KR20230159471A

KR20230159471A - 우심실 부정맥성 심근병증의 유전자 치료 조성물 및 치료

Info

Publication number: KR20230159471A
Application number: KR1020237034942A
Authority: KR
Inventors: 토마스 보이트; 줄리 듀몽소; 페리 엘리엇; 버지니 마리오트
Original assignee: 유씨엘 비즈니스 리미티드
Priority date: 2021-03-19
Filing date: 2022-03-18
Publication date: 2023-11-21
Also published as: WO2022195074A2; CA3212043A1; TW202300180A; AU2022239846A1; BR112023018944A2; JP2024512483A; AU2022239846A9; CN117715660A; US20240042059A1; WO2022195074A3; IL305959A; MX2023011035A; EP4308172A2

Abstract

인간 피험자에서 심근병증을 치료 또는 예방하는 조성물 및 방법이 개시된다. 일부 실시예들에서, 방법은 인간 피험자의 심근세포에 유전자 치료 벡터의 치료 용량을 전달하는 단계를 포함하며, 유전자 치료 벡터는 PKP2를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

Description

우심실 부정맥성 심근병증의 유전자 치료 조성물 및 치료

관련 출원(들)에 대한 상호 참조

본 출원은 2021년 3월 19일자로 출원된 미국 임시 특허 출원 번호 제63/163,393호의 우선권 혜택을 주장하며, 그 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로서 통합된다.

기술분야

본 발명은 심장 질환(예를 들어, 심장 근육병증)의 치료에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 심근병증 치료를 위한 유전자 치료 방법 및 약제학적 조성물에 관한 것이다.

심부전과 같은 다양한 심장 질환 치료의 약리학적 발전에도 불구하고, 사망률 및 이환율은 여전히 받아들일 수 없을 정도로 높다. 더욱이, 특정 치료 접근법은 많은 환자(예를 들어, 다른 동반질환과 관련된 진행성 심부전 상태를 앓고 있는 환자)에게 적합하지 않다. 유전자 치료 및 세포 치료와 같은 대체 접근법은 많은 심장 질환의 근본 원인 병인을 해결하는 데 고유하게 맞춤화되고 효과적일 수 있는 잠재력으로 인해 관심이 높아졌다.

본 발명의 목적은 인간 피험자와 같은 피험자의 심근세포에 치료 폴리뉴클레오티드 서열을 전달하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 특정 실시예들의 추가 목적은 아데노 관련 바이러스와 같은 바이러스 벡터에서 플라코필린-2(plakophilin-2; PKP2) 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 벡터화하는 것이다.

본 발명의 특정 실시예들의 추가 목적은 PKP2-돌연변이 심근세포의 반수체 기능 부전을 교정하기 위한 유전자 치료 방법을 활용하는 것이다.

본 발명의 특정 실시예들의 추가 목적은 PKP2에 대해 반수체 기능 부전인 세포에서 기능적 PKP2 단백질의 발현을 증가시키는 것이다.

상기 목적 및 기타 목적은 적어도 일 양태가 피험자(예를 들어, 인간 피험자)에서 심근병증을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 본 발명에 의해 충족된다. 방법은 예를 들어 피험자의 심근세포에 유전자 치료 벡터의 치료 용량을 전달하는 것을 포함하며, 유전자 치료 벡터는 PKP2를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시예들에서, 플라코필린-2(PKP2)와 관련하여 반수체 기능 부전인 심근세포에 유전자 치료 벡터를 전달하면 심근세포에 의한 PKP2의 데스모좀(desmosomal) 발현이 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배 또는 5배 증가한다. 일부 실시예들에서, 유전자 치료 벡터를 심근세포에 전달하면 비-반수체 기능 부전 심근세포에 의한 데스모좀 발현의 적어도 50%인 PKP2의 데스모좀 발현이 발생한다.

적어도 일 실시예에서, 유전자 치료 벡터는 바이러스 벡터이다. 적어도 일 실시예에서, 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 이들의 변이체, 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 적어도 일 실시예에서, 바이러스 벡터는 AAV6 또는 AAV9를 포함한다. 적어도 일 실시예에서, 바이러스 벡터는 AAV6를 포함한다.

적어도 일 실시예에서, 핵산 서열은 심장별 프로모터를 추가로 인코딩한다.

적어도 일 실시예에서, 치료 용량은 피험자의 심근세포에 의한 PKP2 또는 이의 기능적 변이체의 생성에 영향을 줌으로써 부정맥성 우심실 심근병증(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy; ARVC)을 치료하거나 예방하는 데 효과적이다.

적어도 일 실시예에서, 치료 용량의 전달은 정맥 내로 수행된다.

적어도 일 실시예에서, 피험자는 인간 피험자이다.

다른 양태에서, 유전자 치료 벡터는 피험자의 심근세포 내에서 핵산 서열을 발현하도록 적응된다. 적어도 일 실시예에서, 핵산 서열은 PKP2 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 제1 서열; 및 심장별 프로모터를 포함하는 제2 서열을 포함한다. 적어도 일 실시예에서, PKP2와 관련하여 반수체 기능 부전인 심근세포에 유전자 치료 벡터를 전달하면 심근세포에 의한 PKP2의 총 데스모좀 발현이 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배 또는 5배 증가한다. 적어도 일 실시예에서, 유전자 치료 벡터를 심근세포에 전달하면 비-반수체 기능 부전 심근세포에 의한 총 데스모좀 발현의 적어도 50%인 PKP2의 총 데스모좀 발현이 발생한다.

적어도 일 실시예에서, 유전자 치료 벡터는 바이러스 벡터이다. 적어도 일 실시예에서, 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 이들의 변이체, 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함한다. 적어도 일 실시예에서, 바이러스 벡터는 AAV6 또는 AAV9를 포함한다.

적어도 일 실시예에서, 심장별 프로모터는 TNNT2 또는 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 70% 유사성을 갖는 기능적 서열을 포함한다.

적어도 일 실시예에서, 피험자는 인간 피험자이다.

다른 양태에서, 피험자의 심근병증을 치료 또는 예방하기 위한 치료 제형이 제형화된다. 적어도 일 실시예에서, 치료 제형은 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체; 및 PKP2 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다. 적어도 일 실시예에서, PKP2와 관련하여 반수체 기능 부전인 심근세포에 치료 제형을 전달하면 심근세포에 의한 PKP2의 총 데스모좀 발현이 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배 또는 5배 증가한다. 적어도 일 실시예에서, 치료 제형 벡터를 심근세포에 전달하면 비-반수체 기능 부전 심근세포에 의한 총 데스모좀 발현의 적어도 50%인 PKP2의 총 데스모좀 발현이 발생한다.

적어도 일 실시예에서, 치료 제형은 하나 이상의 비-PKP2 육종 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 각각 포함하는 하나 이상의 추가 바이러스 벡터를 더 포함한다. 적어도 일 실시예에서, 피험자는 인간 피험자이다.

다른 양태에서, 기능적 PKP2 또는 이의 기능적 변이체를 발현하기 위해 돌연변이된 PKP2 유전자를 갖는 심근세포를 유전적으로 변형시키는 방법은 기능적 PKP2를 인코딩하는 핵산 서열로 심근세포를 형질감염 또는 형질도입하는 것을 포함하며, 형질감염 또는 형질도입은 심근세포에 의한 기능적 PKP2의 총 데스모좀 발현이 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배 또는 5배 증가한다. 적어도 일 실시예에서, 형질감염 또는 형질도입은 비-돌연변이된 PKP2 유전자를 갖는 심근세포에 의한 총 데스모좀 발현의 적어도 50%인 기능적 PKP2의 총 데스모좀 발현이 발생한다.

적어도 일 실시예에서, 핵산 서열은 AAV6 또는 AAV9를 포함하는 바이러스 벡터를 통해 전달된다. 적어도 일 실시예에서, 바이러스 벡터는 AAV6를 포함한다.

적어도 일 실시예에서, 핵산 서열은 심장별 프로모터를 추가로 인코딩한다. 적어도 일 실시예에서, 심장별 프로모터는 TNNT2 또는 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 70% 유사성을 갖는 기능적 서열을 포함한다.

적어도 일 실시예에서, 전술한 임의의 방법 또는 제형중 어느 하나의 PKP2는 PKP2 동형체 2a이다.

적어도 일 실시예에서, 전술한 임의의 방법 또는 제형 중 어느 하나의 PKP2는 PKP2 동형체 2b이다.

다른 양태에서, 피험자의 심근병증을 치료 또는 예방하기 위한 치료 제형은 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체; PKP2 동형체 2a 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 바이러스 벡터; 및 PKP2 동형체 2b 또는 그의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 바이러스 벡터를 포함한다. 적어도 일 실시예에서, PKP2 동형체 2a 또는 동형체 2b와 관련하여 반수체 기능 부전인 심근세포에 치료 제형을 전달하면 심근세포에 의한 PKP2 동형체 2a 또는 동형체 2b의 총 데스모좀 발현이 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배 또는 5배 증가한다. 적어도 일 실시예에서, 치료 제형 벡터를 반수체 기능 부전인 심근세포에 전달하면 비-반수체 기능 부전 심근세포에 의한 총 데스모좀 발현의 적어도 50%인 PKP2 동형체 2a 또는 동형체 2b의 총 데스모좀 발현이 발생한다.

다른 양태에서, 격리 세포는 전술한 실시예 중 어느 하나의 유전자 치료 벡터로 형질도입된다. 적어도 일 실시예에서, 세포는 인간 세포이다. 적어도 일 실시예에서, 세포는 심장 세포이다. 적어도 일 실시예에서, 세포는 인간 유도 다능성 줄기 세포 유래 심근세포이다.

또 다른 양태에서, 돌연변이된 PKP2 유전자를 갖는 심근세포에서 하나 이상의 데스모좀 단백질을 상향조절하는 방법은 PKP2 동형체 2a 및 PKP2 동형체 2b로부터 선택된 기능적 PKP2를 인코딩하는 핵산 서열로 심근세포를 형질감염 또는 형질도입하는 것을 포함하고, 형질감염 또는 형질도입은 하나 이상의 데스모좀 단백질 각각의 총 데스모좀 발현이 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배 또는 5배 증가하며, 하나 이상의 데스모좀 단백질은 데스모플라킨 1, 데스모플라킨 2, 데스모콜린 2, 플라코글로빈, 데스모글레인 2 및 코넥신 43으로부터 선택된다.

또 다른 양태에서, 피험자의 심근병증을 치료 또는 예방하는 방법은 피험자의 심근세포에 유전자 치료 벡터의 치료 용량을 전달하는 단계를 포함하며, 심근세포는 플라코필린-2(PKP2)에 대해 반수체 기능 부전이고, 유전자 치료 벡터는 비-우세 PKP2 동형체 또는 그의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 유전자 치료 벡터를 심근세포에 전달하면 심근세포에 의한 PKP2의 총 데스모좀 발현이 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배 또는 5배 증가되고, PKP2의 총 데스모좀 발현은 우세 PKP2 동형체 및 비-우세 PKP2 동형체의 발현을 포함한다. 적어도 일 실시예에서, 우세 PKP2 동형체는 PKP2 동형체 2a이고, 비-우세 PKP2 동형체는 PKP2 동형체 2b이다.

본 개시의의 상기 특징 및 다른 특징, 그 특징 및 다양한 이점은 첨부 도면과 함께 하기의 상세한 설명을 고려하면 더욱 명백해질 것이다:
도 1은 야생형 2D 인간 유도 다능성 줄기 세포 유래 심근세포("hiPSC-CM")의 데스모좀 세포-세포 접합에 국한된 PKP2의 형광 현미경 이미지를 도시한다;
도 2는 대조군 심근세포를 AAV9로 형질도입한 후 PKP2의 발현 및 데스모좀 세포-세포 접합에서의 국소화를 확인하는 형광 현미경 이미지를 도시한다;
도 3은 PKP2 돌연변이 세포주의 반수체 기능 부전이 대조군 세포주와 비교하여 감소된 PKP2 발현에 의해 명백한 PKP2 단백질 발현의 웨스턴 블롯(western blot)을 도시한다;
도 4는 PKP2 돌연변이 hiPSC-CM의 AAV9 매개 형질도입 후 PKP2 동형체 2b의 발현 및 정확한 국소화에 대한 형광 현미경 이미지를 도시한다;
도 5는 두 개의 야생형 hiPSC-CM 대조군(Asi 및 Cau)과 비교한 PKP2 돌연변이 hiPSC-CM을 도시한다;
도 6은 관련되지 않은 대조군 심근세포, 손상되지 않은 인간 심장(non-failing human hear; NFH) 조직 및 PKP2 환자 심근세포와 비교하여 감소된 내인성 PKP2 발현을 도시한다;
도 7은 PKP2 동형체 2a가 인간 조직에서 우세한 PKP2 동형체임을 도시한다;
도 8은 대조군 및 환자 세포와 비교하여 코돈 최적화된 PKP2 동형체 2b를 사용한 AAV9 매개 형질도입 후 RNA 레벨을 도시한다;
도 9a는 내인성 미오신 결합 단백질 C 레벨을 기준으로 대조군 세포와 비교한 형질도입 후 PKP2 단백질 레벨을 도시한다;
도 9b는 내인성 심장 트로포닌 T 레벨을 기준으로 대조군 세포와 비교한 형질도입 후 PKP2 단백질 레벨을 도시한다;
도 10a는 외인성 PKP2 단백질 발현의 결과로 데스모플라킨 1, 데스모플라킨 2, 데스모콜린 2 및 플라코글로빈의 상향조절된 발현을 도시한다; 그리고
도 10b는 외인성 PKP2 단백질 발현의 결과로서 데스모글레인 2 및 코넥신 43의 발현이 상향조절되었음을 도시한다.

정의

본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태인 "a", "an" 및 "the"는 문맥에서 달리 나타내지 않는 한 복수 지시어를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "약물"에 대한 언급에는 단일 약물뿐만 아니라 두 가지 이상의 서로 다른 약물의 혼합물이 포함되며, "바이러스 벡터"에 대한 언급은 단일 바이러스 벡터뿐만 아니라 두 가지 이상의 서로 다른 바이러스 벡터의 혼합물 등을 포함한다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, 측정된 양과 관련하여 사용될 때 "약"은 측정을 수행하고 측정 장비의 정확성과 목적에 상응하는 수준의 주의를 기울이는 데 있어 당업자가 예상하는 측정된 양의 정상적인 변화를 의미한다. 특정 실시예들에서, "약"이라는 용어는 인용된 숫자 ±10%를 포함하므로, "약 10"은 9 내지 11을 포함하게 된다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오타이드"는 당업계에서 일반적이고 관례적인 의미를 가지며, DNA 또는 RNA 분자와 같은 임의의 중합체성 핵산뿐만 아니라 당업자에게 공지된 화학적 유도체도 포함한다. 폴리뉴클레오티드에는 치료 단백질을 코딩하는 것들이 포함될 뿐만 아니라, 당업계에 공지된 기술(예를 들어, 안티센스, 간섭 또는 소형 간섭 핵산)을 사용하여 표적 핵산 서열의 발현을 감소시키는 데 사용될 수 있는 서열도 포함된다. 폴리뉴클레오티드는 또한 심혈관계 세포 내에서 표적화된 핵산 서열의 발현 또는 표적화된 단백질의 생산을 개시하거나 증가시키는 데 사용될 수 있다. 표적 핵산 및 단백질은, 이에 제한되는 것은 아니나, 표적 조직에서 통상적으로 발견되는 핵산 및 단백질, 이러한 자연적으로 발생하는 핵산 또는 단백질의 유도체, 표적 조직에서 통상적으로 발견되지 않는 자연적으로 발생하는 핵산 또는 단백질, 또는 합성 핵산 또는 단백질을 포함한다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드는 하나 이상의 표적화된 핵산 서열 또는 단백질을 증가 및/또는 감소시키기 위해 조합되어 사용될 수 있고, 동시에 및/또는 순차적으로 투여될 수 있다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "외인성" 핵산 또는 유전자는 핵산 전달에 사용되는 벡터에서 자연적으로 발생하지 않는 것이다; 예를 들어, 바이러스 벡터에서 자연적으로 발견되지는 않지만, 이 용어는 환자 또는 숙주에서 자연적으로 발생하는 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 배제하려는 의도는 아니다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "심장 세포"에는 심근 세포, 심장 혈관계 세포 또는 심장 판막에 존재하는 세포와 같이 심장의 구조를 유지하거나 기능을 제공하는 데 관여하는 심장의 모든 세포가 포함된다. 심장 세포에는 심장 근세포(정상 및 비정상 전기적 특성을 모두 가짐), 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 전도 조직 세포, 심장 박동 조절 세포 및 뉴런이 포함된다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "아데노 관련 바이러스" 또는 "AAV"는 모든 아형, 혈청형, 유사형은 물론 자연적으로 발생하는 형태와 재조합 형태를 포함한다. 다양한 AAV 혈청형 및 균주가 당업계에 공지되어 있으며 ATCC 및 학술적 또는 상업적 소스와 같은 소스로부터 공개적으로 이용 가능하다. 대안으로, 공개되고/되거나 다양한 데이터베이스로부터 이용 가능한 AAV 혈청형 및 균주로부터의 서열은 공지된 기술을 사용하여 합성될 수 있다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "혈청형"은 정의된 항혈청과의 캡시드 단백질 반응성을 기반으로 다른 AAV에 의해 식별되고 구별되는 AAV를 의미한다. AAV1부터 AAV12까지를 포함하여 적어도 12개의 인간 AAV 혈청형이 알려져 있지만, 추가 혈청형이 계속해서 발견되고 있으며 새로 발견된 혈청형의 사용이 고려된다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "의사형(pseudotyped)" AAV는 하나의 혈청형으로부터의 캡시드 단백질 및 상이한 또는 이종 혈청형의 5' 및 3' 역위 말단 반복부(ITR)를 포함하는 바이러스 게놈을 함유하는 AAV를 의미한다. 의사형 재조합 AAV(rAAV)는 캡시드 혈청형의 세포 표면 결합 특성과 ITR 혈청형과 일치하는 유전적 특성을 가질 것으로 예상된다. 의사형 rAAV는 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 캡시드 단백질과 AAV1부터 AAV12까지의 영장류 AAV 혈청형을 포함하는 임의의 혈청형 AAV로부터의 ITR을 포함할 수 있다. 단, 캡시드 단백질은 ITR의 혈청형(들)에 이종성인 혈청형이어야 한다. 의사형 rAAV에서, 5' 및 3' ITR은 동일하거나 이종일 수 있다. 의사형 rAAV는 해당 분야에 설명된 표준 기술을 사용하여 생성된다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "키메라" rAAV 벡터는 이종 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터를 포함한다; 즉, rAAV 벡터는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3과 관련하여 키메라일 수 있으므로 VP1, VP2 및 VP3은 모두 동일한 혈청형 AAV가 아니다. 본원에 사용된 키메라 AAV는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3가 AAV1 및 AAV2로부터의 캡시드 단백질을 포함하지만 이에 제한되지 않는 혈청형이 상이하도록 AAV를 포함하며; 다른 파보 바이러스 캡시드 단백질의 혼합물이거나 다른 바이러스 단백질 또는 다른 단백질, 예를 들어 AAV를 원하는 세포 또는 조직으로 전달하는 것을 목표로 하는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 키메라 rAAV는 또한 키메라 5' 및 3' ITR을 포함하는 rAAV를 포함한다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체"는 제형 내 활성제와 조합되는 조성물 내 임의의 불활성 성분을 의미한다. 약제학적으로 허용되는 부형제에는, 이에 제한되는 것은 아니나, 탄수화물(예를 들어, 포도당, 수크로스 또는 덱스트란), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산 또는 글루타티온), 킬레이트제, 저분자량 단백질, 고분자량 중합체, 겔 형성제 또는 기타 안정제 및 첨가제가 포함될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체의 다른 예에는 미생물의 성장 또는 작용을 방지하는 데 특히 유용한 습윤제, 유화제, 분산제 또는 방부제가 포함된다. 다양한 방부제가 잘 알려져 있으며, 예를 들어 페놀 및 아스코르브산이 포함된다. 담체, 안정제 또는 아주반트의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17번째 개정판에서 확인할 수 있다. (1985).

또한 본원에 사용된 바와 같이, "환자"는 특히 이간(그러나 비인간도 포괄할 수 있음), 특정 증상 또는 치료의 필요성을 암시하는 증상의 임상적 징후를 나타내는 자, 상태에 대해 예방적으로 치료되는 자, 또는 치료가 필요한 질환으로 진단받은 자를 말한다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "피험자"는 "환자"라는 용어의 정의를 포함하며 달리 건강한 개인을 제외하지 않는다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "의 치료" 및 "치료하는"에는 질환(예를 들어, 심장병)의 중증도를 완화하거나 예방하려는 의도로 약물을 투여하는 것이 포함된다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "의 예방" 및 "예방하는"에는 질환(예를 들어, 심장병)의 발병을 피하는 것이 포함된다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "상태" 또는 "상태들"에는 대상에게 유효량의 약물을 투여함으로써 치료, 완화 또는 예방될 수 있는 심장병과 같은 의학적 상태를 의미한다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "유효량"은 이러한 효과를 검출하기 위해 일반적으로 사용되는 방법에 의해 쉽게 검출될 수 있는 수준에서 유익하거나 원하는 효과를 생성하기에 충분한 약물의 양을 의미한다. 일부 실시예들에서, 이러한 효과는 약물을 투여하지 않은 기초 수준의 값으로부터 적어도 10%의 변화를 가져온다. 다른 실시예들에서, 변화는 기본 수준에서 최소 20%, 50%, 80% 또는 그보다 더 높은 비율이다. 아래에 설명되는 바와 같이, 약물의 유효량은 피험자마다, 연령, 피험자의 일반적인 상태, 치료되는 상태의 중증도, 투여되는 특정 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 임의의 개별적인 경우에 적절한 "유효량"은 관련 문헌 및 문헌을 참조하고/하거나 일상적인 실험을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "활성제"는 정부 기관의 승인 여부에 관계없이 치료, 예방 또는 기타 의도된 효과를 생성하도록 의도된 모든 물질을 의미한다.

본원에서 값의 범위를 언급하는 것은 본원에서 다르게 표시되지 않는 한 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 언급하는 약식 방법의 역할을 하도록 의도되었으며, 각각의 개별 값은 본원에서 개별적으로 언급된 것처럼 명세서에 포함된다. 본원에 설명된 모든 방법은 본원에서 달리 명시되지 않거나 문맥상 명확하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 모든 예 또는 예시적인 언어(예를 들어, "와 같은")의 사용은 단지 특정 자료 및 방법을 설명하기 위한 것이며 범위를 제한하지 않는다. 명세서의 어떤 언어도 청구되지 않은 요소가 개시된 재료 및 방법의 실시에 필수적인 것으로 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.

상세한 설명

부정맥성 우심실 심근병증(ARVC)은 일차 심장 근육 장애이며 젊은 개인의 심장 돌연사(sudden cardiac death; SCD)의 주요 원인이다. 이는 심근 변성과 심근의 섬유지방 대체를 특징으로 하며, 이는 우심실 및/또는 좌심실에 존재할 수 있고 궁극적으로 진행성 심부전으로 이어질 수 있다. 임상적인 심장 표현형은 전형적인 심전도 이상, 심실 부정맥 부담 증가, 및 심장 자기 공명 영상에서 광범위한 심근 흉터의 존재를 특징으로 한다.

ARVC는 사례의 약 50%가 가족력이 있으며 일반적으로 상염색체 우성 형질로 유전된다. 백인계 환자의 약 30%는 PKP2 유전자에 우성 돌연변이를 가지고 있다. 대부분의 돌연변이는 삽입-결실, 넌센스 또는 스플라이스 부위 돌연변이로 인해 비정상적이거나 잘린 단백질을 생성하여 반수체 기능 부전을 초래한다.

ARVC는 심근세포 사이에 기계적 부착을 제공하는 전자 밀도 구조인 데스모좀의 질병으로 간주된다. PKP2는 데스모좀 단백질 복합체의 일부를 형성하고 ARVC로 이어지는 돌연변이가 식별된 여러 유전자 중 하나이다. 반수체 기능 부전을 통한 PKP2 단백질의 부족은 기계적 및 신호 전달 결과로 데스모좀 단백질 복합체를 불안정하게 한다.

기계적 구성 요소는 다양한 콜라겐과 같은 여러 세포외 기질 유전자의 하향 조절과 원섬유 형성 콜라겐, 피브로넥틴 및 TIMP1과 같은 다른 전섬유화(pro-fibrotic) 마커의 강력한 상향 조절을 포함하는 기계적 스트레스 조건 하에서 PKP2 단백질의 부족으로 인한 비정상적인 유전자 발현 패턴에 의해 생체외에서 강조된다. 임상 전 및 임상적 맥락에서, 이는 PKP2-마우스 모델의 운동에 의한 ARVC의 악화와 운동선수와 같은 인간의 표현형에 대한 운동의 해로운 영향에 의해 반영된다. 신호 전달 레벨에서, 플라코필린이 부족하면 플라코글로빈이 핵으로 전위되어 표준 Wnt/b-카테닌 신호 전달이 감소하고 섬유화 및 지방 생성 유전자의 증가된 발현으로 이어진다.

PKP2의 두 가지 주요 형태에는 PKP2 동형체 2a(서열 ID 번호: 3)와 PKP2 동형체 2b(서열 ID 번호: 5)가 포함된다. PKP2 동형체 2a에 대한 PKP2 유전자의 단백질 코딩 부분은 2764bp cDNA 서열(GenBank: BC126199.1; 서열 ID 번호: 1)에 포함되어 있으며, 이는 본 발명에 의해 AAV에서 벡터화될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "PKP2" 또는 "PKP2 단백질"은, 문맥에서 달리 명시되거나 암시되지 않는 한, PKP2 동형체 2a 및 PKP2 동형체 2b를 포함하여 PKP2의 동형체를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

특정 구현예는 AAV9-TNNT2-PKP2 매개 유전자 전달을 통해 정상 대립 유전자를 대체함으로써 PKP2 단백질의 반수체 기능 부전을 교정할 수 있다. 특정 실시예들에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 예를 들어, (1) PKP2 단백질을 데스모좀에 정확하게 위치시키고; (2) PKP2 돌연변이된 인간 유도 다능성 줄기 세포 유래 심근세포(iPSC-CM)의 반수체 기능 부전을 교정하고 결과적으로 데스모좀 단백질 복합체를 교정할 수 있다. 특정 실시예는 또한 트랜스에서 두 개의 병원성 돌연변이를 운반하는 iPSC-CM에서 완전하거나 거의 완전한 PKP2 결핍을 초래하는 것으로 고려된다. 심근세포로의 PKP2 폴리뉴클레오티드 전달을 테스트하기 위한 비제한적 예시적인 실시예는, (1) TNNT2 프로모터를 사용하여 PKP2를 AAV9 및/또는 AAV6으로 벡터화하는 것; PKP2 돌연변이(1개의 돌연변이 또는 2개의 트랜스 돌연변이)를 운반하는 iPSC-CM을 생성하는 것; 생체외에서 AAV6-PKP2 또는 AAV9-PKP2를 사용하여 2D PKP2 돌연변이된 심근세포 배양물(1개 또는 2개의 돌연변이 보유)을 형질도입하고 데스모좀으로 세포내 국소화를 테스트하는 것; 세포 크기, 수축성 및 전사체 분석을 포함한 분자 및 생리학적 데이터를 테스트하는 것을 포함한다.

본원의 수많은 실시예들이 PKP2 단백질에 관해 기술되어 있지만, 추가적인 단백질(예를 들어, 육종 단백질)의 발현이 고려된다는 것이 이해되어야 한다. PKP2에 추가하여 예시적인 단백질은, 제한 없이, SERCA2, MYBPC3, MYH7, MYL3, MYL2, ACTC1, TPM1, TNNT2, TNNI3, TTN, FHL1, ALPK3, 디스트로핀, FKRP, 이들의 변이체 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 사용된 단백질 또는 단백질들은 또한 본원에 언급된 단백질의 기능적 변이체일 수 있으며, 원래의 단백질과 비교하여 상당한 아미노산 서열 일체성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 아미노산 일체성은 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99%에 달할 수 있다. 이러한 맥락에서, "기능적 변이체"라는 용어는 단백질의 변이체가 자연적으로 발생하는 상응하는 단백질의 기능을 부분적으로 또는 완전히 수행할 수 있음을 의미한다. 단백질의 기능적 변이체에는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 또는 첨가에 의해 자연적으로 발생하는 대응물과 다른 단백질이 포함될 수 있다.

아미노산 치환은 보존적이거나 비보존적일 수 있다. 치환은 보존적 치환, 즉 기능적 등가물로서 작용하는 유사한 극성의 아미노산에 의한 아미노산 잔기의 치환인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 치환체로서 사용되는 아미노산 잔기는 치환될 아미노산 잔기와 동일한 아미노산 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 소수성 잔기는 다른 소수성 잔기로 치환될 수 있거나, 극성 잔기는 동일한 전하를 갖는 다른 극성 잔기로 치환될 수 있다. 보존적 치환에 사용될 수 있는 기능적으로 상동성 아미노산은 예를 들어 글리신, 발린, 알라닌, 이소류신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌 및 트립토판과 같은 비극성 아미노산을 포함한다. 전하를 띠지 않은 극성 아미노산의 예에는 세린, 트레오닌, 글루타민, 아스파라긴, 티로신 및 시스테인이 포함된다. 하전된 극성(염기성) 아미노산의 예는 히스티딘, 아르기닌 및 리신을 포함한다. 하전된 극성(산성) 아미노산의 예는 아스파르트산 및 글루탐산을 포함한다.

자연적으로 발생하는 대응물과 하나 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 10개 또는 15개)의 추가 아미노산이 다른 단백질도 변이체로서 간주된다. 이러한 추가 아미노산은 원래 단백질의 아미노산 서열 내에 존재할 수 있거나(즉, 삽입물로서), 단백질의 한쪽 또는 양쪽 말단에 추가될 수 있다. 기본적으로, 아미노산 첨가가 치료 대상에서 자연적으로 발생하는 단백질의 기능을 수행하는 폴리펩티드의 능력을 손상시키지 않는다면 삽입은 어느 포지션에서든 일어날 수 있다. 더욱이, 단백질의 변이체는 또한 원래의 폴리펩티드와 비교하여 하나 이상의 아미노산이 부족한 단백질을 포함한다. 이러한 결실은 단백질의 정상적인 기능을 수행하는 능력을 손상시키지 않는 한 모든 아미노산 포지션에 영향을 미칠 수 있다.

마지막으로, 심장 육종 단백질(예를 들어, PKP2)의 변이체는 또한 변형된 아미노산과 같은 구조적 변형에 의해 자연적으로 발생하는 단백질과 다른 단백질을 말한다. 변형된 아미노산은 가공 또는 번역 후 변형(post-translational modification)과 같은 자연적 과정에 의해 또는 당업계에 공지된 화학적 변형 과정에 의해 변형된 아미노산이다. 전형적인 아미노산 변형은 인산화, 글리코실화, 아세틸화, O-연결된 N-아세틸글루코사미화, 글루타티오닐화, 아실화, 분지화, ADP 리보실화, 가교결합, 이황화물 가교 형성, 포르밀화, 수산화, 카르복실화, 메틸화, 탈메틸화, 아미드화, 고리화 및/또는 포스포티딜이노시톨, 플라빈 유도체, 리포테이콘산, 지방산 또는 지질에 대한 공유 또는 비공유 결합을 포함한다.

표적 단백질을 인코딩하는 치료 폴리뉴클레오티드 서열은 유전자 치료 벡터, 즉 프로모터, 코자크 서열, 폴리A 신호 등과 같은 외인성 핵산의 발현을 제공하는 데 필요한 다른 서열 옆에 번역 및 종결 코돈을 포함하는 코딩 서열을 포함하는 핵산 구성체의 형태로 치료할 대상에게 투여될 수 있다.

예를 들어, 유전자 치료 벡터는 포유류 발현 시스템의 일부일 수 있다. 유용한 포유류 발현 시스템 및 발현 구성체는 시판 중이다. 또한, 플라스미드- 또는 바이러스 벡터 기반 시스템, 예를 들어 LENTI-Smart^TM(InvivoGen), GenScript^TM 발현 벡터, pAdVAntage^TM(Promega), ViraPower^TM 렌티바이러스, 아데노바이러스 발현 시스템(Invitrogen) 및 아데노 관련 바이러스 발현 시스템(Cell Biolabs)와 같은, 몇몇 포유류 발현 시스템은 서로 다른 제조사에 의해 분포되고 본 발명에 사용될 수 있다.

본 발명의 외인성 치료 폴리뉴클레오티드 서열을 발현하기 위한 유전자 치료 벡터는 예를 들어, 바이러스 또는 비-바이러스 발현 벡터일 수 있으며, 이는 상기 핵산에 의해 인코딩된 단백질의 후속 발현을 위해 외인성 치료 폴리뉴클레오티드 서열을 세포 내로 도입하는데 적합하다. 발현 벡터는 에피솜 벡터, 즉 숙주 세포 내에서 자율적으로 자가 복제할 수 있는 벡터, 또는 통합 벡터, 즉 세포의 게놈에 안정적으로 통합되는 벡터일 수 있다. 숙주 세포에서의 발현은 구성적이거나 조절될 수 있다(예를 들어, 유도성).

특정 실시예에서, 유전자 치료 벡터는 바이러스 발현 벡터이다. 본 발명에 사용하기 위한 바이러스 벡터는 바이러스의 감염성을 파괴하지 않고 이종 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위해 천연 서열의 일부가 결실된 바이러스 게놈을 포함할 수 있다. 바이러스 구성요소와 숙주 세포 수용체 사이의 특정 상호 작용으로 인해, 바이러스 벡터는 유전자를 표적 세포로 효율적으로 전달하는 데 매우 적합하다. 포유류 세포로의 유전자 전달을 촉진하는데 적합한 바이러스 벡터는 다양한 유형의 바이러스로부터, 예를 들어 AAV, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 단순 헤르페스 바이러스, 소 유두종 바이러스, 렌티바이러스, 우두 바이러스, 폴리오마 바이러스, 센다이 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파라믹소바이러스, 파포바바이러스, 피코르나바이러스, 폭스 바이러스, 알파바이러스, 또는 유전자 치료에 적합한 임의의 기타 바이러스 셔틀, 이의 변이체, 및 이들의 조합으로부터 유래될 수 있다.

"아데노바이러스 발현 벡터" 또는 "아데노바이러스"는 (a) 치료 폴리뉴클레오티드 서열 구성체의 패키징을 지지하고, 및/또는 (b) 궁극적으로 그 내부에 복제된 조직 및/또는 세포별 구성체를 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 구성체를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에서, 발현 벡터는 유전적으로 조작된 형태의 아데노바이러스를 포함한다. 36킬로베이스(kb)의 선형 이중 가닥 DNA 바이러스인 아데노바이러스의 유전적 구성에 대한 지식을 통해 큰 조각의 아데노바이러스 DNA를 최대 7kb의 외부 서열로 대체할 수 있다.

아데노바이러스 성장 및 조작은 당업자에게 공지되어 있으며, 생체외 및 생체내에서 광범위한 숙주 범위를 나타낸다. 이 바이러스 그룹은 높은 역가(예를 들어, mL당 10⁹ 내지 10¹¹ 플라크 형성 단위)로 얻을 수 있으며, 감염성이 매우 높다. 아데노바이러스의 수명 주기는 숙주 세포 게놈으로의 통합이 필요하지 않다. 아데노바이러스 벡터에 의해 전달되는 외래 유전자는 에피솜이며, 따라서 숙주 세포에 대한 유전독성이 낮다. 야생형 아데노바이러스를 이용한 백신접종 연구에서는 부작용이 보고되지 않았으며, 이는 생체 내 유전자 전달 벡터로서의 안전성 및/또는 치료 가능성을 입증한다.

레트로바이러스("레트로바이러스 벡터"라고도 함)는 유전자를 숙주 게놈에 통합하여, 다량의 외부 유전 물질을 전달하고, 광범위한 종과 세포 유형을 감염시키는 능력으로 인해 그리고 특별한 세포주에 패키징되기 위해 유전자 전달 벡터로서 선택될 수 있다.

레트로바이러스 게놈에는 캡시드 단백질, 폴리메라아제 효소 및 외피(envelope) 구성요소를 각각 코딩하는 세 가지 유전자인, gag, pol 및 env가 포함되어 있다. gag 유전자의 상류에서 발견된 서열은 게놈을 비리온으로 패키징하기 위한 신호를 포함한다. 두 개의 긴 말단 반복(long terminal repeat; LTR) 서열이 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단에 존재한다. 이들은 강력한 프로모터 및 인핸서 서열을 포함하며, 숙주 세포 게놈에 통합하는데도 필요하다.

레트로바이러스 벡터를 구축하기 위해, 관심 유전자를 인코딩하는 핵산을 특정 바이러스 서열 대신 바이러스 게놈에 삽입하여 복제 결함이 있는 바이러스를 생성한다. 비리온을 생산하기 위해, gag, pol 및/또는 env 유전자를 포함하지만 LTR 및/또는 패키징 구성요소는 포함하지 않는 패키징 세포주를 구성한다. 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 cDNA를 함유한 재조합 플라스미드가 이 세포주에 도입되면(예를 들어 인산칼슘 침전에 의해), 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자로 패키징되도록 하며, 이는 그런 다음 배양 배지로 분비된다. 그런 다음 재조합 레트로바이러스가 포함된 배지가 수집되고, 선택적으로 농축되며, 유전자 전달에 사용된다. 레트로바이러스 벡터는 다양한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정적인 발현에는 숙주 세포의 분열이 필요하다.

레트로바이러스는 어떠한 아과에서도 유래될 수 있다. 예를 들어, 쥐 육종 바이러스, 소 백혈병, 바이러스 라우스 육종 바이러스, 쥐 백혈병 바이러스, 밍크 세포 초점 유도 바이러스, 세망내피증 바이러스 또는 조류 백혈병 바이러스의 벡터가 사용될 수 있다. 당업자는 LTR, tRNA 결합 부위 및 패키징 신호와 같은 다양한 레트로바이러스로부터 유래된 부분을 결합하여 재조합 레트로바이러스를 제공할 수 있을 것이다. 이러한 레트로바이러스는 일반적으로 형질도입 능력이 있는 레트로바이러스 벡터 입자를 생산하는 데 사용된다. 이를 위해, 벡터가 적합한 패키징 세포주에 도입된다. 레트로바이러스는 또한 키메라 인테그라제 효소를 레트로바이러스 입자에 통합함으로써 숙주 세포의 DNA에 부위별 통합을 위해 구성될 수 있다.

단순 헤르페스 바이러스(HSV)는 향신경성이기 때문에, 신경계 장애 치료에 상당한 관심을 불러일으켰다. 더욱이, 숙주 세포 염색체에 통합되거나 숙주 세포의 대사를 변경하지 않고 비분열 신경 세포에서 잠복 감염을 확립하는 HSV의 능력과 잠복기 동안 활성화되는 프로모터의 존재는 HSV를 매력적인 벡터로 만든다. HSV의 향신경성 적용에 많은 관심이 집중되었지만, 이 벡터는 넓은 숙주 범위를 고려할 때 다른 조직에도 활용될 수 있다.

HSV를 매력적인 벡터로 만드는 또 다른 요인은 게놈의 크기와 구성이다. HSV는 크기가 크기 때문에, 여러 유전자 또는 발현 카세트를 통합하는 것은 다른 작은 바이러스 시스템보다 문제가 적다. 또한, 성능(시간적, 세기 등)이 다양한 서로 다른 바이러스 제어 서열의 가용성은 다른 시스템보다 더 큰 범위로 발현을 제어하는 것을 가능하게 한다. 또한 바이러스에는 스플라이스된 메시지가 비교적 적어, 유전자 조작이 더욱 용이하다는 장점도 있다.

HSV는 또한 상대적으로 조작하기 쉽고 높은 역가로 성장할 수 있다. 따라서, 충분한 감염 다중도(MOI)를 달성하는 데 필요한 용량과 반복 투여 필요성 감소 측면에서 전달은 문제가 되지 않는다. HSV의 비병원성 변이체가 개발되었으며 유전자 치료 환경에서 쉽게 사용할 수 있다.

렌티바이러스는 일반적인 레트로바이러스 유전자인 gag, pol 및 env 외에도 조절 또는 구조적 기능을 가진 다른 유전자를 포함하는 복잡한 레트로바이러스이다. 복잡성이 높을수록 바이러스는 잠복 감염 과정에서처럼 수명 주기를 조절할 수 있다. 렌티바이러스의 일부 예에는 인간 면역결핍 바이러스(HIV-1, HIV-2)와 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)가 포함된다. 렌티바이러스 벡터는 HIV 독성 유전자를 다중적으로 약화시킴으로써 생성되었으며, 예를 들어 유전자인 env, vif, vpr, vpu 및 nef가 결실되어 벡터가 생물학적으로 안전해진다.

렌티바이러스 벡터는 플라스미드 기반 또는 바이러스 기반이며, 외래 핵산을 통합하고, 핵산을 선택하고, 핵산을 숙주 세포로 전달하기 위한 필수 서열을 운반하도록 구성된다. 관심 벡터의 gag, pol 및 env 유전자도 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 관련 유전자는 선택된 벡터에 복제된 다음 관심 표적 세포를 변형시키는 데 사용된다.

백시니아 바이러스 벡터는 구축의 용이성, 상대적으로 높은 수준의 발현 획득, 넓은 숙주 범위 및 DNA 운반을 위한 대용량으로 인해 광범위하게 사용되어 왔다. 우두증은 뚜렷한 "A-T" 선호도를 나타내는 약 186kb의 선형 이중 가닥 DNA 게놈을 포함한다. 약 10.5kb의 역전된 말단 반복이 게놈 측면에 위치한다. 필수 유전자의 대부분은 폭스바이러스 중에서 가장 잘 보존되어 있는 중앙 지역 내에서 매핑되는 것으로 보인다. 우두 바이러스 수의 추정된 개방형 판독 프레임은 150 내지 200이다. 두 가닥 모두 코딩되지만, 판독 프레임의 광범위한 중첩은 일반적이지 않다.

우두 바이러스 게놈으로 적어도 25kb가 삽입될 수 있다. 원형 우두 벡터는 상동성 재조합을 통해 바이러스 티미딘 키나제 유전자에 삽입된 이식유전자를 함유한다. 벡터는 tk-표현형(tk-phenotype)을 기준으로 선택된다. 뇌심근염 바이러스의 번역되지 않은 리더 서열을 포함하면 기존 벡터의 발현 수준보다 발현 수준이 높아져 24시간 내에 감염된 세포 단백질의 10% 이상을 이식유전자가 축적하게 된다.

쥐 폴리오마 바이러스와 같은 파포바바이러스의 빈 캡시드는 유전자 전달을 위한 가능한 벡터로서 주목을 받았다. 빈 폴리오마의 사용은 폴리오마 DNA와 정제된 빈 캡시드를 무세포 시스템에서 배양했을 때 처음 설명되었다. 새로운 입자의 DNA는 췌장 DNase의 작용으로부터 보호되었다. 재구성된 입자는 형질전환 폴리오마 DNA 단편을 쥐 FIII 세포로 전달하기 위해 사용되었다. 빈 캡시드와 재구성된 입자는 폴리오마 캡시드 항원(VP1, VP2 및 VP3) 세 가지 모두로 구성된다.

AAV는 데펜도바이러스 속에 속하는 파보바이러스이다. 이들은 복제를 위해 보조 바이러스가 필요한 작고 외피가 없는(nonenveloped) 단일 가닥 DNA 바이러스이다. 기능적으로 완전한 AAV 비리온을 형성하기 우해 보조 바이러스(예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스 또는 우두 바이러스)와의 동시 감염이 필요하다. 생체외에서, 보조 바이러스와의 동시 감염이 없는 경우, AAV는 바이러스 게놈이 에피솜 형태로 존재하지만 감염성 비리온이 생성되지 않는 잠복 상태를 설정한다. 보조 바이러스에 의한 후속 감염은 게놈을 "구출"하여, 게놈이 복제되고 바이러스 캡시드로 패키징되도록 하여, 감염성 비리온을 재구성할 수 있다. 최근 데이터는 생체내에서 야생형 AAV와 재조합 AAV 둘 모두는 주로 큰 에피솜 연쇄체로 존재한다. 일 실시예에서, 본원에서 사용된 유전자 치료 벡터는 AAV 벡터이다. AAV 벡터는 정제되고, 복제 불능하며, 위형이 지정된 rAAV 입자일 수 있다.

AAV는 임의의 알려진 인간 질병과 관련이 없으며, 일반적으로 병원성으로 간주되지 않으며, 통합 시 숙주 세포의 생리학적 특성을 변경하지 않는 것으로 보인다. AAV는 비분열 세포를 포함하여 광범위한 숙주 세포를 감염시킬 수 있으며, 서로 다른 종의 세포도 감염시킬 수 있다. 세포 및 체액 반응 모두에 의해 신속하게 제거되거나 비활성화되는 일부 벡터와는 달리, AAV 벡터는 생체 내 다양한 조직에서 지속적인 이식유전자 발현을 유도하는 것으로 나타났다. 생체 내 비잠수(non-diving) 세포에서 재조합 AAV 매개 이식유전자의 지속성은 천연 AAV 바이러스 유전자의 부족과 에피솜 연쇄체를 형성하는 벡터의 ITR 연결 능력에 기인할 수 있다.

AAV는 에피솜 연쇄체로서 지속 빈도가 높고 심근세포를 포함한 비분열 세포를 감염시킬 수 있어, 예를 들어, 조직 배양 및 생체 내에서 포유류 세포 내로 유전자를 전달하는 데 유용하므로 본 발명의 세포 형질도입에 사용하기에 매력적인 벡터 시스템이다.

전형적으로, rAAV는 두 개의 AAV 말단 반복이 측면에 있는 관심 유전자를 함유하는 플라스미드 및/또는 말단 반복이 없는 야생형 AAV 코딩 서열, 예를 들어 pIM45를 함유하는 발현 플라스미드를 동시형질감염시킴으로써 제조된다. 세포는 또한 AAV 보조 기능에 필요한 아데노바이러스 유전자를 운반하는 아데노바이러스 및/또는 플라스미드로 감염 및/또는 형질감염된다. 이러한 방식으로 만들어진 rAAV 스톡은 아데노바이러스로 오염되어 있으며, 이는 (예를 들어, 염화세슘 밀도 원심분리 또는 컬럼 크로마토그래피에 의해) rAAV 입자로부터 물리적으로 분리되어야 한다. 대안으로, AAV 코딩 영역을 포함하는 아데노바이러스 벡터 및/또는 AAV 코딩 영역을 포함하는 세포주 및/또는 아데노바이러스 보조 유전자의 일부 또는 전부가 사용될 수 있다. 통합된 프로바이러스로서 rAAV DNA를 운반하는 세포주도 사용될 수 있다.

AAV의 여러 혈청형은 자연계에 존재하며, 적어도 12개의 혈청형(AAV1-AAV12)을 가지고 있다. 높은 수준의 상동성에도 불구하고, 서로 다른 혈청형은 서로 다른 조직에 대해 향성(tropism)을 갖는다. 형질감염 시, AAV는 숙주에서 약간의 면역 반응(있는 경우)만 유도한다. 따라서, AAV는 유전자 치료 접근법에 매우 적합하다.

본 개시는 일부 구현예들에서 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, ANC AAV, 이로부터 유래된 키메라 AAV, 이들의 변이체 및 이들의 조합 중 하나 이상인 AAV 벡터를 포함하는 약물에 관한 것일 수 있으며, 이는 관심 조직에서의 고효율 형질도입에 훨씬 더 적합할 것이다. 특정 실시예들에서, 유전자 치료 벡터는 AAV 혈청형 1 벡터이다. 특정 실시예들에서, 유전자 치료 벡터는 AAV 혈청형 2 벡터이다. 특정 실시예들에서, 유전자 치료 벡터는 AAV 혈청형 3 벡터이다. 특정 실시예들에서, 유전자 치료 벡터는 AAV 혈청형 4 벡터이다. 특정 실시예들에서, 유전자 치료 벡터는 AAV 혈청형 5 벡터이다. 특정 실시예들에서, 유전자 치료 벡터는 AAV 혈청형 6 벡터이다. 특정 실시예들에서, 유전자 치료 벡터는 AAV 혈청형 7 벡터이다. 특정 실시예들에서, 유전자 치료 벡터는 AAV 혈청형 8 벡터이다. 특정 실시예들에서, 유전자 치료 벡터는 AAV 혈청형 9 벡터이다. 특정 실시예들에서, 유전자 치료 벡터는 AAV 혈청형 10 벡터이다. 특정 실시예들에서, 유전자 치료 벡터는 AAV 혈청형 11 벡터이다. 특정 실시예들에서, 유전자 치료 벡터는 AAV 혈청형 12 벡터이다.

인간을 위한 AAV의 적합한 투여량은 체중 킬로그램당 약 1×10⁸ 벡터 게놈(vg/kg) 내지 약 3×10¹⁴vg/kg, 약 1×10⁸vg/kg, 약 1×10⁹vg/kg, 약 1×10¹⁰vg/kg, 약 1×10¹¹ vg/kg, 약 1×10¹² vg/kg, 약 1×10¹³ vg/kg, 또는 약 1×10¹⁴ vg/kg의 범위일 수 있다. 바이러스 입자 또는 DRP의 총량은 5×10¹⁵vg/kg, 4×10¹⁵ vg/kg, 3×10¹⁵ vg/kg, 2×10¹⁵ vg/kg, 1×10¹⁵ vg/kg, 9×10¹⁴ vg/kg, 8×10¹⁴　vg/kg, 7×10¹⁴ vg/kg, 6×10¹⁴ vg/kg, 5×10¹⁴ vg/kg, 4×10¹⁴ vg/kg, 3×10¹⁴ vg/kg, 2×10¹⁴　vg/kg, 1×10¹⁴ vg/kg, 9×10¹³ vg/kg, 8×10¹³ vg/kg, 7×10¹³ vg/kg, 6×10¹³ vg/kg, 5×10¹³　vg/kg, 4×10¹³ vg/kg, 3×10¹³ vg/kg, 2×10¹³ vg/kg, 1×10¹³ vg/kg, 9×10¹² vg/kg, 8×10¹²　vg/kg, 7×10¹² vg/kg, 6×10¹² vg/kg, 5×10¹² vg/kg, 4×10¹² vg/kg, 3×10¹² vg/kg, 2×10¹²　vg/kg, 1×10¹² vg/kg, 9×10¹¹ vg/kg, 8×10¹¹ vg/kg, 7×10¹¹ vg/kg, 6×10¹¹ vg/kg, 5×10¹¹　vg/kg, 4×10¹¹ vg/kg, 3×10¹¹ vg/kg, 2×10¹¹ vg/kg, 1×10¹¹ vg/kg, 9×10¹⁰ vg/kg, 8×10¹⁰　vg/kg, 7×10¹⁰ vg/kg, 6×10¹⁰ vg/kg, 5×10¹⁰ vg/kg, 4×10¹⁰ vg/kg, 3×10¹⁰ vg/kg, 2×10¹⁰　vg/kg, 1×10¹⁰ vg/kg, 9×10⁹　vg/kg, 8×10⁹　vg/kg, 7×10⁹　vg/kg, 6×10⁹　vg/kg, 5×10⁹　vg/kg, 4×10⁹　vg/kg, 3×10⁹　vg/kg, 2×10⁹　vg/kg, 1×10⁹ vg/kg, 9×10⁸ vg/kg, 8×10⁸ vg/kg, 7×10⁸　vg/kg, 6×10⁸ vg/kg, 5×10⁸ vg/kg, 4×10⁸ vg/kg, 3×10⁸ vg/kg, 2×10⁸ vg/kg, 또는 1×10⁸ vg/kg이거나, 대략 이러한 값들이거나, 적어도 이러한 값들이거나, 적어도 대략 이러한 값들이거나, 이러한 값들 미만이거나, 대략 이러한 값들 미만이거나, 또는 이러한 값들 중 임의의 두 가지로 정의된 범위 내에 속한다. 위에 나열된 복용량은 vg/kg 심장 조직 단위이다.

바이러스 벡터와는 별도로, 비바이러스 발현 구성체는 표적 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 그 기능적 변이체 또는 그 단편을 환자의 세포에 도입하는데 사용될 수도 있다. 표적 세포에서 단백질의 생체내 발현을 허용하는 비-바이러스 발현 벡터에는 예를 들어 플라스미드, 변형된 RNA, mRNA, cDNA, 안티센스 올리고머, DNA-지질 복합체, 나노입자, 엑소좀, 유전자 치료에 적합한 임의의 비-바이러스 셔틀, 그 변이체 및 이들의 조합이 포함된다.

바이러스 벡터 및 비-바이러스 발현 벡터 외에도, 뉴클레아제 시스템은 벡터 및/또는 전기천공 시스템과 함께 사용되어 환자의 세포에 들어가 그 안에 표적 단백질을 인코딩하는 유전자 또는 기능적 변이체 또는 그 단편을 도입하는 데 사용될 수도 있다. 예시적인 뉴클레아제 시스템에는, 제한 없이, CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat), DNA 절단 효소(예를 들어, Cas9), 메가뉴클레아제, TALEN, 아연 핑거 뉴클레아제, 유전자 치료에 적합한 임의의 다른 뉴클레아제 시스템, 그 변이체, 및 이들의 조합이 포함될 수 있다. 예를 들어, 일 실시예에서, 하나의 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)는 뉴클레아제(예를 들어, CRISPR)에 사용될 수 있고, 다른 바이러스 벡터(예를 들어, AAV)는 DNA 절단 효소(예를 들어, Cas9)에 사용되어 둘 모두(뉴클레아제 및 DNA 절단 효소)를 표적 세포에 도입한다.

치료 유전자를 인코딩하는 치료 폴리뉴클레오티드 서열을 세포 내로 전달하기 위해 사용될 수 있는 기타 벡터 전달 시스템은 수용체 매개 전달 운반체이다. 이는 거의 모든 진핵 세포에서 수용체 매개 세포내이입에 의한 거대분자의 선택적 흡수를 이용한다. 다양한 수용체의 세포 유형별 분포로 인해, 전달은 매우 특정적일 수 있다. 수용체 매개 유전자 표적화 운반체는 세포 수용체별 리간드 및 DNA 결합제라는 두 가지 구성요소를 포함할 수 있다.

비-바이러스 벡터를 표적 세포로 전달하는 데 적합한 방법에는 예를 들어 리포펙션 방법, 인산칼슘 공침 방법, DEAE-덱스트란 방법 및 미세유리관, 초음파, 전기천공법 을 사용한 직접 DNA 도입 방법 등이 있다. 벡터 도입 전에, 심근 세포는 포스파티딜콜린, 스트렙톨리신, 나트륨 카프레이트, 데카노일카르니틴, 타르타르산, 리소레시틴, 트리톤 X-100 등과 같은 투과화제로 처리될 수 있다. 엑소좀은 또한 네이키드(naked) DNA 또는 AAV로 캡슐화된 DNA를 전달하는 데 사용될 수도 있다.

본 발명의 유전자 치료 벡터는 표적 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 기능적으로 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 프로모터 서열은 콤팩트해야 하고 강력한 발현을 보장해야 한다. 바람직하게는, 프로모터는 유전자 치료 벡터로 치료받은 환자의 심근에서 표적 단백질의 발현을 제공한다. 일부 실시예에서, 유전자 치료 벡터는 표적 단백질을 인코딩하는 핵산 서열에 동작 가능하게 연결된 심장별 프로모터를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "심장별 프로모터"는 심장 세포에서의 활성이 임의의 기타 비심장 세포 유형에서보다 적어도 2배 더 높은 프로모터를 말한다. 바람직하게는, 본 발명의 벡터에 사용되기에 적합한 심장별 프로모터는 비심장 세포 유형에서의 활성과 비교하여 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 15배, 적어도 20배, 적어도 25배, 또는 적어도 50배 더 높은 심장 세포에서의 활성을 갖는다.

심장별 프로모터는 선택된 인간 프로모터, 또는 선택된 인간 프로모터와 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 일체성을 갖는 기능적으로 동등한 서열을 포함하는 프로모터일 수 있다. 사용될 수 있는 예시적인 비제한적 프로모터는 심장 트로포닌 T 프로모터(TNNT2)이다. 프로모터의 다른 비제한적인 예에는 알파 미오신 중쇄 프로모터, 미오신 경쇄 2v 프로모터, 알파 미오신 중쇄 프로모터, 알파-심장 액틴 프로모터, 알파-트로포미오신 프로모터, 심장 트로포닌 C 프로모터, 심장 트로포닌 I 프로모터, 심장 미오신 결합 단백질 C 프로모터 및 SERCA(sarco/endoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase) 프로모터(예를 들어, 이 프로모터의 2(SERCA2))이 포함된다.

본 발명에 유용한 벡터는 다양한 형질도입 효율을 가질 수 있다. 결과적으로, 바이러스 또는 비-바이러스 벡터는 표적 혈관 영역의 세포 중 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 또는 100%를 초과하거나, 이러한 퍼센트와 같거나, 또는 적어도 이러한 퍼센트의 세포를 형질도입한다. 둘 이상의 벡터(바이러스성, 비-바이러스성 또는 이들의 조합)가 동시에 또는 순차적으로 사용될 수 있다. 이는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드를 전달하고, 및/또는 둘 이상의 세포 유형을 표적으로 삼는 데 사용될 수 있다. 여러 벡터나 여러 제제가 사용되는 경우, 둘 이상의 형질도입/형질감염 효율성이 발생할 수 있다.

유전자 치료 벡터를 함유하는 약제학적 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 희석제, 담체와 같은 일반적으로 사용되는 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 수 있다. 특히, 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 예를 들어 물, 식염수, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다. 담체 이외에, 약제학적 조성물은 유화제, pH 완충제, 안정화제, 염료 등을 함유할 수도 있다.

특정 실시예들에서, 약제학적 조성물은 피험자에게 독성을 나타내지 않으면서 피험자의 심근병증을 예방 또는 치료할 수 있는 용량인 치료적으로 유효한 유전자 용량을 포함할 것이다. 심근병증의 예방 또는 치료는 심근병증과 관련된 표현형 특성의 변화로 평가될 수 있으며, 이러한 변화는 심근병증을 예방하거나 치료하는 데 효과적이다. 따라서, 치료적으로 유효한 유전자 용량은 전형적으로 생리학적으로 허용되는 조성물로 투여될 때 치료 대상의 병원성 심장 표현형을 개선하거나 예방하기에 충분한 용량이다.

특정 실시예들에서, 유전자 치료 벡터는 정맥내 전달, 동맥내 전달 또는 복막내 전달을 포함한 여러 가지 다른 방법을 통해 피험자에게 형질도입될 수 있다. 일부 실시예들에서, 유전자 치료 벡터는 예를 들어 관상동맥내 투여에 의해 심장 조직에 직접 투여될 수 있다. 일부 실시예들에서, 심근의 조직 형질도입은 카테터 매개 심근내 전달에 의해 달성될 수 있으며, 이는 형질도입 강화 담체에 결합되거나 결합되지 않은 벡터가 없는 cDNA를 심근으로 전달하는 데 사용될 수 있다.

특정 실시예들에서, 약물은 치료적으로 유효한 유전자 용량을 포함할 것이다. 약제학적으로 유효한 유전자 용량은 환자에게 독성을 나타내지 않으면서 환자의 특정 심장 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 용량이다.

본원에 개시된 방법에 의해 치료될 수 있는 심장 질환에는, 제한 없이, 유전적으로 결정된 심장 질환(예를 들어, 유전적으로 결정된 심근병증), 부정맥성 심장 질환, 심부전, 허혈, 부정맥, 심근경색, 울혈성 심부전, 이식 거부, 비정상적인 심장 수축, 비허혈성 심근병증, 승모판 역류, 대동맥 협착 또는 역류, 비정상적인 Ca²⁺ 대사, 선천성 심장 질환, 일차적 또는 이차적 심장 종양 및 이들의 조합 중 하나 이상이 포함될 수 있다.

예시적인 예들

하기의 예들은 본 개시의 이해를 돕기 위해 제시된 것이며, 물론, 본원에 기술되고 청구된 실시예들을 구체적으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 당업자의 권한 내에 있는 현재 알려져 있거나 향후 개발될 모든 등가물의 대체물을 포함하는 실시예들의 이러한 변형과 실험 설계의 사소한 변경 또는 공식 변경은 본원에 포함된 실시예들의 범위 내에 속하는 것으로 간주된다.

예 1(예언적인)

생체외 시스템의 예시적인 예에서, PKP2 동형체 2a cDNA 서열(2764bp cDNA, GenBank: BC126199.1; 서열 ID 번호: 1)은 심장별 TNNT2 프로모터(서열 ID 번호: 6) 하에서 그리고 AAV2 내부 말단 반복부(ITR): ITR-TNNT2-PKP2cDNA-ITR를 사용하여 클로닝된다. PKP2를 인코딩하는 핵산 서열은 PKP2 동형체 2a 단백질을 인코딩하는 PKP2 유전자(서열 ID 번호: 2)의 코돈 최적화된 버전일 수 있다. 또 다른 예시적인 예로서, PKP2를 인코딩하는 핵산 서열은 PKP2 동형체 2b 단백질을 인코딩하는 PKP2 유전자(서열 ID 번호: 4)의 코돈 최적화된 버전일 수 있다.

구성은 AAV6 및 AAV9와 같은 AAV로 벡터화될 수 있다. 안티-플래그(anti-Flag)에 의한 형질감염 후 단백질을 식별하고 이를 내인성 단백질과 구별할 수 있도록 플래그(Flag)가 추가된 구성(Flag-PKP2)가 준비될 수 있다. 서열 ID 번호 7은 예를 들어 PKP2 동형체 2b를 발현하기 위한 예시적인 구성 서열이다. 생체외에서 PKP2의 발현은 PKP2 1차 항체를 사용하는 면역형광 현미경으로 관찰될 수 있으며, 이는 세포막과 치밀한 플라크에서 PKP2의 국소화를 보여준다.

유전자 발현 레벨을 추가로 증가시키기 위해, 하나 이상의 네오-인트론이 본원에 설명된 유전자 치료 벡터에 혼입될 수 있는 것이 고려된다. 예를 들어, 적어도 두 의 상이한 유전자로부터 유래된 적어도 두 개의 상이한 인트론의 일부를 포함하는 인트론을 지칭하는 "키메라 인트론(chimeric intron)은 예컨대 인간 베타 글로빈 유전자 및 인간 면역글로불린 G로부터 유래된 인트론 서열이 이용될 수 있다. 일부 실시예들에서, 네오-인트론은 프로모터의 바로 하류에 삽입될 수 있다. 일부 실시예들에서, 네오-인트로는 엑손 1 뒤와 엑손 2 앞과 같이 PKP2 cDNA 서열의 서로 다른위치에 배치될 수 있다.

AAV6-TNNT2-PKP2는 정상 심근세포; 1개의 이형접합성 PKP2 돌연변이를 보유하는 심근세포(ARVC 환자로부터); 및 트랜스에서 두 의 PKP2 돌연변이를 보유하는 심근세포를 포함하는 2D 세포 배양에서 iPSC-CM을 형질감염시키는 데 사용된다.

PKP2 RNA 및 단백질 레벨의 성공적인 형질감염 및 특성화 후, 세포 크기 및 PKP2 결핍에서 발현이 변경된 것으로 알려진 유전자의 교정(MYL2, SCN5A(단백질 생성물이 NaV1.5임), GJA1 및 TTN)을 포함하는 다수의 판독에 대한 정상 대 PKP2 결핍 및 PKP2 수정 CM의 비교가 수행된다.

유사한 방법론이 인간 3D 배양 모델에서의 생체외 치료뿐만 아니라 PKP2-돌연변이 마우스 모델에서의 생체내 치료에도 적응될 수 있는 것으로 고려된다.

(플래그-)PKP2 단백질이 발현되면, 정확한 세포내 국소화(데스모좀)에 도달하고, 형질감염은 RNA 레벨 및 단백질 레벨에서 PKP2-반수체 기능 부전 또는 완전히 결핍된 세포를 교정하는 것으로 여겨진다. 완전히 PKP2-결핍 세포에서, PKP2-형질감염은 또한 데스모좀 내 데스모좀 단백질 복합체를 복원할 수 있고, 특히 PKP2가 감소할 때 감소되는 플라코글로빈의 복원도 가능할 것으로 여겨진다.

PKP2 동형체 2a, PKP2 동형체 2b, 또는 둘 다를 발현하기 위한 유전자 치료 벡터가 인간 피험자의 심장 조직에 전달될 수 있다는 것이 추가로 고려된다. 예를 들어, 유전자 치료 벡터는 하나 이상의 유전자 치료 벡터 및 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 포함하는 치료 제형으로 제형화될 수 있다. 제형은 정맥내 전달, 동맥내 전달 또는 복막내 전달을 포함한 여러 가지 다른 방법을 통해 인간 피험자에게 형질도입될 수 있다. 유전자 치료 벡터는 예를 들어 관상동맥내 투여에 의해 심장 조직에 직접 투여될 수 있다. 유전자 치료 벡터는 또한 카테터 매개 심근내 전달을 통해 전달될 수 있다.

유전자 치료 벡터는 예를 들어 피험자의 관상동맥 순환계를 피험자의 전신 순환계로부터 격리시켜 폐쇄 회로를 형성하고, 유체(예를 들어, 유전자 치료 벡터를 포함한 제형)를 피험자의 격리된 관상동맥 순환계에 관류시킴으로써 피험자의 관상동맥 순환계에 국소적으로 투여될 수 있는다는 것이 추가로 고려된다. 관류는 피험자의 정지되지 않은 박동 심장으로 수행될 수 있다. 폐쇄 회로는 예를 들어 환자의 우관상동맥에 위치되는 제1 약물 전달 카테터, 환자의 좌주관상동맥에 위치되는 제2 약물 전달 카테터, 관상정맥동에 위치되는 약물 수집 카테터, 관상동맥 동맥, 관상정맥계, 정맥 분지와 동맥 분지 사이에 개재되는 외부 막 산소 공급 장치를 포함하여 형성될 수 있다. 이러한 현지 전달은 2020년 8월 26일에 출원된 국제 출원 번호 제PCT/IB2020/000692오에 대해 설명된 대로 수행될 수 있으며, 이 출원의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다.

예 2: hiPSC 유래 심근세포에서의 데스모좀 PKP2 발현

데스모좀 복합체의 단백질은 2차원(2D) 세포 배양에서 인간 유도 다능성 줄기 세포 유래(hiPSC 유래) 정상 심근세포에서 발현되었으며 형성되는 데스모좀의 세포내 구조에 위치되었다. 도 1은 야생형 2D hiPSC 유래 심근세포의 데스모좀 세포-세포 접합에 국한된 PKP2의 형광 현미경 이미지를 도시한다.

FLAG-태그를 추가로 포함되는 예 1에 설명된 벡터와 유사한 AAV9-TNNT2-PKP2b를 사용하여 대조군 hiPSC-심근세포의 형질도입이 수행되었다. 도 2는 야생형 심근세포에서 FLAG-태그 신호가 발현되고 데스모좀 세포-세포 접합에 올바르게 위치하는지 확인하는 형광 현미경 이미지를 도시한다.

그런 다음 PKP2 돌연변이 hiPSC 유래 심근세포를 특성화하고 세포 레벨에서 반수체 기능 부전을 보여주는 대조군으로서 아시아인(Asi) 및 백인(Cau) 기원의 다양한 야생형 세포주와 비교하였다. 도 3은 PKP2 돌연변이 세포주의 반수체 기능 부전이 대조군 세포주와 비교하여 감소된 PKP2 발현에 의해 명백한 PKP2 단백질 발현의 웨스턴 블롯(western blot)을 도시한다(정량화는 심장 트로포닌 T에 상대적임).

TNNT2 프로모터를 갖는 PKP2 동형체 2b FLAG-태그된 이식유전자를 갖는 PKP2 돌연변이 hiPSC 유래 심근세포의 AAV9 매개 형질도입은 도 4의 형광 현미경 이미지에 도시된 바와 같이 PKP2 동형체 2b의 발현 및 정확한 국소화를 초래하는 것으로 입증되었다.

본원에 설명된 실험에서, 사용된 hiPSC 유래 심근세포는 PKP2 동형체 2a만 발현하는 것으로 밝혀졌는데, 이는 이들이 덜 성숙하고 발달적으로 조절되는 동형체임을 나타낸다. 대조적으로, 성숙한 인간 심장 조직에서는 전체 길이의 PKP2b 동형체 2b가 우세하다. 총 단백질 레벨에서, 웨스턴 블롯을 사용하여 AAV9-TNNT2-PKP2b-FLAG를 사용한 형질도입이 PKP2 돌연변이 hiPSC-심근세포에서 반수체 기능 부전 상태를 총 PKP2 단백질 발현으로 교정했음을 확인했다. 도 5는 두 개의 야생형 hiPSC-CM 대조군(Asi 및 Cau)과 비교한 PKP2 돌연변이 hiPSC-CM("PKP2")을 도시한다. MYBPC3 및 cTnT는 발현된 PKP2의 상대적인 양을 계산하기 위한 참조 단백질로 사용되었다. PKP2 돌연변이 hi-IPSC-CM은 두 개의 대조군 세포주에 비해 PKP2 단백질 발현량이 크게 감소한 것으로 나타났다. PKP2 발현은 AAV9-PKP2를 이용한 형질도입 후 정량적으로 교정되었다. 형질도입된 세포는 AAV 매개 이식유전자에서 생성된 PKP2 동형체 2b와 hiPSC-CM에서 자연적으로 발현되는 PKP2 동형체 2a를 나타내는 PKP2 더블릿(doublet)을 나타냈다는 점에 유의한다. PKP2 동형체 2b의 새로운 발현은 잘 용인되었으며 PKP2 돌연변이 또는 야생형 대조군 심근세포에서 명백한 기능적 변화를 초래하지 않았다.

예 3: 내인성 PKP2 발현 감소

도 6은 관련되지 않은 대조군 심근세포, 손상되지 않은 인간 심장(NFH) 조직 및 PKP2 환자 심근세포(이는 PKP2와 관련하여 반수체 기능 부전임)와 비교하여 감소된 내인성 PKP2 발현을 도시한다. 도시된 바와 같이, PKP2 환자 심근세포는 정상 대조군 세포 및 손상되지 않은 인간 심장(NFH) 세포에 비해 PKP2를 덜 발현한다. 내인성 PKP2의 함량은 형질도입 없이 뉴라미니다제(이는 세포 배양에서 AAV9를 사용한 형질도입 중에 활용됨)("PKP2 환자 NT NA")로 처리한 경우에는 변하지 않았다. 코돈 최적화된 PKP2 동형체 2b 벡터("PKP2 환자 TD 2b opt")를 사용하여 형질도입을 수행했으며, 야생형 PKP2 서열에 결합하지 않도록 프라이머를 선택하여 형질도입 후 변화가 발생하지 않도록 했다.

도 7은 PKP2 동형체 2a가 인간 조직(관련되지 않은 대조군, 손상되지 않은 인간 심장)에서 우세한 PKP2 동형체임을 도시한다. 이는 뉴라미니다제 하에서 그리고 코돈 최적화된 PKP2b를 사용한(위에서 논의된 비결합 프라이머 사용한) 형질도입 후에도 변하지 않은 채로 유지된다. PKP2 동형체 2b 전체 길이의 동형체는 NFH 세포, 대조군, 세포 또는 PKP2 환자 심근세포에서는 검출되지 않았다. PKP2 동형체 2a는 총 PKP2의 대략 절반으로 존재했다.

예 4: 총 PKP2 레벨 복원

도 8a 및 8b는 NFH 세포 및 2개의 관련되지 않은 대조군("wt")의 세포, 환자 세포 및 (NT NA")를 사용한 치료의 평균과 비교한 코돈 최적화된 PKP2 동형체 2b("TD")를 사용한 AAV9-매개 형질도입 후 RNA 레벨을 도시한다. 도 9a 및 9b는 건강한 대조군 CM 레벨 및 PKP2 환자 CM 레벨(형질도입 없음)을 형질도입 후 환자 세포의 PKP2 레벨과 비교하여, 형질도입 후 총 단백질 레벨을 도시한다. 도 9a에서, 총 PKP2 단백질 레벨은 내인성 미오신 결합 단백질 C(MYBPC3) 레벨과 관련하여 결정되며, 도 9b에서, PKP2 단백질 레벨은 내인성 심장 트로포닌 T(cTnT) 레벨과 관련하여 결정된다. 도 8-9에 도시된 바와 같이, 형질도입은 PKP2 환자 CM에서 총 PKP2 레벨을 복원한다. 이는 도 7에 도시된 바와 같이 PKP2 동형체 2a가 우세한 동형체이었음에도 불구하고 PKP2 동형체 2b의 외인성 발현을 사용하여 달성된다.

예 5: 데스모좀 단백질 복합체에서 다른 단백질의 복원

도 10a 및 10b는 코돈 최적화된 PKP2 동형체 2b를 이용한 AAV9 매개 형질도입 후 환자 CM과 비교하여 치료되지 않은 환자 CM에서 데스모플라킨1, 데스모플라킨 2, 데스모콜린 2, 플라코글로빈, 데스모글레인 2, 코넥신 43을 포함하는 데스모좀 단백질 복합체의 다양한 단백질의 발현을 도시한다. 이론에 구애됨이 없이, 외인성 PKP2의 발현은 PKP2에 대해 반수체 기능 부전인 세포에 비해 다양한 데스모좀 단백질의 상향조절을 초래하는 것으로 여겨진다.

전술한 설명에서, 본 발명의 철저한 이해를 제공하기 위해 특정 재료, 치수, 프로세스 파라미터 등과 같은 다양한 특정 세부 사항이 설명되어 있다. 특정 특징, 구조, 재료 또는 특성은 하나 이상의 실시예에서 임의의 적절한 방식으로 결합될 수 있다. 본원에서 "예" 또는 "예시적인"이라는 단어는 예, 실례 또는 예시로서의 역할을 의미하는 것으로 사용된다. "예" 또는 "예시적인 예"로서 본원에 설명된 임의의 양태 또는 설계들은 반드시 다른 양태들 또는 설계들보다 선호되거나 유리한 것으로 해석될 필요는 없다. 오히려 "예" 또는 "예시적인 예"이라는 단어를 사용하는 것은 단순히 개념을 구체적인 방식으로 제시하기 위한 것이다. 본 출원에 사용된 바와 같이, "또는"이라는 용어는 배타적인 "또는"이 아닌 포괄적인 "또는"을 의미하도록 의도되었다. 즉, 달리 명시하지 않거나 문맥에서 명확하지 않는 한, "X는 A 또는 B를 포함한다"는 모든 자연적인 포함 순열을 의미하도록 의도된다. 즉, X에 A가 포함되거나; X에 B가 포함되거나; X에 A와 B가 모두 포함되는 경우, 전술한 경우 중 어느 하나에서 "X가 A 또는 B를 포함"이 충족된다. 또한, 본 명세서 전반에 걸쳐 "실시예", "특정 실시예" 또는 "일 실시예"에 대한 참조는 실시예들과 관련하여 설명된 특정 특징, 구조, 재료 또는 특성이 적어도 일 실시예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 위치에서 "실시예", "특정 실시예" 또는 "일 실시예"라는 문구가 나타나는 것은 반드시 모두 동일한 실시예를 지칭하는 것은 아니다.

본 발명은 특정 예시적인 실시예를 참조하여 설명되었다. 따라서, 본 명세서 및 도면들은 제한적인 의미가 아니라 예시적인 의미로 간주되어야 한다. 본원에 도시되고 설명된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형은 당업자에게 명백할 것이며 첨부된 청구함들의 범위 내에 속하도록 의도된다.

하기의 서열 ID 번호 1은 PKP2 동형체 2a(GenBank: BC126199.1)에 대한 단백질 코딩 서열을 포함하는 mRNA 서열의 cDNA 사본이다:

GAGTCCAGAGGCAGGCGAGCAGCTCGGTCGCCCCCACCGGCCCCATGGCAGCCCCCGGCGCCCCAGCTGAGTACGGCTACATCCGGACCGTCCTGGGCCAGCAGATCCTGGGACAACTGGACAGCTCCAGCCTGGCGCTGCCCTCCGAGGCCAAGCTGAAGCTGGCGGGGAGCAGCGGCCGCGGCGGCCAGACAGTCAAGAGCCTGCGGATCCAGGAGCAGGTGCAGCAGACCCTCGCCCGGAAGGGCCGCAGCTCCGTGGGCAACGGAAATCTTCACCGAACCAGCAGTGTTCCTGAGTATGTCTACAACCTACACTTGGTTGAAAATGATTTTGTTGGAGGCCGTTCCCCTGTTCCTAAAACCTATGACATGCTAAAGGCTGGCACAACTGCCACTTATGAAGGTCGCTGGGGAAGAGGAACAGCACAGTACAGCTCCCAGAAGTCCGTGGAAGAAAGGTCCTTGAGGCATCCTCTGAGGAGACTGGAGATTTCTCCTGACAGCAGCCCGGAGAGGGCTCACTACACGCACAGCGATTACCAGTACAGCCAGAGAAGCCAGGCTGGGCACACCCTGCACCACCAAGAAAGCAGGCGGGCCGCCCTCCTAGTGCCACCGAGATATGCTCGTTCCGAGATCGTGGGGGTCAGCCGTGCTGGCACCACAAGCAGGCAGCGCCACTTTGACACATACCACAGACAGTACCAGCATGGCTCTGTTAGCGACACCGTTTTTGACAGCATCCCTGCCAACCCGGCCCTGCTCACGTACCCCAGGCCAGGGACCAGCCGCAGCATGGGCAACCTCTTGGAGAAGGAGAACTACCTGACGGCAGGGCTCACTGTCGGGCAGGTCAGGCCGCTGGTGCCCCTGCAGCCCGTCACTCAGAACAGGGCTTCCAGGTCCTCCTGGCATCAGAGCTCCTTCCACAGCACCCGCACGCTGAGGGAAGCTGGGCCCAGTGTCGCCGTGGATTCCAGCGGGAGGAGAGCGCACTTGACTGTCGGCCAGGCGGCCGCAGGGGGAAGTGGGAATCTGCTCACTGAGAGAAGCACTTTCACTGACTCCCAGCTGGGGAATGCAGACATGGAGATGACTCTGGAGCGAGCAGTGAGTATGCTCGAGGCAGACCACATGCTGCCATCCAGGATTTCTGCTGCAGCTACTTTCATACAGCACGAGTGCTTCCAGAAATCTGAAGCTCGGAAGAGGGTTAACCAGCTTCGTGGCATCCTCAAGCTTCTGCAGCTCCTAAAAGTTCAGAATGAAGACGTTCAGCGAGCTGTGTGTGGGGCCTTGAGAAACTTAGTATTTGAAGACAATGACAACAAATTGGAGGTGGCTGAACTAAATGGGGTACCTCGGCTGCTCCAGGTGCTGAAGCAAACCAGAGACTTGGAGACTAAAAAACAAATAACAGGTTTGCTGTGGAATTTGTCATCTAATGACAAACTCAAGAATCTCATGATAACAGAAGCATTGCTTACGCTGACGGAGAATATCATCATCCCCTTTTCTGGGTGGCCTGAAGGAGACTACCCAAAAGCAAATGGTTTGCTCGATTTTGACATATTCTACAACGTCACTGGATGCCTAAGAAACATGAGTTCTGCTGGCGCTGATGGGAGAAAAGCGATGAGAAGATGTGACGGACTCATTGACTCACTGGTCCATTATGTCAGAGGAACCATTGCAGATTACCAGCCAGATGACAAGGCCACGGAGAATTGTGTGTGCATTCTTCATAACCTCTCCTACCAGCTGGAGGCAGAGCTCCCAGAGAAATATTCCCAGAATATCTATATTCAAAACCGGAATATCCAGACTGACAACAACAAAAGTATTGGATGTTTTGGCAGTCGAAGCAGGAAAGTAAAAGAGCAATACCAGGACGTGCCGATGCCGGAGGAAAAGAGCAACCCCAAGGGCGTGGAGTGGCTGTGGCATTCCATTGTTATAAGGATGTATCTGTCCTTGATCGCCAAAAGTGTCCGCAACTACACACAAGAAGCATCCTTAGGAGCTCTGCAGAACCTCACGGCCGGAAGTGGACCAATGCCGACATCAGTGGCTCAGACAGTTGTCCAGAAGGAAAGTGGCCTGCAGCACACCCGAAAGATGCTGCATGTTGGTGACCCAAGTGTGAAAAAGACAGCCATCTCGCTGCTGAGGAATCTGTCCCGGAATCTTTCTCTGCAGAATGAAATTGCCAAAGAAACTCTCCCTGATTTGGTTTCCATCATTCCTGACACAGTCCCGAGTACTGACCTTCTCATTGAAACTACAGCCTCTGCCTGTTACACATTGAACAACATAATCCAAAACAGTTACCAGAATGCACGCGACCTTCTAAACACCGGGGGCATCCAGAAAATTATGGCCATTAGTGCAGGCGATGCCTATGCCTCCAACAAAGCAAGTAAAGCTGCTTCCGTCCTTCTGTATTCTCTGTGGGCACACACGGAACTGCATCATGCCTACAAGAAGGCTCAGTTTAAGAAGACAGATTTTGTCAACAGCCGGACTGCCAAAGCCTACCACTCCCTTAAAGACTGAGGAAAATGACAAAGTATTCTCGGCTGCAAAAATCCCCAAAGGAAAACACCTATTTTTCTACTACCCAGCCCAAGAAACCTCAAAAGCATGCCTTGTTTCTATCCTTCTCTATTTCCGTGGTCCCCTGAATCCAGAAAACAAATAGAACATAATTTTATGAGTCTTCCAGAAGACCTTTGCAAGTTTGCCACCAGTAGATACCGGCC

하기의 서열 ID 번호 2는 PKP2 동형체 2a를 인코딩하는 코돈-최적화 cDNA 서열(5' 내지 3')이다:

ATGGCTGCTCCTGGTGCTCCTGCCGAGTACGGCTACATCAGAACAGTGCTGGGCCAGCAGATCCTGGGACAGCTGGATTCTAGCTCTCTGGCCCTGCCTTCTGAGGCCAAGCTGAAACTGGCCGGCAGTTCTGGAAGAGGCGGCCAGACAGTGAAGTCCCTGCGGATCCAAGAACAGGTGCAGCAGACCCTGGCCAGAAAGGGCAGATCTTCTGTCGGCAACGGCAACCTGCACAGAACCAGCTCTGTGCCCGAGTACGTGTACAATCTGCACCTGGTGGAAAACGACTTCGTCGGCGGCAGATCCCCTGTGCCTAAGACCTACGATATGCTGAAGGCCGGCACCACCGCCACCTATGAAGGCAGATGGGGAAGAGGCACAGCCCAGTACAGCAGCCAGAAAAGCGTGGAAGAGAGAAGCCTGCGGCACCCTCTGCGGAGACTGGAAATCAGCCCTGATAGCAGCCCAGAGAGAGCCCACTACACCCACAGCGACTACCAGTACTCCCAGAGATCTCAGGCCGGCCACACACTGCACCACCAAGAGTCTAGAAGGGCCGCTCTGCTGGTGCCTCCTAGATACGCCAGATCTGAGATCGTGGGCGTGTCCAGAGCCGGCACAACAAGCAGACAGAGACACTTCGACACCTACCACCGGCAGTATCAGCACGGCAGCGTGTCCGATACCGTGTTCGATAGCATCCCCGCCAATCCTGCTCTGCTGACATACCCTAGACCTGGCACCTCCAGATCCATGGGCAATCTGCTGGAAAAAGAGAACTACCTGACCGCCGGACTGACCGTGGGACAAGTTCGACCTCTGGTTCCTCTGCAGCCCGTGACACAGAACAGAGCCAGCAGAAGCAGCTGGCACCAGTCCAGCTTCCACAGCACCAGAACACTGAGAGAAGCTGGCCCTAGCGTGGCCGTGGATTCTTCTGGTAGAAGGGCTCACCTGACAGTTGGCCAAGCAGCTGCAGGCGGAAGCGGAAATCTGCTGACCGAGAGAAGCACCTTCACCGACAGCCAGCTGGGCAACGCCGACATGGAAATGACACTGGAACGGGCCGTGTCCATGCTGGAAGCCGATCACATGCTGCCCAGCAGAATTAGCGCCGCTGCCACCTTTATCCAGCACGAGTGCTTCCAGAAGTCTGAGGCCCGGAAGAGAGTGAACCAGCTGAGAGGCATCCTGAAGCTGCTGCAGCTCCTGAAGGTGCAGAACGAGGATGTGCAGAGGGCTGTGTGTGGGGCCCTGAGAAATCTGGTGTTCGAGGACAACGACAACAAGCTGGAAGTGGCCGAGCTGAACGGCGTGCCAAGACTGCTGCAGGTTCTGAAACAGACCCGCGACCTGGAAACAAAGAAGCAGATCACCGGCCTGCTCTGGAACCTGAGCAGCAACGACAAGCTGAAGAACCTGATGATCACAGAGGCCCTGCTGACCCTGACAGAGAACATCATCATCCCTTTCAGCGGCTGGCCCGAGGGCGATTACCCTAAAGCTAATGGCCTGCTGGACTTCGACATCTTCTACAACGTGACCGGCTGCCTGAGAAACATGTCTAGCGCTGGCGCCGATGGCAGAAAGGCCATGAGAAGATGTGACGGCCTGATCGACAGCCTGGTGCACTATGTGCGGGGCACAATCGCCGATTACCAGCCTGATGATAAGGCCACCGAGAACTGCGTGTGCATCCTGCACAACCTGAGCTACCAGCTGGAAGCAGAGCTGCCCGAGAAGTACAGCCAGAACATCTACATCCAGAACCGGAACATCCAGACCGACAACAACAAGAGCATCGGCTGCTTCGGCAGCCGCAGCCGGAAAGTGAAAGAACAGTACCAGGACGTGCCCATGCCTGAGGAAAAGTCTAACCCCAAAGGCGTGGAATGGCTGTGGCACAGCATCGTGATCCGGATGTACCTGAGCCTGATCGCCAAGAGCGTGCGGAATTACACCCAAGAGGCATCTCTGGGCGCCCTGCAGAATCTGACAGCAGGATCTGGCCCTATGCCTACCTCTGTGGCTCAGACCGTGGTGCAGAAAGAGTCTGGCCTGCAGCACACCCGGAAGATGCTGCATGTGGGAGATCCCAGCGTGAAGAAAACCGCCATCAGCCTGCTGAGAAACCTGAGCCGGAATCTGTCTCTGCAGAATGAGATCGCCAAAGAGACACTGCCCGACCTGGTGTCTATCATCCCTGACACCGTGCCTAGCACCGACCTGCTGATTGAGACAACAGCCAGCGCCTGCTACACCCTGAACAACATCATTCAGAACTCCTACCAGAACGCCCGCGATCTGCTGAACACAGGCGGCATCCAGAAAATCATGGCCATCTCTGCCGGCGACGCCTACGCCTCTAACAAGGCCTCTAAAGCCGCCAGCGTGCTGCTGTATTCTCTGTGGGCCCATACCGAGCTGCACCATGCCTATAAGAAGGCCCAGTTCAAAAAGACCGACTTCGTGAACAGCAGAACAGCCAAGGCCTACCACAGCCTGAAGGACTGA

하기의 서열 ID 번호 3은 PKP2 동형체 2a에 대한 아미노산 서열이다:

MAAPGAPAEYGYIRTVLGQQILGQLDSSSLALPSEAKLKLAGSSGRGGQTVKSLRIQEQVQQTLARKGRSSVGNGNLHRTSSVPEYVYNLHLVENDFVGGRSPVPKTYDMLKAGTTATYEGRWGRGTAQYSSQKSVEERSLRHPLRRLEISPDSSPERAHYTHSDYQYSQRSQAGHTLHHQESRRAALLVPPRYARSEIVGVSRAGTTSRQRHFDTYHRQYQHGSVSDTVFDSIPANPALLTYPRPGTSRSMGNLLEKENYLTAGLTVGQVRPLVPLQPVTQNRASRSSWHQSSFHSTRTLREAGPSVAVDSSGRRAHLTVGQAAAGGSGNLLTERSTFTDSQLGNADMEMTLERAVSMLEADHMLPSRISAAATFIQHECFQKSEARKRVNQLRGILKLLQLLKVQNEDVQRAVCGALRNLVFEDNDNKLEVAELNGVPRLLQVLKQTRDLETKKQITGLLWNLSSNDKLKNLMITEALLTLTENIIIPFSGWPEGDYPKANGLLDFDIFYNVTGCLRNMSSAGADGRKAMRRCDGLIDSLVHYVRGTIADYQPDDKATENCVCILHNLSYQLEAELPEKYSQNIYIQNRNIQTDNNKSIGCFGSRSRKVKEQYQDVPMPEEKSNPKGVEWLWHSIVIRMYLSLIAKSVRNYTQEASLGALQNLTAGSGPMPTSVAQTVVQKESGLQHTRKMLHVGDPSVKKTAISLLRNLSRNLSLQNEIAKETLPDLVSIIPDTVPSTDLLIETTASACYTLNNIIQNSYQNARDLLNTGGIQKIMAISAGDAYASNKASKAASVLLYSLWAHTELHHAYKKAQFKKTDFVNSRTAKAYHSLKD

하기의 서열 ID 번호 4는 PKP2 동형체 2b를 인코딩하는 코돈-최적화 cDNA 서열(5' 내지 3')이다:

ATGGCCGCCCCCGGAGCACCTGCCGAGTATGGCTACATTCGCACCGTCCTGGGACAGCAGATTCTGGGACAGCTGGATTCATCAAGCCTGGCCCTGCCTTCTGAGGCCAAGCTGAAGCTGGCAGGAAGCTCCGGAAGGGGAGGACAGACCGTGAAGAGCCTGAGAATCCAGGAGCAGGTGCAGCAGACACTGGCCCGGAAGGGCAGATCTAGCGTGGGCAACGGCAATCTGCACAGGACCTCCTCTGTGCCAGAGTACGTGTATAACCTGCACCTGGTGGAGAATGACTTCGTGGGAGGCCGCAGCCCAGTGCCAAAGACATACGATATGCTGAAGGCCGGCACCACAGCAACCTATGAGGGCAGGTGGGGAAGAGGAACAGCACAGTACAGCTCCCAGAAGTCTGTGGAGGAGCGGAGCCTGAGACACCCTCTGCGGAGACTGGAGATCAGCCCAGACTCTAGCCCTGAGAGGGCACACTATACCCACTCCGATTACCAGTATTCTCAGAGAAGCCAGGCAGGACACACACTGCACCACCAGGAGAGCAGGAGGGCCGCCCTGCTGGTGCCACCTAGATACGCCCGCTCTGAGATCGTGGGCGTGAGCAGGGCAGGAACCACATCCCGGCAGAGACACTTCGACACCTACCACAGACAGTATCAGCACGGCTCTGTGAGCGACACAGTGTTTGATTCCATCCCTGCCAACCCAGCCCTGCTGACCTATCCTCGGCCAGGCACATCCAGATCTATGGGCAACCTGCTGGAGAAGGAGAATTACCTGACCGCAGGCCTGACAGTGGGACAGGTGAGGCCCCTGGTGCCTCTGCAGCCAGTGACCCAGAATCGGGCCAGCAGATCCTCTTGGCACCAGAGCTCCTTCCACTCTACCAGGACACTGAGGGAGGCAGGACCAAGCGTGGCAGTGGACTCTAGCGGCCGGAGAGCCCACCTGACCGTGGGACAGGCAGCAGCAGGAGGATCCGGCAACCTGCTGACAGAGAGGTCCACCTTTACAGACTCTCAGCTGGGCAATGCCGATATGGAGATGACCCTGGAGAGGGCCGTGAGCATGCTGGAGGCAGACCACATGCTGCCATCCAGGATCTCTGCCGCAGCCACATTCATCCAGCACGAGTGCTTTCAGAAGTCCGAGGCAAGGAAGAGGGTGAACCAGCTGAGGGGCATCCTGAAGCTGCTGCAGCTGCTGAAGGTGCAGAACGAGGATGTGCAGAGGGCCGTGTGCGGCGCCCTGAGGAATCTGGTGTTCGAGGACAACGATAATAAGCTGGAGGTGGCAGAGCTGAACGGAGTGCCAAGGCTGCTGCAGGTGCTGAAGCAGACCCGCGACCTGGAGACAAAGAAGCAGATCACCGATCACACAGTGAACCTGCGGAGCAGAAATGGATGGCCTGGAGCAGTGGCACACGCATGCAATCCAAGCACCCTGGGAGGACAGGGAGGAAGGATCACAAGATCCGGCGTGCGGGACCAGCCTGATCAGCACGGCCTGCTGTGGAACCTGTCCTCTAATGACAAGCTGAAGAACCTGATGATCACCGAGGCCCTGCTGACCCTGACAGAGAATATCATCATCCCTTTTAGCGGCTGGCCAGAGGGCGATTATCCCAAGGCCAACGGCCTGCTGGACTTCGATATCTTTTACAACGTGACCGGCTGCCTGAGGAATATGAGCTCCGCCGGAGCAGACGGAAGAAAGGCCATGAGGCGCTGTGACGGCCTGATCGATTCCCTGGTGCACTACGTGCGGGGCACCATCGCCGATTATCAGCCCGACGATAAGGCCACAGAGAACTGCGTGTGCATCCTGCACAATCTGTCTTATCAGCTGGAGGCCGAGCTGCCTGAGAAGTACAGCCAGAACATCTATATCCAGAACAGAAATATCCAGACCGACAACAATAAGAGCATCGGCTGCTTCGGCAGCAGGTCCCGCAAGGTGAAGGAGCAGTACCAGGATGTGCCCATGCCTGAGGAGAAGTCCAATCCCAAGGGCGTGGAGTGGCTGTGGCACTCTATCGTGATCAGGATGTATCTGAGCCTGATCGCCAAGTCCGTGCGCAACTACACCCAGGAGGCATCTCTGGGCGCCCTGCAGAATCTGACAGCAGGATCTGGACCAATGCCCACCAGCGTGGCCCAGACAGTGGTGCAGAAGGAGTCCGGCCTGCAGCACACCCGGAAGATGCTGCACGTGGGCGACCCATCCGTGAAGAAGACAGCCATCTCTCTGCTGAGGAACCTGAGCCGCAATCTGTCCCTGCAGAACGAGATCGCCAAGGAGACACTGCCCGATCTGGTGAGCATCATCCCAGACACCGTGCCCTCCACAGATCTGCTGATCGAGACAACAGCCTCCGCCTGTTACACCCTGAACAATATCATCCAGAACTCTTATCAGAATGCCCGGGACCTGCTGAACACAGGCGGCATCCAGAAGATCATGGCAATCTCCGCCGGCGATGCATACGCATCTAATAAGGCCAGCAAGGCCGCCTCCGTGCTGCTGTATTCTCTGTGGGCACACACCGAGCTGCACCACGCATACAAGAAGGCCCAGTTTAAGAAGACTGATTTCGTGAATAGCAGAACAGCCAAAGCCTACCACAGCCTGAAGGAC

하기의 서열 ID 번호 5는 PKP2 동형체 2b에 대한 아미노산 서열이다:

MAAPGAPAEYGYIRTVLGQQILGQLDSSSLALPSEAKLKLAGSSGRGGQTVKSLRIQEQVQQTLARKGRSSVGNGNLHRTSSVPEYVYNLHLVENDFVGGRSPVPKTYDMLKAGTTATYEGRWGRGTAQYSSQKSVEERSLRHPLRRLEISPDSSPERAHYTHSDYQYSQRSQAGHTLHHQESRRAALLVPPRYARSEIVGVSRAGTTSRQRHFDTYHRQYQHGSVSDTVFDSIPANPALLTYPRPGTSRSMGNLLEKENYLTAGLTVGQVRPLVPLQPVTQNRASRSSWHQSSFHSTRTLREAGPSVAVDSSGRRAHLTVGQAAAGGSGNLLTERSTFTDSQLGNADMEMTLERAVSMLEADHMLPSRISAAATFIQHECFQKSEARKRVNQLRGILKLLQLLKVQNEDVQRAVCGALRNLVFEDNDNKLEVAELNGVPRLLQVLKQTRDLETKKQITDHTVNLRSRNGWPGAVAHACNPSTLGGQGGRITRSGVRDQPDQHGLLWNLSSNDKLKNLMITEALLTLTENIIIPFSGWPEGDYPKANGLLDFDIFYNVTGCLRNMSSAGADGRKAMRRCDGLIDSLVHYVRGTIADYQPDDKATENCVCILHNLSYQLEAELPEKYSQNIYIQNRNIQTDNNKSIGCFGSRSRKVKEQYQDVPMPEEKSNPKGVEWLWHSIVIRMYLSLIAKSVRNYTQEASLGALQNLTAGSGPMPTSVAQTVVQKESGLQHTRKMLHVGDPSVKKTAISLLRNLSRNLSLQNEIAKETLPDLVSIIPDTVPSTDLLIETTASACYTLNNIIQNSYQNARDLLNTGGIQKIMAISAGDAYASNKASKAASVLLYSLWAHTELHHAYKKAQFKKTDFVNSRTAKAYHSLKD

하기의 서열 ID 번호 6은 TNNT2 프로모터를 인코딩하는 핵산 서열(5' 내지 3')이다:

GTCATGGAGAAGACCCACCTTGCAGATGTCCTCACTGGGGCTGGCAGAGCCGGCAACCTGCCTAAGGCTGCTCAGTCCATTAGGAGCCAGTAGCCTGGAAGATGTCTTTACCCCCAGCATCAGTTCAAGTGGAGCAGCACATAACTCTTGCCCTCTGCCTTCCAAGATTCTGGTGCTGAGACTTATGGAGTGTCTTGGAGGTTGCCTTCTGCCCCCCAACCCTGCTCCCAGCTGGCCCTCCCAGGCCTGGGTTGCTGGCCTCTGCTTTATCAGGATTCTCAAGAGGGACAGCTGGTTTATGTTGCATGACTGTTCCCTGCATATCTGCTCTGGTTTTAAATAGCTTATCTGAGCAGCTGGAGGACCACATGGGCTTATATGGCGTGGGGTACATGTTCCTGTAGCCTTGTCCCTGGCACCTGCCAAAATAGCAGCCAACACCCCCCACCCCCACCGCCATCCCCCTGCCCCACCCGTCCCCTGTCGCACATTCCTCCCTCCGCAGGGCTGGCTCACCAGGCCCCAGCCCACATGCCTGCTTAAAGCCCTCTCCATCCTCTGCCTCACCCAGTCCCCGCTGAGACTGAGCAGACGCCTCCA

하기의 서열 ID 번호 7은 심근세포에서 PKP2 동형체 2b를 발현하기 위한 예시적인 벡터 구성이다:

GGCACTGGGCAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGACTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCACTCCCAGTTCAATTACAGCTCTTAAGGCTAGAGTACTTAATACGACTCACTATAGGCTAGCGGTACCGGTCGCCACCATGGACTACAAAGACCATGACGGTGATTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCATGGCCGCCCCCGGAGCACCTGCCGAGTATGGCTACATTCGCACCGTCCTGGGACAGCAGATTCTGGGACAGCTGGATTCATCAAGCCTGGCCCTGCCTTCTGAGGCCAAGCTGAAGCTGGCAGGAAGCTCCGGAAGGGGAGGACAGACCGTGAAGAGCCTGAGAATCCAGGAGCAGGTGCAGCAGACACTGGCCCGGAAGGGCAGATCTAGCGTGGGCAACGGCAATCTGCACAGGACCTCCTCTGTGCCAGAGTACGTGTATAACCTGCACCTGGTGGAGAATGACTTCGTGGGAGGCCGCAGCCCAGTGCCAAAGACATACGATATGCTGAAGGCCGGCACCACAGCAACCTATGAGGGCAGGTGGGGAAGAGGAACAGCACAGTACAGCTCCCAGAAGTCTGTGGAGGAGCGGAGCCTGAGACACCCTCTGCGGAGACTGGAGATCAGCCCAGACTCTAGCCCTGAGAGGGCACACTATACCCACTCCGATTACCAGTATTCTCAGAGAAGCCAGGCAGGACACACACTGCACCACCAGGAGAGCAGGAGGGCCGCCCTGCTGGTGCCACCTAGATACGCCCGCTCTGAGATCGTGGGCGTGAGCAGGGCAGGAACCACATCCCGGCAGAGACACTTCGACACCTACCACAGACAGTATCAGCACGGCTCTGTGAGCGACACAGTGTTTGATTCCATCCCTGCCAACCCAGCCCTGCTGACCTATCCTCGGCCAGGCACATCCAGATCTATGGGCAACCTGCTGGAGAAGGAGAATTACCTGACCGCAGGCCTGACAGTGGGACAGGTGAGGCCCCTGGTGCCTCTGCAGCCAGTGACCCAGAATCGGGCCAGCAGATCCTCTTGGCACCAGAGCTCCTTCCACTCTACCAGGACACTGAGGGAGGCAGGACCAAGCGTGGCAGTGGACTCTAGCGGCCGGAGAGCCCACCTGACCGTGGGACAGGCAGCAGCAGGAGGATCCGGCAACCTGCTGACAGAGAGGTCCACCTTTACAGACTCTCAGCTGGGCAATGCCGATATGGAGATGACCCTGGAGAGGGCCGTGAGCATGCTGGAGGCAGACCACATGCTGCCATCCAGGATCTCTGCCGCAGCCACATTCATCCAGCACGAGTGCTTTCAGAAGTCCGAGGCAAGGAAGAGGGTGAACCAGCTGAGGGGCATCCTGAAGCTGCTGCAGCTGCTGAAGGTGCAGAACGAGGATGTGCAGAGGGCCGTGTGCGGCGCCCTGAGGAATCTGGTGTTCGAGGACAACGATAATAAGCTGGAGGTGGCAGAGCTGAACGGAGTGCCAAGGCTGCTGCAGGTGCTGAAGCAGACCCGCGACCTGGAGACAAAGAAGCAGATCACCGATCACACAGTGAACCTGCGGAGCAGAAATGGATGGCCTGGAGCAGTGGCACACGCATGCAATCCAAGCACCCTGGGAGGACAGGGAGGAAGGATCACAAGATCCGGCGTGCGGGACCAGCCTGATCAGCACGGCCTGCTGTGGAACCTGTCCTCTAATGACAAGCTGAAGAACCTGATGATCACCGAGGCCCTGCTGACCCTGACAGAGAATATCATCATCCCTTTTAGCGGCTGGCCAGAGGGCGATTATCCCAAGGCCAACGGCCTGCTGGACTTCGATATCTTTTACAACGTGACCGGCTGCCTGAGGAATATGAGCTCCGCCGGAGCAGACGGAAGAAAGGCCATGAGGCGCTGTGACGGCCTGATCGATTCCCTGGTGCACTACGTGCGGGGCACCATCGCCGATTATCAGCCCGACGATAAGGCCACAGAGAACTGCGTGTGCATCCTGCACAATCTGTCTTATCAGCTGGAGGCCGAGCTGCCTGAGAAGTACAGCCAGAACATCTATATCCAGAACAGAAATATCCAGACCGACAACAATAAGAGCATCGGCTGCTTCGGCAGCAGGTCCCGCAAGGTGAAGGAGCAGTACCAGGATGTGCCCATGCCTGAGGAGAAGTCCAATCCCAAGGGCGTGGAGTGGCTGTGGCACTCTATCGTGATCAGGATGTATCTGAGCCTGATCGCCAAGTCCGTGCGCAACTACACCCAGGAGGCATCTCTGGGCGCCCTGCAGAATCTGACAGCAGGATCTGGACCAATGCCCACCAGCGTGGCCCAGACAGTGGTGCAGAAGGAGTCCGGCCTGCAGCACACCCGGAAGATGCTGCACGTGGGCGACCCATCCGTGAAGAAGACAGCCATCTCTCTGCTGAGGAACCTGAGCCGCAATCTGTCCCTGCAGAACGAGATCGCCAAGGAGACACTGCCCGATCTGGTGAGCATCATCCCAGACACCGTGCCCTCCACAGATCTGCTGATCGAGACAACAGCCTCCGCCTGTTACACCCTGAACAATATCATCCAGAACTCTTATCAGAATGCCCGGGACCTGCTGAACACAGGCGGCATCCAGAAGATCATGGCAATCTCCGCCGGCGATGCATACGCATCTAATAAGGCCAGCAAGGCCGCCTCCGTGCTGCTGTATTCTCTGTGGGCACACACCGAGCTGCACCACGCATACAAGAAGGCCCAGTTTAAGAAGACTGATTTCGTGAATAGCAGAACAGCCAAAGCCTACCACAGCCTGAAGGACCTCGAGGGATCTGGAGCAACAAACTTCTCACTACTCAAACAAGCAGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGGCCTAAGCTTATGAAAACCTTCAACATCTCTCAGCAGGATCTGGAGCTGGTGGAGGTCGCCACTGAGAAGATCACCATGCTCTATGAGGACAACAAGCACCATGTCGGGGCGGCCATCAGGACCAAGACTGGGGAGATCATCTCTGCTGTCCACATTGAAGCCTACATTGGCAGGGTCACTGTCTGTGCTGAAGCCATTGCCATTGGGTCTGCTGTGAGCAACGGGCAGAAGGACTTTGACACCATTGTGGCTGTCAGGCACCCCTACTCTGATGAGGTGGACAGATCCATCAGGGTGGTCAGCCCCTGTGGCATGTGTAGAGAGCTGATCTCTGACTATGCTCCTGACTGCTTTGTGCTCATTGAGATGAATGGCAAGCTGGTCAAAACCACCATTGAGGAACTCATCCCCCTCAAGTACACCAGGAACTAATAAGCGGCCGCTTCCCTTTAGTGAGGGTTAATGCTTCGAGCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTTTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTGAAAAAAATGCTTTATTTGTGAAATTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGTAACCATTATAAGCTGCAATAAACAAGTTAACAACAACAATTGCATTCATTTTATGTTTCAGGTTCAGGGGGAGATGTGGGAGGTTTTTTAAAGCAAGTAAAACCTCTACAAATGTGGTAAAATCCGATAAGGGACTAGAGCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATGGCGGGTTAATCATTAACTACAAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGAATTCCAGACGATTGAGCGTCAAAATGTAGGTATTTCCATGAGCGTTTTTCCGTTGCAATGGCTGGCGGTAATATTGTTCTGGATATTACCAGCAAGGCCGATAGTTTGAGTTCTTCTACTCAGGCAAGTGATGTTATTACTAATCAAAGAAGTATTGCGACAACGGTTAATTTGCGTGATGGACAGACTCTTTTACTCGGTGGCCTCACTGATTATAAAAACACTTCTCAGGATTCTGGCGTACCGTTCCTGTCTAAAATCCCTTTAATCGGCCTCCTGTTTAGCTCCCGCTCTGATTCTAACGAGGAAAGCACGTTATACGTGCTCGTCAAAGCAACCATAGTACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTCTACAATTTAAATATTTGCTTATACAATCTTCCTGTTTTTGGGGCTTTTCTGATTATCAACCGGGGTACATATGATTGACATGCTAGTTTTACGATTACCGTTCATCGATTCTCTTGTTTGCTCCAGACTCTCAGGCAATGACCTGATAGCCTTTGTAGAGACCTCTCAAAAATAGCTACCCTCTCCGGCATGAATTTATCAGCTAGAACGGTTG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SEQUENCE LISTING <110> UCL BUSINESS LTD <120> GENE THERAPY COMPOSITION AND TREATMENT OF RIGHT VENTRICULAR ARRHYTHMOGENIC CARDIOMYOPATHY <130> U07981WO <150> US 63/163,393 <151> 2021-03-19 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2764 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gagtccagag gcaggcgagc agctcggtcg cccccaccgg ccccatggca gcccccggcg 60 ccccagctga gtacggctac atccggaccg tcctgggcca gcagatcctg ggacaactgg 120 acagctccag cctggcgctg ccctccgagg ccaagctgaa gctggcgggg agcagcggcc 180 gcggcggcca gacagtcaag agcctgcgga tccaggagca ggtgcagcag accctcgccc 240 ggaagggccg cagctccgtg ggcaacggaa atcttcaccg aaccagcagt gttcctgagt 300 atgtctacaa cctacacttg gttgaaaatg attttgttgg aggccgttcc cctgttccta 360 aaacctatga catgctaaag gctggcacaa ctgccactta tgaaggtcgc tggggaagag 420 gaacagcaca gtacagctcc cagaagtccg tggaagaaag gtccttgagg catcctctga 480 ggagactgga gatttctcct gacagcagcc cggagagggc tcactacacg cacagcgatt 540 accagtacag ccagagaagc caggctgggc acaccctgca ccaccaagaa agcaggcggg 600 ccgccctcct agtgccaccg agatatgctc gttccgagat cgtgggggtc agccgtgctg 660 gcaccacaag caggcagcgc cactttgaca cataccacag acagtaccag catggctctg 720 ttagcgacac cgtttttgac agcatccctg ccaacccggc cctgctcacg taccccaggc 780 cagggaccag ccgcagcatg ggcaacctct tggagaagga gaactacctg acggcagggc 840 tcactgtcgg gcaggtcagg ccgctggtgc ccctgcagcc cgtcactcag aacagggctt 900 ccaggtcctc ctggcatcag agctccttcc acagcacccg cacgctgagg gaagctgggc 960 ccagtgtcgc cgtggattcc agcgggagga gagcgcactt gactgtcggc caggcggccg 1020 cagggggaag tgggaatctg ctcactgaga gaagcacttt cactgactcc cagctgggga 1080 atgcagacat ggagatgact ctggagcgag cagtgagtat gctcgaggca gaccacatgc 1140 tgccatccag gatttctgct gcagctactt tcatacagca cgagtgcttc cagaaatctg 1200 aagctcggaa gagggttaac cagcttcgtg gcatcctcaa gcttctgcag ctcctaaaag 1260 ttcagaatga agacgttcag cgagctgtgt gtggggcctt gagaaactta gtatttgaag 1320 acaatgacaa caaattggag gtggctgaac taaatggggt acctcggctg ctccaggtgc 1380 tgaagcaaac cagagacttg gagactaaaa aacaaataac aggtttgctg tggaatttgt 1440 catctaatga caaactcaag aatctcatga taacagaagc attgcttacg ctgacggaga 1500 atatcatcat ccccttttct gggtggcctg aaggagacta cccaaaagca aatggtttgc 1560 tcgattttga catattctac aacgtcactg gatgcctaag aaacatgagt tctgctggcg 1620 ctgatgggag aaaagcgatg agaagatgtg acggactcat tgactcactg gtccattatg 1680 tcagaggaac cattgcagat taccagccag atgacaaggc cacggagaat tgtgtgtgca 1740 ttcttcataa cctctcctac cagctggagg cagagctccc agagaaatat tcccagaata 1800 tctatattca aaaccggaat atccagactg acaacaacaa aagtattgga tgttttggca 1860 gtcgaagcag gaaagtaaaa gagcaatacc aggacgtgcc gatgccggag gaaaagagca 1920 accccaaggg cgtggagtgg ctgtggcatt ccattgttat aaggatgtat ctgtccttga 1980 tcgccaaaag tgtccgcaac tacacacaag aagcatcctt aggagctctg cagaacctca 2040 cggccggaag tggaccaatg ccgacatcag tggctcagac agttgtccag aaggaaagtg 2100 gcctgcagca cacccgaaag atgctgcatg ttggtgaccc aagtgtgaaa aagacagcca 2160 tctcgctgct gaggaatctg tcccggaatc tttctctgca gaatgaaatt gccaaagaaa 2220 ctctccctga tttggtttcc atcattcctg acacagtccc gagtactgac cttctcattg 2280 aaactacagc ctctgcctgt tacacattga acaacataat ccaaaacagt taccagaatg 2340 cacgcgacct tctaaacacc gggggcatcc agaaaattat ggccattagt gcaggcgatg 2400 cctatgcctc caacaaagca agtaaagctg cttccgtcct tctgtattct ctgtgggcac 2460 acacggaact gcatcatgcc tacaagaagg ctcagtttaa gaagacagat tttgtcaaca 2520 gccggactgc caaagcctac cactccctta aagactgagg aaaatgacaa agtattctcg 2580 gctgcaaaaa tccccaaagg aaaacaccta tttttctact acccagccca agaaacctca 2640 aaagcatgcc ttgtttctat ccttctctat ttccgtggtc ccctgaatcc agaaaacaaa 2700 tagaacataa ttttatgagt cttccagaag acctttgcaa gtttgccacc agtagatacc 2760 ggcc 2764 <210> 2 <211> 2514 <212> DNA <213> artificial <220> <223> codon-optimized cDNA encoding PKP2a <400> 2 atggctgctc ctggtgctcc tgccgagtac ggctacatca gaacagtgct gggccagcag 60 atcctgggac agctggattc tagctctctg gccctgcctt ctgaggccaa gctgaaactg 120 gccggcagtt ctggaagagg cggccagaca gtgaagtccc tgcggatcca agaacaggtg 180 cagcagaccc tggccagaaa gggcagatct tctgtcggca acggcaacct gcacagaacc 240 agctctgtgc ccgagtacgt gtacaatctg cacctggtgg aaaacgactt cgtcggcggc 300 agatcccctg tgcctaagac ctacgatatg ctgaaggccg gcaccaccgc cacctatgaa 360 ggcagatggg gaagaggcac agcccagtac agcagccaga aaagcgtgga agagagaagc 420 ctgcggcacc ctctgcggag actggaaatc agccctgata gcagcccaga gagagcccac 480 tacacccaca gcgactacca gtactcccag agatctcagg ccggccacac actgcaccac 540 caagagtcta gaagggccgc tctgctggtg cctcctagat acgccagatc tgagatcgtg 600 ggcgtgtcca gagccggcac aacaagcaga cagagacact tcgacaccta ccaccggcag 660 tatcagcacg gcagcgtgtc cgataccgtg ttcgatagca tccccgccaa tcctgctctg 720 ctgacatacc ctagacctgg cacctccaga tccatgggca atctgctgga aaaagagaac 780 tacctgaccg ccggactgac cgtgggacaa gttcgacctc tggttcctct gcagcccgtg 840 acacagaaca gagccagcag aagcagctgg caccagtcca gcttccacag caccagaaca 900 ctgagagaag ctggccctag cgtggccgtg gattcttctg gtagaagggc tcacctgaca 960 gttggccaag cagctgcagg cggaagcgga aatctgctga ccgagagaag caccttcacc 1020 gacagccagc tgggcaacgc cgacatggaa atgacactgg aacgggccgt gtccatgctg 1080 gaagccgatc acatgctgcc cagcagaatt agcgccgctg ccacctttat ccagcacgag 1140 tgcttccaga agtctgaggc ccggaagaga gtgaaccagc tgagaggcat cctgaagctg 1200 ctgcagctcc tgaaggtgca gaacgaggat gtgcagaggg ctgtgtgtgg ggccctgaga 1260 aatctggtgt tcgaggacaa cgacaacaag ctggaagtgg ccgagctgaa cggcgtgcca 1320 agactgctgc aggttctgaa acagacccgc gacctggaaa caaagaagca gatcaccggc 1380 ctgctctgga acctgagcag caacgacaag ctgaagaacc tgatgatcac agaggccctg 1440 ctgaccctga cagagaacat catcatccct ttcagcggct ggcccgaggg cgattaccct 1500 aaagctaatg gcctgctgga cttcgacatc ttctacaacg tgaccggctg cctgagaaac 1560 atgtctagcg ctggcgccga tggcagaaag gccatgagaa gatgtgacgg cctgatcgac 1620 agcctggtgc actatgtgcg gggcacaatc gccgattacc agcctgatga taaggccacc 1680 gagaactgcg tgtgcatcct gcacaacctg agctaccagc tggaagcaga gctgcccgag 1740 aagtacagcc agaacatcta catccagaac cggaacatcc agaccgacaa caacaagagc 1800 atcggctgct tcggcagccg cagccggaaa gtgaaagaac agtaccagga cgtgcccatg 1860 cctgaggaaa agtctaaccc caaaggcgtg gaatggctgt ggcacagcat cgtgatccgg 1920 atgtacctga gcctgatcgc caagagcgtg cggaattaca cccaagaggc atctctgggc 1980 gccctgcaga atctgacagc aggatctggc cctatgccta cctctgtggc tcagaccgtg 2040 gtgcagaaag agtctggcct gcagcacacc cggaagatgc tgcatgtggg agatcccagc 2100 gtgaagaaaa ccgccatcag cctgctgaga aacctgagcc ggaatctgtc tctgcagaat 2160 gagatcgcca aagagacact gcccgacctg gtgtctatca tccctgacac cgtgcctagc 2220 accgacctgc tgattgagac aacagccagc gcctgctaca ccctgaacaa catcattcag 2280 aactcctacc agaacgcccg cgatctgctg aacacaggcg gcatccagaa aatcatggcc 2340 atctctgccg gcgacgccta cgcctctaac aaggcctcta aagccgccag cgtgctgctg 2400 tattctctgt gggcccatac cgagctgcac catgcctata agaaggccca gttcaaaaag 2460 accgacttcg tgaacagcag aacagccaag gcctaccaca gcctgaagga ctga 2514 <210> 3 <211> 837 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Ala Pro Gly Ala Pro Ala Glu Tyr Gly Tyr Ile Arg Thr Val 1 5 10 15 Leu Gly Gln Gln Ile Leu Gly Gln Leu Asp Ser Ser Ser Leu Ala Leu 20 25 30 Pro Ser Glu Ala Lys Leu Lys Leu Ala Gly Ser Ser Gly Arg Gly Gly 35 40 45 Gln Thr Val Lys Ser Leu Arg Ile Gln Glu Gln Val Gln Gln Thr Leu 50 55 60 Ala Arg Lys Gly Arg Ser Ser Val Gly Asn Gly Asn Leu His Arg Thr 65 70 75 80 Ser Ser Val Pro Glu Tyr Val Tyr Asn Leu His Leu Val Glu Asn Asp 85 90 95 Phe Val Gly Gly Arg Ser Pro Val Pro Lys Thr Tyr Asp Met Leu Lys 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Ala Thr Tyr Glu Gly Arg Trp Gly Arg Gly Thr Ala 115 120 125 Gln Tyr Ser Ser Gln Lys Ser Val Glu Glu Arg Ser Leu Arg His Pro 130 135 140 Leu Arg Arg Leu Glu Ile Ser Pro Asp Ser Ser Pro Glu Arg Ala His 145 150 155 160 Tyr Thr His Ser Asp Tyr Gln Tyr Ser Gln Arg Ser Gln Ala Gly His 165 170 175 Thr Leu His His Gln Glu Ser Arg Arg Ala Ala Leu Leu Val Pro Pro 180 185 190 Arg Tyr Ala Arg Ser Glu Ile Val Gly Val Ser Arg Ala Gly Thr Thr 195 200 205 Ser Arg Gln Arg His Phe Asp Thr Tyr His Arg Gln Tyr Gln His Gly 210 215 220 Ser Val Ser Asp Thr Val Phe Asp Ser Ile Pro Ala Asn Pro Ala Leu 225 230 235 240 Leu Thr Tyr Pro Arg Pro Gly Thr Ser Arg Ser Met Gly Asn Leu Leu 245 250 255 Glu Lys Glu Asn Tyr Leu Thr Ala Gly Leu Thr Val Gly Gln Val Arg 260 265 270 Pro Leu Val Pro Leu Gln Pro Val Thr Gln Asn Arg Ala Ser Arg Ser 275 280 285 Ser Trp His Gln Ser Ser Phe His Ser Thr Arg Thr Leu Arg Glu Ala 290 295 300 Gly Pro Ser Val Ala Val Asp Ser Ser Gly Arg Arg Ala His Leu Thr 305 310 315 320 Val Gly Gln Ala Ala Ala Gly Gly Ser Gly Asn Leu Leu Thr Glu Arg 325 330 335 Ser Thr Phe Thr Asp Ser Gln Leu Gly Asn Ala Asp Met Glu Met Thr 340 345 350 Leu Glu Arg Ala Val Ser Met Leu Glu Ala Asp His Met Leu Pro Ser 355 360 365 Arg Ile Ser Ala Ala Ala Thr Phe Ile Gln His Glu Cys Phe Gln Lys 370 375 380 Ser Glu Ala Arg Lys Arg Val Asn Gln Leu Arg Gly Ile Leu Lys Leu 385 390 395 400 Leu Gln Leu Leu Lys Val Gln Asn Glu Asp Val Gln Arg Ala Val Cys 405 410 415 Gly Ala Leu Arg Asn Leu Val Phe Glu Asp Asn Asp Asn Lys Leu Glu 420 425 430 Val Ala Glu Leu Asn Gly Val Pro Arg Leu Leu Gln Val Leu Lys Gln 435 440 445 Thr Arg Asp Leu Glu Thr Lys Lys Gln Ile Thr Gly Leu Leu Trp Asn 450 455 460 Leu Ser Ser Asn Asp Lys Leu Lys Asn Leu Met Ile Thr Glu Ala Leu 465 470 475 480 Leu Thr Leu Thr Glu Asn Ile Ile Ile Pro Phe Ser Gly Trp Pro Glu 485 490 495 Gly Asp Tyr Pro Lys Ala Asn Gly Leu Leu Asp Phe Asp Ile Phe Tyr 500 505 510 Asn Val Thr Gly Cys Leu Arg Asn Met Ser Ser Ala Gly Ala Asp Gly 515 520 525 Arg Lys Ala Met Arg Arg Cys Asp Gly Leu Ile Asp Ser Leu Val His 530 535 540 Tyr Val Arg Gly Thr Ile Ala Asp Tyr Gln Pro Asp Asp Lys Ala Thr 545 550 555 560 Glu Asn Cys Val Cys Ile Leu His Asn Leu Ser Tyr Gln Leu Glu Ala 565 570 575 Glu Leu Pro Glu Lys Tyr Ser Gln Asn Ile Tyr Ile Gln Asn Arg Asn 580 585 590 Ile Gln Thr Asp Asn Asn Lys Ser Ile Gly Cys Phe Gly Ser Arg Ser 595 600 605 Arg Lys Val Lys Glu Gln Tyr Gln Asp Val Pro Met Pro Glu Glu Lys 610 615 620 Ser Asn Pro Lys Gly Val Glu Trp Leu Trp His Ser Ile Val Ile Arg 625 630 635 640 Met Tyr Leu Ser Leu Ile Ala Lys Ser Val Arg Asn Tyr Thr Gln Glu 645 650 655 Ala Ser Leu Gly Ala Leu Gln Asn Leu Thr Ala Gly Ser Gly Pro Met 660 665 670 Pro Thr Ser Val Ala Gln Thr Val Val Gln Lys Glu Ser Gly Leu Gln 675 680 685 His Thr Arg Lys Met Leu His Val Gly Asp 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Claims

피험자의 심근병증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 피험자의 심근세포에 유전자 치료 벡터의 치료 용량을 전달하는 단계를 포함하며, 상기 심근세포는 플라코필린-2(PKP2)에 대해 반수체 기능 부전이고, 상기 유전자 치료 벡터는 PKP2 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 유전자 치료 벡터를 상기 심근세포에 전달하면 상기 심근세포에 의한 PKP2의 총 데스모좀 발현이 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배 또는 5배 증가되는, 방법.
피험자의 심근병증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 피험자의 심근세포에 유전자 치료 벡터의 치료 용량을 전달하는 단계를 포함하며, 상기 심근세포는 플라코필린-2(PKP2)에 대해 반수체 기증 부전이고, 상기 유전자 치료 벡터는 PKP2 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 유전자 치료 벡터를 상기 심근세포에 전달하면 비-반수체 기능 부전 심근세포에 의한 총 데스모좀 발현의 적어도 50%인 상기 PKP2의 총 데스모좀 발현이 발생하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 치료 벡터는 바이러스 벡터를 포함하는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 이들의 변이체, 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV6 또는 AAV9를 포함하는, 방법.
제3항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV6를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 심장별 프로모터를 추가로 인코딩하는, 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 용량은 상기 피험자의 상기 심근세포에 의한 상기 PKP2 또는 이의 기능적 변이체의 생성에 영향을 줌으로써 부정맥성 우심실 심근병증(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy; ARVC)을 치료하거나 예방하는 데 효과적인, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료 용량의 전달은 정맥 내로 수행되는, 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 인간 피험자인, 방법.
피험자의 심근세포 내의 핵산 서열을 발현하도록 적응된 유전자 치료 벡터로서, 상기 핵산 서열은,
PKP2 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 제1 서열; 및
심장별 프로모터를 포함하는 제2 서열을 포함하며,
PKP2와 관련하여 반수체 기능 부전인 심근세포에 상기 유전자 치료 벡터를 전달하면 상기 심근세포에 의한 PKP2의 총 데스모좀 발현이 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배 또는 5배 증가하는, 유전자 치료 벡터.
피험자의 심근세포 내의 핵산 서열을 발현하도록 적응된 유전자 치료 벡터로서, 상기 핵산 서열은,
PKP2 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 제1 서열; 및
심장별 프로모터를 포함하는 제2 서열을 포함하며,
상기 유전자 치료 벡터를 반수체 기능 부전인 심근세포에 전달하면 비-반수체 기능 부전 심근세포에 의한 총 데스모좀 발현의 적어도 50%인 상기 PKP2의 총 데스모좀 발현이 발생하는, 유전자 치료 벡터.
제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 유전자 치료 벡터는 바이러스 벡터를 포함하는, 유전자 치료 벡터.
제13항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, 이들의 변이체, 및 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는, 유전자 치료 벡터.
제13항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV6 또는 AAV9를 포함하는, 유전자 치료 벡터.
제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 심장별 프로모터는 TNNT2 또는 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 70% 유사성을 갖는 기능적 서열을 포함하는, 유전자 치료 벡터.
제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 인간 피험자인, 유전자 치료 벡터.
피험자의 심근병증을 치료 또는 예방하기 위한 치료 제형으로서, 상기 치료 제형은,
약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체; 및
PKP2 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함하며,
PKP2와 관련하여 반수체 기능 부전인 심근세포에 상기 치료 제형을 전달하면 상기 심근세포에 의한 PKP2의 총 데스모좀 발현이 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배 또는 5배 증가하는, 치료 제형.
피험자의 심근병증을 치료 또는 예방하기 위한 치료 제형으로서, 상기 치료 제형은,
약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체; 및
PKP2 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 바이러스 벡터를 포함하며,
상기 치료 제형을 반수체 기능 부전인 심근세포에 전달하면 비-반수체 기능 부전 심근세포에 의한 총 데스모좀 발현의 적어도 50%인 상기 PKP2의 총 데스모좀 발현이 발생하는, 치료 제형.
제18항 또는 제19항에 있어서,
하나 이상의 비-PKP2 육종 단백질 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 각각 포함하는 하나 이상의 추가 바이러스 벡터를 더 포함하는, 치료 제형.
제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피험자는 인간 피험자인, 치료 제형.
기능적 PKP2 또는 이의 기능적 변이체를 발현하기 위해 돌연변이된 PKP2 유전자를 갖는 심근세포를 유전적으로 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은,
상기 기능적 PKP2를 인코딩하는 핵산 서열로 상기 심근세포를 형질감염 또는 형질도입시키는 단계를 포함하며, 상기 형질감염 또는 형질도입은 상기 심근세포에 의해 상기 기능적 PKP2의 총 데스모좀 발현을 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배 또는 5배 증가시키는, 방법.
기능적 PKP2 또는 이의 기능적 변이체를 발현하기 위해 돌연변이된 PKP2 유전자를 갖는 심근세포를 유전적으로 변형시키는 방법으로서, 상기 방법은,
상기 기능적 PKP2를 인코딩하는 핵산 서열로 상기 심근세포를 형질감염 또는 형질도입시키는 단계를 포함하며, 상기 형질감염 또는 형질도입은 비-돌연변이된 PKP2 유전자를 갖는 심근세포에 의한 총 데스모좀 발현의 적어도 50%인 상기 기능적 PKP2의 총 데스모좀 발현이 발생하는, 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 핵산 서열은 AAV6 또는 AAV9를 포함하는 바이러스 벡터를 통해 전달되는, 방법.
제24항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 AAV6를 포함하는, 방법.
제22항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 서열은 심장별 프로모터를 추가로 인코딩하는, 방법.
제26항에 있어서, 상기 심장별 프로모터는 TNNT2 또는 적어도 99%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75% 또는 70% 유사성을 갖는 기능적 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제10항 또는 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PKP2는 PKP2 동형체 2a인, 방법.
제1항 내지 제10항 또는 제22항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PKP2가 PKP2 동형체 2b인, 방법.
제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PKP2는 PKP2 동형체 2a인, 유전자 치료 벡터 또는 치료 제형.
제11항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PKP2는 PKP2 동형체 2b인, 유전자 치료 벡터 또는 치료 제형.
피험자의 심근병증을 치료 또는 예방하기 위한 치료 제형으로서, 상기 치료 제형은,
약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체;
PKP2 동형체 2a 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 바이러스 벡터; 및
PKP2 동형체 2b 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 바이러스 벡터를 포함하며,
PKP2 동형체 2a 또는 동형체 2b와 관련하여 반수체 기능 부전인 심근세포에 상기 치료 제형을 전달하면 상기 심근세포에 의한 PKP2 동형체 2a 또는 동형체 2b의 총 데스모좀 발현이 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배 또는 5배 증가하는, 치료 제형.
피험자의 심근병증을 치료 또는 예방하기 위한 치료 제형으로서, 상기 치료 제형은,
약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체;
PKP2 동형체 2a 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제1 바이러스 벡터;
PKP2 동형체 2b 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 제2 바이러스 벡터를 포함하며,
상기 치료 제형 벡터를 반수체 기능 부전인 심근세포에 전달하면 비-반수체 기능 부전 심근세포에 의한 총 데스모좀 발현의 적어도 50%인 PKP2 동형체 2a 또는 동형체 2b의 총 데스모좀 발현이 발생하는, 치료 제형.
제11항 내지 제17항 중 어느 한 항의 유전자 치료 벡터로 형질도입된 격리 세포.
제34항에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인, 격리 세포.
제34항에 있어서, 상기 세포는 심장 세포인, 격리 세포.
제34항에 있어서, 상기 세포는 인간 유도 다능성 줄기 세포 유래 심근세포인, 격리 세포.
돌연변이된 PKP2 유전자를 갖는 심근세포에서 하나 이상의 데스모좀 단백질을 상향조절하는 방법으로서, 상기 방법은,
PKP2 동형체 2a 및 PKP2 동형체 2b로부터 선택된 기능적 PKP2를 인코딩하는 핵산 서열로 상기 심장세포를 형질감염 또는 형질도입하는 단계를 포함하며, 상기 형질감염 또는 형질도입은 상기 하나 이상의 데스포좀 단백질 각각의 총 데스모좀 발현이 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배 또는 5배 증가하고, 상기 하나 이상의 데스포좀 단백질은 데스모플라킨 1, 데스모플라킨 2, 데스모콜린 2, 플라코글로빈, 데스모글레인 2 및 코넥신 43으로부터 선택되는, 방법.
피험자의 심근병증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 피험자의 심근세포에 유전자 치료 벡터의 치료 용량을 전달하는 단계를 포함하며, 상기 심근세포는 플라코필린-2(PKP2)에 대해 반수체 기증 부전이고, 상기 유전자 치료 벡터는 비-우세 PKP2 동형체 또는 이의 기능적 변이체를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하고, 상기 유전자 치료 벡터를 상기 심근세포에 전달하면 상기 심근세포에 의한 PKP2의 총 데스모좀 발현이 적어도 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 4배 또는 5배 증가되고, 상기 PKP2의 상기 총 데스모좀 발현은 우세 PKP2 동형체 및 상기 비-우세 PKP2 동형체의 발현을 포함하는, 방법.
제39항에 있어서, 상기 우세 PKP2 동형체는 PKP2 동형체 2a이고, 상기 비-우세 PKP2 동형체는 PKP2 동형체 2b인, 방법.