KR20220066914A - 부정맥 유발성 우심실 심근병증의 유전자 요법 조성물 및 치료 - Google Patents

Abstract

인간 대상체에서 심근병증을 치료 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 치료 용량의 유전자 요법 벡터를 인간 대상체의 심근세포에 전달하는 단계를 포함하며, 여기서 유전자 요법 벡터는 PKP2를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

Description

부정맥 유발성 우심실 심근병증의 유전자 요법 조성물 및 치료

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2019년 9월 20일 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/903,103을 우선권 주장하며, 그 개시내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

본 발명의 기술분야

본 발명은 심장 질환 (예컨대, 심근증)의 치료, 및 더욱 구체적으로, 심근병증 치료를 위한 유전자 요법 방법 및 제약 조성물에 관한 것이다.

예컨대, 심부전과 같은 다양한 심장 병태 치료에서의 약리학적 진보에도 불구하고, 사망률 및 이환율은 허용할 수 없을 정도로 여전히 높다. 추가로, 특정 치료 접근법은 많은 환자 (예컨대, 다른 동반 질환과 연관된 진행성 심부전 병태를 앓는 환자)에게 적합하지 않다. 예컨대, 유전자 요법 및 세포 요법과 같은 대체 접근법은 많은 심장 질환의 근본적 원인의 발병기전을 해결하는 데 있어 고유하게 맞춤화되고, 효과적일 수 있는 그의 잠재능에 기인하여 그에 대한 관심은 계속해서 증가하고 있다.

본 발명의 목적 및 요약

본 발명의 목적은 인간 대상체의 심근세포에 치료 폴리뉴클레오티드 서열을 전달하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 특정 실시양태의 추가 목적은 예컨대, 아데노-연관 바이러스와 같은 바이러스 벡터에서 플라코필린-2 (PKP2) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 벡터화하는 것이다.

본 발명의 특정 실시양태의 추가 목적은 PKP2-돌연변이화된 심근세포에서 반가불충분성을 교정하기 위한 유전자 요법 방법을 이용하는 것이다.

상기 목적 및 다른 목적은 특정 실시양태에서, 인간 대상체의 심근병증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 본 발명에 의해 충족된다. 본 방법은 예컨대, 치료 용량의 유전자 요법 벡터를 인간 대상체의 심근세포에 전달하는 단계이며, 여기서 유전자 요법 벡터는 PKP2를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인 단계를 포함한다.

일부 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 그의 변이체, 및 그의 조합 중 하나 이상의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV6 또는 AAV9를 포함한다.

일부 실시양태에서, 치료 용량은 인간 대상체의 심근세포에 의한 PKP2 단백질의 생산을 수행함으로써 부정맥 유발성 우심실 심근병증 (ARVC)을 치료 또는 예방하는 데 효과적이다.

특정 다른 실시양태는 인간 대상체의 심근세포 내에서 핵산 서열을 발현하도록 적합화된 유전자 요법 벡터에 관한 것이다. 핵산 서열은 예컨대, PKP2 단백질을 코딩하는 제1 서열 및 프로모터를 포함하는 제2 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 바이러스 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 그의 변이체, 및 그의 조합 중 하나 이상의 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 AAV6 또는 AAV9를 포함한다.

일부 실시양태에서, 프로모터는 TNNT2를 포함한다.

정의

본원에서 사용되는, "하나"라는 단수 형태는 문맥상 달리 명확하게 명시되지 않는 한, 복수의 지시대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "한 약물"에 대한 언급은 단일 약물 뿐만 아니라, 2개 이상의 상이한 약물의 혼합물을 포함하고; 한 "바이러스 벡터"에 대한 언급은 단일 바이러스 벡터 뿐만 아니라, 2개 이상의 상이한 바이러스 벡터의 혼합물 등을 포함한다.

또한, 본원에서 사용되는, 측정된 양과 관련하여 사용될 때, "약"은 측정을 수행하고, 측정 목적 및 측정 장비의 정밀도에 상응하는 관리 수준을 실행하는 데 있어 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 예상되는 측정된 양의 정상적인 변동을 의미한다. 특정 실시양태에서, 용어 "약"은 수치 ±10%를 포함하며, 이에 따라 "약 10"은 9 내지 11을 포함한다.

또한, 본원에서 사용되는, "폴리뉴클레오티드"는 관련 기술분야에서 그의 일반적이고, 통상적인 의미를 가지며, 예컨대, DNA 또는 RNA 분자와 같은 임의의 중합체 핵산 뿐만 아니라, 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 화학적 유도체를 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 치료 단백질을 코딩하는 것 뿐만 아니라, 관련 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 표적화된 핵산 서열의 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있는 서열 (예컨대, 안티센스, 간섭 또는 작은 간섭 핵산)을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 또한 표적화된 핵산 서열의 발현 또는 심혈관계의 세포 내 표적화된 단백질의 생산을 개시하거나, 또는 증가시키는 데 사용될 수 있다. 표적화된 핵산 및 단백질로는 정상적으로는 표적화된 조직에서 발견되는 핵산 및 단백질, 상기 자연적으로 발생된 핵산 또는 단백질의 유도체, 정상적으로는 표적화된 조직에서 발견되지 않는 자연적으로 발생된 핵산 또는 단백질, 또는 합성 핵산 또는 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 조합하여 사용될 수 있고/거나, 동시에 및/또는 순차적으로 투여하여 하나 이상의 표적화된 핵산 서열 또는 단백질을 증가 및/또는 감소시킬 수 있다.

또한, 본원에서 사용되는, "외인성" 핵산 또는 유전자는 핵산 전달에 사용되는 벡터에서 자연적으로 발생하지 않는 것이며; 예를 들어, 바이러스 벡터에서 자연적으로 발견되지는 않지만, 이 용어는 환자 또는 숙주에서 자연적으로 발생하는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 배제하려는 것으로 의도되지 않는다.

또한, 본원에서 사용되는, "심장 세포"는 예컨대, 심장 근육 세포, 심장 혈관계의 세포, 또는 심장 판막에 존재하는 세포와 같이, 심장의 구조를 유지하거나, 심장의 기능을 제공하는 데 관여하는 심장의 임의의 세포를 포함한다. 심장 세포로는 (정상 및 비정상적인 전기적 특성, 둘 모두를 갖는) 심근 세포, 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 전도 조직의 세포, 심박 조율 세포 및 뉴런을 포함한다.

또한, 본원에서 사용되는, "아데노-연관 바이러스" 또는 "AAV"는 모든 서브타입, 혈청형, 및 슈도타입 뿐만 아니라, 자연적으로 발생된 형태 및 재조합 형태를 포함한다. 다양한 AAV 혈청형 및 균주가 관련 기술분야에 공지되어 있고, ATCC 및 학술적 또는 상업적 출처와 같은 출처로부터 공개적으로 입수가능하다. 대안적으로, 다양한 데이터베이스로부터 공개 및/또는 입수가능한 AAV 혈청형 및 균주로부터의 서열은 공지된 기술을 사용하여 합성될 수 있다.

또한, 본원에서 사용되는, "혈청형"은 정의된 항혈청과의 캡시드 단백질 반응성에 기초하여 다른 AAV에 의해 확인되고, 그와 구별되는 AAV를 지칭한다. AAV1 내지 AAV12를 포함하여 적어도 12개의 인간 AAV 혈청형이 공지되어 있지만, 추가 혈청형이 계속 발견되고 있고, 새로 발견된 혈청형의 사용이 고려된다.

또한, 본원에서 사용되는, "슈도타이핑된" AAV는 한 혈청형으로부터의 캡시드 단백질 및 상이한 또는 이종 혈청형의 5' 및 3' 역 말단 반복부 (ITR)를 포함하는 바이러스 게놈을 함유하는 AAV를 지칭한다. 슈도타이핑된 재조합 AAV (rAAV)는 캡시드 혈청형의 세포 표면 결합 특성 및 ITR 혈청형과 일치하는 유전적 특성을 가질 것으로 예상된다. 슈도타이핑된 rAAV는 VP1, VP2, 및 VP3 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드 단백질, 및 캡시드 단백질이 ITR의 혈청형(들)에 대해 이종성인 혈청형인 한, AAV1에서 AAV12까지의 임의의 영장류 AAV 혈청형을 포함하는 임의의 혈청형 AAV로부터의 ITR을 포함할 수 있다. 슈도타이핑된 rAAV에서, 5' 및 3' ITR은 동일하거나 이종성일 수 있다. 슈도타이핑된 rAAV는 관련 기술분야에 기술된 표준 기술을 사용하여 생산된다.

또한, 본원에서 사용되는, "키메라" rAAV 벡터는 이종 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터를 포함하고; 즉, rAAV 벡터는 그의 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3에 대해 키메라일 수 있으며, VP1, VP2 및 VP3은 모두 동일한 혈청형 AAV가 아니다. 본원에서 사용되는, 키메라 AAV는 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3이 예를 들어, AAV1 및 AAV2로부터의 캡시드 단백질을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 혈청형이 상이하고; 다른 파보 바이러스 캡시드 단백질의 혼합물이거나, 다른 바이러스 단백질 또는 다른 단백질, 예컨대, 예를 들어, 원하는 세포 또는 조직으로의 AAV 전달을 표적화하는 단백질을 포함하는 AAV를 포함한다. 본원에서 사용되는, 키메라 rAAV는 또한 키메라 5' 및 3' ITR을 포함하는 rAAV를 포함한다.

또한, 본원에서 사용되는, "제약상 허용되는 부형제 또는 담체"는 제제에서 활성제와 조합되는 조성물 중의 임의의 불활성 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 부형제는 탄수화물 (예컨대, 포도당, 수크로스 또는 덱스트란), 항산화제 (예컨대, 아스코르브산 또는 글루타티온), 킬레이팅제, 저분자량 단백질, 고분자량 중합체, 겔 형성제, 또는 다른 안정제 및 첨가제를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 제약상 허용되는 담체의 다른 예로는 습윤화제, 유화제, 분산화제 또는 보존제를 포함하며, 이는 미생물의 성장 또는 작용을 막는 데 특히 유용하다. 다양한 보존제가 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 페놀 및 아스코르브산을 포함한다. 담체, 안정제 또는 애주번트의 예는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)]에서 살펴볼 수 있다.

또한, 본원에서 사용되는, "환자"는 특정 증상 또는 치료가 필요함을 시사하는 증상의 임상적 소견을 나타내거나, 병태에 대한 예방적 치료를 받거나, 또는 치료하고자 하는 병태에 대한 진단을 받은 대상체, 특히, 인간 (그러나, 이는 비인간도 포함할 수 있다)을 지칭한다.

또한, 본원에서 사용되는, "대상체"는 용어 "환자"의 정의를 포함하며, 달리 건강한 개체를 배제하지는 않는다.

또한, 본원에서 사용되는, "~의 치료" 및 "치료하는"은 예컨대, 심장 질환과 같은 병태의 중증도를 감소시키거나, 또는 상기 병태를 예방하기 위한 의도로 약물을 투여하는 것을 포함한다.

또한, 본원에서 사용되는, "~의 예방" 및 "예방하는"은 예컨대, 심장 질환과 같은 병태의 발병을 방지하는 것을 포함한다.

또한, 본원에서 사용되는, "병태" 또는 "병태들"은 대상체에게 유효량의 약물을 투여함으로써 치료, 완화 또는 예방될 수 있는 심장 질환과 같은 의학적 상태를 지칭한다

또한, 본원에서 사용되는, "유효량"은 유익하거나, 또는 원하는 효과의 검출을 위해 통상적으로 사용되는 방법에 의해 용이하게 검출가능한 수준으로 상기 효과를 생성하는 데 충분한 약물의 양을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 효과는 약물이 투여되지 않은 기초 수준의 값으로부터 적어도 10%의 변화를 초래한다. 다른 실시양태에서, 변화는 기초 수준으로부터 적어도 20%, 50%, 80%, 또는 훨씬 더 높은 백분율의 변화이다. 하기 기술되는 바와 같이, 약물의 유효량은 대상체의 연령, 일반적인 상태, 치료되는 병태의 중증도, 투여되는 특정 약물 등에 따라 대상체마다 다를 수 있다. 임의의 개별 경우에서 적절한 "유효"량은 관련 텍스트 및 문헌을 참조하고/거나, 통상의 실험을 사용하여 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다

또한, 본원에서 사용되는, "활성제"는 해당 목적에 대해 정부 기관의 승인을 받았는지 여부와는 상관 없이, 치료, 예방 또는 다른 의도된 효과를 생성하도록 의도된 임의의 물질을 지칭한다.

본원에서 값의 범위를 언급하는 것은 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 범위 내에 포함되는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 속기 방법으로서 역할을 하기 위한 것일 뿐이며, 각각의 개별 값은 마치 본원에서 개별적으로 언급된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 달리 명시되지 않는 한, 또는 문맥상 명백히 모순되지 않는 한, 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 모든 예, 또는 예시적인 표현 (예컨대, "예컨대")의 사용은 단지 특정 물질 및 방법을 설명하기 위한 것이며, 범주에 제한을 두지 않는다. 본 명세서에서 어떤 표현도 청구되지 않은 요소를 개시된 물질 및 방법의 실행에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.

상세한 설명

부정맥 유발성 우심실 심근병증 (ARVC)은 원발성 심장 근육 장애이며, 젊은 개체에서 심장 돌연사 (SCD)의 주요 원인이다. 이는 심근 변성 및 심근의 섬유 지방 대체를 특징으로 하며, 이는 우심실 및/또는 좌심실에 존재할 수 있고, 궁극적으로 진행성 심부전으로 이어질 수 있다. 임상 심장 표현형은 전형적인 심전도 이상, 심실 부정맥의 부담 증가, 심장 자기 공명 영상에서 광범위한 심근 흉터를 특징으로 한다.

ARVC는 대략 50%의 사례에서는 가족성이며, 일반적으로 상염색체 우성 형질로 유전된다. 코카서스계 환자 중 약 30%는 PKP2 유전자에 우성 돌연변이를 보유하고 있다. 대부분의 돌연변이는 삽입-결실, 넌센스 또는 스플라이스 부위 돌연변이에 기인하여 비정상적이거나, 또는 말단절단된 단백질을 생성하고, 그 결과로 반가불충분성을 초래한다.

ARVC는 심근세포 사이에 기계적 부착을 제공하는 전자 조밀 구조인 데스모솜 장애인 것으로 간주된다. PKP2는 데스모솜 단백질 복합체의 일부를 형성하고, ARVC로 이어지는 돌연변이가 확인된 여러 유전자들 중 하나이다. 반가불충분성을 통한 PKP2 단백질의 부족은 기계적 및 신호전달 결과로 데스모솜 단백질 복합체를 불안정하게 만들다.

기계적 구성요소는 시험관내에서 예컨대, 상이한 콜라겐과 같은 여러 세포외 기질 유전자의 하향 조절 및 피브릴 형성 콜라겐, 피브로넥틴 및 예컨대, TIMP1과 같은 다른 섬유증 유발성 마커의 강력한 상향 조절을 포함하는 기계적 스트레스 조건하에서 PKP2 단백질 결여로 유발되는 비정상적인 유전자 발현 패턴에 의해 강조된다. 임상전 및 임상 상황에서, 이는 PKP2-마우스 모델에서의 운동에 의한 ARVC의 악화 및 예컨대, 운동선수와 같은 인간의 표현형에 대한 운동의 해로운 영향에 의해 반영된다. 신호전달 수준에서 플라코필린 결여는 플라코글로빈의 핵으로의 전위를 유발하고, 이는 정규 Wnt/b-카테닌 신호전달을 감소시키고, 섬유형성 및 지방형성 유전자의 발현을 증가시킨다.

PKP2의 두 가지 주요 형태는 PKP2 이소형 2a (서열식별번호 (SEQ ID NO:) 2) 및 PKP2 이소형 2b (서열식별번호 4)를 포함한다. PKP2 이소형 2a에 대한 PKP2 유전자의 단백질 코딩 부분은 2764 bp cDNA 서열 (진뱅크(GenBank): BC126199.1; 서열식별번호 1)에 함유되어 있으며, 이는 본 발명에 의해 AAV에서 벡터화될 수 있다. 본원에서 사용되는, "PKP2" 또는 "PKP2 단백질"은 문맥에서 달리 언급되거나, 또는 암시되지 않는 한, PKP2 이소형 2a 및 PKP2 이소형 2b를 포함하는 PKP2의 이소형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

특정 실시양태는 AAV9-TNNT2-PKP2-매개 유전자 전달을 통해 정상 대립유전자를 치환함으로써 PKP2 단백질의 반가불충분성을 교정할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 예컨대, (1) PKP2 단백질을 데스모솜으로 정확하게 국재화할 수 있고; (2) PKP2-돌연변이화된 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포 (iPSC-CM)에서 반가불충분성을 교정하고, 결과적으로 데스모솜 단백질 복합체를 교정할 수 있다. 특정 실시양태는 또한 트랜스로 2개의 병원성 돌연변이를 보유하는 iPSC-CM에서 완전하거나 거의 완전한 PKP2 결핍을 초래하는 것으로 고려된다. 심근세포로의 PKP2 폴리뉴클레오티드의 전달을 시험하기 위한 비제한적인 예시적 실시양태는 (1) TNNT2 프로모터를 사용하여 AAV9 및/또는 AAV6으로 PKP2를 벡터화하는 것; PKP2 돌연변이 (1개의 돌연변이 또는 트랜스로 2개 돌연변이)를 보유하는 생성된 iPSC-CM 생성하고; 시험관내에서 AAV6-PKP2 또는 AAV9-PKP2를 2D PKP2-돌연변이화된 심근세포 배양물 (1개 또는 2개의 돌연변이 보유)에 형질도입하고, 데스모솜으로의 세포하 국재화를 시험하고; 세포 크기, 수축성 및 트랜스크립톰 분석을 포함한 분자 및 생리학적 데이터를 시험한다.

본원에서 다수의 실시양태가 PKP2 단백질과 관련하여 기술되어 있지만, 추가 단백질 (예를 들어, 근절 단백질)의 발현이 고려되는 것을 이해하여야 한다. PKP2에 추가하여 예시적인 단백질로는 제한 없이, SERCA2, MYBPC3, MYH7, MYL3, MYL2, ACTC1, TPM1, TNNT2, TNNI3, TTN, FHL1, ALPK3, 디스트로핀, FKRP, 그의 변이체, 또는 그의 조합 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다. 사용된 단백질 또는 단백질들은 또한 본원에 언급된 단백질의 기능적 변이체일 수 있고, 원래의 단백질과 비교하여 상당한 아미노산 서열 동일성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 아미노산 동일성은 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%에 이를 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "기능적 변이체"란, 자연적으로 발생된 상응하는 단백질의 기능을 부분적으로 또는 완전히 수행할 수 있다는 것을 의미한다. 단백질의 기능적 변이체는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 그의 자연적으로 발생된 대응물과 상이한 단백질을 포함할 수 있다.

아미노산 치환은 보존적, 또는 비보존적 치환일 수 있다. 치환은 보존적 치환, 즉, 기능적 등가물로서 작용하는, 극성이 유사한 아미노산에 의한 아미노산 잔기의 치환인 것이 바람직하다. 바람직하게, 치환기로서 사용되는 아미노산 잔기는 치환되는 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 소수성 잔기는 또 다른 소수성 잔기로 치환될 수 있거나, 극성 잔기는 동일한 전하를 갖는 또 다른 극성 잔기로 치환될 수 있다. 보존적 치환을 위해 사용될 수 있는, 기능적으로 상동성인 아미노산은 예를 들어, 글리신, 발린, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌 및 트립토판과 같은 비극성 아미노산을 포함한다. 비하전된 극성 아미노산의 예로는 세린, 트레오닌, 글루타민, 아스파라긴, 티로신 및 시스테인을 포함한다. 하전된 극성 (염기성) 아미노산의 예로는 히스티딘, 아르기닌 및 리신을 포함한다. 하전된 극성 (산성) 아미노산의 예로는 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

하나 이상의 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 10, 또는 15개의) 추가 아미노산에 의한 그의 자연적으로 발생된 대응물과 상이한 단백질 또한 변이체로 간주된다. 상기 추가 아미노산은 원래의 단백질의 아미노산 서열 내에 존재할 수 있거나 (즉, 삽입으로서), 단백질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 부가될 수 있다. 기본적으로, 아미노산 부가가 치료하고자 하는 대상체에서 자연적으로 발생된 단백질의 기능을 수행하는 폴리펩티드의 능력을 손상시키지 않는다면, 삽입은 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 더욱이, 단백질의 변이체는 또한 원래의 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 결여된 단백질을 포함한다. 상기 결실은 단백질의 정상적인 기능을 수행하는 능력을 손상시키지 않는다면, 임의의 아미노산 위치에 영향을 미칠 수 있다.

마지막으로, 심장 근절 단백질 (예컨대, PKP2)의 변이체는 또한 예컨대, 변형된 아미노산과 같이, 구조적 변형에 의해 자연적으로 발생된 단백질과 상이한 단백질을 지칭한다. 변형된 아미노산은 자연적 프로세스, 예컨대, 프로세싱 또는 번역 후 변형에 의해, 또는 관련 기술분야에 공지된 화학적 변형 프로세스에 의해 변형된 아미노산이다. 전형적인 아미노산 변형은 인산화, 글리코실화, 아세틸화, O-연결된 N-아세틸글루코사민화, 글루타티오닐화, 아실화, 분지화, ADP 리보실화, 가교, 이황화 브릿지 형성, 포르밀화, 히드록실화, 카르복실화, 메틸화, 탈메틸화, 아미드화, 고리화 및/또는 포스포티딜이노시톨, 플라빈 유도체, 리포테이콘산, 지방산 또는 지질에의 공유 또는 비공유 결합을 포함한다.

표적 단백질을 코딩하는 치료 폴리뉴클레오티드 서열은 유전자 요법 벡터, 즉, 예컨대, 프로모터, 코작 서열, 폴리A 신호 등과 같이, 외인성 핵산의 발현을 제공하기 위해 필요한 다른 서열 바로 옆에 번역 및 종결 코돈을 포함하는 코딩 서열을 포함하는 핵산 구축물의 형태로 치료하고자 하는 대상체에게 투여될 수 있다.

예를 들어, 유전자 요법 벡터는 포유동물 발현 시스템의 일부일 수 있다. 유용한 포유동물 발현 시스템 및 발현 구축물은 상업적으로 이용가능하다. 또한, 여러 포유동물 발현 시스템은 다른 제조업체에 의해 배포되며, 예컨대, 플라스미드 또는 바이러스 벡터 기반 시스템, 예컨대, LENTI-스마트(LENTI-Smart)™(인비보겐(InvivoGen)), 진스크립트™ 익스프레션(GenScript™ Expression) 벡터, pAdVAntage™ (프로메가(Promega)), 비라파워™ 렌티바이럴(ViraPower™ Lentiviral), 아데노바이럴 익스프레션 시스템즈(Adenoviral Expression Systems) (인비트로겐(Invitrogen)), 및 아데노-연관 바이러스 발현 시스템 (셀 바이오랩스(Cell Biolabs))과 같이 본 발명에 사용될 수 있다.

본 발명의 외인성 치료 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시키기 위한 유전자 요법 벡터는 예를 들어, 상기 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 후속 발현을 위해 외인성 치료 폴리뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는 데 적합한 바이러스 또는 비-바이러스 발현 벡터일 수 있다. 발현 벡터는 에피솜 벡터, 즉, 숙주 세포 내에서 자율적으로 자기 복제할 수 있는 것, 또는 통합 벡터, 즉, 세포의 게놈에 안정적으로 도입되는 통합 벡터일 수 있다. 숙주 세포에서의 발현은 구성적이거나 조절될 수 있다 (예컨대, 유도성).

특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 바이러스 발현 벡터이다. 본 발명에서 사용하기 위한 바이러스 벡터는, 바이러스의 감염성을 파괴하지 않으면서 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위해 천연 서열의 일부가 결실된 바이러스 게놈을 포함할 수 있다. 바이러스 구성요소와 숙주 세포 수용체 사이의 특이적인 상호작용에 기인하여, 바이러스 벡터는 유전자를 표적 세포로 효율적으로 전달하는 데 매우 적합하다. 포유동물 세포 내로의 유전자 전달을 촉진시키는 데 적합한 바이러스 벡터는 상이한 유형의 바이러스로부터, 예를 들어, AAV, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 단순 포진 바이러스, 소 유두종 바이러스, 렌티바이러스, 백시니아 바이러스, 폴리오마 바이러스, 센다이 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 파포바바이러스, 피코르나바이러스, 폭스 바이러스, 알파바이러스, 또는 유전자 요법에 적합한 임의의 다른 바이러스 셔틀, 그의 변이체, 및 그의 조합으로부터 유래될 수 있다.

"아데노바이러스 발현 벡터" 또는 "아데노바이러스"는 (a) 치료 폴리뉴클레오티드 서열 구축물의 패키징을 지원하고/하거나, (b) 궁극적으로는 그의 클로닝이 이루어진 조직 및/또는 세포 특이적 구축물을 발현시키는 데 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 구축물을 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 발현 벡터는 유전자 조작된 형태의 아데노바이러스를 포함한다. 36 킬로베이스 (kb), 선형, 이중 가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스의 유전적 조직에 대한 지식을 통해 아데노바이러스 DNA의 큰 조각을 최대 7 kb의 외래 서열로 치환할 수 있다.

아데노바이러스 성장 및 조작은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있으며, 시험관내 및 생체내에서 광범위한 숙주 범위를 나타낸다. 상기 바이러스 군은 예컨대, mL당 10⁹ 내지 10¹¹ 플라크 형성 단위와 같은 높은 역가로 수득될 수 있고, 감염성이 높다. 아데노바이러스의 수명 주기는 숙주 세포 게놈으로의 통합을 필요로 하지 않는다. 아데노바이러스 벡터에 의해 전달되는 외래 유전자는 에피솜이며, 숙주 세포에 대한 유전독성이 낮다. 야생형 아데노바이러스 백신 접종 연구에서 부작용이 보고되지 않았으며, 이는 생체내 유전자 전달 벡터로서의 안전성 및/또는 치료 잠재능을 입증하는 것이다.

레트로바이러스 (또는 "레트로바이러스 벡터"로도 지칭)는 다량의 외래 유전 물질을 전달하고, 광범위한 종 및 세포 유형을 감염시키면서, 그의 유전자를 숙주 게놈 내로 통합시킬 수 있는 그의 능력에 기인하여 유전자 전달 벡터로서, 및 특수 세포주에 패키징하기 위한 것으로 선택될 수 있다.

레트로바이러스 게놈은 각각 캡시드 단백질, 폴리머라제 효소 및 외피 구성요소를 코딩하는 3개의 유전자, gag, pol 및 env를 포함한다. gag 유전자의 상류에서 발견된 서열은 게놈을 비리온으로 패키징하기 위한 신호를 포함한다. 2개의 긴 말단 반복부 (LTR) 서열이 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단에 존재한다. 이는 강력한 프로모터 및 인핸서 서열을 포함하며, 숙주 세포 게놈에서의 통합을 위해서도 요구된다.

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위해, 관심 유전자를 코딩하는 핵산을 특정 바이러스 서열 대신 바이러스 게놈에 삽입하여 복제-결함 바이러스를 생성한다. 비리온을 생성하기 위해, gag, pol 및/또는 env 유전자를 포함하지만, LTR 및/또는 패키징 구성요소가 없는 패키징 세포주를 구축한다. cDNA를 포함하는 재조합 플라스미드가 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 (예를 들어, 인산칼슘 침전에 의해) 상기 세포주에 도입될 때, 패키징 서열을 통해 재조합 플라스미드의 RNA 전사체는 바이러스 입자로 패키징될 수 있고, 이는 이어서, 배양 배지로 분비된다. 이어서, 재조합 레트로바이러스를 포함하는 배지를 수집하고, 임의적으로 농축시키고, 유전자 전달에 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 매우 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정적인 발현을 위해서는 숙주 세포가 분열되어야 한다.

레트로바이러스는 임의의 아과(subfamily)로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 뮤린 육종 바이러스, 소 백혈병 바이러스, 라우스 육종 바이러스, 뮤린 백혈병 바이러스, 밍크 세포 병소 유도 바이러스, 세망내피증 바이러스 또는 조류 백혈증 바이러스로부터의 벡터가 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 재조합 레트로바이러스를 제공하기 위해 예컨대, LTR, tRNA 결합 부위 및 패키징 신호와 같은 상이한 레트로바이러스로부터 유래된 부분을 조합할 수 있을 것이다. 이어서, 상기 레트로바이러스는 일반적으로 형질도입 가능한 레트로바이러스 벡터 입자를 생산하는 데 사용된다. 이를 위해, 벡터를 적합한 패키징 세포주 내로 도입한다. 레트로바이러스는 또한 키메라 인테그라제 효소를 레트로바이러스 입자 내로 통합시킴으로써 숙주 세포의 DNA 내로의 부위 특이적 통합을 위해 구축될 수 있다.

단순 포진 바이러스 (HSV)는 향신경성이며, 신경계 장애를 치료하는 데 상당한 관심을 불러일으켰다. 더욱이, 숙주 세포 염색체 내로의 통합 없이, 또는 다르게는 숙주 세포의 대사를 변경시키지 않으면서, 잠복기 동안 활성인 프로모터의 존재와 함께, 비분열 뉴런 세포에서 잠복 감염을 확립할 수 있는 HSV의 능력에 기인하여 HSV는 관심의 대상이 되는 벡터가 된다. 또한, 비록 HSV의 향신경성 적용에 많은 관심이 집중되었지만, 이 벡터는 그의 광범위한 숙주 범위를 감안할 때 다른 조직에도 이용될 수 있다.

HSV를 관심의 대상이 되는 벡터로 만드는 또 다른 인자는 게놈의 크기 및 조직이다. HSV는 크기 때문에, 다중 유전자 또는 발현 카세트의 도입은 다른 더 작은 소규모 바이러스 시스템보다 문제가 적다. 추가로, 성능 (시간, 강도 등)이 다양한 상이한 바이러스 제어 서열을 이용할 수 있으며, 다른 시스템에서보다 더 큰 범위로 발현을 제어할 수 있다. 또한, 바이러스의 스플라이싱된 메시지가 상대적으로 적고, 유전자 조작이 더욱 용이하다는 것도 장점이다.

HSV는 또한 상대적으로 조작하기 쉽고, 높은 역가로 성장할 수 있다. 따라서, 전달은 충분한 감염 다중도 (MOI)를 달성하는 데 필요한 부피 및 반복 투약의 필요성 감소, 이 둘 모두에서 문제가 적다. HSV의 무독성 변이체가 개발되었으며, 유전자 요법 맥락에서 쉽게 사용될 수 있다.

렌티바이러스는 일반적인 레트로바이러스 유전자 gag, pol 및 env 외에 조절 또는 구조적 기능을 갖는 다른 유전자를 함유하는 복합 레트로바이러스이다. 복잡성이 높을수록 바이러스는 잠복 감염 과정에서와 같이 수명 주기를 조정할 수 있다. 렌티바이러스의 일부 예로는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1, HIV-2) 및 시미안 면역결핍 바이러스 (SIV)를 포함한다. 렌티바이러스 벡터는 HIV 병독성 유전자를 다중으로 약독화시킴으로써 생성되었고, 예를 들어, env, vif, vpr, vpu 및 nef 유전자는 결실됨에 따라 벡터는 생물학적으로 안전한 상태가 된다.

렌티바이러스 벡터는 플라스미드 기반 또는 바이러스 기반이며, 외래 핵산의 도입, 선택 및 숙주 세포로의 핵산 전달을 위한 필수 서열을 전달하도록 구성된다. 관심 벡터의 gag, pol 및 env 유전자 또한 관련 기술분야에 공지되어 있다. 따라서, 관련 유전자를 선택된 벡터에 클로닝한 후, 관심 표적 세포를 형질전환시키는 데 사용된다.

백시니아 바이러스 벡터는 그의 구성이 용이하고, 수득되는 발현 수준이 비교적 높고, 숙주 범위가 넓고, DNA를 운반할 수 있는 수용능이 크기 때문에 광범위하게 사용되어 왔다. 백시니아는 뚜렷한 "A-T" 선호도를 보이는 약 186 kb의 선형 이중 가닥 DNA 게놈을 포함한다. 약 10.5 kb의 역 말단 반복부가 게놈에 플랭킹된다. 대부분의 필수 유전자는 폭스바이러스 중에서 가장 고도로 보존되는 중앙 영역 내에서 매핑되는 것으로 보인다. 백시니아 바이러스의 예상 오픈 리딩 프레임 수는 150 내지 200개이다. 두 가닥 모두 코딩되지만, 리딩 프레임이 광범위하게 오버랩되는 것은 일반적인 것은 아니다.

적어도 25 kb가 백시니아 바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 프로토타입의 백시니아 벡터는 상동성 재조합을 통해 바이러스 티미딘 키나제 유전자에 삽입된 트랜스진을 포함한다. 벡터는 tk-표현형을 기준으로 선택된다. 뇌심근염 바이러스의 비번역 리더 서열을 포함함에 따라 발현 수준은 종래 벡터의 발현 수준보다 높은 수준으로 증가하게 되고, 여기서 트랜스진은 24시간 내에 감염된 세포 단백질의 10% 이상에 축적된다.

예컨대, 마우스 폴리오마 바이러스와 같은 파포바바이러스의 공 캡시드는 유전자 전달을 위해 가능한 벡터로서 주목받고 있다. 공 폴리오마의 사용은 폴리오마 DNA 및 정제된 공 캡시드가 무세포 시스템에서 인큐베이션되었을 때 처음 기술되었다. 새 입자의 DNA는 췌장 DNase의 작용으로부터 보호되었다. 재구성된 입자는 형질전환 폴리오마 DNA 단편을 래트 FIII 세포로 전달하는 데 사용되었다. 공 캡시드 및 재구성된 입자는 폴리오마 캡시드 항원 VP1, VP2 및 VP3, 세 가지 모두로 구성된다.

AAV는 디펜도바이러스 속에 속하는 파보바이러스이다. 이는 복제를 위해 헬퍼 바이러스를 필요로 하는, 작고, 외피가 없는 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 기능적으로 완전한 AAV 비리온을 형성하기 위해서는 헬퍼 바이러스 (예컨대, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 백시니아 바이러스)와의 공동 감염이 필요하다. 시험관내에서 헬퍼 바이러스와의 공동 감염이 없는 경우, AAV는 바이러스 게놈이 에피솜 형태로 존재하지만, 감염성 비리온이 생성되지 않는 잠복 상태를 확립한다. 헬퍼 바이러스에 의한 후속 감염은 게놈을 "구제"하고, 이를 통해 게놈은 복제될 수 있고, 바이러스 캡시드로 패키징될 수 있으며, 이에 따라 감염성 비리온을 재구성할 수 있다. 최근 데이터는 생체내 야생형 AAV 및 재조합 AAV 둘 모두가 주로 큰 에피솜 콘카테머로 존재한다는 것을 시사한다. 한 실시양태에서, 본원에 사용된 유전자 요법 벡터는 AAV 벡터이다. AAV 벡터는 정제된 복제 불능, 슈도타이핑된 rAAV 입자일 수 있다.

AAV는 공지된 어떤 인간 질환과도 연관성이 없으며, 일반적으로 병원성으로 간주되지 않고, 통합시 숙주 세포의 생리학적 특성을 변경시키는 것으로 보이지는 않는다. AAV는 비분열 세포를 포함하여 광범위한 숙주 세포를 감염시킬 수 있고, 다른 종의 세포를 감염시킬 수 있다. 세포 및 체액 반응, 둘 모두에 의해 빠르게 제거되거나, 불활성화되는 일부 벡터와 달리, AAV 벡터는 생체내 다양한 조직에서 지속적인 트랜스진 발현을 유도하는 것으로 나타났다. 생체내 비분열 세포에서 재조합 AAV 매개 트랜스진의 지속성은 천연 AAV 바이러스 유전자의 결여, 및 에피솜 콘카테머를 형성할 수 있는 벡터의 ITR 연결 능력에 기인할 수 있다.

AAV는 에피솜 콘카테머로서 높은 지속 빈도를 갖고, 심근세포를 포함하는 비분열 세포를 감염시킬 수 있고, 이에 따라 예를 들어, 조직 배양물에서 및 생체내에서와 같이 포유동물 세포 내로 유전자를 전달하는 데 유용하며, 본 발명의 세포 형질도입에 사용하는 데 있어 관심의 대상이 되는 벡터 시스템이 된다.

전형적으로, rAAV는 2개의 AAV 말단 반복부가 플랭킹된 관심 유전자를 함유하는 플라스미드 및/또는 말단 반복부가 없는 야생형 AAV 코딩 서열을 함유하는 발현 플라스미드, 예를 들어, pIM45를 공동형질감염시킴으로써 제조된다. 세포는 또한 아데노바이러스 및/또는 AAV 헬퍼 기능을 위해 요구되는 아데노바이러스 유전자를 보유하는 플라스미드로 감염 및/또는 형질감염된다. 상기 방식으로 제조된 rAAV 스톡은 아데노바이러스로 오염되어 있으며, 이는 rAAV 입자로부터 물리적으로 (예를 들어, 염화세슘 밀도 원심분리 또는 칼럼 크로마토그래피에 의해) 분리되어야 한다. 대안적으로, AAV 코딩 영역을 함유하는 아데노바이러스 벡터 및/또는 AAV 코딩 영역 및/또는 아데노바이러스 헬퍼 유전자의 일부 또는 그 전부를 함유하는 세포주가 사용될 수 있다. 통합된 프로바이러스로서 rAAV DNA를 보유하는 세포주도 사용될 수 있다.

AAV의 다중 혈청형이 자연계에 존재하며, 적어도 12개의 혈청형 (AAV1-AAV12)이 있다. 상동성 정도가 높지만, 상이한 혈청형은 상이한 조직에 대해 콘카테머를 갖는다. 형질감염시, AAV는 숙주에서 (있다면) 오직 경미한 면역 반응만을 유발한다. 따라서, AAV는 유전자 요법 접근법에 매우 적합하다.

일부 실시양태에서, 본 개시내용은 관심 조직에서 고효율 형질도입에 훨씬 더 적합한, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, ANC AAV, 그로부터 유래된 키메라 AAV, 그의 변이체 및 그의 조합 중 하나 이상의 것인 AAV 벡터를 포함하는 약물에 관한 것일 수 있다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 혈청형 1 벡터이다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 혈청형 2 벡터이다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 혈청형 3 벡터이다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 혈청형 4 벡터이다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 혈청형 5 벡터이다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 혈청형 6 벡터이다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 혈청형 7 벡터이다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 혈청형 8 벡터이다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 혈청형 9 벡터이다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 혈청형 10 벡터이다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 혈청형 11 벡터이다. 특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 AAV 혈청형 12 벡터이다.

인간에 적합한 AAV 용량은 약 1x10⁸ vg/kg 내지 약 3x10¹⁴ vg/kg 범위, 약 1x10⁸ vg/kg, 약 1x10⁹ vg/kg, 약 1x10¹⁰ vg/kg, 약 1x10¹¹ vg/kg, 약 1x10¹² vg/kg, 약 1x10¹³ vg/kg, 또는 약 1x10¹⁴ vg/kg일 수 있다. 바이러스 입자 또는 DRP의 총량은 5x10¹⁵ vg/kg, 4x10¹⁵ vg/kg, 3x10¹⁵ vg/kg, 2x10¹⁵ vg/kg, 1x10¹⁵ vg/kg, 9x10¹⁴ vg/kg, 8x10¹⁴ vg/kg, 7x10¹⁴ vg/kg, 6x10¹⁴ vg/kg, 5x10¹⁴ vg/kg, 4x10¹⁴ vg/kg, 3x10¹⁴ vg/kg, 2x10¹⁴ vg/kg, 1x10¹⁴ vg/kg, 9x10¹³ vg/kg, 8x10¹³ vg/kg, 7x10¹³ vg/kg, 6x10¹³ vg/kg, 5x10¹³ vg/kg, 4x10¹³ vg/kg, 3x10¹³ vg/kg, 2x10¹³ vg/kg, 1x10¹³ vg/kg, 9x10¹² vg/kg, 8x10¹² vg/kg, 7x10¹² vg/kg, 6x10¹² vg/kg, 5x10¹² vg/kg, 4x10¹² vg/kg, 3x10¹² vg/kg, 2x10¹² vg/kg, 1x10¹² vg/kg, 9x10¹¹ vg/kg, 8x10¹¹ vg/kg, 7x10¹¹ vg/kg, 6x10¹¹ vg/kg, 5x10¹¹ vg/kg, 4x10¹¹ vg/kg, 3x10¹¹ vg/kg, 2x10¹¹ vg/kg, 1x10¹¹ vg/kg, 9x10¹⁰ vg/kg, 8x10¹⁰ vg/kg, 7x10¹⁰ vg/kg, 6x10¹⁰ vg/kg, 5x10¹⁰ vg/kg, 4x10¹⁰ vg/kg, 3x10¹⁰ vg/kg, 2x10¹⁰ vg/kg, 1x10¹⁰ vg/kg, 9x10⁹ vg/kg, 8x10⁹ vg/kg, 7x10⁹ vg/kg, 6x10⁹ vg/kg, 5x10⁹ vg/kg, 4x10⁹ vg/kg, 3x10⁹ vg/kg, 2x10⁹ vg/kg, 1x10⁹ vg/kg, 9x10⁸ vg/kg, 8x10⁸ vg/kg, 7x10⁸ vg/kg, 6x10⁸ vg/kg, 5x10⁸ vg/kg, 4x10⁸ vg/kg, 3x10⁸ vg/kg, 2x10⁸ vg/kg, 또는 1x10⁸ vg/kg이거나, 대략 상기 용량 값이거나, 적어도 상기 용량 값이거나, 적어도 대략 상기 용량 값이거나, 상기 용량 값 이하이거나, 또는 대략 상기 용량 값 이하이거나, 또는 상기 값 중 임의의 두 값에 의해 정의되는 범위 내에 포함되는 값이다. 상기 열거된 투여량은 vg/kg 심장 조직 단위이다.

바이러스 벡터와는 별도로, 비-바이러스 발현 구축물은 또한 표적 단백질 또는 그의 기능적 변이체 또는 단편을 코딩하는 유전자를 환자의 세포 내로 도입하기 위해 사용될 수 있다. 표적 세포에서 단백질의 생체내 발현을 허용하는 비-바이러스 발현 벡터는 예를 들어, 플라스미드, 변형된 RNA, cDNA, 안티센스 올리고머, DNA-지질 복합체, 나노입자, 엑소좀, 유전자 요법에 적합한 임의의 다른 비-바이러스 셔틀, 그의 변이체 및 그의 조합을 포함한다.

바이러스 벡터 및 비-바이러스 발현 벡터와는 별도로, 뉴클레아제 시스템 또한 벡터 및/또는 전기천공 시스템과 함께, 표적 단백질 또는 그의 기능적 변이체 또는 단편을 코딩하는 유전자를 환자의 세포 내로 진입시키고, 그 안에 도입시키는 데 사용될 수 있다. 예시적인 뉴클레아제 시스템은 제한 없이, 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문 반복부 (CRISPR), DNA 절단 효소 (예컨대, Cas9), 메가뉴클레아제, TALEN, 징크 핑거 뉴클레아제, 유전자 요법에 적합한 임의의 다른 뉴클레아제 시스템, 그의 변형, 및 그의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 한 바이러스 벡터 (예컨대, AAV)는 뉴클레아제 (예컨대, CRISPR)에 대해 사용될 수 있고, 또 다른 바이러스 벡터 (예컨대, AAV)는 둘 모두 (뉴클레아제 및 DNA 절단 효소)를 표적 세포 내로 도입시키기 위해 DNA 절단 효소 (예컨대, Cas9)에 대해 사용될 수 있다.

치료 유전자를 코딩하는 치료 폴리뉴클레오티드 서열을 세포 내로 전달하는 데 사용될 수 있는 다른 벡터 전달 시스템은 수용체-매개 전달 비히클이다. 이들은 거의 모든 진핵 세포에서 수용체 매개 세포내이입에 의한 거대분자의 선택적 흡수를 이용한다. 다양한 수용체의 세포 유형 특이적 분포로 인해, 전달은 고도로 특이적일 수 있다. 수용체 매개 유전자 표적화 비히클은 2가지 구성요소: 세포 수용체 특이적 리간드, 및 DNA 결합제를 포함할 수 있다.

비-바이러스 벡터를 표적 세포로 전달하는 데 적합한 방법은 예를 들어, 리포펙션 방법, 인산칼슘 공침전 방법, DEAE-덱스트란 방법 및 마이크로-유리 튜브를 사용한 DNA 직접 도입 방법, 초음파, 전기천공 등이다. 벡터를 도입하기 전에, 예컨대, 포스파티딜콜린, 스트렙토리신, 소듐 카프레이트, 데카노일카르니틴, 타르타르산, 리소레시틴, 트리톤 X-100 등과 같은 투과성 제제로 심장 근육 세포를 처리할 수 있다. 엑소좀은 또한 네이키드 DNA 또는 AAV-캡시드화된 DNA를 전달하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 유전자 요법 벡터는 표적 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터 서열은 콤팩트하여야 하고, 강력한 발현을 보장하여야 한다. 바람직하게, 프로모터는 유전자 요법 벡터로 치료된 환자의 심근에서 표적 단백질의 발현을 제공한다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 표적 단백질을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 심장 특이적 프로모터를 포함한다. 본원에서 사용되는, "심장 특이적 프로모터"는 심장 세포에서의 활성이 임의의 다른 비-심장 세포 유형에서보다 적어도 2배 더 높은 프로모터를 지칭한다. 바람직하게, 본 발명의 벡터에 사용하기에 적합한 심장 특이적 프로모터는 심장 세포에서 활성이 비-심장 세포 유형에서의 그의 활성과 비교하여 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 또는 적어도 50배 더 높은 활성을 갖는다.

심장 특이적 프로모터는 선택된 인간 프로모터, 또는 선택된 인간 프로모터와 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%의 서열 동일성을 갖는 기능적으로 등가인 서열을 포함하는 프로모터일 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 비-제한적 프로모터는 심장 트로포닌 T 프로모터 (TNNT2)이다. 프로모터의 다른 비-제한적 예로는 알파 미오신 중쇄 프로모터, 미오신 경쇄 2v 프로모터, 알파 미오신 중쇄 프로모터, 알파-심장 액틴 프로모터, 알파-트로포미오신 프로모터, 심장 트로포닌 C 프로모터, 심장 트로포닌 I 프로모터, 심장 미오신-결합 단백질 C 프로모터, 및 근소포체/소포체 Ca^{2 +}-ATPase (SERCA) 프로모터 (예컨대, 상기 프로모터의 이소형 2 (SERCA2))를 포함한다.

본 발명에 유용한 벡터는 다양한 형질도입 효율을 가질 수 있다. 그 결과, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터는 표적화된 혈관 영역의 세포 중 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 또는 100% 초과, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 또는 100%, 또는 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 또는 100%의 세포를 형질도입한다. 1 초과의 벡터 (바이러스 또는 비-바이러스성, 또는 그의 조합)가 동시에 또는 순서대로 사용될 수 있다. 이는 1 초과의 폴리뉴클레오티드를 전달하고/거나, 1 초과의 세포 유형을 표적화하는 데 사용될 수 있다. 다중 벡터 또는 다중 작용제가 사용되는 경우, 1 초과의 형질도입/형질감염 효율이 발생할 수 있다.

유전자 요법 벡터를 함유하는 제약 조성물은 액상 액제 또는 현탁제로 제조될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 일반적으로 사용되는 제약상 허용되는 부형제, 예컨대, 희석제 및 담체를 포함할 수 있다. 특히, 조성물은 제약상 허용되는 담체, 예컨대, 물, 식염수, 링거액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 담체 이외에, 제약 조성물은 또한 유화제, pH 완충화제, 안정화제, 염료 등을 함유할 수 있다.

특정 실시양태에서, 제약 조성물은 대상체에 독성 없이, 대상체에서 심근병증을 예방 또는 치료할 수 있는 용량인 치료 유효 유전자 용량을 포함할 것이다. 심근병증의 예방 또는 치료는 심근병증과 연관된 표현형 특징의 변화로서 평가될 수 있으며, 여기서 상기 변화는 심근병증을 예방하거나 치료하는 데 효과적인 것이다. 따라서, 치료 유효 유전자 용량은 전형적으로 생리학적으로 허용되는 조성물로 투여되는 경우, 치료받는 대상체에서 병원성 심장 표현형을 개선하거나 예방하기에 충분한 용량이다.

특정 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 정맥내 전달, 동맥내 전달 또는 복강내 전달을 포함하는 여러 상이한 방법을 통해 대상체로 형질도입될 수 있다. 일부 실시양태에서, 유전자 요법 벡터는 예를 들어, 관상동맥내 투여에 의해 심장 조직에 직접 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 심근의 조직 형질도입은 카테터-매개 심근내 전달에 의해 달성될 수 있으며, 이는 형질도입-증진 캐리어에 커플링되거나, 커플링되지 않은 무벡터 cDNA를 심근으로 전달하는 데 사용될 수 있다.

특정 실시양태에서, 약물은 치료 유효 유전자 용량을 포함할 것이다. 치료 유효 유전자 용량은 환자에게 독성을 나타내지 않으면서, 환자의 특정 심장 병태를 예방하거나 치료할 수 있는 용량이다.

본원에 개시된 방법에 의해 치료될 수 있는 심장 병태로는 제한 없이, 유전적으로 결정된 심장 질환 (예컨대, 유전적으로 결정된 심근병증), 부정맥성 심장 질환, 심부전, 허혈, 부정맥, 심근경색, 울혈성 심부전, 이식 거부, 비정상적인 심장 수축, 비-허혈성 심근병증, 승모판 역류, 대동맥 협착 또는 역류, 비정상적인 Ca^{2 +} 대사, 선천성 심장 질환, 원발성 또는 속발성 심장 종양, 및 그의 조합 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다.

예시적인 예언적 실시예

하기 실시예는 본 개시내용의 이해를 돕기 위해 기술되는 것이며, 이는 물론 본원에서 설명되고, 청구된 실시양태를 구체적으로 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자의 이해 범위 내에 있는, 현재 공지되어 있거나, 또는 추후 개발될 모든 등가물의 치환, 및 제제화의 변경 또는 실험 디자인의 최소한의 변경을 비롯한, 본 실시양태의 상기와 같은 변형은 본원에 포함된 실시양태의 범주 내에 포함되는 것으로 간주되어야 한다.

시험관내 시스템의 예시적인 실시예에서, PKP2 이소형 2a cDNA 서열 (2764 bp cDNA, 진뱅크: BC126199.1; 서열식별번호 1)을 심장 특이적 TNNT2 프로모터 (서열식별번호 5) 하에서 AAV2 내부 말단 반복부 (ITR): ITR-TNNT2-PKP2cDNA-ITR을 사용하여 클로닝한다. 또 다른 예시적인 실시예로서, PKP2를 코딩하는 핵산 서열은 PKP2 이소형 2b (서열식별번호 4)를 코딩하는 PKP2 유전자 (서열식별번호 3)의 코돈 최적화된 버전일 수 있다. 구축물은 AAV, 예컨대, AAV6 및 AAV9로 벡터화될 수 있다. 항-Flag에 의한 형질감염 후 단백질을 확인할 수 있도록 하고, 내인성 단백질과 구별할 수 있도록 하기 위해 Flag가 부가된 구축물 (Flag-PKP2)을 제조할 수 있다. 서열식별번호 6은 예를 들어, PKP2 이소형 2b를 발현하기 위한 예시적인 구축물 서열이다. 시험관내 PKP2의 발현은 PKP2 1차 항체를 사용하는 면역형광 현미경법으로 관찰할 수 있으며, 이는 세포막에서 및 조밀한 플라크에서 PKP2의 국재화를 나타낸다.

정상 심근세포; (ARVC 환자로부터의) 1개의 이형접합성 PKP2 돌연변이를 보유하는 심근세포; 및 트랜스로 2개의 PKP2 돌연변이를 보유하는 심근세포를 포함하는 2D 세포 배양물에서 AAV6-TNNT2-PKP2를 사용하여 iPSC-CM을 형질감염시킨다.

PKP2 RNA 및 단백질 수준의 성공적인 형질감염 및 특징화 후, 세포 크기 및 PKP2 결핍에서 발현이 변경된 것으로 공지된 유전자 (MYL2, SCN5A (그의 단백질 생성물은 NaV1.5이다), GJA1, 및 TTN)의 교정을 비롯한 다수의 판독값에 대해 정상 대 PKP2-결핍 및 PKP2-교정된 CM의 비교를 수행한다.

유사한 방법론이 인간 3D 배양 모델에서의 생체외 치료 및 PKP2-돌연변이화된 마우스 모델에서의 생체내 치료를 위해 적합화될 수 있는 것으로 고려된다.

(Flag-)PKP2 단백질이 발현될 때, 이는 그의 정확한 세포하 위치 (데스모솜)에 도달할 것이며, 형질감염은 RNA 수준 및 단백질 수준에서 PKP2-반가불충분 또는 PKP2가 완전히 결핍된 세포를 교정하는 것으로 간주된다. 완전히 PKP2가 결핍된 세포에서, PKP2-형질감염은 또한 데스모솜에서 데스모솜 단백질 복합체를 복원시킬 수 있고, 특히, PKP2가 감소될 때, 감소되는 플라코글로빈을 복원시킬 수 있는 것으로 간주된다.

PKP2 이소형 2a, PKP2 이소형 2b, 또는 그 둘 모두를 발현하기 위한 유전자 요법 벡터가 인간 대상체의 심장 조직에 전달될 수 있다는 것이 추가로 고려된다. 예를 들어, 유전자 요법 벡터는 하나 이상의 유전자 요법 벡터 및 제약상 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 치료 제제로 제제화될 수 있다. 제제는 정맥내 전달, 동맥내 전달 또는 복강내 전달을 포함하는 여러 상이한 방법을 통해 인간 대상체로 형질도입될 수 있다. 유전자 요법 벡터는 예를 들어, 관상동맥내 투여에 의해 심장 조직에 직접 투여될 수 있다. 유전자 요법 벡터는 또한 카테터-매개 심근내 전달을 통해 전달될 수 있다.

유전자 요법 벡터는 예를 들어 대상체의 전신 순환으로부터 대상체의 관상 순환을 단리시켜 폐쇄 회로를 형성하고, 유체 (예컨대, 유전자 요법 벡터를 포함하는 제제)를 대상체의 단리된 관상 순환에 관류시킴으로써 대상체의 심장 조직에 국소적으로 투여될 수 있다는 것이 추가로 고려된다. 관류는 대상체의 정지되지 않은 박동 중인 심장에서 수행될 수 있다. 폐쇄 회로는 예를 들어, 환자의 우측 관상 동맥에 위치하는 제1 약물 전달 카테터, 환자의 좌측 주관상동맥에 위치하는 제2 약물 전달 카테터, 관상 정맥동에 위치하는 약물 수집 카테터, 관상 동맥, 관상 정맥계, 정맥 분지와 동맥 분지 사이에 산재된 외부 막 산소 공급 장치로 형성될 수 있다. 상기와 같은 국소 전달은 2020년 8월 26일 출원된 국제 출원 번호 PCT/IB2020/000692에 대해 설명된 바와 같이 수행될 수 있으며, 상기 출원의 개시 내용은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다.

전술한 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 제공하기 위해 예컨대, 특정 물질, 치수, 프로세스 파라미터 등과 같은 다수의 특정 세부사항이 설명된다. 특정 특징, 구조, 물질, 또는 특징은 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다. "예" 또는 "예시적인"이라는 단어는 본원에서 예, 일례 또는 실례로서의 역할을 하는 것을 의미하는 것으로 사용된다. "예" 또는 "예시적인"인 것으로 본원에 기술된 임의의 측면 또는 디자인은 다른 측면 또는 디자인에 비해 반드시 바람직하거나, 또는 유익한 것으로 해석되지 않아야 한다. 오히려, "예" 또는 "예시적인"이라는 단어의 사용은 단순히 개념을 구체적인 방식으로 제시하기 위한 것이다. 본 출원에서 사용되는, 용어 "또는"은 배타적인 "또는"이 아니라 포괄적인 "또는"을 의미하는 것으로 의도된다. 즉, 달리 명시되지 않거나, 또는 문맥상 명확하지 않은 한, "X는 A 또는 B를 포함한다"는 포함적인 자연 순열을 의미하는 것으로 의도된다. 즉, X가 A를 포함하는 경우; X는 B를 포함하거나; 또는 X가 A 및 B, 둘 모두를 포함한다면, 이때 "X는 A 또는 B를 포함한다"는 전술한 경우 중 어느 하나에서 충족된다. 본 명세서 전역에 걸쳐 "한(an) 실시양태," "특정 실시양태," 또는 "한(one) 실시양태"에 대한 언급은 실시양태와 관련하여 기술된 특정 특징, 구조 또는 특징이 적어도 하나의 실시양태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전역에 걸쳐 다양한 위치에서 "한(an) 실시양태," "특정 실시양태," 또는 "한(one) 실시양태"라는 어구의 출현이 반드시 모두 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니다.

본 발명은 그의 구체적인 예시적 실시양태를 참조하여 설명되었다. 따라서, 명세서 및 도면은 제한적인 의미가 아니라, 예시적인 것으로 간주되어야 한다. 본원에 제시되고, 기술된 것 외에, 본 발명의 다양한 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 자명해질 것이며, 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.

하기 서열식별번호 1은 PKP2 이소형 2a에 대한 단백질 코딩 서열을 포함하는 mRNA 서열의 cDNA 카피 (진뱅크: BC126199.1)이다:

.

하기 서열식별번호 2는 PKP2 이소형 2a에 대한 아미노산 서열이다:

.

하기 서열식별번호 3은 PKP2 이소형 2b를 코딩하는 코돈 최적화된 cDNA 서열이다:

.

하기 서열식별번호 4는 PKP2 이소형 2b에 대한 아미노산 서열이다:

하기 서열식별번호 5는 TNNT2 프로모터를 코딩하는 핵산 서열이다:

하기 서열식별번호 6은 심근세포에서 PKP2 이소형 2b를 발현하기 위한 예시적인 벡터 구축물이다:

SEQUENCE LISTING <110> UCL BUSINESS LTD <120> GENE THERAPY COMPOSITION AND TREATMENT OF RIGHT VENTRICULAR ARRYTHMOGENIC CARDIOMYOPATHY <130> U07934WO <150> US 62/903,103 <151> 2019-09-20 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2764 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gagtccagag gcaggcgagc agctcggtcg cccccaccgg ccccatggca gcccccggcg 60 ccccagctga gtacggctac atccggaccg tcctgggcca gcagatcctg ggacaactgg 120 acagctccag cctggcgctg ccctccgagg ccaagctgaa gctggcgggg agcagcggcc 180 gcggcggcca gacagtcaag agcctgcgga tccaggagca ggtgcagcag accctcgccc 240 ggaagggccg cagctccgtg ggcaacggaa atcttcaccg aaccagcagt gttcctgagt 300 atgtctacaa cctacacttg gttgaaaatg attttgttgg aggccgttcc cctgttccta 360 aaacctatga catgctaaag gctggcacaa ctgccactta tgaaggtcgc tggggaagag 420 gaacagcaca gtacagctcc cagaagtccg tggaagaaag gtccttgagg catcctctga 480 ggagactgga gatttctcct gacagcagcc cggagagggc tcactacacg cacagcgatt 540 accagtacag ccagagaagc caggctgggc acaccctgca ccaccaagaa agcaggcggg 600 ccgccctcct agtgccaccg 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taacagaagc attgcttacg ctgacggaga 1500 atatcatcat ccccttttct gggtggcctg aaggagacta cccaaaagca aatggtttgc 1560 tcgattttga catattctac aacgtcactg gatgcctaag aaacatgagt tctgctggcg 1620 ctgatgggag aaaagcgatg agaagatgtg acggactcat tgactcactg gtccattatg 1680 tcagaggaac cattgcagat taccagccag atgacaaggc cacggagaat tgtgtgtgca 1740 ttcttcataa cctctcctac cagctggagg cagagctccc agagaaatat tcccagaata 1800 tctatattca aaaccggaat atccagactg acaacaacaa aagtattgga tgttttggca 1860 gtcgaagcag gaaagtaaaa gagcaatacc aggacgtgcc gatgccggag gaaaagagca 1920 accccaaggg cgtggagtgg ctgtggcatt ccattgttat aaggatgtat ctgtccttga 1980 tcgccaaaag tgtccgcaac tacacacaag aagcatcctt aggagctctg cagaacctca 2040 cggccggaag tggaccaatg ccgacatcag tggctcagac agttgtccag aaggaaagtg 2100 gcctgcagca cacccgaaag atgctgcatg ttggtgaccc aagtgtgaaa aagacagcca 2160 tctcgctgct gaggaatctg tcccggaatc tttctctgca gaatgaaatt gccaaagaaa 2220 ctctccctga tttggtttcc atcattcctg acacagtccc gagtactgac cttctcattg 2280 aaactacagc ctctgcctgt tacacattga 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Asn Leu His Leu Val Glu Asn Asp 85 90 95 Phe Val Gly Gly Arg Ser Pro Val Pro Lys Thr Tyr Asp Met Leu Lys 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Glu Gly Arg Trp Gly Arg Gly Thr Ala 115 120 125 Gln Tyr Ser Ser Gln Lys Ser Val Glu Glu Arg Ser Leu Arg His Pro 130 135 140 Leu Arg Arg Leu Glu Ile Ser Pro Asp Ser Ser Pro Glu Arg Ala His 145 150 155 160 Tyr Thr His Ser Asp Tyr Gln Tyr Ser Gln Arg Ser Gln Ala Gly His 165 170 175 Thr Leu His His Gln Glu Ser Arg Arg Ala Ala Leu Leu Val Pro Pro 180 185 190 Arg Tyr Ala Arg Ser Glu Ile Val Gly Val Ser Arg Ala Gly Thr Thr 195 200 205 Ser Arg Gln Arg His Phe Asp Thr Tyr His Arg Gln Tyr Gln His Gly 210 215 220 Ser Val Ser Asp Thr Val Phe Asp Ser Ile Pro Ala Asn Pro Ala Leu 225 230 235 240 Leu Thr Tyr Pro Arg Pro Gly Thr Ser Arg Ser Met Gly Asn Leu Leu 245 250 255 Glu Lys Glu Asn Tyr Leu Thr Ala Gly Leu Thr Val Gly Gln Val Arg 260 265 270 Pro Leu Val Pro Leu Gln Pro Val Thr Gln Asn Arg Ala Ser Arg Ser 275 280 285 Ser Trp His Gln Ser Ser Phe His Ser Thr Arg Thr Leu Arg Glu Ala 290 295 300 Gly Pro Ser Val Ala Val Asp Ser Ser Gly Arg Arg Ala His Leu Thr 305 310 315 320 Val Gly Gln Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Asn Leu Leu Thr Glu Arg 325 330 335 Ser Thr Phe Thr Asp Ser Gln Leu Gly Asn Ala Asp Met Glu Met Thr 340 345 350 Leu Glu Arg Ala Val Ser Met Leu Glu Ala Asp His Met Leu Pro Ser 355 360 365 Arg Ile Ser Ala Ala Ala Thr Phe Ile Gln His Glu Cys Phe Gln Lys 370 375 380 Ser Glu Ala Arg Lys Arg Val Asn Gln Leu Arg Gly Ile Leu Lys Leu 385 390 395 400 Leu Gln Leu Leu Lys Val Gln Asn Glu Asp Val Gln Arg Ala Val Cys 405 410 415 Gly Ala Leu Arg Asn Leu Val Phe Glu Asp Asn Asp Asn Lys Leu Glu 420 425 430 Val Ala Glu Leu Asn Gly Val Pro Arg Leu Leu Gln Val Leu Lys Gln 435 440 445 Thr Arg Asp Leu Glu Thr Lys Lys Gln Ile Thr Gly Leu Leu Trp Asn 450 455 460 Leu Ser Ser Asn Asp Lys Leu Lys Asn Leu Met Ile Thr Glu Ala Leu 465 470 475 480 Leu Thr Leu Thr Glu Asn Ile Ile Ile Pro Phe Ser Gly Trp Pro Glu 485 490 495 Gly Asp Tyr Pro Lys Ala Asn Gly Leu Leu Asp Phe Asp Ile Phe Tyr 500 505 510 Asn Val Thr Gly Cys Leu Arg Asn Met Ser Ser Ala Gly Ala Asp Gly 515 520 525 Arg Lys Ala Met Arg Arg Cys Asp Gly Leu Ile Asp Ser Leu Val His 530 535 540 Tyr Val Arg Gly Thr Ile Ala Asp Tyr Gln Pro Asp Asp Lys Ala Thr 545 550 555 560 Glu Asn Cys Val Cys Ile Leu His Asn Leu Ser Tyr Gln Leu Glu Ala 565 570 575 Glu Leu Pro Glu Lys Tyr Ser Gln Asn Ile Tyr Ile Gln Asn Arg Asn 580 585 590 Ile Gln Thr Asp Asn Asn Lys Ser Ile Gly Cys Phe Gly Ser Arg Ser 595 600 605 Arg Lys Val Lys Glu Gln Tyr Gln Asp Val Pro Met Pro Glu Glu Lys 610 615 620 Ser Asn Pro Lys Gly Val Glu Trp Leu Trp His Ser Ile Val Ile Arg 625 630 635 640 Met Tyr Leu Ser Leu Ile Ala Lys Ser Val Arg Asn Tyr Thr Gln Glu 645 650 655 Ala Ser Leu Gly Ala Leu Gln Asn Leu Thr Ala Gly Ser Gly Pro Met 660 665 670 Pro Thr Ser Val Ala Gln Thr Val Val Gln Lys Glu Ser Gly Leu Gln 675 680 685 His Thr Arg Lys Met Leu His Val Gly Asp Pro Ser Val Lys Lys Thr 690 695 700 Ala Ile Ser Leu Leu Arg Asn Leu Ser Arg Asn Leu Ser Leu Gln Asn 705 710 715 720 Glu Ile Ala Lys Glu Thr Leu Pro Asp Leu Val Ser Ile Ile Pro Asp 725 730 735 Thr Val Pro Ser Thr Asp Leu Leu Ile Glu Thr Thr Ala Ser Ala Cys 740 745 750 Tyr Thr Leu Asn Asn Ile Ile Gln Asn Ser Tyr Gln Asn Ala Arg Asp 755 760 765 Leu Leu Asn Thr Gly Gly Ile Gln Lys Ile Met Ala Ile Ser Ala Gly 770 775 780 Asp Ala Tyr Ala Ser Asn Lys Ala Ser Lys Ala Ala Ser Val Leu Leu 785 790 795 800 Tyr Ser Leu Trp Ala His Thr Glu Leu His His Ala Tyr Lys Lys Ala 805 810 815 Gln Phe Lys Lys Thr Asp Phe Val Asn Ser Arg Thr Ala Lys Ala Tyr 820 825 830 His Ser Leu Lys Asp 835 <210> 3 <211> 2643 <212> DNA <213> artificial <220> <223> PKP2b codon optimized <400> 3 atggccgccc ccggagcacc tgccgagtat ggctacattc gcaccgtcct gggacagcag 60 attctgggac agctggattc atcaagcctg gccctgcctt ctgaggccaa gctgaagctg 120 gcaggaagct ccggaagggg aggacagacc gtgaagagcc tgagaatcca ggagcaggtg 180 cagcagacac tggcccggaa gggcagatct agcgtgggca acggcaatct gcacaggacc 240 tcctctgtgc cagagtacgt gtataacctg cacctggtgg agaatgactt cgtgggaggc 300 cgcagcccag tgccaaagac atacgatatg ctgaaggccg gcaccacagc aacctatgag 360 ggcaggtggg gaagaggaac agcacagtac agctcccaga agtctgtgga ggagcggagc 420 ctgagacacc ctctgcggag actggagatc agcccagact ctagccctga gagggcacac 480 tatacccact ccgattacca gtattctcag agaagccagg caggacacac actgcaccac 540 caggagagca ggagggccgc cctgctggtg ccacctagat acgcccgctc tgagatcgtg 600 ggcgtgagca gggcaggaac cacatcccgg cagagacact tcgacaccta ccacagacag 660 tatcagcacg gctctgtgag cgacacagtg tttgattcca tccctgccaa cccagccctg 720 ctgacctatc ctcggccagg cacatccaga tctatgggca acctgctgga gaaggagaat 780 tacctgaccg caggcctgac agtgggacag gtgaggcccc tggtgcctct gcagccagtg 840 acccagaatc gggccagcag atcctcttgg caccagagct ccttccactc taccaggaca 900 ctgagggagg caggaccaag cgtggcagtg gactctagcg gccggagagc ccacctgacc 960 gtgggacagg cagcagcagg aggatccggc aacctgctga cagagaggtc cacctttaca 1020 gactctcagc tgggcaatgc cgatatggag atgaccctgg agagggccgt gagcatgctg 1080 gaggcagacc acatgctgcc atccaggatc tctgccgcag ccacattcat ccagcacgag 1140 tgctttcaga agtccgaggc aaggaagagg gtgaaccagc tgaggggcat cctgaagctg 1200 ctgcagctgc tgaaggtgca gaacgaggat gtgcagaggg ccgtgtgcgg cgccctgagg 1260 aatctggtgt tcgaggacaa cgataataag ctggaggtgg cagagctgaa cggagtgcca 1320 aggctgctgc aggtgctgaa gcagacccgc gacctggaga caaagaagca gatcaccgat 1380 cacacagtga acctgcggag cagaaatgga tggcctggag cagtggcaca cgcatgcaat 1440 ccaagcaccc tgggaggaca gggaggaagg atcacaagat ccggcgtgcg ggaccagcct 1500 gatcagcacg gcctgctgtg gaacctgtcc tctaatgaca agctgaagaa cctgatgatc 1560 accgaggccc tgctgaccct gacagagaat atcatcatcc cttttagcgg ctggccagag 1620 ggcgattatc ccaaggccaa cggcctgctg gacttcgata tcttttacaa cgtgaccggc 1680 tgcctgagga atatgagctc cgccggagca gacggaagaa aggccatgag gcgctgtgac 1740 ggcctgatcg attccctggt gcactacgtg cggggcacca tcgccgatta tcagcccgac 1800 gataaggcca cagagaactg cgtgtgcatc ctgcacaatc tgtcttatca gctggaggcc 1860 gagctgcctg agaagtacag ccagaacatc tatatccaga acagaaatat ccagaccgac 1920 aacaataaga gcatcggctg cttcggcagc aggtcccgca aggtgaagga gcagtaccag 1980 gatgtgccca tgcctgagga gaagtccaat cccaagggcg tggagtggct gtggcactct 2040 atcgtgatca ggatgtatct gagcctgatc gccaagtccg tgcgcaacta cacccaggag 2100 gcatctctgg gcgccctgca gaatctgaca gcaggatctg gaccaatgcc caccagcgtg 2160 gcccagacag tggtgcagaa ggagtccggc ctgcagcaca cccggaagat gctgcacgtg 2220 ggcgacccat ccgtgaagaa gacagccatc tctctgctga ggaacctgag ccgcaatctg 2280 tccctgcaga acgagatcgc caaggagaca ctgcccgatc tggtgagcat catcccagac 2340 accgtgccct ccacagatct gctgatcgag acaacagcct ccgcctgtta caccctgaac 2400 aatatcatcc agaactctta tcagaatgcc cgggacctgc tgaacacagg cggcatccag 2460 aagatcatgg caatctccgc cggcgatgca tacgcatcta ataaggccag caaggccgcc 2520 tccgtgctgc tgtattctct gtgggcacac accgagctgc accacgcata caagaaggcc 2580 cagtttaaga agactgattt cgtgaatagc agaacagcca aagcctacca cagcctgaag 2640 gac 2643 <210> 4 <211> 881 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Ala Ala Pro Gly Ala Pro Ala Glu Tyr Gly Tyr Ile Arg Thr Val 1 5 10 15 Leu Gly Gln Gln Ile Leu Gly Gln Leu Asp Ser Ser Ser Leu Ala Leu 20 25 30 Pro Ser Glu Ala Lys Leu Lys Leu Ala Gly Ser Ser Gly Arg Gly Gly 35 40 45 Gln Thr Val Lys Ser Leu Arg Ile Gln Glu Gln Val Gln Gln Thr Leu 50 55 60 Ala Arg Lys Gly Arg Ser Ser Val Gly Asn Gly Asn Leu His Arg Thr 65 70 75 80 Ser Ser Val Pro Glu Tyr Val Tyr Asn Leu His Leu Val Glu Asn Asp 85 90 95 Phe Val Gly Gly Arg Ser Pro Val Pro Lys Thr Tyr Asp Met Leu Lys 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Glu Gly Arg Trp Gly Arg Gly Thr Ala 115 120 125 Gln Tyr Ser Ser Gln Lys Ser Val Glu Glu Arg Ser Leu Arg His Pro 130 135 140 Leu Arg Arg Leu Glu Ile Ser Pro Asp Ser Ser Pro Glu Arg Ala His 145 150 155 160 Tyr Thr His Ser Asp Tyr Gln Tyr Ser Gln Arg Ser Gln Ala Gly His 165 170 175 Thr Leu His His Gln Glu Ser Arg Arg Ala Ala Leu Leu Val Pro Pro 180 185 190 Arg Tyr Ala Arg Ser Glu Ile Val Gly Val Ser Arg Ala Gly Thr Thr 195 200 205 Ser Arg Gln Arg His Phe Asp Thr Tyr His Arg Gln Tyr Gln His Gly 210 215 220 Ser Val Ser Asp Thr Val Phe Asp Ser Ile Pro Ala Asn Pro Ala Leu 225 230 235 240 Leu Thr Tyr Pro Arg Pro Gly Thr Ser Arg Ser Met Gly Asn Leu Leu 245 250 255 Glu Lys Glu Asn Tyr Leu Thr Ala Gly Leu Thr Val Gly Gln Val Arg 260 265 270 Pro Leu Val Pro Leu Gln Pro Val Thr Gln Asn Arg Ala Ser Arg Ser 275 280 285 Ser Trp His Gln Ser Ser Phe His Ser Thr Arg Thr Leu Arg Glu Ala 290 295 300 Gly Pro Ser Val Ala Val Asp Ser Ser Gly Arg Arg Ala His Leu Thr 305 310 315 320 Val Gly Gln Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Asn Leu Leu Thr Glu Arg 325 330 335 Ser Thr Phe Thr Asp Ser Gln Leu Gly Asn Ala Asp Met Glu Met Thr 340 345 350 Leu Glu Arg Ala Val Ser Met Leu Glu Ala Asp His Met Leu Pro Ser 355 360 365 Arg Ile Ser Ala Ala Ala Thr Phe Ile Gln His Glu Cys Phe Gln Lys 370 375 380 Ser Glu Ala Arg Lys Arg Val Asn Gln Leu Arg Gly Ile Leu Lys Leu 385 390 395 400 Leu Gln Leu Leu Lys Val Gln Asn Glu Asp Val Gln Arg Ala Val Cys 405 410 415 Gly Ala Leu Arg Asn Leu Val Phe Glu Asp Asn Asp Asn Lys Leu Glu 420 425 430 Val Ala Glu Leu Asn Gly Val Pro Arg Leu Leu Gln Val Leu Lys Gln 435 440 445 Thr Arg Asp Leu Glu Thr Lys Lys Gln Ile Thr Asp His Thr Val Asn 450 455 460 Leu Arg Ser Arg Asn Gly Trp Pro Gly Ala Val Ala His Ala Cys Asn 465 470 475 480 Pro Ser Thr Leu Gly Gly Gln Gly Gly Arg Ile Thr Arg Ser Gly Val 485 490 495 Arg Asp Gln Pro Asp Gln His Gly Leu Leu Trp Asn Leu Ser Ser Asn 500 505 510 Asp Lys Leu Lys Asn Leu Met Ile Thr Glu Ala Leu Leu Thr Leu Thr 515 520 525 Glu Asn Ile Ile Ile Pro Phe Ser Gly Trp Pro Glu Gly Asp Tyr Pro 530 535 540 Lys Ala Asn Gly Leu Leu Asp Phe Asp Ile Phe Tyr Asn Val Thr Gly 545 550 555 560 Cys Leu Arg Asn Met Ser Ser Ala Gly Ala Asp Gly Arg Lys Ala Met 565 570 575 Arg Arg Cys Asp Gly Leu Ile Asp Ser Leu Val His Tyr Val Arg Gly 580 585 590 Thr Ile Ala Asp Tyr Gln Pro Asp Asp Lys Ala Thr Glu Asn Cys Val 595 600 605 Cys Ile Leu His Asn Leu Ser Tyr Gln Leu Glu Ala Glu Leu Pro Glu 610 615 620 Lys Tyr Ser Gln Asn Ile Tyr Ile Gln Asn Arg Asn Ile Gln Thr Asp 625 630 635 640 Asn Asn Lys Ser Ile Gly Cys Phe Gly Ser Arg Ser Arg Lys Val Lys 645 650 655 Glu Gln Tyr Gln Asp Val Pro Met Pro Glu Glu Lys Ser Asn Pro Lys 660 665 670 Gly Val Glu Trp Leu Trp His Ser Ile Val Ile Arg Met Tyr Leu Ser 675 680 685 Leu Ile Ala Lys Ser Val Arg Asn Tyr Thr Gln Glu Ala Ser Leu Gly 690 695 700 Ala Leu Gln Asn Leu Thr Ala Gly Ser Gly Pro Met Pro Thr Ser Val 705 710 715 720 Ala Gln Thr Val Val Gln Lys Glu Ser Gly Leu Gln His Thr Arg Lys 725 730 735 Met Leu His Val Gly Asp Pro Ser Val Lys Lys Thr Ala Ile Ser Leu 740 745 750 Leu Arg Asn Leu Ser Arg Asn Leu Ser Leu Gln Asn Glu Ile Ala Lys 755 760 765 Glu Thr Leu Pro Asp Leu Val Ser Ile Ile Pro Asp Thr Val Pro Ser 770 775 780 Thr Asp Leu Leu Ile Glu Thr Thr Ala Ser Ala Cys Tyr Thr Leu Asn 785 790 795 800 Asn Ile Ile Gln Asn Ser Tyr Gln Asn Ala Arg Asp Leu Leu Asn Thr 805 810 815 Gly Gly Ile Gln Lys Ile Met Ala Ile Ser Ala Gly Asp Ala Tyr Ala 820 825 830 Ser Asn Lys Ala Ser Lys Ala Ala Ser Val Leu Leu Tyr Ser Leu Trp 835 840 845 Ala His Thr Glu Leu His His Ala Tyr Lys Lys Ala Gln Phe Lys Lys 850 855 860 Thr Asp Phe Val Asn Ser Arg Thr Ala Lys Ala Tyr His Ser Leu Lys 865 870 875 880 Asp <210> 5 <211> 600 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gtcatggaga agacccacct tgcagatgtc ctcactgggg ctggcagagc cggcaacctg 60 cctaaggctg ctcagtccat taggagccag tagcctggaa gatgtcttta cccccagcat 120 cagttcaagt ggagcagcac ataactcttg ccctctgcct tccaagattc tggtgctgag 180 acttatggag tgtcttggag gttgccttct gccccccaac cctgctccca gctggccctc 240 ccaggcctgg gttgctggcc tctgctttat caggattctc aagagggaca gctggtttat 300 gttgcatgac tgttccctgc atatctgctc tggttttaaa tagcttatct gagcagctgg 360 aggaccacat gggcttatat ggcgtggggt acatgttcct gtagccttgt ccctggcacc 420 tgccaaaata gcagccaaca ccccccaccc ccaccgccat ccccctgccc cacccgtccc 480 ctgtcgcaca ttcctccctc cgcagggctg gctcaccagg ccccagccca catgcctgct 540 taaagccctc tccatcctct gcctcaccca gtccccgctg agactgagca gacgcctcca 600 <210> 6 <211> 8383 <212> DNA <213> artificial <220> <223> Exemplary vector expressing PKP2b <400> 6 ggcactgggc aggtaagtat caaggttaca agacaggttt aaggagacca atagaaactg 60 ggcttgtcga gacagagaag actcttgcgt ttctgatagg cacctattgg tcttactgac 120 atccactttg cctttctctc cacaggtgtc cactcccagt tcaattacag ctcttaaggc 180 tagagtactt aatacgactc actataggct agcggtaccg gtcgccacca tggactacaa 240 agaccatgac ggtgattata aagatcatga catcgattac aaggatgacg atgacaagct 300 tggtaccgag ctcggatcca tggccgcccc cggagcacct gccgagtatg gctacattcg 360 caccgtcctg ggacagcaga ttctgggaca gctggattca tcaagcctgg ccctgccttc 420 tgaggccaag ctgaagctgg caggaagctc cggaagggga ggacagaccg tgaagagcct 480 gagaatccag gagcaggtgc agcagacact ggcccggaag ggcagatcta gcgtgggcaa 540 cggcaatctg cacaggacct cctctgtgcc agagtacgtg tataacctgc acctggtgga 600 gaatgacttc gtgggaggcc gcagcccagt gccaaagaca tacgatatgc tgaaggccgg 660 caccacagca acctatgagg gcaggtgggg aagaggaaca gcacagtaca gctcccagaa 720 gtctgtggag gagcggagcc tgagacaccc tctgcggaga ctggagatca gcccagactc 780 tagccctgag agggcacact atacccactc cgattaccag tattctcaga gaagccaggc 840 aggacacaca ctgcaccacc aggagagcag gagggccgcc ctgctggtgc cacctagata 900 cgcccgctct gagatcgtgg gcgtgagcag ggcaggaacc acatcccggc agagacactt 960 cgacacctac cacagacagt atcagcacgg ctctgtgagc gacacagtgt ttgattccat 1020 ccctgccaac ccagccctgc tgacctatcc tcggccaggc acatccagat ctatgggcaa 1080 cctgctggag aaggagaatt acctgaccgc aggcctgaca gtgggacagg tgaggcccct 1140 ggtgcctctg cagccagtga cccagaatcg ggccagcaga tcctcttggc accagagctc 1200 cttccactct accaggacac tgagggaggc aggaccaagc gtggcagtgg actctagcgg 1260 ccggagagcc cacctgaccg tgggacaggc agcagcagga ggatccggca acctgctgac 1320 agagaggtcc acctttacag actctcagct gggcaatgcc gatatggaga tgaccctgga 1380 gagggccgtg agcatgctgg aggcagacca catgctgcca tccaggatct ctgccgcagc 1440 cacattcatc cagcacgagt gctttcagaa gtccgaggca aggaagaggg tgaaccagct 1500 gaggggcatc ctgaagctgc tgcagctgct gaaggtgcag aacgaggatg tgcagagggc 1560 cgtgtgcggc gccctgagga atctggtgtt cgaggacaac gataataagc tggaggtggc 1620 agagctgaac ggagtgccaa ggctgctgca ggtgctgaag cagacccgcg acctggagac 1680 aaagaagcag atcaccgatc acacagtgaa cctgcggagc agaaatggat ggcctggagc 1740 agtggcacac gcatgcaatc caagcaccct gggaggacag ggaggaagga tcacaagatc 1800 cggcgtgcgg gaccagcctg atcagcacgg cctgctgtgg aacctgtcct ctaatgacaa 1860 gctgaagaac ctgatgatca ccgaggccct gctgaccctg acagagaata tcatcatccc 1920 ttttagcggc tggccagagg gcgattatcc caaggccaac ggcctgctgg acttcgatat 1980 cttttacaac gtgaccggct gcctgaggaa tatgagctcc gccggagcag acggaagaaa 2040 ggccatgagg cgctgtgacg gcctgatcga ttccctggtg cactacgtgc ggggcaccat 2100 cgccgattat cagcccgacg ataaggccac agagaactgc gtgtgcatcc tgcacaatct 2160 gtcttatcag ctggaggccg agctgcctga gaagtacagc cagaacatct atatccagaa 2220 cagaaatatc cagaccgaca acaataagag catcggctgc ttcggcagca ggtcccgcaa 2280 ggtgaaggag cagtaccagg atgtgcccat gcctgaggag aagtccaatc ccaagggcgt 2340 ggagtggctg tggcactcta tcgtgatcag gatgtatctg agcctgatcg ccaagtccgt 2400 gcgcaactac acccaggagg catctctggg cgccctgcag aatctgacag caggatctgg 2460 accaatgccc accagcgtgg cccagacagt ggtgcagaag gagtccggcc tgcagcacac 2520 ccggaagatg ctgcacgtgg gcgacccatc cgtgaagaag acagccatct ctctgctgag 2580 gaacctgagc cgcaatctgt ccctgcagaa cgagatcgcc aaggagacac tgcccgatct 2640 ggtgagcatc atcccagaca ccgtgccctc cacagatctg ctgatcgaga caacagcctc 2700 cgcctgttac accctgaaca atatcatcca gaactcttat cagaatgccc gggacctgct 2760 gaacacaggc ggcatccaga agatcatggc aatctccgcc ggcgatgcat acgcatctaa 2820 taaggccagc aaggccgcct ccgtgctgct gtattctctg tgggcacaca ccgagctgca 2880 ccacgcatac aagaaggccc agtttaagaa gactgatttc gtgaatagca gaacagccaa 2940 agcctaccac agcctgaagg acctcgaggg atctggagca acaaacttct cactactcaa 3000 acaagcaggt gacgtggagg agaatcccgg gcctaagctt atgaaaacct tcaacatctc 3060 tcagcaggat ctggagctgg tggaggtcgc cactgagaag atcaccatgc tctatgagga 3120 caacaagcac catgtcgggg cggccatcag gaccaagact ggggagatca tctctgctgt 3180 ccacattgaa gcctacattg gcagggtcac tgtctgtgct gaagccattg ccattgggtc 3240 tgctgtgagc aacgggcaga aggactttga caccattgtg gctgtcaggc acccctactc 3300 tgatgaggtg gacagatcca tcagggtggt cagcccctgt ggcatgtgta gagagctgat 3360 ctctgactat gctcctgact gctttgtgct cattgagatg aatggcaagc tggtcaaaac 3420 caccattgag gaactcatcc ccctcaagta caccaggaac taataagcgg ccgcttccct 3480 ttagtgaggg ttaatgcttc gagcagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac 3540 cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt 3600 atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat 3660 gtttcaggtt cagggggaga tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg 3720 tggtaaaatc cgataaggga ctagagcatg gctacgtaga taagtagcat ggcgggttaa 3780 tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 3840 cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 3900 cagtgagcga gcgagcgcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 3960 tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tggaattcca gacgattgag cgtcaaaatg 4020 taggtatttc catgagcgtt tttccgttgc aatggctggc ggtaatattg ttctggatat 4080 taccagcaag gccgatagtt tgagttcttc tactcaggca agtgatgtta ttactaatca 4140 aagaagtatt gcgacaacgg ttaatttgcg tgatggacag actcttttac tcggtggcct 4200 cactgattat aaaaacactt ctcaggattc tggcgtaccg ttcctgtcta aaatcccttt 4260 aatcggcctc ctgtttagct cccgctctga ttctaacgag gaaagcacgt tatacgtgct 4320 cgtcaaagca accatagtac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg 4380 ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct 4440 tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc 4500 ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg 4560 atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt 4620 ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg 4680 tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc 4740 tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgtctaca atttaaatat 4800 ttgcttatac aatcttcctg tttttggggc ttttctgatt atcaaccggg gtacatatga 4860 ttgacatgct agttttacga ttaccgttca tcgattctct tgtttgctcc agactctcag 4920 gcaatgacct gatagccttt gtagagacct ctcaaaaata gctaccctct ccggcatgaa 4980 tttatcagct agaacggttg aatatcatat tgatggtgat ttgactgtct ccggcctttc 5040 tcacccgttt gaatctttac ctacacatta ctcaggcatt gcatttaaaa tatatgaggg 5100 ttctaaaaat ttttatcctt gcgttgaaat aaaggcttct cccgcaaaag tattacaggg 5160 tcataatgtt tttggtacaa ccgatttagc tttatgctct gaggctttat tgcttaattt 5220 tgctaattct ttgccttgcc tgtatgattt attggatgtt ggaatcgcct gatgcggtat 5280 tttctcctta cgcatctgtg cggtatttca caccgcatat ggtgcactct cagtacaatc 5340 tgctctgatg ccgcatagtt aagccagccc cgacacccgc caacacccgc tgacgcgccc 5400 tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt ctccgggagc 5460 tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgagacgaaa gggcctcgtg 5520 atacgcctat ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc 5580 acttttcggg gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat 5640 atgtatccgc tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag 5700 agtatgagta ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt 5760 cctgtttttg ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt 5820 gcacgagtgg gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc 5880 cccgaagaac gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta 5940 tcccgtattg acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac 6000 ttggttgagt actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa 6060 ttatgcagtg ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg 6120 atcggaggac cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc 6180 cttgatcgtt gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg 6240 atgcctgtag caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta 6300 gcttcccggc aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg 6360 cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg 6420 tctcgcggta tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc 6480 tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt 6540 gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt 6600 gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc 6660 atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag 6720 atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa 6780 aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg 6840 aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag 6900 ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg 6960 ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga 7020 tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc 7080 ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc 7140 acgcttcccg aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga 7200 gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt 7260 cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg 7320 aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac 7380 atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga 7440 gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg 7500 gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc 7560 tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgccc gggcaaagcc cgggcgtcgg gcgacctttg 7620 gtcgcccggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta 7680 ggggttcctt gtagttaatg attaacccgc catgctactt atctacgtag ccatgctcta 7740 gatgtcatgg agaagaccca ccttgcagat gtcctcactg gggctggcag agccggcaac 7800 ctgcctaagg ctgctcagtc cattaggagc cagtagcctg gaagatgtct ttacccccag 7860 catcagttca agtggagcag cacataactc ttgccctctg ccttccaaga ttctggtgct 7920 gagacttatg gagtgtcttg gaggttgcct tctgcccccc aaccctgctc ccagctggcc 7980 ctcccaggcc tgggttgctg gcctctgctt tatcaggatt ctcaagaggg acagctggtt 8040 tatgttgcat gactgttccc tgcatatctg ctctggtttt aaatagctta tctgagcagc 8100 tggaggacca catgggctta tatggcgtgg ggtacatgtt cctgtagcct tgtccctggc 8160 acctgccaaa atagcagcca acacccccca cccccaccgc catccccctg ccccacccgt 8220 cccctgtcgc acattcctcc ctccgcaggg ctggctcacc aggccccagc ccacatgcct 8280 gcttaaagcc ctctccatcc tctgcctcac ccagtccccg ctgagactga gcagacgcct 8340 ccagagctcg gatcctgaga acttcagggt gagtctatgg gac 8383

Claims (24)

1. 치료 용량의 유전자 요법 벡터를 인간 대상체의 심근세포에 전달하는 단계를 포함하며, 여기서 유전자 요법 벡터는 플라코필린-2 (PKP2), 또는 그의 기능적 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것인, 인간 대상체에서 심근병증을 치료 또는 예방하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 유전자 요법 벡터가 바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
3. 제2항에 있어서, 바이러스 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 그의 변이체, 및 그의 조합 중 하나 이상을 포함하는 것인 방법.
4. 제2항에 있어서, 바이러스 벡터가 AAV6 또는 AAV9를 포함하는 것인 방법.
5. 제2항에 있어서, 바이러스 벡터가 AAV6을 포함하는 것인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 심장 특이적 프로모터를 추가로 코딩하는 것인 방법.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 용량이 인간 대상체의 심근세포에 의한 PKP2 또는 그의 기능적 변이체의 생산을 수행함으로써 부정맥 유발성 우심실 심근병증 (ARVC)을 치료 또는 예방하는 데 효과적인 것인 방법.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 용량의 전달이 정맥내로 수행되는 것인 방법.
9. 인간 대상체의 심근세포 내에서 핵산 서열을 발현하도록 적합화된 유전자 요법 벡터이며, 핵산 서열은
   PKP2 또는 그의 기능적 변이체를 코딩하는 제1 서열; 및
   심장 특이적 프로모터를 포함하는 제2 서열
   을 포함하는 것인 유전자 요법 벡터.
10. 제9항에 있어서, 유전자 요법 벡터가 바이러스 벡터를 포함하는 것인 유전자 요법 벡터.
11. 제10항에 있어서, 바이러스 벡터가 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 그의 변이체, 및 그의 조합 중 하나 이상을 포함하는 것인 유전자 요법 벡터.
12. 제10항에 있어서, 바이러스 벡터가 AAV6 또는 AAV9를 포함하는 것인 유전자 요법 벡터.
13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 심장 특이적 프로모터가 TNNT2를 포함하는 것인 유전자 요법 벡터.
14. 제약상 허용되는 부형제 또는 담체;
    PKP2 또는 그의 기능적 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터
    를 포함하는, 인간 대상체에서 심근병증을 치료 또는 예방하기 위한 치료 제제.
15. 제14항에 있어서, 각각이 하나 이상의 비-PKP2 근절 단백질 또는 그의 기능적 변이체를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 하나 이상의 추가 바이러스 벡터를 추가로 포함하는 치료 제제.
16. 비-돌연변이화된 PKP2를 코딩하는 핵산 서열로 PKP2-돌연변이화된 심근세포를 형질감염시키는 단계
    를 포함하는, 비-돌연변이화된 PKP2를 발현하도록 PKP2-돌연변이화된 심근세포를 유전자 변형시키는 방법.
17. 제16항에 있어서, 핵산 서열이 AAV6 또는 AAV9를 포함하는 바이러스 벡터를 통해 전달되는 것인 방법.
18. 제17항에 있어서, 바이러스 벡터가 AAV6을 포함하는 것인 방법.
19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열이 심장 특이적 프로모터를 추가로 코딩하는 것인 방법.
20. 제19항에 있어서, 심장 특이적 프로모터가 TNNT2를 포함하는 것인 방법.
21. 제1항 내지 제8항 및 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, PKP2가 PKP2 이소형 2a인 방법.
22. 제1항 내지 제8항 및 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, PKP2가 PKP2 이소형 2b인 방법.
23. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, PKP2가 PKP2 이소형 2a인 유전자 요법 벡터 또는 치료 제제.
24. 제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, PKP2가 PKP2 이소형 2b인 유전자 요법 벡터 또는 치료 제제.