TW202300180A - 右心室心律失常性心肌病之基因療法組合物及治療 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種治療或預防人類個體之心肌病之組合物及方法。在一些實施例中，該方法包括將治療劑量之基因療法載體遞送至人類個體之心肌細胞，其中該基因療法載體包含編碼PKP2之核酸序列。

Description

右心室心律失常性心肌病之基因療法組合物及治療
本發明係關於心臟病(例如心肌病)之治療，且更具體言之，係關於用於治療心肌病之基因療法方法及醫藥組合物。
儘管在治療各種心臟病狀(諸如心臟衰竭)方面取得藥理學進步，但死亡率及致病率仍然是高的無法接受。此外，某些治療性方法不適用於許多患者(例如，具有與其他共病疾病(co-morbid diseases)相關聯之晚期心臟衰竭病狀的患者)。替代方法(諸如基因療法及細胞療法)由於其進行獨特定製之潛力及可有效解決許多心臟病之根本原因發病機理而受到越來越多關注。
本發明之一個目標係提供將治療性多核苷酸序列遞送至個體諸如人類個體之心肌細胞的方法。
本發明之某些實施例之另一個目標係將編碼斑菲素蛋白(plakophilin-2；PKP2)蛋白之多核苷酸序列載體化(vectorize)在病毒載體(諸如腺相關病毒)中。
本發明之某些實施例之另一個目標係利用基因療法方法來矯正PKP2突變之心肌細胞之單倍蛋白含量不足(haploinsufficiency)。
本發明之某些實施例之另一個目標係增加就PKP2而言是單倍蛋白含量不足的細胞中功能性PKP2蛋白之表現。
本發明滿足以上目標及其他目標，其中至少一個態樣係關於一種治療或預防個體(例如人類個體)之心肌病之方法。該方法包括例如將治療劑量之基因療法載體遞送至該個體之心肌細胞，其中該基因療法載體包含編碼PKP2之核酸序列。在一些實施例中，將基因療法載體遞送至就斑菲素蛋白-2 (PKP2)而言是單倍蛋白含量不足的心肌細胞導致心肌細胞增加PKP2之胞橋小體表現至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍。在一些實施例中，將基因療法載體遞送至心肌細胞導致PKP2之胞橋小體表現為非單倍蛋白含量不足的心肌細胞之胞橋小體表現的至少50%。
在至少一個實施例中，基因療法載體包含病毒載體。在至少一個實施例中，該病毒載體包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、其變型及其組合中之一者或多者。在至少一個實施例中，該病毒載體包含AAV6或AAV9。在至少一個實施例中，該病毒載體包含AAV6。
在至少一個實施例中，該核酸序列進一步編碼心臟特異性啟動子。
在至少一個實施例中，該治療劑量為有效藉由實現由個體之心肌細胞產生PKP2或其功能變異體而治療或預防心律失常性右心室心肌病(ARVC)。
在至少一個實施例中，該治療劑量之遞送經靜脈內進行。
在至少一個實施例中，該個體為人類個體。
在另一個態樣中，基因療法載體經調適用於表現個體之心肌細胞內的核酸序列。在至少一個實施例中，該核酸序列包含：編碼PKP2或其功能變異體之第一序列；及包含心臟特異性啟動子之第二序列。在至少一個實施例中，將基因療法載體遞送至就PKP2而言是單倍蛋白含量不足的心肌細胞導致心肌細胞增加PKP2之總胞橋小體表現至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍。在至少一個實施例中，將基因療法載體遞送至單倍蛋白含量不足的心肌細胞導致PKP2之總胞橋小體表現為非單倍蛋白含量不足的心肌細胞之總胞橋小體表現的至少50%。
在至少一個實施例中，基因療法載體包含病毒載體。在至少一個實施例中，該病毒載體包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、其變型及其組合中之一者或多者。在至少一個實施例中，該病毒載體包含AAV6或AAV9。
在至少一個實施例中，該心臟特異性啟動子包含TNNT2或具有至少99%、95%、90%、85%、80%、75%或70%相似性之功能性序列。
在至少一個實施例中，該個體為人類個體。
在另一個態樣中，治療性調配物經調配以用於治療或預防個體之心肌病。在至少一個實施例中，該治療性調配物包含：醫藥上可接受之賦形劑或載劑；及包含編碼PKP2或其功能變異體之核酸序列之病毒載體。在至少一個實施例中，將治療性調配物遞送至就PKP2而言是單倍蛋白含量不足的心肌細胞導致心肌細胞增加PKP2之總胞橋小體表現至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍。在至少一個實施例中，將治療性調配物載體遞送至單倍蛋白含量不足的心肌細胞導致PKP2之總胞橋小體表現為非單倍蛋白含量不足的心肌細胞之總胞橋小體表現的至少50%。
在至少一個實施例中，該治療性調配物進一步包含：一或多種另外病毒載體，其各包含編碼一或多種非-PKP2肌原纖維節蛋白或其功能變異體之核酸序列。在至少一個實施例中，該個體為人類個體。
在另一個態樣中，一種將具有經突變之 PKP2基因之心肌細胞基因改造成表現功能性PKP2或其功能變異體之方法包括：用編碼功能性PKP2之核酸序列轉染或轉導心肌細胞，其中該轉染或轉導導致心肌細胞增加功能性PKP2之總胞橋小體表現至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍。在至少一個實施例中，該轉染或轉導導致功能性PKP2之總胞橋小體表現為具有非突變 PKP2基因之心肌細胞之總胞橋小體表現的至少50%。
在至少一個實施例中，該核酸序列經由包含AAV6或AAV9之病毒載體遞送。在至少一個實施例中，該病毒載體包含AAV6。
在至少一個實施例中，該核酸序列進一步編碼心臟特異性啟動子。在至少一個實施例中，該心臟特異性啟動子包含TNNT2或具有至少99%、95%、90%、85%、80%、75%或70%相似性之功能性序列。
在至少一個實施例中，任何前述方法或調配物之PKP2為PKP2同功型2a。
在至少一個實施例中，任何前述方法或調配物之PKP2為PKP2同功型2b。
在另一個態樣中，用於治療或預防個體之心肌病之治療性調配物包含：醫藥上可接受之賦形劑或載劑；包含編碼PKP2同功型2a或其功能變異體之核酸序列之第一病毒載體；及包含編碼PKP2同功型2b或其功能變異體之核酸序列之第二病毒載體。在至少一個實施例中，將治療性調配物遞送至就PKP2同功型2a或同功型2b而言是單倍蛋白含量不足的心肌細胞導致心肌細胞增加PKP2同功型2a或同功型2b之總胞橋小體表現至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍。在至少一個實施例中，將治療性調配物載體遞送至單倍蛋白含量不足的心肌細胞導致PKP2同功型2a或同功型2b之總胞橋小體表現為非單倍蛋白含量不足的心肌細胞之總胞橋小體表現的至少50%。
在另一個態樣中，用任何前述實施例之基因療法載體轉導分離的細胞。在至少一個實施例中，該細胞為人類細胞。在至少一個實施例中，該細胞為心臟細胞。在至少一個實施例中，該細胞為人類誘導之富潛能幹細胞衍生之心肌細胞。
在另一個態樣中，一種上調具有經突變之 PKP2基因之心肌細胞中一或多種胞橋小體蛋白質之方法包括：用編碼選自PKP2同功型2a及PKP2同功型2b之功能性PKP2之核酸序列轉染或轉導心肌細胞，其中該轉染或轉導導致該一或多種胞橋小體蛋白質中之各者之總胞橋小體表現增加至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍，其中該一或多種胞橋小體蛋白質選自橋粒斑蛋白(desmoplakin) 1、橋粒斑蛋白2、橋粒膠蛋白(desmocollin) 2、斑珠蛋白、橋粒芯醣蛋白(desmoglein) 2及連結蛋白(connexin) 43。
在另一個態樣中，一種治療或預防個體之心肌病之方法包括：將治療劑量之基因療法載體遞送至該個體之心肌細胞，其中該等心肌細胞就斑菲素蛋白-2 (PKP2)而言是單倍蛋白含量不足的，其中該基因療法載體包含編碼非顯性PKP2同功型或其功能變異體之核酸序列，其中將該基因療法載體遞送至心肌細胞導致心肌細胞增加PKP2之總胞橋小體表現至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍，且其中該PKP2之總胞橋小體表現包括顯性PKP2同功型及非顯性PKP2同功型之表現。在至少一個實施例中，顯性PKP2同功型為PKP2同功型2a，且其中該非顯性PKP2同功型為PKP2同功型2b。
相關申請案之交叉參考
本發明主張2021年3月19日申請之美國臨時專利申請案第63/163,393號之優先權，該案之全部揭示內容係以引用之方式併入本文中。 定義
如本文所用，除非上下文清楚地另作指明，否則單數形式「一」、「一個」及「該」包括複數個指示物。因此，例如，提及「一藥物」包括一種藥物以及兩種或更多種不同藥物之混合物；及提及「病毒載體」包括一種病毒載體以及兩種或更多種不同病毒載體之混合物及類似者。
同樣如本文所用，「約」當搭配測量的數量使用時係指該測量的數量之正常變化，如一般技術者在進行測量及實踐與測量目標及測量設備之精度相稱的照護程度時所期望。在某些實施例中，術語「約」包括所引用的數字±10%，使得「約10」將包括9至11。
同樣如本文所用，「多核苷酸」在此項技術中具有其尋常及慣常含義且包括任何聚合核酸(諸如DNA或RNA分子)以及熟習此項技術者已知的化學衍生物。多核苷酸不僅包括編碼治療性蛋白質之核苷酸而且包括可用於使用此項技術中已知的技術降低目標核酸序列之表現之序列(例如反義核酸、干擾核酸或小干擾核酸)。多核苷酸亦可用於引發或增加心血管系統之細胞內目標核酸序列之表現或目標蛋白質之產生。目標核酸及蛋白質包括(但不限於)通常在目標組織中發現的核酸及蛋白質、此類天然生成之核酸或蛋白質之衍生物、通常不在目標組織中發現的天然生成之核酸或蛋白質或合成核酸或蛋白質。一或多種多核苷酸可組合使用，同時及/或依序投與，以增加及/或減少一或多種目標核酸序列或蛋白質。
同樣如本文所用，「外源」核酸或基因為在用於核酸轉移之載體中自然界中不存在之彼等；例如，並非在病毒載體中天然發現者，但該術語並不意圖排除編碼天然存在於患者或宿主中的蛋白質或多肽之核酸。
同樣如本文所用，「心臟細胞」包括心臟之涉及維持結構或提供心臟之功能之任何細胞，諸如心臟肌肉細胞、心臟血管系統之細胞或存在於心臟瓣膜中之細胞。心臟細胞包括心肌細胞(具有正常及異常電性質)、上皮細胞、內皮細胞、纖維母細胞、傳導組織細胞、心臟起搏細胞(cardiac pace making cell)及神經元。
同樣如本文所用，「腺相關病毒」或「AAV」包涵所有亞型、血清型、及假型、以及天然生成之形式及重組形式。多種AAV血清型及品系係此項技術中已知的且可自來源(諸如ATCC及學術或商業來源)公開獲得。或者，可使用已知技術來合成來自AAV血清型及品系之序列，該等序列係經公開及/或可自多種資料庫獲得。
同樣如本文所用，「血清型」係指基於衣殼蛋白與所限定的抗血清之反應性而被其他AAV識別並與其區別之AAV。人類AAV有至少十二種已知血清型，包括AAV1至AAV12，然而，繼續發現另外血清型，且經考慮使用新發現的血清型。
同樣如本文所用，「假型」AAV係指含有一種血清型之衣殼蛋白及不同或異源血清型之病毒基因組(包括5′及3′反向末端重複序列(ITR))之AAV。假型重組AAV (rAAV)將預期具有衣殼血清型之細胞表面結合性質及與ITR血清型一致之遺傳性質。假型rAAV可包含AAV衣殼蛋白(包括VP1、VP2及VP3衣殼蛋白)及任何血清型AAV(包括自AAV1至AAV12之任何靈長類動物AAV血清型)之ITR，只要衣殼蛋白之血清型與ITR之血清型係異源即可。在假型rAAV中，5′及3′ ITR可相同或異源。假型rAAV係使用此項技術中描述的標準技術來產生。
同樣如本文所用，「嵌合」rAAV載體包涵包含異源衣殼蛋白之AAV載體；亦即，rAAV載體可相關於其衣殼蛋白VP1、VP2及VP3係嵌合的，使得VP1、VP2及VP3不是全部相同血清型AAV。如本文所用，嵌合AAV包涵AAV使得衣殼蛋白VP1、VP2、及VP3之血清型不同，包括(例如但不限於) AAV1及AAV2之衣殼蛋白；係其他微小病毒衣殼蛋白之混合物或包含其他病毒蛋白或其他蛋白質，諸如(例如)靶向將AAV遞送至所需細胞或組織之蛋白質。如本文所用，嵌合rAAV亦包涵包含嵌合5′及3′ ITR之rAAV。
同樣如本文所用，「醫藥上可接受之賦形劑或載劑」係指組合物中之與活性劑組合成調配物之任何惰性成分。醫藥上可接受之賦形劑可包括(但不限於)碳水化合物(諸如葡萄糖、蔗糖或聚葡萄糖)、抗氧化劑(諸如抗壞血酸或麩胱甘肽)、螯合劑、低分子量蛋白質、高分子量聚合物、凝膠形成劑或其他穩定劑及添加劑。醫藥上可接受之載劑之其他實例包括濕潤劑、乳化劑、分散劑、或防腐劑，其對於防止微生物之生長或作用特別有用。各種防腐劑係熟知的且包括(例如)苯酚及抗壞血酸。載劑、穩定劑或佐劑之實例可見於Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company，Philadelphia, Pa.，第17版 (1985)中。
同樣如本文所用「患者」係指個體，特別是人類(但亦可包涵非人類)，其已呈現表明需要治療的一種或多種特定症狀之臨床表現，其已針對病狀進行預防性治療，或其已診斷患有待治療的病狀。
同樣如本文所用，「個體」包涵術語「患者」之定義且不排除其他方面健康的個體。
同樣如本文所用，「治療(treatment of)」及「治療(treating)」包括投與藥物意欲減輕病狀(例如心臟病)之嚴重度或預防病狀(例如心臟病)。
同樣如本文所用，「預防(prevention of)」及「預防(preventing)」包括避免病狀(例如心臟病)之發作。
同樣如本文所用，「病狀(condition/conditions)」係指可藉由對個體投與有效量之藥物來治療、減輕、或預防之其等醫學病狀，諸如心臟病。
同樣如本文所用，「有效量」係指足以產生一定程度之有益或所需效應的藥物之量，該程度可容易藉由通常用於偵測此種效應之方法偵測到。在一些實施例中，此種效應導致與不投與藥物之基礎程度之值相比改變至少10%。在其他實施例中，變化是自基礎程度之至少20%、50%、80%或甚至更高百分比。如將於下文所述，根據個體之年齡、一般病狀、所治療病狀之嚴重度、所投與之特定藥物及類似者，藥物之有效量可因個體而異。適宜「有效」量在任何個別情況下可由一般技術者藉由參考相關文本及文獻及/或藉由使用常規實驗來確定。
同樣如本文所用，「活性劑」係指意欲產生治療、預防或其他預期效應之任何材料，無論是否針對該目的而獲得政府機構批准。
除非本文另有指示，否則本文中數值範圍之敘述僅欲用作個別提及指代落入該範圍內的各單獨值之簡寫方法，且將各單獨值併入本說明書中，如同其在本文中經個別敘述般。除非本文另有指示或上下文明顯地矛盾，否則本文所述的所有方法可以任何適宜順序進行。本文所提供的任何及所有實例或例示性語言(例如「諸如」)之使用僅意欲闡明某些材料及方法且不對範疇構成限制。本說明書中之語言均不應解釋為指示任何未主張的要素對於所揭示材料及方法之實務必不可少。
心律失常性右心室心肌病(ARVC)係原發性心肌病症及年輕個體之心臟性猝死(SCD)之主要原因。其特徵為心肌變性及心肌纖維脂肪更換，其可存在於右心室及/或左心室中且最終導致進行性心臟衰竭。臨床心臟表現型之特徵為存在典型心電圖異常、心室性心律不整之負擔增加及心臟磁共振成像上之廣泛心肌瘢痕形成。
ARVC在約50%的病例中係家族性的且通常係呈體染色體顯性性狀遺傳。約30%之高加索人後裔患者攜帶 PKP2基因之顯性突變。大多數突變會因為插入-缺失、無意義或剪接位點突變而導致異常蛋白或截短蛋白，從而導致單倍蛋白含量不足。
ARVC被認為係胞橋小體(提供在心肌細胞之間之機械附著之電子緻密結構)之疾病。 PKP2係形成胞橋小體蛋白質複合體之一部分且其中已識別導致ARVC之突變之幾種基因之一。透過單倍蛋白含量不足而缺乏PKP2蛋白使得胞橋小體蛋白質複合體去穩定，具有機械及信號傳導後果。
機械分量係強調在活體外在機械應力條件下因PKP2蛋白之缺乏引起的異常基因表現模式，該等機械應力條件涉及幾種細胞外基質基因(諸如不同的膠原蛋白)之下調及原纖維形成膠原蛋白、纖維接合素(fibronectin)及其他促纖維化標記物(諸如TIMP1)之強上調。在臨床前及臨床情境中，此點由 PKP2-小鼠模型中因運動使ARVC惡化及由運動對人類(諸如運動員)之表現型之有害效應反映。在信號傳導層級上，缺乏斑菲素蛋白會引起斑珠蛋白(plakoglobin)移位至細胞核，此導致典型Wnt/b-連環蛋白(catenin)信號傳導之減少及成纖維及成脂基因之表現增加。
PKP2之兩種主要形式包括PKP2同功型2a (SEQ ID NO: 3)及PKP2同功型2b (SEQ ID NO: 5)。PKP2同功型2a之 PKP2基因之蛋白質編碼部分包含在2764bp cDNA序列(GenBank：BC126199.1；SEQ ID NO: 1)中，該序列可根據本發明在AAV中進行載體化。如本文所用，除非另有說明或上下文暗示，否則「PKP2」或「PKP2蛋白」應解釋為包涵PKP2之同功型，包括PKP2同功型2a及PKP2同功型2b。
某些實施例可藉由經由AAV9-TNNT2-PKP2介導之基因轉移取代正常對偶基因來矯正PKP2蛋白之單倍蛋白含量不足。在某些實施例中，本發明之組合物及方法可能夠例如(1)將PKP2蛋白正確地定位至胞橋小體；及(2)矯正PKP2突變之人類誘導之富潛能幹細胞衍生之心肌細胞(iPSC-CM)之單倍蛋白含量不足且因此矯正胞橋小體蛋白質複合體。本發明亦考慮攜帶呈反式之兩個致病突變之iPSC-CM中導致完全或接近完全之PKP2缺乏之某些實施例。用於測試PKP2多核苷酸至心肌細胞之遞送的非限制性例示性實施例包括：(1)使用TNNT2啟動子將PKP2載體化至AAV9及/或AAV6中；建立攜帶PKP2突變(1個突變或呈反式之2個突變)之iPSC-CM；活體外用AAV6-PKP2或AAV9-PKP2轉導2D PKP2突變之心肌細胞培養物(攜帶1個或2個突變)且測試亞細胞定位於胞橋小體中；測試分子及生理資料，包括細胞大小、收縮性及轉錄組分析。
雖然本文許多實施例係針對PKP2蛋白進行描述，但應瞭解，另外蛋白質(例如肌原纖維節蛋白(sarcomeric protein))之表現考慮在內。除PKP2外，例示性蛋白質可包括(但不限於) SERCA2、MYBPC3、MYH7、MYL3、MYL2、ACTC1、TPM1、TNNT2、TNNI3、TTN、FHL1、ALPK3、肌肉萎縮蛋白、FKRP、其變異體或其組合中之一者或多者。所使用的蛋白質亦可係本文提及的蛋白質之功能變異體且可展現與原始蛋白質相比顯著胺基酸序列一致性。例如，胺基酸一致性可相當於至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%。在該上下文中，術語「功能變異體」意指蛋白質之能夠部分或完全實現天然生成之相應蛋白質之功能之變異體。蛋白質之功能變異體包括(例如)與其天然生成之對應物相差一或多個胺基酸取代、缺失或添加之蛋白質。
胺基酸取代可為保守的或非保守的。較佳地，取代係保守取代，亦即，胺基酸殘基經具有相似極性之胺基酸取代，該具有相似極性之胺基酸充當功能性等效物。較佳地，用作取代物之胺基酸殘基選自與待取代的胺基酸殘基相同的胺基酸之群。例如，疏水性殘基可經另一疏水性殘基取代，或極性殘基可經具有相同電荷之另一極性殘基取代。可用於保守取代之功能同源胺基酸包含(例如)非極性胺基酸，諸如甘胺酸、纈胺酸、丙胺酸、異白胺酸、白胺酸、甲硫胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸及色胺酸。不帶電荷之極性胺基酸之實例包含絲胺酸、蘇胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、酪胺酸及半胱胺酸。帶電荷之極性(鹼性)胺基酸之實例包含組胺酸、精胺酸、及離胺酸。帶電荷之極性(酸性)胺基酸之實例包含天冬胺酸及麩胺酸。
亦被視為變異體的是與其天然生成之對應物相差一或多個(例如，2、3、4、5、10或15個)額外胺基酸之蛋白質。此等另外胺基酸可存在於原始蛋白質之胺基酸序列內(亦即，作為插入)，或可將其添加至蛋白質之一個或兩個末端。基本上，若胺基酸之添加不損害多肽實現所治療個體中天然生成之蛋白質之功能之能力，則插入可在任何位置進行。此外，蛋白質之變異體亦包含其中與原始多肽相比缺少一或多個胺基酸之蛋白質。此類缺失可在任何胺基酸位置實現，只要不損害實現蛋白質之正常功能之能力。
最後，心臟肌原纖維節蛋白(例如PKP2)之變異體亦指藉由結構修飾與天然生成之蛋白質不同的蛋白質，諸如經修飾之胺基酸。經修飾之胺基酸為已藉由天然製程(諸如加工或轉譯後修飾)或藉由此項技術中已知的化學修飾製程修飾之胺基酸。典型胺基酸修飾包含磷酸化、醣基化、乙醯化、O-連接之N-乙醯葡糖胺化、麩胱甘肽化、醯化、分支化、ADP核糖基化、交聯、二硫鍵形成、甲醯化、羥基化、羧化、甲基化、脫甲基化、醯胺化、環化及/或與磷脂醯肌醇、黃素衍生物、脂磷壁酸(lipoteichonic acid)、脂肪酸或脂質之共價或非共價結合。
編碼靶蛋白質之治療性多核苷酸序列可以基因療法載體(亦即，核酸構築體，其包含編碼序列(包括轉譯及終止密碼子)，緊隨為提供外源核酸之表現所需的其他序列(諸如啟動子、kozak序列、polyA信號及類似者))之形式投與給待治療的個體。
例如，基因療法載體可為哺乳動物表現系統之部分。有用的哺乳動物表現系統及表現構築體可商業購得。再者，幾種哺乳動物表現系統係由不同製造商經銷且可用於本發明，諸如基於質體載體或病毒載體之系統，例如LENTI-Smart™ (InvivoGen)、GenScript™表現載體、pAdVAntage™ (Promega)、ViraPower™慢病毒、腺病毒表現系統(Invitrogen)及腺相關病毒表現系統(Cell Biolabs)。
用於表現本發明之外源性治療性多核苷酸序列之基因療法載體可為(例如)病毒或非病毒表現載體，其適於將外源性治療性多核苷酸序列引入細胞中以於隨後表現由該核酸編碼之蛋白質。表現載體可為游離基因組型載體(亦即，能夠在宿主細胞內自主自我複製之載體)或整合載體(亦即，穩定性地併入細胞之基因組中之載體)。宿主細胞中之表現可為組成型或調節型(例如可誘導的)。
在某一實施例中，基因療法載體係病毒表現載體。用於本發明之病毒載體可包含病毒基因組，其中天然序列之一部分已經刪除以便引入異源多核苷酸而不破壞病毒之感染性。由於病毒組分與宿主細胞受體之間的特異性相互作用，病毒載體極其適合將基因有效轉移至靶細胞中。用於促進基因轉移至哺乳動物細胞中之適宜病毒載體可衍生自不同類型之病毒，例如，衍生自AAV、腺病毒、逆轉錄病毒、單純皰疹病毒、牛乳頭瘤病毒、慢病毒、牛痘病毒、多瘤病毒、仙台病毒(sendai virus)、正黏液病毒、副黏液病毒、乳頭瘤病毒、小核糖核酸病毒(picornavirus)、痘病毒、α病毒或適合基因療法之任何其他病毒穿梭物(viral shuttle)、其變異體及其組合。
「腺病毒表現載體」或「腺病毒」意欲包括彼等含有足以(a)支持治療性多核苷酸序列構築體之包裝，及/或(b)足以最終表現已選殖於其中的組織及/或細胞特異性構築體之腺病毒序列的構築體。在本發明之一個實施例中，表現載體包含腺病毒之基因改造形式。腺病毒(36千鹼基(kb)，線性，雙股DNA病毒)之遺傳組織化知識允許以至多7 kb之外源序列取代大片腺病毒DNA。
腺病毒生長及操作係熟習此項技術者已知的，且在活體外及活體內展現寬泛宿主範圍。該病毒群可以高效價獲得，例如每mL 10 9至10 11個溶菌斑形成單位，且其極具感染性。腺病毒之生命週期不需要整合於宿主細胞基因組中。藉由腺病毒載體遞送之外源基因係附加型的且因此對宿主細胞之遺傳毒性低。在用野生型腺病毒進行疫苗接種之研究中，尚無副作用之報導，證實其之作為活體內基因轉移載體之安全性及/或治療潛力。
逆轉錄病毒(亦稱為「逆轉錄病毒載體」)可經選擇作為基因遞送載體，因為其能夠將其基因整合至宿主基因組中，從而轉移大量外來遺傳物質，感染廣泛範圍之物種及細胞類型及用於被包裝在特定細胞系中。
逆轉錄病毒基因組含有三個基因 gag、 pol及 env，其分別編碼衣殼蛋白、聚合酶酵素及包膜組分。在 gag基因上游發現的序列含有用於將基因組包裝於病毒粒子中之信號。在病毒基因組之5′及3′端存在兩個長末端重複(LTR)序列。此等序列含有強啟動子及增強子序列且亦為整合至宿主細胞基因組中所需。
為建構逆轉錄病毒載體，將編碼受關注基因之核酸代替某些病毒序列插入病毒基因組中以產生複製缺陷型病毒。為產生病毒粒子，建構含有 gag、 pol及/或 env基因但不含LTR及/或包裝組分之包裝細胞系。當將含有cDNA之重組質體以及逆轉錄病毒LTR及包裝序列引入該細胞系中時(例如藉由磷酸鈣沉澱)，包裝序列允許重組質體之RNA轉錄本被包裝至病毒粒子中，該等病毒粒子然後被分泌於培養基中。然後收集含有重組逆轉錄病毒之培養基，視需要進行濃縮，且用於基因轉移。逆轉錄病毒載體能夠感染多種細胞類型。然而，整合及穩定表現需要宿主細胞之分離。
逆轉錄病毒可衍生自任何子家族。例如，可使用來自鼠類肉瘤病毒、牛白血病病毒、勞氏肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus)、鼠類白血病病毒、水貂細胞病灶誘導病毒(Mink-Cell Focus-Inducing Virus)、網狀內皮細胞增生症病毒或禽類白血病病毒之載體。熟練技術者將能夠將衍生自不同逆轉錄病毒之部分(諸如LTR、tRNA結合位點及包裝信號)組合以提供重組逆轉錄病毒。此等逆轉錄病毒然後正常用於產生轉導感受態逆轉錄病毒載體粒子。針對此目的，將載體引入適宜包裝細胞系中。亦可藉由將嵌合整合酶酵素併入逆轉錄病毒粒子中來建構用於定點整合至宿主細胞之DNA中的逆轉錄病毒。
因為單純皰疹病毒(HSV)係親神經性的，因此其在治療神經系統病症方面引起極大興趣。此外，HSV在不分裂之神經元細胞中建立潛伏感染而不整合於宿主細胞染色體中或以其他方式改變宿主細胞之代謝之能力以及潛伏期期間具有活性的啟動子之存在使得HSV成為吸引人的載體。雖然許多注意力集中在HSV之親神經性應用上，但該載體由於其寬宿主範圍亦可開發用於其他組織。
使HSV成為吸引人的載體之另一個因素係基因組之大小及組織化。因為HSV為大型的，因此與其他較小病毒系統相比，多個基因或表現盒之併入的問題較少。另外，具有變化性能(時間、強度等)之不同病毒控制序列之可獲取性使得其與在其他系統中相比可在更大程度上控制表現。病毒具有相對較少剪接訊息從而進一步簡化基因操作亦係一個優勢。
HSV亦相對容易操作且可生長至高效價。因此，就獲得足夠感染倍率(MOI)所需的體積及減少對重複給藥的需要兩方面而言，遞送問題較少。已開發HSV之無毒性變異體且其可很容易用於基因療法情境。
慢病毒係複雜逆轉錄病毒，除了常見逆轉錄病毒基因 gag、 pol及 env外，其含有具有調節或結構功能之其他基因。較高複雜性使病毒能夠調節其生命週期，如在潛伏感染過程中。慢病毒之一些實例包括人類免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。慢病毒載體係藉由多重減毒HIV毒力基因而產生的，例如，基因 env、 vif、 vpr、 vpu及 nef經刪除使得載體生物學上安全。
慢病毒載體係基於質體或基於病毒的，且經構造為攜帶用於併入外來核酸，用於選擇及用於將核酸轉移至宿主細胞中之必需序列。受關注載體之 gag、 pol及 env基因係此項技術中已知的。因此，將相關基因選殖於所選載體中且然後用於轉形受關注靶細胞。
牛痘病毒載體因為其構築容易，獲得相對高的表現程度，寬泛宿主範圍及大的攜帶DNA之容量而被廣泛使用。牛痘含有約186 kb之線性雙股DNA基因組，其展現標記之「A-T」偏好。約10.5 kb之反向末端重複序列側接該基因組。大多數必需基因似乎在中央區域內定位(map)，此在痘病毒中係高度保守的。估計牛痘病毒中之開放閱讀框數為150至200。儘管兩股均在編碼，但閱讀框之廣泛重疊並不常見。
可將至少25 kb插入牛痘病毒基因組中。原型牛痘載體含有經由同源重組插入病毒胸苷激酶基因中之轉殖基因。基於tk表現型來選擇載體。包含腦心肌炎病毒之未轉譯之前導序列會導致表現程度高於習知載體之表現程度，且轉殖基因在24小時內會積聚在受感染細胞之蛋白質之10%或更多處。
乳頭狀病毒(諸如小鼠多瘤病毒)之空衣殼作為基因轉移之可能載體已受到關注。在無細胞系統中培養多瘤DNA及純化的空衣殼時首次描述空多瘤之使用。新粒子之DNA受保護免於胰臟DNA酶的作用。再構粒子用於將轉形多瘤DNA片段轉移至大鼠FIII細胞。空衣殼及再構粒子由全部三種多瘤衣殼抗原VP1、VP2及VP3組成。
AAV為屬於依賴病毒(Dependovirus)屬之微小病毒。其為小的無包膜單股DNA病毒，該病毒需要輔助病毒以便複製。必需與輔助病毒(例如腺病毒、皰疹病毒或牛痘病毒)共同感染以便形成功能上完整的AAV病毒粒子。在活體外，在沒有與輔助病毒共同感染下，AAV建立潛伏狀態，其中病毒基因組以附加型形式存在，但不會產生感染性病毒粒子。隨後經輔助病毒感染可「拯救」基因組，使其得以復製且包裝於病毒衣殼中，由此再構感染性病毒粒子。最新資料指示，在活體內，野生型AAV及重組AAV均主要以大附加型多聯體(concatemer)存在。在一個實施例中，本文所用的基因療法載體為AAV載體。AAV載體可係純化、複製不完全、假型rAAV粒子。
AAV與任何已知人類疾病均不相關，一般不認為是病原性的，且在整合後似乎不會改變宿主細胞之生理特性。AAV可感染寬廣範圍之宿主細胞，包括非分裂細胞，且可感染不同物種之細胞。與藉由細胞反應及體液反應迅速清除或滅活之一些載體相反，AAV載體已顯示活體內誘導各種組織中之持久性轉殖基因表現。重組AAV介導之轉殖基因於非分裂細胞中之活體內持久性可歸因於天然AAV病毒基因之缺乏及形成附加型多聯體之載體之ITR聯結能力。
AAV係用於本發明之細胞轉導中之吸引人的載體系統，因為其作為附加型多聯體具有高頻持久性及其可感染非分裂細胞，包括心肌細胞，因此使其可用於將基因遞送至哺乳動物細胞中，例如，於組織培養及活體內。
通常，藉由共轉染含有側接兩個AAV末端重複序列之受關注基因之質體及/或含有不具有末端重複序列之野生型AAV編碼序列之表現質體(例如pIM45)來製備rAAV。亦利用攜帶為AAV輔助功能所需的腺病毒基因之腺病毒及/或質體感染及/或轉染細胞。以此種方式製備的rAAV原種經腺病毒污染，必須將其與rAAV粒子物理分離(例如藉由氯化銫密度離心或管柱層析)。或者，可使用含有AAV編碼區之腺病毒載體及/或含有AAV編碼區及/或一些或全部腺病毒輔助基因之細胞系。亦可使用攜帶呈整合的原病毒的rAAV DNA之細胞系。
自然界中存在AAV之多種血清型，有至少十二種血清型 (AAV1至AAV12)。儘管同源性程度高，但不同血清型對於不同組織具有向性。轉染後，AAV僅在宿主中引起小免疫反應(若有的話)。因此，AAV極適合基因療法方法。
本發明在一些實施例中可針對包含AAV載體之藥物，該AAV載體為AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、ANC AAV、其衍生之嵌合AAV、其變異體及其組合中之一者或多者，其將甚至更好地適於受關注組織中之高效轉導。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型1載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型2載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型3載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型4載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型5載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型6載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型7載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型8載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型9載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型10載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型11載體。在某些實施例中，基因療法載體為AAV血清型12載體。
用於人類之適宜AAV劑量可在約1x10 8個載體基因組/公斤體重(vg/kg)至約3x10 14vg/kg、約1x10 8vg/kg、約1x10 9vg/kg、約1x10 10vg/kg、約1x10 11vg/kg、約1x10 12vg/kg、約1x10 13vg/kg或約1x10 14vg/kg之範圍內。病毒粒子或DRP之總量為，為約，為至少，為至少約，為不大於，或為不大於約5×10 15vg/kg、4×10 15vg/kg、3×10 15vg/kg、2×10 15vg/kg、1×10 15vg/kg、9×10 14vg/kg、8×10 14vg/kg、7×10 14vg/kg、6×10 14vg/kg、5×10 14vg/kg、4×10 14vg/kg、3×10 14vg/kg、2×10 14vg/kg、1×10 14vg/kg、9×10 13vg/kg、8×10 13vg/kg、7×10 13vg/kg、6×10 13vg/kg、5×10 13vg/kg、4×10 13vg/kg、3×10 13vg/kg、2×10 13vg/kg、1×10 13vg/kg、9×10 12vg/kg、8×10 12vg/kg、7×10 12vg/kg、6×10 12vg/kg、5×10 12vg/kg、4×10 12vg/kg、3×10 12vg/kg、2×10 12vg/kg、1×10 12vg/kg、9×10 11vg/kg、8×10 11vg/kg、7×10 11vg/kg、6×10 11vg/kg、5×10 11vg/kg、4×10 11vg/kg、3×10 11vg/kg、2×10 11vg/kg、1×10 11vg/kg、9×10 10vg/kg、8×10 10vg/kg、7×10 10vg/kg、6×10 10vg/kg、5×10 10vg/kg、4×10 10vg/kg、3×10 10vg/kg、2×10 10vg/kg、1×10 10vg/kg、9×10 9vg/kg、8×10 9vg/kg、7×10 9vg/kg、6×10 9vg/kg、5×10 9vg/kg、4×10 9vg/kg、3×10 9vg/kg、2×10 9vg/kg、1×10 9vg/kg、9×10 8vg/kg、8×10 8vg/kg、7×10 8vg/kg、6×10 8vg/kg、5×10 8vg/kg、4×10 8vg/kg、3×10 8vg/kg、2×10 8vg/kg或1×10 8vg/kg，或落在由任何兩個此等值定義的範圍內。以上所列的劑量的單位為vg/kg心臟組織。
除病毒載體外，非病毒表現構築體亦可用於將編碼靶蛋白質或其功能變異體或片段之基因引入患者之細胞中。允許蛋白質在靶細胞中活體內表現之非病毒表現載體包括(例如)質體、經修飾之RNA、mRNA、cDNA、反義寡聚物、DNA-脂質複合體、奈米粒子、外泌體(exosomes)、適用於基因療法之任何其他非病毒穿梭物、其變異體及其組合。
除病毒載體及非病毒表現載體外，核酸酶系統亦可與載體及/或電穿孔系統結合用於進入患者之細胞中且在其中引入編碼靶蛋白質或其功能變異體或片段之基因。例示性核酸酶系統可包括(但不限於)成簇的規律間隔的短迴文重複序列(CRISPR)、DNA切割酵素(例如Cas9)、大範圍核酸酶(meganuclease)、TALEN、鋅指核酸酶、適用於基因療法之任何其他核酸酶系統、其變異體及其組合。例如，在一個實施例中，一種病毒載體(例如AAV)可用於核酸酶(例如CRISPR)及另一種病毒載體(例如AAV)可用於DNA切割酵素(例如Cas9)以將二者(核酸酶及DNA切割酵素)均引入於靶細胞中。
可用於將編碼治療性基因之治療性多核苷酸序列遞送至細胞中之其他載體遞送系統係受體介導之遞送媒介體(vehicle)。此等媒介體利用於幾乎所有真核細胞中藉由受體介導之吞噬選擇性吸收大分子。因為各種受體之細胞類型特異性分佈，故該遞送可係高度特異性的。受體介導之基因靶向媒介體可包括兩個組分：細胞受體特異性配位體及DNA結合劑。
用於將非病毒載體轉移至靶細胞中之適宜方法係例如脂轉染法、磷酸鈣共沉澱法、DEAE-葡聚糖法及使用微玻璃管、超音波、電穿孔及類似者之直接DNA引入方法。在引入載體之前，可用透化劑(諸如磷脂醯膽鹼、鏈球菌溶血素、癸酸鈉、癸醯基肉鹼、酒石酸、溶血卵磷脂、Triton X-100及類似者)處理心臟肌肉細胞。外泌體亦可用於轉移裸露之DNA或AAV殼體包裹之DNA。
本發明之基因療法載體可包含與編碼靶蛋白質之核酸序列功能上連結之啟動子。啟動子序列必須緊湊且確保強表現。較佳地，啟動子提供靶蛋白質在已用基因療法載體治療的患者之心肌層中之表現。在一些實施例中，基因療法載體包含心臟特異性啟動子，其係可以操作方式連結至編碼靶蛋白質之核酸序列。如本文所用，「心臟特異性啟動子」係指其在心臟細胞中之活性比在任何其他非心臟細胞類型中高至少2倍之啟動子。較佳地，適合用於本發明之載體中之心臟特異性啟動子在心臟細胞中之活性與其在非心臟細胞類型中之活性相比高至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍或至少50倍。
心臟特異性啟動子可係所選人類啟動子或包含與所選人類啟動子具有至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之功能等效序列之啟動子。可使用的例示性非限制性啟動子為心臟肌鈣蛋白T啟動子(TNNT2)。啟動子之其他非限制性實例包括α肌球蛋白重鏈啟動子、肌球蛋白輕鏈2v啟動子、α肌球蛋白重鏈啟動子、α心臟肌動蛋白啟動子、α原肌球蛋白啟動子、心臟肌鈣蛋白C啟動子、心臟肌鈣蛋白I啟動子、心臟肌球蛋白結合蛋白C啟動子及肌/內質網Ca 2+-ATP酶(SERCA)啟動子(例如，該啟動子之同功型2 (SERCA2))。
用於本發明之載體具有不同的轉導效率。結果是，病毒或非病毒載體轉導大於，等於，或至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約55%、約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約99%或100%之目標血管範圍的細胞。可同時或依序使用超過一種載體(病毒或非病毒的、或其組合)。此可用於轉移超過一種多核苷酸，及/或靶向超過一種類型之細胞。當使用多種載體或多種藥劑之情況下，可產生超過一種轉導/轉染效率。
含有基因療法載體之醫藥組合物可製備成液體溶液或懸浮液。本發明之醫藥組合物可包括常用的醫藥上可接受之賦形劑，諸如稀釋劑及載劑。特定言之，組合物包含醫藥上可接受之載劑，例如水、鹽水、林格氏溶液(Ringer’s solution)或右旋糖溶液。除了載劑外，醫藥組合物亦可含有乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、著色劑及類似者。
在某些實施例中，醫藥組合物包含治療有效基因劑量，該劑量係能夠預防或治療個體之心肌病而對該個體不具有毒性之劑量。心肌病之預防或治療可評估為與心肌病相關的表現型特徵的改變，且此種改變對於預防或治療心肌病係有效的。因此，治療有效基因劑量通常係當以生理上可耐受之組合物投與時足以改善或預防所治療個體之病原性心臟表現型之劑量。
在某些實施例中，可透過幾種不同方法(包括靜脈內遞送、動脈內遞送或腹膜內遞送)將基因療法載體轉導至個體中。在一些實施例中，基因療法載體可例如藉由冠狀動脈內投與直接投與給心臟組織。在一些實施例中，可藉由導管介導之心肌內遞送來達成心肌層之組織轉導，其可用於將與增強轉導之載劑偶聯或未偶聯之無載體cDNA轉移至心肌層中。
在某些實施例中，藥物包含治療有效基因劑量。治療有效基因劑量係能夠預防或治療患者之特定心臟病狀而對該患者不具有毒性之劑量。
可藉由本文所揭示之方法治療的心臟病狀包括(但不限於)基因決定之心臟病(例如基因決定之心肌病)、心律不整性心臟病、心臟衰竭、局部缺血、心律不整、心肌梗塞、充血性心臟衰竭、移植排斥、心臟收縮異常、非缺血性心肌病、二尖瓣閉鎖不全(mitral valve regurgitation)、主動脈瓣狹窄或閉鎖不全、Ca 2+代謝異常、先天性心臟病、原發性或繼發性心臟腫瘤及其組合中之一者或多者。 例示性實例
闡明以下實例以幫助理解本發明且當然不應被解釋為具體地限制本文描述且主張之實施例。實施例之此種變型(包括現在已知或以後開發的所有等效物之取代，此將在熟習此項技術者的能力範圍內)及調配物之改變或實驗設計之微小改變均應被認為係落在併入本文中之實施例之範疇內。 實例1 (預見性)
在活體外系統之例示性實例中，PKP2同功型2a cDNA序列(2764bp cDNA，GenBank：BC126199.1；SEQ ID NO:1)在心臟特異性TNNT2啟動子(SEQ ID NO: 6)下且使用AAV2內部末端重複序列(ITR)：ITR-TNNT2-PKP2cDNA-ITR進行選殖。編碼PKP2之核酸序列可為編碼PKP2同功型2b蛋白之 PKP2基因(SEQ ID NO: 2)之經密碼子最佳化形式。作為另一個例示性實例，編碼PKP2之核酸序列可係編碼PKP2同功型2b蛋白之 PKP2基因(SEQ ID NO: 4)之密碼子最佳化形式。
將構築體載體化至AAV (諸如AAV6及AAV9)中。製備在(標誌-PKP2)上添加標誌之構築體以便能夠在藉由抗標誌轉染後識別蛋白質且將其與內源性蛋白質區分開。SEQ ID NO: 7係用於表現例如PKP2同功型2b之例示性構築體序列。使用PKP2一級抗體利用免疫螢光顯微鏡觀測活體外PKP2之表現，此顯示PKP2在細胞膜及以緻密斑塊之定位。
為了進一步增加基因表現程度，經設想可將一或多個新內含子(neo-introns)併入至本文所述的基因療法載體中。例如，可利用「嵌合內含子」，其係指包含已衍生自兩種不同基因之至少兩種不同內含子之部分之內含子，諸如衍生自人類β球蛋白基因及人類免疫球蛋白G之內含子序列。在一些實施例中，可將新內含子緊接插入啟動子下游。在一些實施例中，可將新內含子置於 PKP2cDNA序列之不同位置，諸如在外顯子1之後且在外顯子2之前。
AAV6-TNNT2-PKP2用於轉染2D細胞培養物(包括：正常心肌細胞；攜帶1個雜合性PKP2突變之心肌細胞(來自ARVC患者)；及攜帶呈反式之兩個PKP2突變之心肌細胞)中之iPSC-CM。
成功轉染且表徵PKP2 RNA及蛋白質濃度後，針對大量讀數(包括：細胞大小及PKP2缺乏中具有已知改變表現之基因(MYL2、SCN5A (其蛋白質產物為NaV1.5)、GJA1及TTN)之矯正)進行正常與PKP2缺乏型及PKP2矯正型CM之比較。
考慮相似方法可經調整適用於人類3D培養模型之離體治療以及PKP2突變之小鼠模型中之活體內治療。
咸信，當(標誌-)PKP2蛋白質得以表現時，其會到達其正確亞細胞定位(胞橋小體)，及轉染作用會在RNA層級及蛋白質層級上矯正PKP2單倍蛋白含量不足或完全缺乏細胞。在完全PKP2缺乏細胞中，咸信PKP2轉染亦能夠恢復胞橋小體中之胞橋小體蛋白質複合體，特定言之恢復斑珠蛋白，該蛋白在PKP2減少時會降低。
進一步考慮將用於表現PKP2同功型2a、PKP2同功型2b或二者之基因療法載體遞送至人類個體之心臟組織。例如，基因療法載體可經調配成包括一或多種基因療法載體及醫藥上可接受之賦形劑或載劑之治療性調配物。可透過幾種不同方法(包括靜脈內遞送、動脈內遞送或腹膜內遞送)將調配物轉導至人類個體中。基因療法載體可例如藉由冠狀動脈內投與直接投與給心臟組織。基因療法載體亦可經由導管介導之心肌內遞送來遞送。
進一步考慮基因療法載體可局部投與至個體的心臟組織，例如藉由將個體之冠狀動脈循環與個體之體循環分離由此形成閉合迴路，且灌注流體(例如包含基因療法載體之調配物)至個體之分離的冠狀動脈循環中。可在個體之未停跳心臟中進行灌注。閉合迴路可例如由定位於患者之右冠狀動脈中之第一藥物遞送導管、定位於患者之左主冠狀動脈中之第二藥物遞送導管、定位於冠狀竇中之藥物收集導管、該冠狀動脈、該冠狀靜脈系統及散佈在靜脈分支與動脈分支之間的外部膜充氧器形成。可如相關於2020年8月26日申請之國際申請案第PCT/IB2020/000692號所描述進行此種局部遞送，該案之全部揭示內容係以引用之方式併入本文中。 實例 2 ： hiPSC 衍生之心肌細胞中之胞橋小體 PKP2 表現
胞橋小體複合體之蛋白質表現於二維(2D)細胞培養物中之人類誘導之富潛能幹細胞衍生之(hiPSC衍生之)正常心肌細胞中且位於形成胞橋小體之亞細胞結構處。圖1顯示野生型2D hiPSC衍生之心肌細胞中之位於胞橋小體細胞-細胞接合處之PKP2之螢光顯微鏡影像。
用類似於描述於實例1中之進一步包含FLAG-標籤的載體之AAV9-TNNT2-PKP2b進行對照hiPSC-心肌細胞之轉導。圖2顯示野生型心肌細胞中確認FLAG-標籤信號經表現且正確定位至胞橋小體細胞-細胞接合之螢光顯微鏡影像。
然後表徵PKP2突變之hiPSC衍生之心肌細胞且與作為對照的亞洲(Asi)及高加索(Cau)起源之多種野生型細胞系比較以顯示在細胞層級上之單倍蛋白含量不足。圖3顯示PKP2蛋白表現之西方墨點法，其中該PKP2突變之細胞系之單倍蛋白含量不足藉由與對照細胞系相比PKP2之表現降低來證明(定量是就心臟肌鈣蛋白T而言)。
證實由AAV9介導之利用具有TNNT2啟動子之PKP2同功型2b FLAG標記之轉殖基因轉導PKP2突變之hiPSC衍生之心肌細胞會導致PKP2同功型2b之表現及正確定位，如圖4之螢光顯微鏡影像中所顯示。
在本文所述的實驗中，發現所使用之hiPSC衍生之心肌細胞僅表現PKP2同功型2a，這指示此為較不成熟之發育上調節之同功型。相反地，在成熟人類心臟組織中，全長PKP2b同功型2b佔優勢。在總蛋白質含量下，西方墨點法用於確認用AAV9-TNNT2-PKP2b-FLAG轉導將單倍蛋白含量不足狀態校正為PKP2突變之hiPSC心肌細胞中之完全PKP2蛋白質表現。圖5顯示PKP2突變之hiPSC-CM (「PKP2」)與兩種野生型hiPSC-CM對照(Asi及Cau)的比較。MYBPC3及cTnT用作參考蛋白質以用於計算經表現之PKP2之相對量。PKP2突變之hi-IPSC-CM顯示，與兩種對照細胞系相比，PKP2蛋白表現量大大減少。在用AAV9-PKP2轉導後，定量校正PKP2表現。應注意，經轉導之細胞展現代表從由AAV介導之轉殖基因產生的PKP2同功型2b及天然表現於hiPSC-CM中之PKP2同功型2a之PKP2雙重。PKP2同功型2b之重新表現耐受良好且並未導致PKP2突變之或野生型對照心肌細胞中之明顯功能改變。 實例 3 ：降低之內源性 PKP2 表現
圖6顯示與無關對照心肌細胞、非衰竭人類心臟(NFH)組織及PKP2患者心肌細胞(其就PKP2而言是單倍蛋白含量不足的)相比，內源性PKP2表現降低。如所示，與正常對照細胞相比及與非衰竭人類心臟(NFH)細胞相比，PKP2患者心肌細胞表現更少的PKP2。當用神經胺酸酶(其係在細胞培養物中用AAV9轉導期間使用)處理時在沒有轉導下內源性PKP2之含量沒有變化(「PKP2患者NT NA」)。用經密碼子最佳化之PKP2同功型2b載體(「PKP2患者TD 2b opt」)進行轉導，其中該等引子經選擇成不結合至野生型PKP2序列，因此導致在轉導後無變化。
圖7顯示PKP2同功型2a為人類組織(無關對照、非衰竭人類心臟)中之主要PKP2同功型。此在神經胺酸酶下且在用經密碼子最佳化之PKP2b (具有以上所討論的非結合引子)轉導後保持不變。在NFH細胞、對照細胞或PKP2患者心肌細胞中未偵測到PKP2同功型2b全長同功型。PKP2同功型2a呈現為總PKP2的約一半。 實例 4 ：總 PKP2 含量 之恢復
圖8A及圖8B顯示與NFH細胞及兩種無關對照(「野生型」)之細胞、患者細胞及(「NT NA」)處理之平均值相比，在由AAV9介導之用經密碼子最佳化之PKP2同功型2b (「TD」)轉導後之RNA含量。圖9A及圖9B顯示轉導後之總蛋白質含量，將健康對照CM含量及PKP2患者CM含量(無轉導)與轉導後之患者細胞中之PKP2含量進行比較。在圖9A中，相對於內源性肌球蛋白結合蛋白C (MYBPC3)含量來測定總PKP2蛋白含量，且在圖9B中，相對於內源性心臟肌鈣蛋白T (cTnT)含量來測定PKP2蛋白含量。如圖8至圖9中所顯示，該轉導恢復PKP2患者CM中之總PKP2含量。即使PKP2同功型2a為顯性同功型，使用PKP2同功型2b之外源性表現來達成此，如圖7中所示。 實例 5 ：胞橋小體蛋白質複合體中其他蛋白質之恢復
圖10A及圖10B顯示轉導後與由AAV9介導之用經密碼子最佳化之PKP2同功型2b轉導之患者CM相比，未治療的患者CM中之胞橋小體蛋白質複合體之各種蛋白質(包括橋粒斑蛋白1、橋粒斑蛋白2、橋粒膠蛋白2、斑珠蛋白、橋粒芯醣蛋白2、連結蛋白43)之表現。在不希望受理論約束下，咸信，外源性PKP2之表現導致與就PKP2而言是單倍蛋白含量不足的細胞相比各種胞橋小體蛋白上調。
在前述描述中，闡明許多具體細節，諸如特定材料、尺寸、製程參數等以徹底理解本發明。在一或多個實施例中，特定特徵、結構、材料或特性可以任何適宜方式組合。字詞「實例」或「例示性」在本文中用來意指用作實例(example)、情況(instance)或示例。本文中描述作「實例」或「例示性」之任何態樣或設計均不必被解釋為比其他態樣或設計更佳或更優。而是，使用字詞「實例」或「例示性」僅意欲以具體方式呈現概念。如本申請案中所使用，術語「或」欲意指包含性「或」而非排他性「或」。亦即，除非另作指明或從上下文清楚可見，否則「X包括A或B」欲意指自然包含性排列中之任一者。亦即，若X包括A；X包括B；或X包括A及B二者，則在任何前述情況下均滿足「X包括A或B」。在整篇該說明書中對「一實施例(an embodiment)」、「某些實施例」或「一個實施例(one embodiment)」之提及意指結合該實施例描述的特定特徵、結構或特性包括在至少一個實施例中。因此，在整篇該說明書中各處出現片語「一實施例」、「某些實施例」或「一個實施例」不一定均指相同實施例。
已參考本發明之特定例示性實施例描述本發明。因此，本說明書及附圖應被認為係例示性的而非限制性意義。除了本文顯示及描述之彼等外，本發明之各種修改將為熟習此項技術者所明瞭且意欲落在隨附申請專利範圍之範疇內。
以下SEQ ID NO: 1係mRNA序列之cDNA複本，其包括PKP2同功型2a之蛋白質編碼序列(GenBank：BC126199.1)：
Figure 02_image001
Figure 02_image003
以下SEQ ID NO: 2係編碼PKP2同功型2a之經密碼子最佳化之cDNA序列(5'至3'):
Figure 02_image005
Figure 02_image007
Figure 02_image009
以下SEQ ID NO: 3係PKP2同功型2a之胺基酸序列：
Figure 02_image011
Figure 02_image013
以下SEQ ID NO: 4係編碼PKP2同功型2b之經密碼子最佳化之cDNA序列(5'至3')：
Figure 02_image015
Figure 02_image017
以下SEQ ID NO: 5係PKP2同功型2b之胺基酸序列：
Figure 02_image019
Figure 02_image021
以下SEQ ID NO: 6係編碼TNNT2啟動子之核酸序列(5'至3')：
Figure 02_image023
以下SEQ ID NO: 7係用於在心肌細胞中表現PKP2同功型2b之例示性載體構築體：
Figure 02_image025
Figure 02_image027
Figure 02_image029
Figure 02_image031
Figure 02_image033
Figure 02_image035
在結合附圖考慮以下詳細描述後將更明瞭本發明之以上及其他特徵、其性質及各種優點，其中：
圖1顯示定位在野生型2D人類誘導之富潛能幹細胞衍生之心肌細胞(「hiPSC-CM」)中胞橋小體細胞-細胞接合處的PKP2之螢光顯微鏡影像；
圖2顯示確認在用AAV9轉導對照心肌細胞且定位在胞橋小體細胞-細胞接合處後PKP2之表現之螢光顯微鏡影像；
圖3顯示PKP2蛋白表現之西方墨點法，其中該PKP2突變之細胞系之單倍蛋白含量不足藉由與對照細胞系相比PKP2之表現降低來證明；
圖4顯示在PKP2突變之hiPSC-CM之由AAV9介導之轉導後PKP2同功型2b之表現及正確定位之螢光顯微鏡影像；
圖5顯示PKP2突變之hiPSC-CM與兩種野生型hiPSC-CM對照(Asi及Cau)的比較；
圖6顯示與無關對照心肌細胞、非衰竭人類心臟(NFH)組織及PKP2患者心肌細胞相比，內源性PKP2表現降低；
圖7顯示PKP2同功型2a為人類組織中之主要PKP2同功型；
圖8顯示與對照及患者細胞相比，在利用密碼子最佳化之PKP2同功型2b之由AAV9介導之轉導後之RNA含量；
圖9A顯示基於內源性肌球蛋白結合蛋白C含量，與對照細胞相比，在轉導後之PKP2蛋白質含量；
圖9B顯示基於內源性心臟肌鈣蛋白T含量，與對照細胞相比，在轉導後之PKP2蛋白質含量；
圖10A顯示由於外源性PKP2蛋白之表現所致之，橋粒斑蛋白1、橋粒斑蛋白2、橋粒膠蛋白2及斑珠蛋白之表現上調；及
圖10B顯示由於外源性PKP2蛋白之表現所致之，橋粒芯醣蛋白2及連結蛋白43之表現上調。

Claims (40)

  1. 一種治療或預防個體之心肌病之方法，該方法包括將治療劑量之基因療法載體遞送至該個體之心肌細胞，其中該等心肌細胞就斑菲素蛋白-2 (plakophilin-2；PKP2)而言是單倍蛋白含量不足的，其中該基因療法載體包含編碼PKP2或其功能變異體之核酸序列，且其中將該基因療法載體遞送至心肌細胞導致心肌細胞增加PKP2之總胞橋小體表現至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍。
  2. 一種治療或預防個體之心肌病之方法，該方法包括將治療劑量之基因療法載體遞送至該個體之心肌細胞，其中該等心肌細胞就斑菲素蛋白-2 (PKP2)而言是單倍蛋白含量不足的，其中該基因療法載體包含編碼PKP2或其功能變異體之核酸序列，且其中將該基因療法載體遞送至心肌細胞導致PKP2之總胞橋小體表現為非單倍蛋白含量不足心肌細胞之總胞橋小體表現的至少50%。
  3. 如請求項1或2之方法，其中該基因療法載體包含病毒載體。
  4. 如請求項3之方法，其中該病毒載體包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、其變型及其組合中之一者或多者。
  5. 如請求項3之方法，其中該病毒載體包含AAV6或AAV9。
  6. 如請求項3之方法，其中該病毒載體包含AAV6。
  7. 如請求項1至6中任一項之方法，其中該核酸序列進一步編碼心臟特異性啟動子。
  8. 如請求項1至7中任一項之方法，其中該治療劑量為有效藉由實現由該個體之心肌細胞產生PKP2或其功能變異體而治療或預防心律失常性右心室心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy；ARVC)。
  9. 如請求項1至8中任一項之方法，其中該治療劑量之遞送係經靜脈內進行。
  10. 如請求項1至9中任一項之方法，其中該個體為人類個體。
  11. 一種基因療法載體，其經調適用於在個體之心肌細胞內表現核酸序列，該核酸序列包含： 編碼PKP2或其功能變異體之第一序列；及 包含心臟特異性啟動子之第二序列， 其中將基因療法載體遞送至就PKP2而言是單倍蛋白含量不足的心肌細胞導致心肌細胞增加PKP2之總胞橋小體表現至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍。
  12. 一種基因療法載體，其經調適用於在個體之心肌細胞內表現核酸序列，該核酸序列包含： 編碼PKP2或其功能變異體之第一序列；及 包含心臟特異性啟動子之第二序列， 其中將基因療法載體遞送至單倍蛋白含量不足的心肌細胞導致PKP2之總胞橋小體表現，該表現為非單倍蛋白含量不足的心肌細胞之總胞橋小體表現的至少50%。
  13. 如請求項11或12中任一項之基因療法載體，其中該基因療法載體包含病毒載體。
  14. 如請求項13之基因療法載體，其中該病毒載體包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、其變型及其組合中之一者或多者。
  15. 如請求項13之基因療法載體，其中該病毒載體包含AAV6或AAV9。
  16. 如請求項11至15中任一項之基因療法載體，其中該心臟特異性啟動子包含TNNT2或具有至少99%、95%、90%、85%、80%、75%或70%相似性之功能性序列。
  17. 如請求項11至15中任一項之基因療法載體，其中該個體為人類個體。
  18. 一種用於治療或預防個體之心肌病之治療性調配物，該治療性調配物包含： 醫藥上可接受之賦形劑或載劑；及 包含編碼PKP2或其功能變異體之核酸序列之病毒載體， 其中將治療性調配物遞送至就PKP2而言是單倍蛋白含量不足的心肌細胞導致心肌細胞增加PKP2之總胞橋小體表現至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍。
  19. 一種用於治療或預防個體之心肌病之治療性調配物，該治療性調配物包含： 醫藥上可接受之賦形劑或載劑；及 包含編碼PKP2或其功能變異體之核酸序列之病毒載體， 其中將治療性調配物載體遞送至單倍蛋白含量不足的心肌細胞導致PKP2之總胞橋小體表現，該表現為非單倍蛋白含量不足的心肌細胞之總胞橋小體表現的至少50%。
  20. 如請求項18或請求項19中任一項之治療性調配物，其進一步包含： 一或多種另外病毒載體，其各包含編碼一或多種非PKP2肌原纖維節蛋白或其功能變異體之核酸序列。
  21. 如請求項18至20中任一項之治療性調配物，其中該個體為人類個體。
  22. 一種將具有經突變之 PKP2基因之心肌細胞基因改造成表現功能性PKP2或其功能變異體之方法，該方法包括： 用編碼功能性PKP2之核酸序列轉染或轉導心肌細胞，其中該轉染或轉導導致心肌細胞增加功能性PKP2之總胞橋小體表現至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍。
  23. 一種將具有經突變之 PKP2基因之心肌細胞基因改造成表現功能性PKP2或其功能變異體之方法，該方法包括： 用編碼功能性PKP2之核酸序列轉染或轉導心肌細胞，其中該轉染或轉導導致功能性PKP2之總胞橋小體表現為具有非突變 PKP2基因之心肌細胞之總胞橋小體表現的至少50%。
  24. 如請求項22或23中任一項之方法，其中該核酸序列經由包含AAV6或AAV9之病毒載體遞送。
  25. 如請求項24之方法，其中該病毒載體包含AAV6。
  26. 如請求項22至25中任一項之方法，其中該核酸序列進一步編碼心臟特異性啟動子。
  27. 如請求項26之方法，其中該心臟特異性啟動子包含TNNT2或具有至少99%、95%、90%、85%、80%、75%或70%相似性之功能性序列。
  28. 如請求項1至10或22至27中任一項之方法，其中該PKP2為PKP2同功型2a。
  29. 如請求項1至10或22至27中任一項之方法，其中該PKP2為PKP2同功型2b。
  30. 如請求項11至21中任一項之基因療法載體或治療性調配物，其中該PKP2為PKP2同功型2a。
  31. 如請求項11至21中任一項之基因療法載體或治療性調配物，其中該PKP2為PKP2同功型2b。
  32. 一種用於治療或預防個體之心肌病之治療性調配物，該治療性調配物包含： 醫藥上可接受之賦形劑或載劑； 包含編碼PKP2同功型2a或其功能變異體之核酸序列之第一病毒載體；及 包含編碼PKP2同功型2b或其功能變異體之核酸序列之第二病毒載體， 其中將該治療性調配物遞送至就PKP2同功型2a或同功型2b而言是單倍蛋白含量不足的心肌細胞導致心肌細胞增加PKP2同功型2a或同功型2b之總胞橋小體表現至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍。
  33. 一種用於治療或預防個體之心肌病之治療性調配物，該治療性調配物包含： 醫藥上可接受之賦形劑或載劑； 包含編碼PKP2同功型2a或其功能變異體之核酸序列之第一病毒載體； 包含編碼PKP2同功型2b或其功能變異體之核酸序列之第二病毒載體， 其中將該治療性調配物載體遞送至單倍蛋白含量不足的心肌細胞導致PKP2同功型2a或同功型2b之總胞橋小體表現，該表現為非單倍蛋白含量不足的心肌細胞之總胞橋小體表現的至少50%。
  34. 一種經分離細胞，其用如請求項11至17中任一項之基因療法載體轉導。
  35. 如請求項34之經分離細胞，其中該細胞為人類細胞。
  36. 如請求項34之經分離細胞，其中該細胞為心臟細胞。
  37. 如請求項34之經分離細胞，其中該細胞為人類誘導之富潛能幹細胞衍生之心肌細胞。
  38. 一種上調具有經突變之 PKP2基因之心肌細胞中一或多種胞橋小體蛋白質之方法，該方法包括： 用編碼功能性PKP2之核酸序列轉染或轉導心肌細胞，該功能性PKP2選自PKP2同功型2a及PKP2同功型2b，其中該轉染或轉導導致該一或多種胞橋小體蛋白質中各者之總胞橋小體表現增加至少1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍，其中該一或多種胞橋小體蛋白質選自橋粒斑蛋白(desmoplakin) 1、橋粒斑蛋白2、橋粒膠蛋白(desmocollin) 2、斑珠蛋白、橋粒芯醣蛋白(desmoglein) 2及連結蛋白(connexin) 43。
  39. 一種治療或預防個體之心肌病之方法，該方法包括將治療劑量之基因療法載體遞送至該個體之心肌細胞，其中該等心肌細胞就斑菲素蛋白-2 (PKP2)而言是單倍蛋白含量不足的，其中該基因療法載體包含編碼非顯性PKP2同功型或其功能變異體之核酸序列，其中將該基因療法載體遞送至心肌細胞導致心肌細胞增加PKP2之總胞橋小體表現至少1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍或5倍，且其中該PKP2之總胞橋小體表現包括顯性PKP2同功型及非顯性PKP2同功型之表現。
  40. 如請求項39之方法，其中該顯性PKP2同功型為PKP2同功型2a，且其中該非顯性PKP2同功型為PKP2同功型2b。
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