CN117136232A - 嵌合抗原受体（car）nk细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了使用CRISPR/CAS9系统的腺相关病毒(AAV)递送来遗传工程化NK细胞的质粒和方法。在一些方面，本文公开了使用此类工程化NK细胞来治疗癌症的方法。

Description

嵌合抗原受体(CAR)NK细胞及其用途
I.相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年10月26日提交的美国临时专利申请号63/105,722的权益，该临时专利申请全文明确地以引用方式并入本文。
II.背景技术
人外周血自然杀伤(NK)细胞具有强烈的抗肿瘤活性，并且已经成功用于若干临床试验。用嵌合抗原受体(CAR)修饰NK细胞可改善它们的靶向并增加特异性。然而，由于病毒核酸的先天传感机制的高表达，NK细胞的遗传修饰一直具有挑战性。需要用于工程改造NK细胞的新方法和新载体。
III.发明内容
本发明公开了涉及NK细胞的电穿孔以将CRISPR/CAS9基因编辑系统递送至细胞(例如，NK细胞)的方法和组合物。
在一个方面，本文公开了与成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关9(Cas9)整合系统一起使用的质粒，其中质粒按顺序包含左同源臂、多核苷酸序列和右同源臂，该多核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)多肽诸如例如包含靶向靶细胞上的受体(例如CD33)的scFv的CAR、跨膜结构域(例如NKG2D跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域和/或CD3ξ跨膜结构域)、共刺激结构域(例如2B4结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域，或2B4结构域、CD28共刺激结构域和/或4-1BB共刺激结构域的任何组合)和CD3ξ信号传导结构域；其中左同源臂和右同源臂各自的长度为1000bp或更短(例如，30bp长、300bp长、600bp长)。
本文还公开了与任何前述方面的CRISPR/Cas9整合系统一起使用的质粒，其中左同源臂和右同源臂具有相同长度或不同长度。在一些方面，同源臂与人19号染色体的腺相关病毒整合位点1(AAVS1)特异性地杂交。
在一些实施方案中，本文公开了与任何前述方面的CRISPR/Cas9整合系统一起使用的质粒，其中质粒还包含鼠白血病病毒源性(MND)启动子。
本文还公开了腺相关病毒(AAV)载体(诸如例如，包含AAV6血清型的AAV载体)，这些载体包含任何前述方面的质粒。在一些方面，AAV质粒还包含编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的多核苷酸序列。在一些实施方案中，载体还包含编码crRNA、示踪剂RNA(trcrRNA)和Cas内切核酸酶的质粒。AAV载体可以是单链AAV(ssAAV)或自互补AAV(scAAV)。
在一方面，本文公开了经修饰的细胞(诸如例如NK细胞和NK T细胞)，这些细胞包含任何前述方面的质粒或AAV载体。
本文还公开了治疗、减少、降低、抑制、改善和/或预防受试者的癌症和/或转移(诸如例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)和/或骨髓增生异常综合征(MDS))的方法，这些方法包括向患有癌症的受试者施用任何前述方面的经修饰的细胞。
在一个方面，本文公开了产生嵌合抗原受体(CAR)自然杀伤(NK)细胞或CAR NK T细胞的方法，这些方法包括a)获得包含2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)与对应CRISPR/Cas向导RNA复合的核糖核蛋白(RNP)复合物和包含质粒的AAV载体，该质粒包含转基因(诸如例如，肿瘤抗原的嵌合抗原受体)；其中转基因侧接同源臂；并且其中同源臂的长度为1000bp或更短；以及b)将转基因和RNP复合物引入到NK细胞或NK T细胞中；其中转基因(诸如例如，肿瘤抗原的嵌合抗原受体)经由腺相关病毒(AAV)感染而被引入到NK细胞或NK T细胞中；其中RNP复合物与NK细胞或NK T细胞的基因组DNA内的靶序列杂交，并且NK细胞或NKT细胞的DNA修复酶在靶序列处(例如，通过同源修复)将转基因插入到宿主基因组中，从而产生CAR NK细胞或CAR NK T细胞。在一些方面，RNP复合物可经由电穿孔引入到细胞中。在一些方面，RNP复合物可经由病毒递送在相同或不同的AAV(即，重复感染)中引入到细胞中。
在一个方面，本文公开了遗传修饰细胞(T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、成纤维细胞、造骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌细胞，包括但不限于原代细胞或扩增细胞)的方法，这些方法包括a)获得包含2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)与对应CRISPR/Cas向导RNA复合的核糖核蛋白(RNP)复合物和包含质粒的AAV载体，该质粒包含嵌合抗原受体(CAR)多肽；其中多核苷酸序列侧接同源臂；并且其中同源臂的长度为1000bp或更短；以及b)将多核苷酸序列和RNP复合物引入到细胞中；其中多核苷酸序列经由AAV感染到细胞中而被引入到细胞中；其中RNP复合物与细胞的基因组DNA内的靶序列杂交，并且细胞的DNA修复酶在细胞的基因组DNA内的靶序列处将转基因插入到宿主基因组中，从而产生经修饰的细胞。
在一些实施方案中，本文公开了遗传修饰任何前述方面的细胞的方法，其中细胞(例如，NK细胞或NK T细胞)用约5至500K感染复数(MOI)的本文公开的AAV感染。
本文还公开了遗传修饰任何前述方面的细胞的方法，其中在感染和/或电穿孔之前，在IL-2和/或经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体细胞的存在下将原代细胞温育约4天至10天。在一些实施方案中，本文公开了遗传修饰任何前述方面的细胞的方法，这些方法还包括在感染之前在经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体的存在下将原代细胞扩增约4天至10天，其中经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体表达膜结合的4-1BBL、膜结合的IL-21或膜结合的IL-15或它们的任何组合。本文还公开了遗传修饰任何前述方面的细胞的方法，这些方法还包括在感染之后用经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体扩增经修饰的细胞，其中经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体表达膜结合的4-1BBL、膜结合的IL-21或膜结合的IL-15或它们的任何组合。
在一些方面，本文公开了治疗、减少、降低、抑制、改善和/或预防受试者的癌症和/或转移(诸如例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)和/或骨髓增生异常综合征(MDS))的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的自然杀伤(NK)细胞，其中NK细胞包含与成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关9(Cas9)整合系统一起使用的质粒，其中质粒依次包含左同源臂、编码嵌合抗原受体(CAR)多肽(诸如例如，靶向CD33的CAR)的多核苷酸序列和右同源臂；其中左同源臂和右同源臂各自的长度为1000bp或更短(例如，600bp)。
在一些方面，本文公开了与成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关9(Cas9)整合系统一起使用的质粒，其中质粒包含编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的多核苷酸序列；其中多核苷酸序列与一条前间隔序列邻近基序(PAM)和一条编码crispr RNA(crRNA)的序列相邻，或者侧接两条PAM和两条编码crRNA的序列。在一些方面，本发明所公开的质粒可用于治疗、减少、降低、抑制、改善和/或预防任何前述方面的癌症和/或转移的方法；产生任何前述方面的CAR NK细胞和/或CAR NK T细胞的方法；和/或遗传修饰任何前述方面的细胞的方法中的任何方法中。
IV.附图说明
并入本说明书中并构成其一部分的附图示出了若干实施方案，并与说明书一起示出本发明所公开的组合物和方法。
图1A-图1E示出了mBIL-21扩增的人原代NK细胞中AAVS1的有效CRISPR靶向。图1A示出了使用mbIL21-K562分离和离体扩增NK细胞的步骤的示意图。图1B示出了HR相关基因(图1C)和NHEJ相关基因在不同NK细胞中的相对基因表达水平，对于所有比较，***P<0.001。图1D示出了ATAC-seq数据，这些数据示出在新鲜分离的(初始)NK细胞和mBIL-21扩增的NK细胞(n＝2)之间AAVS1具有相似的染色质可及性。图1E示出了NK细胞中AAVS1的Cas9/RNP介导的靶向的效率。图1E中的序列包括：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58。
图2A-图2C示出了用于通过HR和CRISPaint插入到AAVS1中的mCherry编码DNA的构建体。在图2A中，左图示出，Cas9/RNP将DSB引入AAVS1中，编码感兴趣的基因的DNA可通过HR以最佳长度的Ha整合到NK细胞中；右图示出了构建体的示意图，这些构建体设计用于整合对于AAVS1中的Cas9靶向位点而言具有介于30bp-1000bp之间的HA的编码mCherry的DNA并在ssAAV6和/或scAAV6主链中克隆。在图2B中，上图示出了CRISPaint基因插入如何通过不依赖同源性的DNA修复途径起作用的示意图；下图示出了设计用于通过CRISPaint插入编码mCherry的DNA并在scAAV中克隆的构建体的示意图。图2C示出了电穿孔Cas9/RNP并转导第七天mbIL21扩增的用AAV6转导的IL2刺激的NK以进行基因递送的工作流程的示意图。
图3A-图3C示出，靶向扩增的CD3阴性CD56阳性NK细胞中的AAVS1不改变细胞的正常功能。图3A示出了代表性流式细胞术分析，该分析示出从健康供体血沉棕黄层分离的CD3阴性CD56阳性NK细胞的纯度。图3B示出了用于将Cas9/RNP电穿孔到第7天扩增的人原代NK细胞中以靶向AAVS1的工作流程的示意图。图3C示出了AAVS1KO NK细胞的细胞毒性测定，该测定未示出其针对AML细胞系的抗肿瘤活性的任何抑制。
图4A-图4C示出，AAV6和Cas9/RNP的组合导致有效产生表达mCherry的NK细胞。图4A示出了CRISPR电穿孔和AAV6转导2天后表达mCherry的人原代NK细胞的代表性流式细胞术(MOI＝3×105)。图4B示出了通过HR和CRISPaint，人原代NK细胞中Cas9/RNP和AAV6介导的mCherry表达的效率(n＝3)。图4C示出了在使用mbIL21 K562富集和扩增后NK细胞中稳定的mCherry表达。
图5示出了用Cas9/RNP电穿孔并用AAV6转导的新鲜分离的NK细胞中mCherry表达水平的代表性流式细胞术分析。
图6A-图6F示出，使用Cas9/RNP和AAV6的组合成功产生表达CD33CAR的NK细胞。图6A和图6B示出了具有针对AAVS1靶向位点的HA并克隆在ssAAV中的抗CD33 CAR构建体(Gen2和Gen4v2)的示意图。图6C示出了代表性流式细胞术，该代表性流式细胞术示出在Cas9/RNP电穿孔和AAV6转导7天后CD33CAR在NK细胞上的表达(MOI＝3×105)。图6D示出，Gen2的CD33CAR表达的MFI显著高于Gen4v2，**P＝0.0014。图6E示出，转导和电穿孔七天和十四天后NK细胞上的CD33CAR表达水平未显示显著降低(n＝3)。图6F示出了表达CD33CAR的NK细胞在饲养细胞上从3×105个细胞开始14天的倍数扩增(n＝3)与野生型NK细胞相似。
图7A-图7B示出，冷冻前和解冻后第14天NK细胞中的CD33CAR-Gen2表达水平的代表性流式细胞术分析未显示降低。图7A还示出了冷冻和解冻不影响CD33CAR-Gen2 NK细胞针对Kasumi-1的增强的细胞毒性效应。
图8A-图8I示出了CD33CAR NK细胞具有增强的抗AML活性。当与Kasumi-1共培养时，CD33CAR NK细胞脱粒显著高于野生型NK细胞，**调节的P值＝0.004。图8A和图8B：HL60，*调节的P值＝0.01。图8B示出，在NK细胞上表达CD33CAR也增强NK细胞针对Kasumi-1的抗肿瘤活性，如在不同的效应细胞:靶细胞比率下和三名供体中进行的代表性细胞毒性测定中所示，****调节的P值<0.0001。图8C示出，仅在CD33CAR-Gen2 NK细胞中观察到这种增强的针对HL-60的细胞毒性活性(图8E和8F)，*调节的P值＝0.01。CD33CAR-Gen2和Gen4v2显著杀伤较高AML-10原代细胞，****调节的P值<0.0001(图8G和图8H)。未观察到针对K562的改善的杀伤，**调节的P值＝0.001。
图9A-图9D示出，通过PCR和TLA证实了转基因在AAVS1基因座中的整合。图9A示出了在编码CD33CAR的DNA内部和外部设计并整合在AAVS1中的PCR引物的示意图。图9B示出，扩增子被扩增，并在1％琼脂凝胶上仅在CD33CAR基因在AAVS1基因座处成功插入的NK细胞中观察到(条件1和2)。当引物在转基因外部设计并用于扩增野生型、mCherry或CD33CAR中的AAVS1基因座时，也观察到在人原代NK细胞中的基因插入(条件3，引物：正向-1200bp(2)，反向-1200bp(1))。图9C示出了使用设计的引物来检测第14天细胞中CD33CAR-Gen2的整合时，整个人基因组上的TLA序列覆盖率。图9D示出，染色体示于y轴上，染色体位置示于x轴上。已鉴定的整合位点以红色圈出。
图10A-图10B示出，用10K-300K MOI的编码CD33CAR-Gen2的ssAAV6转导的NK细胞中CD33CAR-Gen2表达水平的代表性流式细胞术(图10A)分析显示CAR在从三名健康供体分离的NK细胞上成功表达(图10B)。
图11示出了不同癌细胞中的CD33表达水平。
图12示出了NK细胞针对K562的代表性钙黄绿素-AM释放测定。
图13A-图13B示出了电穿孔和AAV6转导后7天(图13A)和14天(图13B)人NK细胞中CD33CAR表达水平的代表性流式细胞术分析。
图14示出了载体上的NGS测序覆盖率(灰色)。黑色箭头指示引物位置。蓝色箭头指示已鉴定的载体-基因组断裂点序列(如下所述)的位置。矢量图示于底部。Y轴被限于100倍。在ITR位点之间的区域上观察到高覆盖率，载体序列载体：12-4,255。在载体：0-11和4,256-6,864上观察到低覆盖率/无覆盖，表明该主链尚未整合在该样品的大部分中，潜在地，样品的一小部分也可能含有该主链。而且，在ITR处观察到覆盖，表明在通过同源臂整合之后，样品中也发生基于ITR的整合。在覆盖区域中称为序列变体和结构变体。
图15示出了在载体整合基因座人chr19:54,550,476-55,682,266上的TLA序列覆盖率(灰色)。蓝色箭头指示断裂点序列的位置。Y轴分别被限于20倍和100倍。该图的覆盖率分布示出，在整合位点区域中尚未发生基因组重排。从该数据中得出结论：载体已经如预期整合在人染色体chr19:55,115,754-55,115,767中。根据RefSeq，这发生在PPP1R12C的内含子1中。在chr19:55,115,155-55,116,371之间观察到其他整合位点。根据RefSeq，这也发生在PPP1R12C的内含子1中。
图16示出了pAAV AAVS1(600bpHA)MND-CD33CAR(gen2)(CoOp)的构建体设计。该构建体的序列是SEQ ID NO:22。
图17示出了pAAV AAVS1(600bpHA)MND-CD33CAR(gen4v2)(CoOp)的构建体设计。该构建体的序列是SEQ ID NO:23。
图18示出了未修饰的(WT)和表达CD33-CAR的扩增NK细胞针对K562的细胞毒性的动力学评估。使用两个E:T比率，用xCelligence以15分钟的间隔监测靶标活力来进行该测定。参照不含NK细胞的对照孔计算细胞裂解％。虽然K562对WT扩增的NK细胞高度敏感，并且系列杀伤很明显(在0.5:1E:T比率下>50％裂解)，但是K562的确也表达CD33，因此CD33 CAR能够在两个E:T比率下更快速地开始杀伤并在较低E:T比率下增加总体杀伤。
图19示出了针对Kasumi的细胞毒性的动力学评估。如前图中所述进行测定。与K562相比，Kasumi对WT扩增的NK细胞具有非常强的抗性，但是向NK细胞中增加CD33 CAR靶向能够以更快的动力学更快速地开始高水平杀伤并在两个E:T比率下增加总体杀伤。
图20示出，AML细胞与WT-NK或CD33 CAR-NK细胞的共培养诱导AML细胞死亡，如SPADE曲线图(以彩色表示pRb表达，指示活的循环细胞)所示，绿色箭头指示活的AML细胞，而红色箭头指示死亡/垂死的AML细胞。CD33 CAR-NK细胞表现出增加的AML细胞杀伤，存活的AML细胞具有降低的CD33表面表达和增加的CD38表达，表明CD33 CAR和CD38抗体的组合可以起协同作用。该测定使用源自患者的AML细胞系作为靶标。
图21示出了PAMgRNA mCherry的构建体设计。该构建体的序列是SEQ ID NO:51。
图22示出了PAMgPAMg mCherry的构建体设计。该构建体的序列是SEQ ID NO:50。
V.具体实施方式
在公开和描述本发明的化合物、组合物、制品、装置和/或方法之前，应当理解，除非另外指明，否则它们不限于特定的合成方法或特定的重组生物技术方法，或除非另外指明，否则不限于特定的试剂，因此当然可能会改变。还应当理解，本文所用的术语只是为了描述具体实施方案的目的，并非旨在进行限制。
A.定义
如本说明书和所附权利要求中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指代。因此，例如，提及“药物载体”包括两个或多个此类载体的混合物等。
范围可在本文中表示为从“约”一个特定值和/或至“约”另一个特定值。当表示此类范围时，另一个实施方案包括从该一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，特定值形成另一个实施方案。还应当理解，这些范围中的每个范围的端点无论是相对于另一端点还是独立于另一端点都是重要的。还应当理解，本文公开了多个值，并且每个值在本文中除了公开为值本身之外，也公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则也公开了“约10”。还应当理解，当公开值时，也公开了“小于或等于”该值、“大于或等于该值”和值之间的可能范围，如本领域技术人员适当地理解的那样。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“小于或等于10”以及“大于或等于10”。还应当理解，在整个申请中，数据以多种不同的格式提供，并且该数据表示端点和起点以及数据点的任何组合的范围。例如，如果公开了特定数据点“10”和特定数据点15，则应当理解，认为公开了大于、大于或等于、小于、小于或等于、和等于10和15，以及在10和15之间。还应当理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则也公开了11、12、13和14。
向受试者“施用”包括向受试者引入或递送药剂的任何途径。施用可通过任何合适的途径进行，包括口服、局部、静脉内、皮下、经皮、透皮、肌内、关节内、肠胃外、小动脉内、皮内、心室内、颅内、腹膜内、病灶内、鼻内、直肠、阴道、通过吸入、经由植入型药盒、肠胃外(例如，皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、腹膜内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术)等。如本文所用，“并行施用”、“联合施用”、“同时施用”或“同时地施用”意指化合物在同一时间点施用或基本上彼此紧接着施用。在化合物基本上彼此紧接着施用的情况下，这两种化合物的施用时间足够接近，使得所观察到的结果与当化合物在同一时间点施用时所获得的结果没有区别。“全身施用”是指经由将药剂引入或递送至受试者身体的广泛区域(例如，大于身体的50％)的途径，例如通过进入循环系统或淋巴系统的入口向受试者引入或递送药剂。相比之下，“局部施用”是指经由将药剂引入或递送至施用点的区域或紧邻施用点的区域的途径将药剂引入或递送至受试者，并且不以治疗上显著量全身性地引入药剂。例如，局部施用的药剂在施用点的局部附近很容易被检测到，但在受试者身体的远侧部分检测不到或检测到的量可忽略不计。施用包括自我施用和经他人施用。
“生物相容的”通常是指通常对接受者无毒并且不会对受试者造成显著副作用的材料及其任何代谢物或降解产物。
“对照”是用于比较目的的实验中的另选受试者或样品。对照可以是“阳性”或“阴性”。
“互补的”或“基本上互补的”是指核苷酸或核酸之间，诸如例如，双链DNA分子的两条链之间或寡核苷酸引物和单链核酸上的引物结合位点之间的杂交或碱基配对或双链体的形成。互补的核苷酸通常是A和T/U，或C和G。当一条链的最佳比对和比较的并具有适当核苷酸插入或缺失的核苷酸与另一条链的至少约80％的核苷酸配对，通常至少约90％至95％的核苷酸，并且更优选约98％至100％的核苷酸配对时，认为两个单链RNA或DNA分子是基本互补的。另选地，当RNA或DNA链在选择性杂交条件下与其补体杂交时，存在基本上互补性。通常，当在至少14至25个核苷酸的区段上存在至少约65％互补性、至少约75％互补性或至少约90％互补性时，将发生选择性杂交。参见Kanehisa(1984年)，Nucl.Acids Res.，第12卷：第203页。
如本文所用，术语“包含”及其变型与术语“包括”及其变型同义使用，并且是开放的非限制性术语。虽然术语“包含”和“包括”在本文已用于描述各种实施方案，但是术语“基本上由……组成”和“由……组成”可用于代替“包含”和“包括”，以提供更具体的实施方案，并且也被公开。
“组合物”是指具有有益的生物学效果的任何药剂。有益的生物学效果包括治疗性效果(例如，治疗障碍或其他不期望的生理病症)和预防性效果两者(例如，预防障碍或其他不期望的生理病症)。该术语还涵盖本文具体提及的有益药剂的药学上可接受的、药理学活性衍生物，包括但不限于载体、多核苷酸、细胞、盐、酯、酰胺、前体药剂、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“组合物”时，或当具体鉴定特定组合物时，则应当理解，该术语包括组合物本身以及药学上可接受的、药理学活性载体、多核苷酸、盐、酯、酰胺、前体药剂、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
“编码”特定RNA的DNA序列是转录成RNA的DNA核酸序列。DNA多核苷酸可编码被翻译成蛋白质的RNA(mRNA)(并因此DNA和mRNA都编码蛋白质)，或者DNA多核苷酸可编码不被翻译成蛋白质的RNA(例如，tRNA、rRNA、微RNA(miRNA)、“非编码”RNA(ncRNA)、向导RNA等)。
“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与要表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含充足的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些载体，诸如掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
这些“片段”，无论是否与其他序列连接，可包括特定区域或特定氨基酸残基的插入、缺失、取代或其他所选择的修饰，条件是与未修饰的肽或蛋白质相比，该片段的活性未显著改变或受损。这些修饰可提供一些额外的特性，诸如以去除或添加能够形成二硫键的氨基酸，以延长其生物寿命，以改变其分泌特征等。在任何情况下，片段必须具有生物活性特性，诸如调节靶基因的转录。
术语“基因”或“基因序列”是指编码序列或控制序列或其片段。基因可包括编码序列和控制序列的任何组合，或其片段。因此，本文中提到的“基因”可以是天然基因的全部或部分。本文中提到的多核苷酸序列可与术语“基因”互换使用，或者可包括任何编码序列、非编码序列或控制序列、其片段以及它们的组合。术语“基因”或“基因序列”包括例如编码序列上游的控制序列(例如，核糖体结合位点)。
在两条或多条核酸或多肽序列的上下文中，术语“相同”或“同一性”百分比是指当在比较窗口或指定区域上进行比较和比对以获得最大对应性时，两条或多条序列或子序列是相同的或具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸(即，在指定区域上约60％同一性，优选61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，如使用具有下述默认参数的BLAST或BLAST 2.0序列比较算法测量的，或通过手动比对和视觉检查(参见例如，NCBI网站等)测量的。此类序列则被称为“基本上相同的”。该定义还指或可应用于测试序列的互补序列。该定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。如下所述，优选算法可考虑缺口等。优选地，同一性存在于长度为至少约10个氨基酸或20个核苷酸，或更优选地长度为10个-50个氨基酸或20个-50个核苷酸的区域上。如本文所用，核苷酸序列同一性百分比(％)被定义为在比对序列并引入缺口(如果需要)以实现最大序列同一性百分比之后候选序列中与参考核酸序列中的核苷酸相同的氨基酸的百分比。出于确定序列同一性百分比目的的比对可以本领域技术范围内的各种方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。可通过已知方法确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
对于序列比较，通常一条序列充当参考序列，测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可使用默认的程序参数，或者可指定另选的参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的一个示例是BLAST和BLAST 2.0算法，这两种算法分别描述于Altschul等人(1977年)，Nuc.Acids Res.，第25卷：第3389-3402页；和Altschul等人(1990年)，J.Mol.Biol.，第215卷：第403-410页。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。该算法涉及首先通过鉴定查询序列中长度为W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字进行比对时，这些高评分序列对匹配或满足一些正值阈值评分T。T被称为邻近字评分阈值(Altschul等人(1990年)，J.Mol.Biol.，第215卷，第403-410页)。这些初始邻近字采样数充当用于启动搜索的种子，以找到包含它们的更长的HSP。字采样数沿着每条序列在两个方向上延伸，只要累积比对评分可以增加。对于核苷酸序列而言，使用参数M(一对匹配残基的奖励评分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)计算累积评分。对于氨基酸序列而言，使用评分矩阵计算累积评分。当存在以下情况时，停止字采样数在每个方向上的延伸：累积比对评分从其最大实现值下降数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积评分变为零或更低；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列而言)使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用字长为3和期望值(E)为10，以及BLOSUM62评分矩阵(参见，Henikoff和Henikoff(1989年)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第89卷：第10915页)比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4和两条链的比较作为默认值。
BLAST算法还进行两条序列之间的相似性的统计分析(参见例如，Karlin和Altschul(1993年)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90卷：第5873-5787页)。由BLAST算法提供的相似性的一种量度是最小和概率(P(N))，其提供两条核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.2，更优选小于约0.01，则认为该核酸与参考序列相似。
如本文所用，术语“天然存在的”或“未修饰的”或“野生型”在应用于核酸、多肽、细胞或生物体时是指在自然界中发现的核酸、多肽、细胞或生物体。例如，存在于生物体(包括病毒)中的多肽或多核苷酸序列是野生型的(和天然存在的)，该生物体可从自然界的来源中分离，并且尚未被人在实验室中有意修饰。
“增加”可以指导致更大量的症状、疾病、组合物、病症或活性的任何变化。增加可以是病症、症状、活性、组合物以统计上显著量的任何单独、中值或平均增加。因此，增加可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％增加，只要增加是统计上显著的。
“减少”可以指导致更小量的症状、疾病、组合物、病症或活性的任何变化。当含有某物质的基因产物的遗传输出相对于不含该物质的基因产物的输出更少时，该物质也被理解为减少基因的遗传输出。又例如，减少可以是障碍的症状改变，使得症状比先前观察到的要少。减少可以是病症、症状、活性、组合物以统计上显著量的任何单独、中值或平均减少。因此，减少可以是1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％减少，只要减少是统计上显著的。
如本文所用，术语“核酸”意指由核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA)组成的聚合物。如本文所用，术语“核糖核酸”和“RNA”意指由核糖核苷酸组成的聚合物。如本文所用，术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”意指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。
“任选”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例以及没有发生的实例。
如本文所用，“可操作地连接”可指示，可将可用于表达核酸的编码序列的调节序列置于核酸分子中相对于编码序列的适当位置，以便实现编码序列的表达。同样的定义有时适用于编码序列和/或转录控制元件(例如，启动子、增强子和终止元件)和/或选择性标记物在表达载体中的排列。术语“可操作地连接”也可以指多肽区段在单条多肽链内的排列，其中各个多肽区段可以是但不限于蛋白质、其片段、连接肽和/或信号肽。术语“可操作地连接”可以指不同的各个多肽在单个多肽或其片段内的直接融合，其中在不同区段之间没有间插氨基酸；以及当各个多肽经由一个或多个间插氨基酸彼此连接时的情况。
“引物”是能够支持某种类型的酶操作并且可与靶核酸杂交以便可进行酶操作的探针的子集。引物可由本领域可获得的不干扰酶操作的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制备。
“探针”是能够与靶核酸相互作用的分子，通常以序列特异性方式，例如通过杂交与靶核酸相互作用。核酸的杂交是本领域众所周知的，并在本文中有所讨论。通常，探针可由本领域可获得的核苷酸或核苷酸衍生物或类似物的任何组合制备。
“蛋白质编码序列”或编码特定蛋白质或多肽的序列是当置于适当的调节序列的控制下时，在体外或体内转录成mRNA(在DNA的情况下)和翻译(在mRNA的情况下)成多肽的核酸序列。编码序列的边界由5'末端(N-末端)的起始密码子和3'末端(C-末端)的翻译终止无义密码子确定。编码序列可包括但不限于来自原核或真核mRNA的cDNA、来自原核或真核DNA的基因组DNA序列和合成核酸。转录终止序列通常位于编码序列的3'。
术语“多核苷酸”是指由核苷酸单体组成的单链或双链聚合物。
术语“多肽”是指由D-氨基酸或L-氨基酸的单链或者D-氨基酸和L-氨基酸通过肽键连接的混合物组成的化合物。
如本文所用，术语“启动子”定义为由细胞的合成机制或引入的合成机制识别的DNA序列，其需要启动多核苷酸序列的特异性转录。
如本文所用，术语“启动子/调节序列”意指与启动子/调节序列可操作地连接的基因产物表达所需的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，而在其他情况下，该序列也可包括增强子序列和基因产物表达所需的其他调节元件。启动子/调节序列可以是例如以组织特异性方式表达基因产物的序列。
“药学上可接受的”组分可指不是生物学上或其他方面不期望的组分，即，该组分可被掺入本发明的药物制剂中并如本文所述施用给受试者，而不会引起显著的不期望的生物学效应或以有害的方式与包含该组分的制剂的任何其他组分相互作用。当用于向人施用时，该术语通常表示该组分已符合毒理学和制造测试的要求标准，或者它包含在美国食品药品监督管理局制定的非活性成分指南中。
“药学上可接受的载体”(有时称为“载体”)是指可用于制备通常安全无毒的药物或治疗组合物的载体或赋形剂，并且包括兽医和/或人类药物或治疗用途可接受的载体。术语“载体”或“药学上可接受的载体”可包括但不限于磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳剂(例如油/水或水/油乳剂)和/或各种类型的润湿剂。如本文所用，术语“载体”包括但不限于任何赋形剂、稀释剂、填充剂、盐、缓冲剂、稳定剂、增溶剂、脂质、稳定剂或本领域公知的用于药物制剂和如本文进一步所述的其他材料。
如在“药理学活性”衍生物或类似物中的“药理学活性”(或简单地“活性”)可以指具有与母体化合物相同类型的药理学活性并且在程度上近似相等的衍生物或类似物(例如，盐、酯、酰胺、缀合物、代谢物、异构体、片段等)。
药剂的“有效量”是指足以提供期望效果的药剂的量。“有效的”药剂的量因受试者而异，这取决于许多因素，诸如受试者的年龄和一般状况、特定的一种或多种药剂等。因此，并不总是能够确定量化的“有效量”。然而，在任何受试者情况下，合适的“有效量”可由本领域普通技术人员使用常规实验来确定。此外，如本文所用，并且除非另有特别说明，否则药剂的“有效量”也可指涵盖治疗有效量和预防有效量两者的量。实现治疗效果所必需的药剂的“有效量”可根据诸如受试者的年龄、性别和体重之类的因素而变化。可调整给药方案以提供最佳的治疗性应答。例如，可每天施用若干分次剂量，或者可如治疗情况的紧急性所指示的那样按比例减少剂量。
“治疗剂”是指具有有益的生物学效果的任何组合物。有益的生物学效果包括治疗性效果(例如，治疗障碍或其他不期望的生理病症)和预防性效果两者(例如，预防障碍或其他不期望的生理病症(例如，癌症))。该术语还涵盖本文具体提及的有益药剂的药学上可接受的、药理学活性衍生物，包括但不限于盐、酯、酰胺、前体药剂、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。当使用术语“治疗剂”时，或当具体鉴定特定药剂时，则应当理解，该术语包括药剂本身以及药学上可接受的、药理学活性盐、酯、酰胺、前体药剂、缀合物、活性代谢物、异构体、片段、类似物等。
组合物(例如，包含药剂的组合物)的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是指有效实现期望治疗结果的量。在一些实施方案中，期望的治疗结果是控制癌症。在一些实施方案中，期望的治疗结果是控制转移。在一些实施方案中，期望的治疗结果是减小肿瘤大小。在一些实施方案中，期望的治疗结果是预防和/或治疗复发。给定治疗剂的治疗有效量通常会随着诸如所治疗的障碍或疾病的类型和严重程度以及受试者的年龄、性别和体重等因素而变化。该术语还可指有效地促进期望治疗效果(诸如，疼痛缓解)的治疗剂的量或治疗剂的递送速率(例如，随时间变化的量)。确切的期望治疗效果将根据待治疗的病症、受试者的耐受性、待施用的药剂和/或药剂制剂(例如，治疗药剂的效力、制剂中药剂的浓度等)以及本领域普通技术人员理解的各种其他因素而变化。在一些情况下，在几天、几周或几年的时间内向受试者施用多剂量的组合物后，获得了期望的生物学或医学应答。
如本文所用，“转基因”是指已经提供给细胞或可人工提供给细胞的外源遗传物质(例如，一种或多种多核苷酸)。该术语可用于指编码作为本公开的主题的本文所公开的任何多肽的“重组”多核苷酸。术语“重组”是指在人工提供序列的细胞中不存在的序列(例如，多核苷酸或多肽序列)，或以在人工提供序列的细胞中不存在的排列方式与另一多核苷酸连接。应当理解，“人工”是指宿主细胞中的非天然存在，并且包括通过人、机器、外源因子(例如，酶、病毒等)的操作，其他非天然操作，或它们的组合。转基因可包括与启动子(例如，开放阅读框)可操作地连接的基因，但不限于此。在人工地向细胞提供转基因后，转基因可整合到宿主细胞染色体中，存在于染色体外，或以它们的任何组合存在。
在整个本申请中，引用了各种出版物。这些出版物的全部公开内容据此通过引用方式并入本申请，以便更全面地描述其所属的现有技术。本发明所公开的参考文献也因其中所包含的材料单独且具体地通过引用方式并入本文，在依赖该参考文献的句子中对该材料进行了讨论。
B.质粒和遗传修饰细胞的方法
由于强大的外源DNA和RNA感应机制，使用病毒或非病毒载体对NK细胞进行基因修饰一直具有挑战性，这可能限制基因递送方法应用于NK细胞的效率。为了克服这种限制，开发了一种新方法，以将Cas9/核糖核蛋白复合物(Cas9/RNP)直接电穿孔到人原代NK细胞中。该方法在NK细胞的基因组中引入双链断裂(DSB)，这导致成功的基因敲除和增强的抗肿瘤活性。在基因沉默的这种初始成功之后，进一步进行基因插入方法的开发。在Cas9引入DSB后，可采用两种独立的和先天的DNA修复机制来修复断裂：同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)。在编码感兴趣的基因的DNA模板的存在下，可使用这些修复机制中的任一种修复机制将外源基因整合到Cas9靶向位点中。
因此，本文公开了与成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关9(Cas9)整合系统一起使用的质粒，其中质粒按顺序包含左同源臂、多核苷酸序列和右同源臂，该多核苷酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)多肽诸如例如包含靶向靶细胞上的受体(例如CD33)的scFv的CAR、跨膜结构域(例如NKG2D跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域或CD3ξ跨膜结构域)、共刺激结构域(例如2B4结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域，或2B4结构域、CD28共刺激结构域和/或4-1BB共刺激结构域的任何组合)和CD3ξ信号传导结构域；其中左同源臂和右同源臂各自的长度为1000bp或更短(例如，约30bp长、约300bp长或约600bp长)。
通常，“CRISPR系统”或“CRISPR整合系统”统称为参与CRISPR相关“Cas”基因的表达或引导其活性的转录物和其他元件。在一些实施方案中，CRISPR系统的一个或多个元件源自I型、II型或III型CRISPR系统。CRISPR系统是本领域已知的。参见例如，美国专利号8,697,359，其全文以引用方式并入本文。
核酸内切酶/RNP(例如，Cas9/RNP)由三种组分组成，即与CRISPR基因座复合的重组核酸内切酶蛋白(例如，Cas9核酸内切酶)。与CRISPR基因座复合的核酸内切酶可被称为CRISPR/Cas向导RNA。CRISPR基因座包括合成的单链向导RNA(gRNA)，该合成的单链向导RNA(gRNA)由可与靶序列复合的互补重复RNA(crRNA)和反式互补重复RNA(tracrRNA)杂交的RNA组成。因此，CRISPR/Cas向导RNA与细胞的基因组DNA内的靶序列杂交。在一些情况下，2类CRISPR/Cas核酸内切酶是II型CRISPR/Cas核酸内切酶。在一些情况下，2类CRISPR/Cas核酸内切酶是Cas9多肽，并且对应的CRISPR/Cas向导RNA是Cas9向导RNA。与外源DNA依赖性方法相比，这些Cas9/RNP因作为功能性复合物递送而能够以更高的效率切割基因组靶标。此外，从细胞中快速清除Cas9/RNP可减少脱靶效应，诸如诱导细胞凋亡。
为了制备RNP复合物，在95℃下，可将crRNA和tracrRNA以1:1、2:1或1:2的比率在约50μM至约500μM之间(例如，50μM、60μM、70μM、80μM、90μM、100μM、125μM、150μM、175μM、200μM、225μM、250μM、275μM、300μM、325μM、350μM、375μM、400μM、425μM、450μM、475μM或500μM)，优选在100μM至约300μM之间，最优选约200μM的浓度下混合约5分钟以形成crRNA:tracrRNA复合物(即，向导RNA)。然后可将crRNA:tracrRNA复合物与约20μM至约50μM之间(例如，21μM、22μM、23μM、24μM、25μM、26μM、27μM、28μM、29μM、30μM、31μM、32μM、33μM、34μM、35μM、36μM、37μM、38μM、39μM、40μM、41μM、42μM、43μM、44μM、45μM、46μM、47μM、48μM、49μM或50μM)的Cas核酸内切酶(诸如例如，Cas9)的最终稀释液混合。
一旦结合到靶细胞中的靶序列，CRISPR基因座就可通过向靶DNA中引入一个或多个碱基对的插入或缺失、通过异源DNA片段(例如，供体多核苷酸)的插入、通过内源DNA片段的缺失、通过内源DNA片段的倒位或易位、或它们的组合来修饰基因组。因此，当与DNA组合用于同源重组时，本发明所公开的方法可用于产生敲除或敲入。本文表明，经由Cas9/RNP的腺相关病毒(AAV)转导是相对有效的方法，该方法克服了细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、成纤维细胞、造骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌细胞)中遗传修饰的先前限制。
最近已表明，CRISPR/Cas9系统便于在同源重组(HR)期间使用腺相关病毒(AAV)载体作为供体模板DNA进行高水平的精确基因组编辑。然而，AAV先前的使用受到限制，因为由于其免疫功能，NK细胞和NK T细胞对病毒和细菌载体具有抗性而通过所述载体诱导NK细胞/NK T细胞凋亡。因此，在本发明的方法之前，对NK细胞或NK T细胞进行CRISPR/Cas修饰一直不成功。此外，约4.5千碱基的最大AAV包装容量限制了包含同源臂的供体大小。建议任何高于100bp的转录物和任何转基因都应具有每个臂至少800bp的同源臂，其中许多系统采用800bp和1000bp的不对称臂，总计1800bp。因此，AAV载体不能递送大于约2.5kb的转基因。在一方面，本文公开了AAV CRISPR/CAS9核苷酸递送系统，其包含具有在30bp至1000bp之间，包括但不限于30bp、50bp、100bp、110bp、120bp、130bp、140bp、150bp、160bp、170bp、180bp、190bp、200bp、210bp、220bp、230bp、240bp、250bp、260bp、270bp、280bp、290bp、300bp、310bp、320bp、330bp、340bp、350bp、360bp、370bp、380bp、390bp、400bp、410bp、420bp、430bp、440bp、450bp、460bp、470bp、480bp、490bp、500bp、510bp、520bp、530bp、540bp、550bp、560bp、570bp、580bp、590bp、600bp、610bp、620bp、630bp、640bp、650bp、660bp、670bp、680bp、690bp、700bp、710bp、720bp、730bp、740bp、750bp、760bp、770bp、780bp、790bp、800bp、810bp、820bp、830bp、840bp、850bp、860bp、870bp、880bp、890bp、900bp、910bp、920bp、930bp、940bp、950bp、960bp、970bp、980bp、990bp或1000bp的同源臂的供体构建体质粒。例如，同源臂可以是对称的30bp同源臂、对称的300bp同源臂、对称的500bp同源臂、对称的600bp同源臂、对称的800bp同源臂、对称的1000bp同源臂或不对称的800bp同源臂，包括800bp左同源臂(LHA)和1000bp右同源臂(RHA)以用于同源重组(HR)，或根本没有同源臂以使用不依赖同源性的靶向整合(HITI)质粒进行非同源末端连接。在一些示例中，具有或不具有同源臂的质粒是在国际公开号WO2020/198675中公开的那些质粒，该国际公开全文以引用方式并入本文。在一些实施方案中，质粒具有临床上批准的剪接受体(SA)(SEQ ID NO:10)和临床上批准的聚腺苷酸化终止子(PA)(诸如例如，BGH polyA终止子SEQ ID NO:11)。应当理解并且在本文中设想，同源臂可以是对称的(每侧长度相同)或不对称的(每侧长度不同)以适应不同的转基因长度。也就是说，同源臂长度可具有左同源臂(LHA)长度和右同源臂(RHA)长度的任意组合，包括但不限于LHA 30bp(SEQ ID NO:2)和RHA30bp(SEQ ID NO:1)、LHA 30bp和RHA 100bp、LHA 30bp和RHA 300bp(SEQ ID NO:3)、LHA30bp和RHA 500bp(SEQ ID NO:5)、LHA 30bp和RHA 800bp(SEQ ID NO:7)、LHA 30bp和RHA1000bp、LHA 100bp和RHA 30bp、LHA 100bp和RHA 100bp、LHA 100bp和RHA 300bp、LHA100bp和RHA 500bp、LHA 100bp和RHA 800bp、LHA 100bp和RHA 1000bp、LHA 300bp(SEQ IDNO:4)和RHA 30bp、LHA 300bp和RHA 100bp、LHA 300bp和RHA 300bp、LHA 300bp和RHA500bp、LHA 300bp和RHA 800bp、LHA 300bp和RHA 1000bp、LHA 500bp(SEQ ID NO:6)和RHA30bp、LHA 500bp和RHA 100bp、LHA 500bp和RHA 300bp、LHA 500bp和RHA 500bp、LHA 500bp和RHA 800bp、LHA 500bp和RHA 1000bp、LHA 800bp(SEQ ID NO:8)和RHA 30bp、LHA 800bp和RHA 100bp、LHA 800bp和RHA 300bp、LHA 800bp和RHA 500bp、LHA 800bp和RHA 800bp、LHA 800bp和RHA 1000bp、LHA 1000bp和RHA 30bp、LHA 1000bp和RHA 100bp、LHA 1000bp和RHA 300bp、LHA 1000bp和RHA 500bp、LHA 1000bp和RHA 800bp以及LHA 1000bp和RHA1000bp。
有几种方式提供DNA模板，包括病毒和非病毒方法。在非病毒方法中，单链或双链DNA模板通常连同Cas9/RNP一起电穿孔，然而，与病毒转导相比，该方法具有较低的效率。对于病毒基因递送，腺相关病毒(AAV，包括AAV6)被安全地用于临床试验，并且可用作敏感的原代免疫细胞(包括T细胞)的载体。
经由AAV载体递送的转录物可包装为长度约4.7kb的线性单链(ss)DNA(ssAAV)或线性自互补(sc)DNA(scAAV)。scAAV载体的益处在于它含有突变的反向末端重复序列(ITR)，与ssDNA载体相比，它是复制所需的并且有助于绕过生成第二链的限速步骤。由于scAAV的包装容量的限制，设计了Cas9靶向位点的右侧和左侧的30bp、300bp、500bp和800bp-1000bp的HA，以找出HA的最佳长度，并提供研究者基于转基因的大小选择的HA的可能长度(例如，如图。2A中所示)。另外，由于与ssAAV相比包装容量的限制，scAAV可能不适合较大的转基因，诸如靶向CD33的嵌合抗原受体(CAR)。因此，基于转基因的大小，设计和测试了ssAAV和scAAV两者，这为原代NK细胞和/或NK T细胞中的基因插入提供了广泛的选择。
已经表明，重组效率随着HA长度的增加而增加。因此，对于ssAAV主链，左同源臂和右同源臂(HA)的最长可能长度用于mCherry(例如，800bp-1000bp的HA)和CD33 CAR-NK(例如，600bp的HA)。由于设计同源臂是耗时的过程并且需要多次优化，因此也已研究了CRISPaint方法，一种用于基因插入或标记的不依赖同源性的方法。在该方法中，在编码感兴趣的基因的DNA模板中提供了相同的Cas9靶向位点，包括编码crRNA和PAM序列的序列(本文也称为PAMg，例如SEQ ID NO:9)。在引入Cas9复合物后，同时切割模板和基因组DNA。因此，CRISPaint模板以可通过非同源修复机制整合的线性化双链DNA呈现(例如，如图2B中所示)。在一些示例中，CRISPaint DNA模板如图21和图22中所示。因此，在一个方面，本文公开了用于将供体转基因递送至细胞并将所述转基因(例如，CAR)与CRISPR/Cas9组合整合到细胞中的质粒。因此，本文公开了与任何前述方面的CRISPR/Cas9整合系统一起使用的质粒，其中左同源臂和右同源臂具有相同长度或不同长度。
在一些方面，同源臂与人19号染色体的腺相关病毒整合位点1(AAVS1)特异性地杂交。在一些实施方案中，LHA的长度为600bp。在一些实施方案中，LHA包含与SEQ ID NO:31至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)同一性的序列或其片段。在一些实施方案中，RHA的长度为600bp。在一些实施方案中，RHA包含与SEQ ID NO:32至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)同一性的序列或其片段。
本文公开的质粒包含编码嵌合抗原受体CAR多肽的多核苷酸序列。如本文所用，“嵌合抗原受体”或“CAR”是指靶向癌抗原并用来将表达该受体的细胞定向至表达靶抗原的癌细胞的嵌合受体。通常，CAR包括识别肽的分子，这些肽源自由主要组织相容性(MHC)分子呈递的肿瘤抗原；或在靶向癌抗原的CAR细胞表面上表达的抗体或其片段(诸如例如，Fab'、scFv、Fv)。受体经由接头与信号传导结构域(诸如例如，T细胞的CD3ξ结构域以及NK细胞或NK T细胞的NKG2C、NKp44或CD3ξ结构域)融合。肿瘤抗原靶标是由肿瘤细胞产生的引发免疫应答(特别是B细胞、NK细胞、NK T细胞和T细胞介导的免疫应答)的蛋白质。抗原结合结构域的选择将取决于要治疗的癌症的具体类型。肿瘤抗原是本领域众所周知的，并包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、EGFRvIII、IL-llRa、IL-13Ra、EGFR、FAP、B7H3、Kit、CALX、CS-1、MUC1、BCMA、bcr-abl、HER2、β-人绒毛膜促性腺激素、α-胎甲球蛋白(AFP)、ALK、CD19、CD123、细胞周期蛋白Bl、凝集素反应性AFP、Fos相关抗原1、ADRB3、甲状腺球蛋白、EphA2、RAGE-1、RUl、RU2、SSX2、AKAP-4、LCK、OY-TESl、PAX5、SART3、CLL-1、岩藻糖基GM1、GloboH、MN-CA IX、EPCAM、EVT6-AML、TGS5、人端粒酶逆转录酶、聚唾液酸、PLAC1、RUl、RU2(AS)、肠羧基酯酶、lewisY、sLe、LY6K、mut hsp70-2、M-CSF、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIBI、BORIS、prostase、前列腺特异抗原(PSA)、PAX3、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、LMP2、NCAM、p53、p53突变体、Ras突变体、gplOO、prostein、OR51E2、PANX3、PSMA、PSCA、Her2/neu、hTERT、HMWMAA、HAVCR1、VEGFR2、PDGFR-β、生存素和端粒酶、豆荚蛋白、HPV E6,E7、精子蛋白17、SSEA-4、酪氨酸酶、TARP、WT1、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、ML-IAP、MAGE、MAGE-A1、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MelanA/MART 1、XAGE1、ELF2M、ERG(TMPRSS2ETS融合基因)、NA17、中心粒细胞弹性蛋白酶、肉瘤易位断点、NY-BR-1、ephnnB2、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD97、CD171、CD179a、雄激素受体、FAP、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGFII、IGF-I受体、GD2、o-乙酰基-GD2、GD3、GM3、GPRC5D、GPR20、CXORF61、叶酸受体(FRa)、叶酸受体β、ROR1、Flt3、TAG72、TN Ag、Tie 2、TEM1、TEM7R、CLDN6、TSHR、UPK2和间皮素。肿瘤抗原的非限制性示例包括以下：分化抗原，诸如酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤特异性多谱系抗原诸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pi 5；过表达的胚胎抗原，诸如CEA；过表达的癌基因和突变的肿瘤抑制基因，诸如p53、Ras、HER-2/neu；由于染色体易位产生的独特肿瘤抗原，诸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；以及病毒抗原，诸如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人类乳突病毒(HPV)抗原E6和E7。其他基于蛋白质的大抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、IL13Ra2、CA19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、甲胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCASl、SDCCAG1 6、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、GPC3、MUC16、LMP1、EBMA-1、BARF-1、CS1、CD319、HER1、B7H6、L1CAM、IL6和MET。
CAR多肽还可包含跨膜结构域(诸如例如，NKG2D跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域和/或CD3ξ跨膜结构域)和共刺激结构域(诸如例如，2B4结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域，或2B4结构域、CD28共刺激结构域和/或4-1BB共刺激结构域的任何组合)。例如，在一些实施方案中，CAR多肽包含IgG4铰链结构域、CD4跨膜结构域、CD28共刺激结构域、CD3ζ多肽和特异性地结合靶细胞(包括但不限于表达靶抗原(例如，CD33)的癌细胞)上的受体的单链可变片段(scFV)。在一些实施方案中，CAR多肽包含IgG4铰链结构域、NKG2D跨膜结构域、2B4结构域、CD3ζ多肽和特异性地结合靶细胞(包括但不限于表达靶抗原(例如，CD33)的癌细胞)上的受体的单链可变片段(scFV)。在一些实施方案中，CAR多肽是图6B中所示的那些多肽。在一些实施方案中，编码本文所述的CAR多肽的多核苷酸包含与SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)同一性的序列或其片段。在一些示例中，包含CAR编码多核苷酸的质粒的设计如图16和图17中所示。
在一些实施方案中，编码本文所述的scFv的多核苷酸包含与SEQ ID NO:18至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)同一性的序列或其片段。
在一些实施方案中，编码本文所述的IgG4铰链的多核苷酸包含与SEQ ID NO:19至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)同一性的序列或其片段。
在一些实施方案中，编码本文所述的CD28共刺激结构域的多核苷酸包含与SEQ IDNO:20至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)同一性的序列或其片段。
在一些实施方案中，编码本文所述的CD3ζ的多核苷酸包含与SEQ ID NO:21、SEQID NO:28至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)同一性的序列或其片段。
在一些实施方案中，编码本文所述的NKG2D跨膜结构域的多核苷酸包含与SEQ IDNO:24至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)同一性的序列或其片段。
在一些实施方案中，编码本文所述的2B4结构域的多核苷酸包含与SEQ ID NO:26至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)同一性的序列或其片段。
在一些实施方案中，编码抗CD33 scFv的多核苷酸包含与SEQ ID NO:29至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)同一性的序列或其片段。
在一些实施方案中，本文所述的MND启动子包含与SEQ ID NO:30至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)同一性的序列或其片段。
在一些实施方案中，本文所述的表达载体包含一条或多条接头序列，其中接头序列包含与SEQ ID NO:25至少约70％(例如，至少约75％、80％、85％、90％、95％、97％或99％)同一性的序列或其片段。
因此，在一些实施方案中，本文公开的质粒包含编码CAR多肽的多核苷酸序列，其中CAR多肽包含跨膜结构域(例如，NKG2D跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域或CD3ξ跨膜结构域)、共刺激结构域(例如，2B4结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域，或2B4结构域、CD28共刺激结构域和/或4-1BB共刺激结构域的任何组合)、CD3ζ和特异性地结合靶细胞(例如，表达CD33的癌细胞)上的受体的单链可变片段(scFV)。在一些实施方案中，CAR多肽特异性地结合CD33。
本文还公开了可经由HITI、CRISPaint或其他非同源末端连接(NHEJ)整合到转导细胞的基因组中的质粒。因此，它们具有以更高效率整合的优点。在一些示例中，用于NHEJ的质粒是在国际公开号WO2020/198675中公开的那些质粒，该国际公开全文以引用方式并入本文。为了帮助鉴定切割位点以去除用于整合的转基因，质粒包含一条或多条PAMg序列(即，前间隔序列邻近基序(PAM)和编码crRNA的序列(即，gRNA))(SEQ ID NO:9)以靶向供体转基因整合。在一些示例中，对于NHEJ DNA模板(例如，CRISPaint DNA模板)，将单(PAMg)或双(PAMgPAMg)Cas9靶向序列掺入转基因(例如，编码CAR的多核苷酸，诸如本文公开的CD33CAR)周围，但在ITR内。因此，Cas9可同时切割gDNA和CRISPaint DNA模板，使得能够在基因组DSB处整合。
因此，在一些方面，本文公开了与成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关9(Cas9)整合系统一起使用的质粒，其中质粒包含编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的多核苷酸序列；其中多核苷酸序列与一条前间隔序列邻近基序(PAM)和一条编码crispr RNA(crRNA)的多核苷酸序列相邻，或者侧接两条PAM和两条编码crRNA的多核苷酸序列。在一些方面，本文公开了与成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关9(Cas9)整合系统一起使用的质粒，其中质粒按顺序包含一条前间隔序列邻近基序(PAM)序列和一条编码crRNA的多核苷酸序列、编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的多核苷酸序列以及一条PAM序列和一条编码crRNA的多核苷酸序列。在一些示例中，质粒如图2B、图21和图22中所示。
另外，尽管使用单链(SS)质粒来插入较大转基因是有益的，SS质粒仍然可能需要更多的时间来折叠并在整合之前用作细胞内部的双链DNA，这增强了一些细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、成纤维细胞、造骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌细胞)中的DNA感应机制和细胞毒性。为了减少暴露于细胞中的外源DNA的时间，本文通过使用自互补(SC)(双链)构建体克服了这个问题。
应当理解并在本文中设想，为了将Cas9核酸酶活性靶向靶位点并且还切割供体质粒以允许供体转基因重组到宿主DNA中，使用crispr RNA(crRNA)。在一些情况下，将crRNA与tracrRNA组合以形成向导RNA(gRNA)。本发明所公开的质粒使用AAV整合、蛋白磷酸酶1的内含子1、人19号染色体上的调节亚基12C(PPP1R12C)基因(称为AAVS1)作为用于整合转基因的靶位点。该基因座是“安全港基因”，并允许在许多细胞类型中稳定、长期的转基因表达。由于PPP1R12C的破坏与任何已知的疾病无关，通常认为AAVS1基因座是用于转基因靶向的安全港。因为AAVS1位点被用作靶位置，所以CRSPR RNA(crRNA)必须靶向所述DNA。在此，本文公开的向导RNA包含GGGGCCACTAGGGACAGGAT(SEQ ID NO:17)或其任何10个核苷酸的有义或反义连续片段。因此，在一些示例中，PAM+编码crRNA的序列包含SEQ ID NO:9。虽然AAVS1在此用于示例性目的，但应当理解并在本文中设想，如果考虑到被转染的特定细胞类型或转基因更合适的话，可使用具有等效结果的其他“安全港基因”，并且这些基因可替代AAVS1。其他安全港基因的示例包括但不限于C-C趋化因子受体5型(CCR5)、ROSA26基因座和TRAC。
在一个示例中，本文公开的质粒还包含鼠白血病病毒源性(MND)启动子。
如上所述，使用AAV作为载体来递送本发明所公开的CRISPR/Cas9质粒和任何供体转基因受限于最大约4.5kb。应当理解并在本文中设想，增加转基因的允许大小的一种方法是通过交换通常用于合成Cas9的化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)(SpCas9)的Cas9或来自不同细菌来源的Cas9来形成额外的空间。Cas9的取代也可用于增加靶向特异性，因此需要使用更少的gRNA。因此，例如，Cas9可源自金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(SaCas9)、氨基酸球菌属(Acidaminococcus)物种(AsCpf1)、毛螺科细菌(Lachnospiracase bacterium)(LbCpf1)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)(NmCas9)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)(StCas9)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)(CjCas9)、增强型SpCas9(eSpCas9)、SpCas9-HF1、Fokl融合的dCas9、扩增的Cas9(xCas9)和/或催化失活的Cas9(dCas9)。
应当理解并在本文中设想，使用特定的Cas9可改变Cas9核酸内切酶(或另选物)用于筛选靶标的PAM序列。如本文所用，合适的PAM序列包括NGG(SpCas9 PAM)、NNGRRT(SaCas9PAM)、NNNNGATT(NmCAs9 PAM)、NNNNRYAC(CjCas9 PAM)、NNAGAAW(St)、TTTV(LbCpf1 PAM和AsCpf1 PAM)；TYCV(LbCpf1 PAM变体和AsCpf1PAM变体)；其中N可以是任何核苷酸；V＝A、C或G；Y＝C或T；W＝A或T；并且R＝A或G。
在一个方面，本文公开了遗传修饰细胞的方法，这些方法包括获得包含2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)与特异于细胞中的靶DNA序列的对应CRISPR/Cas向导RNA(gRNA)复合的核糖核蛋白(RNP)复合物和包含转基因(诸如例如，肿瘤抗原的嵌合抗原受体)的质粒；其中转基因侧接同源臂；以及b)将转基因和RNP复合物引入到细胞中；其中转基因经由腺相关病毒(AAV)感染到靶细胞中而被引入到细胞中；其中RNP复合物与细胞的基因组DNA内的靶序列杂交。在一个方面，该方法还可包括经由电穿孔(诸如当修饰NK细胞或NKT细胞时)将RNP复合物引入细胞中。在一个方面，该方法还可包括用包含RNP复合物的第二AAV病毒重复感染靶细胞。在一个方面，当转基因足够小时，相同的AAV可包含转基因和RNP复合物两者。在另外的方面，转基因和RNP复合物可编码在相同的质粒上。
在一个方面，本文公开了遗传修饰细胞(例如，NK细胞或NK T细胞)的方法，这些方法包括a)获得包含2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)与对应CRISPR/Cas向导RNA复合的核糖核蛋白(RNP)复合物和包含质粒的AAV载体，该质粒包含转基因(诸如例如，肿瘤抗原的嵌合抗原受体)；其中转基因与一条PAM和crRNA邻近或侧接两条PAM和两条编码crRNA的序列；以及b)将转基因和RNP复合物引入到细胞中；其中转基因经由AAV感染到靶细胞中而被引入到细胞中；其中核糖核蛋白(RNP)复合物与细胞的基因组DNA内的靶序列杂交，并且细胞的DNA修复酶在靶序列处(例如，通过非同源末端连接)将转基因插入到宿主基因组中，从而产生经修饰的细胞。在一个方面，该方法还可包括经由电穿孔(诸如当修饰NK细胞或NK T细胞时)将RNP复合物引入细胞中。在一个方面，该方法还可包括用包含RNP复合物的第二AAV病毒重复感染靶细胞。在一个方面，当转基因足够小时，相同的AAV可包含转基因和RNP复合物两者。在另一方面，转基因和RNP复合物可编码在相同的质粒上。
在一些示例中，本文所述的AAV可用作载体以递送本发明所公开的先导编辑质粒和本文所述的任何供体转基因(例如，编码CAR的多核苷酸)。先导编辑是一种“搜索和替换”基因组编辑技术，其介导人细胞中的靶向插入、缺失、碱基到碱基的转换以及它们的组合，而不需要DSB或供体DNA模板。先导编辑可使用包含催化受损的Cas9内切核酸酶、工程化逆转录酶、RNA可编程切口酶和/或先导编辑向导RNA(pegRNA)的融合蛋白来将遗传信息从pegRNA上的延伸直接拷贝到靶基因组基因座中。用于设计和使用先导编辑的方法是本领域中已知的。参见例如，Anzalone,A.V.、Randolph,P.B.、Davis,J.R.等人，Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA，Nature，第576卷：第149-157页(2019年)，该文献全文以引用方式并入本文。
应当理解并在本文中设想，本发明所公开的方法可用于任何细胞类型，包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、成纤维细胞、造骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞以及任何其他细胞类型。人NK细胞是本发明所公开的质粒及其使用方法的特别优异的靶标。NK细胞是由CD56或CD16的表达和T细胞受体(CD3)的缺乏来定义的外周血淋巴细胞的亚群。NK细胞感应并杀死缺乏主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的靶细胞。NK细胞活化受体包括天然细胞毒性受体(NKp30、NKp44和NKp46)和凝集素样受体NKG2D和DNAM-1。它们的配体在应激的、转化的或感染的细胞上表达，但不在正常细胞上表达，使得正常细胞对NK细胞杀伤产生抗性。NK细胞活化经由抑制性受体诸如杀伤免疫球蛋白(Ig)样受体(KIR)、NKG2A/CD94、TGF和白细胞Ig样受体-1(LIR-1)负调节。在一个方面，靶细胞可以是来自供体来源(诸如例如用于过继转移疗法的同种异体供体来源或自体供体来源(即，经修饰的细胞的最终接受者))的原代NK细胞、NK细胞系(包括但不限于NK RPMI8866；HFWT、K562和EBV-LCL)，或源自原代NK细胞来源或NK细胞系的扩增NK细胞的来源。
在转导细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、成纤维细胞、造骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌肉细胞)之前，可在适于细胞增殖的培养基中温育细胞。应当理解并在本文中设想，培养条件可包括添加细胞因子、抗体和/或饲养细胞。因此，在一个方面，本文公开了遗传修饰细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、成纤维细胞、造骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌细胞)的方法，该方法还包括在将细胞在支持细胞增殖的培养基中转导之前，将细胞温育至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天；其中培养基还包含细胞因子、抗体和/或饲养细胞。例如，培养基可包含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和/或IL-21。在一个方面，培养基还可包含抗CD3抗体。在一个方面，饲养细胞可从刺激细胞的饲养细胞中纯化。例如，本文公开的用于要求保护的发明的刺激NK细胞的饲养细胞可以是经辐照的自体或同种异体外周血单核细胞(PBMC)或未辐照的自体或PBMC；RPMI8866；HFWT，K562；用膜结合的IL-15和41BBL或IL-21或它们的任何组合转染的K562细胞；或EBV-LCL。在一些方面，饲养细胞与IL-21、IL-15和/或41BBL的溶液组合提供。饲养细胞可以1:2、1:1或2:1的比例接种在细胞培养物中。应当理解并在本文中设想，培养期可以是AAV感染后1天至14天之间(即，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天)，优选3天至7天之间，最优选4天至6天之间。
应当理解并在本文中设想，用于原代细胞和扩增细胞(包括但不限于原代和扩增的T细胞、NK细胞、NK T细胞或B细胞)的温育条件可以不同。在一个方面，AAV感染前原代NK细胞或NK T细胞的培养包括培养基和细胞因子(诸如例如，IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和/或IL-21)和/或抗CD3抗体培养少于5天(例如，1天、2天、3天或4天)。对于扩增的NK细胞，除了细胞因子(诸如例如，IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和/或IL-21)和/或抗CD3抗体之外或作为替代，培养可在NK饲养细胞(例如，以1:1的比例)的存在下进行。在转导之前扩增的NK细胞的培养可进行1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天。因此，在一个方面，本文公开了遗传修饰细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、成纤维细胞、神经元细胞、造骨细胞、肝细胞、上皮细胞和/或肌细胞)的方法，这些方法包括在用AAV载体感染和/或电穿孔(当RNP复合物经由电穿孔引入时)之前在IL-2的存在下将原代细胞温育4天，或在用AAV感染和/或电穿孔(当RNP复合物经由电穿孔引入时)之前在经辐照的饲养细胞的存在下将扩增的细胞温育4天、5天、6天或7天。
在细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、成纤维细胞、造骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌细胞)的转导(例如，经由AAV感染或电穿孔)后，现有经修饰的细胞可在包含刺激经修饰的细胞(诸如例如，T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、成纤维细胞、造骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌细胞)的饲养细胞的培养基中增殖。因此，经修饰的细胞保留了活力和增殖潜力，因为它们能够在AAV感染和/或电穿孔(当RNP复合物经由电穿孔引入时)后使用经辐照的饲养细胞扩增。例如，本文公开的用于要求保护的发明的刺激NK细胞的饲养细胞可以是经辐照的自体或同种异体外周血单核细胞(PBMC)或未辐照的自体或PBMC；RPMI8866；HFWT，K562；用膜结合的IL-15和41BBL或IL-21或它们的任何组合转染的K562细胞；或EBV-LCL。在一些方面，NK细胞饲养细胞与IL-21、IL-15和/或41BBL的溶液组合提供。饲养细胞可以1:2、1:1或2:1的比例接种在NK细胞培养物中。应当理解并在本文中设想，培养期可以是感染和/或电穿孔后1天至14天之间(即，1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天)，优选3天至7天之间，最优选4天至6天之间。在一些方面，用于培养经修饰的NK细胞的培养基还可包含细胞因子，诸如例如，IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和/或IL-21。
在一个方面，应当理解并在本文中设想，本发明所公开的遗传修饰细胞的方法的一个目标是产生经修饰的细胞。因此，本文公开了通过本发明所公开的方法制备的经修饰的T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、NK T细胞、成纤维细胞、造骨细胞、肝细胞、神经元细胞、上皮细胞和/或肌细胞。因此，在一个方面，本文公开了经修饰的NK细胞和/或NK T细胞(包括但不限于CAR NK细胞和/或CAR NK T细胞)，这些细胞包含本文公开的质粒或载体中的任一者。例如，本文公开了抗CD33 CAR NK细胞和抗CD33 CAR NK T细胞(包括但不限于抗CD33CAR NK细胞和/或NK T细胞，其中抗CD33CAR包含靶向CD33的scFv、跨膜结构域(诸如例如，NKG2D跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域和/或CD3ξ跨膜结构域)和共刺激结构域(诸如例如，2B4结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域，或2B4结构域、CD28共刺激结构域和/或4-1BB共刺激结构域的任何组合)。
在一个方面，本文公开了产生嵌合抗原受体(CAR)自然杀伤(NK)细胞的方法，这些方法包括a)获得包含2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)与对应CRISPR/Cas向导RNA复合的核糖核蛋白(RNP)复合物和包含质粒的AAV载体，该质粒包含转基因(诸如例如，肿瘤抗原的嵌合抗原受体)；其中转基因与一条PAM和crRNA邻近或侧接两条PAM和crRNA；以及b)将转基因和RNP复合物引入到细胞中；其中转基因经由腺相关病毒(AAV)感染到靶细胞中而被引入到细胞中；其中核糖核蛋白(RNP)复合物与细胞的基因组DNA内的靶序列杂交，并且细胞的DNA修复酶在靶序列处(例如，通过非同源末端连接)将转基因插入到宿主基因组中，从而产生经修饰的细胞。在一个方面，该方法还可包括经由电穿孔(诸如当修饰NK细胞或NK T细胞时)将RNP复合物引入细胞中。在一个方面，该方法还可包括用包含RNP复合物的第二AAV病毒重复感染靶细胞。在一个方面，当转基因足够小时，相同的AAV可包含转基因和RNP复合物两者。在另一方面，转基因和RNP复合物可编码在相同的质粒上。
在一些方面，本文公开了遗传修饰细胞的方法，该方法包括a)获得包含2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)与对应CRISPR/Cas向导RNA复合的核糖核蛋白(RNP)复合物和包含质粒的AAV载体，该质粒包含编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的多核苷酸序列；其中多核苷酸序列侧接同源臂；并且其中同源臂的长度为800bp或更短；以及b)将多核苷酸序列和RNP复合物引入到细胞中；其中多核苷酸序列经由AAV感染到细胞中而被引入到细胞中；其中RNP复合物与细胞的基因组DNA内的靶序列杂交，并且细胞的DNA修复酶在细胞的基因组DNA内的靶序列处将转基因插入到宿主基因组中，从而产生经修饰的细胞。在一些实施方案中，细胞是NK细胞。
在一个方面，在本发明所公开的免疫治疗方法中使用并通过本发明所公开的修饰方法产生的经修饰的细胞(例如，NK细胞)可以是来自供体来源(诸如例如，用于过继转移疗法的同种异体供体来源或自体供体来源(即，经修饰的细胞的最终接受者))的原代细胞、细胞系(包括但不限于NK细胞系NK RPMI8866；HFWT、K562和EBV-LCL)，或源自原代细胞来源或细胞系的扩增细胞的来源。因为可以使用原代细胞，所以应当理解并在本文中设想，本发明所公开的细胞修饰可离体或在体外发生。
本文所用的细胞可以是原代细胞或扩增细胞。在感染AAV载体之前，可在IL-2的存在下将原代细胞温育约4天至10天。在一个示例中，在感染之前，在经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体的存在下将原代细胞扩增约4天至10天。在一些实施方案中，经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体表达膜结合的4-1BBL、膜结合的IL-21或膜结合的IL-15或它们的任何组合。
在转导细胞(例如，NK细胞)之后，可在将经修饰的(即，工程化的)细胞施用于受试者之前扩增和刺激经修饰的细胞。例如，本文公开了将免疫细胞过继转移到有需要的受试者中的方法，其中在施用于受试者之前，用表达膜结合的IL-21(mbIL-21)的经辐照的饲养细胞、质膜(PM)颗粒或外来体(EX)(表达mbIL-21的PM颗粒和EX外来体在本文分别被称为PM21颗粒和EX21外来体)扩增免疫细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞)。在一些方面，扩增还可包括表达膜结合的IL-15(mbIL-15)和/或膜结合的4-1BBL(mb4-1BBL)的经辐照的饲养细胞、质膜(PM)颗粒或外来体。在一些方面，应当理解并在本文中设想，经修饰的(即，工程化的)细胞的刺激和扩增可在向受试者施用经修饰的细胞之后或与之同时在体内发生。因此，本文公开了免疫治疗方法，其中在经由IL-21或PM颗粒与mbIL-21、外来体与mbIL-21和/或经辐照的表达mbIL-21的饲养细胞的施用将细胞转移至受试者中后，细胞(例如，NK细胞)在受试者中扩增。在一些方面，扩增还包括施用IL-15和/或4-1BBL，或表达膜结合的IL-15和/或4-1BBL的PM颗粒、外来体和/或经辐照的饲养细胞。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括用约1至约1000K MOI(例如，约5至500KMOI)的MOI范围的AAV感染NK细胞。例如，本文公开的方法包括用至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450或500MOI的AAV感染NK细胞。
1.杂交/选择性杂交
术语“杂交”通常意指至少两个核酸分子诸如引物或探针与基因之间的序列驱动的相互作用。序列驱动的相互作用意指以核苷酸特异性方式发生在两个核苷酸或核苷酸类似物或核苷酸衍生物之间的相互作用。例如，G与C的相互作用或A与T的相互作用是序列驱动的相互作用。通常，序列驱动的相互作用发生在核苷酸的Watson-Crick面或Hoogsteen面上。两个核酸的杂交受本领域技术人员已知的许多条件和参数影响。例如，反应的盐浓度、pH和温度都影响两个核酸分子是否会杂交。
用于两个核酸分子之间选择性杂交的参数是本领域技术人员熟知的。例如，在一些实施方案中，选择性杂交条件可被限定为严格杂交条件。例如，杂交的严格性由杂交和洗涤步骤中的任一者或两者的温度和盐浓度两者控制。例如，用以实现选择性杂交的杂交条件可包括在高离子强度溶液(6×SSC或6×SSPE)中在比Tm(一半的分子从其杂交配偶体解离的解链温度)低约12℃-25℃的温度下杂交，随后在所选温度和盐浓度的组合下洗涤，使得洗涤温度比Tm低约5℃至20℃。温度和盐条件容易在初步实验中根据经验确定，在这些初步实验中，固定在过滤器上的参考DNA样品与标记的感兴趣的核酸杂交，然后在不同严格性条件下洗涤。对于DNA-RNA和RNA-RNA杂交而言，杂交温度通常较高。可使用如上所述的条件以实现严格性，或如本领域已知的。用于DNA:DNA杂交的优选严格杂交条件可以是，在6×SSC或6×SSPE中在约68℃下(在水溶液中)杂交，然后在68℃下洗涤。如果需要，杂交和洗涤的严格性可随着所需互补性程度的降低而相应降低，并且进一步取决于在其中搜索可变性的任何区域的G-C或A-T富集。同样，如果需要，杂交和洗涤的严格性可随着所需同源性的增加而相应增加，并且进一步取决于其中需要高同源性的任何区域的G-C或A-T富集，所有这些都是本领域已知的。
另一种限定选择性杂交的方式是通过观察一种核酸与另一种核酸结合的量(百分比)。例如，在一些实施方案中，选择性杂交条件是当至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的限制性核酸与非限制性核酸结合时。通常，非限制性引物是例如10倍或100倍或1000倍过量的。这种类型的测定可在以下条件下进行：其中限制性引物和非限制性引物都低于其kd例如10倍或100倍或1000倍，或者其中仅一个核酸分子低于10倍或100倍或1000倍，或者其中一个或两个核酸分子高于其kd。
另一种限定选择性杂交的方式是通过观察在需要杂交以促进所需的酶操作的条件下被酶操作的引物的百分比。例如，在一些实施方案中，选择性杂交条件是当在促进酶操作的条件下至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的引物被酶操作时，例如如果酶操作是DNA延伸，则选择性杂交条件是当至少约60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的引物分子被延伸时。优选的条件还包括制造商建议的或本领域指出的适合酶进行操作的那些条件。
正如同源性一样，应当理解，本文公开了多种方法来确定两个核酸分子之间的杂交水平。应当理解，这些方法和条件可提供两个核酸分子之间不同的杂交百分比，但是除非另外指出，否则满足这些方法中的任何方法的参数将足够。例如，如果需要80％杂交，则只要在这些方法中的任何一种方法中的所需参数内发生杂交，就认为其在本文中公开。
应当理解，本领域的技术人员理解，如果组合物或方法满足用于共同或单独确定杂交的这些标准中的任何一个标准，则其为本文公开的组合物或方法。
2.核酸
本文公开了多种基于核酸的分子。本发明所公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物组成。本文讨论了这些分子和其他分子的非限制性示例。应当理解，例如，当载体在细胞中表达时，所表达的mRNA通常由A、C、G和U组成。同样，应当理解，如果例如反义分子通过例如外源递送而引入到细胞或细胞环境中，则反义分子由减少反义分子在细胞环境中降解的核苷酸类似物组成是有利的。
a)核苷酸和相关分子
核苷酸是含有碱基部分、糖部分和磷酸酯部分的分子。核苷酸可通过其磷酸酯部分和糖部分连接在一起，从而产生核苷酸间键。核苷酸的碱基部分可以是腺嘌呤-9-基(A)、胞嘧啶-1-基(C)、鸟嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)和胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸的糖部分是核糖或脱氧核糖。核苷酸的磷酸酯部分是五价磷酸酯。核苷酸的非限制性示例是3'-AMP(3'-单磷酸腺苷)或5'-GMP(5'-单磷酸鸟苷)。可在本领域中获得并且可在本文中获得多种这些类型的分子。
核苷酸类似物是含有对碱基、糖或磷酸酯部分的某种类型的修饰的核苷酸。对核苷酸的修饰是本领域公知的，并且包括例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤和2-氨基腺嘌呤以及糖或磷酸酯部分处的修饰。可在本领域中获得并且可在本文中获得多种这些类型的分子。
核苷酸替代物是具有与核苷酸相似的功能特性但不包含磷酸酯部分的分子，诸如肽核酸(PNA)。核苷酸替代物是将以Watson-Crick或Hoogsteen方式识别核酸但通过除磷酸酯部分之外的部分连接在一起的分子。核苷酸替代物在与适当的靶核酸相互作用时能够符合双螺旋型结构。可在本领域中获得并且可在本文中获得多种这些类型的分子。
也可以将其他类型的分子(缀合物)与核苷酸或核苷酸类似物连接以增强例如细胞摄取。缀合物可化学连接至核苷酸或核苷酸类似物。此类缀合物包含但不限于脂质部分，诸如胆固醇部分。(Letsinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989年，第86卷，第6553-6556页)。可在本领域中获得并且可在本文中获得多种这些类型的分子。
Watson-Crick相互作用是与核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的Watson-Crick面的至少一种相互作用。核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的Watson-Crick面包括基于嘌呤的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的位置C2、N1和C6，以及基于嘧啶的核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸替代物的位置C2、N3和C4。
Hoogsteen相互作用是在核苷酸或核苷酸类似物的Hoogsteen面上发生的相互作用，其暴露于双链体DNA的大沟中。Hoogsteen面包括位置N7和嘌呤核苷酸的位置C6位处的反应性基团(NH2或O)。
b)序列
存在许多与参与本文公开的信号传导途径的蛋白质分子相关的序列，例如CD33、4-1BB、NKG2D或2B4，所有这些序列均由核酸编码或者是核酸。这些基因的人类似物以及其他类似物、这些基因的等位基因、剪接变体和其他类型的变体的序列可在各种蛋白质和基因数据库(包括Genbank)中获得。本领域技术人员理解，如何解决序列差异和差别以及如何将与特定序列相关的组合物和方法调整至其他相关序列。考虑到本文公开的和本领域已知的信息，可针对任何给定的序列设计引物和/或探针。
c)引物和探针
公开了包含引物和探针的组合物，其能够与本发明所公开的核酸诸如本文公开的CD33相互作用。在某些实施方案中，引物用于支持DNA扩增反应。通常，引物将能够以序列特异性方式延伸。引物以序列特异性方式延伸包括任何方法，其中引物所杂交或以其他方式缔合的核酸分子的序列和/或组成引导或影响因引物延伸产生的产物的组成或序列。因此，引物以序列特异性方式延伸包括但不限于PCR、DNA测序、DNA延伸、DNA聚合、RNA转录或逆转录。以序列特异性方式扩增引物的技术和条件是优选的。在某些实施方案中，引物用于DNA扩增反应，诸如PCR或直接测序。应当理解，在某些实施方案中，也可使用非酶技术将引物延伸，其中例如，用于延伸引物的核苷酸或寡核苷酸被修饰，使得它们将发生化学反应以将引物以序列特异性方式延伸。通常，本发明所公开的引物与本发明所公开的核酸或核酸的区域杂交，或者它们与核酸的补体或核酸的区域的补体杂交。
在某些实施方案中，用于与核酸相互作用的引物或探针的大小可以是支持引物的所需酶操作(诸如DNA扩增)或者探针或引物的简单杂交的任何大小。典型的引物或探针将为至少6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个、1000个、1250个、1500个、1750个、2000个、2250个、2500个、2750个、3000个、3500个或4000个核苷酸长。
在其他实施方案中，引物或探针可为小于或等于6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个、1000个、1250个、1500个、1750个、2000个、2250个、2500个、2750个、3000个、3500个或4000个核苷酸长。
CD33基因的引物通常用于产生含有CD33基因的区域或完整基因的扩增的DNA产物。一般来讲，产物的大小通常使得可将该大小精确地确定在3个、2个或1个核苷酸内。
在某些实施方案中，产物为至少20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个、1000个、1250个、1500个、1750个、2000个、2250个、2500个、2750个、3000个、3500个或4000个核苷酸长。
在其他实施方案中，产物为小于或等于20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个、100个、125个、150个、175个、200个、225个、250个、275个、300个、325个、350个、375个、400个、425个、450个、475个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个、1000个、1250个、1500个、1750个、2000个、2250个、2500个、2750个、3000个、3500个或4000个核苷酸长。
3.将组合物递送至细胞
有许多组合物和方法可用于在体外或体内将核酸递送至细胞。这些方法和组合物主要可分成两类：基于病毒的递送体系和非基于病毒的递送体系。例如，核酸可通过许多直接递送体系诸如电穿孔、脂质转染、磷酸钙沉淀、质粒、病毒载体、病毒核酸、噬菌体核酸、噬菌体、粘粒递送，或经由遗传物质在细胞或载体诸如阳离子脂质体中的转移递送。合适的转染手段包括病毒载体、化学转染子或物理-机械方法诸如电穿孔和DNA的直接扩散，并由例如Wolff,J.A.等人，《Science》，第247卷，第1465-1468页(1990年)和Wolff,J.A.，《Nature》，第352卷，第815-818页(1991年)描述。此类方法在本领域中是众所周知的并且很容易适用于与本文所述的组合物和方法一起使用。在某些情况下，这些方法将被修改为专门用于大DNA分子。此外，这些方法可通过使用载体的靶向特征来靶向某些疾病和细胞群体。
a)基于核酸的递送体系
转移载体可以是用于将基因递送到细胞中的任何核苷酸构造(例如，质粒)，或作为递送基因的一般策略的一部分，例如，作为重组逆转录病毒或腺病毒的一部分(Ram等人，《Cancer Res.》，第53卷：第83-88页(1993年))。在一些示例中，本文所述的质粒可以是包含本文提供的多核苷酸序列的DNA模板或核苷酸构造。
如本文所用，质粒或病毒载体是在不降解的情况下将本发明所公开的核酸传送到细胞中的媒介，并且包括启动子，该启动子在其被递送到的细胞中产生基因表达。病毒载体是例如腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、AIDS病毒、神经元营养病毒、辛德毕斯病毒和其他RNA病毒，包括具有HIV骨架的这些病毒。还优选的是共享这些病毒的特性的任何病毒家族，这些特性使它们适合用作载体。逆转录病毒包括鼠莫洛尼白血病病毒MMLV和表达MMLV作为载体的所需特性的逆转录病毒。与其他病毒载体相比，逆转录病毒载体能够携带更大的遗传有效载荷，即转基因或标记基因，因此是常用的载体。然而，它们不可用于非增殖细胞中。腺病毒载体相对稳定且易于加工，具有高滴度，可以气溶胶制剂的形式递送，并且可转染非分裂细胞。痘病毒载体很大并具有若干用于插入基因的位点，它们是热稳定的并可在室温下储存。一个优选的实施方案是一种病毒载体，该病毒载体已经过工程改造以便抑制由病毒抗原引发的宿主生物体的免疫应答。这种类型的优选载体将携带白细胞介素8或10的编码区。
与将基因引入到细胞中的化学或物理方法相比，病毒载体可具有更高的交易能力(引入基因的能力)。通常，病毒载体含有非结构性早期基因、结构性晚期基因、RNA聚合酶III转录物、复制和包装所必需的反向末端重复序列以及控制病毒基因组的转录和复制的启动子。当作为载体进行工程改造时，病毒的早期基因中的一个或多个早期基因通常会去除，并且基因或基因/启动子盒被插入到病毒基因组中以代替所去除的病毒DNA。这种类型的构建体可携带多达约8kb的外源遗传物质。所去除的早期基因的必要功能通常由已经过工程改造以反式表达早期基因的基因产物的细胞系提供。
(1)腺相关病毒载体
另一种类型的病毒载体基于腺相关病毒(AAV)。这种缺陷型细小病毒是一种优选的载体，因为它可感染许多细胞类型并且对人没有致病性。AAV类型载体可传送约4kb至5kb，并且已知野生型AAV可(诸如例如在AAV整合位点1(AAVS1))稳定地插入到19号染色体中。含有此位点特异性整合特性的载体是优选的。所用的AAV可源自任何AAV血清型，包括但不限于AAC1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和重组AAV(rAAV，例如AAV-Rh74)和/或合成AAV(诸如例如AAV-DJ、Anc80)。AAV血清型可基于细胞或组织嗜性选择。在所公开的组合物和方法中使用的AAV载体可以是单链(SS)或自互补(SC)的。
在另一种类型的AAV病毒中，AAV含有一对反向末端重复序列(ITR)，这对反向末端重复序列位于至少一个盒的两侧，该至少一个盒含有与异源基因可操作地连接的引导细胞特异性表达的启动子。本上下文中的异源是指非AAV或B19细小病毒固有的任何核苷酸序列或基因。
通常，AAV和B19编码区已被删除，从而产生安全、无细胞毒性的载体。AAV ITR或其修饰赋予感染性和位点特异性整合，但不赋予细胞毒性，并且启动子引导细胞特异性表达。
因此，本发明所公开的载体提供了能够整合到哺乳动物染色体中而无显著毒性的DNA分子。
病毒和逆转录病毒中插入的基因通常含有启动子和/或增强子，以帮助控制期望基因产物的表达。启动子通常是当关于转录起始位点处于相对固定的位置时起作用的一条或多条DNA序列。启动子含有RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并且可能含有上游元件和应答元件。
应当理解并且在本文中设想AAV的包装容量是有限的。克服AAV载体的装载容量有限的一种方法是通过使用两个载体，其中转基因在两个质粒之间分开，并使用3'剪接供体和5'剪接受体将转基因的两个节段接合成单个全长转基因。另选地，可使两个转基因具有大量重叠，并且同源重组将两个片段接合成全长转录物。
4.表达体系
被递送至细胞的核酸通常含有表达控制体系。例如，病毒和逆转录病毒体系中插入的基因通常含有启动子和/或增强子，以帮助控制期望基因产物的表达。启动子通常是当关于转录起始位点处于相对固定的位置时起作用的一条或多条DNA序列。启动子含有RNA聚合酶和转录因子的基本相互作用所需的核心元件，并且可能含有上游元件和应答元件。
a)病毒启动子和增强子
来自哺乳动物宿主细胞中的载体的控制转录的优选启动子可从各种来源，例如诸如以下病毒的基因组获得：多瘤病毒、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、逆转录病毒、-B型肝炎病毒并最优选巨细胞病毒，或获自异源哺乳动物启动子，例如β肌动蛋白启动子。SV40病毒的早期和晚期启动子作为SV40限制性片段方便地获得，该片段还含有SV40病毒复制起点(Fiers等人，《Nature》，第273卷：第113页(1978年))。人巨细胞病毒的立即早期启动子作为HindIII E限制性片段方便地获得(Greenway,P.J.等人，《Gene》，第18卷：第355-360页(1982年))。当然，来自宿主细胞或相关物种的启动子也可用于本文。
增强子通常是指在距转录起始位点不固定距离处起作用的DNA序列并且可以是转录单元的5'(Laimins,L.等人，《Proc.Natl.Acad.Sci.》，第78卷：第993页(1981年))或3'(Lusky,M.L.等人，《Mol.Cell Bio.》，第3卷：第1108页(1983年))。此外，增强子可位于内含子内(Banerji,J.L.等人，《Cell》，第33卷：第729页(1983年))以及位于编码序列本身内(Osborne,T.F.等人，《Mol.Cell Bio.》，第4卷：第1293页(1984年))。它们的长度通常在10bp至300bp之间，并且它们以顺式起作用。增强子的功能是增加附近启动子的转录。增强子通常还含有介导转录调节的应答元件。启动子还可含有介导转录调节的应答元件。增强子通常决定基因表达的调节。虽然现在已知许多来自哺乳动物基因的增强子序列(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、-胎蛋白和胰岛素)，但通常人们将使用来自真核细胞病毒的增强子进行一般表达。优选的示例是复制起点后侧上的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、腺病毒增强子和复制起点后侧上的多瘤增强子。
启动子和/或增强子可通过触发其功能的光或特定化学事件来特异性活化。体系可通过诸如四环素和地塞米松等试剂来调节。还有方法可通过暴露于辐射(诸如γ辐射)或烷基化化疗药物来增强病毒载体基因表达。
在某些实施方案中，启动子和/或增强子区可充当组成型启动子和/或增强子以最大程度增强要转录的转录单元区的表达。在某些构建体中，启动子和/或增强子区在所有真核细胞类型中都具有活性，即使它仅在特定时间在特定类型的细胞中表达。这种类型的优选启动子是CMV启动子(650个碱基)。其他优选的启动子是SV40启动子、巨细胞病毒(全长启动子)和逆转录病毒载体LTR。
已表明，所有特异性调节元件都可被克隆并用于构建在特定细胞类型(诸如黑素瘤细胞)中选择性表达的表达载体。胶质纤维醋酸蛋白(GFAP)启动子已被用于在胶质细胞来源的细胞中选择性地表达基因。
真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或有核细胞)中使用的表达载体也可含有可能影响mRNA表达的转录的终止所必需的序列。这些区被转录为编码组织因子蛋白的mRNA的非翻译部分中的多腺苷酸化片段。3'非翻译区还包含转录终止位点。优选的是转录单元还含有多腺苷酸化区。该区的一个有益效果是它增加了转录单元像mRNA一样被加工和传送的可能性。表达构建体中多聚腺苷酸化信号的识别和使用已经得到公认。优选的是在转基因构建体中使用同源多聚腺苷酸化信号。在某些转录单元中，多腺苷酸化区源自SV40早期多腺苷酸化信号并由约400个碱基组成。还优选的是，转录单元含有单独的或与上述序列组合的其他标准序列以提高构建体的表达或稳定性。
b)标记物
病毒载体可包含编码标记产物的核酸序列。该标记产物用于确定基因是否已被递送至细胞并且是否在递送后就被表达。优选的标记基因是编码β-半乳糖苷酶和绿色荧光蛋白的大肠杆菌(E.Coli)lacZ基因。
在一些实施方案中，标记物可以是选择性标记物。适用于哺乳动物细胞的选择性标记物的示例是二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素和嘌呤霉素。当此类选择性标记物成功地转移到哺乳动物宿主细胞中时，如果置于选择性压力下，转化的哺乳动物宿主细胞可以存活。存在两种广泛使用的不同类别的选择性方案。第一类别是基于细胞的新陈代谢和使用缺乏独立于补充培养基而生长的能力的突变细胞系。两个示例是：CHO DHFR-细胞和小鼠LTK-细胞。这些细胞缺乏在不添加诸如胸苷或次黄嘌呤之类的营养物质的情况下生长的能力。由于这些细胞缺乏完整核苷酸合成途径所必需的某些基因，因此除非在补充培养基中提供缺失的核苷酸，否则它们无法存活。补充培养基的另选方式是将完整的DHFR或TK基因引入到缺乏相应基因的细胞中，从而改变它们的生长要求。未用DHFR或TK基因转化的各个细胞将无法在未-补充的培养基中存活。
第二类别是显性选择，显性选择是指用于任何细胞类型的选择方案，并且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物来阻止宿主细胞的生长。那些具有新型基因的细胞将表达可传递耐药性的蛋白质，并将在选择下存活。这种显性选择的示例使用药物新霉素(Southern P.和Berg,P.，《J.Molec.Appl.Genet.》第1卷：第327页(1982年))、霉酚酸(Mulligan,R.C.和Berg,P.，《Science》，第209卷：第1422页(1980年))或潮霉素(Sugden,B.等人，《Mol.Cell.Biol.》，第5卷：第410-413页(1985年))。这三个示例分别使用真核细胞控制下的细菌基因来传递对适当药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其他药物包括新霉素类似物G418和嘌呤霉素。
5.肽
a)蛋白质变体
蛋白质变体和衍生物是本领域技术人员熟知的，并且可包括氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰通常属于以下三类中的一类或多类：取代的、插入的或缺失的变体。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入通常是比氨基或羧基末端融合更小的插入，例如，大约一至四个残基的插入。免疫原性融合蛋白衍生物诸如示例中所述的那些免疫原性融合蛋白衍生物通过体外交联或通过用编码融合体的DNA转化的重组细胞培养物来融合足够大以赋予靶序列免疫原性的多肽而制备。缺失的特征在于一个或多个氨基酸残基从蛋白质序列中去除。通常，在蛋白质分子内的任何一个位点处缺失不超过约2个至6个残基。这些变体通常通过编码蛋白质的DNA中核苷酸的位点特异性诱变，从而产生编码变体的DNA，然后在重组细胞培养物中表达DNA来制备。用于在具有已知序列的DNA中的预定位点处进行取代突变的技术是众所周知的，例如，M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸取代通常是单个残基的取代，但可同时发生在许多不同的位置；插入通常为约1个至10个氨基酸残基的插入；并且缺失为约1个至30个残基范围内的缺失。缺失或插入优选以相邻对进行，即，缺失2个残基或插入2个残基。可组合取代、缺失、插入或它们的任何组合以获得最终的构建体。突变不能将序列置于阅读框之外，优选不会形成可产生二级mRNA结构的互补区域。取代变体是其中至少一个残基已经被去除并且在其位置插入不同的残基的那些变体。此类取代通常根据下表5和表6进行，并且被称为保守取代。
表5：氨基酸缩写
表6：氨基酸取代
原始残基示例性保守取代，其他取代是本领域已知的。
通过选择比表6中的那些取代保守性更低的取代，即选择它们对维持以下方面的作用更显著不同的残基来对功能或免疫学特性作出实质性改变：(a)取代的区域中多肽主链的结构，例如作为折叠或螺旋构象；(b)靶位点处分子的电荷或疏水性；或(c)侧链的大小。通常预期在蛋白质特性方面产生最大变化的取代是这样的取代：其中(a)亲水残基(例如，丝氨酰基或苏氨酰基)取代疏水残基(例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)(或被疏水残基取代)；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代任何其他残基(或被任何其他残基取代)；(c)具有电正性侧链的残基(例如，赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)取代电负性残基(例如，谷氨酰基或天冬氨酰基)(或被电负性残基取代)；或(d)具有大侧链的残基(例如，苯丙氨酸)取代不具有侧链的残基(在这种情况下例如为甘氨酸)(或被不具有侧链的残基取代)，(e)通过增加用于硫酸化和/或糖基化的位点数目。
例如，本领域技术人员已知一个氨基酸残基被另一个生物学和/或化学性质相似的氨基酸残基置换是保守取代。例如，保守取代是一个疏水残基置换另一个疏水残基，或者一个极性残基置换另一个极性残基。取代包括组合，诸如例如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；和Phe、Tyr。每条明确公开的序列的此类保守取代的变型包括在本文提供的镶嵌多肽内。
可使用取代或缺失诱变来插入用于N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)的位点。半胱氨酸或其他不稳定残基的缺失也可能是期望的。潜在的蛋白水解位点例如Arg的缺失或取代例如通过缺失碱性残基中的一个碱性残基或用谷氨酰胺酰基或组氨酰基取代一个残基来实现。
某些翻译后衍生化是重组宿主细胞对所表达多肽的作用的结果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基经常在翻译后脱酰胺成相应的谷氨酰基和天冬氨酰基残基。另选地，在弱酸性条件下将这些残基脱酰胺。其他翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化；丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基基团的磷酸化；赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的O-氨基基团的甲基化(T.E.Creighton，Proteins:Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，第79-86页[1983年])；N-末端胺的乙酰化；以及在一些情况下C-末端羧基的酰胺化。
应当理解，限定本文所公开的蛋白质的变体和衍生物的一种方式是通过按照与特定已知序列的同源性/同一性来限定变体和衍生物。具体公开了本文公开的这些和其他蛋白质的变体，这些变体与所述序列具有至少70％或75％或80％或85％或90％或95％同源性。本领域技术人员容易理解如何确定两种蛋白质的同源性。例如，可在比对两个序列之后计算同源性，使得同源性处于其最高水平。
计算同源性的另一种方式可通过公开的算法进行。用于比较的序列的最佳比对可通过Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，第2卷：第482页(1981年)的局部同源性算法；通过Needleman和Wunsch，J.MoL Biol.，第48卷：第443页(1970年)的同源性比对算法；通过Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，第85卷：第2444页(1988年)的相似性搜索方法；通过这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)；或通过检查进行。
对于核酸，通过例如Zuker,M.，Science，第244卷：第48-52页，1989年；Jaeger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第86卷：第7706-7710页，1989年；Jaeger等人，MethodsEnzymol.，第183卷：第281-306页，1989年中公开的算法可获得相同类型的同源性。
应当理解，保守突变和同源性的描述可以任何组合方式组合在一起，诸如与特定序列具有至少70％同源性的实施方案，其中变体是保守突变。
由于本说明书讨论了各种蛋白质和蛋白质序列，因此应当理解，本发明还公开了可编码这些蛋白质序列的核酸。这包括与特定蛋白质序列相关的所有简并序列，即，具有编码一条特定蛋白质序列的序列的所有核酸以及编码本发明所公开的蛋白质序列的变体和衍生物的所有核酸(包括简并核酸)。因此，虽然本文可能未写出每种具体的核酸序列，但应当理解，本文实际上通过本发明所公开的蛋白质序列公开和描述了每一条序列。还应当理解，虽然没有氨基酸序列指示生物体内哪些特定DNA序列在编码该蛋白质，但在本文公开了本发明所公开的蛋白质的特定变体的情况下，编码该蛋白质的已知核酸序列也是已知的，并且在本文中公开和描述。
应当理解，存在许多可掺入到所公开的组合物中的氨基酸和肽类似物。例如，存在许多D氨基酸或具有与表5和表6所示的氨基酸不同的功能取代基的氨基酸。公开了天然存在的肽的相反立体异构体，以及肽类似物的立体异构体。通过用选择的氨基酸装载tRNA分子并工程改造利用例如琥珀密码子的遗传构建体，以位点特异性方式将类似物氨基酸插入到肽链中，可容易地将这些氨基酸掺入到多肽链中。
可产生类似于肽但不通过天然肽键连接的分子。例如，氨基酸或氨基酸类似物的键可包括CH2NH--、--CH2S--、--CH2-CH2--、--CH＝CH--(顺式和反式)、--COCH2--、--CH(OH)CH2--和--CHH2SO—(这些键和其他键可见于Spatola,A.F.，Chemistry and Biochemistryof Amino Acids,Peptides,and Proteins，B.Weinstein编辑，Marcel Dekker，New York，第267页(1983年)；Spatola,A.F.，Vega Data(1983年3月)，第1卷第3期，Peptide BackboneModifications(一般性综述)；Morley，Trends Pharm Sci(1980年)，第463-468页；Hudson,D.等人，Int J Pept Prot Res，第14卷：第177-185页(1979年)(--CH2NH--、CH2CH2--)；Spatola等人，Life Sci，第38卷：第1243-1249页(1986年)(--CH H2--S)；Hann，J.Chem.SocPerkin Trans.I，第307-314页(1982年)(--CH--CH--，顺式和反式)；Almquist等人，J.Med.Chem.，第23卷：第1392-1398页(1980年)(--COCH2--)；Jennings-White等人，Tetrahedron Lett，第23卷：第2533页(1982年)(--COCH2--)；Szelke等人，欧洲申请EP45665CA(1982年)：97:39405(1982年)(--CH(OH)CH2--)；Holladay等人，Tetrahedron.Lett，第24卷：第4401-4404页(1983年)(--C(OH)CH2--)；和Hruby，Life Sci，第31卷：第189-199页(1982年)(--CH2--S--)；这些文献中的每一篇以引用方式并入本文。特别优选的非肽键是--CH2NH--。应当理解，肽类似物在键原子之间可具有多于一个原子，诸如b-丙氨酸、g-氨基丁酸等。
氨基酸类似物和类似物和肽类似物通常具有增强的或期望的特性，诸如更经济的生产、更高的化学稳定性、增强的药理学特性(半衰期、吸收、效力、疗效等)、改变的特异性(例如，广谱生物活性)、降低的抗原性等。
D-氨基酸可用于产生更稳定的肽，因为D-氨基酸不被肽酶等识别。用相同类型的D-氨基酸系统取代共有序列的一个或多个氨基酸(例如，用D-赖氨酸代替L-赖氨酸)可用于产生更稳定的肽。半胱氨酸残基可用于环化两个或多个肽或将两个或多个肽连接在一起。这对于将肽限制为特定构象可能是有益的。
6.药物载体/药物产品的递送
如上所述，组合物也可在药学上可接受的载体中在体内施用。所谓的“药学上可接受的”意指材料不是生物学上不期望的或以其他方式不期望的，即该材料可连同核酸或载体施用于受试者，而不会引起任何不期望的生物效应或以有害方式与包含它的药物组合物的其他组分中的任何组分相互作用。如本领域技术人员所熟知的，将载体自然地选择成最大程度降低活性成分的任何降解并且最大程度减少受试者中的任何不良副作用，如本领域技术人员所熟知的。
组合物可口服、肠胃外(例如，静脉内)、通过肌内注射、通过腹膜内注射、透皮、体外、局部等施用，包括局部鼻内施用或通过吸入剂施用。如本文所用，“局部鼻内施用”意指通过一个或两个鼻孔将组合物递送到鼻和鼻道中，并且可包括通过喷雾机制或液滴机制，或通过核酸或载体的气雾吸入来递送。通过吸入剂施用组合物可以是通过鼻或口经由喷雾或液滴机制递送。也可经由插管直接递送至呼吸系统的任何区域(例如肺)。所需组合物的确切量因受试者而异，这取决于受试者的物种、年龄、体重和一般状况、所治疗的过敏性障碍的严重程度、所用的特定核酸或载体、其施用方式等。因此，不可能为每种组合物指定确切的量。然而，考虑到本文的教导，合适的量可由本领域普通技术人员仅使用常规实验来确定。
如果使用，组合物的肠胃外施用通常以注射为特征。可将注射剂制备成常规形式，作为液体溶液或混悬剂、适合在注射前将混悬剂溶解在液体中的固体形式，或者作为乳剂。最近修订的肠胃外施用方法涉及使用缓释或缓效系统以便保持恒定剂量。参见例如美国专利3,610,795，其通过引用方式并入本文。
材料可为溶液、混悬剂形式(例如，掺入微粒、脂质体或细胞中)。这些可经由抗体、受体或受体配体靶向特定的细胞类型。以下参考文献是使用该技术使特定蛋白质靶向肿瘤组织的示例(Senter等人，《Bioconjugate Chem.》，第2卷：第447-451页(1991年)；Bagshawe,K.D.，《Br.J.Cancer》，第60卷：第275-281页(1989年)；Bagshawe等人，《Br.J.Cancer》，第58卷：第700-703页(1988年)；Senter等人，《Bioconjugate Chem.》，第4卷：第3-9页(1993年)；Battelli等人，《Cancer Immunol.Immunother.》，第35卷：第421-425页(1992年)；Pietersz和McKenzie，《Immunolog.Reviews》，第129卷：第57-80页(1992年)和Roffler等人，《Biochem.Pharmacol》，第42卷：第2062-2065页(1991年))。溶媒诸如“stealth”和其他抗体偶联脂质体(包括脂质介导的药物靶向结肠癌)、受体介导的通过细胞特异性配体靶向DNA、淋巴细胞引导的肿瘤靶向以及小鼠神经胶瘤细胞的体内高度特异性治疗逆转录病毒靶向。以下参考文献是使用该技术使特定蛋白质靶向肿瘤组织的示例(Hughes等人，《Cancer Research》，第49卷：第6214-6220页(1989年)；和Litzinger和Huang，《Biochimica et Biophysica Acta》，第1104卷：第179-187页(1992年))。一般来讲，受体参与组成型或配体诱导的内吞途径。这些受体聚集在披网格蛋白小窝中，经由披网格蛋白小泡进入细胞，通过酸化的核内体，在该核内体中受体被分选，然后循环至细胞表面，储存在细胞内，或者在溶酶体中降解。内化途径具有多种功能，诸如营养物质吸收、活化蛋白质的去除、大分子的清除、病毒和毒素的伺机进入、配体的解离和降解以及受体水平调节。许多受体遵循多于一条细胞内途径，这取决于细胞类型、受体浓度、配体类型、配体效价和配体浓度。已经综述受体介导的内吞的分子和细胞机制(Brown和Greene，《DNA and CellBiology》，第10卷第6期：第399-409页(1991年))。
7.治疗癌症的方法
本文公开的质粒、载体和经修饰的NK细胞和NK T细胞可用于治疗、抑制、降低、减少、改善和/或预防任何发生不受控制的细胞增殖的疾病诸如癌症。近年来癌症免疫疗法已经取得进展；经遗传修饰的嵌合抗原受体(CAR)T细胞是成功用于癌症免疫疗法的工程化的免疫细胞的优异示例。这些细胞最近被FDA批准用于治疗CD19+B细胞恶性肿瘤，但迄今为止成功仅限于治疗携带一些可靶向抗原的疾病，并且靶向此类有限的抗原库易于因免疫逃逸而失败。此外，由于同种异体T细胞引起移植物抗宿主病(GvHD)的风险，CAR T细胞已集中于使用自体T细胞。对比之下，NK细胞能够以抗原非依赖性方式杀伤肿瘤靶标，并且不引起GvHD，这使得它们成为癌症免疫疗法的良好候选物。应当理解并在本文中设想，本发明所公开的质粒和方法可用于产生例如CAR NK T细胞和CAR NK细胞以靶向癌症。
因此，本文公开了治疗、减少、降低、抑制、改善和/或预防受试者的癌症和/或转移(诸如例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)和/或骨髓增生异常综合征(MDS))的方法，这些方法包括向患有癌症的受试者施用本文公开的任何经修饰的细胞(例如，经修饰的NK细胞和NK T细胞)。例如，本文公开了治疗、减少、降低、抑制、改善和/或预防受试者的癌症和/或转移(诸如例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)和/或骨髓增生异常综合征(MDS))的方法，这些方法包括向受试者施用治疗有效量的自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞，其中NK细胞或NK T细胞包含与成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关9(Cas9)整合系统一起使用的质粒，其中质粒依次包含左同源臂、编码嵌合抗原受体(CAR)多肽(诸如例如，靶向CD33的CAR)的多核苷酸序列和右同源臂；其中左同源臂和右同源臂各自的长度为1000bp或更短(例如，600bp)。
“抑制(Inhibit/inhibiting/inhibition)”意指活性、应答、病症、疾病或其他生物学参数下降。这可包括但不限于活性、应答、病症或疾病的完全消融。这还可包括例如与天然或对照水平相比，活性、应答、病症或疾病降低10％。因此，降低可以是与天然或对照水平相比，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或介于其间的任何量的降低。
所谓的“降低(动词)”或该词的其他形式诸如动名词或名词形式意指事件或特征(例如，肿瘤生长)变少。应当理解，这通常与某一标准或预期值有关，换句话讲，它是相对的，但并不总是需要参考标准或相对值。例如，“降低肿瘤生长”意指降低肿瘤相对于标准或对照的生长速率。
所谓的“预防(动词)”或该词的其他形式诸如动名词或名词形式意指停止特定事件或特征，稳定或延迟特定事件或特征的发展或进展，或最大程度减少特定事件或特征发生的机会。“预防”不需要与对照进行比较，因为它通常比例如“降低”更绝对。如本文所用，一些情况可降低但不能预防，但是一些情况既可降低也能预防。同样，一些情况可预防但不能降低，但是一些情况既可预防也能降低。应当理解，在使用“降低”或“预防”的情况下，除非另外指明，否则也明确公开了另一个词的使用。
术语“治疗”是指旨在治愈、改善、稳定或预防疾病、病理病症或障碍的患者的医疗管理。该术语包括积极治疗，即，专门针对疾病、病理病症或障碍的改善的治疗，并且还包括因果治疗，即针对相关疾病、病理病症或障碍原因的消除的治疗。此外，该术语包括姑息治疗，即，旨在缓解症状而不是治愈疾病、病理病症或障碍的治疗；预防性治疗，即旨在最大程度减少或部分或完全抑制相关疾病、病理病症或障碍的发展的治疗；和支持性治疗，即用于对针对相关疾病、病理病症或障碍的改善的另一种特定疗法进行补充的治疗。
术语“受试者”是指作为施用或治疗目标的任何个体。受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物。在一个方面，受试者可以是人、非人灵长类动物、牛、马、猪、犬科动物或猫科动物。受试者也可以是豚鼠、大鼠、仓鼠、兔、小鼠或鼹鼠。因此，受试者可以是人或兽医患者。术语“患者”是指正接受临床医生例如医师治疗的受试者。
如上所述，本文公开的质粒、载体和经修饰的NK细胞和NK T细胞可用于治疗、抑制、降低、减少、改善和/或预防癌症。本发明所公开的组合物可用于治疗的癌症的代表性但非限制性列表如下：淋巴瘤；B细胞淋巴瘤；T细胞淋巴瘤；蕈样肉芽肿；霍奇金病；急性淋巴细胞白血病(ALL)；毛细胞白血病(HCL)；骨髓增生异常综合征(MDS)；髓性白血病(包括但不限于，急性髓性白血病(AML)和慢性髓性白血病(CML))；膀胱癌；脑癌；神经系统癌；头颈癌；头颈的鳞状上皮细胞癌；肺癌诸如小细胞肺癌和非小细胞肺癌；神经母细胞瘤/胶质母细胞瘤；卵巢癌；皮肤癌；肝癌；黑素瘤；口、咽、喉和肺的鳞状上皮细胞癌；宫颈癌；卵巢颈癌；乳腺癌和上皮癌；肾癌；泌尿系统癌；肺癌；食道癌；头颈部癌；大肠癌；造血系统肿瘤；睾丸癌；结肠癌；直肠癌；前列腺癌；或胰腺癌。
如在整个本公开中所提到的，所公开的经修饰的NK细胞理想地适用于免疫疗法，诸如将经修饰的(即，工程化的)NK细胞过继转移至有需要的受试者。因此，在一个方面，本文公开了将工程化的NK细胞过继转移至有需要的受试者的方法，所述方法包括a)获得要修饰的NK细胞；b)获得包含2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)与对应CRISPR/Cas向导RNA复合的核糖核蛋白(RNP)复合物和包含质粒的AAV载体，该质粒包含转基因(诸如例如，肿瘤抗原的嵌合抗原受体)；其中转基因侧接同源臂；并且其中同源臂小于1000bp；c)将转基因和RNP复合物引入到NK细胞中；其中转基因经由腺相关病毒(AAV)感染到NK细胞中而被引入到细胞中；其中RNP复合物与NK细胞的基因组DNA内的靶序列杂交，并且NK细胞的DNA修复酶在靶序列处(例如，通过同源修复)将转基因插入到宿主基因组中，从而产生工程化的NK细胞；以及d)将工程化的NK细胞转移到受试者中。在一个方面，转基因可包含在与Cas9核酸内切酶相同的质粒上，或编码在相同或不同AAV载体中的第二质粒上。在一个方面，在用包含AAV的转基因感染细胞之前或与之同时，可经由电穿孔用RNP复合物转导靶细胞。
在一个方面，在本发明所公开的免疫治疗方法中使用的经修饰的细胞(例如，NK细胞)可以是来自供体来源(诸如例如，用于过继转移疗法的同种异体供体来源或自体供体来源(即，经修饰的细胞的最终接受者))的原代细胞、细胞系(包括但不限于NK细胞系NKRPMI8866；HFWT、K562和EBV-LCL)，或源自原代细胞来源或细胞系的扩增细胞的来源。因为可以使用原代细胞，所以应当理解并在本文中设想，本发明所公开的细胞修饰可离体或在体外发生。
本文还公开了一种质粒，该质粒按顺序包含左同源臂、编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的多核苷酸序列和右同源臂；其中左同源臂和右同源臂各自的长度为1000bp或更短。
在另一方面，本文公开了用作药物的如本文公开的质粒、AAV载体或经修饰的细胞。本文还公开了如本文公开的质粒、AAV载体或经修饰的细胞用于制造药物的用途。
本文还公开了用于治疗癌症的如本文公开的质粒、AAV载体或经修饰的细胞。本文还公开了如本文公开的质粒、AAV载体或经修饰的细胞用于制造用于治疗癌症的药物的用途。
本文还公开了用于治疗癌症的CAR NK细胞，该细胞通过使用产生如本文公开的嵌合抗原受体(CAR)自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞的方法产生。本文还公开了CAR NK细胞用于制造用于治疗癌症的药物的用途，该细胞通过使用产生如本文公开的嵌合抗原受体(CAR)自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞的方法产生。
VI.实施例
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制备和评估本文要求保护的化合物、组合物、制品、装置和/或方法的完整公开和描述，并且以下实施例旨在纯粹作为示例并且不旨在限制本公开。已努力确保数字(例如，数量、温度等)的准确性，但应考虑一些错误和偏差。除非另外指定，否则份数是重量份数，温度单位为℃或处于环境温度，并且压力处于或接近大气压。
1.实施例1：使用同源重组和由AAV6递送的CRISPaint在原代人自然杀伤细胞中进行高效定点基因插入
使用本文所述的方法，成功产生高效且稳定的经转基因修饰的人原代NK细胞，包括显示出增强的抗AML活性的两个CAR-NK细胞。
a)方法
(1)人NK细胞纯化和扩增。
如先前所述纯化NK细胞。简言之，使用RosetteSepTM人NK细胞富集混合物，从自健康个体收集的PBMC中分离NK细胞(图1A)。使用流式细胞术将纯化的NK细胞表型化为>90％CD3阴性/Cd56阳性群体(图3A)。这些细胞以2:1的比例(饲养细胞：NK细胞)在纯化当天用表达4-1BBL和膜结合的IL-21(FC21)的经辐照的K562饲养细胞刺激(图1A)。将受刺激的细胞在含有50IU/mL IL-2的无血清AIM-V/ICSR扩增培养基中培养7天。
(2)ATAC-seq测定。
将新鲜分离的(初始的)、FC15和FC21扩增的NK细胞以100,000个活细胞/小瓶的等分试样冷冻保存，然后处理以供ATAC-seq测定。如先前所述进行ATAC-seq。使用IlluminaHiSeq 2500在50bp的配对末端读段处对DNA文库进行测序。
(3)用于靶向NK细胞中的AAVS1的Cas9/RNP电穿孔。
使用一种gRNA(crRNA：5'GGGGCCACTAGGGACAGGAT)(SEQ ID NO:17)，通过如前所述将Cas9/RNP电穿孔到第七天扩增的NK细胞中来靶向AAVS1。简言之，收集3×106个扩增的NK细胞，用13mL的PBS洗涤两次，然后以400g离心5分钟，并吸出PBS。将细胞沉淀重悬于20μL的P3原代细胞4D-Nucleofector溶液中。将5μL预复合的Cas9/RNP(CRISPR-Cas9crRNA、/>CRISPR-Cas9 tracrRNA和/>S.p.HiFi Cas9核酸酶V3)(Integrated DNA Technologies,Inc.，Coralville，Iowa)、靶向AAVS1和1μL的100μM电穿孔增强剂(/>Cas9电穿孔增强剂)加入到细胞悬浮液中。将总体积26μL的CRISPR反应体系转移到4D-NucleofectorTM 16孔条带中，并使用程序EN-138电穿孔(图3B)。在电穿孔后，将细胞转移到12孔板中的2mL含有50IU的IL-2的培养基中，并在37℃和5％CO2压力下温育。在电穿孔后两天，用2×106个饲养细胞刺激细胞，将8mL补充有50IU的新鲜培养基加入细胞悬浮液中，并保持在T25烧瓶中。
(4)ICE突变检测测定。
为了测量AAVS1KO NK细胞中的插入缺失率，使用表1中提到的正向引物和反向引物，使用PCR来扩增Cas9/RNP靶向位点。使用桑格测序对扩增子测序，并使用ICE分析结果。
(5)RNA-seq样品制备和测序。
使用Total RNA Purification Plus Kit试剂盒(Norgen Biotek，Ontario，Canada)从初始的静息细胞、扩增的静息细胞、初始IL-21刺激的细胞和第七天FC21扩增的NK细胞中纯化总RNA。在Nanodrop ND-1000分光光度计中定量所得的总RNA，在Bioanalyzer-2100装置(Agilent Technologies Inc.，Santa Clara，CA)中检查纯度和完整性，并提交给国立儿童医院的基因组学中心进行测序。使用TruSeq RNA样品制备试剂盒(Illumina Inc.)，根据制造商推荐的方案制备文库。文库质量经由Agilent4200Tapestation使用高灵敏度D1000 ScreenTape测定试剂盒来确定，并通过KAPA qPCR(KAPA BioSystems)来定量。使用Illumina HiSeq4000平台产生每个文库大约6千万-8千万个配对末端150bp序列读段。
使用剪接感知比对器STAR的2.5.2b版，将来自每个样品的测序读段与来自NCBI的智人参考的GRCh38.p9组装进行比对。使用来自NCBI的组装的GFF文件，用HTSeq计算特征覆盖率计数。使用来自GFF的特征类型、外显子和特征标识符基因id的默认选项来鉴定RNA-seq分析的特征。使用自定义Perl脚本进行用于样品制备和比对的质量控制检查，这些脚本使用STAR映射质量度量对读段的类型计数并对与由来自NCBI的组装的特征表定义的每种特征类别进行比对的读段的数目计数。
(6)AAV6产生。
克隆到ssAAV或scAAV质粒中的转基因如前所述包装在AAV6衣壳中。
(7)将Cas9/RNP和AAV6组合以产生mCherry和CARNK细胞。
在NK细胞扩增的第6天，实验操作前一天以5×105个细胞/mL进行培养基更换和重悬浮。然后如上所述，在第7天用靶向AAVS1的Cas9/RNP电穿孔NK细胞。电穿孔三十分钟后，收集3×105个活细胞，以每毫升1×106个细胞重悬于24孔板中的总体积为300μL的含有50IUIL2(Novartis)的培养基中。对于用ssAAV6或scAAV6递送编码mCherry或CD33CAR的HR或CRISPaint DNA的每种转导条件，我们用300K MOI(如果需要，10-500KMOI)转导3×105个电穿孔的细胞。用Cas9/RNP电穿孔但不用AAV转导，或用300K MOI的AAV6转导但不用Cas9/RNP电穿孔作为未电穿孔的NK细胞包括的阴性对照。电穿孔和转导后的第二天，我们向每个孔中加入300μL含有50IU IL2的新鲜培养基，而不改变原培养基。电穿孔后将细胞保持培养达48小时，然后用2×106个饲养细胞再刺激，并保持在12孔板中的总体积为2mL的含有50IU的培养基中，而不改变原培养基。48小时后，将8mL补充有IL2的新鲜培养基加入细胞，总体积10mL保持在T25烧瓶中。在转导后第7天，用饲养细胞以1:1的比例重新刺激细胞，并且再生长一周，每2天向细胞中加入新鲜培养基。
(8)用于检测CAR-NK细胞的流式细胞术。
电穿孔后7天和14天，用含有2％FBS的PBS溶液的染色缓冲液将5×105个NK细胞洗涤两次。然后，将2.5μg重组人siglec-3/CD33 Fc嵌合体蛋白(CF；R&D systems#1137-SL-050)加入80μL总体积的细胞悬浮液中，并在4℃下温育30分钟。用染色缓冲液将洗涤细胞两次，然后用2μL的Fcγ片段特异性的Alexa647亲和纯山羊抗人IgG(JacksonImmunoResearch#109-605-098)以1:100的比例在200μL染色缓冲液中染色，并在4℃下保持30分钟。一旦染色，就用染色缓冲液将细胞洗涤两次，然后在MacsQuant流式细胞仪上获得。使用FlowJo软件(FlowJo，LLC)分析流式细胞仪数据。
(9)细胞毒性测定。
如先前所述，使用钙黄绿素-乙酰氧基甲基-释放测定进行细胞毒性测定达3小时-4小时。以如图8中定义的不同靶细胞:效应子比率评估针对Kasumi-1、HL60或AML10细胞的细胞毒性。
(10)CD107a染色。
将NK细胞和癌细胞以10:1的比例以220μL的总体积共培养在96孔板中，并补充有20μL的PE小鼠抗人CD107a抗体(BD PharmingenTM，#555801)。我们将板在37℃培养箱中保持90分钟。然后，用染色缓冲液将细胞洗涤一次，并收集细胞以在MacsQuant流式细胞仪上获得。
(11)转基因整合的基于PCR的检测。
使用设计在CD33CAR构建体的内部或外部的2对引物进行内外式PCR(图9A和图9B以及表2)。我们还增加了一组引物来扩增Cas9靶向和转基因整合位点的1200bp右侧翼区和左侧翼区(图9C)。使用PlatinumTM Taq DNA聚合酶高保真试剂盒(Thermofisher#11304011)进行PCR。
TLA。对于CD33CAR-Gen2整合的全基因组作图，我们使用TLA技术(CergentisB.V.)。关于细节，参见图9C。
b)结果
(1)使用FC21来扩增NK细胞提供了用于基因插入的最佳条件。
酶促反应调节CRISPaint和HR。CRISPaint是LIG4依赖性过程，而其他蛋白质诸如BRCA1和BRCA2调节HR。因此，分析了在新鲜分离的NK细胞中或用表达膜结合IL-21的饲养细胞(FC21)刺激后七天(n＝4)的NK细胞中这些基因的表达水平，以评价在这种细胞类型中哪种修复途径更有效和在哪个扩增阶段更有效(图1A、图3A和图3B)。RNA-seq分析显示，第七天扩增的NK细胞与初始NK细胞相比具有更高表达的BRCA1和BRCA2。另外，在这些细胞中LIG4水平未降低；然而，在扩增的细胞中，作为DNA修复酶的LIG1的水平显著更高(图1B和图1C)，提供了在第7天扩增的NK细胞中通过CRISPaint进行HR或NHEJ引导的基因插入的最佳条件。
(2)成功靶向基因组安全港以进行基因插入。
基因组安全港(GSH)是基因组中可被修饰而不改变宿主细胞的正常功能并允许转基因充分表达的位点。为了在NK细胞中进行基因插入，选择腺相关病毒位点1(AAVS1)，该位点是GSH之一和磷酸酶1调节亚基12C(PPP1R12C)基因内的示例性基因座。该基因座已成功用于将基因定向插入到几种细胞类型中。首先，通过ATAC-seq测定来评估初始的NK细胞和扩增的NK细胞(n＝2)中AAVS1的染色质可及性，并且测定显示，与初始的NK细胞相比，FC21扩增的NK细胞中的染色质可及性未降低(图1D)。接着，通过将Cas9/RNP电穿孔到第七天扩增的NK细胞中使用一种gRNA来靶向AAVS1。48小时后，分离出NK细胞DNA，以用于使用CRISPR编辑推断(ICE)来检测CRISPR编辑的NK细胞中的插入缺失(Indel)，以分析Indel的频率。ICE结果显示，多达85％的经CRISPR修饰的NK细胞在AAVS1 Cas9靶向位点处具有至少一个插入缺失(图1E)。为了确保在该基因座处的基因组修饰不干扰NK细胞靶向癌细胞的能力，评估AAVS1KO NK细胞针对急性髓性白血病(AML)癌细胞系Kasumi-1的细胞毒性。使用钙黄绿素AM测定，在野生型NK细胞和经CRISPR修饰的NK细胞之间未观察到它们的杀伤能力的差异(图3C)。
(3)使用单链AAV6和Cas9/RNP的组合成功产生表达mCherry的原代人NK细胞。
对于HDR介导的基因插入，将编码mCherry的DNA克隆到单链AAV质粒的主链中并包装到AAV6病毒衣壳中，该DNA在AAVS1基因座中的cas9靶向位点的右位点侧翼区具有800bp的HA并且在左位点侧翼区具有1000bp的HA。将构建体设计成在转基因下游具有剪接受体，以改善mCherry基因的转录(图2A)。如这些方法中所述，用靶向AAVS1的Cas9/RNP电穿孔NK细胞，半小时后，用300K MOI或500K MOI的AAV6转导细胞(图2C)。这导致产生17％(300KMOI)和19％(500K MOI)mCherry阳性NK细胞，在电穿孔后48小时使用流式细胞术评价。这些细胞使用FC21进一步扩增一周，并通过FACS分选来富集mCherry阳性细胞。这产生mCherry阳性NK细胞的富集群体(用300K MOI转导的77％mCherry阳性NK细胞和用500K MOI的ssAAV6转导的86％NK细胞)。使用饲养细胞重新刺激这些细胞，并且将这些细胞再扩增30天，未观察到mCherry的表达水平的降低(图4A、图4B和图4C)。
(4)通过使用自互补的AAV6和Cas9/RNP改善基因插入。
如前所述，与ssAAV相比，scAAV载体在进入宿主细胞中之后可在较短的时间范围内变成双链。其可增加NK细胞中的基因插入的效率。为了测试这一点，使用scAAV6并将其与Cas9/RNP组合来改善ssAAV6方法的基因插入结果。由于scAAV中包装转基因的大小限制，设计了几种长度的HA，以提供用于将不同大小的转基因克隆到scAAV主链中的广泛可能性。因此，将编码mCherry的DNA(图2A)克隆到scAAV主链中并包装到AAV6衣壳中，该DNA在右侧具有30bp、300bp、500bp和1000bp的HA并且在左侧具有30bp、300bp、500bp和800bp的HA。然后按照与前面所述相同的步骤将ssAAV节段电穿孔并转导第7天扩增的NK细胞。该方法显著提高了产生表达mCherry的NK细胞的效率，其中正百分比报道如下：30bp(19％-20％)、300bp(80％-85％)、500bp(75％-85％)、800bp(80％-89％)(图4A和图4B)。可使用饲养细胞将这些细胞进一步扩增超过3周，并且未观察到表达mCherry的NK细胞的百分比的任何下降，证实稳定的外源基因表达。虽然由于scAAV中的大小限制，这些载体不能用于产生CAR NK细胞，但可认为mCherry是用于产生具有产生高效和稳定的外源蛋白质的能力的NK细胞的概念验证。当在新鲜分离的NK细胞中使用相同的Cas9/RNP电穿孔和AAV6转导方法时，mCherry表达的百分比显著更低(ss800bp AAV6为1.13％，并且sc300bp AAV6为2.9％，图5)。基于这些观察，使用FC21-扩增的NK细胞。
(5)CRISPaint可用于在NK细胞中进行基因插入。
为了克服在HDR引导的基因插入中观察到的HA优化的复杂性，测试了称为CRISPaint的不依赖同源性的基因插入方法。对于CRISPaint DNA模板，将AAVS1的Cas9双靶向序列(PAMgPAMg)掺入mCherry转基因周围但在scAAV的ITR内，并将其包装到AAV6中(图2B)。本文也进行了用于HR引导的基因插入的NK细胞的电穿孔和转导方法。在电穿孔和转导后并在扩增前两天，进行流式细胞术以评估NK细胞中mCherry的表达。发现被电穿孔并用300K MOI的递送CRISPaint PAMgPAMg的scAAV6转导的细胞中高达6％为mCherry阳性。可将这些细胞进一步分选出并富集多达77％的表达mCherry的NK细胞，并使用FC21扩增30天，未观察到mCherry阳性NK细胞的百分比下降(图4B和图4C)。虽然与HR引导的基因插入相比，使用CRISPaint进行基因整合的效率较低，但是该方法仍然是期望的，因为它允许研究者将感兴趣的基因整合到用户定义的基因座中，而不需要设计同源臂。
(6)成功产生人原代CD33 CAR NK细胞。
为了产生靶向CAR NK细胞的CD33，设计了两种构建体(Gen2和Gen4v2)。本文所用的CAR含有源自CD33单克隆抗体的同一scFv、随后是CD4和CD28作为共刺激结构域，以及用于Gen2和NKG2D的CD3z、2B4、随后是用于Gen4v2的CD3z(图6A和图6B)。为了提高CAR的表达水平(其大于mCherry)，掺入鼠白血病病毒源性(MND)启动子，而不是使用剪接受体，该启动子是造血系统中在CAR的起始密码子之前的高度组成型活性的启动子。然后将编码CD33CAR的DNA克隆到ssAAV的主链中，并将它们包装到AAV6衣壳中，该DNA对于AAVS1靶向位点而言具有600bp HA。电穿孔和转导后七天，使用流式细胞术分析NK细胞上的CAR表达，并检测到多达78％表达CD33 CAR的阳性NK细胞(在转导后第14天，Gen2为平均59.3％，并且Gen4v2为60％)。与Gen4v2相比，观察到在NK细胞上表达的CD33CAR-Gen2的平均荧光强度(MFI)更高(图6C和图6D)。接着，将细胞扩增并使其在饲养细胞上生长另一周(第14天)，在第7天和第14天之间未显示出CAR表达的显著降低(图6E)。与野生型细胞相比，基因操作对CAR表达细胞的扩增也不具有任何显著影响(图6F)。冷冻和解冻过程对CAR表达和CAR NK细胞的增强的细胞毒性也不具有任何负面影响(图7A和图7B)。接着，使用PCR确认编码转基因的DNA在DNA水平上整合(图9A和图9B)。另外，使用靶向基因座扩增(TLA)技术以超过5％的检测随机整合的灵敏度进行CD33CAR-Gen2整合的全基因组作图，并且该技术证明在样品的子集中载体正确整合在染色体19的靶向位置。无证据显示大量的脱靶整合位点。在样品中，检测到1个序列变体和4个结构变体，这表明至少在样品的子集中发生了不正确的靶向事件。此外，在样品的子集中在chr19中也鉴定出随机整合(图9C)。还表明，将病毒浓度降低至10K MOI也可用于产生CD33CAR-Gen2 NK细胞(图10A和图10B)。
(7)人原代CAR-NK细胞具有增强的抗肿瘤活性。
为了研究原代人CD33CAR NK细胞针对表达CD33的AML细胞的细胞毒性作用，进行基于钙黄绿素AM的细胞毒性测定。使用称为Kasumi-1和HL60的两种不同的表达CD33的AML细胞系(图11)并将它们与从三名不同健康个体采集的外周血中分离的NK细胞共培养。与野生型或AAVS1KO NK细胞相比，当与Kasumi-1或HL60共培养时，CD33CAR-gen2和CD33CAR-gen4v2 NK细胞显示出显著更高的CD107a(一种NK细胞脱粒标记)的表达水平。这也导致Kasumi-1被CD33CAR NK细胞显著更高的特异性裂解。还观察到CD33CAR-Gen2针对HL60的较高杀伤能力(图8A-图8F)。通过进行针对K562慢性骨髓性白血病(CML)的细胞毒性测定表明CD33CAR NK细胞针对表达CD33的癌细胞的增强的肿瘤杀伤的特异性，并且未观察到NK细胞杀伤能力的任何改善(图8I和图。12)。重要的是，观察到CD33CAR NK细胞针对AML-10(一种源自复发患者的原代人AML)的显著更高的抗肿瘤活性(图8G和图8H、图12)。总体上，与CD33CAR-Gen4v2 NK细胞相比，CD33CAR-Gen2 NK细胞显示出更好的细胞毒性。
c)讨论
原代人NK细胞中的基因修饰一直具有挑战性；本文报道了使用Cas9/RNP的电穿孔和单链或自互补AAV6基因通过HR和不依赖同源性的基因插入(CRISPaint)而递送的组合将定点基因成功、高效地整合到人原代NK细胞中。本文首次表明，在用FC21扩增期间人NK细胞中调节HR和NHEJ途径的基因的表达水平如何改变，并且提供了用于定点基因插入的最佳条件。还证明，AAVS1能够以高效水平携带并表达外源基因，如先前在T细胞和NK细胞中所示。此外表明，30bp-1000bp范围的HA可用于将基因插入到NK细胞中的AAVS1基因座中，但当用于scAAV6中时最短的最佳长度为300bp。这有助于研究人员基于其用于引入NK细胞的外源DNA的大小选择最佳HA。CRISPaint基因插入可用于标记内源基因，并用于研究NK细胞中蛋白质的生物学。
使用Cas9/RNP和AAV6基因递送的组合，并产生具有增强的抗AML活性的两种不同的人原代CD33CAR NK细胞。这些结果还表明，经基因修饰的NK细胞随后可用FC21扩增，使得能够生产大量用于癌症免疫疗法的经基因修饰的NK细胞。总之，本文所示的方法可用于免疫学、癌症免疫疗法和研究NK细胞的生物学中的若干应用。
表1。
表2。
条件1
反向-1200bp(1) TCCTGGGCAAACAGCATAA(SEQ ID NO:36)
正向-CD33CAR(1) GAGCTGCAGAAGGACAAGAT(SEQ ID NO:37)
条件2
反向-CD33CAR(2) CTCTGTGTCATCTGGATGTCTG(SEQ ID NO:38)
正向-1200bp(2) CTTTGAGCTCTACTGGCTTCTG(SEQ ID NO:39)
条件3
反向-1200bp(1) TCCTGGGCAAACAGCATAA(SEQ ID NO:40)
正向-1200bp(2) CTTTGAGCTCTACTGGCTTCTG(SEQ ID NO:41)
表3。
用特异于载体序列的2个独立引物集进行TLA(表3)。
序列变体。所检测到的序列变体示于表4中。该变体的频率可指示所使用的载体的变化。
表4：所鉴定的序列变体。
鉴定结构变体
发现4个载体-载体断裂点。所有融合均位于注释的同源臂处。由于样品的异质性，预期这些融合仅存在于样品的子集中。应当注意，四个融合中的三个融合显示出9bp-12bp同源性，这可能指示技术偏差。
载体：149(头部)融合至载体：4116(尾部)，具有9个同源碱基
GGCATGGGGTTGGGTGAGGGAGGAGAGATGCCCGGAGAGGACCCAGACACGGGGAGGATCCGCTCAGAGGACATCACGTGGTGCAGCGGCGCGCCGGCCGCAGAAAGGGAGTAGAGGCGGCCACGACCTGGTGAACACCTAGGA CGCACCATTCTCACAAAGGGAGTTTTCCACACGGACACCCCCCTCCTCACCACAGCCCTGCCAGGACGGGGCTGGC TACTGGCCTTATCTC(SEQ ID NO:46)
载体：149(头部)融合至载体：4,113(尾部)，具有12个同源碱基
GCGAGTGAAGACGGCATGGGGTTGGGTGAGGGAGGAGAGATGCCCGGAGAGGACCCAGACACGGGGAGGATCCGCTCAGAGGACATCACGTGGTGCAGCGGCGCGCCGGCCGCAGGAAGGGAGTAGAGGCGGCCACGACCTGGT GAACACCTAGGACGCACCATTCTCACAAAGGGAGTTTTCCACACGGACACCCCCCTCCTCACCACAGCCCTGCCAG GACGGGGCTGGCTACTGGCCTTA(SEQ ID NO:47)
载体：155(头部)融合至载体：4,163(尾部)，具有9个同源碱基
GCGAGTGAAGACGGCATGGGGTTGGGTGAGGGAGGAGAGATGCCCGGAGAGGACCCAGACACGGGGAGGATCCGCTCAGAGGACATCACGTGGTGCAGCGGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTG CGGCCGCAGAAAGGGAGTAGAGGCGGCCACGACCTGGTGAACACCTAGGACGCACCATTCTCACAAAGGGAGTTTT CCACACGGA(SEQ ID NO:48)
载体：158(头部)融合至载体：4,121(尾部)，具有4个同源碱基
GCGAGTGAAGACGGCATGGGGTTGGGTGAGGGAGGAGAGATGCCCGGAGAGGACCCAGACACGGGGAGGATCCGCTCAGAGGACATCACGTGGTGCAGCGGCCGCAGAAAGGGAGTAGAGGCGGCCACGACCTGGTGAACACCT AGGACGCACCATTCTCACAAAGGGAGTTTTCCACACGGACACCCCCCTCCTCACCACAGCCCTGCCAGGACGGGGC TGGCTACTGGCCTT(SEQ ID NO:49)
B.参考文献
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C.序列
SEQ ID NO:1 30bp右同源臂
gattggtgacagaaaagccccatccttagg
SEQ ID NO:2 30bp左同源臂
ttatctgtcccctccaccccacagtggggc
SEQ ID NO:3 300bp右同源臂
gattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgtta
ggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacga
tggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcc
cggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggctgtc
SEQ ID NO:4 300bp左同源臂
gttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctag
ctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatg
tccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccg
gttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggc
SEQ ID NO:5 500bp右同源臂
gattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgtta
ggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacga
tggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcc
cggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggctgtctggtgcgtttcactg
atcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctg
agttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccag
tagccagccccgtcctggcag
SEQ ID NO:6 500bp左同源臂
tcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtccc
gcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacc
tctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagct
cccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctc
agctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccc
cgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccacccca
cagtggggc
SEQ ID NO:7 800bp右同源臂
gattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgtta
ggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacga
tggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcc
cggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggctgtctggtgcgtttcactg
atcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctg
agttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccag
tagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgc
gtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgcta
tctgggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttgg
caagcccaggagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgcccctt
ccctacaggggttcctggctctgctcttcagactgagccccgttcccctgcatccccgttcccctgcatcccccttcccct
gcatcccccagaggccccaggccacctacttggcctggaccccacgagaggccaccccagccctgtctaccaggct
gccttttgggtggattctcctccaactgtggggtgactgcttgg
SEQ ID NO:8 800bp左同源臂
tgctttctctgacctgcattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggct
ggcccagatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcc
caaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgg
gtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggg
gcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcct
gcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttg
cctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggc
SEQ ID NO:9PAMg(PAM+编码crRNA的序列)
Ccaatcctgtccctagtggcccc
SEQ ID NO:10剪接受体
atcgatcgcaggcgcaatcttcgcatttcttttttccag
SEQ ID NO:11BGH polyA终止子
cctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattc
SEQ ID NO:12mCherry
gtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaa
SEQ ID NO:13具有掺入的mCherry转基因的30bp质粒。
ttatctgtcccctccaccccacagtggggccactagggacagcgatcgggtacatcgatcgcaggcgcaatcttcgca
tttcttttttccaggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacat
ggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccag
accgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacgg
ctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtggg
agcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcat
ctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctggga
ggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaagg
acggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctac
aacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagg
gccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaacgcggccgccctcgactgtgccttctagttgccagc
catctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgagga
aattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattcgattggtgacagaaaagccccatccttagg
SEQ ID NO:14具有掺入的mCherry转基因的300bp质粒。
gttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctag
ctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatg
tccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccg
gttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccactagggacagcgatcgggta
catcgatcgcaggcgcaatcttcgcatttcttttttccaggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaag
gagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgag
ggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctggga
catcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagct
gtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggac
tcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaat
gcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgag
atcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaa
gcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcg
tggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagtaacgcggccgc
cctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactc
ccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattcgattggtgacagaaaa
gccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctg
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atcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggcc
accctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggctgtc
SEQ ID NO:15具有掺入的mCherry转基因的500bp质粒。
tcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtccc
gcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacc
tctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagct
cccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctc
agctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccc
cgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccacccca
cagtggggccactagggacagcgatcgggtacatcgatcgcaggcgcaatcttcgcatttcttttttccaggtgagcaa
gggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggc
cacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtga
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accccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgag
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gcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgta
ccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgct
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atcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggc
atggacgagctgtacaagtaacgcggccgccctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctccccc
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ccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctct
aaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaaggggggg
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ggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcaga
ataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgt
gagataaggccagtagccagccccgtcctggcag
SEQ ID NO:16具有掺入的mCherry转基因的800bp质粒。
tgctttctctgacctgcattctctcccctgggcctgtgccgctttctgtctgcagcttgtggcctgggtcacctctacggct
ggcccagatccttccctgccgcctccttcaggttccgtcttcctccactccctcttccccttgctctctgctgtgttgctgcc
caaggatgctctttccggagcacttccttctcggcgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgg
gtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggg
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gcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttg
cctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctc
tagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacc
cgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttata
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gccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagg
gcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcc
cttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccga
ctacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccg
tgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgac
ggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccct
gaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctaca
aggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgagga
ctacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaagta
acgcggccgccctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctgga
aggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgtcattctattcgattg
gtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgttaggca
gattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacgatgga
gccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcccggt
tctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggctgtctggtgcgtttcactgatcct
ggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctgagttct
aactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccagtagcc
agccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgcgtcct
aggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctctttctccatccttctttccttaaagagtccccagtgctatctg
ggacatattcctccgcccagagcagggtcccgcttccctaaggccctgctctgggcttctgggtttgagtccttggcaa
gcccaggagaggcgctcaggcttccctgtcccccttcctcgtccaccatctcatgcccctggctctcctgccccttccct
acaggggttcctggctctgctcttcagactgagccccgttcccctgcatccccgttcccctgcatcccccttcccctgca
tcccccagaggccccaggccacctacttggcctggaccccacgagaggccaccccagccctgtctaccaggctgcc
ttttgggtggattctcctccaactgtggggtgactgcttgg
SEQ ID NO:17(crRNA)
GGGGCCACTAGGGACAGGAT
SEQ ID NO:18scFV：
atgctgctgctggtgacctctctgctgctgtgcgagctgccacacccagccttcctgctgatcccagacatccagatga
cacagagccccagctccctgagcgcctccgtgggcgacagagtgaccatcacatgtagggcctctgagagcgtgga
taactatggcatcagcttcatgaattggtttcagcagaagcctggcggcgccccaaagctgctgatctacgcagccag
catgcagggctccggcgtgccctctcggttctccggctctggcagcggcaccgacttcaccctgacaatctctagcct
gcagccagacgatttcgccacatactattgccagcagagcaaggaggtgccctggacctttggccagggcacaaag
gtggagatcaagggctccacctctggcagcggcaagcctggcagcggagagggctccacaaagggacaggtgca
gctggtgcagtccggagccgaggtgaagaagccaggctcctctgtgaaggtgtcttgtaaggccagcggctatacct
tcacagactacaacatgcactgggtgcgccaggcaccaggacagggcctggagtggatcggctacatctatccttac
aacggcggcaccggctataatcagaagtttaagtccaaggccaccatcacagccgatgagtctaccaatacagccta
catggagctgagcagcctgcggtccgaggacacagccgtgtactattgcgcccggggcagacccgctatggactatt
ggggccagggcaccctggtgacagtgtctag
SEQ ID NO:19IgG4铰链：
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caaagccaaaggacaccctgatgatcagccggaccccagaggtgacatgcgtggtggtggacgtgagccaggag
gaccccgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgccaagaccaagccaagagaggag
cagtttaactccacctatagggtggtgtctgtgctgacagtgctgcaccaggactggctgaacggcaaggagtacaag
tgcaaggtgtccaataagggcctgccttcctctatcgagaagaccatctctaaggcaaagggacagccaagggagcc
acaggtgtatacactgccccctagccaggaggagatgaccaagaaccaggtgtccctgacatgtctggtgaagggct
tttacccttctgacatcgccgtggagtgggagagcaatggccagccagagaacaattataagaccacaccacccgtg
ctggactctgatggcagcttctttctgtacagccgcctgaccgtggataagtcccggtggcaggagggcaacgtgttct
cctgctctgtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacacagaagagcctgtccctgtctctgggcaag
SEQ ID NO:20CD28：
Atgttttgggtgctggtggtggtgggaggcgtgctggcctgttattccctgctggtgaccgtggccttcatcatcttttgg
gtgcgctccaagcggagccggggcggacactctgactacatgaacatgaccccacggagacccggacctacaagg
aagcactatcagccctacgcccctccacgggacttcgcagcatatcgcagc
SEQ ID NO:21CD3z：
Cgggtgaagtttagcagatccgccgatgcaccagcatatcagcagggacagaatcagctgtacaacgagctgaatct
gggcaggcgcgaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcccag
gcgcaagaaccctcaggagggcctgtataatgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctacagcgagatcgg
catgaagggagagcggagaaggggcaagggacacgatggcctgtatcagggcctgtccaccgccacaaaggaca
cctacgatgcactgcacatgcaggccctgccacctcggtga
SEQ ID NO:22克隆在ssAAV主链中的CD33CAR-Gen2(图16)：cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccggcgcgccgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaacccc
aaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcg
ggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgt
catggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagc
atgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggtt
ctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccactagggacagcgatcgggtacatcgatcacgagact
agcctcgagaagcttgatatcgaattccacggggttggacgcgtcttaattaaggatccaaggtcaggaacagagaaa
caggagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagttggaac
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agatgcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaatgaccct
gtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctctatataagcagag
ctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgactctagag
gatcgatcccccgggctgcaggaattcaagcgagaagacaagggcagaaagcaccgccaccatgctgctgctggt
gacctctctgctgctgtgcgagctgccacacccagccttcctgctgatcccagacatccagatgacacagagccccag
ctccctgagcgcctccgtgggcgacagagtgaccatcacatgtagggcctctgagagcgtggataactatggcatca
gcttcatgaattggtttcagcagaagcctggcggcgccccaaagctgctgatctacgcagccagcatgcagggctcc
ggcgtgccctctcggttctccggctctggcagcggcaccgacttcaccctgacaatctctagcctgcagccagacgat
ttcgccacatactattgccagcagagcaaggaggtgccctggacctttggccagggcacaaaggtggagatcaagg
gctccacctctggcagcggcaagcctggcagcggagagggctccacaaagggacaggtgcagctggtgcagtcc
ggagccgaggtgaagaagccaggctcctctgtgaaggtgtcttgtaaggccagcggctataccttcacagactacaa
catgcactgggtgcgccaggcaccaggacagggcctggagtggatcggctacatctatccttacaacggcggcacc
ggctataatcagaagtttaagtccaaggccaccatcacagccgatgagtctaccaatacagcctacatggagctgagc
agcctgcggtccgaggacacagccgtgtactattgcgcccggggcagacccgctatggactattggggccagggca
ccctggtgacagtgtctagcgagagcaagtacggaccaccttgcccaccatgtcctgcaccagagttcctgggagga
ccttccgtgttcctgtttcctccaaagccaaaggacaccctgatgatcagccggaccccagaggtgacatgcgtggtg
gtggacgtgagccaggaggaccccgaggtgcagttcaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgccaag
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gaacggcaaggagtacaagtgcaaggtgtccaataagggcctgccttcctctatcgagaagaccatctctaaggcaa
agggacagccaagggagccacaggtgtatacactgccccctagccaggaggagatgaccaagaaccaggtgtccc
tgacatgtctggtgaagggcttttacccttctgacatcgccgtggagtgggagagcaatggccagccagagaacaatt
ataagaccacaccacccgtgctggactctgatggcagcttctttctgtacagccgcctgaccgtggataagtcccggtg
gcaggagggcaacgtgttctcctgctctgtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacacagaagagcctgtccct
gtctctgggcaagatgttttgggtgctggtggtggtgggaggcgtgctggcctgttattccctgctggtgaccgtggcct
tcatcatcttttgggtgcgctccaagcggagccggggcggacactctgactacatgaacatgaccccacggagaccc
ggacctacaaggaagcactatcagccctacgcccctccacgggacttcgcagcatatcgcagccgggtgaagtttag
cagatccgccgatgcaccagcatatcagcagggacagaatcagctgtacaacgagctgaatctgggcaggcgcga
ggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagcccaggcgcaagaaccct
caggagggcctgtataatgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggaga
gcggagaaggggcaagggacacgatggcctgtatcagggcctgtccaccgccacaaaggacacctacgatgcact
gcacatgcaggccctgccacctcggtgaaagtaacgccctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgccc
ctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattg
tctgagtaggtgtcattctattcgattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgg
gtctaacccccacctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgcca
gaacctctaaggtttgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaa
gggggggatgcgtgacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacg
cggctgtctggtgcgtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaaca
aaatcagaataagttggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagt
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actccctttgtgagaatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctgcggccgcaggaac
ccctagtgatggagttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccga
cgcccgggctttgcccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcgcctgatgcggtat
tttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcatta
agcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttc
ttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtg
ctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttc
gccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggct
attcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattt
taacaaaatattaacgtttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccga
cacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgt
ctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcc
tatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccct
atttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaa
ggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccaga
aacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcg
gtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtatt
atcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcacca
gtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacact
gcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgta
actcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagc
aatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatgg
aggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccgg
tgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacg
gggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactg
tcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgat
aatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttct
tgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatc
aagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccg
tagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgc
cagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaa
cggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatg
agaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagag
cgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtc
gatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttt
tgctggccttttgctcacatgt
ITR1序列对应于SEQ ID NO:22的核酸位置1-141；
MND-CD33CAR-gen2构建体对应于SEQ ID NO:22的核酸位置156-4118；600bp左同源臂AAVS1对应于SEQ ID NO:22的核酸位置156-759；
MND启动子对应于SEQ ID NO:22的核酸位置783-1322；
编码CD33 CAR gen2的序列对应于SEQ ID NO:22的核酸位置1329-3362；
编码scFV-CD33的序列对应于SEQ ID NO:22的核酸位置1329-2128；
编码IgG铰链CD4的序列对应于SEQ ID NO:22的核酸位置2130-2816；
编码CD28的序列对应于SEQ ID NO:22的核酸位置2814-3023；
编码CD3ζ的序列对应于SEQ ID NO:22的核酸位置3024-3362；
BGHPA对应于SEQ ID NO:22的核酸位置3372-3518；
BGH poly对应于SEQ ID NO:22的核酸位置3378-3489；
600bp右同源臂AAVS1对应于SEQ ID NO:22的核酸位置3519-4118；
ITR2序列对应于SEQ ID NO:22的核酸位置4127-4267。
SEQ ID NO:23CD33CAR-Gen4v2(图17)：
cctgcaggcagctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgcccgggcaaagcccgggcgtcgggcgacctttggtcgcccggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcctgcggccggcgcgccgctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaaccccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttctccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagtaccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcacctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggcatcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttgctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggtacttttatctgtcccctccaccccacagtggggccactagggacagcgatcgggtacatcgatcacgagactagcctcgagaagcttgatatcgaattccacggggttggacgcgtcttaattaaggatccaaggtcaggaacagagaaacaggagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagttggaacagcagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaagacaccgactctagaggatcgatcccccgggctgcaggaattcaagcgagaagacaagggcagaaagcaccgccaccatgctgctgctggtgacctccctgctgctgtgcgagctgccacaccctgcctttctgctgatcccagacatccagatgacacagagccccagctccctgtctgccagcgtgggcgacagagtgaccatcacatgtagggcctccgagtctgtggataactatggcatcag
ctttatgaattggttccagcagaagccaggaggcgcccctaagctgctgatctacgcagcctccatgcagggctctgg
cgtgcccagccgctttagcggctccggctctggcaccgatttcaccctgacaatctctagcctgcagccagacgatttt
gccacatactattgccagcagtccaaggaggtgccctggaccttcggccagggcacaaaggtggagatcaagggca
gcacctccggctctggcaagcctggctccggagagggctctacaaagggacaggtgcagctggtgcagagcggag
ccgaggtgaagaagccaggctcctctgtgaaggtgagctgtaaggcctccggctatacctttacagactacaacatgc
actgggtgagacaggcaccaggacagggcctggagtggatcggctacatctatccttacaacggcggcaccggcta
taatcagaagttcaagagcaaggccaccatcacagccgatgagtccaccaatacagcctacatggagctgagcagc
ctgaggagcgaggacacagccgtgtactattgcgccagaggcaggcctgctatggactattggggccagggcaccc
tggtgacagtgtctagcgagtccaagtacggaccaccttgcccaccatgtccagcaccagagtttctgggaggaccta
gcgtgtttctgttccctccaaagccaaaggacaccctgatgatcagcagaacccccgaggtgacatgcgtggtggtgg
acgtgtcccaggaggaccccgaggtgcagtttaactggtacgtggatggcgtggaggtgcacaatgccaagaccaa
gcctagagaggagcagttcaactccacctatagggtggtgtctgtgctgacagtgctgcaccaggactggctgaacg
gcaaggagtacaagtgcaaggtgtctaataagggcctgccatcctctatcgagaagaccatcagcaaggccaaggg
ccagcctagggagccacaggtgtatacactgcccccttcccaggaggagatgaccaagaaccaggtgtctctgacat
gtctggtgaagggcttctacccatccgacatcgccgtggagtgggagtctaatggccagcccgagaacaattataaga
ccacaccacccgtgctggactctgatggcagcttctttctgtactctcgcctgaccgtggataagagccggtggcagg
agggcaacgtgtttagctgctccgtgatgcacgaggccctgcacaatcactacacacagaagtctctgagcctgtccc
tgggcaagagcaacctgttcgtggcctcctggatcgccgtgatgatcatctttcgcatcggcatggccgtggccatctt
ctgctgtttctttttcccatccggaggctctggaggaggctccggctggcggagaaagcggaaggagaagcagagc
gagacctcccctaaggagtttctgacaatctatgaggacgtgaaggatctgaagaccaggcgcaatcacgagcagga
gcagaccttcccaggaggaggctctacaatctacagcatgatccagtcccagagcagcgccccaaccagccagga
gccagcctatacactgtactctctgatccagcctagccggaagtctggcagccgcaagcggaaccactccccatcttt
caattctaccatctatgaagtgatcggcaagagccagcctaaggcccagaacccagccagactgtccaggaaggag
ctggagaattttgacgtgtactctggaggcagcggaggaggctctggccgcgtgaagttcagccggtccgccgatgc
cccagcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgct
ggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagccccggagaaagaaccctcaggagggcctgtat
aatgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggca
agggacacgatggcctgtatcagggcctgagcaccgccacaaaggacacctacgatgccctgcacatgcaggccct
gcctccacggtgatgaaagtaacgccctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgcc
ttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcgcattgtctgagtaggtgt
cattctattcgattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccac
ctcctgttaggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtt
tgcttacgatggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgt
gacctgcccggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggctgtctggtgc
gtttcactgatcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagt
tggtcctgagttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagata
aggccagtagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgag
aatggtgcgtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttctgcggccgcaggaacccctagtgatgga
gttggccactccctctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttg
cccgggcggcctcagtgagcgagcgagcgcgcagctgcctgcaggggcgcctgatgcggtattttctccttacgcat
ctgtgcggtatttcacaccgcatacgtcaaagcaaccatagtacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggt
gtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctc
gccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctc
gaccccaaaaaacttgatttgggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttg
gagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcgggctattcttttgatttataa
gggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaac
gtttacaattttatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacac
ccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgc
atgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaa
tgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttcta
aatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgag
tattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaa
gtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgag
agttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacg
ccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagc
atcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttactt
ctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgtt
gggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgtt
gcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagtt
gcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgt
ITR1序列对应于SEQ ID NO:23的核酸位置1-141；MND-CD33CAR-gen2构建体对应于SEQ ID NO:23的核酸位置156-4415；600bp左同源臂AAVS1对应于SEQ ID NO:23的核酸位置156-759；MND启动子对应于SEQ ID NO:23的核酸位置783-1322；
编码CD33 CAR gen2的序列对应于SEQ ID NO:23的核酸位置1329-3659；编码scFV-CD33的序列对应于SEQ ID NO:23的核酸位置1329-2129；编码IgG铰链CD4的序列对应于SEQ ID NO:23的核酸位置2130-2816；编码NKG2D TM的序列对应于SEQ ID NO:23的核酸位置2817-2909；编码2B4的序列对应于SEQ ID NO:23的核酸位置2934-3293；编码CD3ζ的序列对应于核酸位置3318-3659；BGHPA对应于SEQ ID NO:23的核酸位置3669-3815；BGH poly对应于SEQ ID NO:23的核酸位置3675-3786；
600bp右同源臂AAVS1对应于SEQ ID NO:23的核酸位置3816-4415；ITR2序列对应于SEQ ID NO:23的核酸位置4424-4564。
SEQ ID NO:24NKG2D跨膜结构域：
Agcaacctgttcgtggcctcctggatcgccgtgatgatcatctttcgcatcggcatggccgtggccatcttctgctgtttctttttcccatcc
SEQ ID NO:25接头：
Ggaggctctggaggaggctccggc
SEQ ID NO:26 2B4：
Tggcggagaaagcggaaggagaagcagagcgagacctcccctaaggagtttctgacaatctatgaggacgtgaaggatctgaagaccaggcgcaatcacgagcaggagcagaccttcccaggaggaggctctacaatctacagcatgatccagtcccagagcagcgccccaaccagccaggagccagcctatacactgtactctctgatccagcctagccggaagtctggcagccgcaagcggaaccactccccatctttcaattctaccatctatgaagtgatcggcaagagccagcctaaggcccagaacccagccagactgtccaggaaggagctggagaattttgacgtgtactct
SEQ ID NO:27接头：
Ggaggcagcggaggaggctctggc
SEQ ID NO:28CD3z：
Cgcgtgaagttcagccggtccgccgatgccccagcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaatctgggccggagagaggagtacgacgtgctggataagaggcggggccgggaccccgagatgggaggcaagccccggagaaagaaccctcaggagggcctgtataatgagctgcagaaggacaagatggccgaggcctactccgagatcggcatgaagggagagaggcgccggggcaagggacacgatggcctgtatcagggcctgagcaccgccacaaaggacacctacgatgccctgcacatgcaggccctgcctccacggtgatga
SEQ ID NO:29，抗CD33 ScFv。
Atgctgctgctggtgacctccctgctgctgtgcgagctgccacaccctgcctttctgctgatcccagacatccagatgacacagagccccagctccctgtctgccagcgtgggcgacagagtgaccatcacatgtagggcctccgagtctgtggataactatggcatcagctttatgaattggttccagcagaagccaggaggcgcccctaagctgctgatctacgcagcctccatgcagggctctggcgtgcccagccgctttagcggctccggctctggcaccgatttcaccctgacaatctctagcctgc
agccagacgattttgccacatactattgccagcagtccaaggaggtgccctggaccttcggccagggcacaaaggtg
gagatcaagggcagcacctccggctctggcaagcctggctccggagagggctctacaaagggacaggtgcagctg
gtgcagagcggagccgaggtgaagaagccaggctcctctgtgaaggtgagctgtaaggcctccggctatacctttac
agactacaacatgcactgggtgagacaggcaccaggacagggcctggagtggatcggctacatctatccttacaacg
gcggcaccggctataatcagaagttcaagagcaaggccaccatcacagccgatgagtccaccaatacagcctacat
ggagctgagcagcctgaggagcgaggacacagccgtgtactattgcgccagaggcaggcctgctatggactattgg
ggccagggcaccctggtgacagtgtctagc
SEQ ID NO:30，MND启动子
atcgatcacgagactagcctcgagaagcttgatatcgaattccacggggttggacgcgtcttaattaaggatccaaggt
caggaacagagaaacaggagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggcca
agaacagttggaacagcagaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaa
gaacagatggtccccagatgcggtcccgccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaag
gacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgag
ctctatataagcagagctcgtttagtgaaccgtcagatcgcctggagacgccatccacgctgttttgacctccatagaag
acaccgactctagaggatcgatcccccgggctgcaggaattcaagcgagaagacaagggcagaaagcacc
SEQ ID NO:31，600bp，LHA，AAVS1(gen4v2和gen2)
gctgcaccacgtgatgtcctctgagcggatcctccccgtgtctgggtcctctccgggcatctctcctccctcacccaac
cccatgccgtcttcactcgctgggttcccttttccttctccttctggggcctgtgccatctctcgtttcttaggatggccttct
ccgacggatgtctcccttgcgtcccgcctccccttcttgtaggcctgcatcatcaccgtttttctggacaaccccaaagta
ccccgtctccctggctttagccacctctccatcctcttgctttctttgcctggacaccccgttctcctgtggattcgggtcac
ctctcactcctttcatttgggcagctcccctaccccccttacctctctagtctgtgctagctcttccagccccctgtcatggc
atcttccaggggtccgagagctcagctagtcttcttcctccaacccgggcccctatgtccacttcaggacagcatgtttg
ctgcctccagggatcctgtgtccccgagctgggaccaccttatattcccagggccggttaatgtggctctggttctgggt
acttttatctgtcccctccaccccacagtggggc
SEQ ID NO:32，600bp，RHA，AAVS1(gen4v2和gen2)
Gattggtgacagaaaagccccatccttaggcctcctccttcctagtctcctgatattgggtctaacccccacctcctgtta
ggcagattccttatctggtgacacacccccatttcctggagccatctctctccttgccagaacctctaaggtttgcttacga
tggagccagagaggatcctgggagggagagcttggcagggggtgggagggaagggggggatgcgtgacctgcc
cggttctcagtggccaccctgcgctaccctctcccagaacctgagctgctctgacgcggctgtctggtgcgtttcactg
atcctggtgctgcagcttccttacacttcccaagaggagaagcagtttggaaaaacaaaatcagaataagttggtcctg
agttctaactttggctcttcacctttctagtccccaatttatattgttcctccgtgcgtcagttttacctgtgagataaggccag
tagccagccccgtcctggcagggctgtggtgaggaggggggtgtccgtgtggaaaactccctttgtgagaatggtgc
gtcctaggtgttcaccaggtcgtggccgcctctactccctttct
SEQ ID NO:33，靶向AAVS1的gRNA序列
GGGGCCACTAGGGACAGGAT
SEQ ID NO:34.TTCTCCTGTGGATTCGGGTCAC
SEQ ID NO:35.CTCTCTGGCTCCATCGTAAGCA
SEQ ID NO:36.TCCTGGGCAAACAGCATAA
SEQ ID NO:37.GAGCTGCAGAAGGACAAGAT
SEQ ID NO:38.CTCTGTGTCATCTGGATGTCTG
SEQ ID NO:39.CTTTGAGCTCTACTGGCTTCTG
SEQ ID NO:40.TCCTGGGCAAACAGCATAA
SEQ ID NO:41.CTTTGAGCTCTACTGGCTTCTG
SEQ ID NO:42.GCGAGTGAAGACGGCATG
SEQ ID NO:43.GTCTGTGCTAGCTCTTCCAG
SEQ ID NO:44.GCGATGTCAGAAGGGTAAA
SEQ ID NO:45.GGCGGACACTCTGACTACAT
SEQ ID NO:46
GGCATGGGGTTGGGTGAGGGAGGAGAGATGCCCGGAGAGGACCCAGA
CACGGGGAGGATCCGCTCAGAGGACATCACGTGGTGCAGCGGCGCGCC
GGCCGCAGAAAGGGAGTAGAGGCGGCCACGACCTGGTGAACACCTAG
GACGCACCATTCTCACAAAGGGAGTTTTCCACACGGACACCCCCCTCCT
CACCACAGCCCTGCCAGGACGGGGCTGGCTACTGGCCTTATCTC
SEQ ID NO:47
GCGAGTGAAGACGGCATGGGGTTGGGTGAGGGAGGAGAGATGCCCGG
AGAGGACCCAGACACGGGGAGGATCCGCTCAGAGGACATCACGTGGT
GCAGCGGCGCGCCGGCCGCAGGAAGGGAGTAGAGGCGGCCACGACCT
GGTGAACACCTAGGACGCACCATTCTCACAAAGGGAGTTTTCCACACG
GACACCCCCCTCCTCACCACAGCCCTGCCAGGACGGGGCTGGCTACTG
GCCTTA
SEQ ID NO:48
GCGAGTGAAGACGGCATGGGGTTGGGTGAGGGAGGAGAGATGCCCGG
AGAGGACCCAGACACGGGGAGGATCCGCTCAGAGGACATCACGTGGT
GCAGCGGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCC
TGCGGCCGCAGAAAGGGAGTAGAGGCGGCCACGACCTGGTGAACACC
TAGGACGCACCATTCTCACAAAGGGAGTTTTCCACACGGA
SEQ ID NO:49
GCGAGTGAAGACGGCATGGGGTTGGGTGAGGGAGGAGAGATGCCCGG
AGAGGACCCAGACACGGGGAGGATCCGCTCAGAGGACATCACGTGGT
GCAGCGGCCGCAGAAAGGGAGTAGAGGCGGCCACGACCTGGTGAACA
CCTAGGACGCACCATTCTCACAAAGGGAGTTTTCCACACGGACACCCC
CCTCCTCACCACAGCCCTGCCAGGACGGGGCTGGCTACTGGCCTT
SEQ ID NO:50(PAMgPAMg mCherry构建体，图22)
CCAATCCTGTCCCTAGTGGCCCCCACTAGGGACAGCGATCGGGTACAT
CGATCGCAGGCGCAATCTTCGCATTTCTTTTTTCCAGGTGAGCAAGGGC
GAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTG
CACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGA
GGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGG
TGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCA
GTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCC
CGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGT
GATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTC
CCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAA
CTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGA
GGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGA
GATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTG
AGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCG
CCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACT
ACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCG
GCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACGCGGCCGCCCTCGACTGTGCC
TTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGA
CCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAAT
TGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCCCAATCCTGTCCCT
AGTGGCCCC
第一PAM序列对应于SEQ ID NO:50的核酸位置1-3；编码crRNA的第一序列对应于SEQ ID NO:50的核酸位置4-23；剪接受体序列对应于SEQ ID NO:50的核酸位置47-85；mCherry密码子(优化的)对应于SEQ ID NO:50的核酸位置86-793；BGHpA序列对应于SEQ IDNO:50的核酸位置803-949；第二PAM序列对应于SEQ ID NO:50的核酸位置950-952；编码crRNA的第二序列对应于SEQ ID NO:50的核酸位置953-972。
SEQ ID NO:51(PAMgRNA mCherry构建体序列，图21)
CCAATCCTGTCCCTAGTGGCCCCCACTAGGGACAGCGATCGGGTACAT
CGATCGCAGGCGCAATCTTCGCATTTCTTTTTTCCAGGTGAGCAAGGGC
GAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTG
CACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGA
GGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGG
TGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCA
GTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCC
CGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGT
GATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTC
CCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAA
CTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGA
GGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGA
GATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTG
AGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCG
CCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACT
ACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACGCGGCCGCCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTC
PAM序列对应于SEQ ID NO:51的核酸位置1-3；
编码crRNA的序列对应于SEQ ID NO:51的核酸位置4-23；
剪接受体对应于SEQ ID NO:51的核酸位置47-85；
mCherry密码子(优化的)对应于SEQ ID NO:51的核酸位置86-793；
BGHpA序列对应于SEQ ID NO:51的核酸位置803-949。
SEQ ID NO:52.
Cccctccaccccacagtggggccactagggacaggattggtgacagaaaagccccatccttaggc
SEQ ID NO:53
Cccctccaccccacagtggggccactagggacag
SEQ ID NO:54
Attggtgacagaaaagccccatccttaggc
SEQ ID NO:55
Cccctccaccccacagtggggccactaggga
SEQ ID NO:56
Cccctccaccccac
SEQ ID NO:57
Cccctccaccccacagtggggccac
SEQ ID NO:58
gattggtgacagaaaagccccatccttaggc。
序列表
<110> 全国儿童医院研究所
<120> 嵌合抗原受体（CAR）NK细胞及其用途
<130> 10935-017WO1
<160> 58
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 1
gattggtgac agaaaagccc catccttagg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 2
ttatctgtcc cctccacccc acagtggggc 30
<210> 3
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 3
gattggtgac agaaaagccc catccttagg cctcctcctt cctagtctcc tgatattggg 60
tctaaccccc acctcctgtt aggcagattc cttatctggt gacacacccc catttcctgg 120
agccatctct ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc 180
ctgggaggga gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt 240
tctcagtggc caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggctgtc 300
<210> 4
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 4
gttctcctgt ggattcgggt cacctctcac tcctttcatt tgggcagctc ccctaccccc 60
cttacctctc tagtctgtgc tagctcttcc agccccctgt catggcatct tccaggggtc 120
cgagagctca gctagtcttc ttcctccaac ccgggcccct atgtccactt caggacagca 180
tgtttgctgc ctccagggat cctgtgtccc cgagctggga ccaccttata ttcccagggc 240
cggttaatgt ggctctggtt ctgggtactt ttatctgtcc cctccacccc acagtggggc 300
<210> 5
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 5
gattggtgac agaaaagccc catccttagg cctcctcctt cctagtctcc tgatattggg 60
tctaaccccc acctcctgtt aggcagattc cttatctggt gacacacccc catttcctgg 120
agccatctct ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc 180
ctgggaggga gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt 240
tctcagtggc caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggctgtc 300
tggtgcgttt cactgatcct ggtgctgcag cttccttaca cttcccaaga ggagaagcag 360
tttggaaaaa caaaatcaga ataagttggt cctgagttct aactttggct cttcaccttt 420
ctagtcccca atttatattg ttcctccgtg cgtcagtttt acctgtgaga taaggccagt 480
agccagcccc gtcctggcag 500
<210> 6
<211> 500
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 6
tcccttttcc ttctccttct ggggcctgtg ccatctctcg tttcttagga tggccttctc 60
cgacggatgt ctcccttgcg tcccgcctcc ccttcttgta ggcctgcatc atcaccgttt 120
ttctggacaa ccccaaagta ccccgtctcc ctggctttag ccacctctcc atcctcttgc 180
tttctttgcc tggacacccc gttctcctgt ggattcgggt cacctctcac tcctttcatt 240
tgggcagctc ccctaccccc cttacctctc tagtctgtgc tagctcttcc agccccctgt 300
catggcatct tccaggggtc cgagagctca gctagtcttc ttcctccaac ccgggcccct 360
atgtccactt caggacagca tgtttgctgc ctccagggat cctgtgtccc cgagctggga 420
ccaccttata ttcccagggc cggttaatgt ggctctggtt ctgggtactt ttatctgtcc 480
cctccacccc acagtggggc 500
<210> 7
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 7
gattggtgac agaaaagccc catccttagg cctcctcctt cctagtctcc tgatattggg 60
tctaaccccc acctcctgtt aggcagattc cttatctggt gacacacccc catttcctgg 120
agccatctct ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc 180
ctgggaggga gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt 240
tctcagtggc caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggctgtc 300
tggtgcgttt cactgatcct ggtgctgcag cttccttaca cttcccaaga ggagaagcag 360
tttggaaaaa caaaatcaga ataagttggt cctgagttct aactttggct cttcaccttt 420
ctagtcccca atttatattg ttcctccgtg cgtcagtttt acctgtgaga taaggccagt 480
agccagcccc gtcctggcag ggctgtggtg aggagggggg tgtccgtgtg gaaaactccc 540
tttgtgagaa tggtgcgtcc taggtgttca ccaggtcgtg gccgcctcta ctccctttct 600
ctttctccat ccttctttcc ttaaagagtc cccagtgcta tctgggacat attcctccgc 660
ccagagcagg gtcccgcttc cctaaggccc tgctctgggc ttctgggttt gagtccttgg 720
caagcccagg agaggcgctc aggcttccct gtcccccttc ctcgtccacc atctcatgcc 780
cctggctctc ctgccccttc cctacagggg ttcctggctc tgctcttcag actgagcccc 840
gttcccctgc atccccgttc ccctgcatcc cccttcccct gcatccccca gaggccccag 900
gccacctact tggcctggac cccacgagag gccaccccag ccctgtctac caggctgcct 960
tttgggtgga ttctcctcca actgtggggt gactgcttgg 1000
<210> 8
<211> 804
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 8
tgctttctct gacctgcatt ctctcccctg ggcctgtgcc gctttctgtc tgcagcttgt 60
ggcctgggtc acctctacgg ctggcccaga tccttccctg ccgcctcctt caggttccgt 120
cttcctccac tccctcttcc ccttgctctc tgctgtgttg ctgcccaagg atgctctttc 180
cggagcactt ccttctcggc gctgcaccac gtgatgtcct ctgagcggat cctccccgtg 240
tctgggtcct ctccgggcat ctctcctccc tcacccaacc ccatgccgtc ttcactcgct 300
gggttccctt ttccttctcc ttctggggcc tgtgccatct ctcgtttctt aggatggcct 360
tctccgacgg atgtctccct tgcgtcccgc ctccccttct tgtaggcctg catcatcacc 420
gtttttctgg acaaccccaa agtaccccgt ctccctggct ttagccacct ctccatcctc 480
ttgctttctt tgcctggaca ccccgttctc ctgtggattc gggtcacctc tcactccttt 540
catttgggca gctcccctac cccccttacc tctctagtct gtgctagctc ttccagcccc 600
ctgtcatggc atcttccagg ggtccgagag ctcagctagt cttcttcctc caacccgggc 660
ccctatgtcc acttcaggac agcatgtttg ctgcctccag ggatcctgtg tccccgagct 720
gggaccacct tatattccca gggccggtta atgtggctct ggttctgggt acttttatct 780
gtcccctcca ccccacagtg gggc 804
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 9
ccaatcctgt ccctagtggc ccc 23
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 10
atcgatcgca ggcgcaatct tcgcatttct tttttccag 39
<210> 11
<211> 147
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 11
cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct 60
tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc 120
attgtctgag taggtgtcat tctattc 147
<210> 12
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 12
gtgagcaagg gcgaggagga taacatggcc atcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg 60
cacatggagg gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc 120
ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca agggtggccc cctgcccttc 180
gcctgggaca tcctgtcccc tcagttcatg tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc 240
gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg 300
atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc gtgacccagg actcctccct gcaggacggc 360
gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg 420
cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc 480
ctgaagggcg agatcaagca gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgctgag 540
gtcaagacca cctacaaggc caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac 600
atcaagttgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc 660
gccgagggcc gccactccac cggcggcatg gacgagctgt acaagtaa 708
<210> 13
<211> 986
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列
<400> 13
ttatctgtcc cctccacccc acagtggggc cactagggac agcgatcggg tacatcgatc 60
gcaggcgcaa tcttcgcatt tcttttttcc aggtgagcaa gggcgaggag gataacatgg 120
ccatcatcaa ggagttcatg cgcttcaagg tgcacatgga gggctccgtg aacggccacg 180
agttcgagat cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag accgccaagc 240
tgaaggtgac caagggtggc cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc cctcagttca 300
tgtacggctc caaggcctac gtgaagcacc ccgccgacat ccccgactac ttgaagctgt 360
ccttccccga gggcttcaag tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc ggcgtggtga 420
ccgtgaccca ggactcctcc ctgcaggacg gcgagttcat ctacaaggtg aagctgcgcg 480
gcaccaactt cccctccgac ggccccgtaa tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct 540
cctccgagcg gatgtacccc gaggacggcg ccctgaaggg cgagatcaag cagaggctga 600
agctgaagga cggcggccac tacgacgctg aggtcaagac cacctacaag gccaagaagc 660
ccgtgcagct gcccggcgcc tacaacgtca acatcaagtt ggacatcacc tcccacaacg 720
aggactacac catcgtggaa cagtacgaac gcgccgaggg ccgccactcc accggcggca 780
tggacgagct gtacaagtaa cgcggccgcc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc 840
tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct 900
ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattcgatt 960
ggtgacagaa aagccccatc cttagg 986
<210> 14
<211> 1526
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 14
gttctcctgt ggattcgggt cacctctcac tcctttcatt tgggcagctc ccctaccccc 60
cttacctctc tagtctgtgc tagctcttcc agccccctgt catggcatct tccaggggtc 120
cgagagctca gctagtcttc ttcctccaac ccgggcccct atgtccactt caggacagca 180
tgtttgctgc ctccagggat cctgtgtccc cgagctggga ccaccttata ttcccagggc 240
cggttaatgt ggctctggtt ctgggtactt ttatctgtcc cctccacccc acagtggggc 300
cactagggac agcgatcggg tacatcgatc gcaggcgcaa tcttcgcatt tcttttttcc 360
aggtgagcaa gggcgaggag gataacatgg ccatcatcaa ggagttcatg cgcttcaagg 420
tgcacatgga gggctccgtg aacggccacg agttcgagat cgagggcgag ggcgagggcc 480
gcccctacga gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac caagggtggc cccctgccct 540
tcgcctggga catcctgtcc cctcagttca tgtacggctc caaggcctac gtgaagcacc 600
ccgccgacat ccccgactac ttgaagctgt ccttccccga gggcttcaag tgggagcgcg 660
tgatgaactt cgaggacggc ggcgtggtga ccgtgaccca ggactcctcc ctgcaggacg 720
gcgagttcat ctacaaggtg aagctgcgcg gcaccaactt cccctccgac ggccccgtaa 780
tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct cctccgagcg gatgtacccc gaggacggcg 840
ccctgaaggg cgagatcaag cagaggctga agctgaagga cggcggccac tacgacgctg 900
aggtcaagac cacctacaag gccaagaagc ccgtgcagct gcccggcgcc tacaacgtca 960
acatcaagtt ggacatcacc tcccacaacg aggactacac catcgtggaa cagtacgaac 1020
gcgccgaggg ccgccactcc accggcggca tggacgagct gtacaagtaa cgcggccgcc 1080
ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt 1140
gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca 1200
ttgtctgagt aggtgtcatt ctattcgatt ggtgacagaa aagccccatc cttaggcctc 1260
ctccttccta gtctcctgat attgggtcta acccccacct cctgttaggc agattcctta 1320
tctggtgaca cacccccatt tcctggagcc atctctctcc ttgccagaac ctctaaggtt 1380
tgcttacgat ggagccagag aggatcctgg gagggagagc ttggcagggg gtgggaggga 1440
agggggggat gcgtgacctg cccggttctc agtggccacc ctgcgctacc ctctcccaga 1500
acctgagctg ctctgacgcg gctgtc 1526
<210> 15
<211> 1926
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 15
tcccttttcc ttctccttct ggggcctgtg ccatctctcg tttcttagga tggccttctc 60
cgacggatgt ctcccttgcg tcccgcctcc ccttcttgta ggcctgcatc atcaccgttt 120
ttctggacaa ccccaaagta ccccgtctcc ctggctttag ccacctctcc atcctcttgc 180
tttctttgcc tggacacccc gttctcctgt ggattcgggt cacctctcac tcctttcatt 240
tgggcagctc ccctaccccc cttacctctc tagtctgtgc tagctcttcc agccccctgt 300
catggcatct tccaggggtc cgagagctca gctagtcttc ttcctccaac ccgggcccct 360
atgtccactt caggacagca tgtttgctgc ctccagggat cctgtgtccc cgagctggga 420
ccaccttata ttcccagggc cggttaatgt ggctctggtt ctgggtactt ttatctgtcc 480
cctccacccc acagtggggc cactagggac agcgatcggg tacatcgatc gcaggcgcaa 540
tcttcgcatt tcttttttcc aggtgagcaa gggcgaggag gataacatgg ccatcatcaa 600
ggagttcatg cgcttcaagg tgcacatgga gggctccgtg aacggccacg agttcgagat 660
cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac 720
caagggtggc cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc cctcagttca tgtacggctc 780
caaggcctac gtgaagcacc ccgccgacat ccccgactac ttgaagctgt ccttccccga 840
gggcttcaag tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc ggcgtggtga ccgtgaccca 900
ggactcctcc ctgcaggacg gcgagttcat ctacaaggtg aagctgcgcg gcaccaactt 960
cccctccgac ggccccgtaa tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct cctccgagcg 1020
gatgtacccc gaggacggcg ccctgaaggg cgagatcaag cagaggctga agctgaagga 1080
cggcggccac tacgacgctg aggtcaagac cacctacaag gccaagaagc ccgtgcagct 1140
gcccggcgcc tacaacgtca acatcaagtt ggacatcacc tcccacaacg aggactacac 1200
catcgtggaa cagtacgaac gcgccgaggg ccgccactcc accggcggca tggacgagct 1260
gtacaagtaa cgcggccgcc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc 1320
ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa 1380
aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattcgatt ggtgacagaa 1440
aagccccatc cttaggcctc ctccttccta gtctcctgat attgggtcta acccccacct 1500
cctgttaggc agattcctta tctggtgaca cacccccatt tcctggagcc atctctctcc 1560
ttgccagaac ctctaaggtt tgcttacgat ggagccagag aggatcctgg gagggagagc 1620
ttggcagggg gtgggaggga agggggggat gcgtgacctg cccggttctc agtggccacc 1680
ctgcgctacc ctctcccaga acctgagctg ctctgacgcg gctgtctggt gcgtttcact 1740
gatcctggtg ctgcagcttc cttacacttc ccaagaggag aagcagtttg gaaaaacaaa 1800
atcagaataa gttggtcctg agttctaact ttggctcttc acctttctag tccccaattt 1860
atattgttcc tccgtgcgtc agttttacct gtgagataag gccagtagcc agccccgtcc 1920
tggcag 1926
<210> 16
<211> 2730
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 16
tgctttctct gacctgcatt ctctcccctg ggcctgtgcc gctttctgtc tgcagcttgt 60
ggcctgggtc acctctacgg ctggcccaga tccttccctg ccgcctcctt caggttccgt 120
cttcctccac tccctcttcc ccttgctctc tgctgtgttg ctgcccaagg atgctctttc 180
cggagcactt ccttctcggc gctgcaccac gtgatgtcct ctgagcggat cctccccgtg 240
tctgggtcct ctccgggcat ctctcctccc tcacccaacc ccatgccgtc ttcactcgct 300
gggttccctt ttccttctcc ttctggggcc tgtgccatct ctcgtttctt aggatggcct 360
tctccgacgg atgtctccct tgcgtcccgc ctccccttct tgtaggcctg catcatcacc 420
gtttttctgg acaaccccaa agtaccccgt ctccctggct ttagccacct ctccatcctc 480
ttgctttctt tgcctggaca ccccgttctc ctgtggattc gggtcacctc tcactccttt 540
catttgggca gctcccctac cccccttacc tctctagtct gtgctagctc ttccagcccc 600
ctgtcatggc atcttccagg ggtccgagag ctcagctagt cttcttcctc caacccgggc 660
ccctatgtcc acttcaggac agcatgtttg ctgcctccag ggatcctgtg tccccgagct 720
gggaccacct tatattccca gggccggtta atgtggctct ggttctgggt acttttatct 780
gtcccctcca ccccacagtg gggccactag ggacagcgat cgggtacatc gatcgcaggc 840
gcaatcttcg catttctttt ttccaggtga gcaagggcga ggaggataac atggccatca 900
tcaaggagtt catgcgcttc aaggtgcaca tggagggctc cgtgaacggc cacgagttcg 960
agatcgaggg cgagggcgag ggccgcccct acgagggcac ccagaccgcc aagctgaagg 1020
tgaccaaggg tggccccctg cccttcgcct gggacatcct gtcccctcag ttcatgtacg 1080
gctccaaggc ctacgtgaag caccccgccg acatccccga ctacttgaag ctgtccttcc 1140
ccgagggctt caagtgggag cgcgtgatga acttcgagga cggcggcgtg gtgaccgtga 1200
cccaggactc ctccctgcag gacggcgagt tcatctacaa ggtgaagctg cgcggcacca 1260
acttcccctc cgacggcccc gtaatgcaga agaagaccat gggctgggag gcctcctccg 1320
agcggatgta ccccgaggac ggcgccctga agggcgagat caagcagagg ctgaagctga 1380
aggacggcgg ccactacgac gctgaggtca agaccaccta caaggccaag aagcccgtgc 1440
agctgcccgg cgcctacaac gtcaacatca agttggacat cacctcccac aacgaggact 1500
acaccatcgt ggaacagtac gaacgcgccg agggccgcca ctccaccggc ggcatggacg 1560
agctgtacaa gtaacgcggc cgccctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt 1620
ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta 1680
ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc gattggtgac 1740
agaaaagccc catccttagg cctcctcctt cctagtctcc tgatattggg tctaaccccc 1800
acctcctgtt aggcagattc cttatctggt gacacacccc catttcctgg agccatctct 1860
ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc ctgggaggga 1920
gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt tctcagtggc 1980
caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggctgtc tggtgcgttt 2040
cactgatcct ggtgctgcag cttccttaca cttcccaaga ggagaagcag tttggaaaaa 2100
caaaatcaga ataagttggt cctgagttct aactttggct cttcaccttt ctagtcccca 2160
atttatattg ttcctccgtg cgtcagtttt acctgtgaga taaggccagt agccagcccc 2220
gtcctggcag ggctgtggtg aggagggggg tgtccgtgtg gaaaactccc tttgtgagaa 2280
tggtgcgtcc taggtgttca ccaggtcgtg gccgcctcta ctccctttct ctttctccat 2340
ccttctttcc ttaaagagtc cccagtgcta tctgggacat attcctccgc ccagagcagg 2400
gtcccgcttc cctaaggccc tgctctgggc ttctgggttt gagtccttgg caagcccagg 2460
agaggcgctc aggcttccct gtcccccttc ctcgtccacc atctcatgcc cctggctctc 2520
ctgccccttc cctacagggg ttcctggctc tgctcttcag actgagcccc gttcccctgc 2580
atccccgttc ccctgcatcc cccttcccct gcatccccca gaggccccag gccacctact 2640
tggcctggac cccacgagag gccaccccag ccctgtctac caggctgcct tttgggtgga 2700
ttctcctcca actgtggggt gactgcttgg 2730
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 17
ggggccacta gggacaggat 20
<210> 18
<211> 800
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 18
atgctgctgc tggtgacctc tctgctgctg tgcgagctgc cacacccagc cttcctgctg 60
atcccagaca tccagatgac acagagcccc agctccctga gcgcctccgt gggcgacaga 120
gtgaccatca catgtagggc ctctgagagc gtggataact atggcatcag cttcatgaat 180
tggtttcagc agaagcctgg cggcgcccca aagctgctga tctacgcagc cagcatgcag 240
ggctccggcg tgccctctcg gttctccggc tctggcagcg gcaccgactt caccctgaca 300
atctctagcc tgcagccaga cgatttcgcc acatactatt gccagcagag caaggaggtg 360
ccctggacct ttggccaggg cacaaaggtg gagatcaagg gctccacctc tggcagcggc 420
aagcctggca gcggagaggg ctccacaaag ggacaggtgc agctggtgca gtccggagcc 480
gaggtgaaga agccaggctc ctctgtgaag gtgtcttgta aggccagcgg ctataccttc 540
acagactaca acatgcactg ggtgcgccag gcaccaggac agggcctgga gtggatcggc 600
tacatctatc cttacaacgg cggcaccggc tataatcaga agtttaagtc caaggccacc 660
atcacagccg atgagtctac caatacagcc tacatggagc tgagcagcct gcggtccgag 720
gacacagccg tgtactattg cgcccggggc agacccgcta tggactattg gggccagggc 780
accctggtga cagtgtctag 800
<210> 19
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 19
gagagcaagt acggaccacc ttgcccacca tgtcctgcac cagagttcct gggaggacct 60
tccgtgttcc tgtttcctcc aaagccaaag gacaccctga tgatcagccg gaccccagag 120
gtgacatgcg tggtggtgga cgtgagccag gaggaccccg aggtgcagtt caactggtac 180
gtggatggcg tggaggtgca caatgccaag accaagccaa gagaggagca gtttaactcc 240
acctataggg tggtgtctgt gctgacagtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300
tacaagtgca aggtgtccaa taagggcctg ccttcctcta tcgagaagac catctctaag 360
gcaaagggac agccaaggga gccacaggtg tatacactgc cccctagcca ggaggagatg 420
accaagaacc aggtgtccct gacatgtctg gtgaagggct tttacccttc tgacatcgcc 480
gtggagtggg agagcaatgg ccagccagag aacaattata agaccacacc acccgtgctg 540
gactctgatg gcagcttctt tctgtacagc cgcctgaccg tggataagtc ccggtggcag 600
gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgatg cacgaggccc tgcacaatca ctacacacag 660
aagagcctgt ccctgtctct gggcaag 687
<210> 20
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 20
atgttttggg tgctggtggt ggtgggaggc gtgctggcct gttattccct gctggtgacc 60
gtggccttca tcatcttttg ggtgcgctcc aagcggagcc ggggcggaca ctctgactac 120
atgaacatga ccccacggag acccggacct acaaggaagc actatcagcc ctacgcccct 180
ccacgggact tcgcagcata tcgcagc 207
<210> 21
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 21
cgggtgaagt ttagcagatc cgccgatgca ccagcatatc agcagggaca gaatcagctg 60
tacaacgagc tgaatctggg caggcgcgag gagtacgacg tgctggataa gaggcggggc 120
cgggaccccg agatgggagg caagcccagg cgcaagaacc ctcaggaggg cctgtataat 180
gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggagagcgg 240
agaaggggca agggacacga tggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac aaaggacacc 300
tacgatgcac tgcacatgca ggccctgcca cctcggtga 339
<210> 22
<211> 6864
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 22
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccggc gcgccgctgc accacgtgat gtcctctgag 180
cggatcctcc ccgtgtctgg gtcctctccg ggcatctctc ctccctcacc caaccccatg 240
ccgtcttcac tcgctgggtt cccttttcct tctccttctg gggcctgtgc catctctcgt 300
ttcttaggat ggccttctcc gacggatgtc tcccttgcgt cccgcctccc cttcttgtag 360
gcctgcatca tcaccgtttt tctggacaac cccaaagtac cccgtctccc tggctttagc 420
cacctctcca tcctcttgct ttctttgcct ggacaccccg ttctcctgtg gattcgggtc 480
acctctcact cctttcattt gggcagctcc cctacccccc ttacctctct agtctgtgct 540
agctcttcca gccccctgtc atggcatctt ccaggggtcc gagagctcag ctagtcttct 600
tcctccaacc cgggccccta tgtccacttc aggacagcat gtttgctgcc tccagggatc 660
ctgtgtcccc gagctgggac caccttatat tcccagggcc ggttaatgtg gctctggttc 720
tgggtacttt tatctgtccc ctccacccca cagtggggcc actagggaca gcgatcgggt 780
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gagccagcct atacactgta ctctctgatc cagcctagcc ggaagtctgg cagccgcaag 240
cggaaccact ccccatcttt caattctacc atctatgaag tgatcggcaa gagccagcct 300
aaggcccaga acccagccag actgtccagg aaggagctgg agaattttga cgtgtactct 360
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 27
ggaggcagcg gaggaggctc tggc 24
<210> 28
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 28
cgcgtgaagt tcagccggtc cgccgatgcc ccagcctata agcagggcca gaaccagctg 60
tacaacgagc tgaatctggg ccggagagag gagtacgacg tgctggataa gaggcggggc 120
cgggaccccg agatgggagg caagccccgg agaaagaacc ctcaggaggg cctgtataat 180
gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tactccgaga tcggcatgaa gggagagagg 240
cgccggggca agggacacga tggcctgtat cagggcctga gcaccgccac aaaggacacc 300
tacgatgccc tgcacatgca ggccctgcct ccacggtgat ga 342
<210> 29
<211> 801
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 29
atgctgctgc tggtgacctc cctgctgctg tgcgagctgc cacaccctgc ctttctgctg 60
atcccagaca tccagatgac acagagcccc agctccctgt ctgccagcgt gggcgacaga 120
gtgaccatca catgtagggc ctccgagtct gtggataact atggcatcag ctttatgaat 180
tggttccagc agaagccagg aggcgcccct aagctgctga tctacgcagc ctccatgcag 240
ggctctggcg tgcccagccg ctttagcggc tccggctctg gcaccgattt caccctgaca 300
atctctagcc tgcagccaga cgattttgcc acatactatt gccagcagtc caaggaggtg 360
ccctggacct tcggccaggg cacaaaggtg gagatcaagg gcagcacctc cggctctggc 420
aagcctggct ccggagaggg ctctacaaag ggacaggtgc agctggtgca gagcggagcc 480
gaggtgaaga agccaggctc ctctgtgaag gtgagctgta aggcctccgg ctataccttt 540
acagactaca acatgcactg ggtgagacag gcaccaggac agggcctgga gtggatcggc 600
tacatctatc cttacaacgg cggcaccggc tataatcaga agttcaagag caaggccacc 660
atcacagccg atgagtccac caatacagcc tacatggagc tgagcagcct gaggagcgag 720
gacacagccg tgtactattg cgccagaggc aggcctgcta tggactattg gggccagggc 780
accctggtga cagtgtctag c 801
<210> 30
<211> 540
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 30
atcgatcacg agactagcct cgagaagctt gatatcgaat tccacggggt tggacgcgtc 60
ttaattaagg atccaaggtc aggaacagag aaacaggaga atatgggcca aacaggatat 120
ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agttggaaca gcagaatatg 180
ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg ctcagggcca agaacagatg 240
gtccccagat gcggtcccgc cctcagcagt ttctagagaa ccatcagatg tttccagggt 300
gccccaagga cctgaaatga ccctgtgcct tatttgaact aaccaatcag ttcgcttctc 360
gcttctgttc gcgcgcttct gctccccgag ctctatataa gcagagctcg tttagtgaac 420
cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgactc 480
tagaggatcg atcccccggg ctgcaggaat tcaagcgaga agacaagggc agaaagcacc 540
<210> 31
<211> 604
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 31
gctgcaccac gtgatgtcct ctgagcggat cctccccgtg tctgggtcct ctccgggcat 60
ctctcctccc tcacccaacc ccatgccgtc ttcactcgct gggttccctt ttccttctcc 120
ttctggggcc tgtgccatct ctcgtttctt aggatggcct tctccgacgg atgtctccct 180
tgcgtcccgc ctccccttct tgtaggcctg catcatcacc gtttttctgg acaaccccaa 240
agtaccccgt ctccctggct ttagccacct ctccatcctc ttgctttctt tgcctggaca 300
ccccgttctc ctgtggattc gggtcacctc tcactccttt catttgggca gctcccctac 360
cccccttacc tctctagtct gtgctagctc ttccagcccc ctgtcatggc atcttccagg 420
ggtccgagag ctcagctagt cttcttcctc caacccgggc ccctatgtcc acttcaggac 480
agcatgtttg ctgcctccag ggatcctgtg tccccgagct gggaccacct tatattccca 540
gggccggtta atgtggctct ggttctgggt acttttatct gtcccctcca ccccacagtg 600
gggc 604
<210> 32
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 32
gattggtgac agaaaagccc catccttagg cctcctcctt cctagtctcc tgatattggg 60
tctaaccccc acctcctgtt aggcagattc cttatctggt gacacacccc catttcctgg 120
agccatctct ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc 180
ctgggaggga gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt 240
tctcagtggc caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggctgtc 300
tggtgcgttt cactgatcct ggtgctgcag cttccttaca cttcccaaga ggagaagcag 360
tttggaaaaa caaaatcaga ataagttggt cctgagttct aactttggct cttcaccttt 420
ctagtcccca atttatattg ttcctccgtg cgtcagtttt acctgtgaga taaggccagt 480
agccagcccc gtcctggcag ggctgtggtg aggagggggg tgtccgtgtg gaaaactccc 540
tttgtgagaa tggtgcgtcc taggtgttca ccaggtcgtg gccgcctcta ctccctttct 600
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 33
ggggccacta gggacaggat 20
<210> 34
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 34
ttctcctgtg gattcgggtc ac 22
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 35
ctctctggct ccatcgtaag ca 22
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 36
tcctgggcaa acagcataa 19
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 37
gagctgcaga aggacaagat 20
<210> 38
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 38
ctctgtgtca tctggatgtc tg 22
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 39
ctttgagctc tactggcttc tg 22
<210> 40
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 40
tcctgggcaa acagcataa 19
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 41
ctttgagctc tactggcttc tg 22
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 42
gcgagtgaag acggcatg 18
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 43
gtctgtgcta gctcttccag 20
<210> 44
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 44
gcgatgtcag aagggtaaa 19
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 45
ggcggacact ctgactacat 20
<210> 46
<211> 235
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 46
ggcatggggt tgggtgaggg aggagagatg cccggagagg acccagacac ggggaggatc 60
cgctcagagg acatcacgtg gtgcagcggc gcgccggccg cagaaaggga gtagaggcgg 120
ccacgacctg gtgaacacct aggacgcacc attctcacaa agggagtttt ccacacggac 180
acccccctcc tcaccacagc cctgccagga cggggctggc tactggcctt atctc 235
<210> 47
<211> 243
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 47
gcgagtgaag acggcatggg gttgggtgag ggaggagaga tgcccggaga ggacccagac 60
acggggagga tccgctcaga ggacatcacg tggtgcagcg gcgcgccggc cgcaggaagg 120
gagtagaggc ggccacgacc tggtgaacac ctaggacgca ccattctcac aaagggagtt 180
ttccacacgg acacccccct cctcaccaca gccctgccag gacggggctg gctactggcc 240
tta 243
<210> 48
<211> 229
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 48
gcgagtgaag acggcatggg gttgggtgag ggaggagaga tgcccggaga ggacccagac 60
acggggagga tccgctcaga ggacatcacg tggtgcagcg gcgcgcagag agggagtggc 120
caactccatc actaggggtt cctgcggccg cagaaaggga gtagaggcgg ccacgacctg 180
gtgaacacct aggacgcacc attctcacaa agggagtttt ccacacgga 229
<210> 49
<211> 234
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 49
gcgagtgaag acggcatggg gttgggtgag ggaggagaga tgcccggaga ggacccagac 60
acggggagga tccgctcaga ggacatcacg tggtgcagcg gccgcagaaa gggagtagag 120
gcggccacga cctggtgaac acctaggacg caccattctc acaaagggag ttttccacac 180
ggacaccccc ctcctcacca cagccctgcc aggacggggc tggctactgg cctt 234
<210> 50
<211> 972
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 50
ccaatcctgt ccctagtggc ccccactagg gacagcgatc gggtacatcg atcgcaggcg 60
caatcttcgc atttcttttt tccaggtgag caagggcgag gaggataaca tggccatcat 120
caaggagttc atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc gtgaacggcc acgagttcga 180
gatcgagggc gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc cagaccgcca agctgaaggt 240
gaccaagggt ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tcccctcagt tcatgtacgg 300
ctccaaggcc tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacttgaagc tgtccttccc 360
cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg tgaccgtgac 420
ccaggactcc tccctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctgc gcggcaccaa 480
cttcccctcc gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg cctcctccga 540
gcggatgtac cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc tgaagctgaa 600
ggacggcggc cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac aaggccaaga agcccgtgca 660
gctgcccggc gcctacaacg tcaacatcaa gttggacatc acctcccaca acgaggacta 720
caccatcgtg gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac tccaccggcg gcatggacga 780
gctgtacaag taacgcggcc gccctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt 840
tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa 900
taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattcc caatcctgtc 960
cctagtggcc cc 972
<210> 51
<211> 949
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 51
ccaatcctgt ccctagtggc ccccactagg gacagcgatc gggtacatcg atcgcaggcg 60
caatcttcgc atttcttttt tccaggtgag caagggcgag gaggataaca tggccatcat 120
caaggagttc atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc gtgaacggcc acgagttcga 180
gatcgagggc gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc cagaccgcca agctgaaggt 240
gaccaagggt ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tcccctcagt tcatgtacgg 300
ctccaaggcc tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacttgaagc tgtccttccc 360
cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg tgaccgtgac 420
ccaggactcc tccctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctgc gcggcaccaa 480
cttcccctcc gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg cctcctccga 540
gcggatgtac cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc tgaagctgaa 600
ggacggcggc cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac aaggccaaga agcccgtgca 660
gctgcccggc gcctacaacg tcaacatcaa gttggacatc acctcccaca acgaggacta 720
caccatcgtg gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac tccaccggcg gcatggacga 780
gctgtacaag taacgcggcc gccctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt 840
tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa 900
taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattc 949
<210> 52
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 52
cccctccacc ccacagtggg gccactaggg acaggattgg tgacagaaaa gccccatcct 60
taggc 65
<210> 53
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 53
cccctccacc ccacagtggg gccactaggg acag 34
<210> 54
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 54
attggtgaca gaaaagcccc atccttaggc 30
<210> 55
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 55
cccctccacc ccacagtggg gccactaggg a 31
<210> 56
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 56
cccctccacc ccac 14
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 57
cccctccacc ccacagtggg gccac 25
<210> 58
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列
<400> 58
gattggtgac agaaaagccc catccttagg c 31

Claims (117)

1.一种与成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关9(Cas9)整合系统一起使用的质粒，其中所述质粒按顺序包含左同源臂、编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的多核苷酸序列和右同源臂；其中所述左同源臂和右同源臂各自的长度为1000bp或更短。
2.根据权利要求1所述的质粒，其中所述CAR多肽包含跨膜结构域、共刺激结构域、CD3□信号传导结构域和特异性地结合靶细胞上的受体的单链可变片段(scFV)。
3.根据权利要求2所述的质粒，其中所述受体包括CD33。
4.根据权利要求3所述的质粒，其中与CD33特异性地结合的scFV包含与SEQ ID NO:29至少90％同一性的序列或其片段。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的质粒，其中所述CAR多肽的所述跨膜结构域包括CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3□跨膜结构域或NKG2D跨膜结构域。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的质粒，其中所述CAR多肽的所述共刺激结构域包括2B4结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域或它们的任何组合。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的质粒，所述质粒还包括所述转基因和所述右同源臂之间的多腺苷酸化信号。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的质粒，其中所述左同源臂和右同源臂具有相同长度。
9.根据权利要求8所述的质粒，其中所述同源臂各自为30bp长。
10.根据权利要求8所述的质粒，其中所述同源臂各自为300bp长。
11.根据权利要求8所述的质粒，其中所述同源臂各自为600bp长。
12.根据权利要求8所述的质粒，其中所述同源臂各自为1000bp长。
13.根据权利要求1至7中任一项所述的质粒，其中所述左同源臂和右同源臂具有不同长度。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的质粒，其中所述同源臂与人19号染色体的所述腺相关病毒整合位点1(AAVS1)特异性地杂交。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的质粒，所述质粒还包含鼠白血病病毒源性(MND)启动子。
16.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述腺相关病毒载体包含根据权利要求1至15中任一项所述的质粒。
17.根据权利要求16所述的AAV载体，其中所述AAV的血清型包含AAV6。
18.根据权利要求16或17所述的AAV载体，其中所述载体还包含编码crRNA、示踪剂RNA(trcrRNA)和CAS内切核酸酶的质粒。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的AAV载体，其中所述载体是单链AAV(ssAAV)。
20.根据权利要求16至18中任一项所述的AAV载体，其中所述载体是自互补AAV(scAAV)。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的AAV载体，其中所述载体包含与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23至少90％同一性的序列、其片段。
22.一种经修饰的细胞，所述经修饰的细胞包含根据权利要求1至15中任一项所述的质粒或根据权利要求16至21中任一项所述的AAV载体。
23.根据权利要求22所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞是自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞。
24.根据权利要求23所述的经修饰的细胞，其中所述NK细胞或NK T细胞已在表达膜结合的IL-21、膜结合的4-1BBL和/或膜结合的IL-15的经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体的存在下扩增。
25.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用根据权利要求22至24中任一项所述的经修饰的细胞。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述癌症包括白血病。
27.一种遗传修饰细胞的方法，所述方法包括：
a)获得包含2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)与对应CRISPR/Cas向导RNA复合的核糖核蛋白(RNP)复合物和包含质粒的AAV载体，所述质粒包含编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的多核苷酸序列；其中所述多核苷酸序列侧接同源臂；并且其中所述同源臂的长度为800bp或更短；以及
b)将编码所述CAR多肽的所述多核苷酸序列和所述RNP复合物引入到所述细胞中；其中编码所述CAR多肽的所述多核苷酸序列经由所述AAV感染到所述细胞中而被引入到所述细胞中；其中所述RNP复合物与所述细胞的所述基因组DNA内的靶序列杂交，并且所述细胞的DNA修复酶在所述细胞的所述基因组DNA内的所述靶序列处将编码所述CAR多肽的所述多核苷酸序列插入到所述宿主基因组中，从而产生经修饰的细胞。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述细胞为原代细胞或扩增细胞。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述原代细胞在感染之前在IL-2的存在下温育约4天至10天。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述原代细胞在感染之前在经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体的存在下扩增约4天至10天。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体表达膜结合的4-1BBL、膜结合的IL-21或膜结合的IL-15或它们的任何组合。
32.根据权利要求27至31中任一项所述的方法，所述方法还包括在感染之后用经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体扩增所述经修饰的细胞，其中所述经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体表达膜结合的4-1BBL、膜结合的IL-21或膜结合的IL-15或它们的任何组合。
33.根据权利要求27至32中任一项所述的方法，所述方法还包括在感染之后用IL-2扩增所述经修饰的细胞。
34.根据权利要求27至33中任一项所述的方法，其中所述细胞用约5至500,000感染复数(MOI)的所述AAV以感染。
35.根据权利要求27至34中任一项所述的方法，其中所述RNP复合物经由电穿孔而被引入到所述细胞中。
36.根据权利要求27至35中任一项所述的方法，其中所述RNP复合物经由转染而被引入到所述细胞中；并且其中所述RNP复合物编码在相同或不同的AAV上。
37.根据权利要求27至36中任一项所述的方法，其中所述细胞是自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞。
38.根据权利要求27至37中任一项所述的方法，其中所述CAR多肽包含跨膜结构域、共刺激结构域、CD3ζ信号传导结构域和特异性地结合靶细胞上的受体的单链可变片段(scFV)。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述受体包括CD33。
40.根据权利要求39所述的方法，其中与CD33特异性地结合的scFV包含与SEQ ID NO:29至少90％同一性的序列或其片段。
41.根据权利要求27至40中任一项所述的方法，其中所述CAR多肽的所述跨膜结构域包括CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3ζ跨膜结构域或NKG2D跨膜结构域。
42.根据权利要求27至41中任一项所述的方法，其中所述CAR多肽的所述共刺激结构域包括2B4结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域或它们的任何组合。
43.根据权利要求27至42中任一项所述的方法，其中所述左同源臂和右同源臂具有相同长度。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述同源臂各自为600bp长。
45.根据权利要求27至42中任一项所述的方法，其中所述左同源臂和右同源臂具有不同长度。
46.根据权利要求27至45中任一项所述的方法，其中所述同源臂与人19号染色体的所述腺相关病毒整合位点1(AAVS1)特异性地杂交。
47.根据权利要求27至46中任一项所述的方法，其中所述质粒还包含鼠白血病病毒源性(MND)启动子。
48.根据权利要求27至47中任一项所述的方法，其中所述AAV的所述血清型包含AAV6。
49.根据权利要求27至48中任一项所述的方法，其中所述载体是单链AAV(ssAAV)或自互补AAV(scAAV)。
50.根据权利要求27至49中任一项所述的方法，其中所述载体包含与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23至少90％同一性的序列或其片段。
51.一种产生嵌合抗原受体(CAR)自然杀伤(NK)细胞或CAR NK T细胞的方法，所述方法包括
a)获得包含2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)与对应CRISPR/Cas向导RNA复合的核糖核蛋白(RNP)复合物和包含质粒的AAV载体，所述质粒包含编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的多核苷酸序列；其中所述多核苷酸序列侧接同源臂；并且其中所述同源臂的长度为1000bp或更短；以及
b)将编码所述CAR多肽的所述多核苷酸序列和所述RNP复合物引入到NK细胞或NK T细胞中；其中编码所述CAR多肽的所述多核苷酸序列经由所述AAV感染到所述NK细胞或NK T细胞中而被引入到所述NK细胞或NK T细胞中；其中所述RNP复合物与所述NK细胞或NK T细胞的所述基因组DNA内的靶序列杂交，并且所述NK细胞或NK T细胞的所述DNA修复酶在所述细胞的所述基因组DNA内的所述靶序列处将编码所述CAR多肽的所述多核苷酸序列插入到所述宿主基因组中，从而产生CAR NK细胞或CAR NK T细胞。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述NK细胞或NK T细胞是原代或扩增的NK细胞或NK T细胞。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述原代NK细胞或NK T细胞在感染之前在IL-2的存在下温育约4天至10天。
54.根据权利要求52或53所述的方法，其中所述原代NK细胞或NK T细胞在感染之前在经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体的存在下扩增约4天至10天。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体表达膜结合的4-1BBL、膜结合的IL-21或膜结合的IL-15或它们的任何组合。
56.根据权利要求51至55中任一项所述的方法，所述方法还包括在感染之后用经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体扩增所述CAR NK细胞，其中所述经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体表达膜结合的4-1BBL、膜结合的IL-21或膜结合的IL-15或它们的任何组合。
57.根据权利要求51至56中任一项所述的方法，所述方法还包括在感染之后用IL-2扩增所述CAR NK细胞或CAR NK T细胞。
58.根据权利要求51至57中任一项所述的方法，其中所述NK细胞或NK T细胞用约5至500K MOI的所述AAV感染。
59.根据权利要求51至58中任一项所述的方法，其中所述RNP复合物经由电穿孔而被引入到所述NK细胞或NK T细胞中。
60.根据权利要求51至59中任一项所述的方法，其中所述RNP复合物经由转染而被引入到所述NK细胞或NK T细胞中；并且其中所述RNP复合物编码在相同或不同的AAV上。
61.根据权利要求51至60中任一项所述的方法，其中所述CAR多肽包含跨膜结构域、共刺激结构域、CD3ζ信号传导结构域和特异性地结合靶细胞上的受体的单链可变片段(scFV)。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述受体包括CD33。
63.根据权利要求62所述的方法，其中与CD33特异性地结合的scFV包含与SEQ ID NO:29至少90％同一性的序列或其片段。
64.根据权利要求51至63中任一项所述的方法，其中所述CAR多肽的所述跨膜结构域包括CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3□跨膜结构域或NKG2D跨膜结构域。
65.根据权利要求51至64中任一项所述的方法，其中所述CAR多肽的所述共刺激结构域包括2B4结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域或它们的任何组合。
66.根据权利要求51至65中任一项所述的方法，其中所述左同源臂和右同源臂具有相同长度。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述同源臂各自为600bp长。
68.根据权利要求51至65中任一项所述的方法，其中所述左同源臂和右同源臂具有不同长度。
69.根据权利要求51至68中任一项所述的方法，其中所述同源臂与人19号染色体的所述腺相关病毒整合位点1(AAVS1)特异性地杂交。
70.根据权利要求51至69中任一项所述的方法，其中所述质粒还包含鼠白血病病毒源性(MND)启动子。
71.根据权利要求51至70中任一项所述的方法，其中所述AAV的所述血清型包含AAV6。
72.根据权利要求51至71中任一项所述的方法，其中所述载体是单链AAV(ssAAV)或自互补AAV(scAAV)。
73.根据权利要求51至72中任一项所述的方法，其中所述载体包含与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23至少90％同一性的序列或其片段。
74.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的通过使用根据权利要求51至73中任一项所述的方法产生的所述CAR NK细胞或所述CAR NK T细胞。
75.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞，其中所述NK细胞或NK T细胞包含与成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关9(Cas9)整合系统一起使用的质粒，其中所述质粒按顺序包含左同源臂、编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的多核苷酸序列和右同源臂；其中所述左同源臂和右同源臂各自的长度为1000bp或更短。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述CAR多肽包含跨膜结构域、共刺激结构域、CD3ζ信号传导结构域和特异性地结合靶细胞上的受体的单链可变片段(scFV)。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述受体包括CD33。
78.根据权利要求77所述的方法，其中与CD33特异性地结合的scFV包含与SEQ ID NO:29至少90％同一性的序列或其片段。
79.根据权利要求75至78中任一项所述的方法，其中所述CAR多肽的所述跨膜结构域包括CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3ζ跨膜结构域或NKG2D跨膜结构域。
80.根据权利要求75至79中任一项所述的方法，其中所述CAR多肽的所述共刺激结构域包括2B4结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共刺激结构域或它们的任何组合。
81.根据权利要求75至80中任一项所述的方法，所述方法还包括所述转基因和所述右同源臂之间的多腺苷酸化信号。
82.根据权利要求75至81中任一项所述的方法，其中所述左同源臂和右同源臂具有相同长度。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述同源臂各自为30bp长。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述同源臂各自为300bp长。
85.根据权利要求82所述的方法，其中所述同源臂各自为600bp长。
86.根据权利要求82所述的方法，其中所述同源臂各自为1000bp长。
87.根据权利要求75至80中任一项所述的方法，其中所述左同源臂和右同源臂具有不同长度。
88.根据权利要求75至87中任一项所述的方法，其中所述同源臂与人19号染色体的所述腺相关病毒整合位点1(AAVS1)特异性地杂交。
89.根据权利要求75至88中任一项所述的方法，所述方法还包括鼠白血病病毒源性(MND)启动子。
90.根据权利要求75至89中任一项所述的方法，其中所述质粒通过腺相关病毒(AAV)载体而被转导到所述NK中。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述AAV的血清型包含AAV6。
92.根据权利要求90或91所述的方法，其中所述载体还包含编码crRNA、示踪剂RNA(trcrRNA)和CAS内切核酸酶的质粒。
93.根据权利要求90至92中任一项所述的方法，其中所述载体是单链AAV(ssAAV)。
94.根据权利要求90至93中任一项所述的方法，其中所述载体是自互补AAV(scAAV)。
95.根据权利要求90至94中任一项所述的方法，其中所述载体包含与SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23至少90％同一性的序列或其片段。
96.根据权利要求75至95中任一项所述的方法，其中所述癌症包括急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)或骨髓增生异常综合征(MDS)。
97.一种与成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关9(Cas9)整合系统一起使用的质粒，其中所述质粒包含编码嵌合抗原受体(CAR)多肽的多核苷酸序列；其中所述多核苷酸序列与一个前间隔序列邻近基序(PAM)和一条编码crispr RNA(crRNA)的多核苷酸序列相邻，或者侧接两个PAM和两条编码crRNA的多核苷酸序列。
98.根据权利要求97所述的质粒，所述质粒按顺序包含一条PAM序列和一条编码crRNA的多核苷酸序列、编码所述CAR多肽的多核苷酸序列、以及一条PAM序列和一条编码crRNA的多核苷酸序列。
99.根据权利要求97或98所述的质粒，其中所述CAR多肽包含跨膜结构域、共刺激结构域、CD3ζ信号传导结构域和特异性地结合靶细胞上的受体的单链可变片段(scFV)。
100.根据权利要求99所述的质粒，其中所述受体包括CD33。
101.根据权利要求100所述的方法，其中与CD33特异性地结合的scFV包含与SEQ IDNO:29至少90％同一性的序列或其片段。
102.根据权利要求97至101中任一项所述的质粒，其中所述CAR多肽的所述跨膜结构域包括CD4跨膜结构域、CD8跨膜结构域、CD28跨膜结构域、CD3ζ跨膜结构域或NKG2D跨膜结构域。
103.根据权利要求97至102中任一项所述的质粒，其中所述CAR多肽的所述共刺激结构域包括2B4结构域、CD28共刺激结构域、4-1BB共
104.根据权利要求97至103中任一项所述的质粒，所述质粒还包含鼠白血病病毒源性(MND)启动子。
105.一种腺相关病毒(AAV)载体，所述腺相关病毒载体包含根据权利要求97至104中任一项所述的质粒。
106.根据权利要求105所述的AAV载体，其中所述AAV的血清型包含AAV6。
107.根据权利要求105或106所述的AAV载体，其中所述载体还包含编码crRNA、示踪剂RNA(trcrRNA)和CAS内切核酸酶的质粒。
108.根据权利要求105至107中任一项所述的AAV载体，其中所述载体是单链AAV(ssAAV)或自互补AAV(scAAV)。
109.一种经修饰的细胞，所述经修饰的细胞包含根据权利要求97至104中任一项所述的质粒或根据权利要求105至108中任一项所述的AAV载体。
110.根据权利要求109所述的经修饰的细胞，其中所述经修饰的细胞是自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞。
111.根据权利要求110所述的经修饰的细胞，其中所述NK细胞或NK T细胞已在表达膜结合的IL-21、膜结合的4-1BBL和/或膜结合的IL-15的经辐照的饲养细胞、质膜颗粒或外来体的存在下扩增。
112.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向患有癌症的受试者施用根据权利要求109至111中任一项所述的经修饰的细胞。
113.根据权利要求112所述的方法，其中所述癌症包括白血病。
114.一种产生嵌合抗原受体(CAR)自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞的方法，所述方法包括
a)获得包含2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)与对应CRISPR/Cas向导RNA复合的核糖核蛋白(RNP)复合物和包含质粒的AAV载体，所述质粒包含编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸序列；其中所述多核苷酸序列与一个前间隔序列邻近基序(PAM)和一条编码crisprRNA(crRNA)的多核苷酸序列相邻，或者侧接两个PAM和两条编码crRNA的多核苷酸序列；以及
b)将编码所述CAR多肽的所述多核苷酸序列和所述RNP复合物引入到所述NK细胞或NKT细胞中；其中所述质粒经由所述腺相关病毒(AAV)感染到靶细胞中而被引入到所述细胞中；其中所述核糖核蛋白(RNP)复合物与所述细胞的所述基因组DNA内的靶序列杂交，并且所述细胞的DNA修复酶在所述靶序列处将编码所述CAR的所述多核苷酸序列插入到所述宿主基因组中，从而产生CAR NK细胞或CAR NK T细胞。
115.根据权利要求114所述的方法，其中所述质粒按顺序包含一条PAM序列和一条编码crRNA的多核苷酸序列、编码所述CAR多肽的所述多核苷酸序列、以及一条PAM序列和一条编码crRNA的多核苷酸序列。
116.一种遗传修饰自然杀伤(NK)细胞或NK T细胞的方法，所述方法包括
a)获得包含2类CRISPR/Cas核酸内切酶(Cas9)与对应CRISPR/Cas向导RNA复合的核糖核蛋白(RNP)复合物和包含质粒的AAV载体，所述质粒包含编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸序列；其中所述多核苷酸序列与一条PAM和一条编码crRNA的多核苷酸序列相邻，或者侧接两条PAM和两条编码crRNA的多核苷酸序列；以及
b)将编码所述CAR多肽的所述多核苷酸序列和所述RNP复合物引入到所述NK细胞或NKT细胞中；其中编码所述CAR多肽的所述多核苷酸序列经由所述腺相关病毒(AAV)感染到靶细胞中而被引入到所述细胞中；其中所述核糖核蛋白(RNP)复合物与所述细胞的所述基因组DNA内的靶序列杂交，并且所述细胞的DNA修复酶在所述靶序列处将编码所述嵌合抗原受体(CAR)的所述多核苷酸序列插入到所述宿主基因组中，从而产生经修饰的细胞。
117.根据权利要求116所述的方法，其中所述质粒按顺序包含一条PAM序列和一条编码crRNA的多核苷酸序列、编码所述CAR多肽的所述多核苷酸序列、以及一条PAM序列和一条编码crRNA的多核苷酸序列。
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