酸转运至细胞内。转运进入细胞内的胱氨酸经过一系列酶促反应,最终在谷胱甘肽合成酶催化下生成GSH,发挥强效抗氧化作用,维持细胞内氧化还原平衡。xCT/slc7a11信号通路在正常RGC中处于静默状态,而轴突损伤后大部分RGC无法有效激活xCT/slc7a11通路而最终凋亡,有研究证实激活xCT/slc7a11通路可促进RGC在轴突损伤后存活,提示xCT/slc7a11通路对RGC在轴突损伤后存活很关键。因此,在各种视神经变性疾病中,增强RGC中xCT/slc7a11信号通路可能是防止RGC变性,促进RGC存活及轴突再生的有效治疗措施。
核酸编码序列
本发明提供了一种优化后的XCT/SLC7A11编码序列,如SEQ ID NO:1所示。经研究发现,本发明优化的XCT/SLC7A11编码序列(SEQ ID NO.:1),XCT/SLC7A11蛋白表达效率更高,可以更有效地降低眼压,增加小鼠RGCs的存活率,有效的治疗青光眼。
本发明所述的编码XCT/SLC7A11蛋白的核酸,其核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。在另一优选例中,所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95%相同性,优选地≥98%,更优选地≥99%。。
本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。在另一优选例中,所述核苷酸为DNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO.:2所示的氨基酸序列。
XCT/SLC7A11蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。核酸序列可以是基因组的、重组的或合成的。核酸序列可以是分离的或纯化的。核酸序列可以是单链或双链的。优选地,核酸序列将编码如本文描述的XCT/SLC7A11蛋白。核酸序列可以通过克隆衍生,例如使用包括限制性酶切、连接、凝胶电泳的标准的分子克隆技术,例如在Sambrook等Molecular Cloning:Alaboratory manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press)中描述的。核酸序列可是分离的,例如使用PCR技术分离的。分离意指从任何杂质和从被自然地发现与其来源中的核酸序列缔合的其他核酸序列和/或蛋白中分离核酸序列。优选地,其还将不含细胞材料、培养基或来自纯化/生产过程的其他化学物质。核酸序列可以是合成的,例如通过直接的化学合成产生。核酸序列可以作为裸露的核酸被提供,或可与蛋白或脂质复合提供。
本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法,可根据已公开的有关核苷酸序列,尤其是开放阅读框序列来设计引物,并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板,扩增而得有关序列。当序列较长时,常常需要进行两次或多次PCR扩增,然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。
如本文所用,“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质,原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的,但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开,则为分离纯化的。
在本发明较佳的实施方式中,所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择,并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体,以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞,以及经重组技术利用所述宿主细胞表达XCT/SLC7A11蛋白的方法。
通过常规的重组DNA技术,可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明XCT/SLC7A11蛋白的宿主细胞(如哺乳动物细胞)。一般来说包括步骤:将本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体转导入宿主细胞内。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多肽的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上,以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外,表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因,以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状,如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP),或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体,可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达多肽。
宿主细胞可以是原核细胞,或是低等真核细胞,或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。代表性例子有:CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中,选择293T细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、神经细胞为宿主细胞。在另一优选例中,所述宿主细胞选自下组:视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时,能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获,用CaCl2法处理,所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl2。如果需要,转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物,可选用如下的DNA转染方法:磷酸钙共沉淀法,常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养,表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞,培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后,用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子,将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
腺相关病毒
因腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)较其他病毒载体小,无致病性,可转染正在分裂和未分裂的细胞等特性,基于AAV载体的针对眼部特别是遗传性视网膜退行性病变的基因治疗方法受到了广泛的关注。
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒,需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白,rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。
重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒,由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低,在体内表达外源基因时间长等特点,被视为最有前途的基因转移载体之一,在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究,重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解,尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中,rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验);同时作为一种有特点的基因转移载体,还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。
在本发明一个优选的实施例中,载体为重组AAV载体。AAV是相对较小的DNA病毒,其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响,并且它们似乎并不涉及人体病理学。AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域,其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域:包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分;以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。
AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006,它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请No.PCT/US2005/027091中有所描述,该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和WO93/09239;美国专利No.4,797,368、6,596,535和5,139,941,以及欧洲专利No.0488528,它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于AAV的构建体,以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组AAV可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备:所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的质粒,和携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。
在一些实施方案中,重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16的AAV病毒粒子)中。因此,本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域己知的,并在美国专利No.6,596,535中有所描述。
表达载体和宿主细胞
本发明还提供了一种用于XCT/SLC7A11蛋白的表达载体,它含有本发明的优化XCT/SLC7A11编码序列。
通过提供的序列信息,熟练的技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入细胞的核酸序列或载体。
优选地,编码XCT/SLC7A11蛋白的核酸序列作为载体,优选地表达载体被提供。优选地,其可作为优选地适用于在视网膜靶细胞中转导和表达的基因治疗载体被提供。载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。病毒载体包括源自以下的那些病毒载体:腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、MMLV、GaLV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、HIV、痘病毒和SV40。优选地,病毒载体是复制缺陷的(replication defective),尽管设想其可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶视网膜细胞的基因组。用于向视网膜靶细胞引入编码XCT/SLC7A11蛋白的核酸序列的优选的病毒载体是AAV载体,例如自身互补的腺相关病毒(scAAV)。使用特定的AAV血清型(AAV血清型2到AAV血清型12)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本(包括AAV 4YF和AAV 7m8载体)可以实现选择性靶向。
在另一优选例中,本发明所用的腺相关病毒为AAV2,较佳地,所述腺相关病毒为单链AAV2。
病毒载体可被修饰以缺失任何非必需的序列。例如,AAV中,病毒可被修饰以缺失全部或部分的IX基因、Ela和/或Elb基因。对于野生型AAV,没有辅助病毒诸如腺病毒的存在,复制是非常低效率的。对于重组的腺相关病毒,优选地,复制基因和衣壳基因以反式被提供(在pRep/Cap质粒中),并且仅AAV基因组的2ITR被保留并且包装进入病毒体,同时需要的腺病毒基因被被腺病毒或另一个质粒提供。也可对慢病毒载体做出类似的修饰。
病毒载体具有进入细胞的能力。然而,非病毒载体诸如质粒可与剂复合以有利于病毒载体被靶细胞的摄取。此类剂包括聚阳离子剂。可选地,递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用,并且优选地适于在人类中使用。
载体将优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、内含子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记,例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在视网膜靶细胞中的表达。
“可操作地连接”意指,核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关,以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如,与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。
启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。启动子可以指导在内视网膜细胞中遍在的表达,或神经元特异的表达。在后一种情况中,启动子可以指导细胞类型特异的表达,例如对给视神经节细胞。合适的启动子将是本领域技术人员己知的。例如,合适的启动子可以选自由以下组成的组:L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增强子SV40融合蛋白。使用细胞特异的启动子可以实现靶向,例如Grm6-SV40用于选择性靶向给视神经细胞。Grm6启动子是Grm6基因的200碱基对增强子序列和SV40真核启动予的融合体,Grm6基因编码给视神经细胞特异的代谢型谷氨酸受体mGluR6。Grm6基因的优选的来源是小鼠和人类。使用泛-神经元的启动子可以实现遍在的表达,其实例在本领域是己知的并且可得的。一个此类实例是CAG。CAG启动子是CMV早期增强子和鸡β肌动蛋白启动子的融合体。
合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而,也可使用其他组成型启动子序列,包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子,诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地,本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关,其能够当这样的表达是期望的时,打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达,或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
许多表达载体可应用XCT/SLC7A11蛋白在哺乳动物细胞(较佳地为人,更佳地为人视神经细胞或感光细胞)表达。本发明优选用腺相关病毒作为表达载体。
本发明还提供一种XCT/SLC7A11优化编码序列的重组应用腺相关病毒载体的构建方法,该方法能快速,简便地构建携带XCT/SLC7A11优化编码序列的重组腺相关病毒载体,并包装获得复杂缺陷腺相关病毒载体。
在另一优选例中,本发明所述的携带XCT/SLC7A11优化编码序列的腺相关病毒载体的序列如SEQ ID NO.:12所示。其中,所述表达xCT/slc7a11蛋白的基因序列如SEQ IDNO:1所示,L-ITR序列如SEQ ID NO:3所示,CMV增强子/启动子序列如SEQ ID NO:4所示,β-globin内含子序列如SEQ ID NO:5所示,hGHpA序列如SEQ ID NO:7所示,R-ITR序列如SEQID NO:8所示,Ampicillin序列如SEQ ID NO:9所示,f1ori序列如SEQ ID NO:11所示。
基因治疗载体
本发明中的基因治疗载体是病毒表达载体,根据本发明,病毒表达载体是腺相关病毒(AAV)载体,诸如选自由血清型AAV1、2、3、4、5、6、7、8、9和10,或其衍生的嵌合AAV组成的组中的AAV载体如AAV2-AAV3,AAVrh.10,AAVhu.14,AAV3a/3b,AAVrh32.33,AAVHSC15,AAV-HSC17,AAVhu.37,AAVrh.8,CHt-P6,AAV2.5,AAV6.2,AAV2i8,AAV-HSC15/17,AAVM41,AAV9.45,AAV6(Y445F/Y731F),AAV2.5T,AAV-HAE1/2,AAV clone 32/83,AAVShH10,AAV2(Y->F),AAV8(Y733F),AAV2.15,AAV2.4,AAVM41,AAVr3.45,AAV2或AAV5,这能更好地适于在感兴趣的组织中进行高效率的转导。在转染时,AAV只在宿主中引起轻微的免疫反应(如果有的话)。在本发明的优选实施方式中,基因治疗载体是AAV血清型2或5载体。在进一步优选的实施方式中,基因治疗载体是AAV 2载体。
本发明的AAV载体为单链AAV,可根据标准技术生产重组病毒载体。例如,重组腺相关病毒载体能在人293细胞(其提供反式E1A和E1B特性)中传播,以达到在107~1013个病毒颗粒/mL范围内的滴度。在体内应用之前,病毒载体可通过凝胶过滤方法(诸如琼脂糖柱)进行脱盐,并通过随后的过滤进行纯化。纯化降低给药载体的主体中潜在的有害作用。所给药的病毒基本上不含野生型病毒和可复制型病毒。能通过合适的方法,诸如十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),随后进行银染,来证明病毒的纯度。
用于人的AAV的合适剂量在约1×1010~1×1014个病毒颗粒的范围内。
基因治疗载体可以是眼内注射给药的,可以采用视网膜下腔或玻璃体腔注射给药。
本发明还提供了一种宿主细胞,用于表达XCT/SLC7A11蛋白。优选地,所述宿主细胞为哺乳动物细胞(较佳地为人,更佳地为人视神经细胞或感光细胞),提高XCT/SLC7A11蛋白的表达量。
制剂和组合物
本发明提供一种制剂或组合物,所述制剂或组合物含有(a)本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的腺相关病毒载体,以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一优选例中,所述药物制剂用于治疗眼部疾病,较佳地,所述药物制剂用于治疗视网膜神经节细胞变性疾病。
为了便于临床应用,本发明的药物组合物可以包含在注射用给药器(如注射用针)中,所述的注射用给药器中,可以包含一次给药量的所述的药物组合物。所述的注射用给药器可以被包含在药盒中,以方便储存、使用。运输时需要将装有药物悬浊液的微小容器放置于干冰中。平时应保存于-80℃冰箱中。
本发明所述的药盒或试剂盒中,还可包括使用说明书,以利于本领域技术人员按照正确的方式使用。
本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的载体(vector),例如病毒载体(包括腺相关病毒载体)。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于治疗眼部疾病。“安全有效量”指的是:活性成分的量足以明显改善病情或症状,而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是:一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质,它们适合于人使用,而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和,而不明显降低活性成分的药效。
组合物可以是液体或固体,例如粉末、凝胶或糊剂。优选地,组合物是液体,优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。
在本发明中,所述载体可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中,优选地,载体作为可注射液体被提供。优选地,可注射液体作为胶囊或注射器被提供。
药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如
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)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液,和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明提供的编码XCT/SLC7A11的核酸或融合核酸,可以体外或体内生产XCT/SLC7A11蛋白,含所述XCT/SLC7A11优化编码序列的制剂可应用于制备治疗眼部疾病的药物。
经优化的编码人XCT/SLC7A11蛋白的核酸表达量更高,从而翻译出更多的XCT/SLC7A11蛋白,比现有技术表达更多的XCT/SLC7A11蛋白,能较好地治疗视网膜神经节细胞变性疾病。
治疗方法
本发明提供了治疗视网膜神经节细胞变性疾病的方法,所述方法包括将包含编码XCT/SLC7A11的优化序列的载体引入到眼睛内。所述方法可包括向眼睛的内视网膜细胞视网膜下或玻璃体内施用核酸载体。
本发明提供了用于通过向细胞提供感光细胞功能在治疗视网膜退化的方法中使用的核酸载体,所述核酸载体包含编码XCT/SLC7A11的优化序列。本发明组合物可以单独给药,或者与其他治疗药物联合给药(如配制在同一药物组合物中)。
如本文所用,治疗疾病意指施用如本文描述的核酸或载体以改善或减轻疾病的一种或多种症状,包括降低眼压,增加RGCs存活率等。
本发明的方法包括将编码XCT/SLC7A11蛋白的核酸序列引入到眼睛的玻璃体腔内。优选地,方法包括使细胞与包含编码XCT/SLC7A11蛋白的核酸序列的载体(较佳地为病毒,更佳地为腺相关病毒)接触。优选地,细胞是视网膜细胞,优选地视锥细胞、视杆细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞和/或无长突细胞。
当核酸序列和一种或多种酶以多个(两个或多个)剂量被提供时,这些剂量可分隔合适的时间间隔,例如30秒到若干小时或1天或多天。
每个剂量可包含有效量的核酸序列或病毒载体。核酸序列或病毒载体的有效剂量可以在每治疗方案1×109-1×1016病毒的范围。
本发明是基于靶向编码XCT/SLC7A11的优化的核酸序列到视网膜细胞,以补偿视网膜中感光细胞的退化。核酸序列被靶向至的细胞是视网膜的细胞,其是活的并且能够表达外来核酸序列。视网膜细胞是视网膜的细胞,其是神经或神经元细胞并且能够变兴奋并传送电信号。优选地,靶视网膜细胞将能够产生电信号并且起始信号级联,导致信号向视神经的传送。优选地,靶视网膜细胞是内视网膜的细胞。靶细胞可以是视杆或视锥细胞,和/或可以是非感光细胞(即呈其天然形式的对光不响应的视网膜细胞)。靶视网膜细胞可以包括一种或多种细胞类型,所述细胞类型选自由以下组成的组:视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、米勒细胞和/或无长突细胞。
因此,当靶视网膜细胞是靶向视网膜的给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞和/或无长突细胞时,编码XCT/SLC7A11的核酸的表达可以被称作异位表达。因此,本发明在其范围内包括在非感光细胞中异位表达编码XCT/SLC7A11的核酸序列的方法。此类异位表达通过其中的异源XCT/SLC7A11蛋白的表达,具有向细胞提供感光细胞功能的作用。这用于增加观察到退化的视网膜的感光能力。
水平细胞是内视网膜细胞,参与信号加工和反馈到感光细胞;双极细胞是内视网膜细胞并且在视杆/视锥细胞和无长突和/或神经节细胞间通信;无长突细胞发现于内视网膜并且允许在感光细胞途径和神经节细胞间的通信;神经节细胞是最内部的视网膜细胞,其将信号从感光细胞传递到视神经。
本文对细胞的提及包括细胞的后代。优选地,根据本发明的对细胞的修饰还发生在转化的宿主细胞以后的代中。后代细胞可以不与最初的靶向细胞一致,但优选地将也展现非天然的XCT/SLC7A11的表达。
本发明的主要优点包括:
(a)本发明对人xCT/slc7a11基因序列进行了优化,表达效率更高,适合在哺乳动物体内表达;
(b)本发明选择了合适的载体和相关元件,构建了重组腺相关病毒载体AAV_xCT/slc7a11,感染效果优异,且在细胞核内稳定表达,是一种稳定的重组腺相关病毒载体。
(c)本发明的重组腺相关病毒载体能显著降低小鼠眼压,增加小鼠RGCs的存活率,因此可用于制备治疗青光眼视网膜神经节细胞变性的药物,具有广泛的市场前景。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold SpringHarbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
实施例1重组腺相关病毒载体的构建和分离纯化
本发明涉及的基因序列如下:
SEQ ID NO:1所示的是xCT/slc7a11序列,
SEQ ID NO:2所示的是xCT/slc7a11氨基酸序列,
SEQ ID NO:3所示的是Left ITR序列,
SEQ ID NO:4所示的是CMV序列,
SEQ ID NO:5所示的是humanβ-globin intron序列,
SEQ ID NO:6所示的是MCS序列,
SEQ ID NO:7所示的是hGHpA序列,
SEQ ID NO:8所示的是Right ITR序列,
SEQ ID NO:9所示的是Ampicillin Resi stance序列,
SEQ ID NO:10所示的是空载体的全核苷酸序列
SEQ ID NO:11所示的是f1ori序列,
SEQ ID NO:12所示的是重组载体的核苷酸序列。
质粒AAV_xCT/slc7a11的构建、特征图谱及各元件的起止位点如图1所示,主要元件包括CMV增强子/启动子(SEQ ID NO:4)及xCT/slc7a11序列(SEQ ID NO:1),CMV增强子可以增强转入基因的表达,目的基因之后紧接着是hGHpA(SEQ ID NO:7),表达盒两侧是反向末端重复序列(TR),即病毒载体包括L-ITR(SEQ ID NO:3),R-ITR(SEQ ID NO:8),病毒载体还包括Ampicillin(SEQ ID NO:9)和f1ori(SEQ ID NO:11)。
病毒载体是通过质粒共转染方法获得的。将含有AAV2外壳蛋白基因和能帮助AAV复制的基因的辅助质粒和AAV_xCT/slc7a11质粒与HEK 293T细胞共转染,初步形成重组腺相关病毒载体;经碘克丁醇初步纯化后,经过以5ml-Hitrp Q琼脂糖凝胶作为填料的快速蛋白液相色谱仪通过离子交换层析进一步纯化,使用仪器为Pharmacia AKTAFPLC system(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ);之后用pH8.0,215mM的NaCl淋洗琼脂糖凝胶柱,对峰值的重组腺相关病毒载体进行收集;收集的液体通过浓缩器(100K concentrater,Millipore)后,用含0.014%的吐温20淋洗浓缩器对重组腺相关病毒载体进行浓缩;再用DNase I消化掉病毒颗粒以外DNA,并通过实时荧光定量PCR的方法确定病毒的滴度;最后用硝酸银染色-SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳法确保重组腺相关病毒载体颗粒没被污染且不含内毒素,并分装零下80℃储存。
实施例2重组腺相关病毒载体对青光眼模型小鼠的治疗
1实验材料
1.1实验动物
正常C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,光照周期为12h光照-12h黑暗,自由采食,自由饮水,所有的动物研究严格按照国家科学技术委员会颁发的《实验动物管理条例》进行。
1.2实验试剂及耗材
生理盐水(浙江天瑞药业有限公司),一次性注射针头(美国Becton Dickinsonand Company公司),xCT抗体(Novus Biologicals),TUJ1(Abcam),二抗山羊抗兔IgG(JacksonImmuno),山羊血清(Sigma),聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)(Sigma),多聚甲醛(Sigma)。
1.3实验仪器
眼科实验手术显微镜(日本Nikon公司);眼科显微器械(苏州明仁医疗器械有限公司);微量进样器(美国Hami lton公司);共聚焦显微镜(德国徕卡公司)。
2小鼠青光眼模型的构建
磁性微珠悬浮溶液制备:因磁性微珠表面覆盖有环氧基,使用前应先除去,即将1ml磁性微珠迅速混入50ml新鲜配置的0.02M氢氧化钠(NaOH,MW 39.997g/mol)的10×Tris缓冲液的混合液中,室温振荡混匀24小时,利用磁力将磁珠微粒收集在试管底部。试管平放以确保所有微粒都被磁力所吸附。室温下混匀4小时。用移液器小心除去上层液体,小心地将磁珠团混入50ml 10×Tris溶液中,混匀并使所有微粒悬浮,磁珠微粒在无菌平衡液中的浓缩和悬浮:实验用超纯水振荡清洗微粒3次。在超净台中,加入500ml BBS吹打混匀3次。加入250ml BBS吹打混匀,使微粒重悬浮。确保溶液尽量均匀,并快速将25μl悬液移入0.5ml无菌管中。所得到的微粒溶液最终浓度为1.6×106个/μl,4℃保存。
预先准备好注射用毛细针管,针管顶端呈椭圆形,且存在20度的内向夹角,并准备好已除去表面环氧基团的磁珠微粒悬液(1.6×106个/μl)。选取6-8周雄性小鼠进行腹腔注射麻醉,侧放在操作台上,造模眼需水平朝上且需预先扩瞳。手术前将事先准备好的磁性微粒悬液再次吹打混匀,并迅速在毛细针管中吸取1.5μl磁性微粒悬液。毛细针管与角膜缘呈45°夹角,并在另一侧与之呈90°处用塑胶显微镊固定眼球。小心刺入毛细针管,需保证针管未进入前方深处,且过程中禁止触及虹膜和晶体。在注射点对侧角巩缘处放置一磁极,后缓慢注射1.5μl磁性微粒悬液,注射过程需保证在15至30秒内完成,注射过程中需保证磁极位置不变。注射完成后迅速移出毛细针管,后磁极位置保持不变,维持30至60秒以保证所有微粒未附着在角膜缘内测。之后眼角巩缘环绕眼球移动磁极,是磁性微粒均匀分散在角膜、虹膜夹角处并形成磁性微粒环。造模结束后小鼠需侧放在热毯上复苏,复苏过程需保持造模眼朝上。
3处理方法
3.1玻璃体腔注射
使用玻璃制毛细针,于视网膜边缘、角膜巩膜交界靠后处进针,使用微量注射器注射,注射时需注意进针角度和深度,注意避免损伤晶体或其他眼内组织。
3.2组织处理
动物先经由PBS进行全身灌注,后继续用4%多聚甲醛(PFA)灌注,灌注速度为5mL/分钟。眼球及视神经取出后在4%PFA溶液中浸泡约2小时。组织染色铺片前需在0.1M PBS中4℃储存;组织冰冻切片前需在30%蔗糖溶液中浸泡过夜。
4表达xCT/slc7a11蛋白的腺相关病毒感染及检测
造模成功的小鼠玻璃体腔注射AAV_xCT/slc7a11两周后,据前述组织处理方法进行眼球的前处理,后使用显微镊夹住眼球底部向上提起,用剪刀剪断眼球周围的结膜和肌肉组织,保持眼球组织完整,剪去角膜、虹膜和晶状体做成眼杯,并分离视网膜和脉络膜复合体。
免疫荧光染色:选取视网膜,在20%山羊血清溶液中封闭1h,后一抗孵育过夜,抗体分别为TUJ1、HA,PBS清洗三次,每次10min,后二抗孵育1h,PBS清洗三次,每次10min后封片;使用共聚焦显微镜观察视网膜结构变化并拍照。
结果如下:
小鼠注射AAV_xCT/slc7a11两周后,进行视网膜免疫荧光染色铺片,可见大量AAV_xCT/slc7a11,且定位在细胞核内表达,与DAPI重合,为RGC细胞(TUJ1免疫荧光染色),显示AAV_xCT/slc7a11的感染效果优异(图2)。
5RGC存活率检测
8周龄小鼠单侧眼玻璃体腔注射AAV_xCT/slc7a11(实验组)、AAV_GFP(对照组),同时在注射眼进行前房磁珠微粒注射,分别于2周、4周、8周据上述组织处理方法处理眼球及视网膜,进行免疫荧光染色,使用共聚焦显微镜观察视网膜结构变化并拍照,每个眼球选取5个视野计数RGC(比例尺:20μm),并计算RGC存活率。
结果如下:
定量分析证明前房微珠注射后RGC在2W、8W时逐渐凋亡,且数量减少显著(实验组);与之对比,注射AAV_xCT/slc7a11小鼠RGC凋亡不显著,显示AAV_xCT/slc7a11对RGC具有保护作用(图3、图4)。
实施例3重组腺相关病毒载体对青光眼模型大鼠的治疗
大鼠青光眼模型的构建及给药
SPF级健康成年雄性Wistar大鼠,无眼部疾患,体重200~270g,购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,光照周期为12h光照-12h黑暗,自由采食,自由饮水,所有的动物研究严格按照国家科学技术委员会颁发的《实验动物管理条例》进行。
大鼠青光眼模型的构建方法同实施例2。
取15只造模成功的大鼠,随机分为三组,分别为模型组,对照组以及实验组,另取5只未造模健康成年雄性Wistar大鼠,作为空白组;实验组和对照组大鼠左侧眼玻璃体腔注射AAV_xCT/slc7a11(实验组)、AAV_GFP(对照组),空白组及模型组注射等量0.9%生理盐水,每天一次,持续两周。
3检测指标及方法
术前、给药2周后、停药2周后分别用Tono-Lab弹性眼压计进行眼压测量,其中:术前为术前24小时内,给药2周后即末次给药当日,停药2周后即停止给药后的第14天。
停药两周并测量眼压(mmHg)后,将大鼠用颈椎脱臼法处死,立即摘取左侧眼球,进行视网膜铺片Nissl染色和象限及视野划分,每个标本划分4个象限,每个象限划分为3个视野,即每个标本12个视野,使用共聚焦显微镜计数每个视野的视网膜神经节细胞(retinalganglion cells,RGCs)数目(每个标本取12个视野的均值作为代表值)。
检测结果如下:
各组大鼠平均眼内压及视网膜节细胞数目见下表。
Figure BDA0002149753280000221
由上表可见,术前4组大鼠眼压经统计学检验,无统计学差异(P>0.05);给药2周后及停药两周后,与空白组相比,模型组、对照组以及实验组眼压升高,具有统计学差异(P<0.05),与模型组相比,对照组和实验组眼压明显降低,结果具有统计学差异(P<0.05),与对照组相比,实验组眼压降低,结果具有统计学差异(P<0.05),且实验组停药两周后眼压明显低于给药两周后,表明停药的两周内,大鼠眼压在持续降低;停药两周后,与空白组相比,模型组、对照组以及实验组RGCs数目减少,具有统计学差异(P<0.05),与模型组相比,对照组和实验组RGCs显著数目增加,结果具有统计学差异(P<0.05),与对照组相比,实验组RGCs数目增加,结果具有统计学差异(P<0.05)。
由上述实验可见,本发明的重组腺相关病毒AAV_xCT/slc7a11能显著降低小鼠眼压,增加小鼠RGCs的存活率,有效的治疗青光眼。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海市第一人民医院
<120> 一种重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用
<130> P2019-0713
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1506
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
atggtcagaa agcctgttgt gtccaccatc tccaaaggag gttacctgca gggaaatgtt 60
aacgggaggc tgccttccct gggcaacaag gagccacctg ggcaggagaa agtgcagctg 120
aagaggaaag tcactttact gaggggagtc tccattatca ttggcaccat cattggagca 180
ggaatcttca tctctcctaa gggcgtgctc cagaacacgg gcagcgtggg catgtctctg 240
accatctgga cggtgtgtgg ggtcctgtca ctatttggag ctttgtctta tgctgaattg 300
ggaacaacta taaagaaatc tggaggtcat tacacatata ttttggaagt ctttggtcca 360
ttaccagctt ttgtacgagt ctgggtggaa ctcctcataa tacgccctgc agctactgct 420
gtgatatccc tggcatttgg acgctacatt ctggaaccat tttttattca atgtgaaatc 480
cctgaacttg cgatcaagct cattacagct gtgggcataa ctgtagtgat ggtcctaaat 540
agcatgagtg tcagctggag cgcccggatc cagattttct taaccttttg caagctcaca 600
gcaattctga taattatagt ccctggagtt atgcagctaa ttaaaggtca aacgcagaac 660
tttaaagacg ccttttcagg aagagattca agtattacgc ggttgccact ggctttttat 720
tatggaatgt atgcatatgc tggctggttt tacctcaact ttgttactga agaagtagaa 780
aaccctgaaa aaaccattcc ccttgcaata tgtatatcca tggccattgt caccattggc 840
tatgtgctga caaatgtggc ctactttacg accattaatg ctgaggagct gctgctttca 900
aatgcagtgg cagtgacctt ttctgagcgg ctactgggaa atttctcatt agcagttccg 960
atctttgttg ccctctcctg ctttggctcc atgaacggtg gtgtgtttgc tgtctccagg 1020
ttattctatg ttgcgtctcg agagggtcac cttccagaaa tcctctccat gattcatgtc 1080
cgcaagcaca ctcctctacc agctgttatt gttttgcacc ctttgacaat gataatgctc 1140
ttctctggag acctcgacag tcttttgaat ttcctcagtt ttgccaggtg gctttttatt 1200
gggctggcag ttgctgggct gatttatctt cgatacaaat gcccagatat gcatcgtcct 1260
ttcaaggtgc cactgttcat cccagctttg ttttccttca catgcctctt catggttgcc 1320
ctttccctct attcggaccc atttagtaca gggattggct tcgtcatcac tctgactgga 1380
gtccctgcgt attatctctt tattatatgg gacaagaaac ccaggtggtt tagaataatg 1440
tcggagaaaa taaccagaac attacaaata atactggaag ttgtaccaga agaagataag 1500
ttatga 1506
<210> 2
<211> 506
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
Met Val Arg Lys Pro Val Val Ser Thr Ile Ser Lys Gly Gly Tyr Leu
1 5 10 15
Gln Gly Asn Val Asn Gly Arg Leu Pro Ser Leu Gly Asn Lys Glu Pro
20 25 30
Pro Gly Gln Glu Lys Val Gln Leu Lys Arg Lys Val Thr Leu Leu Arg
35 40 45
Gly Val Ser Ile Ile Ile Gly Thr Ile Ile Gly Ala Gly Ile Phe Ile
50 55 60
Ser Pro Lys Gly Val Leu Gln Asn Thr Gly Ser Val Gly Met Ser Leu
65 70 75 80
Thr Ile Trp Thr Val Cys Gly Val Leu Ser Leu Phe Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Tyr Ala Glu Leu Gly Thr Thr Ile Lys Lys Ser Gly Gly His Tyr Thr
100 105 110
Tyr Ile Leu Glu Val Phe Gly Pro Leu Pro Ala Phe Val Arg Val Trp
115 120 125
Val Glu Leu Leu Ile Ile Arg Pro Ala Ala Thr Ala Val Ile Ser Leu
130 135 140
Ala Phe Gly Arg Tyr Ile Leu Glu Pro Phe Phe Ile Gln Cys Glu Ile
145 150 155 160
Pro Glu Leu Ala Ile Lys Leu Ile Thr Ala Val Gly Ile Thr Val Val
165 170 175
Met Val Leu Asn Ser Met Ser Val Ser Trp Ser Ala Arg Ile Gln Ile
180 185 190
Phe Leu Thr Phe Cys Lys Leu Thr Ala Ile Leu Ile Ile Ile Val Pro
195 200 205
Gly Val Met Gln Leu Ile Lys Gly Gln Thr Gln Asn Phe Lys Asp Ala
210 215 220
Phe Ser Gly Arg Asp Ser Ser Ile Thr Arg Leu Pro Leu Ala Phe Tyr
225 230 235 240
Tyr Gly Met Tyr Ala Tyr Ala Gly Trp Phe Tyr Leu Asn Phe Val Thr
245 250 255
Glu Glu Val Glu Asn Pro Glu Lys Thr Ile Pro Leu Ala Ile Cys Ile
260 265 270
Ser Met Ala Ile Val Thr Ile Gly Tyr Val Leu Thr Asn Val Ala Tyr
275 280 285
Phe Thr Thr Ile Asn Ala Glu Glu Leu Leu Leu Ser Asn Ala Val Ala
290 295 300
Val Thr Phe Ser Glu Arg Leu Leu Gly Asn Phe Ser Leu Ala Val Pro
305 310 315 320
Ile Phe Val Ala Leu Ser Cys Phe Gly Ser Met Asn Gly Gly Val Phe
325 330 335
Ala Val Ser Arg Leu Phe Tyr Val Ala Ser Arg Glu Gly His Leu Pro
340 345 350
Glu Ile Leu Ser Met Ile His Val Arg Lys His Thr Pro Leu Pro Ala
355 360 365
Val Ile Val Leu His Pro Leu Thr Met Ile Met Leu Phe Ser Gly Asp
370 375 380
Leu Asp Ser Leu Leu Asn Phe Leu Ser Phe Ala Arg Trp Leu Phe Ile
385 390 395 400
Gly Leu Ala Val Ala Gly Leu Ile Tyr Leu Arg Tyr Lys Cys Pro Asp
405 410 415
Met His Arg Pro Phe Lys Val Pro Leu Phe Ile Pro Ala Leu Phe Ser
420 425 430
Phe Thr Cys Leu Phe Met Val Ala Leu Ser Leu Tyr Ser Asp Pro Phe
435 440 445
Ser Thr Gly Ile Gly Phe Val Ile Thr Leu Thr Gly Val Pro Ala Tyr
450 455 460
Tyr Leu Phe Ile Ile Trp Asp Lys Lys Pro Arg Trp Phe Arg Ile Met
465 470 475 480
Ser Val Thr Glu Asn Thr Lys Cys Arg Leu Ile Asn Thr Pro Leu Phe
485 490 495
Lys Glu Arg Val Pro Arg Val Asp Tyr Pro
500 505
<210> 3
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc t 141
<210> 4
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
acgcgtggaa ttcgctagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 60
atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 120
cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgt caatagggac 180
tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 240
agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 300
gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 360
agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg 420
gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg 480
caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt cgtaacaact ccgccccatt gacgcaaatg 540
ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat ataagcagag ctcgtttagt gaaccgtcag 600
atcgcctgga gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc 660
agc 663
<210> 5
<211> 493
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gattcgaatc ccggccggga acggtgcatt ggaacgcgga ttccccgtgc caagagtgac 60
gtaagtaccg cctatagagt ctataggccc acaaaaaatg ctttcttctt ttaatatact 120
tttttgttta tcttatttct aatactttcc ctaatctctt tctttcaggg caataatgat 180
acaatgtatc atgcctcttt gcaccattct aaagaataac agtgataatt tctgggttaa 240
ggcaatagca atatttctgc atataaatat ttctgcatat aaattgtaac tgatgtaaga 300
ggtttcatat tgctaatagc agctacaatc cagctaccat tctgctttta ttttatggtt 360
gggataaggc tggattattc tgagtccaag ctaggccctt ttgctaatca tgttcatacc 420
tcttatcttc ctcccacagc tcctgggcaa cgtgctggtc tgtgtgctgg cccatcactt 480
tggcaaagaa ttg 493
<210> 6
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 6
atcgattgaa ttccccgggg atcctctaga gtcgacctgc agaagcttgc ctcgagcagc 60
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<210> 7
<211> 479
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 7
acgggtggca tccctgtgac ccctccccag tgcctctcct ggccctggaa gttgccactc 60
cagtgcccac cagccttgtc ctaataaaat taagttgcat cattttgtct gactaggtgt 120
ccttctataa tattatgggg tggagggggg tggtatggag caaggggcaa gttgggaaga 180
caacctgtag ggcctgcggg gtctattggg aaccaagctg gagtgcagtg gcacaatctt 240
ggctcactgc aatctccgcc tcctgggttc aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt 300
tgttgggatt ccaggcatgc atgaccaggc tcagctaatt tttgtttttt tggtagagac 360
ggggtttcac catattggcc aggctggtct ccaactccta atctcaggtg atctacccac 420
cttggcctcc caaattgctg ggattacagg cgtgaaccac tgctcccttc cctgtcctt 479
<210> 8
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 8
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60
ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120
gagcgcgcag ctgcctgcag g 141
<210> 9
<211> 861
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 9
atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60
gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120
cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180
gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240
cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300
gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360
tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420
ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480
gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540
cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600
tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660
tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 720
cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780
acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840
tcactgatta agcattggta a 861
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 10
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggaat tcgctagtta ttaatagtaa 180
tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 240
gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 300
tatgttccca tagtaacgtc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 360
cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 420
gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 480
tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 540
tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 600
cccattgacg tcaatgggag tttgttttgc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 660
gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 720
taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg 780
acctccatag aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg attcgaatcc cggccgggaa 840
cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg taagtaccgc ctatagagtc 900
tataggccca caaaaaatgc tttcttcttt taatatactt ttttgtttat cttatttcta 960
atactttccc taatctcttt ctttcagggc aataatgata caatgtatca tgcctctttg 1020
caccattcta aagaataaca gtgataattt ctgggttaag gcaatagcaa tatttctgca 1080
tataaatatt tctgcatata aattgtaact gatgtaagag gtttcatatt gctaatagca 1140
gctacaatcc agctaccatt ctgcttttat tttatggttg ggataaggct ggattattct 1200
gagtccaagc taggcccttt tgctaatcat gttcatacct cttatcttcc tcccacagct 1260
cctgggcaac gtgctggtct gtgtgctggc ccatcacttt ggcaaagaat tgggattcga 1320
acatcgattg aattccccgg ggatcctcta gagtcgacct gcagaagctt gcctcgagca 1380
gcgctgctcg agagatctac gggtggcatc cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg 1440
ccctggaagt tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct aataaaatta agttgcatca 1500
ttttgtctga ctaggtgtcc ttctataata ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca 1560
aggggcaagt tgggaagaca acctgtaggg cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga 1620
gtgcagtggc acaatcttgg ctcactgcaa tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc 1680
tgcctcagcc tcccgagttg ttgggattcc aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt 1740
tgtttttttg gtagagacgg ggtttcacca tattggccag gctggtctcc aactcctaat 1800
ctcaggtgat ctacccacct tggcctccca aattgctggg attacaggcg tgaaccactg 1860
ctcccttccc tgtccttctg attttgtagg taaccacgtg cggaccgagc ggccgcagga 1920
acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg 1980
gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc 2040
gcgcagctgc ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat 2100
ttcacaccgc atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg 2160
gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct 2220
cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta 2280
aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa 2340
cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct 2400
ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc 2460
aaccctatct cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg 2520
ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt 2580
acaattttat ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc 2640
cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct 2700
tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca 2760
ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg 2820
ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct 2880
atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga 2940
taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc 3000
cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg 3060
aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc 3120
aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact 3180
tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc 3240
ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag 3300
catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat 3360
aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt 3420
ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa 3480
gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc 3540
aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 3600
gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 3660
gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 3720
gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 3780
gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 3840
gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 3900
atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 3960
ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 4020
ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 4080
ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 4140
ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 4200
ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 4260
tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 4320
tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 4380
tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg 4440
tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 4500
gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 4560
tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 4620
ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgt 4654
<210> 11
<211> 306
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 11
cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa 60
gctctaaatc gggggctccc tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc 120
aaaaaacttg atttgggtga tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt 180
cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca 240
acactcaacc ctatctcggg ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc 300
tattgg 306
<210> 12
<211> 6124
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 12
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtggaat tcgctagtta ttaatagtaa 180
tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 240
gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 300
tatgttccca tagtaacgtc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 360
cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac gccccctatt 420
gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttatgggac 480
tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 540
tggcagtaca tcaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 600
cccattgacg tcaatgggag tttgttttgc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 660
gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 720
taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga tcgcctggag acgccatcca cgctgttttg 780
acctccatag aagacaccgg gaccgatcca gcctccgcgg attcgaatcc cggccgggaa 840
cggtgcattg gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgacg taagtaccgc ctatagagtc 900
tataggccca caaaaaatgc tttcttcttt taatatactt ttttgtttat cttatttcta 960
atactttccc taatctcttt ctttcagggc aataatgata caatgtatca tgcctctttg 1020
caccattcta aagaataaca gtgataattt ctgggttaag gcaatagcaa tatttctgca 1080
tataaatatt tctgcatata aattgtaact gatgtaagag gtttcatatt gctaatagca 1140
gctacaatcc agctaccatt ctgcttttat tttatggttg ggataaggct ggattattct 1200
gagtccaagc taggcccttt tgctaatcat gttcatacct cttatcttcc tcccacagct 1260
cctgggcaac gtgctggtct gtgtgctggc ccatcacttt ggcaaagaat tgggattcga 1320
acatcgattg aattccacca tgatggtcag aaagcctgtt gtgtccacca tctccaaagg 1380
aggttacctg cagggaaatg ttaacgggag gctgccttcc ctgggcaaca aggagccacc 1440
tgggcaggag aaagtgcagc tgaagaggaa agtcacttta ctgaggggag tctccattat 1500
cattggcacc atcattggag caggaatctt catctctcct aagggcgtgc tccagaacac 1560
gggcagcgtg ggcatgtctc tgaccatctg gacggtgtgt ggggtcctgt cactatttgg 1620
agctttgtct tatgctgaat tgggaacaac tataaagaaa tctggaggtc attacacata 1680
tattttggaa gtctttggtc cattaccagc ttttgtacga gtctgggtgg aactcctcat 1740
aatacgccct gcagctactg ctgtgatatc cctggcattt ggacgctaca ttctggaacc 1800
attttttatt caatgtgaaa tccctgaact tgcgatcaag ctcattacag ctgtgggcat 1860
aactgtagtg atggtcctaa atagcatgag tgtcagctgg agcgcccgga tccagatttt 1920
cttaaccttt tgcaagctca cagcaattct gataattata gtccctggag ttatgcagct 1980
aattaaaggt caaacgcaga actttaaaga cgccttttca ggaagagatt caagtattac 2040
gcggttgcca ctggcttttt attatggaat gtatgcatat gctggctggt tttacctcaa 2100
ctttgttact gaagaagtag aaaaccctga aaaaaccatt ccccttgcaa tatgtatatc 2160
catggccatt gtcaccattg gctatgtgct gacaaatgtg gcctacttta cgaccattaa 2220
tgctgaggag ctgctgcttt caaatgcagt ggcagtgacc ttttctgagc ggctactggg 2280
aaatttctca ttagcagttc cgatctttgt tgccctctcc tgctttggct ccatgaacgg 2340
tggtgtgttt gctgtctcca ggttattcta tgttgcgtct cgagagggtc accttccaga 2400
aatcctctcc atgattcatg tccgcaagca cactcctcta ccagctgtta ttgttttgca 2460
ccctttgaca atgataatgc tcttctctgg agacctcgac agtcttttga atttcctcag 2520
ttttgccagg tggcttttta ttgggctggc agttgctggg ctgatttatc ttcgatacaa 2580
atgcccagat atgcatcgtc ctttcaaggt gccactgttc atcccagctt tgttttcctt 2640
cacatgcctc ttcatggttg ccctttccct ctattcggac ccatttagta cagggattgg 2700
cttcgtcatc actctgactg gagtccctgc gtattatctc tttattatat gggacaagaa 2760
acccaggtgg tttagaataa tgtcggagaa aataaccaga acattacaaa taatactgga 2820
agttgtacca gaagaagata agttatgaca gcgctgctcg agagatctac gggtggcatc 2880
cctgtgaccc ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca gtgcccacca 2940
gccttgtcct aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc ttctataata 3000
ttatggggtg gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca acctgtaggg 3060
cctgcggggt ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg ctcactgcaa 3120
tctccgcctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg ttgggattcc 3180
aggcatgcat gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg ggtttcacca 3240
tattggccag gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct tggcctccca 3300
aattgctggg attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg attttgtagg 3360
taaccacgtg cggaccgagc ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc 3420
tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt 3480
tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcaggggc gcctgatgcg 3540
gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atacgtcaaa gcaaccatag 3600
tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc 3660
gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc 3720
acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt 3780
agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg 3840
ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt 3900
ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct cgggctattc ttttgattta 3960
taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt 4020
aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat ggtgcactct cagtacaatc 4080
tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 4140
tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc 4200
tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg 4260
atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc 4320
acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 4380
atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 4440
agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt 4500
cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 4560
gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc 4620
cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta 4680
tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 4740
ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 4800
ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 4860
atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 4920
cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 4980
atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 5040
gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 5100
cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 5160
tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 5220
tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 5280
gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 5340
gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 5400
atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 5460
atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 5520
aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 5580
aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 5640
ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 5700
ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 5760
tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 5820
ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 5880
acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 5940
gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 6000
cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 6060
aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 6120
atgt 6124

Claims (10)

1.一种表达盒,其特征在于,所述表达盒从5’-3’端具有式I结构:
Z1-Z2-Z3-Z4(I)
式中,各“-”独立地为键或核苷酸连接序列;
Z1为增强子和/或启动子;
Z2为内含子;
Z3为编码XCT/SLC7A11蛋白的核苷酸序列;和
Z4为任选的hGHpA(human growth hormone poly(A)tail)序列。
2.如权利要求1所述的表达盒,其特征在于,所述的增强子和/或启动子为CMV增强子/启动子。
3.如权利要求1所述的表达盒,其特征在于,所述内含子为β-globin内含子,较佳地,所述内含子的核苷酸序列如SEQ ID NO.:5所示。
4.如权利要求1所述的表达盒,其特征在于,所述hGHpA的核苷酸序列与SEQ ID NO.:7所示的核苷酸序列有≥95%相同性,优选地≥98%,更优选地≥99%。
5.一种载体,其特征在于,所述载体含有权利要求1所述的表达盒。
6.一种腺相关病毒载体,其特征在于,所述腺相关病毒载体含有如权利要求1所述的表达盒。
7.如权利要求6所述的载体,其特征在于,所述腺相关病毒为AAV2,较佳地,所述腺相关病毒为单链AAV2。
8.如权利要求6所述的载体,其特征在于,所述腺相关病毒载体具有式II结构:
A1-Z1-Z2-Z3-Z4-A2-A3(I)
式中,各“-”独立地为键或核苷酸连接序列;
A1为L-ITR序列;
Z1为CMV增强子/启动子;
Z2为β-globin内含子;
Z3为编码XCT/SLC7A11蛋白的核苷酸序列;
Z4为hGHpA序列;
A2为R-ITR序列;
A3为任选的标签序列;和
A4为任选的f1ori序列。
9.一种如权利要求5所述的载体或权利要求6所述的腺相关病毒载体的用途,用于制备一制剂或组合物,所述制剂或组合物用于治疗眼部疾病,较佳地,用于治疗视网膜神经节细胞变性疾病。
10.一种药物制剂,所述的制剂含有(a)权利要求5所述的载体或权利要求6所述的腺相关病毒载体,以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
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