JP2024512483A - 遺伝子治療組成物及び不整脈原性右室心筋症の治療 - Google Patents
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Abstract
ヒト対象において心筋症を治療または予防する組成物及び方法が開示される。いくつかの実施形態では、方法は、治療用量の遺伝子治療ベクターをヒト対象の心筋細胞に送達することを含み、遺伝子治療ベクターは、ＰＫＰ２をコードする核酸配列を含む。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本発明は、２０２１年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／１６３，３９３号の優先権の利益を主張するものであり、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、２０２１年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／１６３，３９３号の優先権の利益を主張するものであり、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、心疾患（例えば、心臓ミオパチー）の治療、特に、心筋症の治療のための遺伝子治療方法及び医薬組成物に関する。
心不全などの様々な心臓病の治療における薬理学的な進歩にも関わらず、死亡率及び罹患率は容認できないほど高いままである。さらに、特定の治療アプローチは、多くの患者（例えば、他の共存疾患に関連する進行した心不全状態を有する患者）には適していない。遺伝子治療及び細胞治療などの代替アプローチは、多くの心疾患の根本原因の発病機序に対処する上で独自に調整され、効果的である可能性があるため、ますます注目を集めている。
本発明の目的は、治療用ポリヌクレオチド配列をヒト対象などの対象の心筋細胞に送達する方法を提供することである。
本発明の特定の実施形態のさらなる目的は、プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列をアデノ随伴ウイルスなどのウイルスベクターにベクター化することである。
本発明の特定の実施形態のさらなる目的は、ＰＫＰ２が変異した心筋細胞におけるハプロ不全を修正するために遺伝子治療方法を利用することである。
本発明の特定の実施形態のさらなる目的は、ＰＫＰ２に関してハプロ不全の細胞における機能的ＰＫＰ２タンパク質の発現を増加させることである。
上記目的及び他は、少なくとも１つの態様が対象（例えば、ヒト対象）において心筋症を治療または予防する方法を対象とする本発明によって満たされる。方法は、例えば、治療用量の遺伝子治療ベクターを対象の心筋細胞に送達することを含み、遺伝子治療ベクターは、ＰＫＰ２をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）に関してハプロ不全の心筋細胞への遺伝子治療ベクターの送達は、心筋細胞によるＰＫＰ２のデスモソーム発現の少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、心筋細胞への遺伝子治療ベクターの送達は、非ハプロ不全心筋細胞によるデスモソーム発現の少なくとも５０％である、ＰＫＰ２のデスモソーム発現をもたらす。
少なくとも１つの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ウイルスベクターを含む。少なくとも１つの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、それらの変異体、及びそれらの組み合わせの１つまたは複数を含む。少なくとも１つの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９を含む。少なくとも１つの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ６を含む。
少なくとも１つの実施形態では、核酸配列は、心臓特異的プロモーターをさらにコードする。
少なくとも１つの実施形態では、治療用量は、対象の心筋細胞によるＰＫＰ２またはその機能的変異体の産生を引き起こすことによって不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）を治療または予防するのに有効である。
少なくとも１つの実施形態では、治療用量の送達は、静脈内に行われる。
少なくとも１つの実施形態では、対象は、ヒト対象である。
別の態様では、遺伝子治療ベクターは、対象の心筋細胞内で核酸配列を発現させるために適合される。少なくとも１つの実施形態では、核酸配列は、ＰＫＰ２またはその機能的変異体をコードする第１の配列と、心臓特異的プロモーターを含む第２の配列とを含む。少なくとも１つの実施形態では、ＰＫＰ２に関してハプロ不全の心筋細胞への遺伝子治療ベクターの送達は、心筋細胞によるＰＫＰ２の総デスモソーム発現の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍の増加をもたらす。少なくとも１つの実施形態では、ハプロ不全の心筋細胞への遺伝子治療ベクターの送達は、非ハプロ不全心筋細胞による総デスモソーム発現の少なくとも５０％である、ＰＫＰ２の総デスモソーム発現をもたらす。
少なくとも１つの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ウイルスベクターを含む。少なくとも１つの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、それらの変異体、及びそれらの組み合わせの１つまたは複数を含む。少なくとも１つの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９を含む。
少なくとも１つの実施形態では、心臓特異的プロモーターは、ＴＮＮＴ２または少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、もしくは７０％の類似性を有する機能的配列を含む。
少なくとも１つの実施形態では、対象は、ヒト対象である。
別の態様では、治療用製剤は、対象において心筋症を治療または予防するために製剤化される。少なくとも１つの実施形態では、治療用製剤は、薬学的に許容される賦形剤または担体と、ＰＫＰ２またはその機能的変異体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターとを含む。少なくとも１つの実施形態では、ＰＫＰ２に関してハプロ不全の心筋細胞への治療用製剤の送達は、心筋細胞によるＰＫＰ２の総デスモソーム発現の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍の増加をもたらす。少なくとも１つの実施形態では、ハプロ不全の心筋細胞への治療用製剤ベクターの送達は、非ハプロ不全心筋細胞による総デスモソーム発現の少なくとも５０％である、ＰＫＰ２の総デスモソーム発現をもたらす。
少なくとも１つの実施形態では、治療用製剤は、それぞれが１つまたは複数の非ＰＫＰ２サルコメアタンパク質もしくはその機能的変異体をコードする核酸配列を含む１つまたは複数の追加のウイルスベクターをさらに含む。少なくとも１つの実施形態では、対象は、ヒト対象である。
別の態様では、変異したＰＫＰ２遺伝子を有する心筋細胞を機能的ＰＫＰ２またはその機能的変異体を発現するよう遺伝子改変する方法は、心筋細胞に機能的ＰＫＰ２をコードする核酸配列をトランスフェクトまたは形質導入することを含み、トランスフェクションまたは形質導入は、心筋細胞による機能的ＰＫＰ２の総デスモソーム発現の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍の増加をもたらす。少なくとも１つの実施形態では、トランスフェクションまたは形質導入は、変異していないＰＫＰ２遺伝子を有する心筋細胞による総デスモソーム発現の少なくとも５０％である、機能的ＰＫＰ２の総デスモソーム発現をもたらす。
少なくとも１つの実施形態では、核酸配列は、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９を含むウイルスベクターにより送達される。少なくとも１つの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ６を含む。
少なくとも１つの実施形態では、核酸配列は、心臓特異的プロモーターをさらにコードする。少なくとも１つの実施形態では、心臓特異的プロモーターは、ＴＮＮＴ２または少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、もしくは７０％の類似性を有する機能的配列を含む。
少なくとも１つの実施形態では、任意の上記の方法または製剤のＰＫＰ２は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａである。
少なくとも１つの実施形態では、任意の上記の方法または製剤のＰＫＰ２は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂである。
別の態様では、対象において心筋症を治療または予防するための治療用製剤は、薬学的に許容される賦形剤または担体と、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａまたはその機能的変異体をコードする核酸配列を含む第１のウイルスベクターと、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂまたはその機能的変異体をコードする核酸配列を含む第２のウイルスベクターとを含む。少なくとも１つの実施形態では、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａまたはアイソフォーム２ｂに関してハプロ不全の心筋細胞への治療用製剤の送達は、心筋細胞によるＰＫＰ２アイソフォーム２ａまたはアイソフォーム２ｂの総デスモソーム発現の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍の増加をもたらす。少なくとも１つの実施形態では、ハプロ不全の心筋細胞への治療用製剤ベクターの送達は、非ハプロ不全心筋細胞による総デスモソーム発現の少なくとも５０％である、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａまたはアイソフォーム２ｂの総デスモソーム発現をもたらす。
別の態様では、単離細胞は、上記の実施形態のいずれかの遺伝子治療ベクターを形質導入される。少なくとも１つの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。少なくとも１つの実施形態では、細胞は、心臓細胞である。少なくとも１つの実施形態では、細胞は、ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞である。
別の態様では、変異したＰＫＰ２遺伝子を有する心筋細胞において１つまたは複数のデスモソームタンパク質をアップレギュレートする方法は、心筋細胞にＰＫＰ２アイソフォーム２ａ及びＰＫＰ２アイソフォーム２ｂから選択される機能的ＰＫＰ２をコードする核酸配列をトランスフェクトまたは形質導入することを含み、トランスフェクションまたは形質導入は、１つまたは複数のデスモソームタンパク質のそれぞれの総デスモソーム発現の少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍の増加をもたらし、１つまたは複数のデスモソームタンパク質は、デスモプラキン１、デスモプラキン２、デスモコリン２、プラコグロビン、デスモグレイン２、及びコネキシン４３から選択される。
別の態様では、対象において心筋症を治療または予防する方法は、治療用量の遺伝子治療ベクターを対象の心筋細胞に送達することを含み、心筋細胞は、プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）に関してハプロ不全であり、遺伝子治療ベクターは、非優性ＰＫＰ２アイソフォームまたはその機能的変異体をコードする核酸配列を含み、心筋細胞への遺伝子治療ベクターの送達は、心筋細胞によるＰＫＰ２の総デスモソーム発現の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍の増加をもたらし、ＰＫＰ２の総デスモソーム発現は、優性ＰＫＰ２アイソフォーム及び非優性ＰＫＰ２アイソフォームの発現を含む。少なくとも１つの実施形態では、優性ＰＫＰ２アイソフォームは、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａであり、非優性ＰＫＰ２アイソフォームは、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂである。
本開示の上記及び他の特徴、その本質及び様々な利点は、添付図面と関連して解釈される以下の発明を実施するための形態を検討すると明らかになる。
定義
本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別途指示しない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「薬物」への言及は、単一の薬物だけでなく、２つ以上の異なる薬物の混合物も含み、「ウイルスベクター」への言及は、単一のウイルスベクターだけでなく、２つ以上の異なるウイルスベクターの混合物なども含む。
本明細書において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別途指示しない限り、複数形の言及を含む。したがって、例えば、「薬物」への言及は、単一の薬物だけでなく、２つ以上の異なる薬物の混合物も含み、「ウイルスベクター」への言及は、単一のウイルスベクターだけでなく、２つ以上の異なるウイルスベクターの混合物なども含む。
また、本明細書で使用される場合、「ａｂｏｕｔ（約）」は、測定された量に関して使用されるときには、測定を行い、測定の目的及び測定装置の精度に見合ったレベルの注意を払う際に当業者が予測する、その測定された量の通常の変動を指す。特定の実施形態では、用語「約」は記載された数字±１０％を含み、したがって、「約１０」は９～１１を含むであろう。
また、本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」は、当該技術分野における通常の慣用的な意味を有し、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子などの任意のポリマー核酸、ならびに当業者に既知の化学誘導体を含む。ポリヌクレオチドは、治療用タンパク質をコードするものを含むだけでなく、当技術分野で既知の技術を使用して標的核酸配列の発現を減少させるために使用できる配列も含む（例えば、アンチセンス、干渉、または低分子干渉核酸）。ポリヌクレオチドはまた、心血管系の細胞内での標的核酸配列の発現または標的タンパク質の産生を開始または増加させるために使用することもできる。標的の核酸及びタンパク質は、標的組織で通常検出される核酸及びタンパク質、そのような自然に存在する核酸もしくはタンパク質の誘導体、標的組織で通常検出されない自然に存在する核酸もしくはタンパク質、または合成核酸もしくはタンパク質を含むが、これらに限定されない。１つまたは複数のポリヌクレオチドは、組み合わせて使用し、同時に及び／または連続して投与して１つまたは複数の標的核酸配列またはタンパク質を増加及び／または減少させることができる。
また、本明細書で使用される場合、「外来性」核酸または遺伝子は、例えば、ウイルスベクターでは自然には見られないなど、核酸導入に利用されるベクター内に本来は存在しないものであるが、用語は、患者または宿主に自然に存在するタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸を除外することを意図しない。
また、本明細書で使用される場合、「心臓細胞」は、心筋細胞、心臓血管系の細胞、または心臓弁内に存在する細胞など、心臓の構造を維持するか、または心臓の機能を提供することに関与する心臓の任意の細胞を含む。心臓細胞には、心筋細胞（正常な電気特性と異常な電気特性の両方を有する）、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、伝導組織の細胞、心臓ペースメーカ細胞及びニューロンを含む。
また、本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」は、すべてのサブタイプ、血清型、及び偽型、ならびに自然発生型及び組み換え型を包含する。様々なＡＡＶ血清型及び株は、当技術分野で既知であり、ＡＴＣＣ及び学術的または商業的な情報源などの情報源から公的に入手可能である。代わりに、公開されている、及び／または様々なデータベースから入手可能なＡＡＶ血清型及び株からの配列は、既知の技術を使用して合成し得る。
また、本明細書で使用される場合、「血清型」は、規定の抗血清とのカプシドタンパク質の反応性に基づいて他のＡＡＶによって同定され、他のＡＡＶから区別されるＡＡＶを指す。ヒトＡＡＶは、ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２を含む少なくとも１２の既知の血清型があるが、さらなる血清型が発見され続けており、新たに発見された血清型の使用が企図されている。
また、本明細書で使用される場合、「偽型」ＡＡＶは、１つの血清型のカプシドタンパク質と、異なるまたは異種の血清型の５’及び３’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含むウイルスゲノムとを含むＡＡＶを指す。偽型組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、カプシド血清型の細胞表面結合特性及びＩＴＲ血清型と一致する遺伝的特性を有することが期待されるであろう。偽型ｒＡＡＶは、カプシドタンパク質がＩＴＲの血清型（複数可）にとって異種の血清型である限り、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドタンパク質、及びＡＡＶ１～ＡＡＶ１２の任意の霊長類ＡＡＶ血清型を含む任意の血清型のＡＡＶからのＩＴＲを含み得る。偽型ｒＡＡＶでは、５’及び３’ＩＴＲは、同一または異種であってよい。偽型ｒＡＡＶは、当該技術分野で説明される標準的な技術を使用して生成される。
また、本明細書で使用される場合、「キメラの」ｒＡＡＶベクターは異種カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターを包含する。すなわち、ｒＡＡＶベクターは、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３が、すべて同じ血清型のＡＡＶではないように、そのカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３に関してキメラであってよい。本明細書で使用されるキメラＡＡＶは、例えばＡＡＶ１及びＡＡＶ２からのカプシドタンパク質を含むが、これらに限定されないカプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３が血清型で異なるか、他のパルボウイルスのカプシドタンパク質の混合物であるか、または他のウイルスタンパク質、もしくは例えばＡＡＶの所望の細胞または組織への送達を標的とするタンパク質などの他のタンパク質を含むように、ＡＡＶを包含する。本明細書で使用されるキメラｒＡＡＶはまた、キメラ５’及び３’ＩＴＲを含むｒＡＡＶも包含する。
また、本明細書で使用される場合「薬学的に許容される賦形剤または担体」は、製剤中の活性剤と結合された組成物中の任意の不活性成分を指す。薬学的に許容される賦形剤は、炭水化物（グルコース、スクロース、またはデキストランなど）、抗酸化剤（アスコルビン酸またはグルタチオンなど）、キレート剤、低分子量タンパク質、高分子量ポリマー、ゲル形成剤、またはその他の安定剤及び添加剤を含む場合があるがこれらに限定されない。薬学的に許容される担体の他の例は、湿潤剤、乳化剤、分散剤、または微生物の増殖もしくは作用を防止するのに特に有用である保存剤を含む。様々な保存剤は周知であり、例えばフェノール及びアスコルビン酸を含む。担体、安定剤または補助剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ ｅｄ．（１９８５）に記載されている。
また、本明細書で使用される場合、「患者」は、特定の症状または治療の必要性を示唆する症状の臨床兆候を提示しているか、状態について予防的に治療されているか、または治療されるべき状態があると診断されている対象、特にヒトを指す（が、ヒト以外も包含するであろう）。
また、本明細書で使用される場合、「対象」は、用語「患者」の定義を包含し、他の点では健康な個人を除外しない。
また、本明細書で使用される場合、「の治療」及び「治療する」は、例えば心疾患など、状態の重症度を軽減するか、状態を防ぐことを目的とした薬物の投与を含む。
また、本明細書で使用される場合、「の予防」及び「防ぐ」には、例えば心疾患など、状態の発症を回避することを含む。
また、本明細書で使用される場合、「状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」または「状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」は、有効量の薬物の対象への投与によって治療、軽減、または予防することができる、心疾患などのそれらの医学的状態を指す。
また、本明細書で使用される場合、「有効量」は、有益なまたは所望の効果を、そのような効果の検出のために一般的に使用される方法によって容易に検出可能であるレベルで生じさせるために十分である薬物の量を指す。いくつかの実施形態では、そのような効果は、薬物が投与されていない基礎レベルの値から少なくとも１０％の変化を生じさせる。他の実施形態では、変化は、基礎レベルから少なくとも２０％、５０％、８０％、またはさらに高い割合である。以下に説明されるように、薬物の有効量は、対象の年齢、全身状態、治療されている状態の重症度、投与される特定の薬物などに応じて、対象ごとに変わる場合がある。任意の個々の場合の適切な「有効」量は、関連するテキスト及び文献を参照することによって及び／または定型化した実験を使用することによって当業者によって決定されてもよい。
また、本明細書で使用される場合、「活性剤」は、その目的で政府機関によって承認されているかどうかに関係なく、治療効果、予防効果、または他の意図された効果を生じさせることを意図した任意の物質を指す。
本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書で別様が示されない限り、単に、範囲内に収まるそれぞれの別個の値を個々に指す速記方法としての役割を果たすことが意図され、それぞれの別個の値は、本明細書に個々に列挙されるかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書に別様が示されない限り、または文脈によって別様が明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行され得る。本明細書中提示されるありとあらゆる例、または例示的な言葉（例えば、「例えば（ｓｕｃｈ ａｓ）」など）の使用は、特定の材料及び方法をより理解しやすくすることを意図するに過ぎず、特許請求の範囲に制限をかけることはない。本明細書のいかなる言葉も、開示されている材料及び方法の実施にとって必須として任意の請求されていない要素を示すものと解釈されるべきではない。
不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）は主要な心筋障害であり、若い個人における心臓性突然死（ＳＣＤ）の主な原因である。不整脈原性右室心筋症は、心筋変性及び心筋の繊維脂肪置換を特徴とし、これは、右心室及び／または左心室に存在し、最終的に進行性心不全につながる可能性がある。臨床的な心臓表現型は、典型的な心電図異常の存在、心室性不整脈の負担の増加、及び心臓磁気共鳴断層撮影における広範囲の心筋瘢痕化を特徴とする。
ＡＲＶＣは、症例のおよそ５０％が家族性であり、通常、常染色体優性形質として遺伝する。白人系の患者の約３０％がＰＫＰ２遺伝子に優性変異をもつ。変異の大部分は、挿入・欠失、ナンセンス、もしくはスプライシング部位変異の結果として異常または切断型タンパク質をもたらし、ハプロ不全を引き起こす。
ＡＲＶＣは、高電子密度の構造が心筋細胞間の機械的接着をもたらすデスモソームの疾患と考えられる。ＰＫＰ２は、デスモソームタンパク質複合体の一部を形成するいくつかの遺伝子のうちの１つであり、ここにＡＲＶＣに至る変異が特定された。ハプロ不全によるＰＫＰ２タンパク質の欠如は、デスモソームタンパク質複合体を不安定にし、機械的及びシグナル伝達に影響がある。
機械的応力条件下においてＰＫＰ２タンパク質の欠如に起因する、様々なコラーゲンなどのいくつかの細胞外マトリックス遺伝子のダウンレギュレーションならびに線維形成コラーゲン、フィブロネクチン、及びＴＩＭＰ１などのその他の線維化促進マーカーの強いアップレギュレーションを含む異常な遺伝子発現パターンによってインビトロで機械的構成要素が強調される。前臨床及び臨床の状況では、これは、ＰＫＰ２マウスモデルにおける運動によるＡＲＶＣの悪化によって及びヒト、例えば、アスリートの表現型に対する運動の悪影響によって反映される。シグナル伝達レベルでは、プラコフィリンの欠如がプラコグロビンの核への移行を引き起こし、これが、古典的Ｗｎｔ／ｂ－カテニンシグナル伝達の減少ならびに繊維形成遺伝子及び脂肪生成遺伝子の発現の増加につながる。
ＰＫＰ２の２つの主要な形態は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａ（配列番号３）及びＰＫＰ２アイソフォーム２ｂ（配列番号５）を含む。ＰＫＰ２アイソフォーム２ａに対するＰＫＰ２遺伝子のタンパク質コード部分は、２７６４ｂｐのｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ１２６１９９．１；配列番号１）に含まれ、これは、本発明によってＡＡＶにベクター化することができる。本明細書で使用される場合、「ＰＫＰ２」または「ＰＫＰ２タンパク質」は、別段の記載または文脈から示唆されない限り、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａ及びＰＫＰ２アイソフォーム２ｂを含む、ＰＫＰ２のアイソフォームを包含するものと解釈されるべきである。
特定の実施形態は、ＡＡＶ９－ＴＮＮＴ２－ＰＫＰ２媒介遺伝子導入により正常な対立遺伝子で置換することによってＰＫＰ２タンパク質のハプロ不全を修正することができる。特定の実施形態では、本発明の組成物及び方法は、例えば、（１）ＰＫＰ２タンパク質を正確にデスモソームに局在化させること、及び（２）ＰＫＰ２が変異したヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞（ｉＰＳＣ－ＣＭ）においてハプロ不全を修正し、その結果としてデスモソームタンパク質複合体を修正することが可能であり得る。特定の実施形態は、トランスに２つの病原性変異をもつｉＰＳＣ－ＣＭにおいて完全またはほぼ完全なＰＫＰ２欠損をもたらすことも予想される。心筋細胞へのＰＫＰ２ポリヌクレオチドの送達を試験するための非限定的な例示的実施形態は、（１）ＴＮＮＴ２プロモーターを使用してＰＫＰ２をＡＡＶ９及び／またはＡＡＶ６にベクター化すること；ＰＫＰ２変異（１つの変異またはトランスに２つの変異のいずれか）をもつｉＰＳＣ－ＣＭを作製すること；（１または２つの変異をもつ）２Ｄ ＰＫＰ２変異心筋細胞培養物にＡＡＶ６－ＰＫＰ２またはＡＡＶ９－ＰＫＰ２をインビトロで形質導入し、デスモソームへの細胞内局在化を試験すること；細胞サイズ、収縮性、及びトランスクリプトーム分析を含む、分子データ及び生理的データを試験することを含む。
ＰＫＰ２タンパク質に関して本明細書中で多くの実施形態が記載されているが、さらなるタンパク質（例えば、サルコメアタンパク質）の発現が想定されることが理解されるべきである。ＰＫＰ２に加えて、例示的なタンパク質は、限定することなく、ＳＥＲＣＡ２、ＭＹＢＰＣ３、ＭＹＨ７、ＭＹＬ３、ＭＹＬ２、ＡＣＴＣ１、ＴＰＭ１、ＴＮＮＴ２、ＴＮＮＩ３、ＴＴＮ、ＦＨＬ１、ＡＬＰＫ３、ジストロフィン、ＦＫＲＰ、それらの変異体、またはそれらの組み合わせの１つまたは複数を含み得る。使用される１つまたは複数のタンパク質はまた、本明細書に言及されるタンパク質の機能的変異体であってもよく、元のタンパク質と比較して顕著なアミノ酸配列同一性を示す場合がある。例えば、アミノ酸同一性は、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％に達する場合がある。これに関連して、用語「機能的変異体」は、タンパク質の変異体が、自然に発生する対応するタンパク質の機能を部分的にもしくは完全に発揮することができることを意味する。タンパク質の機能的変異体は、例えば、１つまたは複数のアミノ酸の置換、欠失、または添加によりその自然に発生する対応物とは異なるタンパク質を含む場合がある。アミノ酸置換は、保存的または非保存的である場合がある。置換が保存的な置換である、すなわち、機能的等価物として作用する類似した極性のアミノ酸によるアミノ酸残基の置換であることが好ましい。好ましくは、置換物として使用されるアミノ酸残基は、置換されるアミノ酸残基と同じアミノ酸群から選択される。例えば、疎水性残基が、別の疎水性残基と置換される場合もあれば、極性残基が同じ電荷を有する別の極性残基と置換される場合もある。保存的置換に使用され得る機能的に一致するアミノ酸は、例えば、グリシン、バリン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、フェニルアラニン、及びトリプトファンなどの非極性アミノ酸を含む。非荷電極性アミノ酸の例は、セリン、スレオニン、グルタミン、アスパラギン、チロシン及びシステインを含む。荷電極性（塩基性）アミノ酸の例は、ヒスチジン、アルギニン、及びリジンを含む。荷電極性（酸性）アミノ酸の例は、アスパラギン酸及びグルタミン酸を含む。
また、変異体と見なされるのは、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、１０、または１５）の追加のアミノ酸によって自然に発生する対応物と異なるタンパク質である。これらの追加のアミノ酸は、元のタンパク質のアミノ酸配列内に（すなわち、挿入として）存在する場合もあれば、タンパク質の一方または両方の末端に付加される場合もある。基本的に、挿入は、アミノ酸の添加が、治療される被験者において自然に発生するタンパク質の機能を発揮するポリペプチドの機能を阻害しない場合、任意の位置で行うことができる。さらに、タンパク質の変異体はまた、元のポリペプチドと比較すると、１つまたは複数のアミノ酸が欠如しているタンパク質を含む。そのような欠失は、それがタンパク質の正常な機能を発揮する能力を損なわない限り、任意のアミノ酸の位置に影響を及ぼしてもよい。
最後に、心臓サルコメアタンパク質（例えば、ＰＫＰ２）の変異体は、修飾アミノ酸など、構造修飾によって自然に発生するタンパク質とは異なるタンパク質も指す。修飾アミノ酸は、プロセシングもしくは翻訳後修飾などの自然なプロセス、または当該技術分野で既知の化学修飾プロセスのいずれかによって修飾されたアミノ酸である。典型的なアミノ酸修飾は、リン酸化、グリコシル化、アセチル化、Ｏ－結合型Ｎ－アセチルグルコサミン化、グルタチオニル化、アシル化、分岐、ＡＤＰリボシル化、架橋、ジスルフィド架橋形成、ホルミル化、ヒドロキシル化、カルボキシル化、メチル化、脱メチル化、アミド化、環化、及び／またはホスファチジルイノシトール、フラビン誘導体、リポテイコン酸、脂肪酸、または脂質との共有結合または非共有結合を含む。
標的タンパク質をエンコードする治療用ポリヌクレオチド配列は、遺伝子治療ベクター、すなわち、プロモーター、コザック配列、ポリＡ信号などの外因性核酸の発現を提供するために必要とされる他の配列の隣に、翻訳コドン及び終止コドンを含むコード配列を含む核酸構築物の形で、治療される被験者に投与され得る。
例えば、遺伝子治療ベクターは、哺乳動物の発現系の一部であってよい。有用な哺乳動物発現系及び発現構築物は、市販されている。また、プラスミドまたはウイルスベクターベースのシステム、例えば、ＬＥＮＴＩ－Ｓｍａｒｔ （商標）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ベクター、ｐＡｄＶＡｎｔａｇｅ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）ＶｉｒａＰｏｗｅｒ（商標）Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ、Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びアデノ随伴ウイルス発現システム（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）などのいくつかの哺乳動物発現システムが異なる製造業者によって販売されており、本発明で使用することができる。
本発明の外因性治療用ポリヌクレオチド配列を発現するための遺伝子治療ベクターは、例えば、該核酸によってエンコードされるタンパク質の後続の発現のために、外因性治療用ポリヌクレオチド配列を細胞に導入するために適した、ウイルス発現ベクターまたは非ウイルス発現ベクターである場合がある。発現ベクターは、エピソーマルベクター、すなわち宿主細胞内で自律的に自己複製できるベクター、または組み込みベクター、すなわち細胞のゲノムに安定して組み込まれるベクターである場合がある。宿主細胞内での発現は、構成的である場合も、調節される（例えば、誘導性）場合もある。
特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ウイルス発現ベクターである。本発明で使用するためのウイルスベクターは、ウイルスの感染力を破壊することなく異種ポリヌクレオチドを導入するために、天然配列の一部が欠失したウイルスゲノムを含み得る。ウイルス成分と宿主細胞受容体との間の特異的な相互作用により、ウイルスベクターは、標的細胞内への遺伝子の効率的な導入に非常に適している。哺乳類細胞への遺伝子導入を促進するために適したウイルスベクターは、例えば、ＡＡＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、ウシパピローマウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオーマウイルス、センダイウイルス、オルトミクソウイルス、パラミクソウイルス、パポバウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、または遺伝子治療に適した任意の他のウイルスシャトル、それらの変異体、及びそれらの組み合わせからなど、異なるタイプのウイルスから抽出できる。
「アデノウイルス発現ベクター」または「アデノウイルス」は、（ａ）治療用ポリヌクレオチド配列構築物のパッケージングをサポートするために、及び／または（ｂ）その中でクローン化されている組織及び／または細胞特異的構築物を最終的に発現するために十分なアデノウイルス配列を含むそれらの構築物を含むことを意図している。本発明の一実施形態では、発現ベクターは、遺伝子操作された形のアデノウイルスを含む。３６キロベース（ｋｂ）の直鎖二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスの遺伝子構成に関する知識により、アデノウイルスＤＮＡの大きな断片を最大７ｋｂの外来配列で置換することが可能になる。
アデノウイルスの増殖及び操作は当業者に既知であり、インビトロ及びインビボで広い宿主範囲を示す。このグループのウイルスは、高力価、例えば１ｍＬあたり１０９～１０１１のプラーク形成単位で取得でき、感染力が非常に高い。アデノウイルスのライフサイクルは、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子はエピソームであるため、宿主細胞に対する遺伝毒性が低い。野生型アデノウイルスによるワクチン接種の研究では副作用は報告されておらず、インビボ遺伝子導入ベクターとしての安全性及び／または治療の可能性を実証している。
レトロウイルス（「レトロウイルスベクター」とも呼ばれる）は、遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、大量の外来遺伝物質を導入し、広範囲の種及び細胞型に感染し、特別な細胞株にパッケージングされる能力のために遺伝子送達ベクターとして選ばれ得る。
レトロウイルスゲノムは、それぞれカプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、及びエンベロープ成分をコードする３つの遺伝子、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖを含む。ｇａｇ遺伝子から上流にある配列は、ゲノムのビリオンへのパッケージングのためのシグナルを含む。２つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列は、ウイルス遺伝子の５’末端及び３’末端に存在する。これらは、強力なプロモーター及びエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組み込みにも必要とされる。
レトロウイルスベクターを構築するために、対象の遺伝子をエンコードする核酸が、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノム内に挿入されて、複製欠損ウイルスを生成する。ビリオンを産生するために、ｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及び／またはｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ及び／またはパッケージングの成分は含まないパッケージング細胞株が構築される。レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列とともに、（例えば、リン酸カルシウム酸の沈殿によって）ｃＤＮＡを含む組み換えプラスミドがこの細胞株に導入されるとき、パッケージング配列は、組み換えプラスミドのＲＮＡ転写物の、その後培地に分泌されるウイルス粒子内へのパッケージングが可能になる。組み換えレトロウイルスを含む培地は、次に収集され、任意選択で凝縮され、遺伝子導入に使用される。レトロウイルスベクターは、幅広い様々な細胞型に感染することができる。しかしながら、組み込み及び安定した発現には、宿主細胞の分裂が必要である。
レトロウイルスは、サブファミリーのいずれから抽出できる。例えば、マウス肉腫ウイルス、ウシ白血病、ウイルスラウス肉腫ウイルス、マウス白血病ウイルス、ミンク細胞焦点誘導ウイルス、細網内皮症ウイルス、または鳥類白血病ウイルスからのベクターを使用することができる。当業者は、ＬＴＲ、ｔＲＮＡ結合部位、及びパッケージングシグナルなど、異なるレトロウイルスに由来する部分を組み合わせて、組み換えレトロウイルスを提供できる。これらのレトロウイルスは、次に、通常、形質導入能力のあるレトロウイルスベクター粒子を産生するために使用される。この目的のために、ベクターは、適切なパッケージング細胞株内に導入される。レトロウイルスはまた、キメラインテグラーゼ酵素をレトロウイルス粒子に組み込むことによって、宿主細胞のＤＮＡ内への部位特異的な組み込みのために構築することもできる。
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は向神経性であるため、神経系疾患の治療に大きな関心を集めている。さらに、宿主細胞の染色体内へ組み込むことなく、またはそれ以外の場合、宿主細胞の代謝を変化させることなく、非分裂神経細胞内での潜伏感染を確立するＨＳＶの能力に加え、潜伏中も活性であるプロモーターの存在により、ＨＳＶは魅力的なベクターになる。そして、ＨＳＶの向神経性応用に多くの注目が集まっているが、このベクターは、宿主範囲が広いため、他の組織にも利用できる。
ＨＳＶを魅力的なベクターにするもう１つの要因は、ゲノムのサイズ及び構成である。ＨＳＶは大きいため、複数の遺伝子または発現カセットの組み込みは、他のより小さいウイルス系に比べて問題が少ない。さらに、様々な性能（時間、強度など）を備えた異なるウイルス制御配列を使用できることによって、他の系よりもよりも大幅に発現を制御することが可能になる。また、ウイルスはスプライスされたメッセージが比較的に少ないため、遺伝子操作がさらに容易になることも利点である。
ＨＳＶはまた、比較的に操作が容易であり、高力価まで増殖させることができる。したがって、十分な感染の多重度（ＭＯＩ）を達成するために必要とされる量の点でも、反復投薬の必要性の軽減の点でも、送達はそれほど問題ではない。ＨＳＶの無毒性変異体が開発されており、遺伝子治療の関連での使用に容易に利用できる。
レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節機能または構造機能を有する他の遺伝子を含んでいる。複雑度が高まると、潜伏感染の過程においてのように、ウイルスはそのライフサイクルを調節することが可能になる。レンチウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２）またはサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）を含む。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶ毒性遺伝子を多重に弱毒化することによって生成されており、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、及びｎｅｆは欠失しており、ベクターを生物学的に安全にしている。
レンチウイルスベクターは、プラスミドベースまたはウイルスベースであり、外来の核酸を組み込むために、核酸の選択及び宿主細胞内への導入のために必須の配列を運ぶように構成される。対象のｇａｇ遺伝子、ｐｏｌ遺伝子、及びｅｎｖ遺伝子はまた、当該技術分野で既知である。したがって、関連する遺伝子は、選択されたベクター内にクローン化され、次に、対象の標的細胞を形質転換するために使用される。
ワクシニアウイルスベクターは、構築が容易であり、比較的に高レベルの発現が得られ、宿主範囲が広く、ＤＮＡを運ぶ能力が大きいため、広く使用されてきた。ワクシニアは、顕著な「ＡＴ」優先性を示す約１８６ｋｂの直鎖二本鎖ＤＮＡゲノムを含む。約１０．５ｋｂの逆方向末端反復がゲノムに隣接する。必須遺伝子の大部分は、ポックスウイルス間で最も高度に保存されている中心部位内でマッピングするように見える。ワクシニアウイルスの推定オープンリーディングフレーム数は１５０～２００である。両方のストランドがコード化されているが、リーディングフレームが広範囲に重複することは一般的ではない。
ワクシニアウイルスゲノムには少なくとも２５ｋｂを挿入できる。原型的なワクシニアベクターは、相同組み換えを介してウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子に挿入された導入遺伝子を含む。ベクターはｔｋ表現型に基づいて選択される。脳心筋炎ウイルスの非翻訳リーダー配列を含めることで、従来のベクターの発現レベルよりも高い発現レベルが得られ、導入遺伝子は２４時間で感染細胞のタンパク質の１０％以上に蓄積する。
マウスポリオーマウイルスなどのパポバウイルスの空のカプシドは、遺伝子導入の可能性のあるベクターとして注目されている。空のポリオーマの使用は、ポリオーマＤＮＡ及び精製された空のカプシドが無細胞系でインキュベートされたときに初めて報告された。新しい粒子のＤＮＡは膵臓ＤＮａｓｅの作用から保護された。再構成された粒子は、形質転換ポリオーマＤＮＡ断片をラットＦＩＩＩ細胞に導入するために使用された。空のカプシド及び再構成された粒子は、ポリオーマカプシド抗原ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３の３つすべてから成る。
ＡＡＶは、ディペンドウイルス属に属するパルボウイルスである。これらは、小型でエンベロープのない一本鎖ＤＮＡウイルスであり、複製するためにヘルパーウイルスを必要とする。機能的に完全なＡＡＶビリオンを形成するためには、ヘルパーウイルス（アデノウイルス、ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルスなど）との重感染が必要である。インビトロでは、ヘルパーウイルスとの重感染がない場合、ＡＡＶは、ウイルスゲノムがエピソーム形態で存在するが、感染性ビリオンは産生されない潜伏状態を確立する。後のヘルパーウイルスによる感染によりゲノムが「救出」され、ゲノムが複製され、ウイルスカプシドにパッケージングされることを可能にし、それによって感染性ビリオンが再構成される。最近のデータは、インビボでは野生型ＡＡＶと組み換えＡＡＶの両方が、おもに大きなエピソームコンカテマーとして存在することを示している。一実施形態では、本明細書で使用される遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶベクターである。ＡＡＶベクターは、精製され、複製不能な、偽型化されたｒＡＡＶ粒子であってよい。
ＡＡＶはいかなる既知のヒト疾患とも関連しておらず、一般に病原性があるとは考えられておらず、組み込み時に宿主細胞の生理学的特性を変化させるようには見えない。ＡＡＶは、非分裂細胞を含む広範囲の宿主細胞に感染することができ、異なる種の細胞に感染することができる。細胞応答と体液性応答の両方によって迅速に除去または不活性化される一部のベクターとは対照的に、ＡＡＶベクターは、インビボでは様々な組織での持続的な導入遺伝子発現を誘導することが示されている。インビボでの非分裂細胞内の組み換えＡＡＶ媒介導入遺伝子が持続することは、天然ＡＡＶウイルス遺伝子の欠如、及びベクターのＩＴＲ関連エピソームコンカテマー形成能力に起因する場合がある。
ＡＡＶは、エピソームコンカテマーとしての持続性の高い頻度を有し、心筋細胞を含む非分裂細胞に感染することができ、したがって例えば、組織培養及びインビボでの哺乳類細胞への遺伝子の送達に有用であるため、本発明の細胞形質導入に使用するための魅力的なベクター系である。
通常、ｒＡＡＶは、例えばｐＩＭ４５など、２つのＡＡＶ末端反復が隣接する対象の遺伝子を含むプラスミド、及び／または末端反復がない野生型ＡＡＶコード配列を含む発現プラスミドを同時トランスフェクトすることによって作製される。細胞はまた、ＡＡＶヘルパー機能に必要とされるアデノウイルス及び／またはアデノウイルス遺伝子をもつプラスミドで感染及び／またはトランスフェクトされる。そのような方法で作製されたｒＡＡＶのストックはアデノウイルスで汚染されているため、（例えば、塩化セシウム密度遠心分離またはカラムクロマトグラフィーによって）ｒＡＡＶ粒子から物理的に分離する必要がある。代わりに、ＡＡＶコード領域を含むアデノウイルス、及び／またはＡＡＶコード領域及び／またはアデノウイルスヘルパー遺伝子の一部またはすべてを含む細胞株を使用できるであろう。組み込まれたプロウイルスとしてｒＡＡＶ ＤＮＡをもつ細胞株も使用できる。
自然界にはＡＡＶの複数の血清型が存在し、少なくとも１２の血清型（ＡＡＶ１～ＡＡＶ１２）が存在する。高い相同性にも関わらず、異なる血清型は、異なる組織に対して親和性を有する。トランスフェクションの際、ＡＡＶは、宿主内で（あったとしても）軽微な免疫反応しか引き起こさない。したがって、ＡＡＶは、遺伝子治療アプローチに非常に適している。
本開示は、いくつかの実施形態では、対象の組織における高効率の形質導入にさらに適する、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＮＣ ＡＡＶ、それらのキメラＡＡＶ由来、それらの変異体、及びそれらの組み合わせの１つまたは複数である、ＡＡＶベクターを含む薬物を対象にし得る。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型１ベクターである。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型２ベクターである。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型３ベクターである。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型４ベクターである。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型５ベクターである。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型６ベクターである。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型７ベクターである。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型８ベクターである。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型９ベクターである。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型１０ベクターである。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型１１ベクターである。特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、ＡＡＶ血清型１２ベクターである。
ヒトに対するＡＡＶの適切な用量は、体重１キログラム当たり約１×１０８ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）～約３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、約１×１０８ｖｇ／ｋｇ、約１×１０９ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、約１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、または約１×１０１４ｖｇ／ｋｇの範囲内であってよい。ウイルス粒子の総量、つまりＤＲＰは、約５×１０１５ｖｇ／ｋｇ、４×１０１５ｖｇ／ｋｇ、３×１０１５ｖｇ／ｋｇ、２×１０１５ｖｇ／ｋｇ、１×１０１５ｖｇ／ｋｇ、９×１０１４ｖｇ／ｋｇ、８×１０１４ｖｇ／ｋｇ、７×１０１４ｖｇ／ｋｇ、６×１０１４ｖｇ／ｋｇ、５×１０１４ｖｇ／ｋｇ、４×１０１４ｖｇ／ｋｇ、３×１０１４ｖｇ／ｋｇ、２×１０１４ｖｇ／ｋｇ、１×１０１４ｖｇ／ｋｇ、９×１０１３ｖｇ／ｋｇ、８×１０１３ｖｇ／ｋｇ、７×１０１３ｖｇ／ｋｇ、６×１０１３ｖｇ／ｋｇ、５×１０１３ｖｇ／ｋｇ、４×１０１３ｖｇ／ｋｇ、３×１０１３ｖｇ／ｋｇ、２×１０１３ｖｇ／ｋｇ、１×１０１３ｖｇ／ｋｇ、９×１０１２ｖｇ／ｋｇ、８×１０１２ｖｇ／ｋｇ、７×１０１２ｖｇ／ｋｇ、６×１０１２ｖｇ／ｋｇ、５×１０１２ｖｇ／ｋｇ、４×１０１２ｖｇ／ｋｇ、３×１０１２ｖｇ／ｋｇ、２×１０１２ｖｇ／ｋｇ、１×１０１２ｖｇ／ｋｇ、９×１０１１ｖｇ／ｋｇ、８×１０１１ｖｇ／ｋｇ、７×１０１１ｖｇ／ｋｇ、６×１０１１ｖｇ／ｋｇ、５×１０１１ｖｇ／ｋｇ、４×１０１１ｖｇ／ｋｇ、３×１０１１ｖｇ／ｋｇ、２×１０１１ｖｇ／ｋｇ、１×１０１１ｖｇ／ｋｇ、９×１０１０ｖｇ／ｋｇ、８×１０１０ｖｇ／ｋｇ、７×１０１０ｖｇ／ｋｇ、６×１０１０ｖｇ／ｋｇ、５×１０１０ｖｇ／ｋｇ、４×１０１０ｖｇ／ｋｇ、３×１０１０ｖｇ／ｋｇ、２×１０１０ｖｇ／ｋｇ、１×１０１０ｖｇ／ｋｇ、９×１０９ｖｇ／ｋｇ、８×１０９ｖｇ／ｋｇ、７×１０９ｖｇ／ｋｇ、６×１０９ｖｇ／ｋｇ、５×１０９ｖｇ／ｋｇ、４×１０９ｖｇ／ｋｇ、３×１０９ｖｇ／ｋｇ、２×１０９ｖｇ／ｋｇ、１×１０９ｖｇ／ｋｇ、９×１０８ｖｇ／ｋｇ、８×１０８ｖｇ／ｋｇ、７×１０８ｖｇ／ｋｇ、６×１０８ｖｇ／ｋｇ、５×１０８ｖｇ／ｋｇ、４×１０８ｖｇ／ｋｇ、３×１０８ｖｇ／ｋｇ、２×１０８ｖｇ／ｋｇ、または１×１０８ｖｇ／ｋｇであるか、ほぼこれらであるか、少なくともこれらであるか、少なくともほぼこれらであるか、これら以下であるか、もしくはほぼこれら以下であるか、またはこれらの値のいずれか２つによって定義される範囲に入る。上で挙げた投与量は、ｖｇ／ｋｇ心臓組織単位である。
ウイルスベクターとは別に、非ウイルス発現構築物もまた、標的タンパク質、またはその機能的変異体もしくは断片をコードする遺伝子を患者の細胞内に導入するために使用され得る。標的細胞内でのタンパク質のインビボ発現を可能にする非ウイルス発現ベクターは、例えば、プラスミド、修飾ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、アンチセンスオリゴマー、ＤＮＡ脂質複合体、ナノ粒子、エクソソーム、遺伝子治療に適した任意の他の非ウイルスシャトル、それらの変異体、及びそれらの組み合わせを含む。
ウイルスベクター及び非ウイルスベクターとは別に、ヌクレアーゼ系は、患者の細胞内に進入し、その中で、標的タンパク質またはその機能変異体もしくは断片をエンコードする遺伝子を導入するために、ベクター及び／またはエレクトロポレーションシステムと連動して使用されてもよい。例示的なヌクレアーゼ系には、限定することなく、クラスター化された規則的に間隔をあけられた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）、ＤＮＡ切断酵素（例えば、Ｃａｓ９）、メガヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、遺伝子療法に適した任意の他のヌクレアーゼ系、それらの変形、及びそれらの組み合わせを含み得る。例えば、一実施形態では、１つのウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）がヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）に使用され得、別のウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ）が両方（ヌクレアーゼ及びＤＮＡ切断酵素）を標的セルに導入するために、ＤＮＡ切断酵素（例えば、Ｃａｓ９）に使用され得る。
治療用遺伝子をエンコードする治療用ポリヌクレオチド配列を細胞内に送達するために利用できる他のベクター送達系は、受容体媒介送達賦形剤である。これらは、ほぼすべての真核細胞において受容体媒介エンドサイトーシスによる高分子の選択的取り込みを利用する。様々な受容体の細胞型特異的分布のため、送達は非常に特異的である可能性がある。受容体媒介遺伝子標的賦形剤は、２つの成分、つまり細胞受容体に特異的なリガンド、及びＤＮＡ結合剤を含み得る。
標的細胞内への非ウイルスベクターの導入に適した方法は、例えば、リポフェクション法、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥデキストラン法、及びマイクロガラス管、超音波、エレクトロポレーションなどを使用する直接的なＤＮＡ導入法である。ベクターの導入前に、心筋細胞は、ホスファチジルコリン、ストレプトリシン、カプリン酸ナトリウム、デカノイルカルニチン、酒石酸、リゾレシチン、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００など、透過化剤で処理され得る。エクソソームはまた、裸のＤＮＡまたはＡＡＶのカプシドに包まれたＤＮＡを導入するために使用され得る。
本発明の遺伝子治療ベクターは、標的タンパク質をコードする核酸配列に機能的に連結されたプロモーターを含み得る。プロモーター配列はコンパクトであり、強力な発現を保証しなければならない。好ましくは、プロモーターは、遺伝子治療ベクターで治療されてきた患者の心筋層内の標的タンパク質の発現を提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、標的タンパク質をエンコードする核酸配列に動作可能に連結された心臓特異的プロモーターを含む。本明細書で使用される場合、「心臓特異的プロモーター」は、心臓細胞内でのその活性が、任意の他の非心臓細胞型においてよりも少なくとも２倍高いプロモーターを指す。好ましくは、本発明のベクターでの使用に適した心臓特異的プロモーターは、非心臓細胞型における活性と比較して、心臓細胞内で少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、または少なくとも５０倍高い活性を有する。
心臓特異的プロモーターは、選択されたヒトのプロモーター、または選択されたヒトのプロモーターに対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、もしくは少なくとも約９９％の配列同一性を有する機能的に同等な配列を含むプロモーターである場合がある。使用され得る例示的な非限定的なプロモーターは、心臓トロポニンＴプロモーター（ＴＮＮＴ２）である。プロモーターの他の非限定的な例は、αミオシン重鎖プロモーター、ミオシン軽鎖２ｖプロモーター、αミオシン重鎖プロモーター、α－心臓アクチンプロモーター、α－トロポミオシンプロモーター、心臓トロポニンＣプロモーター、心筋トロポニンＩプロモーター、心筋ミオシン結合タンパク質Ｃプロモーター、及び筋／小胞体Ｃａ２＋－ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ）プロモーター（例えば、このプロモーターのアイソフォーム２（ＳＥＲＣＡ２））を含む。
本発明で有用なベクターは、様々な形質導入効率を有し得る。結果として、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターは、標的血管領域の細胞の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９９％、または約１００％以上、これらに等しい、または少なくともほぼこれらを形質導入する。複数のベクター（ウイルス性または非ウイルス性、またはそれらの組み合わせ）は、同時に、または順番に使用できる。これは、複数のポリヌクレオチドを導入するために、及び／または複数の細胞型を標的とするために使用できる。複数のベクターまたは複数の薬物が使用される場合、複数の形質導入／トランスフェクション効率が生じる可能性がある。
遺伝子療法ベクターを含む医薬組成物は、液体溶液または懸濁液のどちらかとして調製され得る。本発明の医薬組成物は、希釈剤及び担体など、通常使用される薬学的に許容される賦形剤を含む場合がある。特に、組成物は、例えば、水、生理食塩水、リンゲル液、またはデキストロース溶液など、薬学的に許容される担体を含む。担体に加えて、医薬組成物はまた、乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、色素などを含んでもよい。
特定の実施形態では、医薬組成物は、被験者にとって有毒ではなく、被験者の心筋症を防ぐまたは治療することができる用量である、治療効果のある遺伝子用量を含む。心筋症の予防または治療は、心筋症と関連付けられた表現型特徴の変化として評価される場合があり、そのような変化は、心筋症を予防または治療するために効果的である。したがって、治療効果のある遺伝子用量は、通常、生理学的に許容可能な組成物で投与されるとき、治療される対象の病原性心臓表現型を改善または予防するのに十分な用量である。
特定の実施形態では、遺伝子治療ベクターは、静脈内送達、動脈内送達、または腹腔内送達を含む、いくつかの異なる方法により対象に形質導入されてもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子治療ベクターは、心臓組織に、例えば、冠内投与によって直接投与されてもよい。いくつかの実施形態では、心筋の組織形質導入は、カテーテルを介した心筋内送達によって達成されてもよく、これは、形質導入促進担体と結合した、または結合していないベクターフリーのｃＤＮＡを心筋に導入するために使用することができる。
特定の実施形態では、薬物は、治療効果のある遺伝子用量を含むことになる。治療効果のある遺伝子用量は、患者に毒性がなく、患者の特定の心臓状態を予防または治療することができる用量である。
本明細書に開示される方法によって治療され得る心臓状態は、限定することなく、遺伝的に決定された心疾患（例えば、遺伝的に決定された心筋症）、不整脈性心疾患、心不全、虚血、不整脈、心筋梗塞、うっ血性心不全、移植拒絶反応、異常な心収縮性、非虚血性心筋症、僧帽弁逆流、大動脈狭窄または逆流、異常なＣａ２＋代謝、先天性心疾患、原発性または二次性心臓腫瘍、及びそれらの組み合わせの１つまたは複数を含み得る。
以下の実施例は、本開示の理解を補助するために記載されるものであり、本明細書に記載されかつ特許請求される実施形態を具体的に限定するものと解釈すべきではないことは言うまでもない。当業者の技量内であろう、現在公知であるかまたは後に開発されるすべての均等物の置換、及び製剤における変更または実験計画における小さな変更を含む実施形態のそのような変形形態は、本明細書に組み込まれている実施形態の範囲内に含まれるものとして解釈されたい。
実施例１（預言的）
インビトロ系の例示的な例では、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａ ｃＤＮＡ配列（２７６４ｂｐ ｃＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ１２６１９９．１；配列番号１）を、心臓特異的なＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号６）下、ＡＡＶ２内部末端反復（ＩＴＲ）を使用してクローン化する：ＩＴＲ－ＴＮＮＴ２－ＰＫＰ２ｃＤＮＡ－ＩＴＲ。ＰＫＰ２をコードする核酸配列は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａタンパク質をコードするＰＫＰ２遺伝子のコドン最適化型（配列番号２）であってもよい。別の例示的な例として、ＰＫＰ２をコードする核酸配列は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂタンパク質をコードするＰＫＰ２遺伝子のコドン最適化型（配列番号４）であってもよい。
インビトロ系の例示的な例では、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａ ｃＤＮＡ配列（２７６４ｂｐ ｃＤＮＡ、ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ１２６１９９．１；配列番号１）を、心臓特異的なＴＮＮＴ２プロモーター（配列番号６）下、ＡＡＶ２内部末端反復（ＩＴＲ）を使用してクローン化する：ＩＴＲ－ＴＮＮＴ２－ＰＫＰ２ｃＤＮＡ－ＩＴＲ。ＰＫＰ２をコードする核酸配列は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａタンパク質をコードするＰＫＰ２遺伝子のコドン最適化型（配列番号２）であってもよい。別の例示的な例として、ＰＫＰ２をコードする核酸配列は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂタンパク質をコードするＰＫＰ２遺伝子のコドン最適化型（配列番号４）であってもよい。
構築物をＡＡＶ６及びＡＡＶ９などのＡＡＶにベクター化することができる。抗Ｆｌａｇによりトランスフェクション後のタンパク質を特定し、それを内因性タンパク質と区別できるようにするためにＦｌａｇを付加した構築物（Ｆｌａｇ－ＰＫＰ２）を作製してもよい。配列番号７は、例えば、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂを発現させるための例示的な構築物配列である。インビトロにおけるＰＫＰ２の発現は、ＰＫＰ２一次抗体を使用して免疫蛍光顕微鏡により観察することができ、これは、細胞膜及び密なプラークにおけるＰＫＰ２の局在化を明らかにする。
遺伝子発現レベルをさらに増加させるために、１つまたは複数の新しいイントロンを、本明細書に記載の遺伝子治療ベクターに組み込むことができることが予想される。例えば、ヒトベータグロビン遺伝子及びヒト免疫グロブリンＧ由来のイントロン配列などの２つの異なる遺伝子由来の少なくとも２つの異なるイントロンの一部を含むイントロンを指す「キメライントロン」が利用されてもよい。いくつかの実施形態では、新しいイントロンは、プロモーターのすぐ下流に挿入されてもよい。いくつかの実施形態では、新しいイントロは、エクソン１の後ろ及びエクソン２の前など、ＰＫＰ２ ｃＤＮＡ配列の異なる場所に配置されてもよい。
ＡＡＶ６－ＴＮＮＴ２－ＰＫＰ２を使用して、正常な心筋細胞、（ＡＲＶＣ患者の）１つのヘテロ接合ＰＫＰ２変異をもつ心筋細胞、及びトランスに２つのＰＫＰ２変異をもつ心筋細胞を含む、２Ｄ細胞培養物中のｉＰＳＣ－ＣＭをトランスフェクトする。
トランスフェクションの成功ならびにＰＫＰ２ ＲＮＡ及びタンパク質レベルのキャラクタリゼーション後、正常なＣＭ対ＰＫＰ２欠損ＣＭ及びＰＫＰ２修正ＣＭの比較を、細胞サイズ及びＰＫＰ２欠損の発現変化がわかっている遺伝子の修正（ＭＹＬ２、ＳＣＮ５Ａ（タンパク質産物はＮａＶ１．５である）、ＧＪＡ１、及びＴＴＮ）を含む、多くの測定値に関して行う。
同様の手法がヒト３Ｄ培養モデルにおけるエクスビボ治療ならびにＰＫＰ２変異マウスモデルにおけるインビボ治療に適合可能であることが予想される。
（Ｆｌａｇ－）ＰＫＰ２タンパク質が発現すると、それがその正しい細胞内局在（デスモソーム）に到達し、トランスフェクションがＰＫＰ２ハプロ不全細胞または完全欠損細胞をＲＮＡレベル及びタンパク質レベルで修正すると考えられる。完全ＰＫＰ２欠損細胞では、ＰＫＰ２トランスフェクションがまた、デスモソーム内のデスモソームタンパク質複合体を回復させること、特にＰＫＰ２が減少すると減少するプラコグロビンの回復も可能であると考えられる。
ＰＫＰ２アイソフォーム２ａ、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂ、またはその両方を発現させるための遺伝子治療ベクターをヒト対象の心臓組織に送達することができることがさらに予想される。例えば、遺伝子治療ベクターは、１つまたは複数の遺伝子治療ベクター及び薬学的に許容される賦形剤または担体を含む治療用製剤に製剤化されてもよい。製剤は、静脈内送達、動脈内送達、または腹腔内送達を含む、いくつかの異なる方法によりヒト対象に形質導入されてもよい。遺伝子治療ベクターは、心臓組織に、例えば、冠内投与によって直接投与されてもよい。遺伝子治療ベクターはまた、カテーテルを介した心筋内送達により送達されてもよい。
例えば、対象の冠循環を対象の体循環から切り離すことにより閉回路を形成し、流体（例えば、遺伝子治療ベクターを含む製剤）を対象の切り離された冠循環に灌流させることによって、遺伝子治療ベクターを対象の心臓組織に局所投与することができることもさらに予想される。灌流は、患者の停止していない鼓動する心臓内で行われてもよい。閉回路は、例えば、患者の右冠動脈に配置された第１の薬物送達カテーテル、患者の左主幹冠動脈に配置された第２の薬物送達カテーテル、冠状静脈洞に配置された薬物回収カテーテル、冠動脈、冠静脈系、及び静脈枝と動脈枝の間に挿入された体外式膜型人工肺で形成されてもよい。そのような局所送達は、２０２０年８月２６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０２０／０００６９２号に記載されているとおりに行ってもよく、その開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
実施例２：ｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞におけるデスモソームＰＫＰ２発現
デスモソーム複合体のタンパク質は、二次元（２Ｄ）細胞培養中のヒト人工多能性幹細胞由来の（ｈｉＰＳＣ由来の）正常な心筋細胞で発現し、形成するデスモソームの細胞内構造に位置した。図１は、野生型２Ｄ ｈｉＰＳＣ心筋細胞のデスモソーム細胞間接合部に局在するＰＫＰ２の蛍光顕微鏡画像を示す。
デスモソーム複合体のタンパク質は、二次元（２Ｄ）細胞培養中のヒト人工多能性幹細胞由来の（ｈｉＰＳＣ由来の）正常な心筋細胞で発現し、形成するデスモソームの細胞内構造に位置した。図１は、野生型２Ｄ ｈｉＰＳＣ心筋細胞のデスモソーム細胞間接合部に局在するＰＫＰ２の蛍光顕微鏡画像を示す。
ＦＬＡＧタグをさらに含む実施例１に記載のベクターと同様のＡＡＶ９－ＴＮＮＴ２－ＰＫＰ２ｂにより対照ｈｉＰＳＣ心筋細胞の形質導入を行った。図２は、ＦＬＡＧタグシグナルが発現し、野生型心筋細胞のデスモソーム細胞間接合部に正確に局在することを確認する蛍光顕微鏡画像を示す。
次に、ＰＫＰ２が変異したｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞を特徴づけ、細胞レベルでのハプロ不全を示すために対照としてのアジア人（Ａｓｉ）及び白人（Ｃａｕ）由来の種々の野生型細胞株と比較した。図３は、ＰＫＰ２タンパク質発現のウエスタンブロットを示し、ＰＫＰ２変異細胞株のハプロ不全は、対照細胞株と比較して低下したＰＫＰ２の発現により明らかである（定量は心筋トロポニンＴと比較）。
図４の蛍光顕微鏡画像に示されるとおり、ＰＫＰ２が変異したｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞へのＴＮＮＴ２プロモーターを含むＦＬＡＧタグ付きＰＫＰ２アイソフォーム２ｂ導入遺伝子のＡＡＶ９媒介形質導入は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂの発現及び正確な局在化をもたらすことが示された。
本明細書に記載の実験では、使用したｈｉＰＳＣ由来の心筋細胞はＰＫＰ２アイソフォーム２ａのみを発現することがわかり、これは成熟度が低く、発生制御されたアイソフォームであることを示す。対照的に、成熟したヒト心臓組織では、完全長のＰＫＰ２ｂアイソフォーム２ｂが優勢である。総タンパク質レベルでは、ウエスタンブロットを使用して、ＡＡＶ９－ＴＮＮＴ２－ＰＫＰ２ｂ－ＦＬＡＧによる形質導入がＰＫＰ２変異ｈｉＰＳＣ心筋細胞においてハプロ不全状態を完全なＰＫＰ２タンパク質発現に修正したことを確認した。図５は、２つの野生型ｈｉＰＳＣ－ＣＭ対照（Ａｓｉ及びＣａｕ）と比較したＰＫＰ２変異ｈｉＰＳＣ－ＣＭ（「ＰＫＰ２」）を示す。発現したＰＫＰ２の相対量を計算するための参照タンパク質としてＭＹＢＰＣ３及びｃＴｎＴを使用した。ＰＫＰ２変異ｈｉ－ＩＰＳＣ－ＣＭは、２つの対照細胞株と比較して、大きく減少したＰＫＰ２タンパク質発現量を示した。ＰＫＰ２発現は、ＡＡＶ９－ＰＫＰ２による形質導入後、量的に修正された。形質導入された細胞が、ＡＡＶ媒介導入遺伝子から産生されたＰＫＰ２アイソフォーム２ｂ及びｈｉＰＳＣ－ＣＭにおいて天然に発現したＰＫＰ２アイソフォーム２ａを示すＰＫＰ２の二重線を示したことに留意されたい。ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂの新規の発現は十分に許容され、ＰＫＰ２変異心筋細胞または野生型対照心筋細胞における明白な機能的変化にはつながらなかった。
実施例３：内因性ＰＫＰ２発現の低下
図６は、無関係の対照心筋細胞、非不全ヒト心臓（ＮＦＨ）組織、及びＰＫＰ２患者心筋細胞（ＰＫＰ２に関してハプロ不全）と比較して低下した内因性ＰＫＰ２発現を示す。示されているように、ＰＫＰ２患者心筋細胞は、正常な対照細胞及び非不全ヒト心臓（ＮＦＨ）細胞と比較してＰＫＰ２の発現が少ない。内因性ＰＫＰ２の含有量は、形質導入せずにノイラミニダーゼ（細胞培養におけるＡＡＶ９による形質導入中に利用される）で処理された場合（「ＰＫＰ２ Ｐａｔ ＮＴ ＮＡ」）、変化しなかった。野生型ＰＫＰ２配列に結合しないように選択されたプライマーを用いて、コドン最適化ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂベクター（「ＰＫＰ２ ｐａｔ ＴＤ ２ｂ ｏｐｔ」）により形質導入を行った。それにより形質導入後に変化はなかった。
図６は、無関係の対照心筋細胞、非不全ヒト心臓（ＮＦＨ）組織、及びＰＫＰ２患者心筋細胞（ＰＫＰ２に関してハプロ不全）と比較して低下した内因性ＰＫＰ２発現を示す。示されているように、ＰＫＰ２患者心筋細胞は、正常な対照細胞及び非不全ヒト心臓（ＮＦＨ）細胞と比較してＰＫＰ２の発現が少ない。内因性ＰＫＰ２の含有量は、形質導入せずにノイラミニダーゼ（細胞培養におけるＡＡＶ９による形質導入中に利用される）で処理された場合（「ＰＫＰ２ Ｐａｔ ＮＴ ＮＡ」）、変化しなかった。野生型ＰＫＰ２配列に結合しないように選択されたプライマーを用いて、コドン最適化ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂベクター（「ＰＫＰ２ ｐａｔ ＴＤ ２ｂ ｏｐｔ」）により形質導入を行った。それにより形質導入後に変化はなかった。
図７は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａがヒト組織（無関係の対照、非不全ヒト心臓）において優勢なＰＫＰ２アイソフォームであることを示す。これは、ノイラミニダーゼ下、及び（上記の非結合プライマーを用いた）コドン最適化ＰＫＰ２ｂの形質導入後でも変化しないままである。ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂの完全長アイソフォームは、ＮＦＨ細胞、対照細胞、またはＰＫＰ２患者心筋細胞で検出されなかった。ＰＫＰ２アイソフォーム２ａは、総ＰＫＰ２のおよそ半分として存在した。
実施例４：総ＰＫＰ２レベルの回復
図８Ａ及び８Ｂは、ＮＦＨ細胞及び２つの無関係の対照の細胞の平均（「ｗｔ」）、患者細胞、及びによる処理（「ＮＴ ＮＡ」）と比較した、コドン最適化ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂ（「ＴＤ」）のＡＡＶ９媒介形質導入後のＲＮＡレベルを示す。図９Ａ及び９Ｂは、健常対照ＣＭレベル及びＰＫＰ２患者ＣＭレベル（形質導入なし）を形質導入後の患者細胞のＰＫＰ２レベルと比較した、形質導入後の総タンパク質レベルを示す。図９Ａでは総ＰＫＰ２タンパク質レベルを内在性ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）レベルに対して求め、図９ＢではＰＫＰ２タンパク質レベルを内在性心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）レベルに対して求めている。図８～９に示されるとおり、形質導入は、ＰＫＰ２患者ＣＭにおいて総ＰＫＰ２レベルを回復させている。これは、図７に示されるとおり、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａが優勢のアイソフォームであっても、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂの外因性発現を使用して達成される。
図８Ａ及び８Ｂは、ＮＦＨ細胞及び２つの無関係の対照の細胞の平均（「ｗｔ」）、患者細胞、及びによる処理（「ＮＴ ＮＡ」）と比較した、コドン最適化ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂ（「ＴＤ」）のＡＡＶ９媒介形質導入後のＲＮＡレベルを示す。図９Ａ及び９Ｂは、健常対照ＣＭレベル及びＰＫＰ２患者ＣＭレベル（形質導入なし）を形質導入後の患者細胞のＰＫＰ２レベルと比較した、形質導入後の総タンパク質レベルを示す。図９Ａでは総ＰＫＰ２タンパク質レベルを内在性ミオシン結合タンパク質Ｃ（ＭＹＢＰＣ３）レベルに対して求め、図９ＢではＰＫＰ２タンパク質レベルを内在性心筋トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）レベルに対して求めている。図８～９に示されるとおり、形質導入は、ＰＫＰ２患者ＣＭにおいて総ＰＫＰ２レベルを回復させている。これは、図７に示されるとおり、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａが優勢のアイソフォームであっても、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂの外因性発現を使用して達成される。
実施例５：デスモソームタンパク質複合体における他のタンパク質の回復
図１０Ａ及び１０Ｂは、コドン最適化ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂの形質導入ＡＡＶ９媒介形質導入後の患者ＣＭと比較した、未処理患者ＣＭにおけるデスモプラキン１、デスモプラキン２、デスモコリン２、プラコグロビン、デスモグレイン２、コネキシン４３を含むデスモソームタンパク質複合体の各種タンパク質の発現を示す。理論に縛られることを望まないが、外因性ＰＫＰ２の発現が、ＰＫＰ２に関してハプロ不全の細胞と比較して、各種デスモソームタンパク質のアップレギュレーションをもたらすと考えられる。
図１０Ａ及び１０Ｂは、コドン最適化ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂの形質導入ＡＡＶ９媒介形質導入後の患者ＣＭと比較した、未処理患者ＣＭにおけるデスモプラキン１、デスモプラキン２、デスモコリン２、プラコグロビン、デスモグレイン２、コネキシン４３を含むデスモソームタンパク質複合体の各種タンパク質の発現を示す。理論に縛られることを望まないが、外因性ＰＫＰ２の発現が、ＰＫＰ２に関してハプロ不全の細胞と比較して、各種デスモソームタンパク質のアップレギュレーションをもたらすと考えられる。
上記の説明では、本発明の完全な理解を提供するために、特定の材料、寸法、プロセスパラメータなどの多くの具体的な詳細が述べられている。特定の特徴、構造、材料、または特性は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせられ得る。「例」または「例示的な」という単語は、本明細書では、例（ｅｘａｍｐｌｅ）、実例（ｉｎｓｔａｎｃｅ）、または実例（ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ）として役立つことを意味するために使用される。本明細書に「例」または「例示的」として説明されるいかなる態様または設計も、必ずしも、他の態様または設計よりも好ましいまたは有利と解釈されるべきではない。むしろ、「例」または「例示的な」という単語の使用は、具体的に概念を提示することを単に意図する。本出願で使用される場合、「または」は、排他的な「または」ではなく包含的な「または」を意味することが意図される。すなわち、別様に指定されない限り、または文脈から明らかでない限り、「ＸはＡまたはＢを含む」とは、あらゆる自然な包括的置換を意味することが意図される。すなわち、ＸがＡを含む場合、ＸがＢを含む場合、またはＸがＡとＢの両方を含む場合には、「ＸはＡまたはＢを含む」は、あらゆる上記の実例の下で満たされる。「一実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「特定の実施形態（ｃｅｒｔａｉｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）」、または「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」に対する本明細書全体での言及は、その実施形態と関係して記載される特定の機能、構造、または特性が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体の様々な箇所で出現するフレーズ「一実施形態」、「特定の実施形態」、または「一実施形態」は、必ずしもすべて同じ実施形態を言及しているわけではない。
本発明を、その特定の例示的な実施形態を参照して説明された。したがって、明細書及び図面は、限定する意味ではなくて例示的なものと見なされる。本明細書に示され記載されたものに加えて、本発明の様々な改変形態が、当業者にとって明らかとなり、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
下記配列番号１は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａのタンパク質コード配列を含むｍＲＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ１２６１９９．１）のｃＤＮＡコピーである。
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下記配列番号２は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列（５’から３’）である。
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下記配列番号３は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａのアミノ酸配列である。
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下記配列番号４は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂをコードするコドン最適化ＤＮＡ配列（５’から３’）である。
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下記配列番号５は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂのアミノ酸配列である。
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下記配列番号６は、ＴＮＮＴ２プロモーターをコードする核酸配列（５’から３’）である。
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下記配列番号７は、心筋細胞においてＰＫＰ２アイソフォーム２ｂを発現させるための例示的なベクター構築物である。
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Claims (40)
- 対象において心筋症を治療または予防する方法であって、前記方法は、治療用量の遺伝子治療ベクターを前記対象の心筋細胞に送達することを含み、前記心筋細胞は、プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）に関してハプロ不全であり、前記遺伝子治療ベクターは、ＰＫＰ２またはその機能的変異体をコードする核酸配列を含み、前記心筋細胞への前記遺伝子治療ベクターの送達は、前記心筋細胞によるＰＫＰ２の総デスモソーム発現の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍の増加をもたらす、前記方法。
- 対象において心筋症を治療または予防する方法であって、前記方法は、治療用量の遺伝子治療ベクターを前記対象の心筋細胞に送達することを含み、前記心筋細胞は、プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）に関してハプロ不全であり、前記遺伝子治療ベクターは、ＰＫＰ２またはその機能的変異体をコードする核酸配列を含み、前記心筋細胞への前記遺伝子治療ベクターの送達は、非ハプロ不全心筋細胞による総デスモソーム発現の少なくとも５０％である、前記ＰＫＰ２の総デスモソーム発現をもたらす、前記方法。
- 前記遺伝子治療ベクターは、ウイルスベクターを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、それらの変異体、及びそれらの組み合わせの１つまたは複数を含む、請求項３に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９を含む、請求項３に記載の方法。
- 前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ６を含む、請求項３に記載の方法。
- 前記核酸配列は、心臓特異的プロモーターをさらにコードする、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
- 前記治療用量は、前記対象の前記心筋細胞による前記ＰＫＰ２またはその機能的変異体の産生を引き起こすことによって不整脈原性右室心筋症（ＡＲＶＣ）を治療または予防するのに有効である、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
- 前記治療用量の前記送達は、静脈内に行われる、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
- 前記対象は、ヒト対象である、請求項１～９のいずれかに記載の方法。
- 対象の心筋細胞内で核酸配列を発現させるために適合される遺伝子治療ベクターであって、前記核酸配列は、
ＰＫＰ２またはその機能的変異体をコードする第１の配列と、
心臓特異的プロモーターを含む第２の配列と
を含み、
ＰＫＰ２に関してハプロ不全の心筋細胞への前記遺伝子治療ベクターの送達は、前記心筋細胞によるＰＫＰ２の総デスモソーム発現の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍の増加をもたらす、前記遺伝子治療ベクター。 - 対象の心筋細胞内の核酸配列を発現させるために適合される遺伝子治療ベクターであって、前記核酸配列は、
ＰＫＰ２またはその機能的変異体をコードする第１の配列と、
心臓特異的プロモーターを含む第２の配列と
を含み、
ハプロ不全の心筋細胞への前記遺伝子治療ベクターの送達は、非ハプロ不全心筋細胞による総デスモソーム発現の少なくとも５０％である、前記ＰＫＰ２の総デスモソーム発現をもたらす、前記遺伝子治療ベクター。 - 前記遺伝子治療ベクターは、ウイルスベクターを含む、請求項１１または請求項１２のいずれかに記載の遺伝子治療ベクター。
- 前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、それらの変異体、及びそれらの組み合わせの１つまたは複数を含む、請求項１３に記載の遺伝子治療ベクター。
- 前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９を含む、請求項１３に記載の遺伝子治療ベクター。
- 前記心臓特異的プロモーターは、ＴＮＮＴ２または少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、もしくは７０％の類似性を有する機能的配列を含む、請求項１１～１５のいずれかに記載の遺伝子治療ベクター。
- 前記対象は、ヒト対象である、請求項１１～１５のいずれかに記載の遺伝子治療ベクター。
- 対象において心筋症を治療または予防するための治療用製剤であって、前記治療用製剤は、
薬学的に許容される賦形剤または担体と、
ＰＫＰ２またはその機能的変異体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターと
を含み、
ＰＫＰ２に関してハプロ不全の心筋細胞への前記治療用製剤の送達は、前記心筋細胞によるＰＫＰ２の総デスモソーム発現の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍の増加をもたらす、前記治療用製剤。 - 対象において心筋症を治療または予防するための治療用製剤であって、前記治療用製剤は、
薬学的に許容される賦形剤または担体と、
ＰＫＰ２またはその機能的変異体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターと
を含み、
ハプロ不全の心筋細胞への前記治療用製剤ベクターの送達は、非ハプロ不全心筋細胞による総デスモソーム発現の少なくとも５０％である、前記ＰＫＰ２の総デスモソーム発現をもたらす、前記治療用製剤。 - それぞれが１つまたは複数の非ＰＫＰ２サルコメアタンパク質またはその機能的変異体をコードする核酸配列を含む１つまたは複数の追加のウイルスベクターをさらに含む、請求項１８または請求項１９のいずれかに記載の治療用製剤。
- 前記対象は、ヒト対象である、請求項１８～２０のいずれかに記載の治療用製剤。
- 変異したＰＫＰ２遺伝子を有する心筋細胞を機能的ＰＫＰ２またはその機能的変異体を発現するよう遺伝子改変する方法であって、前記方法は、
前記心筋細胞に前記機能的ＰＫＰ２をコードする核酸配列をトランスフェクトまたは形質導入することを含み、前記トランスフェクションまたは前記形質導入は、前記心筋細胞による前記機能的ＰＫＰ２の総デスモソーム発現の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍の増加をもたらす、前記方法。 - 変異したＰＫＰ２遺伝子を有する心筋細胞を機能的ＰＫＰ２またはその機能的変異体を発現するよう遺伝子改変する方法であって、前記方法は、
前記心筋細胞に前記機能的ＰＫＰ２をコードする核酸配列をトランスフェクトまたは形質導入することを含み、前記トランスフェクションまたは前記形質導入は、変異していないＰＫＰ２遺伝子を有する心筋細胞による総デスモソーム発現の少なくとも５０％である、前記機能的ＰＫＰ２の総デスモソーム発現をもたらす、前記方法。 - 前記核酸配列は、ＡＡＶ６またはＡＡＶ９を含むウイルスベクターにより送達される、請求項２２または２３のいずれかに記載の方法。
- 前記ウイルスベクターは、ＡＡＶ６を含む、請求項２４に記載の方法。
- 前記核酸配列は、心臓特異的プロモーターをさらにコードする、請求項２２～２５のいずれかに記載の方法。
- 前記心臓特異的プロモーターは、ＴＮＮＴ２または少なくとも９９％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、もしくは７０％の類似性を有する機能的配列を含む、請求項２６に記載の方法。
- 前記ＰＫＰ２は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａである、請求項１～１０または２２～２７のいずれかに記載の方法。
- 前記ＰＫＰ２は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂである、請求項１～１０または２２～２７のいずれかに記載の方法。
- 前記ＰＫＰ２は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａである、請求項１１～２１のいずれかに記載の遺伝子治療ベクターまたは治療用製剤。
- 前記ＰＫＰ２は、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂである、請求項１１～２１のいずれかに記載の遺伝子治療ベクターまたは治療用製剤。
- 対象において心筋症を治療または予防するための治療用製剤であって、前記治療用製剤は、
薬学的に許容される賦形剤または担体と、
ＰＫＰ２アイソフォーム２ａまたはその機能的変異体をコードする核酸配列を含む第１のウイルスベクターと、
ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂまたはその機能的変異体をコードする核酸配列を含む第２のウイルスベクターと
を含み、
ＰＫＰ２アイソフォーム２ａまたはアイソフォーム２ｂに関してハプロ不全の心筋細胞への前記治療用製剤の送達は、前記心筋細胞によるＰＫＰ２アイソフォーム２ａまたはアイソフォーム２ｂの総デスモソーム発現の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍の増加をもたらす、前記治療用製剤。 - 対象において心筋症を治療または予防するための治療用製剤であって、前記治療用製剤は、
薬学的に許容される賦形剤または担体と、
ＰＫＰ２アイソフォーム２ａまたはその機能的変異体をコードする核酸配列を含む第１のウイルスベクターと、
ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂまたはその機能的変異体をコードする核酸配列を含む第２のウイルスベクターと
を含み、
ハプロ不全の心筋細胞への前記治療用製剤ベクターの送達は、非ハプロ不全心筋細胞による総デスモソーム発現の少なくとも５０％である、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａまたはアイソフォーム２ｂの総デスモソーム発現をもたらす、前記治療用製剤。 - 請求項１１～１７のいずれかに記載の遺伝子治療ベクターを形質導入された単離細胞。
- 前記細胞は、ヒト細胞である、請求項３４に記載の単離細胞。
- 前記細胞は、心臓細胞である、請求項３４に記載の単離細胞。
- 前記細胞は、ヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞である、請求項３４に記載の単離細胞。
- 変異したＰＫＰ２遺伝子を有する心筋細胞において１つまたは複数のデスモソームタンパク質をアップレギュレートする方法であって、前記方法は、
前記心筋細胞にＰＫＰ２アイソフォーム２ａ及びＰＫＰ２アイソフォーム２ｂから選択される機能的ＰＫＰ２をコードする核酸配列をトランスフェクトまたは形質導入することを含み、前記トランスフェクションまたは前記形質導入は、前記１つまたは複数のデスモソームタンパク質のそれぞれの総デスモソーム発現の少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍の増加をもたらし、前記１つまたは複数のデスモソームタンパク質は、デスモプラキン１、デスモプラキン２、デスモコリン２、プラコグロビン、デスモグレイン２、及びコネキシン４３から選択される、前記方法。 - 対象において心筋症を治療または予防する方法であって、前記方法は、治療用量の遺伝子治療ベクターを前記対象の心筋細胞に送達することを含み、前記心筋細胞は、プラコフィリン－２（ＰＫＰ２）に関してハプロ不全であり、前記遺伝子治療ベクターは、非優性ＰＫＰ２アイソフォームまたはその機能的変異体をコードする核酸配列を含み、前記心筋細胞への前記遺伝子治療ベクターの送達は、前記心筋細胞によるＰＫＰ２の総デスモソーム発現の少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、４倍、または５倍の増加をもたらし、前記ＰＫＰ２の前記総デスモソーム発現は、優性ＰＫＰ２アイソフォーム及び前記非優性ＰＫＰ２アイソフォームの発現を含む、前記方法。
- 前記優性ＰＫＰ２アイソフォームは、ＰＫＰ２アイソフォーム２ａであり、前記非優性ＰＫＰ２アイソフォームは、ＰＫＰ２アイソフォーム２ｂである、請求項３９に記載の方法。
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