TW202233829A - 嵌合抗原受體(car) nk細胞及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明揭示使用CRISPR/CAS9系統之腺相關病毒(AAV)遞送對NK細胞進行基因工程改造的質體及方法。在一些態樣中，本文揭示使用該等工程改造NK細胞治療癌症之方法。

Description

嵌合抗原受體(CAR)　NK細胞及其用途

人類末梢血液自然殺手(NK)細胞具有強烈抗腫瘤活性且已成功地用於若干臨床試驗中。用嵌合抗原受體(CAR)修飾NK細胞可改良其靶向性及增加特異性。然而，NK細胞之基因修飾由於病毒核酸之先天性感測機制之高表現而具有挑戰性。需要用於工程改造NK細胞之新方法及載體。

揭示與NK細胞電穿孔有關之方法及組合物，其用於將CRISPR/CAS9基因編輯系統遞送至細胞(例如NK細胞)。

在一個態樣中，本文揭示供與規律間隔重複短回文序列簇(CRISPR)/CRISPR相關9 (Cas9)整合系統一起使用的質體，其中該質體依序包含左同源臂、編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽(諸如，CAR包含靶向目標細胞上之受體(例如CD33)的scFv、跨膜域(例如NKG2D跨膜域、CD4跨膜域、CD8跨膜域、CD28跨膜域及/或CD3ξ跨膜域)、共刺激域(例如2B4域、CD28共刺激域、4-1 BB共刺激域，或2B4域、CD28共刺激域及/或4-1 BB共刺激域之任何組合)及CD3ξ信號傳導域)之聚核苷酸序列及右同源臂；其中左右同源臂之長度各自為1000 bp或更短(例如30 bp長、300 bp長、600 bp長)。

本文亦揭示供與任何前述態樣之CRISPR/Cas9整合系統一起使用的質體，其中左同源臂及右同源臂為相同長度或不同長度。在一些態樣中，同源臂特異性地與人類染色體19之腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)雜交。

在一些實施例中，本文揭示供與任何前述態樣之CRISPR/Cas9整合系統一起使用的質體，其中該質體進一步包含鼠白血病病毒源性(MND)啟動子。

本文亦揭示包含任何前述態樣之質體的腺相關病毒(AAV)載體(諸如包含AAV6血清型之AAV載體)。在一些態樣中，AAV質體進一步包含編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽之聚核苷酸序列。在一些實施例中，載體進一步包含編碼crRNA、示蹤劑RNA (trcrRNA)及Cas核酸內切酶之質體。AAV載體可為單股AAV (ssAAV)或自互補AAV (scAAV)。

在一個態樣中，本文揭示包含如任何前述態樣之質體或AAV載體的經修飾細胞(諸如NK細胞及NK T細胞)。

本文亦揭示治療、減少、緩解、抑制、改善及/或預防個體之癌症及/或癌轉移(諸如，急性淋巴球性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛細胞白血病(HCL)及/或骨髓發育不良症候群(MDS))的方法，其包含向患有癌症之個體投與任何前述態樣之經修飾細胞。

在一個態樣中，本文揭示產生嵌合抗原受體(CAR)自然殺手(NK)細胞或CAR NK T細胞之方法，其包含a)獲得包含與對應CRISPR/Cas引導RNA複合之2類CRISPR/Cas核酸內切酶(Cas9)之核糖核蛋白(RNP)複合體及包含含有轉殖基因(諸如腫瘤抗原之嵌合抗原受體)之質體的AAV載體；其中該轉殖基因側接同源臂；且其中該等同源臂長度為1000 bp或更短；及b)將轉殖基因及RNP複合體引入至NK細胞或NK T細胞中；其中經由用腺相關病毒(AAV)感染而將轉殖基因(諸如腫瘤抗原之嵌合抗原受體)引入至NK細胞或NK T細胞中；其中RNP複合體與NK細胞或NK T細胞之基因體DNA內的目標序列雜交，且NK細胞或NK T細胞之DNA修復酶將該轉殖基因在目標序列處插入至宿主基因體中(例如藉由同源修復)，由此產生CAR NK細胞或CAR NK T細胞。在一些態樣中，RNP複合體可經由電穿孔引入至細胞中。在一些態樣中，RNP複合體可經由相同或不同AAV之病毒遞送而引入至細胞中(亦即，重複感染)。

在一個態樣中，本文揭示基因修飾細胞(T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞、NK T細胞、纖維母細胞、骨母細胞、肝細胞、神經元細胞、上皮細胞及/或肌肉細胞，包括但不限於初級或擴增細胞)之方法，其包含a)獲得包含與對應CRISPR/Cas引導RNA複合之2類CRISPR/Cas核酸內切酶(Cas9)的核糖核蛋白(RNP)複合體及包含含有嵌合抗原受體(CAR)多肽之質體的AAV載體；其中該聚核苷酸序列側接同源臂；且其中該等同源臂之長度為1000 bp或更短；及b)將該聚核苷酸序列及該RNP複合體引入至該細胞中；其中經由用AAV感染至細胞中而將聚核苷酸序列引入至該細胞中；其中RNP複合體與細胞之基因體DNA內的目標序列雜交，且細胞之DNA修復酶將轉殖基因在該細胞之基因體DNA內的目標序列處插入至宿主基因體中，由此產生經修飾細胞。

在一些實施例中，本文揭示基因修飾任何前述態樣之細胞的方法，其中該細胞(例如NK細胞或NK T細胞)感染有約5至500 K感染倍率(MOI)的本文所揭示之AAV。

本文亦揭示基因修飾任何前述態樣之細胞之方法，其中在感染及/或電穿孔之前，將初級細胞在IL-2及/或經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外細胞存在下培育約4至10天。在一些實施例中，本文揭示基因修飾任何前述態樣之細胞之方法，其進一步包含在感染之前在經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體存在下擴增初級細胞約4至10天，其中經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體表現膜結合4-1BBL、膜結合IL-21或膜結合IL-15或其任何組合。本文亦揭示基因修飾任何前述態樣之細胞之方法，其進一步包含在感染之後用經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體擴增經修飾細胞，其中經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體表現膜結合4-1BBL、膜結合IL-21或膜結合IL-15或其任何組合。

在一些態樣中，本文揭示一種治療、減少、緩解、抑制、改善及/或預防個體之癌症及/或癌轉移(諸如，急性淋巴球性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛細胞白血病(HCL)及/或骨髓發育不良症候群(MDS))的方法，其包含向個體投與治療有效量之自然殺手(NK)細胞，其中NK細胞包含供與規律間隔重複短回文序列簇(CRISPR)/CRISPR相關9 (Cas9)整合系統起使用的質體，其中該質體依序包含左同源臂、編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽(諸如，靶向CD33之CAR)之聚核苷酸序列及右同源臂；其中左右同源臂之長度各自為1000bp或更短(例如600 bp)。

在一些態樣中，本文揭示一種供與規律間隔重複短回文序列簇(CRISPR)/CRISPR相關9 (Cas9)整合系統一起使用的質體，其中該質體包含編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽之聚核苷酸序列；其中該聚核苷酸序列鄰近於一個原間隔序列相鄰模體(PAM)及一個編碼crispr RNA (crRNA)之序列或側接兩個PAM及編碼crRNA之序列。在一些態樣中，所揭示之質體可用於治療、減少、緩解、抑制、改善及/或預防任何前述態樣之癌症及/或轉移之任何方法中；用於產生任一前述態樣之CAR NK細胞及/或CAR NK T細胞之方法中；及/或用於基因修飾任何前述態樣之細胞中。

相關申請之交叉引用

本申請案主張2020年10月26日申請之美國臨時申請案第63/105,722號之權益，其以全文引用之方式明確併入本文中。

在揭示及描述本發明化合物、組合物、製品、裝置及/或方法之前，應瞭解，除非另外規定，否則其不限於特定合成方法或特定重組生物技術方法，或除非另外規定，否則不限於特定試劑，因此其當然可變化。亦應瞭解，本文所用術語僅為了描述特定實施例，而非為了限制。 A.   定義

除非上下文另外明確規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a)」、「一(an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，舉例而言，提及「醫藥載劑」包括兩種或更多種此類載劑及其類似者之混合物。

範圍可在本文中表示為「約」一個特定值及/或至「約」另一特定值。當表述此類範圍時，另一個實施例包括自一個特定值及/或至另一個特定值。類似地，當藉由使用前綴「約」將值表達為近似值時，應瞭解，特定值形成另一實施例。進一步應瞭解，各範圍的端點相對於其他端點而言均為顯著的且獨立於其他端點。亦應瞭解，本文揭示了多個值，且各值在本文中亦揭示為「約」特定值(除值本身之外)。舉例來說，若揭示值「10」，則亦揭示「約10」。亦應瞭解，若揭示值時，則亦揭示「低於或等於」該值、「大於或等於該值」及值之間的可能範圍，如熟習此項技術者所恰當瞭解。舉例而言，若揭示值「10」，則亦揭示「小於或等於10」以及「大於或等於10」。亦應瞭解，在整個申請案中，資料係以多種不同形式提供，且此資料表示端點及起點，以及資料點之任何組合之範圍。舉例而言，若揭示特定資料點「10」及特定資料點15，則應瞭解視為揭示大於、大於或等於、小於、小於或等於及等於10與15以及在10與15之間。亦應瞭解亦揭示兩個特定單元之間的各單元。舉例而言，若揭示10及15，則亦揭示11、12、13及14。

向個體「投與」包括向個體引入或遞送藥劑之任何途徑。投與可藉由任何適合途徑進行，包括經口、局部、靜脈內、皮下、經皮、透皮、肌肉內、關節內、非經腸、小動脈內、皮內、心室內、顱內、腹膜內、病灶內、鼻內、經直腸、經陰道、藉由吸入、經由植入式貯器、非經腸(例如皮下、靜脈內、肌肉內、關節內、滑膜內、胸骨內、鞘內、腹膜內、肝內、病灶內及顱內注射或輸注技術)及其類似途徑。如本文所用，「同時投與」、「組合投與」、「同步投與(simultaneous administration)」或「同步投與(administered simultaneously)」意謂化合物在相同時間點或基本上緊隨彼此投與。在後一情況下，兩種化合物在足夠接近的時間投與，使得觀測到之結果與在相同時間點投與化合物時所達成之結果不可區分。「全身投與」係指經由將藥劑引入或遞送至大面積之個體身體(例如大於身體之50%)的途徑，例如經由進入循環或淋巴系統中而向個體引入或遞送藥劑。相比之下，「局部投與」係指經由將藥劑引入或遞送至該區域或緊鄰投與點之區域且不以治療顯著量全身性引入藥劑的途徑而向個體引入或遞送藥劑。舉例而言，局部投與之藥劑在投與位置附近可容易地偵測到，但在個體身體之遠端部分中在可忽略量下不可偵測到或可偵測到。投與包括自投與及由另一者投與。

「生物相容性」一般指對接受者大體上無毒且不會對個體產生顯著不利影響的材料及其任何代謝物或降解產物。

「對照」係出於比較目的在實驗中使用之替代性個體或樣品。對照物可為「陽性」或「陰性」。

「互補」或「實質上互補」係指在核苷酸或核酸之間(諸如在雙股DNA分子之兩股之間或在單股核酸上之寡核苷酸引子與引子結合位點之間)雜交或鹼基配對或形成雙螺旋。互補核苷酸一般為A及T/U或C及G。當經最佳比對及比較且具有適當核苷酸插入或缺失的一個股之核苷酸，與另一股之核苷酸至少約80%，通常至少約90%至95%，且更佳約98%至100%配對時，稱兩個單股RNA或DNA分子實質上互補。替代地，實質性互補在RNA或DNA股將在選擇性雜交條件下與其互補序列雜交時存在。通常，選擇性雜交將在至少14至25個核苷酸之一段上存在至少約65%互補、至少約75%或至少約90%互補時出現。參見Kanehisa (1984) Nucl. Acids Res. 12:203。

如本文所使用之術語「包含」及其變化形式與術語「包括」及其變化形式同義地使用，且為開放性、非限制性術語。儘管術語「包含」及「包括」在本文中已用以描述各種實施例，但術語「基本上由……組成」及「由……組成」可替代「包含」及「包括」使用以提供更特定實施例並亦予以揭示。

「組合物」係指具有有益生物效應之任何藥劑。有益生物效應包括兩種療效，例如病症或其他非所需生理病狀之治療，及預防作用，例如預防病症或其他非所需生理病狀。該等術語亦涵蓋本文具體提及之有益藥劑之醫藥學上可接受之藥理學活性衍生物，包括但不限於載體、聚核苷酸、細胞、鹽、酯、醯胺、前藥、活性代謝物、異構體、片段、類似物等。當隨後使用術語「組合物」時，或當特定組合物經具體鑑別時，應瞭解，該術語包括組合物本身以及醫藥學上可接受之藥理學活性載體、聚核苷酸、鹽、酯、醯胺、前藥、結合物、活性代謝物、異構體、片段、類似物等。

「編碼」特定RNA之DNA序列為轉錄成RNA之DNA核酸序列。DNA聚核苷酸可編碼轉譯成蛋白質之RNA (mRNA) (且因此DNA及mRNA皆編碼蛋白質)，或DNA聚核苷酸可編碼未轉譯成蛋白質之RNA (例如tRNA、rRNA、微RNA (miRNA)、「非編碼」RNA (ncRNA)、引導RNA等)。

「表現載體」係指包含重組聚核苷酸之載體，該重組聚核苷酸包含與待表現核苷酸序列可操作地連接之表現控制序列。表現載體包含用於表現之足夠順式作用元件；用於表現之其他元件可由宿主細胞供應或在活體外表現系統中供應。表現載體包括此項技術中已知之所有表現載體，諸如併入重組性聚核苷酸之黏質體、質體(例如裸露或含於脂質體中)及病毒(例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)。

是否連接至其他序列之「片段」可以包括特定區域或特定胺基酸殘基的插入、缺失、取代或其他所選修飾，只要片段之活性與未經修飾之肽或蛋白質相比未顯著改變或削弱。此等修飾可提供一些額外特性，以便移除或添加能夠二硫鍵鍵結之胺基酸，以增加其生物壽命，以改變其分泌特徵等。在任何情況下，片段必須擁有生物活性特性，諸如調控目標基因之轉錄。

術語「基因」或「基因序列」係指編碼序列或控制序列或其片段。基因可包括編碼序列及控制序列或其片段之任何組合。因此，如本文中所提及之「基因」可為原生基因之全部或部分。如本文中所提及之聚核苷酸序列可與術語「基因」互換使用，或可包括任何編碼序列、非編碼序列或控制序列、其片段及其組合。術語「基因」或「基因序列」包括例如編碼序列(例如核糖體結合位點)上游之控制序列。

在兩種或更多種核酸或多肽序列之上下文中，術語「一致」或「一致性」百分比係指兩種或更多種序列或子序列相同或具有規定百分比之相同胺基酸殘基或核苷酸(亦即，在針對比較窗或指定區域上之最大對應性進行比較及比對時，在規定區域上約60%一致性，較佳61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%,94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高一致性)，如使用具有描述如下之預設參數的BLAST或BLAST 2.0序列比較算法所量測，或藉由人工比對及目視檢驗(參見例如NCBI網站或類似者)。此類序列隨後稱為「實質上一致」。此定義亦關於或可施加至測試序列之補充。該定義亦包括具有缺失及/或添加之序列以及具有取代之彼等序列。如下所述，較佳算法可考慮空隙及其類似者。較佳地，一致性存在於長度為至少約10個胺基酸或20個核苷酸之區域上，或更佳長度為10-50個胺基酸或20-50個核苷酸之區域上。如本文所用，核苷酸序列一致性百分比(%)定義為在比對序列且視需要引入空隙以實現最大序列一致性百分比之後，候選序列中與參考序列中之核苷酸一致的胺基酸百分比。出於測定序列一致性百分比之目的而進行之比對可以此項技術內之各種方式，例如使用諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR)軟體之公開可用電腦軟體來達成。包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何算法之用於量測比對之適當參數可藉由已知方法來測定。

對於序列比較，通常一個序列充當參考序列，使測試序列與其比較。當使用序列比較算法時，將測試序列及參考序列輸入至電腦中，必要時指定子序列座標，且指定序列算法程式參數。較佳地，可使用預設程式參數，或可指定替代參數。序列比較算法隨後基於程式參數來計算測試序列相對於參考序列之序列一致性百分比。

適合於測定序列一致性及序列類似性百分比之算法的一個實例為BLAST及BLAST 2.0算法，其分別描述於Altschul等人(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402及Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410中。進行BLAST分析之軟體可經由國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information)公開獲得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。此算法包括藉由鑑別查詢序列中之長度W之短字來首先鑑別高評分序列對(HSP)，該等短字在與資料庫序列中相同長度之字比對時匹配或滿足某些正值閾值分數T。T稱為鄰域字分數閾值(Altschul等人(1990) J. Mol. Biol. 215:403-410)。此等初始鄰域字成功結果充當用於起始搜尋之種子以尋找含有其之較長HSP。字命中者沿各序列以兩個方向延伸，只要累積比對分數可增加即可。對於核苷酸序列，累積分數係使用參數M (一對匹配殘基之獎勵分數；始終＞0)以及N (錯配殘基之懲罰分數；始終＜0)來計算。對於胺基酸序列，使用計分矩陣計算累積分數。當以下情況時，字命中者沿各方向之延伸中斷：累積比對分值自其達成之最大值降低數量X；累積分值由於一或多個負分殘基比對之累加而變成零或以下；或達至任一序列之末端。BLAST算法參數W、T及X確定比對之靈敏度及速度。BLASTN程式(用於核苷酸序列)係使用字長(W) 11、期望值(E)或10、M=5、N=-4及雙股比較作為預設參數。對於胺基酸序列，BLASTP程式使用以下作為預設值：字長為3且期望值(E)為10，且BLOSUM62計分矩陣(參見Henikoff及Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:10915)比對(B)為50，期望值(E)為10，M=5，N=-4，且比較兩個股。

BLAST算法亦對兩個序列之間的相似性進行統計分析(參見例如Karlin及Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:5873-5787)。藉由BLAST算法得到之一種相似性量測結果為最小總和機率(P(N))，其提供兩個核苷酸或胺基酸序列之間隨機出現匹配之機率的指示。舉例而言，若測試核酸與參考核酸之比較中的最小總和機率小於約0.2，更佳小於約0.01，則認為核酸與參考序列類似。

應用於核酸、多肽、細胞或生物體的如本文所用之術語「天然存在的」或「未修飾」或「野生型」係指自然界中發現之核酸、多肽、細胞或生物體。舉例而言，可自自然界中之來源中分離且尚未在實驗室中有意地由人修改之生物體(包括病毒)中所存在之多肽或聚核苷酸序列為野生的(及天然存在的)。

「增加」可指引起更大量之症狀、疾病、組合物、病狀或活性的任何變化。增加可為病狀、症狀、活性、組合物呈統計學上顯著之量之任何單獨、中值或平均增加。因此，增加可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%增加，只要增加為統計顯著的。

「減少」可指引起較小量之症狀、疾病、組合物、病狀或活性的任何變化。當相對於不具有物質之基因產物之輸出，具有該物質之基因產物之基因輸出較少時，該物質亦理解為減少基因之基因輸出。此外舉例而言，減少可為病症之症狀變化，使得症狀小於先前觀測到的症狀。減少可為病狀、症狀、活性、組合物呈統計學上顯著之量之任何單獨、中值或平均減少。因此，減少可為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100%減少，只要減少為統計顯著的。 如本文所用，術語「核酸」意謂由核苷酸(例如去氧核糖核苷酸(DNA)或核糖核苷酸(RNA))構成之聚合物。如本文所用，術語「核糖核酸」及「RNA」意謂由核糖核苷酸構成之聚合物。如本文所用，術語「去氧核糖核酸」及「DNA」意謂由去氧核糖核苷酸構成之聚合物。

術語「可選」或「視情況」意謂隨後所描述之事件或情形可能發生或可能不發生，且該描述包括該事件或情形發生之情況及該事件或情形不發生之情況。

如本文所用，「可操作地連接」可指示適用於表現核酸之編碼序列的調控序列相對於編碼序列置於核酸分子中之適當位置，以便實現編碼序列之表現。此相同定義有時應用於表現載體中編碼序列及/或轉錄控制元件(例如啟動子、強化子及終止元件)及/或可選標記之排列。術語「可操作地連接」亦可指在單一多肽鏈內排列多肽區段，其中個別多肽區段可為(但不限於)蛋白質、其片段、連接肽及/或信號肽。術語可操作地連接在不同區段之間不存在介入胺基酸的情況下以及當個別多肽經由一或多個介入胺基酸彼此連接時，可指單個多肽或其片段內不同個別多肽之直接融合。

「引子」為探針子組，其能夠支持一些類型之酶操作且可與目標核酸雜交以使得可發生酶操作。引子可由此項技術中可獲得之不干擾酶操作的核苷酸或核苷酸衍生物或類似物之任何組合製成。

「探針」能夠通常以序列特異性方式(例如經由雜交)與目標核酸相互作用的分子。核酸之雜交在此項技術中得以很好地理解且論述於本文中。通常，探針可由此項技術中可用之核苷酸或核苷酸衍生物或類似物之任何組合製成。

「蛋白質編碼序列」或編碼特定蛋白質或多肽之序列係當置於適當調控序列的控制下時活體外或活體內經轉錄成mRNA (在DNA之情況下)及經轉譯為多肽(在mRNA之情況下)的核酸序列。編碼序列之邊界係藉由5'端(N端)處之起始密碼子及3'端(C端)處之轉譯終止無意義密碼子確定。編碼序列可包括但不限於來自原核或真核mRNA之cDNA、來自原核或真核DNA之基因體DNA序列及合成核酸。轉錄終止序列通常將位於編碼序列之3'處。

術語「聚核苷酸」係指由核苷酸單體構成之單股或雙股聚合物。

術語「多肽」係指由D-或L-胺基酸之單鏈或由肽鍵連接之D-及L-胺基酸之混合物構成的化合物。

如本文所用，術語「啟動子」定義為起始聚核苷酸序列之特異性轉錄所需的由細胞之合成機制識別或引入合成機制之DNA序列。

如本文所用，術語「啟動子/調控序列」意謂表現可操作地連接於啟動子/調節序列之基因產物所需的核酸序列。在一些情況下，此序列可為核心啟動子序列，且在其他情況下，此序列亦可包括強化子序列及表現基因產物所必需的其他調控元件。啟動子/調控序列可例如為以組織特異性方式表現基因產物之各者。

「醫藥學上可接受之」組分可指非生物學上或其他方面不合需要之組分，亦即該組分可併入至本發明之醫藥調配物中且如本文所描述投與個體，而不會引起顯著不合需要之生物效應或以有害方式與調配物中所含之任何其他組分相互作用。當參考向人類投與使用時，該術語大體上暗示組分符合毒理學及製造測試之所需標準或其包括於由美國食品藥物管理局(U.S. Food and Drug Administration)製備之非活性成分指南上。

「醫藥學上可接受之載劑」(有時稱為「載劑」)意謂適用於製備通常安全且無毒之醫藥或治療性組合物的載劑或賦形劑，且包括可接受用於獸醫學及/或人類醫藥或治療用途之載劑。術語「載劑」或「醫藥學上可接受之載劑」可包括但不限於磷酸鹽緩衝鹽水溶液、水、乳液(諸如油/水或水/油乳液)及/或各種類型之潤濕劑。如本文所用，術語「載劑」涵蓋但不限於任何賦形劑、稀釋劑、填充劑、鹽、緩衝劑、穩定劑、增溶劑、脂質、穩定劑或此項技術中熟知用於醫藥調配物且如本文中進一步描述之其他材料。

如「藥理學活性」衍生物或類似物中之「藥理學活性」(或簡稱「活性」)，可指具有與母體化合物相同的藥理學活性類型且在程度上大致相等的衍生物或類似物(例如鹽、酯、醯胺、結合物、代謝物、異構體、片段等)。

藥劑之「有效量」係指藥劑足以提供所需作用之量。取決於許多因素，諸如個體之年齡及一般狀況、特定一或多種藥劑及其類似因素，藥劑之「有效」量將隨個體而變化。因此，不可能總是規定定量之「有效量」。然而，在任何個體情況下之適當「有效量」可由一般熟習此項技術者使用常規實驗來確定。此外，如本文所用，且除非另外具體說明，否則藥劑之「有效量」亦可指涵蓋治療有效量及預防有效量兩者之量。為達成療效所必需的藥劑之「有效量」可根據諸如個體之年齡、性別及體重之因素而變化。可調整給藥方案以提供最佳治療反應。舉例而言，可每天投與若干分次劑量，或可如治療情況之緊急程度所指示按比例減少劑量。

「治療劑」係指具有有益生物效應之任何組合物。有益生物效應包括兩種療效，例如病症或其他非所需生理病狀之治療，及預防作用，例如預防病症或其他非所需生理病狀(例如癌症)。該等術語亦涵蓋本文具體提及之有益藥劑之醫藥學上可接受之藥理學活性衍生物，包括但不限於鹽、酯、醯胺、前藥、活性代謝物、異構體、片段、類似物等。當隨後使用術語「治療劑」時，或當特定組合物經具體鑑別時，應瞭解，該術語包括藥劑本身以及醫藥學上可接受之藥理學活性鹽、酯、醯胺、前藥、結合物、活性代謝物、異構體、片段、類似物等。

組合物(例如包含藥劑之組合物)之「治療有效量」或「治療有效劑量」係指有效實現所需治療結果的量。在一些實施例中，所需治療結果為控制癌症。在一些實施例中，所需治療結果為控制癌轉移。在一些實施例中，所需治療結果為腫瘤尺寸減小。在一些實施例中，所需治療結果為預防及/或治療復發。給定治療劑之治療有效量通常將根據諸如以下因素而變化：所治療之病症或疾病之類型及嚴重程度及個體之年齡、性別及體重。該術語亦可指可有效促進所需療效，諸如疼痛緩解的治療劑之量或治療劑之遞送率(例如隨時間推移之量)。精確的所需療效將根據待治療之病狀、個體之耐受性、待投與之藥劑及/或藥劑調配物(例如治療劑之效能、調配物中藥劑之濃度及其類似者)及一般熟習此項技術者瞭解之多種其他因素而變化。在一些情況下，在經數天、數週或數年之時段向個體投與多次劑量之組合物後，達成所需生物或醫學反應。

如本文所用，「轉殖基因」係指已提供或可人工提供至細胞之外源性遺傳物質(例如一或多個聚核苷酸)。該術語可用於指編碼本文所揭示之作為本發明之主題的多肽中之任一者的「重組」聚核苷酸。術語「重組」係指序列(例如聚核苷酸或多肽序列)不存在於待人工提供該序列之細胞中，或以排列方式連接至不存在於待人工提供該序列之細胞中的另一聚核苷酸。應理解，「人工」係指在宿主細胞中非天然存在且包括由人、機器、外源因素(例如酶、病毒等)操作、其他非天然操作或其組合。轉殖基因可包含可操作地連接於啟動子(例如，開放閱讀框架)的基因，但不限於此。在將轉殖基因人工提供至細胞後，轉殖基因可整合至宿主細胞染色體中，存在於染色體外，或以其任何組合存在。

在整個本申請案中，提及多個公開案。此等公開案之揭示內容全部特此以引用之方式併入本申請案中，以便更充分地描述本發明所關於的目前先進技術。所揭示之參考文獻亦單獨且具體地以引用之方式併入本文中，其中所含之材料在參考文獻所依據之句子中論述。 B.   質體及基因修飾細胞之方法

由於穩定的外來DNA及RNA感測機制，使用病毒或非病毒載體對NK細胞進行基因修飾具有挑戰性，此可限制向NK細胞執行基因遞送方法之效率。為克服此侷限性，研發新方法以將Cas9/核糖核蛋白複合體(Cas9/RNP)直接電穿孔至人類初級NK細胞中。此方法在NK細胞之基因體中引入雙股斷裂(DSB)，此成功引起基因剔除及增強抗腫瘤活性。在基因沉默中之此初始成功之後，進一步實行基因插入方法之發展。在Cas9引入DSB之後，兩個非依賴性及先天性DNA修復機制可用於修復以下斷裂：同源重組(HR)或非同源末端接合(NHEJ)。在編碼相關基因之DNA模板存在下，可使用此等修復機制中之任一者將外源性基因整合至Cas9靶向位點中。

因此，本文揭示供與規律間隔重複短回文序列簇(CRISPR)/CRISPR相關9 (Cas9)整合系統一起使用的質體，其中該質體依序包含左同源臂、編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽(諸如，CAR包含靶向目標細胞上之受體(例如CD33)的scFv、跨膜域(例如NKG2D跨膜域、CD4跨膜域、CD8跨膜域、CD28跨膜域或CD3ξ跨膜域)、共刺激域(例如2B4域、CD28共刺激域、4-1 BB共刺激域，或2B4域、CD28共刺激域及/或4-1 BB共刺激域之任何組合)及CD3ξ信號傳導域)之聚核苷酸序列及右同源臂；其中左右同源臂之長度各自為1000 bp或更短(例如約30 bp長、約300 bp長或約600 bp長)。

一般而言，「CRISPR系統」或「CRISPR整合系統」共同指轉錄物及參與CRISPR相關「Cas」基因之表現或導引其活性的其他元件。在一些實施例中，CRISPR系統之一或多個元件衍生自I型、II型或III型CRISPR系統。CRISPR系統為此項技術中已知的。參見例如美國專利第8,697,359號，其以全文引用的方式併入本文中。

核酸內切酶/RNP (例如Cas9/RNP)包含三個組分，重組核酸內切酶蛋白質(例如Cas9核酸內切酶)與CRISPR基因座複合。與CRISPR基因座複合之核酸內切酶可稱為CRISPR/Cas引導RNA。CRISPR基因座包含合成單引導RNA (gRNA)，該gRNA由可與目標序列複合互補重複RNA (crRNA)及反式互補重複RNA (tracrRNA)雜交之RNA構成。因此，CRISPR/Cas引導RNA與細胞之基因體DNA內的目標序列雜交。在一些情況下，2類CRISPR/Cas核酸內切酶為II型CRISPR/Cas核酸內切酶。在一些情況下，2類CRISPR/Cas核酸內切酶為Cas9多肽且對應CRISPR/Cas引導RNA為Cas9引導RNA。此等Cas9/RNP由於其作為功能性複合體遞送而能夠以相比於外來DNA依賴性方法更高效率裂解基因體目標。另外，自細胞快速清除Cas9/RNP可減少脫靶效應，諸如誘導細胞凋亡。

為製成RNP複合體，crRNA及tracrRNA可以1:1、2:1或1:2濃度比率在約50 μm及約500 μm之間(例如50 μM、60 μM、70 μM、80 μM、90 μM、100 μM、125 μM、150 μM、175 μM、200 μM、225 μM、250 μM、275 μM、300 μM、325 μM、350 μM、375 μM、400 μM、425 μM、450 μM、475 μM或500 μM)，較佳100 μm及約300 μm之間，最佳約200 μm在95℃下混合約5分鐘，形成crRNA:tracrRNA複合體(亦即，引導RNA)。crRNA:tracrRNA複合體可隨後與在約20 μM與約50 μM (例如21 μM、22 μM、23 μM、24 μM、25 μM、26 μM、27 μM、28 μM、29 μM、30 μM、31 μM、32 μM、33 μM、34 μM、35 μM、36 μM、37 μM、38 μM、39 μM、40 μM、41 μM、42 μM、43 μM、44 μM、45 μM、46 μM、47 μM、48 μM、49 μM或50 μM)之間的最終稀釋之Cas核酸內切酶(諸如Cas9)混合。

一旦結合至目標細胞中之目標序列，CRISPR基因座可藉由將一或多個鹼基對之插入或缺失引入目標DNA，藉由異源DNA片段(例如供體聚核苷酸)之插入，藉由內源DNA片段之缺失，藉由內源DNA片段之反轉或易位，或其組合，來修飾基因體。因此，所揭示之方法可用於在與DNA組合用於同源重組時產生基因剔除或基因嵌入。本文中展示經由Cas9/RNP之腺相關病毒(AAV)轉導係克服細胞(諸如T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞、NK T細胞、纖維母細胞、骨母細胞、肝細胞、神經元細胞、上皮細胞及/或肌肉細胞)中之基因修飾之前述限制的相對高效方法。

最近已展示CRISPR/Cas9系統促進在同源重組(HR)期間使用腺相關病毒(AAV)載體充當供體模板DNA之高水準精確基因體編輯。然而，先前使用AAV受到限制；因為其免疫功能，NK細胞及NK T細胞對病毒及細菌載體具有抗性且藉由該等載體誘導NK細胞/NK T細胞凋亡。因此，在本發明方法之前，NK細胞或NK T細胞之CRISPR/Cas修飾尚未成功。此外，約4.5千鹼基之最大AAV封裝容量限制包括同源臂之供體尺寸。建議100 bp以上之任何轉錄物及任何轉殖基因對於各臂具有至少800bp之同源臂，其中許多系統採用800 bp及1000 bp之不對稱臂總共1800 bp。因此，AAV載體無法遞送大於約2.5 kb之轉殖基因。在一個態樣中，本文揭示AAV CRISPR/CAS9核苷酸遞送系統，其包含供體構築體質體，該供體構築體質體之同源臂在30 bp及1000 bp之間，包括但不限於30 bp、50 bp、100 bp、110 bp、120 bp、130 bp、140 bp、150 bp、160 bp、170 bp、180 bp、190 bp、200 bp、210 bp、220 bp、230 bp、240 bp、250 bp、260 bp、270 bp、280 bp、290 bp、300 bp、310 bp、320 bp、330 bp、340 bp、350 bp、360 bp、370 bp、380 bp、390 bp、400 bp、410 bp、420 bp、430 bp、440 bp、450 bp、460 bp、470 bp、480 bp、490 bp、500 bp、510 bp、520 bp、530 bp、540 bp、550 bp、560 bp、570 bp、580 bp、590 bp、600 bp、610 bp、620 bp、630 bp、640 bp、650 bp、660 bp、670 bp、680 bp、690 bp、700 bp、710 bp、720 bp、730 bp、740 bp、750 bp、760 bp、770 bp、780 bp、790 bp、800 bp、810 bp、820 bp、830 bp、840 bp、850 bp、860 bp、870 bp、880 bp、890 bp、900 bp、910 bp、920 bp、930 bp、940 bp、950 bp、960 bp、970 bp、980 bp、990 b或1000 bp。舉例而言，同源臂可為對稱的30 bp同源臂、對稱的300 bp同源臂、對稱的500 bp同源臂、對稱的600 bp同源臂、對稱的800 bp同源臂、對稱的1000 bp同源臂或不對稱的800 bp同源臂，其包含800 bp左同源臂(LHA)及1000 bp右同源臂(RHA)用於同源重組(HR)，或根本沒有同源臂用於使用同源非依賴性靶向整合(HITI)質體進行非同源末端接合。在一些實例中，具有或不具有同源臂之質體係國際公開案第WO2020/198675號中所揭示之彼等質體，其以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，質體具有臨床上經批准之剪接接受體(SA) (SEQ ID NO: 10)及臨床上經批准之聚腺苷酸化終止子(PA) (諸如BGH polyA終止子SEQ ID NO: 11)。應理解且在本文中經審慎考慮，同源臂可為對稱的(在各側上具有相同長度)或不對稱的(在各側上具有不同長度)以容納不同轉殖基因長度。即，同源臂之長度可具有左同源臂(LHA)長度及右同源臂(RHA)長度之任何組合，包括但不限於LHA 30 bp (SEQ ID NO: 2)及RHA 30 bp (SEQ ID NO: 1)、LHA 30 bp及RHA 100 bp、LHA 30 bp及RHA 300 bp (SEQ ID NO: 3)、LHA 30 bp及RHA 500 bp (SEQ ID NO: 5)、LHA 30 bp及RHA 800 bp (SEQ ID NO: 7)、LHA 30 bp及RHA 1000 bp、LHA 100 bp及RHA 30 bp、LHA 100 bp及RHA 100 bp、LHA 100 bp及RHA 300 bp、LHA 100 bp及RHA 500 bp、LHA 100 bp及RHA 800 bp、LHA 100 bp及RHA 1000 bp、LHA 300 bp (SEQ ID NO: 4)及RHA 30 bp、LHA 300 bp及RHA 100 bp、LHA 300 bp及RHA 300 bp、LHA 300 bp及RHA 500 bp、LHA 300 bp及RHA 800 bp、LHA 300 bp及RHA 1000 bp、LHA 500 bp (SEQ ID NO: 6)及RHA 30 bp、LHA 500 bp及RHA 100 bp、LHA 500 bp及RHA 300 bp、LHA 500 bp及RHA 500 bp、LHA 500 bp及RHA 800 bp、LHA 500 bp及RHA 1000 bp、LHA 800 bp (SEQ ID NO: 8)及RHA 30 bp、LHA 800 bp及RHA 100 bp、LHA 800 bp及RHA 300 bp、LHA 800 bp及RHA 500 bp、LHA 800 bp及RHA 800 bp、LHA 800 bp及RHA 1000 bp、LHA 1000 bp及RHA 30 bp、LHA 1000 bp及RHA 100 bp、LHA 1000 bp及RHA 300 bp、LHA 1000 bp及RHA 500 bp、LHA 1000 bp及RHA 800 bp以及LHA 1000 bp及RHA 1000 bp。

有若干方式提供DNA模板，包括病毒及非病毒方法。在非病毒方法中，單股或雙股DNA模板通常與Cas9/RNP一起電穿孔，然而，其與病毒轉導相比具有較低效率。對於病毒基因遞送，包括AAV6之腺相關病毒(AAV)安全地用於臨床試驗且適用作敏感性初級免疫細胞(包括T細胞)之載體。

經由AAV載體遞送之轉錄物可封裝為長度為大致4.7 kb之線性單股(ss) DNA (ssAAV)或線性自互補(sc) DNA (scAAV)。scAAV載體之益處在於，其含有突變反向末端重複序列(ITR)，相較於ssDNA載體，該突變反向末端重複序列為複製所需且有助於繞過第二股產生之速度限制性步驟。由於scAAV之封裝能力限制，Cas9靶向位點之右側及左側的30 bp、300 bp、500 bp及800 bp至1000 bp之HA經設計以發現HA之最佳長度且提供研究人員基於轉殖基因尺寸選擇的HA之可能長度(舉例而言，如圖2A中所示)。另外，由於與ssAAV相比封裝能力的限制，scAAV可能不適用於較大轉殖基因，諸如靶向CD33的嵌合抗原受體(CAR)。因此，基於轉殖基因之尺寸，設計及測試ssAAV及scAAV兩者，其為在初級NK細胞及/或NK T細胞中之基因插入提供廣泛範圍的選擇方案。

已展示，重組之效率隨著HA之長度增加而增加。因此，對於ssAAV主鏈，左右同源臂(HA)之最長可能長度用於mCherry (例如800 bp-1000 bp之HA)及CD33 CAR-NK (例如600 bp之HA)。由於設計同源臂係耗時程序且需要多次最佳化，因此亦已研究CRISPaint方法，一種用於基因插入或標記的同源非依賴性方法。在此方法中，在編碼相關基因之DNA模板中提供相同Cas9靶向位點，包括編碼crRNA之序列及PAM序列(在本文中亦稱為PAMg，例如SEQ ID NO: 9)。在引入Cas9複合體後，同時切割模板及基因體DNA兩者。因此，CRISPaint模板展現為可經由非同源性修復機構整合之線性化雙股DNA (例如如圖2B中所示)。在一些實例中，CRISPaint DNA模板如圖21及圖22中所示。因此，在一個態樣中，本文揭示用於將供體轉殖基因遞送至細胞且將該轉殖基因(例如CAR)與CRISPR/Cas9組合整合至細胞中的質體。因此，本文揭示供與任何前述態樣之CRISPR/Cas9整合系統一起使用的質體，其中左同源臂及右同源臂為相同長度或不同長度。

在一些態樣中，同源臂特異性地與人類染色體19之腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)雜交。在一些實施例中，LHA長度為600 bp。在一些實施例中，LHA包含與SEQ ID NO: 31或其片段至少約70% (例如至少約75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)一致之序列。在一些實施例中，RHA長度為600 bp。在一些實施例中，RHA包含與SEQ ID NO: 32或其片段至少約70% (例如至少約75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)一致之序列。

本文所揭示之質體包含編碼嵌合抗原受體CAR多肽之聚核苷酸序列。如本文所用，「嵌合抗原受體」或「CAR」係指靶向癌症抗原且用以使表現受體之細胞進入至表現目標抗原之癌細胞的嵌合受體。通常，CAR包含識別肽的分子，該肽衍生自由主要組織相容(MHC)分子表現之腫瘤抗原，或在靶向癌症抗原之CAR細胞之表面上表現的抗體或其片段(諸如Fab'、scFv、Fv)。受體經由連接子融合至信號傳導域(諸如T細胞之CD3ζ域及NK細胞或NK T細胞之NKG2C、NKp44或CD3ζ域)。腫瘤抗原目標為由引發免疫反應，尤其B細胞、NK細胞、NK T細胞及T細胞介導之免疫反應的腫瘤細胞產生之蛋白質。抗原結合域之選擇將視待治療之癌症之特定類型而定。腫瘤抗原在此項技術中已被熟知且包括例如神經膠質瘤相關抗原、癌胚抗原(CEA)、EGFRvIII、IL-llRa、IL-13Ra、EGFR、FAP、B7H3、Kit、CA LX、CS-1、MUC1、BCMA、bcr-abl、HER2、β-人絨毛膜促性腺激素、α胎蛋白(AFP)、ALK、CD19、CD123、週期蛋白Bl、凝集素-反應性AFP、Fos相關抗原1、ADRB3、甲狀球蛋白、EphA2、RAGE-1、RUl、RU2、SSX2、AKAP-4、LCK、OY-TESl、PAX5、SART3、CLL-1、海藻糖基GM1、GloboH、MN-CA IX、EPCAM、EVT6-AML、TGS5、人類端粒酶反轉錄酶、聚唾液酸、PLAC1、RUl、RU2 (AS)、腸道羧基酯酶、lewisY、sLe、LY6K、mut hsp70-2、M-CSF、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIBI、BORIS、前列腺酶、前列腺特異性抗原(PSA)、PAX3、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、LMP2、NCAM、p53、p53突變體、Ras突變體、gplOO、前列腺蛋白、OR51E2、PANX3、PSMA、PSCA、Her2/neu、hTERT、HMWMAA、HAVCR1、VEGFR2、PDGFR-β、存活素及端粒酶、豆莢蛋白、HPV E6,E7、精子蛋白17、SSEA-4、酪胺酸酶、TARP、WT1、前列腺癌瘤腫瘤抗原-1 (PCTA-1)、ML-IAP、MAGE、MAGE-A1,MAD-CT-1、MAD-CT-2、MelanA/MART 1、XAGE1、ELF2M、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、嗜中性球彈性蛋白酶、肉瘤易位斷點、NY-BR-1、ephnnB2、CD20、CD22、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD97、CD171、CD179a、雄激素受體、FAP、胰島素生長因子(IGF)-I、IGFII、IGF-I受體、GD2、o-乙醯基-GD2、GD3、GM3、GPRC5D、GPR20、CXORF61、葉酸受體(FRa)、葉酸受體β、ROR1、Flt3、TAG72、TN Ag、Tie 2、TEM1、TEM7R、CLDN6、TSHR、UPK2及間皮素。腫瘤抗原之非限制性實例包括以下：分化抗原，諸如酪胺酸酶、TRP-1、TRP-2及腫瘤特異性多譜系抗原，諸如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pi 5；過度表現胚抗原，諸如CEA；過度表現致癌基因及突變腫瘤抑制基因，諸如p53、Ras、HER-2/neu；由染色體易位產生之獨特腫瘤抗原；諸如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；及病毒抗原，諸如埃-巴二氏病毒抗原(Epstein Barr virus antigen) EBVA及人類乳突狀瘤病毒(HPV)抗原E6及E7。其他基於蛋白質之大抗原包括TSP- 180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、pl85erbB2、pl80erbB-3、c-met、nm- 23H1、PSA、IL13Ra2、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-連環蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB/70K、NY-CO-1、RCASl、SDCCAG1 6、TA-90\Mac-2結合蛋白\親環蛋白C相關蛋白、TAAL6、TAG72、TLP、TPS、GPC3、MUC16、LMP1、EBMA-1、BARF-1、CS1、CD319、HER1、B7H6、L1CAM、IL6及MET。

CAR多肽亦可包含跨膜域(諸如NKG2D跨膜域、CD4跨膜域、CD8跨膜域、CD28跨膜域及/或CD3ξ跨膜域)及共刺激域(諸如2B4域、CD28共刺激域、4-1 BB共刺激域，或2B4域、CD28共刺激域及/或4-1 BB共刺激域之任何組合)。舉例而言，在一些實施例中，CAR多肽包含IgG4鉸鏈域、CD4跨膜域、CD28共刺激域、CD3ζ多肽及特異性結合至目標細胞上之受體的單鏈可變片段(scFV)，該目標細胞包括但不限於表現目標抗原(例如CD33)之癌細胞。在一些實施例中，CAR多肽包含IgG4鉸鏈域、NKG2D跨膜域、2B4域、CD3ζ多肽，及特異性結合至目標細胞上之受體的單鏈可變片段(scFV)，該目標細胞包括但不限於表現目標抗原(例如，CD33)之癌細胞。在一些實施例中，CAR多肽為圖6B中所示之彼等多肽。在一些實施例中，編碼本文所描述之CAR多肽的聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 23或其片段至少約70% (例如至少約75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)一致的序列。在一些實例中，包含編碼CAR之聚核苷酸之質體的設計如圖16及圖17中所示。

在一些實施例中，編碼本文所描述之scFV之聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 18或其片段至少約70% (例如至少約75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)一致之序列。

在一些實施例中，編碼本文所述之IgG4鉸鏈的聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 19或其片段至少約70% (例如至少約75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)一致的序列。

在一些實施例中，編碼本文所述之CD28共刺激域的聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 20或其片段至少約70% (例如至少約75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)一致的序列。

在一些實施例中，編碼本文所描述之CD3ζ的聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 28或其片段至少約70% (例如至少約75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)一致的序列。

在一些實施例中，編碼本文中所描述之NKG2D跨膜域的聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 24或其片段至少約70% (例如至少約75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)一致的序列。

在一些實施例中，編碼本文所述之2B4域的聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 26或其片段至少約70% (例如至少約75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)一致的序列。

在一些實施例中，編碼抗CD33 scFV之聚核苷酸包含與SEQ ID NO: 29或其片段至少約70% (例如至少約75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)一致之序列。

在一些實施例中，本文所述之MND啟動子包含與SEQ ID NO: 30或其片段至少約70% (例如至少約75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)一致的序列。

在一些實施例中，本文所述之表現載體包含一或多個連接序列，其中該連接序列包含與SEQ ID NO: 25或其片段至少約70% (例如至少約75%、80%、85%、90%、95%、97%或99%)一致的序列。

因此，在一些實施例中，本文所揭示之質體包含編碼CAR多肽之聚核苷酸序列，其中CAR多肽包含跨膜域(例如NKG2D跨膜域、CD4跨膜域、CD8跨膜域、CD28跨膜域或CD3ξ跨膜域)、共刺激域(例如2B4域、CD28共刺激域、4-1 BB共刺激域，或2B4域、CD28共刺激域及/或4-1 BB共刺激域之任何組合)、CD3ζ及特異性結合至目標細胞(例如表現CD33之癌細胞)上之受體的單鏈可變片段(scFV)。在一些實施例中，CAR多肽特異性結合CD33。

本文亦揭示可經由HITI、CRISPaint或其他非同源末端接合(NHEJ)整合至轉導細胞之基因體中的質體。因而，其具有以高效整合優勢。在一些實例中，NHEJ之質體為國際公開案第WO2020/198675號中所揭示之質體，其以全文引用之方式併入本文中。為輔助鑑別裂解位點以移除用於整合之轉殖基因，質體包含一或多個PAMg序列(亦即原間隔序列相鄰模體(PAM)及編碼crRNA之序列(亦即gRNA)) (SEQ ID NO: 9)以靶向供體轉殖基因整合。在一些實例中，對於NHEJ DNA模板(例如CRISPaint DNA模板)，單一(PAMg)或雙重(PAMgPAMg) Cas9靶向序列併入轉殖基因(例如編碼CAR，諸如本文所揭示之CD33 CAR之聚核苷酸)周圍但在ITR內。因此，Cas9可同時切割gDNA及CRISPaint DNA模板，使得能夠在基因體DSB處整合。

因此，在一些態樣中，本文揭示一種供與規律間隔重複短回文序列簇(CRISPR)/CRISPR相關9 (Cas9)整合系統一起使用的質體，其中該質體包含編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽之聚核苷酸序列；其中該聚核苷酸序列鄰近於一個原間隔序列相鄰模體(PAM)及一個編碼crispr RNA (crRNA)之聚核苷酸序列或側接兩個PAM及兩個編碼crRNA之聚核苷酸序列。在一些態樣中，本文揭示一種供與規律間隔重複短回文序列簇(CRISPR)/CRISPR相關9 (Cas9)整合系統一起使用的質體，其中該質體依序包含一個原間隔序列相鄰模體(PAM)序列及一個編碼crRNA的聚核苷酸序列、編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽的聚核苷酸序列及一個PAM序列及一個編碼crRNA的聚核苷酸序列。在一些實例中，質體如圖2B、圖21及圖22中所示。

另外，不管使用單股(SS)質體插入較大轉殖基因之益處，SS質體可能需要更多時間在整合之前在細胞內部摺疊及充當雙股DNA，其增加在一些細胞(諸如T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞、纖維母細胞、骨母細胞、肝細胞、神經元細胞、上皮細胞及/或肌肉細胞)中之DNA感測機制及細胞毒性。此問題在本文中藉由使用自互補(SC) (雙股)構築體來克服，以便減少暴露於細胞中之外源DNA的時間。

應理解且在本文中經審慎考慮，為使Cas9核酸酶活性靶向至目標位點且亦裂解供體質體以允許將供體轉殖基因重組成宿主DNA，使用crispr RNA (crRNA)。在一些情況下，crRNA與tracrRNA組合以形成引導RNA (gRNA)。所揭示之質體使用人類染色體19上之蛋白質磷酸酶1調控次單元12C (PPP1R12C)基因之AAV整合內含子1，其稱為AAVS1，作為用於整合轉殖基因之目標位點。此基因座為「安全港基因」且允許在許多細胞類型中穩定長期轉殖基因表現。由於PPP1R12C之破壞不與任何已知疾病相關，因此AAVS1基因座通常被視為轉殖基因靶向之安全港。因為AAVS1位點用作目標位置，所以CRSPR RNA (crRNA)必須靶向該DNA。本文揭示之引導RNA包含GGGGCCACTAGGGACAGGAT (SEQ ID NO: 17)或其任何10個核苷酸有義或反義連續片段。因此，在一些實例中，PAM+編碼crRNA之序列包含SEQ ID NO: 9。雖然出於例示性目的使用AAVS1，但應瞭解且在本文中經審慎考慮，在經轉染之特定細胞類型或轉殖基因的情況下，若更適當，則其他「安全港基因」可經使用得到等效結果且可取代AAVS1。其他安全港基因之實例包括但不限於C-C趨化因子受體類型5 (CCR5)、ROSA26基因座及TRAC。

在一個實例中，本文所揭示之質體進一步包含鼠白血病病毒源性(MND)啟動子。

如上文所指出，使用AAV作為載體遞送所揭示之CRISPR/Cas9質體及任何供體轉殖基因限於最大約4.5 kb。應理解且在本文中經審慎考慮，增加轉殖基因之可允許尺寸的一種方法為藉由交換通常用於合成Cas9或來自不同細菌來源之Cas9的化膿性鏈球菌之Cas9 (SpCas9)來產生額外空間。Cas9之取代亦可用於增加靶向特異性，因此需要使用較少gRNA。因此，舉例而言，Cas9可衍生自金黃色葡萄球菌(SaCas9)、胺基酸球菌屬(AsCpf1)、毛螺菌科細菌(Lachnospiracase bacterium，LbCpf1)、奈瑟氏腦膜炎菌(NmCas9)、嗜熱鏈球菌(StCas9)、空腸彎曲桿菌(CjCas9)、增強型SpCas9 (eSpCas9)、SpCas9-HF1、Fokl融合dCas9、擴增Cas9 (xCas9)及/或催化死亡Cas9 (dCas9)。

應理解且在本文中經審慎考慮，使用特定Cas9可改變PAM序列，其中Cas9核酸內切酶(或替代物)用於篩檢目標。如本文所用，適合的PAM序列包含NGG (SpCas9 PAM) NNGRRT (SaCas9 PAM) NNNNGATT (NmCAs9 PAM)、NNNNRYAC (CjCas9 PAM)、NNAGAAW (St)、TTTV (LbCpf1 PAM及AsCpf1 PAM)；TYCV (LbCpf1 PAM變異體及AsCpf1 PAM變異體)；其中N可為任何核苷酸；V=A、C或G；Y=C或T；W=A或T；及R=A或G。

在一個態樣中，本文揭示基因修飾細胞之方法，其包含獲得包含與對細胞中之目標DNA序列具有特異性的對應CRISPR/Cas引導RNA (gRNA)複合之2類CRISPR/Cas核酸內切酶(Cas9)的核糖核蛋白(RNP)複合體以及包含轉殖基因(諸如針對腫瘤抗原之嵌合抗原受體)之質體；其中轉殖基因側接同源臂；及b)將轉殖基因及RNP複合體引入至細胞中；其中經由用腺相關病毒(AAV)感染至目標細胞中而將轉殖基因引入至細胞中；其中RNP複合體與細胞之基因體DNA內之目標序列雜交。在一個態樣中，該方法可進一步包含經由電穿孔(諸如當修飾NK細胞或NK T細胞時)將RNP複合體引入至細胞中。在一個態樣中，該方法可進一步包含用包含RNP複合體之第二AAV病毒重複感染目標細胞。在一個態樣中，其中轉殖基因足夠少，相同AAV可包含轉殖基因及RNP複合體兩者。在又其他態樣中，轉殖基因及RNP複合體可編碼於相同質體上。

在一個態樣中，本文揭示基因修飾細胞(例如NK細胞或NK T細胞)之方法，其包含a)獲得包含與對應CRISPR/Cas引導RNA複合之2類CRISPR/Cas核酸內切酶(Cas9)之核糖核蛋白(RNP)複合體及包含含有轉殖基因(諸如腫瘤抗原之嵌合抗原受體)之質體的AAV載體；其中該轉殖基因側接同源臂；其中轉殖基因鄰近於一個PAM及crRNA或側接兩個PAM及兩個crRNA之序列；及b)將轉殖基因及RNP複合體引入至細胞中；其中經由用AAV感染至目標細胞中而將轉殖基因引入至細胞中；其中核糖核蛋白(RNP)複合體與細胞之基因體DNA內之目標序列雜交，且細胞之DNA修復酶將轉殖基因在目標序列處插入至宿主基因體中(例如藉由非同源末端接合)，由此產生經修飾細胞。在一個態樣中，該方法可進一步包含經由電穿孔(諸如當修飾NK細胞或NK T細胞時)將RNP複合體引入至細胞中。在一個態樣中，該方法可進一步包含用包含RNP複合體之第二AAV病毒重複感染目標細胞。在一個態樣中，其中轉殖基因足夠少，相同AAV可包含轉殖基因及RNP複合體兩者。在又另一態樣中，轉殖基因及RNP複合體可編碼於相同質體上。

在一些實例中，本文中所描述之AAV可用作載體來遞送所揭示之初級編輯質體及本文中所描述之任何供體轉殖基因(例如，編碼CAR之聚核苷酸)。初級編輯為「搜尋及置換」基因體編輯技術，其在不需要DSB或供體DNA模板之情況下介導人類細胞中之靶向插入、缺失鹼基-鹼基轉化及其組合。初級編輯可使用包含催化受損Cas9核酸內切酶、工程改造反轉錄酶、RNA可程式化切口酶及/或引子編輯引導RNA (pegRNA)的融合蛋白，以直接自pegRNA上之延伸段將遺傳資訊複製至目標基因體基因座中。用於設計及使用初級編輯之方法為此項技術中已知的。參見例如Anzalone, A.V., Randolph, P.B., Davis, J.R.等人 Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA. Nature 576, 149-157 (2019)，其全部內容以引用之方式併入本文中。

應理解且在本文中經審慎考慮，可在任何細胞類型之情況下使用所揭示之方法，包括T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞、NK T細胞、纖維母細胞、骨母細胞、肝細胞、神經元細胞、上皮細胞及/或肌肉細胞以及任何其他細胞類型。人類NK細胞為所揭示之質體及其使用方法之尤其極佳目標。NK細胞係由CD56或CD16之表現及T細胞受體(CD3)之不存在界定之末梢血液淋巴球的子組。NK細胞感測且殺死缺乏主要組織相容複合體(MHC)-I類分子之目標細胞。NK細胞活化受體尤其包括天然細胞毒性受體(NKp30、NKp44及NKp46)及凝集素樣受體NKG2D及DNAM-1。其配位體表現於受壓、經轉型或經感染之細胞上，但不表現於正常細胞上，使得正常細胞對NK細胞殺死具有抗性。NK細胞活化經由抑制受體，諸如殺手免疫球蛋白(Ig)樣受體(KIR)、NKG2A/CD94、TGFβ及白血球Ig樣受體-1 (LIR-1)負調控。在一個態樣中，目標細胞可為來自供體來源，諸如用於授受性轉移療法之同種異體供體來源或自體供體來源(亦即，經修飾細胞之最終接受者)之初級NK細胞；NK細胞株(包括但不限於NK RPMI8866；HFWT、K562及EBV-LCL)；或自擴增NK細胞來源得到初級NK細胞來源或NK細胞株。

在細胞(諸如T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞、NK T細胞、纖維母細胞、骨母細胞、肝細胞、神經元細胞、上皮細胞及/或肌肉細胞)轉導之前，細胞可在適合於繁殖細胞之培養基中培育。應理解且在本文中經審慎考慮，培養條件可包含添加細胞介素、抗體及/或餵養細胞。因此，在一個態樣中，本文揭示基因修飾細胞(諸如T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞、NK T細胞、纖維母細胞、骨母細胞、肝細胞、神經元細胞、上皮細胞及/或肌肉細胞)之方法，其進一步包含培育細胞至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天，隨後在支持細胞繁殖之培養基中轉導細胞；其中培養基進一步包含細胞介素、抗體及/或餵養細胞。舉例而言，培養基可包含IL-2、IL-12、IL-15、IL-18及/或IL-21。在一個態樣中，培養基亦可包含抗CD3抗體。在一個態樣中，餵養細胞可自刺激細胞之餵養細胞純化。舉例而言，本文所揭示用於所主張之本發明的NK細胞刺激餵養細胞可為經輻射自體或同種異體末梢血液單核細胞(PBMC)或無輻射自體或PBMC；RPMI8866；HFWT、K562；經膜結合IL-15及41BBL或IL-21或其任何組合轉染的K562細胞；或EBV-LCL。在一些態樣中，餵養細胞與IL-21、IL-15及/或41BBL之溶液組合提供。餵養細胞可以1:2、1:1或2:1比率接種於細胞培養物中。應理且在本文中經審慎考慮，培養時段可在AAV感染後1天與14天之間(亦即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)，較佳在3天與7天之間，最佳在4天與6天之間。

應理解且在本文中經審慎考慮，初級細胞及擴增細胞(包括但不限於初級及擴增T細胞、NK細胞、NK T細胞或B細胞)的培育條件可不同。在一個態樣中，在AAV感染之前培養初級NK細胞或NK T細胞包含小於5天(例如1、2、3或4天)的培養基及細胞介素(諸如IL-2、IL-12、IL-15、IL-18及/或IL-21)及/或抗CD3抗體。對於擴增NK細胞，可在除細胞介素(諸如IL-2、IL-12、IL-15、IL-18及/或IL-21)及/或抗CD3抗體之外或代替該等細胞介素及/或該抗體，在NK餵養細胞(例如1:1比率)存在下進行培養。擴增NK細胞之培養可在轉導之前進行1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天。因此，在一個態樣中，本文揭示基因修飾細胞(諸如T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞、NK T細胞、纖維母細胞、神經元細胞、骨母細胞、肝細胞、上皮細胞及/或肌肉細胞)之方法，其包含在IL-2存在下培育初級細胞4天，隨後用AAV載體感染及/或電穿孔(當RNP複合體經由電穿孔引入時)；或在經輻射餵養細胞存在下培育擴增細胞4、5、6或7天，隨後用AAV感染及/或電穿孔(當RNP複合體經由電穿孔引入時)。

在轉導(例如經由AAV感染或電穿孔)細胞(諸如T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞、NK T細胞、纖維母細胞、骨母細胞、肝細胞、神經元細胞、上皮細胞及/或肌肉細胞)之後，目前的經修飾細胞可在包含刺激經修飾細胞(諸如T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞、NK T細胞、纖維母細胞、骨母細胞、肝細胞、神經元細胞、上皮細胞及/或肌肉細胞)之餵養細胞的培養基中繁殖。因此，經修飾細胞保留存活率及增殖潛力，因為其能夠使用經輻射餵養細胞進行AAV後感染及/或電穿孔(當RNP複合體經由電穿孔引入時)擴增。舉例而言，本文所揭示用於所主張之本發明的NK細胞刺激餵養細胞可為經輻射自體或同種異體末梢血液單核細胞(PBMC)或無輻射自體或PBMC；RPMI8866；HFWT、K562；經膜結合IL-15及41BBL或IL-21或其任何組合轉染的K562細胞；或EBV-LCL。在一些態樣中，NK細胞餵養細胞與IL-21、IL-15及/或41BBL之溶液組合提供。餵養細胞可以1:2、1:1或2:1比率接種於NK細胞培養物中。應理且在本文中經審慎考慮，培養時段可在感染及/或電穿孔後1天與14天之間(亦即，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)，較佳在3天與7天之間，最佳在4天與6天之間。在一些態樣中，培養經修飾NK細胞之培養基可進一步包含細胞介素，諸如IL-2、IL-12、IL-15、IL-18及/或IL-21。

在一個態樣中，應理解且在本文中經審慎考慮，所揭示之基因修飾細胞之方法的一個目標為產生經修飾細胞。因此，本文揭示藉由所揭示之方法製成之經修飾T細胞、B細胞、巨噬細胞、NK細胞、NK T細胞、纖維母細胞、骨母細胞、肝細胞、神經元細胞、上皮細胞及/或肌肉細胞。因此，在一個態樣中，本文揭示包含本文所揭示之質體或載體中之任一者的經修飾NK細胞及/或NK T細胞(包括但不限於CAR NK細胞及/或CAR NK T細胞)。例如，本文所揭示之抗CD33 CAR NK細胞及抗CD33 CAR NK T細胞(包括但不限於抗CD33 CAR NK細胞及/或NK T細胞，其中抗CD33 CAR包含靶向CD33之scFv、跨膜域(諸如NKG2D跨膜域、CD4跨膜域、CD8跨膜域、CD28跨膜域及/或CD3ξ跨膜域)及共刺激域(諸如2B4域、CD28共刺激域、4-1 BB共刺激域，或2B4域、CD28共刺激域及/或4-1 BB共刺激域之任何組合)。

在一個態樣中，本文揭示產生嵌合抗原受體(CAR)自然殺手(NK細胞)之方法，其包含a)獲得包含與對應CRISPR/Cas引導RNA複合之2類CRISPR/Cas核酸內切酶(Cas9)之核糖核蛋白(RNP)複合體及包含含有轉殖基因(諸如腫瘤抗原之嵌合抗原受體)之質體的AAV載體；其中該轉殖基因側接同源臂；其中轉殖基因鄰近於一個PAM及crRNA或側接兩個PAM及crRNA；及b)將轉殖基因及RNP複合體引入至細胞中；其中經由用腺相關病毒(AAV)感染至目標細胞中而將轉殖基因引入至細胞中；其中核糖核蛋白(RNP)複合體與細胞之基因體DNA內之目標序列雜交，且細胞之DNA修復酶將轉殖基因在目標序列處插入至宿主基因體中(例如藉由非同源末端接合)，由此產生經修飾細胞。在一個態樣中，該方法可進一步包含經由電穿孔(諸如當修飾NK細胞或NK T細胞時)將RNP複合體引入至細胞中。在一個態樣中，該方法可進一步包含用包含RNP複合體之第二AAV病毒重複感染目標細胞。在一個態樣中，其中轉殖基因足夠少，相同AAV可包含轉殖基因及RNP複合體兩者。在又另一態樣中，轉殖基因及RNP複合體可編碼於相同質體上。

在一些態樣中，本文揭示基因修飾細胞之方法，其包含a)獲得包含與對應CRISPR/Cas引導RNA複合之2類CRISPR/Cas核酸內切酶(Cas9)的核糖核蛋白(RNP)複合體及包含含有編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽之聚核苷酸序列的質體的AAV載體；其中該聚核苷酸序列側接同源臂；且其中該等同源臂之長度為800 bp或更短；及b)將該聚核苷酸序列及該RNP複合體引入至該細胞中；其中經由用AAV感染至細胞中而將聚核苷酸序列引入至該細胞中；其中RNP複合體與細胞之基因體DNA內的目標序列雜交，且細胞之DNA修復酶將轉殖基因在該細胞之基因體DNA內的目標序列處插入至宿主基因體中，由此產生經修飾細胞。在一些實施例中，細胞為NK細胞。

在一個態樣中，用於所揭示之免疫療法方法中且藉由所揭示之修飾方法產生之經修飾細胞(例如NK細胞)可為來自供體來源(諸如用於授受性轉移療法之同種異體供體來源或自體供體來源(亦即經修飾細胞之最終接受者)、細胞株(包括但不限於NK細胞株NK RPMI8866；HFWT、K562及EBV-LCL)之初級細胞，或自擴增細胞來源得到初級細胞來源或細胞株。因為可使用初級細胞，所以應理解且在本文中經審慎考慮，可離體或活體外進行所揭示之細胞修飾。

本文所用之細胞可為初級細胞或擴增細胞。初級細胞可在AAV載體感染之前、在IL-2存在下培育約4至10天。在一個實例中，初級細胞在經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體存在下在感染之前擴增約4至10天。在一些實施例中，經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體表現膜結合4-1BBL、膜結合IL-21或膜結合-15或其任何組合。

在細胞(例如，NK細胞)轉導之後，可在向個體投與經修飾(亦即，經工程改造)之細胞之前擴增及刺激經修飾細胞。舉例而言，本文揭示將免疫細胞授受性轉移至有需要之個體之方法，其中免疫細胞(例如自然殺手(NK)細胞)在向個體投與之前用表現膜結合IL-21 (mbIL-21)之經輻射餵養細胞、質膜(PM)粒子或胞外體(EX) (表現mbIL-21之PM粒子及EX胞外體在本文中分別稱為PM21粒子及EX21胞外體)擴增。在一些態樣中，擴增可進一步包含表現膜結合IL-15 (mbIL-15)及/或膜結合4-1BBL (mb4-1BBL)之經輻射餵養細胞、質膜(PM)粒子或胞外體。在一些態樣中，應理解且在本文中經審慎考慮，經修飾(亦即，經工程改造)細胞之刺激及擴增可在向個體投與經修飾細胞之後活體內進行或與其同時在活體內進行。因此，本文揭示免疫療法方法，其中細胞(例如NK細胞)在該等細胞轉移至個體之後經由投與IL-21或具有mbIL-21之PM粒子、具有mbIL-21之胞外體及/或經輻射表現mbIL-21之餵養細胞而在個體中擴增。在一些態樣中，擴增進一步包含投與IL-15及/或4-1BBL或表現膜結合IL-15及/或4-1BBL之PM粒子、胞外體及/或經輻射餵養細胞。

在一些實施例中，本文所揭示之方法包含用MOI範圍為約1至約1000 K MOI (例如約5至500 K MOI)之AAV感染NK細胞。舉例而言，本文所揭示之方法包含用至少約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450或500 MOI之AAV感染NK細胞。 1.    雜交/選擇性雜交

術語雜交通常意謂至少兩個核酸分子(諸如引子或探針)與基因之間的序列驅動之相互作用。序列驅動之相互作用意謂以核苷酸特異性方式在兩個核苷酸或核苷酸類似物或核苷酸衍生物之間發生的相互作用。舉例而言，G與C相互作用或A與T相互作用為序列驅動之相互作用。通常，序列驅動之相互作用在核苷酸之沃森-克里克面(Watson-Crick face)或胡斯坦面(Hoogsteen face)上發生。兩個核酸之雜交受熟習此項技術者已知之多種條件及參數影響。舉例而言，反應之鹽濃度、pH及溫度皆影響兩個核酸分子是否會雜交。

兩種核酸分子之間的選擇性雜交參數為熟習此項技術者所熟知。舉例而言，在一些實施例中，選擇性雜交條件可定義為嚴格雜交條件。舉例而言，雜交嚴格度係由雜交及洗滌步驟中之任一者或兩者之溫度及鹽濃度控制。舉例而言，達成選擇性雜交之雜交條件可涉及在低於Tm (熔融溫度，在該溫度下一半分子與其雜交伴侶解離)約12-25℃之溫度下在高離子強度溶液(6X SSC或6X SSPE)中雜交，隨後在經選擇以使得洗滌溫度低於Tm約5℃至20℃之溫度及鹽濃度之組合下洗滌。溫度及鹽條件容易憑經驗在初步實驗中測定，其中使固定於過濾器上之參考DNA之樣品與相關經標記核酸雜交且隨後在不同嚴格條件下洗滌。雜交溫度對於DNA-RNA及RNA-RNA雜交通常較高。可如上文所描述使用條件以達成嚴格度，或如此項技術中已知使用條件。DNA:DNA雜交之較佳嚴格雜交條件可在6X SSC或6X SSPE中在約68℃下(在水溶液中)，接著在68℃下洗滌。必要時，雜交及洗滌之嚴格度可隨著所需互補程度降低而相應地降低，且另外視任何搜尋變化之區域的G-C或A-T豐富度而定。同樣地，必要時，雜交及洗滌之嚴格度可因此隨著所需同源性增加而增加，且另外視任何需要較高同源性之區域的G-C或A-T豐富度而定，其所有均如此項技術中已知。

另一種定義選擇性雜交之方式為藉由觀測結合至其他核酸之核酸中之一者的量(百分比)。舉例而言，在一些實施例中，選擇性雜交條件將為至少約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%之限制性核酸結合至非限制性核酸。通常，非限制性引子例如10或100倍或1000倍過量。可在以下條件下進行此類型之分析：限制性及非限制性引子兩者低於其k _d例如10倍或100倍或1000倍，或僅核酸分子中之一者低於其k _d的10倍或100倍或1000倍，或一或兩個核酸分子超過其k _d。

另一種定義選擇性雜交之方式為尋找在需要雜交促進所需酶操作之條件下使進行酶操作之引子的百分比。例如，在一些實施例中選擇性雜交條件將為至少約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%之引子在促進酶操作之條件下經酶操作，舉例來說，若酶操作係DNA延伸，則選擇性雜交條件將為至少約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100%之引子分子係延伸的。較佳條件亦包括由製造商建議或在此項技術中指示為適合於酶進行操作之彼等條件。

正如同源性，應理解，本文揭示多種用於測定兩種核酸分子之間的雜交程度之方法。應理解，此等方法及條件可提供兩種核酸分子之間的不同雜交百分比，但除非另外指示，否則將足夠符合該等方法中之任一者之參數。舉例而言，若需要80%雜交且只要在此等方法中之任一者之所需參數內出現雜交，則其視為揭示於本文中。

應理解，熟習此項技術者瞭解，若組合物或方法符合共同或單獨測定雜交之此等標準中之任一者，則其為本文所揭示之組合物或方法。 2.    核酸

本文揭示之多種基於核酸之分子。所揭示之核酸由例如核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物構成。本文中論述此等及其他分子之非限制性實例。應理解，例如當載體在細胞中表現時，經表現mRNA將通常由A、C、G及U構成。同樣，應理解，舉例而言，若經由例如外源性遞送將反義分子引入至細胞或細胞環境中，則反義分子有利地由減少細胞環境中反義分子之降解的核苷酸類似物構成。 a)    核苷酸及相關分子

核苷酸為含有鹼基部分、糖部分及磷酸酯部分之分子。核苷酸可經由其磷酸酯部分及糖部分產生核苷間鍵而連接在一起。核苷酸之鹼基部分可為腺嘌呤-9-基(A)、胞嘧啶-1-基(C)、鳥嘌呤-9-基(G)、尿嘧啶-1-基(U)及胸腺嘧啶-1-基(T)。核苷酸之糖部分為核糖或去氧核糖。核苷酸之磷酸酯部分為五價磷酸酯。核苷酸之非限制性實例將為3'-AMP (3'-單磷酸腺苷)或5'-GMP (5'-單磷酸鳥苷)。存在此項技術中可利用且本文中可利用之多種此等類型之分子。

核苷酸類似物為含有對鹼基、糖或磷酸酯部分之某種修飾的核苷酸。對核苷酸之修飾為此項技術中熟知的且將包括例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤及2-胺基腺嘌呤以及糖或磷酸酯部分的修飾。存在此項技術中可利用且本文中可利用之多種此等類型之分子。

核苷酸取代物為與核苷酸具有類似功能特性但不含磷酸酯部分之分子，諸如肽核酸(PNA)。核苷酸取代物為將以沃森-克里克或胡斯坦方式識別核酸，但經由除磷酸酯部分以外之部分連接在一起的分子。當與適當目標核酸相互作用時，核苷酸取代物能夠符合雙螺旋型結構。存在此項技術中可利用且本文中可利用之多種此等類型之分子。

亦有可能將其他類型之分子(結合物)連接至核苷酸或核苷酸類似物以增強例如細胞吸收。結合物可化學連接至核苷酸或核苷酸類似物。此類結合物包括但不限於脂質部分，諸如膽固醇部分。(Letsinger等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1989, 86, 6553-6556)。存在此項技術中可利用且本文中可利用之多種此等類型之分子。

沃森-克里克相互作用為與核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物之沃森-克里克面的至少一種相互作用。核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物之沃森-克里克面包括基於嘌呤之核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物之C2、N1及C6位置及基於嘧啶之核苷酸、核苷酸類似物或核苷酸取代物之C2、N3、C4位置。

胡斯坦相互作用為在暴露於雙螺旋DNA之主要溝槽中的核苷酸或核苷酸類似物之胡斯坦面上發生的相互作用。胡斯坦面包括嘌呤核苷酸之C6位置處的N7位置及反應性基團(NH2或O)。 b)    序列

存在與參與本文所揭示之信號傳導路徑之蛋白質分子有關的多種序列，例如CD33、4-1BB、NKG2D或2B4，其皆由核酸編碼或為核酸。此等基因之人類類似物以及其他類似物及此等基因之對偶基因以及剪接變異體及其他類型之變異體的序列可在多種蛋白質及基因資料庫(包括Genbank)中獲得。熟習此項技術者瞭解如何解決序列不符及差異，且將與特定序列有關之組合物及方法調整至其他相關序列。考慮到本文所揭示及此項技術中已知之資訊，可針對任何給定序列設計引子及/或探針。 c)    引子及探針

本發明揭示包括引子及探針之組合物，其能夠與所揭示之核酸(諸如如本文所揭示之CD33)相互作用。在某些實施例中，引子用於支持DNA擴增反應。通常，引子將能夠以序列特異性方式延伸。引子以序列特異性方式延伸包括任何方法，其中與引子雜交或以其他方式結合之核酸分子的序列及/或組合物引導或影響藉由引子延伸產生之產物的組合物或序列。因此，引子以序列特異性方式延伸包括但不限於PCR、DNA定序、DNA延伸、DNA聚合、RNA轉錄或反轉錄。以序列特異性方式擴增引子之技術及條件為較佳的。在某些實施例中，引子用於DNA擴增反應，諸如PCR或直接定序。應瞭解，在某些實施例中，引子亦可使用非酶促技術延伸，其中例如用於使引子延伸之核苷酸或寡核苷酸經修飾，使得其將進行化學反應，以序列特異性方式延伸引子。通常，所揭示之引子與所揭示之核酸或核酸區域雜交，或其與核酸之互補序列或核酸區域之互補序列雜交。

在某些實施例中，用於與核酸相互作用之引子或探針的尺寸可為支持引子之所需酶操作，諸如DNA擴增或探針或引子之簡單雜交的任何尺寸。典型引子或探針長度將為至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000個核苷酸。

在其他實施例中，引子或探針長度可小於或等於6、7、8、9、10、11、12 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000個核苷酸。

CD33基因之引子通常用於產生含有CD33基因之區域或整個基因的擴增DNA產物。一般而言，產物尺寸通常將使得尺寸可精確地確定在3或2或1個核苷酸內。

在某些實施例中，此產物長度為至少20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000個核苷酸。

在其他實施例中，產物長度小於或等於20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500、2750、3000、3500或4000個核苷酸。 3.    向細胞遞送組合物

存在多種可用於活體外或活體內向細胞遞送核酸之組合物及方法。此等方法及組合物可基本上分解成兩類：基於病毒之遞送系統及基於非病毒之遞送系統。舉例而言，核酸可經由許多直接遞送系統遞送，諸如電穿孔、脂質體轉染、磷酸鈣沈澱、質體、病毒載體、病毒核酸、噬菌體核酸、噬菌體、黏質體，或經由轉移細胞或載體(諸如陽離子脂質體)中之遺傳物質來遞送。適當的轉染方式，包括病毒載體、化學轉染物或物理機械方法(諸如電穿孔及DNA之直接擴散)係由例如Wolff, J. A.等人, Science, 247, 1465-1468, (1990)；及Wolff, J. A. Nature, 352, 815-818, (1991)描述。此類方法為此項技術中所熟知且可容易地適於與本文所描述之組合物及方法一起使用。在某些情況下，將修改該等方法以專門在大DNA分子情況下起作用。此外，此等方法可用於藉由使用載劑之靶向特徵靶向某些疾病及細胞群。 a)    基於核酸之遞送系統

轉移載體可為用於將基因遞送至細胞(例如質體)中之任何核苷酸構築體，或作為用以遞送基因之通用策略之一部分，例如作為重組反轉錄病毒或腺病毒之一部分(Ram等人 Cancer Res. 53:83-88, (1993))。在一些實例中，本文所述之質體可為DNA模板或包含本文提供之聚核苷酸序列之核苷酸結構。

如本文所用，質體或病毒載體係在不降解情況下將所揭示之核酸輸送至細胞中的藥劑，且包括在其所輸送之細胞中產生基因表現的啟動子。病毒載體為例如腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、脊髓灰質炎病毒、AIDS病毒、神經元營養病毒、辛德比(Sindbis)及其他RNA病毒，包括具有HIV主鏈之此等病毒。與此等病毒共有使其適用作載體之特性的任何病毒家族亦為較佳的。反轉錄病毒包括鼠類莫洛尼白血病病毒(Murine Maloney Leukemia virus，MMLV)及表現MMLV作為載體之所需特性的反轉錄病毒。反轉錄病毒載體能夠載運比其他病毒載體更大的基因有效負載(亦即，轉殖基因或標記基因)，且出於此原因，為常用載體。然而，其並不適用於非增殖性細胞。腺病毒載體相對穩定且易於與其一起工作，具有高效價，且可在氣溶膠調配物中遞送，且可轉染非分裂細胞。痘病毒載體較大且具有若干用於插入基因之位點，其為熱穩定的且可在室溫下儲存。較佳實施例為已經工程改造以便遏制由病毒抗原引發之宿主生物體之免疫反應的病毒載體。此類型之較佳載體將載運介白素8或10之編碼區。

病毒載體可具有比化學或物理方法高的將基因引入至細胞中之交互(引入基因之能力)能力。通常，病毒載體含有非結構早期基因、結構晚期基因、RNA聚合酶III轉錄物、複製及殼體化所必需之反轉末端重複序列及用以控制病毒基因體之轉錄及複製的啟動子。當經工程改造為載體時，病毒通常具有經移除早期基因中之一或多者，且基因或基因/啟動子卡匣經插入至病毒基因體中代替經移除之病毒DNA。此類型之構築體可以載運至多約8 kb之外來遺傳物質。所移除之早期基因之所需功能通常藉由細胞株供應，該等細胞株已經工程改造以反式表現早期基因之基因產物。 (1)  腺相關病毒載體

另一類型之病毒載體係基於腺相關病毒(AAV)。因為此有缺陷的小病毒可感染許多細胞類型且對人類不致病，所以其為較佳載體。AAV型載體可以輸送約4至5 kb且已知野生型AAV穩定地插入染色體19中(諸如AAV整合位點1 (AAVS1))。含有此位點特異性整合特性之載體為較佳的。所用AAV可來源於任何AAV血清型，包括但不限於AAC1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9，及重組型(rAAV)，諸如AAV-Rh74，及/或合成AAV (諸如AAV-DJ、Anc80)。可基於細胞或組織向性選擇AAV血清型。用於所揭示之組合物及方法中的AAV載體可為單股(SS)或自互補(SC)的。

在另一類型的AAV病毒中，AAV含有一對反向末端重複序列(ITR)，該等反向末端重複序列側接至少一個含有啟動子的卡匣，該啟動子引導可操作地連接至異源基因之細胞特異性表現。在此上下文中，異源係指並非原生AAV或B19細小病毒之任何核苷酸序列或基因。

通常，AAV及B19編碼區已缺失，產生安全無細胞毒性載體。AAV ITR或其修飾賦予感染性及位點特異性整合，但不賦予細胞毒性，且啟動子引導細胞特異性表現。

因此，所揭示之載體提供能夠整合至哺乳動物染色體中而無實質性毒性之DNA分子。

病毒及反轉錄病毒中插入之基因通常含有啟動子及/或強化子來幫助控制所需基因產物之表現。啟動子一般為在位於關於轉錄起始位點相對固定位置時起作用的一或多個DNA序列。啟動子含有RNA聚合酶與轉錄因子之基本相互作用所需的核心元件，且可含有上游元件及反應元件。

應理解且在本文中經審慎考慮，AAV之封裝能力受到限制。一種克服AAV載體負載能力之方法係經由使用兩種載體，其中轉殖基因在兩個質體之間分開且使用3'剪接供體及5'剪接接受體將轉殖基因之兩個區部連接至單一全長轉殖基因中。替代地，可在實質性重疊下製成兩個轉殖基因且同源重組將使兩個區段連接至全長轉錄物中。 4.    表現系統

遞送至細胞之核酸通常含有表現控制系統。舉例而言，病毒及反轉錄病毒系統中插入之基因通常含有啟動子及/或強化子，以幫助控制所需基因產物之表現。啟動子一般為在位於關於轉錄起始位點相對固定位置時起作用的一或多個DNA序列。啟動子含有RNA聚合酶與轉錄因子之基本相互作用所需的核心元件，且可含有上游元件及反應元件。 a)    病毒啟動子及強化子

控制自哺乳動物宿主細胞中之載體轉錄的較佳啟動子可獲自不同來源，例如病毒之基因體，該等病毒諸如：多瘤病毒、猿猴病毒40 (SV40)、腺病毒、反轉錄病毒、B型肝炎病毒且最佳為巨細胞病毒，或來自異源哺乳動物啟動子，例如β肌動蛋白啟動子。SV40之早期及晚期啟動子宜以亦含有SV40病毒複製起點之SV40限制性片段形式獲得(Fiers等人, Nature, 273: 113 (1978))。人類巨細胞病毒之即刻早期啟動子宜以HindIII E限制性片段形式獲得(Greenway, P.J.等人, Gene18: 355-360 (1982))。當然，來自宿主細胞或相關物種之啟動子在本文中亦適用。

強化子一般係指在與轉錄起始位點無固定距離處起作用之DNA序列且可為轉錄單元之5' (Laimins, L.等人, Proc. Natl. Acad. Sci.78: 993 (1981))或3' (Lusky, M.L.等人, Mol. Cell Bio.3: 1108 (1983))。此外，強化子可在內含子(Banerji, J.L.等人, Cell 33: 729 (1983))內以及在編碼序列本身內(Osborne, T.F.等人, Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984))。其長度通常在10與300 bp之間，且其以順式起作用。強化子起作用以增加鄰近啟動子之轉錄。強化子亦通常含有介導轉錄調控之反應元件。啟動子亦可含有介導轉錄調控之反應元件。強化子通常決定基因表現之調控。雖然現已自哺乳動物基因(血球蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、-胎蛋白及胰島素)知曉許多強化子序列，但通常會使用真核細胞病毒之強化子進行一般表現。較佳實例為複製起點(bp 100-270)後的SV40強化子、巨細胞病毒早期啟動子強化子、複製起點後的多瘤病毒強化子，及腺病毒強化子。

啟動子及/或強化子可藉由觸發其功能之光或特定化學事件來特異性活化。可藉由諸如四環素及地塞米松之試劑調控系統。亦存在藉由暴露於輻射(諸如γ輻射)或烷基化化學療法藥物來增強病毒載體基因表現的方式。

在某些實施例中，啟動子及/或強化子區域可充當組成型啟動子及/或強化子，以使轉錄單元之轉錄區域之表現最大化。在某些構築體中，啟動子及/或強化子區域在所有真核細胞類型中均具有活性，即使其僅在特定類型之細胞中特定時間表現。此類型之較佳啟動子為CMV啟動子(650個鹼基)。其他較佳啟動子為SV40啟動子、巨細胞病毒(全長啟動子)及反轉錄病毒載體LTR。

已展示，所有特異性調控元件可經選殖且用於構築選擇性表現於特定細胞類型(諸如黑素瘤細胞)中的表現載體。膠質纖維乙酸蛋白(GFAP)啟動子已用於在膠質源性細胞中選擇性地表現基因。

真核宿主細胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人類或有核細胞)中使用之表現載體亦可含有可影響mRNA表現之轉錄終止所必需的序列。此等區域經轉錄為mRNA編碼組織因子蛋白質之未轉譯部分中的聚腺苷酸化區段。3'未轉譯區域亦包括轉錄終止位點。較佳地，轉錄單元亦含有聚腺苷酸化區域。此區域之一個益處為其增加經轉錄單元將如同mRNA一般經處理及轉運之可能性。已明確聚腺苷酸化信號於表現構築體中之鑑別及使用。較佳地，同源聚腺苷酸化信號用於轉殖基因構築體中。在某些轉錄單元中，聚腺苷酸化區域衍生自SV40早期聚腺苷酸化信號且由約400個鹼基組成。亦較佳地，經轉錄單元含有單獨或與以上序列組合之其他標準序列，提高構築體之表現或其穩定性。 b)    標記物

病毒載體可包括編碼標記產物之核酸序列。此標記產物用於判定基因是否已遞送至細胞且在遞送後是否經表現。較佳標記基因為編碼β-半乳糖苷酶及綠色螢光蛋白之大腸桿菌lacZ基因。

在一些實施例中，標記可為可選標記。哺乳動物細胞之適合可選標記的實例為二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶、新黴素、新黴素類似物G418、潮黴素(hydromycin)及嘌呤黴素。當該等可選標記經成功地轉移至哺乳動物宿主細胞中時，經轉型哺乳動物宿主細胞可在置放於選擇性壓力下之情況下存活。存在兩種廣泛使用之不同類別之選擇性方案。第一類係基於細胞之代謝及使用缺乏獨立於補充培養基生長之能力的突變細胞株。兩個實例為：CHO DHFR-細胞及小鼠LTK-細胞。此等細胞缺乏在不添加諸如胸苷或次黃嘌呤之養分的情況下生長的能力。因為此等細胞缺乏完整核苷酸合成路徑所需之某些基因，所以除非補充培養基中提供缺失核苷酸，否則其無法存活。補充培養基之替代方案為將完整DHFR或TK基因引入至缺乏相應基因之細胞中，由此改變其生長要求。未經DHFR或TK基因轉型之個別細胞將無法在無補充培養基中存活。

第二類為顯性選擇，其係指用於任何細胞類型之選擇方案，且並不需要使用突變細胞株。此等方案通常使用藥物以遏制宿主細胞之生長。具有新穎基因之彼等細胞將表現傳遞抗藥性之蛋白質且將在選擇中存活下來。此類顯性選擇之實例使用新黴素藥物(Southern P.及Berg, P., J. Molec. Appl. Genet.1: 327 (1982))、黴酚酸(Mulligan, R.C.及Berg, P. Science209: 1422 (1980))或潮黴素(Sugden, B.等人, Mol. Cell. Biol.5: 410-413 (1985))。該等三個實例在真核對照下採用細菌基因以分別傳遞對適當藥物G418或新黴素(遺傳黴素)、黴酚酸(xgpt)或潮黴素之抗性。其他的包括新黴素類似物G418及嘌呤黴素(puramycin)。 5.    肽  a)    蛋白質變異體

蛋白質變異體及衍生物為熟習此項技術者所熟知且可涉及胺基酸序列修飾。舉例而言，胺基酸序列修飾通常屬於三個類別中之一或多者：取代型、插入型或缺失型變異體。插入包括單個或多個胺基酸殘基之胺基及/或羧基端融合以及序列內插入。插入通常將比胺基或羧基端融合之插入小的插入，例如約一至四個殘基。免疫原性融合蛋白衍生物，諸如實例中所述之衍生物，藉由融合多肽製成，該多肽足夠大以藉由活體外交聯或藉由用編碼融合物之DNA轉型的重組細胞培養物來賦予目標序列免疫原性。缺失由自蛋白質序列移除一或多個胺基酸殘基界定特徵。通常，在蛋白質分子內之任一個位點缺失不超過約2至6個殘基。此等變異體通常藉由核苷酸在編碼蛋白質之DNA中之位點特異性誘變，由此產生編碼變異體之DNA，且其後在重組細胞培養物中表現DNA來製備。在具有已知序列之DNA中之預定位點處進行取代型突變的技術為熟知的，例如M13引子誘變及PCR誘變。胺基酸取代通常具有單個殘基，但可同時在多個不同位置進行；插入通常將為約1至10個胺基酸殘基；且缺失將在約1至30個殘基範圍內。缺失或插入較佳在相鄰對中進行，亦即缺失2個殘基或插入2個殘基。取代、缺失、插入或其任何組合可組合以到達最終構築體。突變必須不將序列置放於閱讀框架外，且較佳地將不創建可產生二級mRNA結構之互補區。取代型變異體為其中已移除至少一個殘基且在其位置插入不同殘基的變異體。此類取代一般根據以下表5及表6進行且稱為保守取代。

表 5 ：胺基酸縮寫
胺基酸	縮寫
丙胺酸	Ala	A
別異白胺酸	AIle
精胺酸	Arg	R
天冬醯胺	Asn	N
天冬胺酸	Asp	D
半胱胺酸	Cys	C
麩胺酸	Glu	E
麩醯胺酸	Gln	Q
甘胺酸	Gly	G
組胺酸	His	H
異白胺酸	Ile	I
白胺酸	Leu	L
離胺酸	Lys	K
苯丙胺酸	Phe	F
脯胺酸	Pro	P
焦麩胺酸	pGlu
絲胺酸	Ser	S
蘇胺酸	Thr	T
酪胺酸	Tyr	Y
色胺酸	Trp	W
纈胺酸	Val	V

表6 ：胺基酸取代
初始殘基例示性保守取代，其他為此項技術中已知的。
Ala	Ser
Arg	Lys; Gln
Asn	Gln; His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gln	Asn, Lys
Glu	Asp
Gly	Pro
His	Asn;Gln
Ile	Leu; Val
Leu	Ile; Val
Lys	Arg; Gln
Met	Leu; Ile
Phe	Met; Leu; Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp; Phe
Val	Ile; Leu

功能或免疫特性之實質性變化係藉由選擇比表6中之取代的保守性更低的取代，亦即選擇在其對維持以下方面之影響較顯著不同的殘基來實現：(a)取代區域中多肽主鏈之結構，例如呈片狀或螺旋狀構形，(b)目標位點處的分子之電荷或疏水性或(c)側鏈之主體。一般預期在蛋白質特性方面產生最大變化之取代將為彼等取代，其中(a)親水性殘基，例如絲胺醯基或羥丁胺醯基，經取代為疏水性殘基(或由疏水性殘基取代)，例如白胺醯基、異白胺醯基、苯丙胺醯基、纈胺醯基或丙胺醯基；(b)半胱胺酸或脯胺酸經(或被)任何其他殘基取代；(c)具有正電性側鏈之殘基，例如離胺醯基、精胺醯基或組胺醯基，經取代為負電性殘基(或由負電性殘基取代)，例如麩胺醯基或天冬胺醯基；或(d)具有龐大側鏈之殘基，例如苯丙胺酸，經取代為不具有側鏈之殘基(或由不具有側鏈之殘基取代)，例如甘胺酸，在此情況下，(e)藉由增加硫酸化及/或糖基化之位點數目來實現。

舉例而言，熟習此項技術者已知，一個胺基酸殘基經生物學及/或化學類似之另一胺基酸殘基置換為保守取代。舉例而言，保守取代將用一個疏水性殘基置換另一個或用一個極性殘基置換另一個。取代包括組合，諸如Gly、Ala；Val、Ile、Leu；Asp、Glu；Asn、Gln；Ser、Thr；Lys、Arg；及Phe、Tyr。各明確揭示之序列的此類保守取代變化形式包括於本文提供之嵌合體多肽內。

取代型或缺失型誘變可用於插入N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)之位點。亦可能需要半胱胺酸或其他不穩定殘基之缺失。潛在蛋白水解位點(例如Arg)之缺失或取代例如藉由刪除鹼性殘基中之一者或由麩醯胺醯基或組胺酸殘基取代一者來實現。

某些轉譯後衍生為重組宿主細胞對所表現多肽之作用的結果。常使麩醯胺醯基及天冬醯胺醯基殘基在轉譯後脫除醯胺基，變成對應的麩胺醯基及天冬胺醯基殘基。替代地，此等殘基在適度酸性條件下脫除醯胺基。其他轉譯後修飾包括：脯胺酸及離胺酸之羥基化；絲胺醯基之羥基或羥丁胺醯基殘基之磷酸化；離胺酸、精胺酸及組胺酸側鏈之鄰胺基之甲基化(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco pp 79-86 [1983])；N端胺之乙醯化，及在一些情況下，C端羧基之醯胺化。

應理解，一種定義本文所揭示之蛋白質之變異體及衍生物的方式係經由根據與特定已知序列之同源性/一致性來定義變異體及衍生物。特定言之，揭示本文揭示之此等及其他蛋白質之變異體，其與所述序列具有至少70%、或75%、或80%、或85%、或90%、或95%同源性。熟習此項技術者容易地瞭解如何測定兩種蛋白質之同源性。舉例而言，可在比對兩個序列以使得同源性處於其最高水準之後計算同源性。

另一計算同源性之方式可藉由公開之算法進行。可藉由以下進行用於比較之序列的最佳比對：Smith及Waterman, Adv. Appl. Math.2: 482 (1981)之局部同源算法；Needleman及Wunsch, J. MoL Biol.48: 443 (1970)之同源比對算法；Pearson及Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.85: 2444 (1988)之相似性方法檢索；此等算法之電腦化實施(Wisconsin Genetics軟體包, 遺傳學電腦小組(Genetics Computer Group), 575名科學博士, Madison, WI中的GAP、BESTFIT、FASTA以及TFASTA)；或藉由目測。

核酸之相同類型同源性可藉由例如Zuker, M. Science244:48-52, 1989, Jaeger等人 Proc. Natl. Acad. Sci. USA86:7706-7710, 1989, Jaeger等人 Methods Enzymol.183:281-306, 1989中所揭示之算法獲得。

應理解，保守性突變及同源性之描述可以任何組合組合在一起，諸如與其中變異體為保守性突變之特定序列具有至少70%同源性的實施例。

由於本說明書論述各種蛋白質及蛋白質序列，應理解，亦揭示可編碼彼等蛋白質序列之核酸。此將包括與特定蛋白質序列相關之所有簡併序列，亦即具有編碼一個特定蛋白質序列之序列的所有核酸以及編碼所揭示之蛋白質序列之變異體及衍生物的所有核酸，包括簡併核酸。因此，雖然各特定核酸序列在本文中可能未寫出，但應瞭解，每一個序列實際上經由所揭示之蛋白質序列揭示及描述於本文中。亦應瞭解，雖然無胺基酸序列指示何種特定DNA序列編碼生物體內之該蛋白質，其中本文揭示所揭示蛋白質之特定變異體，但編碼該蛋白質之已知核酸序列亦為已知的且在本文中經揭示及描述。

應理解，存在許多可併入至所揭示之組合物中之胺基酸及肽類似物。舉例而言，存在許多D胺基酸或胺基酸，其具有與表5及表6中所示之胺基酸不同的功能取代基。揭示天然存在之肽的相反立體異構體以及肽類似物之立體異構體。此等胺基酸可容易地藉由用具有選擇及工程改造之基因構築體的胺基酸填充tRNA分子而併入至多肽鏈中，該等構築體利用例如琥珀密碼子以位點特異性方式將類似物胺基酸插入至肽鏈中。

可產生類似於肽但未經由天然肽鍵連接之分子。例如，胺基酸或胺基酸類似物之鍵聯可包括CH ₂NH--、--CH ₂S--、--CH ₂-CH ₂--、--CH=CH-- (順式及反式)、--COCH ₂--、--CH(OH)CH ₂--及--CHH ₂SO-(此等及其他可見於Spatola, A. F. 在 Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins中, B. Weinstein, 編, Marcel Dekker, New York, 第267頁 (1983); Spatola, A. F., Vega Data(1983年3月), 第1卷, 第3期, Peptide Backbone Modifications (一般性綜述); Morley, Trends Pharm Sci(1980) 第463-468頁; Hudson, D. 等人, Int J Pept Prot Res 14:177-185 (1979) (--CH ₂NH--, CH ₂CH ₂--); Spatola等人. Life Sci38:1243-1249 (1986) (--CH H ₂--S); Hann J. Chem. Soc Perkin Trans. I 307-314 (1982) (--CH--CH--，順式及反式); Almquist等人. J. Med. Chem. 23:1392-1398 (1980) (--COCH ₂--); Jennings-White等人. Tetrahedron Lett23:2533 (1982) (--COCH ₂--); Szelke等人. European Appln, EP 45665 CA (1982): 97:39405 (1982) (--CH(OH)CH ₂--); Holladay等人. Tetrahedron. Lett 24:4401-4404 (1983) (--C(OH)CH ₂--); 及Hruby Life Sci31:189-199 (1982) (--CH ₂--S--)；各文獻以引用的方式併入本文中。尤佳非肽鍵聯為--CH ₂NH--。應理解，肽類似物在鍵原子，諸如b-丙胺酸、g-胺基丁酸及其類似物之間可具有超過一個原子。

胺基酸類似物及類似物及肽類似物通常具有增強的或期望的特性，諸如較低成本的生產、較高的化學穩定性、增強的藥理學特性(半衰期、吸收、效能、功效等)、改變的特異性(例如生物活性之廣譜)、降低的抗原性及其他特性。

D-胺基酸可用於產生更穩定的肽，因為D胺基酸不由肽酶等識別。用相同類型之D-胺基酸對共同序列之一或多個胺基酸系統替換(例如D-離胺酸替代L-離胺酸)可用以生成更加穩定的肽。半胱胺酸殘基可用於將兩種或更多種肽環化或連接在一起。此可有益於將肽約束為特定構形。 6.    醫藥載劑/醫藥產品遞送

如上文所描述，組合物亦可在醫藥學上可接受之載劑中活體內投與。「醫藥學上可接受」意謂材料不是生物學上或其他方面不合需要的，亦即，該材料可與核酸或載體一起向個體投與，而不會引起任何不合需要之生物效應或以有害方式與含有其之醫藥組合物之其他組分中之任一者相互作用。載體應天然選定以使活性成份之分解降至最低且使個體中的任何有害副作用降至最低，如應為熟習此項技術者所熟知。

組合物可經口、非經腸(例如靜脈內)、藉由肌肉內注射、藉由腹膜內注射、經皮、體外、局部或其類似方式投與，包括局部鼻內投與或藉由吸入劑投與。如本文所用，「局部鼻內投藥」意謂組合物經由一或兩個鼻孔遞送至鼻及鼻腔通道且可以包含藉由噴霧機構或滴液機構遞送，或經由核酸或載體之氣溶膠化來遞送。藉由吸入劑投與組合物可以經由鼻或口部、經由噴霧或滴液機構遞送來完成。亦可經由插管直接遞送至呼吸系統的任何區域(例如肺)。所需組合物之確切量將隨各個體而變化，視個體之物種、年齡、體重及一般狀況、所治療之過敏性病症之嚴重程度、所用特定核酸或載體、其投與模式及其類似因素而定。因此，不可能指定每一組合物之確切量。然而，可由一般熟習此項技術者僅使用本文中之教示給出的常規實驗來確定適量。

若使用，則該組合物之非經腸投與的一般特徵為注射。可注射劑可製備成習知形式，液體溶液或懸浮液形式，適於溶於或懸浮於液體中後再注射之固體形式，或乳液形式。最近修訂的用於非經腸投與之方法涉及使用緩慢釋放或持續釋放系統，使得維持恆定劑量。參見例如美國專利第3,610,795號，其以引用的方式併入本文中。

材料可呈溶液、懸浮液形式(例如併入至微粒、脂質體或細胞中)。此等抗體可經由抗體、受體或受體配位體靶向特定細胞類型。以下參考文獻為使用此技術靶向腫瘤組織之特定蛋白質的實例(Senter等人, Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991); Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989); Bagshawe, 等人, Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988); Senter, 等人, Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993); Battelli, 等人, Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992); Pietersz及McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992); 及Roffler, 等人, Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991))。媒劑，諸如「隱形(stealth)」及其他抗體結合脂質體(包括靶向結腸癌瘤的脂質介導之藥物)、經由細胞特異性配位體的DNA之受體介導靶向、淋巴球引導之腫瘤靶向及活體內鼠類神經膠質瘤細胞之高度特異性治療性反轉錄病毒靶向。以下參考文獻為使用此技術靶向腫瘤組織之特定蛋白質的實例(Hughes等人, Cancer Research, 49:6214-6220, (1989); 及Litzinger及Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992))。一般而言，受體涉及組成型或配位體誘導之胞吞作用路徑。經網格蛋白塗佈之凹點中的此等受體簇經由經網格蛋白塗佈之小泡進入細胞，通過酸化胞內體，受體在該酸化胞內體中經分選，且隨後再循環至細胞表面，在細胞內儲存，或在溶酶體中降解。內化途徑提供多種功能，諸如養分吸收、活化蛋白質移除、大分子清除、病毒及毒素機會性進入、配位體之解離及降解以及受體水準調控。視細胞類型、受體濃度、配位體類型、配位體價數及配位體濃度而定，許多受體遵循超過一個細胞內路徑。已審查受體介導之胞吞作用之分子及細胞機制(Brown及Greene, DNA and Cell Biology10:6, 399-409 (1991))。 7.    治療癌症之方法

本文所揭示之質體、載體及經修飾NK細胞及NK T細胞可用於治療、抑制、緩解、減少、改善及/或預防任何其中發生不受控之細胞增殖的疾病，諸如癌症。近年來癌症免疫療法已取得進展；基因修飾之嵌合抗原受體(CAR) T細胞為成功用於癌症免疫療法中之經工程改造之免疫細胞的極佳實例。此等細胞最近經FDA批准用於治療CD19+B細胞惡性病，但迄今為止成功受限於攜有幾個可靶向抗原之疾病，且靶向此類有限抗原譜系易於因免疫逃逸而失效。此外，由於同種異體T細胞所引起之移植物抗宿主病(GvHD)之風險，在使用自體T細胞上聚焦CAR T細胞。相比之下，NK細胞能夠以抗原非依賴性方式殺死腫瘤目標且不引起GvHD，使其成為癌症免疫療法之良好候選物。應理解且在本文中經審慎考慮，所揭示之質體及方法可用於產生例如CAR NK T細胞及CAR NK細胞以靶向癌症。

因此，本文揭示治療、減少、緩解、抑制、改善及/或預防個體之癌症及/或癌轉移(諸如，急性淋巴球性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛細胞白血病(HCL)及/或骨髓發育不良症候群(MDS))的方法，其包含向患有癌症之個體投與本文所揭示之任何經修飾細胞(例如經修飾NK細胞及NK T細胞)。在一些態樣中，本文揭示一種治療、減少、緩解、抑制、改善及/或預防個體之癌症及/或癌轉移(諸如，急性淋巴球性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛細胞白血病(HCL)及/或骨髓發育不良症候群(MDS))的方法，其包含向個體投與治療有效量之自然殺手(NK)細胞或NK T細胞，其中NK細胞或NK T細胞包含供與規律間隔重複短回文序列簇(CRISPR)/CRISPR相關9 (Cas9)整合系統起使用的質體，其中該質體依序包含左同源臂、編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽(諸如，靶向CD33之CAR)之聚核苷酸序列及右同源臂；其中左右同源臂之長度各自為1000bp或更短(例如600 bp)。

「抑制(inhibit)」、「抑制(inhibiting)」及「抑制(inhibition)」意謂減小活性、反應、病狀、疾病或其他生物學參數。此可包括但不限於活性、反應、病狀或疾病之完全去除。此亦可包括例如活性、反應、病狀或疾病相比於原生或對照水準降低10%。因此，相比於天然或對照水準，減少可為10、20、30、40、50、60、70、80、90、100%減少或其間之任何減少量。

「減少(reduce)」或其他形式之字組，諸如「減少(reducing)」或「減少(reduction)」意謂減少事件或特徵(例如腫瘤生長)。應理解，此通常係相對於一些標準或期望值，換言之，其為相對的，但其並非始終為所參考之標準或相對值所必需的。舉例而言，相對於標準或對照而言，「減緩腫瘤生長」意謂減緩腫瘤生長速率。

「預防(prevent)」或其他形式之字組，諸如「預防(preventing)」或「預防(prevention)」，意謂停止特定事件或特徵，以使特定事件或特徵之發展或進展穩定或延遲，或使將出現特定事件或特徵之機會降至最低。預防並不需要與對照比較，此係因為其通常比(例如)減少更絕對。如本文所用，可減少但不預防某物，但亦可預防經減少之某物。同樣地，可預防某物但不減少某物，但亦可減少經預防之某物。應理解，當使用減少或預防時，除非另外特別指示，否則亦明確地揭示另一字組之使用。

術語「治療」係指患者之醫療管理，旨在治癒、改善、穩定或預防疾病、病理性病狀或病症。此術語包括積極治療，亦即特別旨在改善疾病、病理性病狀或病症之治療，且亦包括病因治療，亦即旨在移除相關疾病、病理性病狀或病症之病因的治療。此外，此術語包括緩解性治療，亦即，設計用於緩解症狀而非治癒疾病、病理性病狀或病症之治療；預防性治療，亦即，旨在最小化或部分地或完全地抑制相關疾病、病理性病狀或病症之發展的治療；及支持性治療，亦即，用於補助另一旨在改善相關疾病、病理性病狀或病症之特定療法的治療。

術語「個體」係指作為投與或治療之目標的任何個體。個體可為脊椎動物，例如哺乳動物。在一個態樣中，個體可為人類、非人類靈長類動物、牛、馬、豬、犬或貓。個體亦可為天竺鼠、大鼠、倉鼠、兔、小鼠或鼴鼠。因此，個體可為人類或獸醫學患者。術語「患者」係指在臨床醫師(例如醫師)治療下之個體。

如上所述，本文所揭示之質體、載體及經修飾NK細胞及NK T細胞可用於治療、抑制、緩解、減少、改善及/或預防癌症。本發明組合物可用於治療之癌症的代表性但非限制性清單為以下：淋巴瘤、B細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、蕈樣黴菌病、霍奇金氏病、急性淋巴球性白血病(ALL)、毛細胞白血病(HCL)、骨髓發育不良症候群(MDS)、骨髓白血病(包括但不限於急性骨髓性白血病(AML)及慢性骨髓性白血病(CML))、膀胱癌、腦癌、神經系統癌、頭頸癌、頭頸部鱗狀細胞癌、肺癌(諸如小細胞肺癌及非小細胞肺癌)、神經母細胞瘤/神經膠母細胞瘤、卵巢癌、皮膚癌、肝癌、黑素瘤、口部鱗狀細胞癌、喉癌、喉頭癌及肺、宮頸癌、子宮頸癌、乳癌及上皮癌、腎癌、泌尿生殖癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌瘤、大型腸癌、造血癌；睪丸癌；大腸癌、直腸癌、前列腺癌或胰臟癌。

如貫穿本發明所指出，所揭示之經修飾NK細胞理想地適合用於免疫療法，諸如經修飾之授受性轉移(亦即工程改造NK細胞至有需要之個體)。因此，在一個態樣中，本文揭示將經工程改造之NK細胞授受性轉移至有需要之個體的方法，該方法包含a)獲得待修飾之NK細胞；b)獲得包含與對應CRISPR/Cas引導RNA複合之2類CRISPR/Cas核酸內切酶(Cas9)的核糖核蛋白(RNP)複合體及包含有包含轉殖基因(諸如用於腫瘤抗原之嵌合抗原受體)之質體的AAV載體；其中轉殖基因側接同源臂；且其中同源臂小於1000 bp；及c)將該轉殖基因及該RNP複合體引入至NK細胞中；其中經由用腺相關病毒(AAV)感染至NK細胞中而將轉殖基因引入至細胞中；其中RNP複合體與NK細胞之基因體DNA內的目標序列雜交且NK細胞之DNA修復酶將轉殖基因在目標序列處插入至目標細胞之基因體DNA內的宿主基因體中(例如藉由同源修復)，由此產生經工程改造之NK細胞；及d)將工程改造NK細胞轉移至個體中。在一個態樣中，轉殖基因可包含於與Cas9核酸內切酶相同之質體上或編碼於相同或不同AAV載體中之第二質體上。在一個態樣中，目標細胞可在用包含AAV之轉殖基因感染細胞之前或與其同時經由電穿孔用RNP複合體轉導。

在一個態樣中，所揭示之免疫療法方法中所用之經修飾細胞(例如NK細胞)可為來自供體來源(諸如用於授受性轉移療法之同種異體供體來源或自體供體來源(亦即經修飾細胞之最終接受者)、細胞株(包括但不限於NK細胞株NK RPMI8866；HFWT、K562及EBV-LCL)之初級細胞，或自擴增細胞來源得到初級細胞來源或細胞株。因為可使用初級細胞，所以應理解且在本文中經審慎考慮，可離體或活體外進行所揭示之細胞修飾。

本文亦揭示一種質體，其依序包含左同源臂、編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽之聚核苷酸序列及右同源臂；其中左右同源臂之長度各自為1000 bp或更短。

在另一態樣中，本文揭示如本文所揭示用作藥劑之質體、AAV載體或經修飾細胞。本文亦揭示如本文所揭示用於製造藥劑之質體、AAV載體或經修飾細胞之用途。

本文亦揭示如本文所揭示用於治療癌症之質體、AAV載體或經修飾細胞。本文亦揭示如本文所揭示用於製造供治療癌症用之藥劑的質體、AAV載體或經修飾細胞之用途。

本文亦揭示一種CAR NK細胞，其藉由使用產生如本文所揭示用於治療癌症之嵌合抗原受體(CAR)自然殺手(NK)細胞或NK T細胞之方法產生。本文亦揭示CAR NK細胞之用途，其藉由使用產生如本文所揭示用於製造供治療癌症用之藥劑的嵌合抗原受體(CAR)自然殺手(NK)細胞或NK T細胞之方法產生。 實例

提供以下實例以向一般熟習此項技術者提供如何製造及評估本文中主張之化合物、組合物、物品、裝置及/或方法之完全揭示內容及說明，且意欲僅為例示性且不意欲限制本發明。已儘力確保關於數字(例如量、溫度等)之準確度，但應考慮一些誤差及偏差。除非另外指明，否則份數為重量份，溫度以℃為單位或在環境溫度下，且壓力為大氣壓或接近大氣壓。 8.    實例1：使用同源重組及由AAV6遞送之CRISPaint在初級人類自然殺手細胞中進行高效定點基因插入

使用本文所描述之方法，成功產生高效且穩定的經修飾人類初級NK細胞，包括展示增強之抗AML活性之兩個CAR NK細胞。 a)    方法  (1)  人類NK細胞純化及擴增.

NK細胞如先前所述純化。簡言之，自PBMC分離NK細胞，該PBMC使用RosetteSep™人類NK細胞增濃混合液自健康個體收集(圖1A)。使用流動式細胞測量術將純化之NK細胞表型分型為＞90% CD3陰性/CD56陽性群體(圖3A)。在純化當天，此等細胞用表現4-1BBL及膜結合IL-21 (FC21)的經輻射K562餵養細胞以2:1 (餵養細胞:NK)之比率刺激(圖1A)。將經刺激之細胞在含有50 IU/mL IL-2之無血清AIM-V/ICSR擴增培養基中培養7天。 (2)  ATAC-seq分析.

在加工用於ATAC-seq之前，以100,000個活細胞/小瓶等分試樣冷凍保存新近分離(未處理)、FC15擴增及FC21擴增NK細胞。如先前所述進行ATAC-seq。使用Illumina HiSeq 2500在50 bp成對末端讀段下定序DNA庫。 (3)  Cas9/RNP電穿孔用於靶向NK細胞中之AAVS1.

使用一個gRNA (crRNA：5'GGGGCCACTAGGGACAGGAT) (SEQ ID NO: 17)經由如先前所述將Cas9/RNP電穿孔至第七天擴增NK細胞中靶向AAVS1。簡言之，收集3×10 ⁶個擴增NK細胞且用13 ml PBS洗滌兩次，繼而以400 g離心5分鐘且抽吸PBS。使細胞集結粒再懸浮於20 μl P3初級細胞4D-Nucleofector溶液中。將靶向AAVS1之5 μl預複合之Cas9/RNP (ALT-R® CRISPR-Cas9 crRNA、ALT-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA及ALT-R® S.p. HiFi Cas9核酸酶V3) (Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, Iowa)及1 μl 100 μM電穿孔強化子(ALT-R® Cas9電穿孔強化子)添加至細胞懸浮液中。將26 μl CRISPR反應物之總體積轉移至4D-Nucleofector ^TM16孔盤中且使用程式EN-138電穿孔(圖3B)。在電穿孔之後，將細胞轉移至12孔盤中含有50 IU之IL-2的2 ml培養基中且在37度及5% CO ₂氣壓下培育。電穿孔後兩天，用2×10 ⁶個餵養細胞刺激細胞，且向細胞懸浮液中添加補充有50 IU之8ml新鮮培養基且保存於T25燒瓶中。 (4)  ICE突變偵測分析.

為了量測AAVS1KO NK細胞中之插入或缺失率，使用表1中提及之正向及反向引子，使用PCR來擴增Cas9/RNP靶向位點。使用桑格定序(sanger sequencing)對擴增子進行定序，且使用ICE分析結果。 (5)  RNA-seq樣品製備及定序.

使用Total RNA Purification Plus套組(Norgen Biotek, Ontario, Canada)自未處理靜息、擴增靜息、未處理IL-21刺激及第七天FC21擴增NK細胞純化總RNA。所得總RNA在Nanodrop ND-1000分光光度計中定量，在Bioanalyzer-2100裝置(Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA)中檢查純度及完整性，且提交至全國兒童醫院研究所(Nationwide Children's Hospital)之基因體學中心進行定序。根據製造商建議之方案，使用TruSeq RNA樣品製備套組(Illumina Inc.)製備庫。庫品質經由Agilent 4200 Tapestation使用高靈敏度D1000 ScreenTape分析套組測定且藉由KAPA qPCR (KAPA BioSystems)定量。使用Illumina HiSeq4000平台產生每個庫大致6-8千萬個成對末端150 bp序列讀段。

使用剪接感知比對器STAR版本2.5.2b將各樣品定序讀段與NCBI之智人參考之GRCh38.p9總成比對。使用來自NCBI之總成的GFF檔案，用HTSeq計算特徵覆蓋度計數(feature coverage count)。使用GFF之特徵類型、外顯子及特徵識別符、基因id的預設選項鑑別RNA-Seq分析之特徵。使用定製Perl指令碼來進行樣品製備及比對之品質控制檢查，該檢查使用STAR映射品質度量對讀段類型進行計數且對與由來自NCBI之總成的特徵表所界定的各特徵類別之讀段比對的數目進行計數。 (6)  AAV6產生.

選殖至ssAAV或scAAV質體中的轉殖基因封裝於AAV6衣殼中，如先前所述。 (7)  組合Cas9/RNP及AAV6以產生mCherry及CAR NK細胞.

在實驗操作前一天，在NK細胞擴增之第6天進行培養基更換及以5×10 ⁵個細胞/毫升再懸浮。NK細胞接著在第7天用Cas9/RNP靶向AAVS1電穿孔，如上文所描述。在電穿孔之後三十分鐘，收集3×10 ⁵個活細胞且以1×10 ⁶個細胞/毫升再懸浮於24孔盤中含有50 IU IL-2 (Novartis)之培養基中，總體積為300 μl。對於用ssAAV6或scAAV6遞送HR或CRISPaint DNA編碼mCherry或CD33CAR之各種轉導條件，吾等以300 K MOI (若需要，10-500 K MOI)轉導3×10 ⁵個電穿孔細胞。陰性對照包括未經電穿孔、用Cas9/RNP電穿孔但不經AAV轉導或經300 K MOI之AAV6轉導而不用Cas9/RNP電穿孔之NK細胞。在電穿孔及轉導後當天，吾等添加300 μl含有50 IU IL2之新鮮培養基至各孔，而不更換舊培養基。細胞在電穿孔之後保持在培養物中48小時，且接著用2×10 ⁶個餵養細胞再刺激且保持在12孔盤中含有50 IU之2 ml培養基之總體積，而不更換舊培養基。48小時後，將補充有IL2之8 ml新鮮培養基添加至細胞中，將10 ml總體積保持在T25燒瓶中。在轉導後第7天，細胞用餵養細胞以1:1之比率再刺激且生長又一週，每2天向細胞中添加新鮮培養基。 (8)  流動式細胞測量術用於偵測CAR-NK細胞.

在電穿孔之後7天及14天，用含有含2% FBS之PBS的染色緩衝液洗滌5×10 ⁵個NK細胞兩次。接著，將2.5 μg重組人類唾液酸結合免疫球蛋白樣凝集素(siglec)-3/CD33 Fc嵌合體蛋白(CF；R&D systems #1137-SL-050)以80 μl總體積添加至細胞懸浮液中，且在4℃下培育30分鐘。用染色緩衝液洗滌細胞兩次，隨後用含2 μl Alexa Fluor® 647親和純化山羊抗人類IgG Fcγ片段特異性(Jackson ImmunoResearch #109-605-098)之200 μl染色緩衝液以1:100之比率染色，且在4℃下保持30分鐘。染色後，細胞用染色緩衝液洗滌兩次，接著在MacsQuant流式細胞儀上獲取。使用FlowJo軟體(FlowJo, LLC)分析流動式細胞測量術資料。 (9)  細胞毒性分析.

如先前所描述，使用鈣黃綠素-乙醯氧基甲基-釋放分析進行細胞毒性分析3-4小時。針對 Kasumi-1 、 HL60或 AML10細胞在如圖8中所界定之標目標:效應子之不同比率下評定細胞毒性。 (10)       CD107a染色.

NK細胞及癌細胞以10:1比率共培養且在96孔盤中用20 μl PE小鼠抗人類CD107a抗體(BD Pharmingen™, #555801)以220 μl總體積補充。吾等將該盤保持在37℃培育箱中90分鐘。隨後，用染色緩衝液洗滌細胞一次且收集以便用MacsQuant流式細胞儀獲取。 (11)       對轉殖基因整合的基於PCR之偵測.

使用2對引子進行進出PCR (圖9A及圖9B及表2)，該等引子經設計於CD33CAR構築體內部或外部。吾等亦添加一組引子以擴增Cas9靶向及轉殖基因整合位點之1200 bp左右側接區域(圖9C)。使用Platinum™ Taq DNA聚合酶高保真度套組(Thermofisher #11304011)進行PCR。

TLA.對於CD33CAR-Gen2整合之基因體圖譜，吾等使用TLA技術(Cergentis B.V.)。關於細節，參見圖9C。 b)    結果  (1)  使用FC21擴增NK細胞提供基因插入之最佳條件.

酶促反應調控CRISPaint及HR。CRISPaint係LIG4依賴性製程，而諸如BRCA1及BRCA2之其他蛋白質調控HR。因此，在新近分離或用表現膜結合IL-21之餵養細胞(FC21) (n=4)刺激之後七天的NK細胞中分析此等基因之表現量，以評估哪一修復路徑在此細胞類型中及在哪一擴增階段中更高效(圖1A，圖3A及圖3B)。RNA-seq分析展示第七天擴增NK細胞相比於未處理NK細胞具有更高的BRCA1及BRCA2表現。另外，在此等細胞中LIG4水準不降低；然而，LIG1 (其為DNA修復酶)水準在擴增細胞中顯著較高(圖1B及圖1C)，在第7天擴增NK細胞中經由CRISPaint為HR或NHEJ引導之基因插入提供最佳條件。 (2)  針對基因插入的基因體安全港之成功靶向.

基因體安全港(GSH)為基因體中之位點，該基因體可經修飾而宿主細胞之正常功能無變化且允許轉殖基因之充分表現。針對NK細胞中之基因插入，選擇腺相關病毒位點1 (AAVS1)，其為GSH中之一者及磷酸酶1調控次單元12C (PPP1R12C)基因內之例示性基因座。此基因座已成功地用於將基因插入至若干細胞類型中。首先，未處理及擴增NK細胞(n=2)中AAVS1之染色質可達性係藉由ATAC-seq分析評估，且展示FC21擴增NK細胞中之染色質可達性相比於未處理NK細胞沒有降低(圖1D)。接下來，使用一個gRNA經由將Cas9/RNP電穿孔至第七天擴增NK細胞中來靶向AAVS1。48小時之後，分離NK細胞DNA以用於使用CRISPR Edits (ICE)之推斷偵測CRISPR編輯之NK細胞中的插入或缺失(Indel)，以分析插入或缺失之頻率。ICE結果展示至多85%經CRISPR修飾之NK細胞在AAVS1 Cas9靶向位點處具有至少一個插入或缺失(圖1E)。為了確保此基因座處之基因體修飾不干擾NK細胞靶向癌細胞之能力，針對Kasumi-1 (急性骨髓性白血病(AML)癌細胞株)評定AAVS1KO NK細胞之細胞毒性。使用鈣黃綠素AM分析，未觀測到野生型與經CRISPR修飾之NK細胞的殺死能力差異(圖3C)。 (3)  使用單股AAV6及Cas9/RNP之組合成功產生表現mCherry之初級人類NK細胞.

對於HDR介導之基因插入，將針對AAVS1基因座中cas9靶向位點之右側位點側接區域具有800 bp HA且針對左側具有1000 bp HA的DNA編碼mCherry選殖至單股AAV質體之主鏈中且封裝至AAV6病毒衣殼中。構築體經設計以在轉殖基因下游具有剪接接受體，從而改良mCherry基因之轉錄(圖2A)。如方法中所描述，NK細胞用Cas9/RNP靶向AAVS1電穿孔，且在半小時之後，細胞用300 K MOI或500 K MOI之AAV6轉導(圖2C)。由此產生17% (300 K MOI)及19% (500 K MOI) mCherry陽性NK細胞，電穿孔後48小時使用流動式細胞測量術對其評估。此等細胞進一步使用FC21擴增一週且藉由FACS分選增濃mCherry陽性細胞。由此產生增濃之mCherry陽性NK細胞群(77% mCherry陽性NK細胞在300 K MOI下轉導，及86% NK細胞用500 K MOI之ssAAV6轉導)。此等細胞使用餵養細胞再刺激，且再擴增30天且未觀測到mCherry之表現量降低(圖4A，圖4B及圖4C)。 (4)  藉由使用自互補AAV6及Cas9/RNP改良基因插入.

如先前所描述，在進入宿主細胞中之後，與ssAAV相比，scAAV載體可在更短時間範圍內變成雙股。其可增加NK細胞中之基因插入效率。為了測試這一點，使用scAAV6且將其與Cas9/RNP組合來改善ssAAV6方法之基因插入結果。由於scAAV中封裝轉殖基因之尺寸限制，所以設計若干長度之HA以為將具有不同大小的轉殖基因選殖至scAAV主鏈中提供廣泛範圍的可能性。因此，將右側HA為30 bp、300 bp、500 bp及1000 bp及左側HA為30 bp、300 bp、500 bp及800 bp之DNA編碼mCherry (圖2A)選殖至scAAV主鏈中且封裝至AAV6衣殼中。接著針對ssAAV區部遵循與先前所描述相同的步驟，以電穿孔及轉導第7天擴增NK細胞。此方法顯著增加產生表現mCherry之NK細胞之效率，其中陽性百分比報導如下：30 bp (19-20%)、300 bp (80-85%)、500 bp (75-85%)及800 bp (80-89%) (圖4A及圖4B)。此等細胞可使用餵養細胞進一步擴增超過3週且不見表現mCherry之NK細胞百分比之任何下降，從而展示穩定的外源基因表現。儘管由於scAAV之尺寸限制，此等載體無法用於產生CAR NK細胞，但mCherry可被視為產生能夠產生高效且穩定之外源蛋白質的NK細胞的概念驗證。當Cas9/RNP電穿孔及AAV6轉導之相同方法用於新近分離之NK細胞中時，mCherry表現之百分比顯著較低(ss800bp AAV6 1.13%及sc300bp AAV6 2.9%，圖5)。基於此等觀測結果，使用FC21擴增NK細胞。 (5)  CRISPaint可用於NK細胞中之基因插入.

為克服在HDR引導之基因插入中見到的HA最佳化之複雜性，測試稱為CRISPaint之同源性非依賴性基因插入方法。對於CRISPaint DNA模板，將AAVS1 (PAMgPAMg)之雙重Cas9靶向序列併入mCherry轉殖基因周圍，但在scAAV ITR內，且將其封裝至AAV6中(圖2B)。此處亦針對HR引導之基因插入進行用於電穿孔及轉導NK細胞的方法。在電穿孔及轉導之後兩天且在擴增之前，進行流動式細胞測量術以評定NK細胞中之mCherry表現。經電穿孔且用300 K MOI之scAAV6轉導遞送CRISPaint PAMgPAMg的細胞具有至多6% mCherry陽性。此等細胞可進一步經分選及增濃至多77%表現mCherry之NK細胞且使用FC21擴增30天，且不見mCherry陽性NK細胞百分比降低(圖4B及圖4C)。儘管發現使用CRISPaint之基因整合效率與HR引導之基因插入相比較低，但仍需要此方法，因其允許研究人員將相關基因整合至使用者界定之基因座中而無需設計同源臂。 (6)  成功產生人類初級CD33 CAR NK細胞.

為產生CD33靶向CAR NK細胞，設計兩種構築體(Gen2及Gen4v2)。本文所用之CAR含有相同scFv，該scFv來源於CD33單株抗體、隨後CD4及CD28作為共刺激域，以及Gen2及NKG2D之CD3z、2B4隨後為Gen4v2之CD3z (圖6A及圖6B)。為改良大於mCherry之CAR之表現量，而非使用剪接接受體，併入鼠白血病病毒源性(MND)啟動子，其為CAR之起始密碼子之前的造血系統中之高度及組成型活性啟動子。接著將DNA編碼CD33CAR用針對AAVS1靶向位點之600bp HA選殖至ssAAV主鏈中且將其封裝至AAV6衣殼中。電穿孔及轉導後七天，使用流動式細胞量測術分析NK細胞上CAR表現且偵測到至多78%陽性表現CD33 CAR之NK細胞(Gen2平均59.3%，且Gen4v2在轉導後第14天平均60%)。與Gen4v2相比，觀測到NK細胞上表現之CD33CAR-Gen2之較高平均螢光強度(MFI) (圖6C及圖6D)。接著，細胞擴增再在餵養細胞上且生長一週(第14天)且在第7天與第14天CAR NK細胞之間未展示CAR表現之顯著降低(圖6E)。與野生型細胞相比，基因操作亦對表現CAR之細胞的擴增不具有任何顯著影響(圖6F)。冷凍及解凍過程對CAR表現及增強之CAR NK細胞的細胞毒性亦無任何負面影響(圖7A及圖7B)。接著，使用PCR證實DNA編碼轉殖基因在DNA層面之整合(圖9A及圖9B)。另外，目標基因座擴增(TLA)技術用於CD33CAR-Gen2整合之整個基因體映射，其中偵測隨機整合之靈敏度超過5%且表明在一小組樣品中載體在染色體19中之目標位置處正確整合。對於充足的脫靶整合位點不存在指示。在樣品1序列變異體及樣品4結構變異體中偵測到，其指示至少在該樣品之子組中發生不正確靶向事件。另外，亦在一小組樣品的chr19中鑑別到隨機整合(圖9C)。亦展示，將病毒濃度降低至10 K MOI亦可用於CD33CAR-Gen2 NK細胞生產(圖10A及圖10B)。 (7)  人類初級CAR NK細胞具有增強之抗腫瘤活性.

為研究初級人類CD33CAR NK細胞針對表現CD33之AML細胞的細胞毒性作用，進行基於鈣黃綠素AM之細胞毒性分析。使用被稱為 Kasumi-1及 HL60的兩種不同的表現CD33之AML細胞株(圖11)，且將其與自三個不同健康個體所收集之末梢血液分離的NK細胞共培養。與野生型或 AAVS1 ^KO NK細胞相比，當與 Kasumi-1或 HL60共培養時，CD33CAR-gen2及CD33CAR-gen4v2 NK細胞展示顯著較高的CD107a (NK細胞脫粒標記)表現量。此亦引起CD33CAR NK細胞的顯著較高的 Kasumi-1之比溶胞率。亦觀測到CD33CAR-Gen2針對HL60之較高殺死能力(圖8A-8F)。藉由進行針對K562慢性骨髓性白血病(CML)之細胞毒性分析，展示CD33CAR NK細胞針對表現CD33之癌細胞的增強之腫瘤殺死特異性，且不見NK細胞殺死能力的任何改善(圖8I及圖12)。重要地，觀測到CD33CAR NK細胞針對 AML-10 (來源於復發性患者之初級人類AML)之顯著較高抗腫瘤活性(圖8G及8H，圖12)。總體而言，與CD33CAR-Gen4v2 NK細胞相比，CD33CAR-Gen2 NK展示較好細胞毒性。 c)    論述

在初級人類NK細胞中進行基因修飾始終具有挑戰性；本文中報導一種使用經由HR及同源非依賴性基因插入(CRISPaint)的Cas9/RNP及單股或自互補AAV6基因遞送之電穿孔之組合而向人類初級NK細胞中進行的成功高效定點基因整合。此處首次展示人類NK細胞中調控HR及NHEJ路徑之基因之表現量在擴增期間用FC21改變之程度，且提供針對定點基因插入之最佳條件。亦表明AAVS1可以高效水準承載及表現外源基因，如先前在T細胞及NK細胞中所示。此外，展示可用於在NK細胞中之AAVS1基因座中之基因插入的30-1000 bp之HA範圍，但在scAAV6中使用時最短最佳長度係300 bp。此有助於研究人員基於用於引入NK細胞中之外源性DNA之尺寸選擇最佳HA。CRISPaint基因插入可用於標記內源性基因且用於研究NK細胞中蛋白質之生物學。

使用Cas9/RNP及AAV6基因遞送之組合，且產生具有增強之抗AML活性的兩種不同人類初級CD33CAR NK細胞。此等結果亦展示，經遺傳修飾之NK細胞可隨後用FC21擴增，使得能夠產生大量經遺傳修飾之NK細胞用於癌症免疫療法。總體而言，本文中所展示之方法可用於免疫學、癌症免疫療法及研究NK細胞之生物學中之若干應用。

表1.

正向引子	5' TTCTCCTGTGGATTCGGGTCAC 3' (SEQ ID NO: 34)
反向引子	5' CTCTCTGGCTCCATCGTAAGCA 3' (SEQ ID NO: 35)

表2.

條件1
反向-1200bp (1)	TCCTGGGCAAACAGCATAA (SEQ ID NO: 36)
正向-CD33CAR (1)	GAGCTGCAGAAGGACAAGAT (SEQ ID NO: 37)
條件2
反向-CD33CAR (2)	CTCTGTGTCATCTGGATGTCTG (SEQ ID NO: 38)
正向-1200bp (2)	CTTTGAGCTCTACTGGCTTCTG (SEQ ID NO: 39)
條件3
反向-1200bp (1)	TCCTGGGCAAACAGCATAA (SEQ ID NO: 40)
正向-1200bp (2)	CTTTGAGCTCTACTGGCTTCTG (SEQ ID NO: 41)

表3.

引子組	名稱/觀點	方向	序列
1	600bp HA AAVS1	反向	GCGAGTGAAGACGGCATG (SEQ ID NO: 42)
		正向	GTCTGTGCTAGCTCTTCCAG (SEQ ID NO: 43)
2	CD33CAR- Gen2	反向	GCGATGTCAGAAGGGTAAA (SEQ ID NO: 44)
		正向	GGCGGACACTCTGACTACAT (SEQ ID NO: 45)

關於對載體序列具有特異性之2個非依賴性引子組進行TLA (表3)。

序列變異體.所偵測之序列變異體展現於表4中。此變體之頻率可指示所使用之載體之變化。

表4：經鑑別之序列變異體.

				引子組1		引子組2
區域	位置	參考	突變	覆蓋度	%	覆蓋度	%
600bp HA AAVS1	4,116	T	C	193	37	341	14

鑑別結構變異體

發現4個載體-載體斷點。所有融合物位於標註同源臂處。由於樣品之異質性質，預期此等融合物僅存在於樣品子組中。應注意，四種融合物中之三種展示9-12 bp同源性，其可指示技術偏差。

載體 ： 149 ( 頭部 )與 載體 ： 4116 ( 尾部 )經9個同源鹼基融合

載體 ： 149 ( 頭部 )與 載體 ： 4,113 ( 尾部 )經12個同源鹼基融合

載體 ： 155 ( 頭部 )與 載體 ： 4,163 ( 尾部 )經9個同源鹼基融合

載體 ： 158 ( 頭部 )與 載體 ： 4,121 ( 尾部 )經4個同源鹼基融合

C.   參考文獻  Buenrostro, J.D., Giresi, P.G., Zaba, L.C., Chang, H.Y. & Greenleaf, W.J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods10, 1213-1218 (2013). de Vree, P.J. et al. Targeted sequencing by proximity ligation for comprehensive variant detection and local haplotyping. Nat Biotechnol32, 1019-1025 (2014). Dutour, A. et al. In Vitro and In Vivo Antitumor Effect of Anti-CD33 Chimeric Receptor-Expressing EBV-CTL against CD33 Acute Myeloid Leukemia. Adv Hematol2012, 683065 (2012). Foust, K.D. et al. Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS. Mol Ther21, 2148-2159 (2013). He, X. et al. Knock-in of large reporter genes in human cells via CRISPR/Cas9-induced homology-dependent and independent DNA repair. Nucleic Acids Res44, e85 (2016). Hsiau, T. et al. Inference of CRISPR Edits from Sanger Trace Data. bioRxiv, 251082 (2018). Li, K., Wang, G., Andersen, T., Zhou, P. & Pu, W.T. Optimization of genome engineering approaches with the CRISPR/Cas9 system. PLoS One9, e105779 (2014). Li, Y., Hermanson, D.L., Moriarity, B.S. & Kaufman, D.S. Human iPSC-Derived Natural Killer Cells Engineered with Chimeric Antigen Receptors Enhance Anti-tumor Activity. Cell Stem Cell23, 181-192 e185 (2018). Liu, J., Zhou, G., Zhang, L. & Zhao, Q. Building Potent Chimeric Antigen Receptor T Cells With CRISPR Genome Editing. Front Immunol10, 456 (2019). MacLeod, D.T. et al. Integration of a CD19 CAR into the TCR Alpha Chain Locus Streamlines Production of Allogeneic Gene-Edited CAR T Cells. Mol Ther25, 949-961 (2017). Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science339, 823-826 (2013). McCarty, D.M. Self-complementary AAV vectors; advances and applications. Mol Ther16, 1648-1656 (2008). Mendell, J.R. et al. Single-Dose Gene-Replacement Therapy for Spinal Muscular Atrophy. N Engl J Med377, 1713-1722 (2017). Moseman, J.E., Foltz, J.A., Sorathia, K., Heipertz, E.L. & Lee, D.A. Evaluation of serum-free media formulations in feeder cell-stimulated expansion of natural killer cells. Cytotherapy(2020). Naeimi Kararoudi, M. et al. CD38 deletion of human primary NK cells eliminates daratumumab-induced fratricide and boosts their effector activity. Blood(2020). Naeimi Kararoudi, M. et al. Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins. J Vis Exp(2018). Oceguera-Yanez, F. et al. Engineering the AAVS1 locus for consistent and scalable transgene expression in human iPSCs and their differentiated derivatives. Methods101, 43-55 (2016). Pomeroy, E.J. et al. A Genetically Engineered Primary Human Natural Killer Cell Platform for Cancer Immunotherapy. Mol Ther28, 52-63 (2020). Ran, F.A. et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc8, 2281-2308 (2013). Schmid-Burgk, J.L., Honing, K., Ebert, T.S. & Hornung, V. CRISPaint allows modular base-specific gene tagging using a ligase-4-dependent mechanism. Nat Commun7, 12338 (2016). Somanchi, S.S., Senyukov, V.V., Denman, C.J. & Lee, D.A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. J Vis Exp(2011). Song, F. & Stieger, K. Optimizing the DNA Donor Template for Homology-Directed Repair of Double-Strand Breaks. Mol Ther Nucleic Acids7, 53-60 (2017). Suzuki, K. et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature540, 144-149 (2016). D.   序列表 SEQ ID NO: 1 30bp 右同源臂

SEQ ID NO: 2 30bp 左同源臂

SEQ ID NO: 3 300bp 右同源臂

SEQ ID NO: 4 300bp 左同源臂

SEQ ID NO: 5 500bp 右同源臂

SEQ ID NO: 6 500bp 左同源臂

SEQ ID NO: 7 800bp 右同源臂

SEQ ID NO: 8 800bp 左同源臂

SEQ ID NO: 9 PAMg (PAM+ 編碼 crRNA 之序列 )

SEQ ID NO: 10 剪接受體

SEQ ID NO: 11 BGH polyA 終止子

SEQ ID NO: 12 mCherry

SEQ ID NO: 13 30bp 具有併入之 mCherry 轉殖基因的質體 .

SEQ ID NO: 14 300bp 具有併入之 mCherry 轉殖基因的質體 .

SEQ ID NO: 15 500bp 具有併入之 mCherry 轉殖基因的質體 .

SEQ ID NO: 16 800bp 具有併入之 mCherry 轉殖基因的質體 .

SEQ ID NO: 17 (crRNA)

SEQ ID NO: 18 scFV ：

SEQ ID NO: 19 IgG4- 鉸鏈 ：

SEQ ID NO: 20 CD28 ：

SEQ ID NO: 21 CD3z ：

SEQ ID NO: 22 CD33CAR-Gen2 在 ssAAV 主鏈中 選殖 ( 圖 16) ：

ITR1序列對應於SEQ ID NO: 22之核酸位置1-141； MND-CD33CAR-gen2構築體對應於SEQ ID NO: 22之核酸位置156-4118； 左側600 bp同源臂AAVS1對應於SEQ ID NO: 22之核酸位置156-759； MND啟動子對應於SEQ ID NO: 22之核酸位置783-1322； 編碼CD33 CAR gen2之序列對應於SEQ ID NO: 22之核酸位置1329-3362； 編碼scFV-CD33之序列對應於SEQ ID NO: 22之核酸位置1329-2128； 編碼IgG-鉸鏈CD4之序列對應於SEQ ID NO: 22之核酸位置2130-2816； 編碼CD28之序列對應於SEQ ID NO: 22之核酸位置2814-3023； 編碼CD3ζ之序列對應於SEQ ID NO: 22之核酸位置3024-3362； BGHPA對應於SEQ ID NO: 22之核酸位置3372-3518； BGH poly對應於SEQ ID NO: 22之核酸位置3378-3489； 右側600 bp同源臂AAVS1對應於SEQ ID NO: 22之核酸位置3519-4118； ITR2序列對應於SEQ ID NO: 22之核酸位置4127-4267。 SEQ ID NO: 23 CD33CAR-Gen4v2 ( 圖 17) ：

ITR1序列對應於SEQ ID NO: 23之核酸位置1-141； MND-CD33CAR-gen2構築體對應於SEQ ID NO: 23之核酸位置156-4415； 左側600 bp同源臂AAVS1對應於SEQ ID NO: 23之核酸位置156-759； MND啟動子對應於SEQ ID NO: 23之核酸位置783-1322； 編碼CD33 CAR gen2之序列對應於SEQ ID NO: 23之核酸位置1329-3659； 編碼scFV-CD33之序列對應於SEQ ID NO: 23之核酸位置1329-2129； 編碼IgG-鉸鏈CD4之序列對應於SEQ ID NO: 23之核酸位置2130-2816； 編碼NKG2D TM之序列對應於SEQ ID NO: 23之核酸位置2817-2909； 編碼2B4之序列對應於SEQ ID NO: 23之核酸位置2934-3293； 編碼CD3ζ之序列對應於核酸位置3318-3659； BGHPA對應於SEQ ID NO: 23之核酸位置3669-3815； BGH poly對應於SEQ ID NO: 23之核酸位置3675-3786； 右側600 bp同源臂AAVS1對應於SEQ ID NO: 23之核酸位置3816-4415； ITR2序列對應於SEQ ID NO: 23之核酸位置4424-4564。 SEQ ID NO: 24 NKG2D 跨膜域：

SEQ ID NO: 25 連接子：

SEQ ID NO: 26 2B4 ：

SEQ ID NO: 27 連接子：

SEQ ID NO: 28 CD3z ：

SEQ ID NO: 29 ，抗 CD33 ScFv.

SEQ ID NO: 30 ， MND 啟動子

SEQ ID NO: 31, 600bp, LHA, AAVS1 (gen4v2及gen2)

SEQ ID NO: 32, 600bp, RHA, AAVS1 (gen4v2及gen2)

SEQ ID NO: 33 ，靶向 AAVS1 之 gRNA 序列

SEQ ID NO: 50 (PAMgPAMg mCherry構築體，圖22)

第一PAM序列對應於SEQ ID NO: 50之核酸位置1-3； 編碼crRNA之第一序列對應於SEQ ID NO: 50之核酸位置4-23； 剪接受體序列對應於SEQ ID NO: 50之核酸位置47-85； mCherry密碼子(最佳化)對應於SEQ ID NO: 50之核酸位置86-793； BGHpA序列對應於SEQ ID NO: 50之核酸位置803-949； 第二PAM序列對應於SEQ ID NO: 50之核酸位置950-952； 編碼crRNA之第二序列對應於SEQ ID NO: 50之核酸位置953-972。 SEQ ID NO: 51 (PAMgRNA mCherry構築體序列，圖21)

PAM序列對應於SEQ ID NO: 51之核酸位置1-3； 編碼crRNA之序列對應於SEQ ID NO: 51之核酸位置4-23； 剪接受體對應於SEQ ID NO: 51之核酸位置47-85； mCherry密碼子(最佳化)對應於SEQ ID NO: 51之核酸位置86-793； BGHpA序列對應於SEQ ID NO: 51之核酸位置803-949。

併入本說明書中且構成本說明書之一部分的隨附圖式說明若干實施例且連同本說明書說明所揭示之組合物及方法。

圖1A-1E展示在mbIL-21擴增人類初級NK細胞中對AAVS1之高效CRISPR靶向。圖1A展示使用mbIL21-K562分離及離體擴增NK細胞之步驟的示意圖。圖1B展示不同NK細胞中HR相關基因(圖1C)及NHEJ相關基因之相對基因表現量，對於所有比較，***P＜0.001。圖1D展示ATAC-seq資料，其展示AAVS1在新近分離(未處理)的mbIL-21擴增NK細胞(n=2)之間具有類似染色質可達性。圖1E展示NK細胞中對AAVS1的Cas9/RNP介導之靶向的效率。

圖2A-2C展示用於經由HR及CRISPaint插入至AAVS1中之編碼mCherry的DNA的構築體。在圖2A中，左圖展示Cas9/RNP將DSB引入至AAVS1中，相關DNA編碼基因可經由HR用最佳長度之Ha整合至NK細胞中；右圖展示針對AAVS1中Cas9靶向位點具有在30-1000 bp之間之HA的DNA編碼mCherry之整合且在ssAAV6及/或scAAV6主鏈中選殖的構築體設計之示意圖。在圖2B中，上圖展示CRISPaint基因插入如何經由同源性非依賴性DNA修復路徑起作用之示意圖；下圖展示經由CRISPaint的DNA編碼mCherry之插入且在scAAV中選殖的構築體設計之示意圖。圖2C展示以下工作流程示意圖：對Cas9/RNP進行電穿孔，且轉導第七天mbIL21擴增IL2刺激NK，其經AAV6轉導以用於基因遞送。

圖3A-3C展示擴增CD3陰性CD56陽性NK細胞中之靶向AAVS1不改變細胞之正常功能。圖3A展示代表性流動式細胞測量術分析，其展示自健康供體白血球層分離之CD3陰性CD56陽性NK細胞的純度。圖3B展示將Cas9/RNP電穿孔至第7天擴增人類初級NK細胞中以靶向AAVS1之工作流程示意圖。圖3C展示AAVS1KO NK細胞之細胞毒性分析，其不展示其針對AML細胞株之抗腫瘤活性的任何遏制。

圖4A-4C展示AAV6及Cas9/RNP之組合使得高效產生表現mCherry之NK細胞。圖4A展示在CRISPR電穿孔及AAV6轉導之後2天，表現mCherry之人類初級NK細胞的代表性流動式細胞測量術(MOI=3×105)。圖4B展示在人類初級NK細胞中經由HR及CRISPaint (n=3)的Cas9/RNP及AAV6介導之mCherry表現的效率。圖4C展示在使用mbIL21 K562增濃及擴增之後NK細胞中之穩定mCherry表現。

圖5展示對在用Cas9/RNP電穿孔且經AAV6轉導之新近分離之NK細胞中之mCherry表現量的代表性流動式細胞測量術分析。

圖6A-6F展示使用Cas9/RNP及AAV6之組合成功產生表現CD33CAR之NK細胞。圖6A及圖6B展示具有針對AAVS1靶向位點之HA且在ssAAV中選殖的抗CD33 CAR構築體(Gen2及Gen4v2)的示意圖。圖6C展示代表性流動式細胞測量術，其展示在Cas9/RNP電穿孔及AAV6轉導(MOI=3×10 ⁵) 7天後NK細胞上CD33CAR之表現。圖6D展示，Gen2之CD33CAR表現之MFI明顯高於Gen4v2，**P=0.0014。圖6E展示，在轉導及電穿孔之後七天及十四天NK細胞上之CD33CAR表現量未展示顯著減少(n=3)。圖6F展示，自3×10 ⁵個細胞(n=3)開始，餵養細胞上表現CD33CAR之NK細胞在14天內的擴增倍數類似於野生型NK細胞。

圖7A-7B展示，對在冷凍前及解凍後的第14天NK細胞中CD33CAR-Gen2表現量之代表性流動式細胞測量術分析展示無減少。圖7A亦展示冷凍及解凍不影響CD33CAR-Gen2 NK細胞針對Kasumi-1的增強之細胞毒性作用。

圖8A-8I展示CD33CAR NK細胞具有增強之抗AML活性。CD33CAR NK細胞在與 Kasumi-1共同培養時脫粒顯著高於野生型NK細胞，**經調整P值=0.004。圖8A及圖8B HL60，*經調整P值=0.01。圖8B展示，在NK細胞上表現CD33CAR亦增強NK細胞針對 Kasumi-1之抗腫瘤活性，如在不同效應子:目標比率下且在三個供體中進行之代表性細胞毒性分析中所示，****經調整P值＜0.0001。圖8C展示，僅在CD33CAR-Gen2 NK細胞中觀測到針對 HL-60的此增強之細胞毒活性(圖8E及圖8F)，*經調整P值=0.01。CD33CAR-Gen2及Gen4v2顯著殺死較高 AML-10初級細胞，****經調整P值＜0.0001 (圖8G及圖8H)。未發現針對 K562之殺死提高，**經調整P值=0.001。

圖9A-9D展示，藉由PCR及TLA證實轉殖基因在AAVS1基因座中之整合。圖9A展示設計於編碼CD33CAR的DNA之內部及外部且整合至AAVS1中之PCR引子的示意圖。圖9B展示，僅在AAVS1基因座處CD33CAR基因成功插入之NK細胞中擴增子擴增且在1%瓊脂凝膠上被觀測到(條件1及2)。當引子經設計於轉殖基因外部且用於在野生型mCherry或CD33CAR中擴增AAVS1基因座時，亦發現人類初級NK細胞中之基因插入(條件3，引子：正向-1200 bp (2)反向-1200 bp (1))。圖9C展示經由使用經設計引子偵測第14天細胞中CD33CAR-Gen2之整合的人類基因體中之TLA序列覆蓋度。圖9D展示，染色體係在y軸上指示，染色體位置係在x軸上指示。鑑別出之整合位點用紅色圈出。

圖10A-10B展示，對用編碼CD33CAR-Gen2之ssAAV6在10 K-300 K MOI下轉導之NK細胞中的CD33CAR-Gen2表現量之代表性流動式細胞測量術(圖10A)分析展示CAR在自三個健康供體分離之NK細胞上成功表現(圖10B)。

圖11展示不同癌細胞中之CD33表現量。

圖12展示NK細胞針對K562之代表性鈣黃綠素AM釋放分析。

圖13A-13B展示對在人類NK細胞中在電穿孔及AAV6轉導後7天(圖13A)及14天(圖13B) CD33CAR表現量之代表性流式細胞儀分析。

圖14展示在載體上之NGS定序覆蓋度(灰色)。黑色箭頭指示引子位置。藍色箭頭指示經識別之載體基因體斷點序列之位置(描述如下)。在底部展示載體圖譜。Y軸限於100×。在ITR位點之間的區域中觀測到高覆蓋率：載體序列載體：12-4,255。在載體上觀測到低/無覆蓋度：0-11及4,256-6,864，指示主鏈尚未整合至大部分此樣品中，可能較小樣品子組亦可能含有主鏈。此外，在ITR處觀測到覆蓋度，指示在經由同源臂整合之後，樣品中亦出現基於ITR之整合。在所覆蓋區域中需要序列變異體及結構變異體。

圖15展示在載體整合基因座人類chr19:54,550,476-55,682,266中之TLA序列覆蓋度(灰色)。藍色箭頭指示斷點序列之位置。y軸分別限於20×及100×。此圖之覆蓋概況展示在整合位點之區域中未發生基因體重排。由此資料推斷，載體已如所預期整合至人類染色體chr19: 55,115,754- 55,115,767中。根據RefSeq，此係在PPP1R12C之內含子1中。在chr19: 55,115,155-55,116,371之間觀測到其他整合位點。根據RefSeq，此亦在PPP1R12C之內含子1中。

圖16展示pAAV AAVS1(600bpHA) MND-CD33CAR(gen2) (CoOp)之構築體設計。構築體之序列為SEQ ID NO: 22。

圖17展示pAAV AAVS1(600bpHA) MND-CD33CAR(gen4v2) (CoOp)之構築體設計。構築體之序列為SEQ ID NO: 23。

圖18展示對未經修飾(WT)及表現CD33-CAR之擴增NK細胞針對K562之細胞毒性的動力學評定。使用兩個E:T比率，以15分鐘時間間隔，用xCelligence進行分析以監測目標存活率。參考無NK細胞之對照孔計算細胞溶解%。儘管K562對WT擴增之NK細胞高度敏感且連環殺死明顯(在0.5:1 E:T比率下，＞50%溶解)，但K562亦表現CD33，因此CD33 CAR能夠在兩個E:T比率下更快速殺死，且在較低E:T比率下提高整體殺死率。

圖19展示細胞毒性相對於Kasumi之動力學評定。如前述圖中進行分析。與K562相比，Kasumi對WT擴增之NK細胞極具抗性，但添加靶向NK細胞之CD33 CAR能夠更快速地高水準殺死，同時在兩個E:T比率下具有更快的動力學及提高的整體殺死率。

圖20展示AML細胞與WT-NK或CD33 CAR-NK細胞共培養誘導AML細胞死亡，如SPADE圖(pRb表現著色表明活循環細胞)中所示，綠色箭頭表明活AML細胞，而紅色箭頭表明死/染色AML細胞。CD33 CAR-NK細胞展現AML細胞殺死增加，存活AML細胞減少CD33表面表現且增加CD38表現，表明CD33 CAR與CD38抗體之組合可為協同的。此分析使用患者來源之AML細胞株作為目標。

圖21展示PAMgRNA mCherry之構築體設計。構築體之序列為SEQ ID NO: 51。

圖22展示PAMgPAMg mCherry之構築體設計。構築體之序列為SEQ ID NO: 50。

     
          <![CDATA[<110>  美國全美兒童醫院之研究學會(RESEARCH INSTITUTE AT NATIONWIDE CHILDREN'S HOSPITAL)]]>
          <![CDATA[<120>  嵌合抗原受體(CAR) NK細胞及其用途]]>
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          ctgggaggga gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt      240
          tctcagtggc caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggctgtc      300
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          gttctcctgt ggattcgggt cacctctcac tcctttcatt tgggcagctc ccctaccccc       60
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          cgagagctca gctagtcttc ttcctccaac ccgggcccct atgtccactt caggacagca      180
          tgtttgctgc ctccagggat cctgtgtccc cgagctggga ccaccttata ttcccagggc      240
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          agccatctct ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc      180
          ctgggaggga gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt      240
          tctcagtggc caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggctgtc      300
          tggtgcgttt cactgatcct ggtgctgcag cttccttaca cttcccaaga ggagaagcag      360
          tttggaaaaa caaaatcaga ataagttggt cctgagttct aactttggct cttcaccttt      420
          ctagtcccca atttatattg ttcctccgtg cgtcagtttt acctgtgaga taaggccagt      480
          agccagcccc gtcctggcag                                                  500
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          cgacggatgt ctcccttgcg tcccgcctcc ccttcttgta ggcctgcatc atcaccgttt      120
          ttctggacaa ccccaaagta ccccgtctcc ctggctttag ccacctctcc atcctcttgc      180
          tttctttgcc tggacacccc gttctcctgt ggattcgggt cacctctcac tcctttcatt      240
          tgggcagctc ccctaccccc cttacctctc tagtctgtgc tagctcttcc agccccctgt      300
          catggcatct tccaggggtc cgagagctca gctagtcttc ttcctccaac ccgggcccct      360
          atgtccactt caggacagca tgtttgctgc ctccagggat cctgtgtccc cgagctggga      420
          ccaccttata ttcccagggc cggttaatgt ggctctggtt ctgggtactt ttatctgtcc      480
          cctccacccc acagtggggc                                                  500
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          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          atcgatcgca ggcgcaatct tcgcatttct tttttccag                              39
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  147]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct       60
          tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc      120
          attgtctgag taggtgtcat tctattc                                          147
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  708]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          gtgagcaagg gcgaggagga taacatggcc atcatcaagg agttcatgcg cttcaaggtg       60
          cacatggagg gctccgtgaa cggccacgag ttcgagatcg agggcgaggg cgagggccgc      120
          ccctacgagg gcacccagac cgccaagctg aaggtgacca agggtggccc cctgcccttc      180
          gcctgggaca tcctgtcccc tcagttcatg tacggctcca aggcctacgt gaagcacccc      240
          gccgacatcc ccgactactt gaagctgtcc ttccccgagg gcttcaagtg ggagcgcgtg      300
          atgaacttcg aggacggcgg cgtggtgacc gtgacccagg actcctccct gcaggacggc      360
          gagttcatct acaaggtgaa gctgcgcggc accaacttcc cctccgacgg ccccgtaatg      420
          cagaagaaga ccatgggctg ggaggcctcc tccgagcgga tgtaccccga ggacggcgcc      480
          ctgaagggcg agatcaagca gaggctgaag ctgaaggacg gcggccacta cgacgctgag      540
          gtcaagacca cctacaaggc caagaagccc gtgcagctgc ccggcgccta caacgtcaac      600
          atcaagttgg acatcacctc ccacaacgag gactacacca tcgtggaaca gtacgaacgc      660
          gccgagggcc gccactccac cggcggcatg gacgagctgt acaagtaa                   708
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  986]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  人工序列]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          ttatctgtcc cctccacccc acagtggggc cactagggac agcgatcggg tacatcgatc       60
          gcaggcgcaa tcttcgcatt tcttttttcc aggtgagcaa gggcgaggag gataacatgg      120
          ccatcatcaa ggagttcatg cgcttcaagg tgcacatgga gggctccgtg aacggccacg      180
          agttcgagat cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag accgccaagc      240
          tgaaggtgac caagggtggc cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc cctcagttca      300
          tgtacggctc caaggcctac gtgaagcacc ccgccgacat ccccgactac ttgaagctgt      360
          ccttccccga gggcttcaag tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc ggcgtggtga      420
          ccgtgaccca ggactcctcc ctgcaggacg gcgagttcat ctacaaggtg aagctgcgcg      480
          gcaccaactt cccctccgac ggccccgtaa tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct      540
          cctccgagcg gatgtacccc gaggacggcg ccctgaaggg cgagatcaag cagaggctga      600
          agctgaagga cggcggccac tacgacgctg aggtcaagac cacctacaag gccaagaagc      660
          ccgtgcagct gcccggcgcc tacaacgtca acatcaagtt ggacatcacc tcccacaacg      720
          aggactacac catcgtggaa cagtacgaac gcgccgaggg ccgccactcc accggcggca      780
          tggacgagct gtacaagtaa cgcggccgcc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc      840
          tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct      900
          ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattcgatt      960
          ggtgacagaa aagccccatc cttagg                                           986
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  1526]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          gttctcctgt ggattcgggt cacctctcac tcctttcatt tgggcagctc ccctaccccc       60
          cttacctctc tagtctgtgc tagctcttcc agccccctgt catggcatct tccaggggtc      120
          cgagagctca gctagtcttc ttcctccaac ccgggcccct atgtccactt caggacagca      180
          tgtttgctgc ctccagggat cctgtgtccc cgagctggga ccaccttata ttcccagggc      240
          cggttaatgt ggctctggtt ctgggtactt ttatctgtcc cctccacccc acagtggggc      300
          cactagggac agcgatcggg tacatcgatc gcaggcgcaa tcttcgcatt tcttttttcc      360
          aggtgagcaa gggcgaggag gataacatgg ccatcatcaa ggagttcatg cgcttcaagg      420
          tgcacatgga gggctccgtg aacggccacg agttcgagat cgagggcgag ggcgagggcc      480
          gcccctacga gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac caagggtggc cccctgccct      540
          tcgcctggga catcctgtcc cctcagttca tgtacggctc caaggcctac gtgaagcacc      600
          ccgccgacat ccccgactac ttgaagctgt ccttccccga gggcttcaag tgggagcgcg      660
          tgatgaactt cgaggacggc ggcgtggtga ccgtgaccca ggactcctcc ctgcaggacg      720
          gcgagttcat ctacaaggtg aagctgcgcg gcaccaactt cccctccgac ggccccgtaa      780
          tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct cctccgagcg gatgtacccc gaggacggcg      840
          ccctgaaggg cgagatcaag cagaggctga agctgaagga cggcggccac tacgacgctg      900
          aggtcaagac cacctacaag gccaagaagc ccgtgcagct gcccggcgcc tacaacgtca      960
          acatcaagtt ggacatcacc tcccacaacg aggactacac catcgtggaa cagtacgaac     1020
          gcgccgaggg ccgccactcc accggcggca tggacgagct gtacaagtaa cgcggccgcc     1080
          ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg tgccttcctt     1140
          gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa ttgcatcgca     1200
          ttgtctgagt aggtgtcatt ctattcgatt ggtgacagaa aagccccatc cttaggcctc     1260
          ctccttccta gtctcctgat attgggtcta acccccacct cctgttaggc agattcctta     1320
          tctggtgaca cacccccatt tcctggagcc atctctctcc ttgccagaac ctctaaggtt     1380
          tgcttacgat ggagccagag aggatcctgg gagggagagc ttggcagggg gtgggaggga     1440
          agggggggat gcgtgacctg cccggttctc agtggccacc ctgcgctacc ctctcccaga     1500
          acctgagctg ctctgacgcg gctgtc                                          1526
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  1926]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          tcccttttcc ttctccttct ggggcctgtg ccatctctcg tttcttagga tggccttctc       60
          cgacggatgt ctcccttgcg tcccgcctcc ccttcttgta ggcctgcatc atcaccgttt      120
          ttctggacaa ccccaaagta ccccgtctcc ctggctttag ccacctctcc atcctcttgc      180
          tttctttgcc tggacacccc gttctcctgt ggattcgggt cacctctcac tcctttcatt      240
          tgggcagctc ccctaccccc cttacctctc tagtctgtgc tagctcttcc agccccctgt      300
          catggcatct tccaggggtc cgagagctca gctagtcttc ttcctccaac ccgggcccct      360
          atgtccactt caggacagca tgtttgctgc ctccagggat cctgtgtccc cgagctggga      420
          ccaccttata ttcccagggc cggttaatgt ggctctggtt ctgggtactt ttatctgtcc      480
          cctccacccc acagtggggc cactagggac agcgatcggg tacatcgatc gcaggcgcaa      540
          tcttcgcatt tcttttttcc aggtgagcaa gggcgaggag gataacatgg ccatcatcaa      600
          ggagttcatg cgcttcaagg tgcacatgga gggctccgtg aacggccacg agttcgagat      660
          cgagggcgag ggcgagggcc gcccctacga gggcacccag accgccaagc tgaaggtgac      720
          caagggtggc cccctgccct tcgcctggga catcctgtcc cctcagttca tgtacggctc      780
          caaggcctac gtgaagcacc ccgccgacat ccccgactac ttgaagctgt ccttccccga      840
          gggcttcaag tgggagcgcg tgatgaactt cgaggacggc ggcgtggtga ccgtgaccca      900
          ggactcctcc ctgcaggacg gcgagttcat ctacaaggtg aagctgcgcg gcaccaactt      960
          cccctccgac ggccccgtaa tgcagaagaa gaccatgggc tgggaggcct cctccgagcg     1020
          gatgtacccc gaggacggcg ccctgaaggg cgagatcaag cagaggctga agctgaagga     1080
          cggcggccac tacgacgctg aggtcaagac cacctacaag gccaagaagc ccgtgcagct     1140
          gcccggcgcc tacaacgtca acatcaagtt ggacatcacc tcccacaacg aggactacac     1200
          catcgtggaa cagtacgaac gcgccgaggg ccgccactcc accggcggca tggacgagct     1260
          gtacaagtaa cgcggccgcc ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc     1320
          ccctcccccg tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa     1380
          aatgaggaaa ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattcgatt ggtgacagaa     1440
          aagccccatc cttaggcctc ctccttccta gtctcctgat attgggtcta acccccacct     1500
          cctgttaggc agattcctta tctggtgaca cacccccatt tcctggagcc atctctctcc     1560
          ttgccagaac ctctaaggtt tgcttacgat ggagccagag aggatcctgg gagggagagc     1620
          ttggcagggg gtgggaggga agggggggat gcgtgacctg cccggttctc agtggccacc     1680
          ctgcgctacc ctctcccaga acctgagctg ctctgacgcg gctgtctggt gcgtttcact     1740
          gatcctggtg ctgcagcttc cttacacttc ccaagaggag aagcagtttg gaaaaacaaa     1800
          atcagaataa gttggtcctg agttctaact ttggctcttc acctttctag tccccaattt     1860
          atattgttcc tccgtgcgtc agttttacct gtgagataag gccagtagcc agccccgtcc     1920
          tggcag                                                                1926
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  2730]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          tgctttctct gacctgcatt ctctcccctg ggcctgtgcc gctttctgtc tgcagcttgt       60
          ggcctgggtc acctctacgg ctggcccaga tccttccctg ccgcctcctt caggttccgt      120
          cttcctccac tccctcttcc ccttgctctc tgctgtgttg ctgcccaagg atgctctttc      180
          cggagcactt ccttctcggc gctgcaccac gtgatgtcct ctgagcggat cctccccgtg      240
          tctgggtcct ctccgggcat ctctcctccc tcacccaacc ccatgccgtc ttcactcgct      300
          gggttccctt ttccttctcc ttctggggcc tgtgccatct ctcgtttctt aggatggcct      360
          tctccgacgg atgtctccct tgcgtcccgc ctccccttct tgtaggcctg catcatcacc      420
          gtttttctgg acaaccccaa agtaccccgt ctccctggct ttagccacct ctccatcctc      480
          ttgctttctt tgcctggaca ccccgttctc ctgtggattc gggtcacctc tcactccttt      540
          catttgggca gctcccctac cccccttacc tctctagtct gtgctagctc ttccagcccc      600
          ctgtcatggc atcttccagg ggtccgagag ctcagctagt cttcttcctc caacccgggc      660
          ccctatgtcc acttcaggac agcatgtttg ctgcctccag ggatcctgtg tccccgagct      720
          gggaccacct tatattccca gggccggtta atgtggctct ggttctgggt acttttatct      780
          gtcccctcca ccccacagtg gggccactag ggacagcgat cgggtacatc gatcgcaggc      840
          gcaatcttcg catttctttt ttccaggtga gcaagggcga ggaggataac atggccatca      900
          tcaaggagtt catgcgcttc aaggtgcaca tggagggctc cgtgaacggc cacgagttcg      960
          agatcgaggg cgagggcgag ggccgcccct acgagggcac ccagaccgcc aagctgaagg     1020
          tgaccaaggg tggccccctg cccttcgcct gggacatcct gtcccctcag ttcatgtacg     1080
          gctccaaggc ctacgtgaag caccccgccg acatccccga ctacttgaag ctgtccttcc     1140
          ccgagggctt caagtgggag cgcgtgatga acttcgagga cggcggcgtg gtgaccgtga     1200
          cccaggactc ctccctgcag gacggcgagt tcatctacaa ggtgaagctg cgcggcacca     1260
          acttcccctc cgacggcccc gtaatgcaga agaagaccat gggctgggag gcctcctccg     1320
          agcggatgta ccccgaggac ggcgccctga agggcgagat caagcagagg ctgaagctga     1380
          aggacggcgg ccactacgac gctgaggtca agaccaccta caaggccaag aagcccgtgc     1440
          agctgcccgg cgcctacaac gtcaacatca agttggacat cacctcccac aacgaggact     1500
          acaccatcgt ggaacagtac gaacgcgccg agggccgcca ctccaccggc ggcatggacg     1560
          agctgtacaa gtaacgcggc cgccctcgac tgtgccttct agttgccagc catctgttgt     1620
          ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta     1680
          ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct gagtaggtgt cattctattc gattggtgac     1740
          agaaaagccc catccttagg cctcctcctt cctagtctcc tgatattggg tctaaccccc     1800
          acctcctgtt aggcagattc cttatctggt gacacacccc catttcctgg agccatctct     1860
          ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc ctgggaggga     1920
          gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt tctcagtggc     1980
          caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggctgtc tggtgcgttt     2040
          cactgatcct ggtgctgcag cttccttaca cttcccaaga ggagaagcag tttggaaaaa     2100
          caaaatcaga ataagttggt cctgagttct aactttggct cttcaccttt ctagtcccca     2160
          atttatattg ttcctccgtg cgtcagtttt acctgtgaga taaggccagt agccagcccc     2220
          gtcctggcag ggctgtggtg aggagggggg tgtccgtgtg gaaaactccc tttgtgagaa     2280
          tggtgcgtcc taggtgttca ccaggtcgtg gccgcctcta ctccctttct ctttctccat     2340
          ccttctttcc ttaaagagtc cccagtgcta tctgggacat attcctccgc ccagagcagg     2400
          gtcccgcttc cctaaggccc tgctctgggc ttctgggttt gagtccttgg caagcccagg     2460
          agaggcgctc aggcttccct gtcccccttc ctcgtccacc atctcatgcc cctggctctc     2520
          ctgccccttc cctacagggg ttcctggctc tgctcttcag actgagcccc gttcccctgc     2580
          atccccgttc ccctgcatcc cccttcccct gcatccccca gaggccccag gccacctact     2640
          tggcctggac cccacgagag gccaccccag ccctgtctac caggctgcct tttgggtgga     2700
          ttctcctcca actgtggggt gactgcttgg                                      2730
          <![CDATA[<210>  17]]>
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          <![CDATA[<400>  17]]>
          ggggccacta gggacaggat                                                   20
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  800]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          atgctgctgc tggtgacctc tctgctgctg tgcgagctgc cacacccagc cttcctgctg       60
          atcccagaca tccagatgac acagagcccc agctccctga gcgcctccgt gggcgacaga      120
          gtgaccatca catgtagggc ctctgagagc gtggataact atggcatcag cttcatgaat      180
          tggtttcagc agaagcctgg cggcgcccca aagctgctga tctacgcagc cagcatgcag      240
          ggctccggcg tgccctctcg gttctccggc tctggcagcg gcaccgactt caccctgaca      300
          atctctagcc tgcagccaga cgatttcgcc acatactatt gccagcagag caaggaggtg      360
          ccctggacct ttggccaggg cacaaaggtg gagatcaagg gctccacctc tggcagcggc      420
          aagcctggca gcggagaggg ctccacaaag ggacaggtgc agctggtgca gtccggagcc      480
          gaggtgaaga agccaggctc ctctgtgaag gtgtcttgta aggccagcgg ctataccttc      540
          acagactaca acatgcactg ggtgcgccag gcaccaggac agggcctgga gtggatcggc      600
          tacatctatc cttacaacgg cggcaccggc tataatcaga agtttaagtc caaggccacc      660
          atcacagccg atgagtctac caatacagcc tacatggagc tgagcagcct gcggtccgag      720
          gacacagccg tgtactattg cgcccggggc agacccgcta tggactattg gggccagggc      780
          accctggtga cagtgtctag                                                  800
          <![CDATA[<210>  19]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  19]]>
          gagagcaagt acggaccacc ttgcccacca tgtcctgcac cagagttcct gggaggacct       60
          tccgtgttcc tgtttcctcc aaagccaaag gacaccctga tgatcagccg gaccccagag      120
          gtgacatgcg tggtggtgga cgtgagccag gaggaccccg aggtgcagtt caactggtac      180
          gtggatggcg tggaggtgca caatgccaag accaagccaa gagaggagca gtttaactcc      240
          acctataggg tggtgtctgt gctgacagtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag      300
          tacaagtgca aggtgtccaa taagggcctg ccttcctcta tcgagaagac catctctaag      360
          gcaaagggac agccaaggga gccacaggtg tatacactgc cccctagcca ggaggagatg      420
          accaagaacc aggtgtccct gacatgtctg gtgaagggct tttacccttc tgacatcgcc      480
          gtggagtggg agagcaatgg ccagccagag aacaattata agaccacacc acccgtgctg      540
          gactctgatg gcagcttctt tctgtacagc cgcctgaccg tggataagtc ccggtggcag      600
          gagggcaacg tgttctcctg ctctgtgatg cacgaggccc tgcacaatca ctacacacag      660
          aagagcctgt ccctgtctct gggcaag                                          687
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  207]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          atgttttggg tgctggtggt ggtgggaggc gtgctggcct gttattccct gctggtgacc       60
          gtggccttca tcatcttttg ggtgcgctcc aagcggagcc ggggcggaca ctctgactac      120
          atgaacatga ccccacggag acccggacct acaaggaagc actatcagcc ctacgcccct      180
          ccacgggact tcgcagcata tcgcagc                                          207
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  339]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          cgggtgaagt ttagcagatc cgccgatgca ccagcatatc agcagggaca gaatcagctg       60
          tacaacgagc tgaatctggg caggcgcgag gagtacgacg tgctggataa gaggcggggc      120
          cgggaccccg agatgggagg caagcccagg cgcaagaacc ctcaggaggg cctgtataat      180
          gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggagagcgg      240
          agaaggggca agggacacga tggcctgtat cagggcctgt ccaccgccac aaaggacacc      300
          tacgatgcac tgcacatgca ggccctgcca cctcggtga                             339
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  6864]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc       60
          gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca      120
          actccatcac taggggttcc tgcggccggc gcgccgctgc accacgtgat gtcctctgag      180
          cggatcctcc ccgtgtctgg gtcctctccg ggcatctctc ctccctcacc caaccccatg      240
          ccgtcttcac tcgctgggtt cccttttcct tctccttctg gggcctgtgc catctctcgt      300
          ttcttaggat ggccttctcc gacggatgtc tcccttgcgt cccgcctccc cttcttgtag      360
          gcctgcatca tcaccgtttt tctggacaac cccaaagtac cccgtctccc tggctttagc      420
          cacctctcca tcctcttgct ttctttgcct ggacaccccg ttctcctgtg gattcgggtc      480
          acctctcact cctttcattt gggcagctcc cctacccccc ttacctctct agtctgtgct      540
          agctcttcca gccccctgtc atggcatctt ccaggggtcc gagagctcag ctagtcttct      600
          tcctccaacc cgggccccta tgtccacttc aggacagcat gtttgctgcc tccagggatc      660
          ctgtgtcccc gagctgggac caccttatat tcccagggcc ggttaatgtg gctctggttc      720
          tgggtacttt tatctgtccc ctccacccca cagtggggcc actagggaca gcgatcgggt      780
          acatcgatca cgagactagc ctcgagaagc ttgatatcga attccacggg gttggacgcg      840
          tcttaattaa ggatccaagg tcaggaacag agaaacagga gaatatgggc caaacaggat      900
          atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata      960
          tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga     1020
          tggtccccag atgcggtccc gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg     1080
          gtgccccaag gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc     1140
          tcgcttctgt tcgcgcgctt ctgctccccg agctctatat aagcagagct cgtttagtga     1200
          accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccgac     1260
          tctagaggat cgatcccccg ggctgcagga attcaagcga gaagacaagg gcagaaagca     1320
          ccgccaccat gctgctgctg gtgacctctc tgctgctgtg cgagctgcca cacccagcct     1380
          tcctgctgat cccagacatc cagatgacac agagccccag ctccctgagc gcctccgtgg     1440
          gcgacagagt gaccatcaca tgtagggcct ctgagagcgt ggataactat ggcatcagct     1500
          tcatgaattg gtttcagcag aagcctggcg gcgccccaaa gctgctgatc tacgcagcca     1560
          gcatgcaggg ctccggcgtg ccctctcggt tctccggctc tggcagcggc accgacttca     1620
          ccctgacaat ctctagcctg cagccagacg atttcgccac atactattgc cagcagagca     1680
          aggaggtgcc ctggaccttt ggccagggca caaaggtgga gatcaagggc tccacctctg     1740
          gcagcggcaa gcctggcagc ggagagggct ccacaaaggg acaggtgcag ctggtgcagt     1800
          ccggagccga ggtgaagaag ccaggctcct ctgtgaaggt gtcttgtaag gccagcggct     1860
          ataccttcac agactacaac atgcactggg tgcgccaggc accaggacag ggcctggagt     1920
          ggatcggcta catctatcct tacaacggcg gcaccggcta taatcagaag tttaagtcca     1980
          aggccaccat cacagccgat gagtctacca atacagccta catggagctg agcagcctgc     2040
          ggtccgagga cacagccgtg tactattgcg cccggggcag acccgctatg gactattggg     2100
          gccagggcac cctggtgaca gtgtctagcg agagcaagta cggaccacct tgcccaccat     2160
          gtcctgcacc agagttcctg ggaggacctt ccgtgttcct gtttcctcca aagccaaagg     2220
          acaccctgat gatcagccgg accccagagg tgacatgcgt ggtggtggac gtgagccagg     2280
          aggaccccga ggtgcagttc aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcac aatgccaaga     2340
          ccaagccaag agaggagcag tttaactcca cctatagggt ggtgtctgtg ctgacagtgc     2400
          tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtccaat aagggcctgc     2460
          cttcctctat cgagaagacc atctctaagg caaagggaca gccaagggag ccacaggtgt     2520
          atacactgcc ccctagccag gaggagatga ccaagaacca ggtgtccctg acatgtctgg     2580
          tgaagggctt ttacccttct gacatcgccg tggagtggga gagcaatggc cagccagaga     2640
          acaattataa gaccacacca cccgtgctgg actctgatgg cagcttcttt ctgtacagcc     2700
          gcctgaccgt ggataagtcc cggtggcagg agggcaacgt gttctcctgc tctgtgatgc     2760
          acgaggccct gcacaatcac tacacacaga agagcctgtc cctgtctctg ggcaagatgt     2820
          tttgggtgct ggtggtggtg ggaggcgtgc tggcctgtta ttccctgctg gtgaccgtgg     2880
          ccttcatcat cttttgggtg cgctccaagc ggagccgggg cggacactct gactacatga     2940
          acatgacccc acggagaccc ggacctacaa ggaagcacta tcagccctac gcccctccac     3000
          gggacttcgc agcatatcgc agccgggtga agtttagcag atccgccgat gcaccagcat     3060
          atcagcaggg acagaatcag ctgtacaacg agctgaatct gggcaggcgc gaggagtacg     3120
          acgtgctgga taagaggcgg ggccgggacc ccgagatggg aggcaagccc aggcgcaaga     3180
          accctcagga gggcctgtat aatgagctgc agaaggacaa gatggccgag gcctacagcg     3240
          agatcggcat gaagggagag cggagaaggg gcaagggaca cgatggcctg tatcagggcc     3300
          tgtccaccgc cacaaaggac acctacgatg cactgcacat gcaggccctg ccacctcggt     3360
          gaaagtaacg ccctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc     3420
          cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga     3480
          aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattcga ttggtgacag aaaagcccca     3540
          tccttaggcc tcctccttcc tagtctcctg atattgggtc taacccccac ctcctgttag     3600
          gcagattcct tatctggtga cacaccccca tttcctggag ccatctctct ccttgccaga     3660
          acctctaagg tttgcttacg atggagccag agaggatcct gggagggaga gcttggcagg     3720
          gggtgggagg gaaggggggg atgcgtgacc tgcccggttc tcagtggcca ccctgcgcta     3780
          ccctctccca gaacctgagc tgctctgacg cggctgtctg gtgcgtttca ctgatcctgg     3840
          tgctgcagct tccttacact tcccaagagg agaagcagtt tggaaaaaca aaatcagaat     3900
          aagttggtcc tgagttctaa ctttggctct tcacctttct agtccccaat ttatattgtt     3960
          cctccgtgcg tcagttttac ctgtgagata aggccagtag ccagccccgt cctggcaggg     4020
          ctgtggtgag gaggggggtg tccgtgtgga aaactccctt tgtgagaatg gtgcgtccta     4080
          ggtgttcacc aggtcgtggc cgcctctact ccctttctgc ggccgcagga acccctagtg     4140
          atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag     4200
          gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc     4260
          ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc     4320
          atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg     4380
          tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt     4440
          tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc     4500
          tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg     4560
          gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg     4620
          agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct     4680
          cgggctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg     4740
          agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt ttaacaaaat attaacgttt acaattttat     4800
          ggtgcactct cagtacaatc tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc     4860
          caacacccgc tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag     4920
          ctgtgaccgt ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg     4980
          cgagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg     5040
          tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat     5100
          ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc     5160
          aataatattg aaaaaggaag agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct     5220
          tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag     5280
          atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta     5340
          agatccttga gagttttcgc cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc     5400
          tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca     5460
          tacactattc tcagaatgac ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg     5520
          atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg     5580
          ccaacttact tctgacaacg atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca     5640
          tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa     5700
          acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa     5760
          ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata     5820
          aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat     5880
          ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc     5940
          cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata     6000
          gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt     6060
          actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga     6120
          agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag     6180
          cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa     6240
          tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag     6300
          agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg     6360
          tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat     6420
          acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta     6480
          ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg     6540
          gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc     6600
          gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa     6660
          gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc     6720
          tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt     6780
          caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct     6840
          tttgctggcc ttttgctcac atgt                                            6864
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  7161]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
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          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc       60
          gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca      120
          actccatcac taggggttcc tgcggccggc gcgccgctgc accacgtgat gtcctctgag      180
          cggatcctcc ccgtgtctgg gtcctctccg ggcatctctc ctccctcacc caaccccatg      240
          ccgtcttcac tcgctgggtt cccttttcct tctccttctg gggcctgtgc catctctcgt      300
          ttcttaggat ggccttctcc gacggatgtc tcccttgcgt cccgcctccc cttcttgtag      360
          gcctgcatca tcaccgtttt tctggacaac cccaaagtac cccgtctccc tggctttagc      420
          cacctctcca tcctcttgct ttctttgcct ggacaccccg ttctcctgtg gattcgggtc      480
          acctctcact cctttcattt gggcagctcc cctacccccc ttacctctct agtctgtgct      540
          agctcttcca gccccctgtc atggcatctt ccaggggtcc gagagctcag ctagtcttct      600
          tcctccaacc cgggccccta tgtccacttc aggacagcat gtttgctgcc tccagggatc      660
          ctgtgtcccc gagctgggac caccttatat tcccagggcc ggttaatgtg gctctggttc      720
          tgggtacttt tatctgtccc ctccacccca cagtggggcc actagggaca gcgatcgggt      780
          acatcgatca cgagactagc ctcgagaagc ttgatatcga attccacggg gttggacgcg      840
          tcttaattaa ggatccaagg tcaggaacag agaaacagga gaatatgggc caaacaggat      900
          atctgtggta agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata      960
          tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga     1020
          tggtccccag atgcggtccc gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg     1080
          gtgccccaag gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc     1140
          tcgcttctgt tcgcgcgctt ctgctccccg agctctatat aagcagagct cgtttagtga     1200
          accgtcagat cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccgac     1260
          tctagaggat cgatcccccg ggctgcagga attcaagcga gaagacaagg gcagaaagca     1320
          ccgccaccat gctgctgctg gtgacctccc tgctgctgtg cgagctgcca caccctgcct     1380
          ttctgctgat cccagacatc cagatgacac agagccccag ctccctgtct gccagcgtgg     1440
          gcgacagagt gaccatcaca tgtagggcct ccgagtctgt ggataactat ggcatcagct     1500
          ttatgaattg gttccagcag aagccaggag gcgcccctaa gctgctgatc tacgcagcct     1560
          ccatgcaggg ctctggcgtg cccagccgct ttagcggctc cggctctggc accgatttca     1620
          ccctgacaat ctctagcctg cagccagacg attttgccac atactattgc cagcagtcca     1680
          aggaggtgcc ctggaccttc ggccagggca caaaggtgga gatcaagggc agcacctccg     1740
          gctctggcaa gcctggctcc ggagagggct ctacaaaggg acaggtgcag ctggtgcaga     1800
          gcggagccga ggtgaagaag ccaggctcct ctgtgaaggt gagctgtaag gcctccggct     1860
          atacctttac agactacaac atgcactggg tgagacaggc accaggacag ggcctggagt     1920
          ggatcggcta catctatcct tacaacggcg gcaccggcta taatcagaag ttcaagagca     1980
          aggccaccat cacagccgat gagtccacca atacagccta catggagctg agcagcctga     2040
          ggagcgagga cacagccgtg tactattgcg ccagaggcag gcctgctatg gactattggg     2100
          gccagggcac cctggtgaca gtgtctagcg agtccaagta cggaccacct tgcccaccat     2160
          gtccagcacc agagtttctg ggaggaccta gcgtgtttct gttccctcca aagccaaagg     2220
          acaccctgat gatcagcaga acccccgagg tgacatgcgt ggtggtggac gtgtcccagg     2280
          aggaccccga ggtgcagttt aactggtacg tggatggcgt ggaggtgcac aatgccaaga     2340
          ccaagcctag agaggagcag ttcaactcca cctatagggt ggtgtctgtg ctgacagtgc     2400
          tgcaccagga ctggctgaac ggcaaggagt acaagtgcaa ggtgtctaat aagggcctgc     2460
          catcctctat cgagaagacc atcagcaagg ccaagggcca gcctagggag ccacaggtgt     2520
          atacactgcc cccttcccag gaggagatga ccaagaacca ggtgtctctg acatgtctgg     2580
          tgaagggctt ctacccatcc gacatcgccg tggagtggga gtctaatggc cagcccgaga     2640
          acaattataa gaccacacca cccgtgctgg actctgatgg cagcttcttt ctgtactctc     2700
          gcctgaccgt ggataagagc cggtggcagg agggcaacgt gtttagctgc tccgtgatgc     2760
          acgaggccct gcacaatcac tacacacaga agtctctgag cctgtccctg ggcaagagca     2820
          acctgttcgt ggcctcctgg atcgccgtga tgatcatctt tcgcatcggc atggccgtgg     2880
          ccatcttctg ctgtttcttt ttcccatccg gaggctctgg aggaggctcc ggctggcgga     2940
          gaaagcggaa ggagaagcag agcgagacct cccctaagga gtttctgaca atctatgagg     3000
          acgtgaagga tctgaagacc aggcgcaatc acgagcagga gcagaccttc ccaggaggag     3060
          gctctacaat ctacagcatg atccagtccc agagcagcgc cccaaccagc caggagccag     3120
          cctatacact gtactctctg atccagccta gccggaagtc tggcagccgc aagcggaacc     3180
          actccccatc tttcaattct accatctatg aagtgatcgg caagagccag cctaaggccc     3240
          agaacccagc cagactgtcc aggaaggagc tggagaattt tgacgtgtac tctggaggca     3300
          gcggaggagg ctctggccgc gtgaagttca gccggtccgc cgatgcccca gcctataagc     3360
          agggccagaa ccagctgtac aacgagctga atctgggccg gagagaggag tacgacgtgc     3420
          tggataagag gcggggccgg gaccccgaga tgggaggcaa gccccggaga aagaaccctc     3480
          aggagggcct gtataatgag ctgcagaagg acaagatggc cgaggcctac tccgagatcg     3540
          gcatgaaggg agagaggcgc cggggcaagg gacacgatgg cctgtatcag ggcctgagca     3600
          ccgccacaaa ggacacctac gatgccctgc acatgcaggc cctgcctcca cggtgatgaa     3660
          agtaacgccc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt     3720
          gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat     3780
          tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattcgattg gtgacagaaa agccccatcc     3840
          ttaggcctcc tccttcctag tctcctgata ttgggtctaa cccccacctc ctgttaggca     3900
          gattccttat ctggtgacac acccccattt cctggagcca tctctctcct tgccagaacc     3960
          tctaaggttt gcttacgatg gagccagaga ggatcctggg agggagagct tggcaggggg     4020
          tgggagggaa gggggggatg cgtgacctgc ccggttctca gtggccaccc tgcgctaccc     4080
          tctcccagaa cctgagctgc tctgacgcgg ctgtctggtg cgtttcactg atcctggtgc     4140
          tgcagcttcc ttacacttcc caagaggaga agcagtttgg aaaaacaaaa tcagaataag     4200
          ttggtcctga gttctaactt tggctcttca cctttctagt ccccaattta tattgttcct     4260
          ccgtgcgtca gttttacctg tgagataagg ccagtagcca gccccgtcct ggcagggctg     4320
          tggtgaggag gggggtgtcc gtgtggaaaa ctccctttgt gagaatggtg cgtcctaggt     4380
          gttcaccagg tcgtggccgc ctctactccc tttctgcggc cgcaggaacc cctagtgatg     4440
          gagttggcca ctccctctct gcgcgctcgc tcgctcactg aggccgggcg accaaaggtc     4500
          gcccgacgcc cgggctttgc ccgggcggcc tcagtgagcg agcgagcgcg cagctgcctg     4560
          caggggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata     4620
          cgtcaaagca accatagtac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg     4680
          ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct     4740
          tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc     4800
          ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gatttgggtg     4860
          atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt     4920
          ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg     4980
          gctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc     5040
          tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgtttaca attttatggt     5100
          gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagccccga cacccgccaa     5160
          cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg     5220
          tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga     5280
          gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt     5340
          cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt     5400
          tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat     5460
          aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt     5520
          ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg     5580
          ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga     5640
          tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc     5700
          tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac     5760
          actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg     5820
          gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca     5880
          acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg     5940
          gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg     6000
          acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg     6060
          gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag     6120
          ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg     6180
          gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct     6240
          cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac     6300
          agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact     6360
          catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga     6420
          tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt     6480
          cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct     6540
          gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc     6600
          taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgtcc     6660
          ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc     6720
          tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg     6780
          ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt     6840
          cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg     6900
          agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg     6960
          gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt     7020
          atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag     7080
          gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt     7140
          gctggccttt tgctcacatg t                                               7161
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          <![CDATA[<400>  24]]>
          agcaacctgt tcgtggcctc ctggatcgcc gtgatgatca tctttcgcat cggcatggcc       60
          gtggccatct tctgctgttt ctttttccca tcc                                    93
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          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  25]]>
          ggaggctctg gaggaggctc cggc                                              24
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          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  26]]>
          tggcggagaa agcggaagga gaagcagagc gagacctccc ctaaggagtt tctgacaatc       60
          tatgaggacg tgaaggatct gaagaccagg cgcaatcacg agcaggagca gaccttccca      120
          ggaggaggct ctacaatcta cagcatgatc cagtcccaga gcagcgcccc aaccagccag      180
          gagccagcct atacactgta ctctctgatc cagcctagcc ggaagtctgg cagccgcaag      240
          cggaaccact ccccatcttt caattctacc atctatgaag tgatcggcaa gagccagcct      300
          aaggcccaga acccagccag actgtccagg aaggagctgg agaattttga cgtgtactct      360
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          ggaggcagcg gaggaggctc tggc                                              24
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          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  28]]>
          cgcgtgaagt tcagccggtc cgccgatgcc ccagcctata agcagggcca gaaccagctg       60
          tacaacgagc tgaatctggg ccggagagag gagtacgacg tgctggataa gaggcggggc      120
          cgggaccccg agatgggagg caagccccgg agaaagaacc ctcaggaggg cctgtataat      180
          gagctgcaga aggacaagat ggccgaggcc tactccgaga tcggcatgaa gggagagagg      240
          cgccggggca agggacacga tggcctgtat cagggcctga gcaccgccac aaaggacacc      300
          tacgatgccc tgcacatgca ggccctgcct ccacggtgat ga                         342
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          <![CDATA[<400>  29]]>
          atgctgctgc tggtgacctc cctgctgctg tgcgagctgc cacaccctgc ctttctgctg       60
          atcccagaca tccagatgac acagagcccc agctccctgt ctgccagcgt gggcgacaga      120
          gtgaccatca catgtagggc ctccgagtct gtggataact atggcatcag ctttatgaat      180
          tggttccagc agaagccagg aggcgcccct aagctgctga tctacgcagc ctccatgcag      240
          ggctctggcg tgcccagccg ctttagcggc tccggctctg gcaccgattt caccctgaca      300
          atctctagcc tgcagccaga cgattttgcc acatactatt gccagcagtc caaggaggtg      360
          ccctggacct tcggccaggg cacaaaggtg gagatcaagg gcagcacctc cggctctggc      420
          aagcctggct ccggagaggg ctctacaaag ggacaggtgc agctggtgca gagcggagcc      480
          gaggtgaaga agccaggctc ctctgtgaag gtgagctgta aggcctccgg ctataccttt      540
          acagactaca acatgcactg ggtgagacag gcaccaggac agggcctgga gtggatcggc      600
          tacatctatc cttacaacgg cggcaccggc tataatcaga agttcaagag caaggccacc      660
          atcacagccg atgagtccac caatacagcc tacatggagc tgagcagcct gaggagcgag      720
          gacacagccg tgtactattg cgccagaggc aggcctgcta tggactattg gggccagggc      780
          accctggtga cagtgtctag c                                                801
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  540]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          atcgatcacg agactagcct cgagaagctt gatatcgaat tccacggggt tggacgcgtc       60
          ttaattaagg atccaaggtc aggaacagag aaacaggaga atatgggcca aacaggatat      120
          ctgtggtaag cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agttggaaca gcagaatatg      180
          ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt cctgccccgg ctcagggcca agaacagatg      240
          gtccccagat gcggtcccgc cctcagcagt ttctagagaa ccatcagatg tttccagggt      300
          gccccaagga cctgaaatga ccctgtgcct tatttgaact aaccaatcag ttcgcttctc      360
          gcttctgttc gcgcgcttct gctccccgag ctctatataa gcagagctcg tttagtgaac      420
          cgtcagatcg cctggagacg ccatccacgc tgttttgacc tccatagaag acaccgactc      480
          tagaggatcg atcccccggg ctgcaggaat tcaagcgaga agacaagggc agaaagcacc      540
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  604]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          gctgcaccac gtgatgtcct ctgagcggat cctccccgtg tctgggtcct ctccgggcat       60
          ctctcctccc tcacccaacc ccatgccgtc ttcactcgct gggttccctt ttccttctcc      120
          ttctggggcc tgtgccatct ctcgtttctt aggatggcct tctccgacgg atgtctccct      180
          tgcgtcccgc ctccccttct tgtaggcctg catcatcacc gtttttctgg acaaccccaa      240
          agtaccccgt ctccctggct ttagccacct ctccatcctc ttgctttctt tgcctggaca      300
          ccccgttctc ctgtggattc gggtcacctc tcactccttt catttgggca gctcccctac      360
          cccccttacc tctctagtct gtgctagctc ttccagcccc ctgtcatggc atcttccagg      420
          ggtccgagag ctcagctagt cttcttcctc caacccgggc ccctatgtcc acttcaggac      480
          agcatgtttg ctgcctccag ggatcctgtg tccccgagct gggaccacct tatattccca      540
          gggccggtta atgtggctct ggttctgggt acttttatct gtcccctcca ccccacagtg      600
          gggc                                                                   604
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  600]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          gattggtgac agaaaagccc catccttagg cctcctcctt cctagtctcc tgatattggg       60
          tctaaccccc acctcctgtt aggcagattc cttatctggt gacacacccc catttcctgg      120
          agccatctct ctccttgcca gaacctctaa ggtttgctta cgatggagcc agagaggatc      180
          ctgggaggga gagcttggca gggggtggga gggaaggggg ggatgcgtga cctgcccggt      240
          tctcagtggc caccctgcgc taccctctcc cagaacctga gctgctctga cgcggctgtc      300
          tggtgcgttt cactgatcct ggtgctgcag cttccttaca cttcccaaga ggagaagcag      360
          tttggaaaaa caaaatcaga ataagttggt cctgagttct aactttggct cttcaccttt      420
          ctagtcccca atttatattg ttcctccgtg cgtcagtttt acctgtgaga taaggccagt      480
          agccagcccc gtcctggcag ggctgtggtg aggagggggg tgtccgtgtg gaaaactccc      540
          tttgtgagaa tggtgcgtcc taggtgttca ccaggtcgtg gccgcctcta ctccctttct      600
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          ggggccacta gggacaggat                                                   20
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          ttctcctgtg gattcgggtc ac                                                22
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          ctctctggct ccatcgtaag ca                                                22
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          tcctgggcaa acagcataa                                                    19
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          gagctgcaga aggacaagat                                                   20
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          ctctgtgtca tctggatgtc tg                                                22
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          ctttgagctc tactggcttc tg                                                22
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          tcctgggcaa acagcataa                                                    19
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  22]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          ctttgagctc tactggcttc tg                                                22
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  18]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          gcgagtgaag acggcatg                                                     18
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          gtctgtgcta gctcttccag                                                   20
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  19]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          gcgatgtcag aagggtaaa                                                    19
          <![CDATA[<210>  45]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  45]]>
          ggcggacact ctgactacat                                                   20
          <![CDATA[<210>  46]]>
          <![CDATA[<211>  235]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  46]]>
          ggcatggggt tgggtgaggg aggagagatg cccggagagg acccagacac ggggaggatc       60
          cgctcagagg acatcacgtg gtgcagcggc gcgccggccg cagaaaggga gtagaggcgg      120
          ccacgacctg gtgaacacct aggacgcacc attctcacaa agggagtttt ccacacggac      180
          acccccctcc tcaccacagc cctgccagga cggggctggc tactggcctt atctc           235
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  243]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          gcgagtgaag acggcatggg gttgggtgag ggaggagaga tgcccggaga ggacccagac       60
          acggggagga tccgctcaga ggacatcacg tggtgcagcg gcgcgccggc cgcaggaagg      120
          gagtagaggc ggccacgacc tggtgaacac ctaggacgca ccattctcac aaagggagtt      180
          ttccacacgg acacccccct cctcaccaca gccctgccag gacggggctg gctactggcc      240
          tta                                                                    243
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  229]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          gcgagtgaag acggcatggg gttgggtgag ggaggagaga tgcccggaga ggacccagac       60
          acggggagga tccgctcaga ggacatcacg tggtgcagcg gcgcgcagag agggagtggc      120
          caactccatc actaggggtt cctgcggccg cagaaaggga gtagaggcgg ccacgacctg      180
          gtgaacacct aggacgcacc attctcacaa agggagtttt ccacacgga                  229
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  234]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          gcgagtgaag acggcatggg gttgggtgag ggaggagaga tgcccggaga ggacccagac       60
          acggggagga tccgctcaga ggacatcacg tggtgcagcg gccgcagaaa gggagtagag      120
          gcggccacga cctggtgaac acctaggacg caccattctc acaaagggag ttttccacac      180
          ggacaccccc ctcctcacca cagccctgcc aggacggggc tggctactgg cctt            234
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  972]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          ccaatcctgt ccctagtggc ccccactagg gacagcgatc gggtacatcg atcgcaggcg       60
          caatcttcgc atttcttttt tccaggtgag caagggcgag gaggataaca tggccatcat      120
          caaggagttc atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc gtgaacggcc acgagttcga      180
          gatcgagggc gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc cagaccgcca agctgaaggt      240
          gaccaagggt ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tcccctcagt tcatgtacgg      300
          ctccaaggcc tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacttgaagc tgtccttccc      360
          cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg tgaccgtgac      420
          ccaggactcc tccctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctgc gcggcaccaa      480
          cttcccctcc gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg cctcctccga      540
          gcggatgtac cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc tgaagctgaa      600
          ggacggcggc cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac aaggccaaga agcccgtgca      660
          gctgcccggc gcctacaacg tcaacatcaa gttggacatc acctcccaca acgaggacta      720
          caccatcgtg gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac tccaccggcg gcatggacga      780
          gctgtacaag taacgcggcc gccctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt      840
          tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa      900
          taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattcc caatcctgtc      960
          cctagtggcc cc                                                          972
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<211>  949]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  合成序列]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          ccaatcctgt ccctagtggc ccccactagg gacagcgatc gggtacatcg atcgcaggcg       60
          caatcttcgc atttcttttt tccaggtgag caagggcgag gaggataaca tggccatcat      120
          caaggagttc atgcgcttca aggtgcacat ggagggctcc gtgaacggcc acgagttcga      180
          gatcgagggc gagggcgagg gccgccccta cgagggcacc cagaccgcca agctgaaggt      240
          gaccaagggt ggccccctgc ccttcgcctg ggacatcctg tcccctcagt tcatgtacgg      300
          ctccaaggcc tacgtgaagc accccgccga catccccgac tacttgaagc tgtccttccc      360
          cgagggcttc aagtgggagc gcgtgatgaa cttcgaggac ggcggcgtgg tgaccgtgac      420
          ccaggactcc tccctgcagg acggcgagtt catctacaag gtgaagctgc gcggcaccaa      480
          cttcccctcc gacggccccg taatgcagaa gaagaccatg ggctgggagg cctcctccga      540
          gcggatgtac cccgaggacg gcgccctgaa gggcgagatc aagcagaggc tgaagctgaa      600
          ggacggcggc cactacgacg ctgaggtcaa gaccacctac aaggccaaga agcccgtgca      660
          gctgcccggc gcctacaacg tcaacatcaa gttggacatc acctcccaca acgaggacta      720
          caccatcgtg gaacagtacg aacgcgccga gggccgccac tccaccggcg gcatggacga      780
          gctgtacaag taacgcggcc gccctcgact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt      840
          tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa      900
          taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc attctattc                  949
          

Claims (117)

1. 一種供與規律間隔重複短回文序列簇(CRISPR)/CRISPR相關9 (Cas9)整合系統一起使用的質體，其中該質體依序包含左同源臂、編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽之聚核苷酸序列及右同源臂；其中該左同源臂及該右同源臂之長度各自為1000 bp或更短。
2. 如請求項1之質體，其中該CAR多肽包含跨膜域、共刺激域、CD3ζ信號傳導域及特異性結合至目標細胞上之受體的單鏈可變片段(scFV)。
3. 如請求項2之質體，其中該受體包含CD33。
4. 如請求項3之質體，其中特異性結合至CD33之scFV包含與SEQ ID NO: 29或其片段至少90%一致之序列。
5. 如請求項1至4中任一項之質體，其中該CAR多肽之該跨膜域包含CD4跨膜域、CD8跨膜域、CD28跨膜域、CD3ζ跨膜域或NKG2D跨膜域。
6. 如請求項1至5中任一項之質體，其中該CAR多肽之該共刺激域包含2B4域、CD28共刺激域、4-1 BB共刺激域或其任何組合。
7. 如請求項1至6中任一項之質體，其進一步包含在轉殖基因與該右同源臂之間的聚腺苷酸化信號。
8. 如請求項1至7中任一項之質體，其中該左同源臂及該右同源臂為相同長度。
9. 如請求項8之質體，其中該等同源臂之長度各自為30 bp。
10. 如請求項8之質體，其中該等同源臂之長度各自為300 bp。
11. 如請求項8之質體，其中該等同源臂之長度各自為600 bp。
12. 如請求項8之質體，其中該等同源臂之長度各自為1000 bp。
13. 如請求項1至7中任一項之質體，其中該左同源臂及該右同源臂為不同長度。
14. 如請求項1至13中任一項之質體，其中該等同源臂特異性地與人類染色體19之腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)雜交。
15. 如請求項1至14中任一項之質體，其進一步包含鼠白血病病毒源性(MND)啟動子。
16. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含如請求項1至15中任一項之質體。
17. 如請求項16之AAV載體，其中該AAV之血清型包含AAV6。
18. 如請求項16或17之AAV載體，其中該載體進一步包含編碼crRNA、示蹤劑RNA (trcrRNA)及CAS核酸內切酶之質體。
19. 如請求項16至18中任一項之AAV載體，其中該載體為單股AAV (ssAAV)。
20. 如請求項16至19中任一項之AAV載體，其中該載體為自互補AAV (scAAV)。
21. 如請求項16至20中任一項之AAV載體，其中該載體包含與SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 23或其片段至少90%一致之序列。
22. 一種經修飾細胞，其包含如請求項1至15中任一項之質體或如請求項16至21中任一項之AAV載體。
23. 如請求項22之經修飾細胞，其中該經修飾細胞為自然殺手(NK)細胞或NK T細胞。
24. 如請求項23之經修飾細胞，其中該NK細胞或NK T細胞已在表現膜結合IL-21、膜結合4-1BBL及/或膜結合IL-15或其任何組合之經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體存在下擴增。
25. 一種治療個體之癌症的方法，其包含向患有癌症之個體投與如請求項22至24中任一項之經修飾細胞。
26. 如請求項25之方法，其中該癌症包含白血病。
27. 一種基因修飾細胞之方法，其包含 a)獲得包含與對應CRISPR/Cas引導RNA複合之2類CRISPR/Cas核酸內切酶(Cas9)的核糖核蛋白(RNP)複合體及包含含有編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽之聚核苷酸序列的質體的AAV載體；其中該聚核苷酸序列側接同源臂；且其中該等同源臂之長度為800 bp或更短；及 b)將編碼該CAR多肽之該聚核苷酸序列及該RNP複合體引入至該細胞中；其中經由用該AAV感染至該細胞中而將編碼該CAR多肽之該聚核苷酸序列引入至該細胞中；其中該RNP複合體與該細胞之基因體DNA內的目標序列雜交，且該細胞之DNA修復酶將編碼該CAR多肽之該聚核苷酸序列在該細胞之基因體DNA內之該目標序列處插入至宿主基因體中，由此產生經修飾細胞。
28. 如請求項27之方法，其中該細胞為初級細胞或擴增細胞。
29. 如請求項28之方法，其中該初級細胞在感染之前在IL-2存在下培育約4至10天。
30. 如請求項28或29之方法，其中該初級細胞在感染之前在經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體存在下擴增約4至10天。
31. 如請求項30之方法，其中該等經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體表現膜結合4-1BBL、膜結合IL-21或膜結合IL-15或其任何組合。
32. 如請求項27至31中任一項之方法，其進一步包含在感染之後用經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體擴增該經修飾細胞，其中該等經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體表現膜結合4-1BBL、膜結合IL-21或膜結合IL-15或其任何組合。
33. 如請求項27至32中任一項之方法，其進一步包含在感染之後用IL-2擴增該經修飾細胞。
34. 如請求項27至33中任一項之方法，其中該細胞感染有約5至500,000感染倍率(MOI)之該AAV。
35. 如請求項27至34中任一項之方法，其中該RNP複合體係經由電穿孔引入至該細胞中。
36. 如請求項27至35中任一項之方法，其中該RNP複合體係經由轉染引入至該細胞中；且其中該RNP複合體係在相同或不同AAV上經編碼。
37. 如請求項27至36中任一項之方法，其中該細胞為自然殺手(NK)細胞或NK T細胞。
38. 如請求項27至37中任一項之方法，其中該CAR多肽包含跨膜域、共刺激域、CD3ζ信號傳導域及特異性結合至目標細胞上之受體的單鏈可變片段(scFV)。
39. 如請求項38之方法，其中該受體包含CD33。
40. 如請求項39之方法，其中特異性結合至CD33之scFV包含與SEQ ID NO: 29或其片段至少90%一致之序列。
41. 如請求項27至40中任一項之方法，其中該CAR多肽之該跨膜域包含CD4跨膜域、CD8跨膜域、CD28跨膜域、CD3ζ跨膜域或NKG2D跨膜域。
42. 如請求項27至41中任一項之方法，其中該CAR多肽之該共刺激域包含2B4域、CD28共刺激域、4-1 BB共刺激域或其任何組合。
43. 如請求項27至42中任一項之方法，其中該左同源臂及該右同源臂為相同長度。
44. 如請求項43之方法，其中該等同源臂之長度各自為600 bp。
45. 如請求項27至42中任一項之方法，其中該左同源臂及該右同源臂為不同長度。
46. 如請求項27至45中任一項之方法，其中該等同源臂特異性地與人類染色體19之腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)雜交。
47. 如請求項27至46中任一項之方法，其中該質體進一步包含鼠白血病病毒源性(MND)啟動子。
48. 如請求項27至47中任一項之方法，其中該AAV之血清型包含AAV6。
49. 如請求項27至48中任一項之方法，其中該載體為單股AAV (ssAAV)或自互補AAV (scAAV)。
50. 如請求項27至49中任一項之方法，其中該載體包含與SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 23或其片段至少90%一致之序列。
51. 一種產生嵌合抗原受體(CAR)自然殺手(NK)細胞或CAR NK T細胞之方法，其包含 a)獲得包含與對應CRISPR/Cas引導RNA複合之2類CRISPR/Cas核酸內切酶(Cas9)的核糖核蛋白(RNP)複合體及包含含有編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽之聚核苷酸序列的質體的AAV載體；其中該聚核苷酸序列側接同源臂；且其中該等同源臂之長度為1000 bp或更短；及 b)將編碼該CAR多肽之該聚核苷酸序列及該RNP複合體引入至NK細胞或NK T細胞中；其中經由用該AAV感染至該NK細胞或NK T細胞中而將編碼該CAR多肽之該聚核苷酸序列引入至該NK細胞或NK T細胞中；其中該RNP複合體與該NK細胞或NK T細胞之基因體DNA內的目標序列雜交，且該NK細胞或NK T細胞之該DNA修復酶將編碼該CAR多肽之該聚核苷酸序列在該細胞之基因體DNA內之該目標序列處插入至宿主基因體中，由此產生CAR NK細胞或CAR NK T細胞。
52. 如請求項51之方法，其中該等NK細胞或NK T細胞為初級或擴增NK細胞或NK T細胞。
53. 如請求項52之方法，其中該等初級NK細胞或NK T細胞在感染之前在IL-2存在下培育約4至10天。
54. 如請求項52或53之方法，其中該等初級NK細胞或NK T細胞在感染之前在經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體存在下擴增約4至10天。
55. 如請求項54之方法，其中該等經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體表現膜結合4-1BBL、膜結合IL-21或膜結合IL-15或其任何組合。
56. 如請求項51至55中任一項之方法，其進一步包含在感染之後用經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體擴增該CAR NK細胞，其中該等經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體表現膜結合4-1BBL、膜結合IL-21或膜結合IL-15或其任何組合。
57. 如請求項51至56中任一項之方法，其進一步包含在感染之後用IL-2擴增該CAR NK細胞或CAR NK T細胞。
58. 如請求項51至57中任一項之方法，其中該NK細胞或NK T細胞感染有約5至500 K MOI之該AAV。
59. 如請求項51至58中任一項之方法，其中該RNP複合體係經由電穿孔引入至該NK細胞或NK T細胞中。
60. 如請求項51至59中任一項之方法，其中該RNP複合體係經由轉染引入至該NK細胞或NK T細胞中；且其中該RNP複合體係在相同或不同AAV上經編碼。
61. 如請求項51至60中任一項之方法，其中該CAR多肽包含跨膜域、共刺激域、CD3ζ信號傳導域及特異性結合至目標細胞上之受體的單鏈可變片段(scFV)。
62. 如請求項61之方法，其中該受體包含CD33。
63. 如請求項62之方法，其中特異性結合至CD33之scFV包含與SEQ ID NO: 29或其片段至少90%一致之序列。
64. 如請求項51至63中任一項之方法，其中該CAR多肽之該跨膜域包含CD4跨膜域、CD8跨膜域、CD28跨膜域、CD3ζ跨膜域或NKG2D跨膜域。
65. 如請求項51至64中任一項之方法，其中該CAR多肽之該共刺激域包含2B4域、CD28共刺激域、4-1 BB共刺激域或其任何組合。
66. 如請求項51至65中任一項之方法，其中該左同源臂及該右同源臂為相同長度。
67. 如請求項66之方法，其中該等同源臂之長度各自為600 bp。
68. 如請求項51至65中任一項之方法，其中該左同源臂及該右同源臂為不同長度。
69. 如請求項51至68中任一項之方法，其中該等同源臂特異性地與人類染色體19之腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)雜交。
70. 如請求項51至69中任一項之方法，其中該質體進一步包含鼠白血病病毒源性(MND)啟動子。
71. 如請求項51至70中任一項之方法，其中該AAV之血清型包含AAV6。
72. 如請求項51至71中任一項之方法，其中該載體為單股AAV (ssAAV)或自互補AAV (scAAV)。
73. 如請求項51至72中任一項之方法，其中該載體包含與SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 23或其片段至少90%一致之序列。
74. 一種治療個體之癌症的方法，其包含向該個體投與治療有效量之藉由使用如請求項51至73中任一項之方法產生的該CAR NK細胞或該CAR NK T細胞。
75. 一種治療個體之癌症的方法，其包含向該個體投與治療有效量之自然殺手(NK)細胞或NK T細胞，其中該NK細胞或NK T細胞包含供與規律間隔重複短回文序列簇(CRISPR)/CRISPR相關9 (Cas9)整合系統一起使用的質體，其中該質體依序包含左同源臂、編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽之聚核苷酸序列及右同源臂；其中該左同源臂及該右同源臂之長度各自為1000 bp或更短。
76. 如請求項75之方法，其中該CAR多肽包含跨膜域、共刺激域、CD3ζ信號傳導域及特異性結合至目標細胞上之受體的單鏈可變片段(scFV)。
77. 如請求項76之方法，其中該受體包含CD33。
78. 如請求項77之方法，其中特異性結合至CD33之scFV包含與SEQ ID NO: 29或其片段至少90%一致之序列。
79. 如請求項75至78中任一項之方法，其中該CAR多肽之該跨膜域包含CD4跨膜域、CD8跨膜域、CD28跨膜域、CD3ζ跨膜域或NKG2D跨膜域。
80. 如請求項75至79中任一項之方法，其中該CAR多肽之該共刺激域包含2B4域、CD28共刺激域、4-1 BB共刺激域或其任何組合。
81. 如請求項75至80中任一項之方法，其進一步包含在轉殖基因與該右同源臂之間的聚腺苷酸化信號。
82. 如請求項75至81中任一項之方法，其中該左同源臂及該右同源臂為相同長度。
83. 如請求項82之方法，其中該等同源臂之長度各自為30 bp。
84. 如請求項82之方法，其中該等同源臂之長度各自為300 bp。
85. 如請求項82之方法，其中該等同源臂之長度各自為600 bp。
86. 如請求項82之方法，其中該等同源臂之長度各自為1000 bp。
87. 如請求項75至80中任一項之方法，其中該左同源臂及該右同源臂為不同長度。
88. 如請求項75至87中任一項之方法，其中該等同源臂特異性地與人類染色體19之腺相關病毒整合位點1 (AAVS1)雜交。
89. 如請求項75至88中任一項之方法，其進一步包含鼠白血病病毒源性(MND)啟動子。
90. 如請求項75至89中任一項之方法，其中該質體藉由腺相關病毒(AAV)載體轉導至該NK中。
91. 如請求項90之方法，其中該AAV之血清型包含AAV6。
92. 如請求項90或91之方法，其中該載體進一步包含編碼crRNA、示蹤劑RNA (trcrRNA)及CAS核酸內切酶之質體。
93. 如請求項90至92中任一項之方法，其中該載體為單股AAV (ssAAV)。
94. 如請求項90至93中任一項之方法，其中該載體為自互補AAV (scAAV)。
95. 如請求項90至94中任一項之方法，其中該載體包含與SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 23或其片段至少90%一致之序列。
96. 如請求項75至95中任一項之方法，其中該癌症包含急性淋巴球性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性骨髓性白血病(CML)、毛細胞白血病(HCL)或骨髓發育不良症候群(MDS)。
97. 一種供與規律間隔重複短回文序列簇(CRISPR)/CRISPR相關9 (Cas9)整合系統一起使用的質體，其中該質體包含編碼嵌合抗原受體(CAR)多肽之聚核苷酸序列；其中該聚核苷酸序列鄰近於一個原間隔序列相鄰模體(PAM)及一個編碼crispr RNA (crRNA)之聚核苷酸序列或側接兩個PAM及兩個編碼crRNA之聚核苷酸序列。
98. 如請求項97之質體，該質體依序包含一個PAM序列及一個編碼crRNA之聚核苷酸序列、編碼該CAR多肽之該聚核苷酸序列以及一個PAM序列及一個編碼crRNA之聚核苷酸序列。
99. 如請求項97或98之質體，其中該CAR多肽包含跨膜域、共刺激域、CD3ζ信號傳導域及特異性結合至目標細胞上之受體的單鏈可變片段(scFv)。
100. 如請求項99之質體，其中該受體包含CD33。
101. 如請求項100之方法，其中特異性結合至CD33之scFV包含與SEQ ID NO: 29或其片段至少90%一致之序列。
102. 如請求項97至101中任一項之質體，其中該CAR多肽之該跨膜域包含CD4跨膜域、CD8跨膜域、CD28跨膜域、CD3ζ跨膜域或NKG2D跨膜域。
103. 如請求項97至102中任一項之質體，其中該CAR多肽之該共刺激域包含2B4域、CD28共刺激域、4-1 BB共共刺激域或任何組合。
104. 如請求項97至103中任一項之質體，其進一步包含鼠白血病病毒源性(MND)啟動子。
105. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含如請求項97至104中任一項之質體。
106. 如請求項105之AAV載體，其中該AAV之血清型包含AAV6。
107. 如請求項105或106之AAV載體，其中該載體進一步包含編碼crRNA、示蹤劑RNA (trcrRNA)及CAS核酸內切酶之質體。
108. 如請求項105至107中任一項之AAV載體，其中該載體為單股AAV (ssAAV)或自互補AAV (scAAV)。
109. 一種經修飾細胞，其包含如請求項97至104中任一項之質體或如請求項105至108中任一項之AAV載體。
110. 如請求項109之經修飾細胞，其中該經修飾細胞為自然殺手(NK)細胞或NK T細胞。
111. 如請求項110之經修飾細胞，其中該NK細胞或NK T細胞已在表現膜結合IL-21、膜結合4-1BBL及/或膜結合IL-15或其任何組合之經輻射餵養細胞、質膜粒子或胞外體存在下擴增。
112. 一種治療個體之癌症的方法，其包含向患有癌症之個體投與如請求項109至111中任一項之經修飾細胞。
113. 如請求項112之方法，其中該癌症包含白血病。
114. 一種產生嵌合抗原受體(CAR)自然殺手(NK)細胞或NK T細胞之方法，其包含 a)獲得包含與對應CRISPR/Cas引導RNA複合之2類CRISPR/Cas核酸內切酶(Cas9)的核糖核蛋白(RNP)複合體及包含含有編碼嵌合抗原受體(CAR)之聚核苷酸序列的質體的AAV載體；其中該聚核苷酸序列鄰近於一個原間隔序列相鄰模體(PAM)及一個編碼crispr RNA (crRNA)之聚核苷酸序列或側接兩個PAM及兩個編碼crRNA之聚核苷酸序列；及 b)將編碼該CAR多肽之該聚核苷酸序列及該RNP複合體引入至該NK細胞或NK T細胞中；其中經由用該腺相關病毒(AAV)感染至目標細胞中而將該質體引入至該細胞中；其中該核糖核蛋白(RNP)複合體與該細胞之基因體DNA內的目標序列雜交，且該細胞之DNA修復酶將編碼該CAR之該聚核苷酸在該目標序列處插入至該宿主基因體中，由此產生CAR NK細胞或CAR NK T細胞。
115. 如請求項114之方法，其中該質體依序包含一個PAM序列及一個編碼crRNA之聚核苷酸序列、編碼該CAR多肽之該聚核苷酸序列以及一個PAM序列及一個編碼crRNA之聚核苷酸序列。
116. 一種基因修飾自然殺手(NK)細胞或NK T細胞之方法，其包含 a)獲得包含與對應CRISPR/Cas引導RNA複合之2類CRISPR/Cas核酸內切酶(Cas9)的核糖核蛋白(RNP)複合體及包含含有編碼嵌合抗原受體(CAR)之聚核苷酸序列的質體的AAV載體；其中該聚核苷酸序列鄰近於一個PAM及一個編碼crRNA之聚核苷酸序列或側接兩個PAM及兩個編碼crRNA之聚核苷酸序列；及 b)將編碼該CAR多肽之該聚核苷酸序列及該RNP複合體引入至該NK細胞或NK T細胞中；其中經由用該腺相關病毒(AAV)感染至目標細胞中而將編碼該CAR多肽之該聚核苷酸序列引入至該細胞中；其中該核糖核蛋白(RNP)複合體與該細胞之基因體DNA內的目標序列雜交，且該細胞之DNA修復酶將編碼該嵌合抗原受體(CAR)之該聚核苷酸序列在該目標序列處插入至該宿主基因體中，由此產生經修飾細胞。
117. 如請求項116之方法，其中該質體依序包含一個PAM序列及一個編碼crRNA之聚核苷酸序列、編碼該CAR多肽之該聚核苷酸序列以及一個PAM序列及一個編碼crRNA之聚核苷酸序列。

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