CN111836649A - 腺相关病毒变异衣壳和其使用方法 - Google Patents

腺相关病毒变异衣壳和其使用方法 Download PDF

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4D Molecular Therapeutics Inc
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Abstract

本文提供了变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其相对于亲代AAV衣壳蛋白具有一种或多种氨基酸序列修饰，当存在于AAV病毒粒子中时，与包括未经修饰的亲代AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子对肌细胞的感染性相比，所述变异AAV衣壳蛋白赋予一种或多种类型的肌细胞增加的感染性。还提供了重组AAV病毒粒子和包括如本文所描述的变异AAV衣壳蛋白的其药物组合物；制备这些rAAV衣壳蛋白和病毒粒子的方法；以及在研究和临床实践中使用这些rAAV衣壳蛋白和病毒粒子的方法，例如在例如将核酸序列递送到一种或多种肌细胞以治疗肌肉病症和疾病方面。

Description

腺相关病毒变异衣壳和其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年9月20日提交的第62/560,901号美国临时专利申请的权益，所述申请的全部公开内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
本文公开的发明总体上涉及包括变异衣壳蛋白的腺相关病毒(AAV)病毒粒子领域和使用定向进化技术产生这种变异衣壳。
背景技术
肌肉与多种严重的遗传病症相关。肌肉是许多肌营养不良症的基因疗法中的靶组织，也可以用作生物工厂(biofactory)来产生分泌因子来治疗全身性疾病。将治疗基因递送到人类的肌肉组织可以认为是治疗肌肉相关疾病的未满足的最迫切需求。
实现肌肉定向的基因递送的一种方法是基于基因的腺相关病毒(AAV)介导的疗法，其中使用重组腺相关病毒(rAAV)将基因递送到一种或多种肌细胞以例如替换缺失的基因、纠正显性缺陷基因、或提供用于连续蛋白质疗法的模板。虽然基于AAV的临床基因疗法已经越来越成功，但是在病毒载体性质方面仍然存在缺点，包含例如以高效率靶向期望的肌细胞。因此，所属领域中需要具有优良转导能力的新颖AAV变异体，其将提供更有效的基于基因的递送到肌细胞以治疗疾病。所属领域需要这种AAV变异体，所述AAV变异体呈现出增强的肌肉转导概况-与所属领域中已知的野生型AAV和AAV变异体相比，在某些情况下，所述AAV变异体广泛地用于某些肌细胞类型，在其它情况下，所述 AAV变异体优先用于某些肌细胞类型。
天然存在的AAV是单链DNA病毒，其含有三个开放阅读框(open reading frame)，rep、cap和aap。第一个基因rep编码基因组复制必需的四种蛋白质 (Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)，第二个基因cap表达组装形成病毒衣壳的三种结构蛋白(VP1-3)，并且第三个基因表达对衣壳组装至关重要的组装激活蛋白(assembly-activating protein；AAP)。AAV取决于辅助病毒(如腺病毒或疱疹病毒)的存在进行活性复制。在没有辅助病毒的情况下，AAV形成潜伏状态，其中其基因组以游离方式维持或整合到AAVS1基因座中的宿主染色体中。
体外和体内定向进化技术可以用于选择提供优于当前基于AAV的基因递送载体的改良的AAV变异体。这种定向进化技术是所属领域中已知的并且描述于例如PCT公开WO2014/194132和Kotterman&Schaffer(《自然遗传学综述 (Nature Review Genetics)》，AOP，2014年5月20日在线出版；doi: 10.1038/nrg3742)中，这两者均以全文引用的方式并入本文中。定向进化是一种衣壳工程改造方法，其通过多轮迭代的遗传多样化和选择过程模拟自然进化，由此能够积累逐步改良生物分子(如基于AAV的病毒粒子)的功能的有益的突变。在此方法中，使野生型AAV cap基因多样化以产生经包装以产生病毒颗粒库的较大基因库，并且施加选择性压力以分离具有可以克服基因递送障碍的优良表型的独特变异体。
以下已经公开了AAV变异体：例如美国专利号9,193,956；9；186；419； 8,632,764；8,663,624；8,927,514；8,628,966；8,263,396；8,734,809；8,889,641； 8,632,764；8,691,948；8,299,295；8,802,440；8,445,267；8,906,307；8,574,583； 8,067,015；7,588,772；7,867,484；8,163,543；8,283,151；8,999,678；7,892,809； 7,906,111；7,259,151；7,629,322；7,220,577；8,802,080；7,198,951；8,318,480； 8,962,332；7,790,449；7,282,199；8,906,675；8,524,446；7,712,893；6,491,907； 8,637,255；7,186,522；7,105,345；6,759,237；6,984,517；6,962,815；7,749,492； 7,259,151和6,156,303；美国公开号2013/0295614；2015/0065562；2014/0364338； 2013/0323226；2014/0359799；2013/0059732；2014/0037585；2014/0056854； 2013/0296409；2014/0335054 2013/0195801；2012/0070899；2011/0275529； 2011/0171262；2009/0215879；2010/0297177；2010/0203083；2009/0317417；2009/0202490；2012/0220492；2006/0292117和2004/0002159；欧洲公开号2692731 A1；2383346 B1；2359865 B1；2359866 B1；2359867 B1和2357010 B1；1791858B1；1668143 B1；1660678 B1；1664314 B1；1496944 B1；1456383 B1；2341068 B1；2338900B1；1456419 B1；1310571 B1；1456383 B1；1633772 B1和1135468 B1；和国际(PCT)公开号WO 2014/124282；WO 2013/170078； WO 2014/160092；WO 2014/103957；WO 2014/052789；WO 2013/174760；WO 2013/123503；WO 2011/038187和WO 2008/124015；WO 2003/054197；然而，这些参考文献没有公开本文所公开的AAV变异体的实施例和/或特征和/或物质结构的组合物。
本文引用的和参考的专利文献中的所有文献和参考文献特此以引用的方式并入本文中。
发明内容
本文提供了变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其相对于亲代AAV衣壳蛋白具有一种或多种氨基酸序列修饰，当存在于AAV病毒粒子中时，与包括未经修饰的亲代AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子对肌细胞的感染性相比，所述变异 AAV衣壳蛋白赋予一种或多种类型的肌细胞增加的感染性。还提供了重组AAV 病毒粒子和包括如本文所描述的变异AAV衣壳蛋白的其药物组合物；制备变异 rAAV衣壳蛋白和病毒粒子的方法；以及在研究和临床实践中使用这些rAAV衣壳蛋白和病毒粒子的方法，例如将核酸序列递送到一种或多种肌细胞以治疗病症和疾病方面。
在本公开的一些方面，提供了变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，这些变异AAV衣壳蛋白相对于亲代AAV衣壳具有一种或多种氨基酸序列修饰，当存在于AAV病毒粒子中时，与包括不包括所述氨基酸序列修饰的亲代AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子对肌细胞的感染性相比，所述变异AAV衣壳蛋白赋予一种或多种类型的肌细胞(例如骨骼肌细胞和/或心肌细胞)增加的感染性。在本公开的相关方面，当存在于AAV病毒粒子中时，变异AAV衣壳蛋白还赋予通过抗AAV抗体对中和的增强的抗性。
在本公开的一些方面，提供了重组AAV(rAAV)病毒粒子，这些rAAV病毒粒子包括如本文所描述的变异衣壳蛋白，其中相对于包括相应的未经修饰的亲代AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子对肌细胞的感染性，所述rAAV病毒粒子呈现出对一种或多种类型的肌细胞(例如骨骼肌细胞和/或心肌细胞)增加的感染性。在一些实施例中，相对于包括亲代AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子，所述rAAV病毒粒子呈现出对所有肌细胞增加的感染性。在其它实施例中，所述 rAAV病毒粒子呈现出对某些肌细胞类型而不是相对于包括亲代AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子的其它细胞类型的增加的感染性。换句话说，rAAV病毒粒子呈现出对某些肌细胞类型而非其它类型优先的增加的感染性，例如，rAAV表现出优先对一种或多种选自骨骼肌成纤维细胞、骨骼肌卫星细胞、心肌成纤维细胞、心肌祖细胞、平滑肌细胞和/或隔膜肌细胞的细胞类型的增加的感染性，但并未证明对所有细胞类型有增加的感染性。
在一些实施例中，所述rAAV病毒粒子包括异源核酸。在一些此类实施例中，所述异源核酸对编码多肽的RNA进行编码。在其它此类实施例中，所述异源核酸序列对不编码多肽的RNA进行编码，例如异源核酸序列为RNA干扰剂、核酸酶的指导RNA等。
本文还提供了包括本发明感染性rAAV病毒粒子和药学上可接受的载剂的药物组合物。
还提供了包括如本文所描述的变异衣壳蛋白的rAAV病毒粒子在通过使靶细胞与rAAV病毒粒子接触而将异源核酸递送到靶细胞(如心肌细胞)的方法中的用途。在一些实施例中，所述靶细胞在体内，如在需要治疗心血管病症的个体的心脏中。在其它实施例中，所述靶细胞在体外。
还提供了通过向需要此类治疗的个体给予有效量的包括如本文中所描述的变异衣壳蛋白的rAAV病毒粒子或包括有效量的rAAV病毒粒子的药物组合物来治疗和/或预防疾病((例如心肌或骨骼肌病症)的方法。
还提供了一种包括对如本文所描述的变异AAV衣壳蛋白进行编码的序列的分离核酸和包括所述分离核酸的宿主细胞。在又其它实施例中，所述分离核酸和/或分离宿主细胞包括rAAV。
在一些方面，相对于相应的亲代AAV衣壳蛋白，所述变异AAV衣壳蛋白包括在衣壳蛋白的GH-环中插入约5个氨基酸到约20个氨基酸(“异源肽”或“肽插入”)，其中当存在于AAV病毒粒子中时，与包括相应的亲代AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子对肌细胞的感染性相比，所述变异衣壳蛋白赋予对肌细胞增加的感染性。在一些实施例中，所述肽包括选自以下组成的组的序列：NKIQRTD (SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)、TNKIGVT(SEQ ID NO:15)、 GNLTKGN(SEQ ID NO:16)、NTVKLST(SEQ ID NO:17)、SNTVKAI(SEQ ID NO:18)、ASNITKA(SEQ ID NO:19)、DNTVTRS(SEQ ID NO:20)、NKISAKD (SEQ ID NO:21)、NQDYTKT(SEQ ID NO:22)、QADTTKN(SEQ ID NO:23)、 TNRTSPD(SEQ ID NO:24)、SNTTQKT(SEQ IDNO:25)、ASDSTKA(SEQ ID NO:26)、LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)、 LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)、LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)、 LANTVKLSTA(SEQ ID NO:31)、LASNTVKAIA(SEQ ID NO:32)、 LAASNITKAA(SEQ ID NO:33)、LADNTVTRSA(SEQ ID NO:34)、 LANKISAKDA(SEQ ID NO:35)、LANQDYTKTA(SEQ ID NO:36)、 LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)、LATNKIGVTA(SEQ ID NO:38)、 LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)、LATNRTSPDA(SEQ ID NO:40)、 LASNTTQKTA(SEQ ID NO:41)和LAASDSTKAA(SEQ ID NO:42)或主要由其组成。在一些优选实施例中，肽包括选自以下组成的组的序列：NKIQRTD (SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQID NO:14)、TNKIGVT(SEQ ID NO:15)、LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、LANKTTNKDA(SEQ IDNO:28)、 LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)和LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)或主要由其组成。
在一些方面，变异AAV衣壳蛋白相对于相应的亲代AAV衣壳蛋白包括一个或多个氨基酸取代，其中当存在于AAV病毒粒子中时，与包括相应的亲代 AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子对肌细胞的感染性相比，所述变异衣壳蛋白赋予对肌细胞增加的感染性。
在一些实施例中，公开了一种变异AAV衣壳蛋白，其相对于AAV2包括 P363L取代并且任选地，相对于AAV2进一步包括E347K和/或V708I取代。
在相关方面，相对于相应的亲代AAV衣壳蛋白，所述变异AAV衣壳蛋白包括肽插入和一个或多个氨基酸取代，其中当存在于AAV病毒粒子中时，与包括相应的亲代AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子对肌细胞的感染性相比，所述变异衣壳蛋白赋予对肌细胞增加的感染性。在若干实施例中，提供了相对于AAV2 包括肽插入和V708I取代的变异AAV衣壳蛋白，其中所述肽插入任选地选自以下组成的组：NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)、TNKIGVT(SEQ ID NO:15)、GNLTKGN(SEQ ID NO:16)、NTVKLST(SEQ ID NO:17)、SNTVKAI(SEQID NO:18)、ASNITKA(SEQ ID NO:19)、DNTVTRS (SEQ ID NO:20)、NKISAKD(SEQ ID NO:21)、NQDYTKT(SEQ ID NO:22)、 QADTTKN(SEQ ID NO:23)、TNRTSPD(SEQ ID NO:24)、SNTTQKT(SEQ ID NO:25)、ASDSTKA(SEQ ID NO:26)、LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、 LANKTTNKDA(SEQID NO:28)、LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)、 LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)、LANTVKLSTA(SEQID NO:31)、 LASNTVKAIA(SEQ ID NO:32)、LAASNITKAA(SEQ ID NO:33)、 LADNTVTRSA(SEQID NO:34)、LANKISAKDA(SEQ ID NO:35)、 LANQDYTKTA(SEQ ID NO:36)、LATNKIGVTS(SEQID NO:37)、LATNKIGVTA(SEQ ID NO:38)、LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)、 LATNRTSPDA(SEQID NO:40)、LASNTTQKTA(SEQ ID NO:41)和 LAASDSTKAA(SEQ ID NO:42)，优选地选自以下组成的组：NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)、TNKIGVT(SEQ ID NO:15)、LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)、 LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)和LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)。在若干实施例中，提供一种相对于AAV2P包括肽插入和363L取代的变异AAV衣壳蛋白，其中所述肽插入任选地选自以下组成的组：GNLTKGN(SEQ ID NO:16)、 LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)、QADTTKN(SEQ ID NO:23)和 LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)。
在一些实施例中，公开了一种变异AAV衣壳蛋白，其包括异源肽 LANKIQRTDA(SEQID NO:27)并相对于AAV2包括V708I取代并且任选地，相对于AAV2进一步包括A593E和/或S109T和/或T330A和/或R588M取代。在其它实施例中，公开了一种包括异源肽LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)并相对于AAV2包括A35P取代的变异AAV衣壳蛋白。在其它实施例中，公开了一种变异AAV衣壳蛋白，其包括异源肽LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)并相对于AAV2包括氨基酸取代N312K、N449D、N551S、I698V和L735Q，并且任选地，相对于AAV2进一步包括V708I取代。
在一些实施例中，公开了一种变异AAV衣壳蛋白，其包括异源肽 LANKTTNKDA(SEQID NO:28)并相对于AAV2包括V708I取代并且任选地，相对于AAV2进一步包括S109T和/或W694C和/或W606C取代。在其它实施例中，公开了一种包括异源肽LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)并相对于 AAV2包括I698V取代的变异AAV衣壳蛋白。在其它实施例中，公开了一种变异AAV衣壳蛋白，其包括异源肽LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)并相对于 AAV2包括氨基酸取代N312K、N449D、N551S、I698V和L735Q，并且任选地，相对于AAV2进一步包括V708I取代。
在一些实施例中，公开了一种变异AAV衣壳蛋白，其包括异源肽 LATNKIGVTA(SEQID NO:29)并相对于AAV2包括V708I取代并且任选地，相对于AAV2进一步包括N449K和/或G222S取代。在其它实施例中，公开了一种变异AAV衣壳蛋白，其包括异源肽LATNKIGVTA(SEQID NO:29)并相对于AAV2包括氨基酸取代N312K、N449D、N551S、I698V和L735Q，并且任选地，相对于AAV2进一步包括V708I取代。
在一些实施例中，公开了一种包括如本文所描述的异源肽并相对于AAV2 包括P363L取代的变异AAV衣壳蛋白。
本文还公开了用于制造和/或递送包括如本文中公开的变异AAV衣壳的 rAAV的方法。另外，本文提供了包括rAAV的试剂盒和用于本文所描述的方法的用途，所述rAAV包括如本文所公开的变异AAV衣壳。
在其它实施例中，包括前述段落中的变异衣壳蛋白的AAV病毒粒子可以并入前述或随后公开的实施例中的任一个。实际上，应了解，为清楚起见在单独的实施例的背景下所描述的本发明的某些特征也可以在单个实施例中组合提供。相反地，为简洁起见而在单个实施例的背景下所描述的本发明的各种特征还可以分开地或以任何适合的子组合形式提供。本发明具体涵盖与本发明有关的实施例的所有组合，并且在本文中公开，就如同每一和每个组合被单独和明确地公开一样。此外，本发明还具体涵盖了各种实施例及其要素的所有子组合，并且在本文中公开，就如同每一和每个此类子组合在本文中单独和明确地公开一样。
发明内容并非旨在限定权利要求，也不旨在以任何方式限制本发明的范围。
本文中所公开的本发明的其它特征和优点将从以下图式、具体实施方式和权利要求书显而易见。
附图说明
当结合附图阅读时从以下详细描述中最好地理解本发明。本专利或申请文件含有至少一幅彩图。具有一个或多个彩图的这种专利或专利申请公开的拷贝将在请求和支付必需费用之后由专利局提供。应强调，根据惯例，附图的各种特征未按比例绘制。相反，为了清晰起见，各种特征的尺寸经过任意扩大或缩小。附图中包括以下诸图。
图1描绘了定向进化方法的实施例。步骤(a)描绘了包括DNA突变技术和cap基因的组合的病毒衣壳库的产生。步骤(b)描绘了病毒的包装，使得每个病毒颗粒由围绕编码那个衣壳和纯化的cap基因的突变衣壳构成。然后将衣壳库置于体外或体内选择压力下。在定向进化技术的这个方面，收获相关组织或细胞材料以分离已成功感染那个靶的AAV变异体，并且回收成功的病毒。步骤(c)描绘了通过重复选择进行成功克隆的阶段1富集。步骤(d)描绘了所选择的cap基因的阶段2富集，所选择的cap基因经历再多样化和进一步选择步骤以迭代地增加病毒适应性。步骤(e)描绘了在载体选择阶段1和2期间鉴别为命中物的变异体，其将作为重组AAV载体制造并且表征各种细胞类型和组织靶的转导水平。根据AAV定向进化过程的性质，本文所公开的变异体已经证明在选择过程期间转导肌细胞并递送基因组(对变异cap基因进行编码的基因组)的能力。
图2展示来自心脏和骨骼肌组织的病毒基因组从代表性选择轮次的PCR扩增。红框内的条带表示病毒基因组的成功扩增。
图3A-3C展示测序分析内的基序的频率。图3A提供用于静脉内递送到心肌组织的选择性压力的轮次4测序分析。图3B提供用于在中和抗体存在下静脉内递送到心肌组织的选择性压力的轮次2测序分析。图3C提供用于静脉内递送到骨骼肌组织的选择性压力的轮次3测序分析。图3A展示57.40％ LANKIQRTDA基序、16.96％LANKTTNKDA基序、7.32％A593E基序、7.32％其它、4.88％V708I基序和4.88％LASNTVKAIA基序。图3B展示21.14％其它、20.33％LAQADTTKNA基序、15.45％LANKTTNKDA基序、15.45％ LAASNITKAA基序、15.45％AAV6/AAV5嵌合体基序和12.20％LANTVKLSTA 基序。图3C展示43.21％A593E基序、41.98％P363L基序和14.81％其它。
图4A-4C图4A是含有在氨基酸587和V708I取代之后的随机七聚体的 AAV2的代表性三维模型。图4B为含有V229I、A490T和A581T取代(对应于示为SEQ ID NO:62的氨基酸序列)的AAV6/AAV5嵌合体的代表性三维模型。图4C为含有P363L取代的AAV2的代表性三维模型。
图5提供了野生型AAV SEQ ID NO:1-11的比对，其展示了野生型(天然存在的)血清型AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B与AAV4-10之间和跨越其的氨基酸位置。
图6A-6E提供了关于通过重组AAV病毒在体外转导人心肌细胞的数据，所述重组AAV病毒包括新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I衣壳、新颖 AAV变异体LANKTTNKDA+V708I衣壳和新颖LATNKIGVTA+V708I变异衣壳，每一种均表达在CAG启动子控制下的GFP转基因。图6A：用新颖AAV 变异体LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP、新颖AAV变异体 LANKTTNKDA+V708I.CAG.GFP、新颖AAV变异体 LATNKIGVTA+V708I.CAG.GFP或野生型对照AAV1.CAG.GFP、AAV2.CAG.GFP和AAV9.CAG.GFP以20、100、500和2500的MOI感染分化成来自人多能干细胞系的心肌细胞的细胞。在所有MOI下感染后6天对细胞培养物进行的免疫荧光成像表明，与野生型AAV1、AAV2或AAV9衣壳相比，新颖AAV变异衣壳能更好地转导心肌细胞。图6B：通过流式细胞测量术对每个培养物中的GFP-阳性心肌细胞百分比的定量揭露新颖AAV变异衣壳提供对野生型AAV1、AAV2或AAV9衣壳所转导的细胞数目的显著的、剂量依赖性改良。*p<0.05图6C-6D：通过蛋白质印迹(Western blot)对每个培养物中的GFP 的量的定量揭露新颖AAV变异体提供了转基因对野生型AAV1、AAV2或AAV9 衣壳的表达的显著改良。NT＝未转导。图6E：用新颖AAV变异体 LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP、新颖AAV变异体 LANKTTNKDA+V708I.CAG.GFP、新颖AAV变异体 LATNKIGVTA+V708I.CAG.GFP或野生型对照AAV1.CAG.GFP、AAV2.CAG.GFP和AAV9.CAG.GFP感染分化成来自人多能干细胞系的心肌细胞的细胞。在500的MOI下，感染后第1、2、3和5天对细胞培养物进行的免疫荧光成像表明，与野生型AAV1、AAV2或AAV9衣壳相比，新颖AAV变异衣壳能更好地转导心肌细胞并更早开始表达GFP转基因。
图7A-E提供了关于通过重组AAV病毒在体外转导人心肌细胞的数据，所述重组AAV病毒包括SEQ ID NO:62的新颖AAV变异AAV6/AAV5嵌合体衣壳，在CAG启动子的控制下表达GFP转基因。图7A：在100、500和2500的 MOI下，用新颖AAV变异AAV6/AAV5嵌合体衣壳或野生型对照 AAV1.CAG.GFP、AAV8.CAG.GFP和AAV9.CAG.GFP感染分化成来自人多能干细胞系的心肌细胞的细胞。在所有MOI下感染后6天对细胞培养物进行的免疫荧光成像表明，与野生型AAV1、AAV8或AAV9衣壳相比，新颖AAV变异衣壳能更好地转导心肌细胞。图7B：通过流式细胞测量术对每个培养物中的 GFP-阳性心肌细胞百分比的定量揭露新颖AAV变异衣壳提供对野生型AAV1、 AAV8或AAV9衣壳所转导的细胞数目的显著的、剂量依赖性改良。*p<0.05图7C-7D：通过蛋白质印迹对每个培养物中的GFP的量的定量揭露新颖AAV变异体提供了转基因对野生型AAV1、AAV8或AAV9衣壳的表达的显著改良。媒剂＝未转导。图7E：用新颖AAV变异AAV6/AAV5嵌合体衣壳或野生型对照 AAV8.CAG.GFP感染分化成来自人多能干细胞系的心肌细胞的细胞。在以2500 的MOI感染后第3、4、5和6天的细胞培养物的免疫荧光成像表明，与野生型 AAV8衣壳相比，新颖AAV变异衣壳能更好地转导心肌细胞并更早开始表达 GFP转基因。
图8A-C提供了关于通过重组AAV病毒在体外转导人骨骼肌纤维的数据，所述重组AAV病毒包括新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I衣壳、新颖 AAV变异体LANKTTNKDA+V708I衣壳和新颖变异AAV6/AAV5嵌合体衣壳，每一种均表达在CAG启动子控制下的GFP转基因。图8A：用新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP、新颖AAV变异体 LANKTTNKDA+V708I.CAG.GFP、新颖AAV变异AAV6/AAV5嵌合体.CAG.GFP或野生型对照AAV8.CAG.GFP和AAV9.CAG.GFP以100、500和 2500的MOI感染分化成来自人原代成肌细胞(human primarymyoblast)的骨骼肌纤维的细胞。在所有MOI下感染后7天对细胞培养物进行的免疫荧光成像表明，与野生型AAV8或AAV9衣壳相比，新颖AAV变异衣壳能更好地转导骨骼肌纤维。图8B：通过流式细胞测量术对每个培养物中的GFP-阳性骨骼肌纤维百分比的定量揭露新颖AAV变异衣壳提供对野生型AAV8或AAV9衣壳所转导的细胞数目的显著的、剂量依赖性改良。*p<0.05图8C：用新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP、新颖AAV变异AAV6/AAV5嵌合体.CAG.GFP或野生型对照AAV8.CAG.GFP和AAV9.CAG.GFP感染分化成来自人原代成肌细胞的骨骼肌纤维的细胞。在2500的MOI下，感染后第2-7天对细胞培养物进行的免疫荧光成像表明，与野生型AAV8或AAV9衣壳相比，新颖AAV变异衣壳能更好地转导骨骼肌纤维并更早开始表达GFP转基因。
图9A-B提供了关于通过重组AAV病毒在体外转导人肌肉祖细胞的数据，所述重组AAV病毒包括新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I衣壳、新颖 AAV变异体LANKTTNKDA+V708I衣壳和新颖AAV变异AAV6/AAV5嵌合体衣壳，每一种均表达在CAG启动子的控制下的GFP转基因。图9A：用新颖 AAV变异体LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP、新颖AAV变异体 LANKTTNKDA+V708I.CAG.GFP、新颖AAV变异AAV6/AAV5嵌合体.CAG.GFP或野生型对照AAV9.CAG.GFP以500的MOI感染分化成来自人多能干细胞系的肌肉祖细胞的细胞。在所有MOI下感染后6天对细胞培养物进行的免疫荧光成像表明，与野生型AAV9相比，新颖AAV变异衣壳能更好地转导肌肉祖细胞。图9B：通过流式细胞测量术对每个培养物中的GFP-阳性肌肉祖细胞百分比的定量揭露新颖AAV变异衣壳提供对野生型AAV9所转导的细胞数目的显著改良。*p<0.05
图10A-B提供了通过重组AAV病毒在体外转导人心肌细胞和人骨骼肌纤维的数据，所述重组AAV病毒包括新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I衣壳、新颖AAV变异体LANKTTNKDA+V708I衣壳和新颖变异AAV6/AAV5嵌合体衣壳，每一种均表达在CAG启动子控制下的GFP转基因。图10A：与野生型AAV8和AAV9相比，新颖AAV衣壳变异体对人心肌细胞转导的倍数增加，血清型在临床应用中最广泛用于肌肉疾病。图10B：与野生型AAV8和AAV9 相比，新颖AAV衣壳变异体对人骨骼肌纤维转导的倍数增加。
图11A-B提供了关于通过重组AAV病毒在体内转导小鼠组织的数据，所述重组AAV病毒包括在CAG启动子的控制下表达荧光素酶转基因的新颖AAV 变异体LANKIQRTDA+V708I衣壳。通过尾静脉向小鼠单次静脉内注射每只动物2×1011个病毒基因组。图11A：在给药后第14天(左)和第28天(右)的荧光素酶的生命成像表明，新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I衣壳可在体内转导小鼠细胞。图11B：给药后56天，心脏、隔膜和四头肌中的荧光素酶活性表明，新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I衣壳可在体内转导小鼠心肌和骨骼肌。
图12A-B提供了关于通过重组AAV病毒在体内转导非人类灵长类动物骨骼肌的数据，所述重组AAV病毒包括在CAG启动子的控制下表达GFP转基因的新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I衣壳。对非人类灵长类动物进行3次肌肉内注射，每次注射1011个病毒基因组到左侧股外侧肌，给药后4周对肌肉组织进行分析。图12A：苏木精和曙红(H&E)以及抗GFP抗体染色的近端活检部位横切面在2倍、4倍和20倍放大倍数下的代表性图像表明，新颖AAV 变异体LANKIQRTDA+V708II衣壳可以在体内转导灵长类骨骼肌。图12B：苏木精和曙红(H&E)以及抗GFP抗体染色的远端活检部位的纵切面在2倍、4 倍和20倍放大倍数下的代表性图像表明，新颖AAV变异体 LANKIQRTDA+V708I衣壳可以在体内转导灵长类骨骼肌细胞。
具体实施方式
在描述本发明的方法和组合物之前，应理解本发明不限于所描述的具体方法或组合物，并且因此可以变化。还应理解，本文所使用的术语仅出于描述特定实施例的目的，并且不旨在限制性的，因为本发明的范围仅由所附权利要求书限定。
在附图和说明书中说明了本文公开的发明。然而，尽管在附图中说明了具体实施例，但是并不意图将本发明限制于具体实施例或所说明和/或公开的实施例。相反，本文所公开的发明旨在覆盖落入本发明的精神和范围内的所有修改、替代构建和等同物。因此，附图旨在是说明性的而非限制性的。
在提供数值范围的情况下，应理解还专门公开所述范围的上限与下限之间的每个中间值，直到下限单位的十分之一(除非上下文另外明确规定)。所陈述的范围内的任何所陈述值或中间值与那个所陈述范围内的任何其它所陈述值或中间值之间的每个更小范围涵盖于本发明中。这些更小范围的上限和下限可以独立地包含在所述范围内或排除在其外，并且每个范围(其中两个限值之一、没有一个、或都包含在所述更小的范围内)也涵盖在本发明内，服从所述范围中任何特别排除的限值。在所陈述的范围包含一个或两个限值时，排除了那些被包含的限值的任一个或两者的范围也包含于本发明中。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。虽然与本文所描述的那些类似或等同的任何方法和材料均可以用于本发明的实践或测试，但现在描述一些潜在且优选的方法和材料。本文所提及的所有公开均以引用的方式并入本文中，以公开和描述与所列公开相关的方法和/或材料。应理解，在存在矛盾的情况下，本公开取代所并入公开的任何公开内容。
如所属领域的技术人员在阅读本公开之后将显而易见，本文所描述和说明的个别实施例的每一个具有离散的组件和特征，所述特征可在不脱离本发明的范围或精神的情况下，容易与其它若干实施例中的任一个的特征分离或与其组合。任何所列举的方法均可以所列举事件的顺序或以逻辑上可能的任何其它顺序来进行。
应注意，如本文以及在所附权利要求书中所用的，单数形式“一个/一种 (a/an)”和“所述(the)”包含复数个指代物，除非上下文另外清晰地指示。因此，举例来说，提及“重组AAV病毒粒子”包含复数个此类病毒粒子并且提及“肌细胞”包含提及所属领域的普通技术人员已知的一种或多种肌细胞和其等同细胞等。应进一步注意，权利要求书可书写为排除任何任选的要素。因此，这样的陈述旨在用作使用与权利要求要素的叙述有关的排他性术语如“单独”、“仅”等或使用“否定”限制的前提基础。
本文所论述的公开仅针对其在本申请的提交日之前的公开内容提供。不应将本文的任何内容理解为承认本发明无权凭借先前发明而先于此类公开。另外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，实际公开日期可能需要独立地确定。
定义
腺相关病毒是一种非致病性细小病毒，其由无包膜二十面体衣壳内的4.7 kb单链DNA基因组构成。基因组含有三个开放阅读框(ORF)，侧接有作为病毒复制和包装信号起源的反向末端重复序列(inverted terminal repeat；ITR)。rep ORF对四种非结构蛋白进行编码，所述四种非结构蛋白在病毒复制、转录调节、位点特异性整合和病毒粒子组装中发挥作用。cap ORF对三种结构蛋白(VP1- 3)进行编码，所述三种结构蛋白组装以形成60-mer病毒衣壳。最后，作为cap 基因内的替代阅读框存在的ORF产生组装激活蛋白(AAP)，AAP是一种将 AAV衣壳蛋白定位于细胞核并在衣壳组装过程中起作用的病毒蛋白。
存在若干种天然存在的(“野生型”)血清型和超过100种已知的AAV变异体，所述变异体中的每一种的氨基酸序列不同，尤其是在衣壳蛋白的高变区域内以及因此在其基因递送性质方面。尚未有AAV与任何人类疾病相关，使得重组AAV对临床应用具有吸引力。
出于本文公开的目的，术语“AAV”是腺相关病毒的缩写，包含但不限于病毒本身和其衍生物。除非另有说明，否则术语是指所有亚型或血清型以及复制能力和重组形式两者。术语“AAV”包含但不限于AAV 1型(AAV-1或AAV1)、 AAV 2型(AAV-2或AAV2)、AAV 3A型(AAV-3A或AAV3A)、AAV 3B型 (AAV-3B或AAV3B)、AAV 4型(AAV-4或AAV4)、AAV 5型(AAV-5或AAV5)、AAV 6型(AAV-6或AAV6)、AAV 7型(AAV-7或AAV7)、AAV 8型 (AAV-8或AAV8)、AAV 9型(AAV-9或AAV9)、AAV 10型(AAV-10或AAV10 或AAVrh10)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、山羊AAV、马AAV、灵长类动物 AAV、非灵长类动物AAV和绵羊AAV。“灵长类动物AAV”是指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类动物AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指感染牛哺乳动物的AAV等。
各种血清型AAV的基因组序列以及天然末端重复(TR)序列、Rep蛋白和衣壳子单元是所属领域已知的。此类序列可以在文献中或在如GenBank的公共数据库中找到。参见，例如，GenBank登录号NC_002077.1(AAV1)、AF063497.1 (AAV1)、NC_001401.2(AAV2)、AF043303.1(AAV2)、J01901.1(AAV2)、 U48704.1(AAV3A)、NC_001729.1(AAV3A)、AF028705.1(AAV3B)、 NC_001829.1(AAV4)、U89790.1(AAV4)、NC_006152.1(AA5)、AF085716.1 (AAV-5)、AF028704.1(AAV6)、NC_006260.1(AAV7)、AF513851.1(AAV7)、AF513852.1(AAV8)NC_006261.1(AAV-8)、AY530579.1(AAV9)、AAT46337 (AAV10)和AAO88208(AAVrh10)；其公开内容以引用的方式并入本文中以教导AAV核酸和氨基酸序列。还参见，例如Srivistava等人，(1983)J.Virology 45:555；Chiorini等人，(1998)J.Virology 71:6823；Chiorini等人，(1999)J. Virology 73:1309；Bantel-Schaal等人，(1999)J.Virology 73:939；Xiao等人， (1999)J.Virology 73:3994；Muramatsu等人，(1996)《病毒学》221:208；Shade 等人，(1986)J.Virol.58:921；Gao等人，(2002)《美国国家科学院院刊(Proc. Nat.Acad.Sci.USA)》99:11854；Moris等人，(2004)《病毒学》33:375-383；国际专利公开WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；和第6,156,303号美国专利。
与AAV血清型相关的天然存在的cap(衣壳)蛋白的序列是所属领域中已知的并且包含本文所公开的那些序列：如AAV1(SEQ ID NO:1)、AAV2(SEQ ID NO:2)、AAV3A(SEQ IDNO:3)、AAV3B(SEQ ID NO:4)、AAV4(SEQ ID NO:5)、AAV5(SEQ ID NO:6)、AAV6(SEQ ID NO:7)、AAV7(SEQ ID NO:8)、 AAV8(SEQ ID NO:9)、AAV9(SEQ ID NO:10)、AAV10(SEQ ID NO:11)和 AAVrh10(SEQ ID NO:12)。术语“变异AAV衣壳蛋白”或“AAV变异体”是指包括氨基酸序列的AAV衣壳蛋白，所述氨基酸序列包含相对于天然存在的或“野生型”AAV衣壳蛋白序列例如如本文SEQ ID NO:1-12中所示的至少一种修饰或取代(包含缺失、插入、点突变等)。变异AAV衣壳蛋白可以与野生型衣壳蛋白的氨基酸序列具有约80％一致性或更高，例如与野生型衣壳蛋白的氨基酸序列具有85％一致性或更高、90％一致或更高、或95％一致性或更高，例如与野生型衣壳蛋白具有98％或99％一致性。变异AAV衣壳蛋白可能不是野生型衣壳蛋白。
出于本文公开的目的，“AAV病毒粒子”或“AAV病毒颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的AAV多核苷酸构成的病毒颗粒。
出于本文公开的目的，术语“rAAV”是指重组腺相关病毒的缩写。如应用于多核苷酸的“重组”是指多核苷酸是克隆、限制或连接步骤的各种组合的产物、以及产生不同于在自然中找到的多核苷酸的构建体的其它过程。重组病毒是包括重组多核苷酸的病毒颗粒。所述术语分别包含原始多核苷酸构建体的复制和原始病毒构建体的后代。
术语“rAAV载体”涵盖rAAV病毒粒子(即rAAV病毒颗粒)(例如，感染性rAAV病毒粒子)，其定义包含rAAV多核苷酸；并且还涵盖对rAAV进行编码的多核苷酸(例如，对rAAV进行编码的单链多核苷酸(ss-rAAV)；对rAAV 进行编码的双链多核苷酸(ds-rAAV)，例如对rAAV进行编码的质粒；等等)。
如果AAV病毒粒子包括异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，例如待递送到靶细胞的转基因、待递送到靶细胞的RNAi剂或CRISPR 剂等)，其通常被称作“重组AAV(rAAV)病毒粒子”或“rAAV病毒颗粒”。通常，异源多核苷酸侧接至少一个并且通常两个AAV反向末端重复序列(ITR)。
术语“包装”是指产生AAV颗粒的组装和衣壳化的一系列细胞内事件。 AAV“rep”和“cap”基因是指对腺相关病毒的复制和衣壳化蛋白进行编码的多核苷酸序列。AAV rep和cap在本文中称为AAV“包装基因”。
术语AAV的“辅助病毒”是指允许AAV(例如野生型AAV)被哺乳动物细胞复制和包装的病毒。用于AAV的各种此类辅助病毒是所属领域中已知的，包含腺病毒、疱疹病毒和如牛痘病毒的痘病毒。腺病毒涵盖许多不同子组，但最常使用的是子组C中的5型腺病毒。人类、非人类哺乳动物和禽类来源的许多腺病毒是已知的并且可以从如ATCC的寄存处获得。疱疹家族的病毒包含例如单纯疱疹病毒(HSV)和爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr viruse；EBV)，以及巨细胞病毒(CMV)和伪狂犬病病毒(pseudorabies viruse；PRV)；其也可以从如ATCC的寄存处获得。
术语“一个或多个辅助病毒功能”是指在辅助病毒基因组中编码的一个或多个功能，其允许AAV复制和包装(结合本文所描述的复制和包装的其它要求)。如本文所描述，“辅助病毒功能”可以多种方式提供，包含通过提供辅助病毒或向反式生产细胞提供对一个或多个必需功能进行编码的多核苷酸序列。例如，将包括对一种或多种腺病毒蛋白进行编码的核苷酸序列的质粒或其它表达载体与rAAV载体一起转染到生产细胞中。
术语“感染性”病毒或病毒颗粒是包括有效组装的病毒衣壳并且能够将多核苷酸组分递送到病毒物种为热带的细胞中的术语。所述术语不一定意味着病毒的任何复制能力。在本公开和所属领域中描述了用于计数感染性病毒颗粒的分析。病毒感染性可以表示为感染性病毒颗粒与总病毒颗粒的比率。确定感染性病毒颗粒与总病毒颗粒的比率的方法是所属领域中已知的。参见，例如 Grainger等人(2005)《分子疗法(Mol.Ther.)》11：S337(描述TCID50感染性效价分析)；和Zolotukhin等人(1999)《基因疗法(Gene Ther.)》6:973。另见实例。
如本文所用的术语“趋向性”是指病毒(例如，AAV)优先靶向特定宿主物种的细胞或宿主物种内的特定细胞类型。举例来说，相对于仅可能感染肺和肌细胞的病毒，可以感染心脏、肺、肝和肌细胞的病毒具有更宽(即增加)的趋向性。趋向性还可以包含病毒对宿主的特定类型的细胞表面分子的依赖性。举例来说，一些病毒只可能感染具有表面糖胺聚糖的细胞，而其它病毒只可能感染具有唾液酸的细胞(这种依赖性可以使用缺乏特定类别分子的各种细胞系作为病毒感染的潜在宿主细胞进行测试)。在某些情况下，病毒的趋向性描述了病毒的相对偏好。举例来说，第一种病毒可能能够感染所有细胞类型，但在用表面糖胺聚糖感染那些细胞方面更成功。如果第二种病毒也偏好相同的特征(例如，第二种病毒在用表面糖胺聚糖感染那些细胞方面也更成功)，则可以认为第二种病毒与第一种病毒具有相似(或相同)的趋向性，即使绝对转导效率不相似。举例来说，第二种病毒在感染每种测试的给定细胞类型时可能比第一种病毒更有效，但如果相对偏好相似(或相同)，则第二种病毒仍可被认为具有与第一种病毒相似(或相同)的趋向性。在一些实施例中，相对于天然存在的病毒粒子，包括本发明变异AAV衣壳蛋白的病毒粒子的趋向性没有改变。在一些实施例中，相对于天然存在的病毒粒子，包括本发明变异AAV衣壳蛋白的病毒粒子的趋向性被扩展(即，变宽)。在一些实施例中，相对于天然存在的病毒粒子，包括本发明变异AAV衣壳蛋白的病毒粒子的趋向性降低。
术语“具有复制能力的”病毒(例如，具有复制能力的AAV)是指具有感染性并且还能够在受感染的细胞中复制(即在存在辅助病毒或辅助病毒功能的情况下)的表型野生型病毒。在AAV的情况下，复制能力通常需要存在功能性 AAV包装基因。通常，由于缺乏一种或多种AAV包装基因，如本文所描述的 rAAV载体在哺乳动物细胞(尤其在人类细胞中)中是不能复制的。通常，此类 rAAV载体缺乏任何AAV包装基因序列，以便使通过AAV包装基因与进入的 rAAV载体之间的重组产生具有复制能力AAV的可能性达到最低。在许多实施例中，如本文所描述的rAAV载体制剂是含有极少(如果有的话)复制能力AAV (rcAAV，也称为RCA)的那些载体制剂(例如，每102个rAAV颗粒小于约1 rcAAV、每104个rAAV颗粒小于约1rcAAV、每10个rAAV颗粒小于约1 rcAAV、每1012个rAAV颗粒小于约1rcAAV、或没有rcAAV)。
术语“多核苷酸”是指任何长度的聚合形式的核苷酸，包含脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以包括经修饰的核苷酸，如甲基化核苷酸和核苷酸类似物，并且可以间杂有非核苷酸组分。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后赋予对核苷酸结构的修饰。如本文所使用的术语多核苷酸可互换地指双链和单链分子。除非另外说明或要求，否则本文包括多核苷酸的任何实施例涵盖双链形式和已知或预测构成双链形式的两种互补单链形式中的每一种。
多核苷酸或多肽与另一种多核苷酸或多肽具有一定百分比的“序列一致性”，这意味着当比对时，碱基或氨基酸的百分比在与两种序列比较时是相同的。序列相似性可以以多种不同方式确定。为了确定序列一致性，可以使用包含可通过万维网ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/获得的BLAST的方法和计算机程序对序列进行比对。另一种比对算法是FASTA，其可从Oxford Molecular Group公司的全资子公司美国威斯康星州麦迪逊市的遗传计算组(Genetics Computing Group；GCG)包中获得。其它用于比对的技术描述于《酶学方法(Methods in Enzymology)》，第266卷：用于大分子序列分析的计算机方法(1996)，编辑，美国加利福尼亚州圣地亚哥Harcourt Brace&Co.的部门Doolittle，Academic Press公司。特别感兴趣的是允许序列中存在间隙的比对程序。Smith-Waterman 是一种允许序列比对间隙的算法类型。参见《分子生物学方法(Meth.Mol. Biol.)》70：173-187(1997)。此外，使用Needleman和Wunsch比对方法的GAP 程序可以用于比对序列。参见《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》48：443-453 (1970)。
术语“基因”是指在细胞中发挥某种功能的多核苷酸。例如，基因可以含有能够对基因产物进行编码的开放阅读框。基因产物的一个实例是从基因转录和转译的蛋白质。基因产物的另一个实例是被转录但未转译的RNA，例如功能性RNA产物，例如核酸酶的适体、干扰RNA、核糖体核糖核酸(rRNA)、转移核糖核酸(tRNA)、非编码RNA(ncRNA)、指导RNA等。
术语“基因表达产物”或“基因产物”是由如上文定义的特定基因的表达产生的分子。基因表达产物包含例如多肽、适体、干扰RNA、信使核糖核酸 (mRNA)、rRNA、tRNA、非编码RNA(ncRNA)等。
术语“siRNA剂”(“小干扰”或“短干扰RNA”(或siRNA))是靶向相关基因(“靶基因”)的核苷酸的RNA双链体。“RNA双链体”是指通过RNA分子的形成双链RNA区域(dsRNA)的两个区域之间的互补配对形成的结构。 siRNA被“靶向”到基因，因为siRNA的双链体部分的核苷酸序列与靶基因的核苷酸序列互补。在一些实施例中，siRNA的双链体的长度小于30个核苷酸。在一些实施例中，双链体的长度可以是29、28、27、26、25、24、23、22、21、 20、19、18、17、16、15、14、13、12、11或10个核苷酸。在一些实施例中，双链体的长度为19-25个核苷酸。在一些实施例中，siRNA介导的基因靶向是通过使用DNA指导的RNA干扰(ddRNAi)实现的，所述ddRNAi是利用DNA 构建体激活动物细胞的内源性RNA干扰(RNAi)途径的基因沉默技术。此类 DNA构建体被设计成表达处理后引起一个靶基因或多个靶基因沉默的自身互补的双链RNA，通常是短发夹RNA(shRNA)。包含内源性mRNA或病毒RNA 的任何RNA可以通过设计构建体以表达与期望mRNA靶互补的双链RNA而沉默。因此，siRNA剂的RNA双链体部分可以是被称为shRNA的短发夹结构的一部分。除了双链体部分之外，发夹结构可以含有位于形成双链体的两个序列之间的环部分。所述环的长度可以变化。在一些实施例中，环的长度为5、6、 7、8、9、10、11、12或13个核苷酸。发夹结构还可以含有3'或5'悬垂物部分。在一些实施例中，悬垂物是长度为0、1、2、3、4或5个核苷酸的3'或5'悬垂物。通常，靶基因的表达产物(例如，mRNA、多肽等)的水平被含有特异性双链核苷酸序列的siRNA剂(例如，siRNA、shRNA等)降低，所述特异性双链核苷酸序列与长度至少为19-25个核苷酸片段(例如，20-21个核苷酸序列)的靶基因转录物互补，包含5'非转译(UT)区域、ORF或3'UT区域。在一些实施例中，短干扰RNA的长度为约19-25nt。参见例如，PCT申请WO 00/44895、 WO 99/32619、WO 01/75164、WO 01/92513、WO 01/29058、WO 01/89304、WO 02/16620和WO 02/29858；以及用于描述siRNA技术的美国专利公开第 2004/0023390号。siRNA和/或shRNA可以由核酸序列编码，并且核酸序列还可以包括启动子。核酸序列还可以包含聚腺苷酸化信号。在一些实施例中，聚腺苷酸化信号是合成的最小聚腺苷酸化信号。
术语“反义RNA”涵盖与基因表达产物互补的RNA。举例来说，靶向特异性mRNA的反义RNA是基于RNA的药剂(或可以是经修饰的RNA)，所述基于RNA的药剂与mRNA互补，其中反义RNA与mRNA的杂交改变mRNA的表达(例如，通过改变RNA的稳定性、改变RNA的转译等)。“反义RNA”中还包含对反义RNA进行编码的核酸。
关于“CRISPR/Cas9药剂”，术语“CRISPR”涵盖聚集的规则间杂短回文重复/CRISPR相关(Cas)系统，其通过使用CRISPR RNA(crRNA)引导入侵核酸沉默进行进化以提供针对病毒和质粒的细菌和古细菌的适应性免疫。Cas9 蛋白(或其功能等同物和/或变异体，即Cas9类蛋白)天然含有DNA核酸内切酶活性，其依赖于蛋白质与被称为crRNA和tracrRNA(也称为指导RNA)的两种天然存在的或合成的RNA分子缔合。在一些情况下，两个分子共价连接以形成单个分子(也称为单个指导RNA(“sgRNA”))。因此，Cas9或Cas9样蛋白与DNA靶向RNA(所述术语涵盖双分子指导RNA配置和单分子指导RNA 配置两者)缔合，所述DNA靶向RNA激活Cas9或Cas9样蛋白并将蛋白质指导到靶核酸序列。
如果Cas9或Cas9样蛋白保留其天然酶功能，则它将切割靶DNA以产生双链断裂，其可导致基因组改变(即编辑：缺失、插入(当存在供体多核苷酸时)、替换等)，由此改变基因表达。Cas9的一些变异体(其变异体被术语Cas9 样涵盖)已被改变，使得它们具有降低的DNA切割活性(在某些情况下，它们切割单链而不是靶DNA的两条链，而在其它情况下，它们严重减少到没有DNA 切割活性)。具有降低的DNA切割活性(甚至没有DNA切割活性)的Cas9样蛋白仍然可以被引导到靶DNA以阻断RNA聚合酶活性。可替代地，Cas9或 Cas9样蛋白可以通过将VP64转录激活结构域与Cas9蛋白融合并用MS2-P65- HSF1辅助蛋白和在四环上包括MS2 RNA适体的单一指导RNA编码协同递送来修饰以在激活转录的细胞中形成协同激活介体(Cas9-SAM)复合物。因此，酶促失活的Cas9样蛋白可以通过靶向DNA的RNA来靶向靶DNA中的特定位置，以阻断或激活靶DNA的转录。如本文所用的术语“CRISPR/Cas9剂”涵盖如上所描述或所属领域中已知的所有形式的CRISPR/Cas9。
关于CRISPR剂的详细信息可以在以下文献中找到：例如(a)Jinek等人，《科学(Science)》2012年8月17日；337(6096):816-21：“适应性细菌免疫中的可编程双-RNA指导的DNA核酸内切酶(A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptivebacterial immunity)”；(b)Qi等人，《细胞(Cell)》2013 年2月28日；152(5):1173-83：“将CRISPR重新用作基因表达的序列特异性对照的RNA指导平台(Repurposing CRISPR as anRNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression)”，和(c)美国专利申请号13/842,859 和PCT申请号PCT/US13/32589；其全部特此以全文引用的方式并入。因此，本文所使用的术语“CRISPR剂”涵盖可以在基于Cas9的系统(例如，Cas9或 Cas9样蛋白；靶向DNA的RNA的任何组分，例如crRNA样RNA、tracrRNA 样RNA、单一指导RNA等；供体多核苷酸；等等)中使用的包括天然存在和/ 或合成序列的任何药剂(或编码此类药剂的核酸)。
“锌指核酸酶”(ZFN)是指通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工DNA核酸内切酶。ZFN可以被工程化成靶向期望的DNA 序列，并且这使得锌指核酸酶能够切割独特的靶序列。当引入细胞中时，ZFN 可以用于通过诱导双链断裂来编辑细胞中的靶DNA(例如，细胞的基因组)。对于使用ZFN的更多信息，参见例如：Asuri等人，《分子疗法》，2012年2月； 20(2):329-38；Bibikova等人，《科学》2003年5月2日；300(5620):764；Wood 等人，《科学》2011年7月15日；333(6040):307；Ochiai等人，《基因细胞》 2010年8月；15(8):87575-85；Takasu等人,《生物科学杂志(Insect Biochem Mol Biol.)》2010年10月；40(10):759-65；Ekker等人,《斑马鱼》2008年夏季； 5(2):121-3；Young等人,《美国国家科学院院刊》2011年4月26日；108(17):7052- 7；Goldberg等人，《细胞(Cell.)》2010年5月5日；140(5):678-91；Geurts等人，《科学》2009年7月24日；325(5939):433；Flisikowska等人，《公共科学图书馆综合(PLoS One)》2011；6(6):e21045.doi:10.1371/journal.pone.0021045. 电子版2011年6月13日；Hauschild等人，《美国国家科学院院刊》2011年7 月19日；108(29):12013-7；和Yu等人，Cell Res.2011年11月；21(l 1):1638- 40；其全部以引用的方式并入本文中，以用于其与ZFN有关的教导。术语“ZFN 剂”涵盖锌指核酸酶和/或包括对锌指核酸酶进行编码的核苷酸序列的多核苷酸。
术语“转录活化因子样效应核酸酶”或“TALEN”剂是指转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)。TALEN为通过将TAL(转录活化因子样)效应DNA结合结构域融合到DNA切割结构域产生的人工DNA核酸内切酶。TALEN可以被快速工程改造成实际上结合任何期望DNA序列，并且当引入细胞中时， TALEN可以通过诱导双链断裂来编辑细胞中的靶DNA(例如，细胞的基因组)。对于关于TALEN的使用的更多信息，参见例如Hockemeyer等人，《自然·生物技术(Nat Biotechnol.)》2011年7月7日；29(8):731-4；Wood等人，《科学》 2011年7月15日；333(6040):307；Tesson等人，《自然·生物技术》2011年8月 5日；29(8):695-6；和Huang等人，《自然·生物技术》2011年8月5日；29(8):699- 700；其所有均以引用的方式并入本文中以用于它们关于TALEN的教导。术语“TALEN剂”涵盖TALEN和/或包括对TALEN进行编码的核苷酸序列的多核苷酸。
术语“对照元件”或“对照序列”是指参与分子相互作用的核苷酸序列，所述核苷酸序列有助于多核苷酸的功能调节，包含多核苷酸的复制、重复、转录、剪接、转译或降解。所述调节可能影响过程的频率、速度或特异性，并且可能本质上是增强或抑制的。所属领域中已知的控制元件包含例如转录调节序列，如启动子和强化子。启动子是能够在某些条件下与RNA聚合酶结合并且引发通常位于启动子下游(3'方向)的编码区转录的DNA区域。启动子可以广泛地起作用，即在许多细胞类型(例如CAG或CMV启动子)中具有活性；或组织或细胞特异性，例如启动子可以是针对心肌细胞中表达的组织特异性的。
术语“可操作地连接(operatively linked或operably linked)”是指基因元件的并置，其中所述元件处于允许其以预期方式操作的关系中。例如，如果启动子有助于引发编码序列的转录，则启动子可操作地连接于编码区。只要保持这种功能关系，在启动子与编码区之间就可能存在中间残基。
术语“表达载体”涵盖包括对相关多肽进行编码的多核苷酸区域的载体，并且用于实现蛋白质在预期靶细胞中的表达。表达载体还可以包括与编码区可操作地连接的控制元件，以促进蛋白质在靶中的表达。控制元件和其可操作地连接以进行表达的一个基因或多个基因的组合有时被称为“表达盒”，其中许多是所属领域中已知的并可获得的，或者可以容易地由在所属领域中可获得的组分构造。
术语“异源”是指源自与其进行比较的实体的其余部分的基因型不同的实体。举例来说，通过基因工程改造技术引入到源自不同物种的质粒或载体中的多核苷酸是异源多核苷酸。从其天然编码序列中除去并与天然未发现连接的编码序列可操作地连接的启动子是异源启动子。因此，举例来说，包含对异源基因产物进行编码的异源核酸序列的rAAV是包含通常不包含在天然存在的野生型AAV中的多核苷酸的rAAV，并且编码的异源基因产物是通常不由天然存在的野生型AAV编码的基因产物。
术语“遗传改变”和“遗传修饰”(和其语法变体)在本文中可互换使用以指代其中基因元件(例如，多核苷酸)被引入除有丝分裂或减数分裂之外的细胞中的过程。所述要素对于细胞可以是异源的，或者它可以是已经存在于细胞中的元件的额外拷贝或改进版本。遗传改变可以例如通过用重组质粒或其它多核苷酸通过所属领域中已知的任何方法转染细胞来实现，如电穿孔、磷酸钙沉淀、或与多核苷酸-脂质体复合物接触。基因改变还可以例如通过用DNA或RNA 病毒或病毒载体转导或感染来实现。通常，基因元件被引入细胞中的染色体或微型染色体中；但是任何改变细胞及其后代的表型和/或基因型的改变都包含在这个术语中。
关于细胞修饰，通过外源性DNA(例如通过重组病毒)进行的术语“遗传修饰”或“转化”或“转染”或“转导”是指何时此类DNA已引入细胞内。外源性DNA的存在导致永久或瞬时的遗传变化。转化DNA可以或可以不整合 (共价连接)到细胞的基因组中。“克隆”是通过有丝分裂从单个细胞或共同祖先衍生的细胞群。“细胞系”是能够在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。
如本文所用，如果序列可用于在体外延长的细胞培养期间和/或在体内延长的时间段发挥其功能，则称细胞被“稳定地”改变、转导、遗传修饰或用基因序列转化。通常，此类细胞被“可遗传地”改变(遗传修饰)，因为引入了还可通过改变的细胞的后代遗传的遗传改变。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用以指代任何长度的氨基酸的聚合物。所述术语还涵盖已修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂化、磷酸化或与标记组分的结合。当在向哺乳动物个体递送基因产物的背景下讨论时，如抗血管生成多肽、神经保护多肽等和其组合物的多肽是指保留了完整蛋白质所需的生化功能的相应的完整多肽、或其任何片段或基因工程衍生物。类似地，提及对抗血管生成多肽进行编码的核酸、对神经保护多肽进行编码的核酸和其它用于将基因产物递送到哺乳动物个体(其可以被称为待递送到受体细胞的“转基因”)的此类核酸包含对完整多肽进行编码的多核苷酸或具有期望生化功能的任何片段或基因工程衍生物。
如本文所用，“分离的”质粒、核酸、载体、病毒、病毒粒子、宿主细胞、蛋白质或其它物质是指缺乏其它组分中的至少一些的物质的制剂，所述其它组分还可以存在于天然存在或最初由其制备的物质或类似物质中。因此，举例来说，可以通过使用纯化技术从源混合物中富集分离的物质来制备所述分离的物质。富集可以在绝对基础上测量，如每体积溶液的重量，或者可以相对于源混合物中存在的第二种潜在干扰物质进行测量。本公开的实施例的增加的富集越来越孤立。在一些实施例中，分离的质粒、核酸、载体、病毒、宿主细胞或其它物质是纯化的，例如约80％到约90％纯度、至少约90％纯度、至少约95％纯度、至少约98％纯度、或至少约99％纯度或更大的纯度。
如本文所用，术语“治疗(treatment/treating)”等是指获得期望药理学和/或生理学效果。就完全或部分预防疾病或其症状而言，所述效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的副作用而言可以是治疗性的。如本文所用，“治疗”涵盖哺乳动物，尤其人类的疾病的任何治疗，并且包含： (a)预防可能在个体中发生的疾病(和/或由疾病引起的症状)，所述个体可能易患所述疾病或有患病风险但尚未被诊断为患有所述疾病；(b)抑制疾病(和/或由疾病引起的症状)，即阻止其发展；以及(c)缓解疾病(和/或由疾病引起的症状)，即引起疾病(和/或由疾病引起的症状)消退，即改善疾病和/或疾病的一种或多种症状。举例来说，本发明组合物和方法可以针对肌肉疾病的治疗。评估肌肉疾病和其治疗的非限制性方法包含测量治疗蛋白产生(例如，肌肉活检随后进行免疫组织化学或血清采样，随后进行ELISA或"或"逻辑和活性分析)、测量心力衰竭的症状(例如，纽约心脏协会功能分类或明尼苏达州心力衰竭生活问卷(New York Heart AssociationFunctional Classification or the Minnesota Living With Heart FailureQuestionnaire))、功能性心肌状态(例如，6分钟步行测试或峰值最大耗氧量)、生物标记分析(例如，N-末端激素原脑利钠肽 (prohormone brain natriuretic peptide))、左心室功能/重塑(例如左心室射血分数或左心室收缩末期容积)、肌肉强度(例如，杜兴氏肌营养不良(Duchenne Dystrophy)、手持式测力仪、最大举重的医学研究委员会量表临床研究)、肌肉功能(例如，Vignos量表、定时功能测试、Hammersmith马达能力得分、从地板上定时爬升、步行测试、运动功能测量量表、北极星动态评估(North Star Ambulatory Assessment)、9孔钉测试(9Hole Peg Test)或费城儿童医院神经肌肉病症婴儿测试)、肌肉疾病症状(例如，神经肌肉症状得分或临床总体印象)、粒线体(例如，31P磁共振波谱)、基于问卷的生活品质评估、患者报告结果或日常活动。
术语“个体”，“宿主”，“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，并且指代哺乳动物，包含但不限于：人类；非人类灵长类动物，包含猿猴；哺乳动物运动动物(例如马)；哺乳动物农场动物(例如绵羊，山羊等)；哺乳动物宠物(狗，猫等)；和啮齿动物(例如，小鼠，大鼠等)。
在一些实施例中，个体是先前已经天然暴露于AAV并且因此携带抗AAV 抗体(即，AAV中和抗体)的人。在一些实施例中，个体是先前已经给药AAV 载体的人(并且因此可能携带抗AAV抗体)并且需要再次给药载体以治疗不同病况或进一步治疗相同病况。基于将AAV基因递送到受针对这种载剂的中和抗体影响的所有组织例如肝脏、肌肉和视网膜的临床试验中的阳性结果，存在许多此类治疗性应用/疾病靶。
如本文所用的术语“有效量”是足以实现有益或期望的临床结果的量。有效量可以在一次或多次给药中给予。出于本公开的目的，化合物(例如，感染性rAAV病毒粒子)的有效量是足以减轻、改善、稳定、逆转、预防、减缓或延迟(和/或与其相关的症状)特定疾病状态(例如，肌肉疾病)的进展的量。因此，感染性rAAV病毒粒子的有效量是能够将异源核酸有效递送到个体的靶细胞(或多个靶细胞)的感染性rAAV病毒粒子的量。有效量可以通过例如使用所属领域中熟知的技术例如RT-PCR、蛋白质印迹、ELISA、荧光或其它报道因子读数等在细胞或组织中检测由异源核酸序列编码的基因产物(RNA，蛋白质) 来临床前确定。有效量可以通过例如使用所属领域中已知的方法检测疾病的起始或进展的变化来临床上确定，例如如本文中所描述并且如所属领域中已知的 6分钟行走测试、左心室射血分数、手持式测力仪、Vignos量表等。
术语“肌细胞”或“肌肉组织”在本文中是指来源于任何种类的肌肉的细胞或细胞群，包含但不限于骨骼肌、心肌、平滑肌(例如，来自消化道、膀胱和血管)和隔膜肌肉。此类肌细胞可以是分化的或未分化的，例如成肌细胞、肌细胞、肌管、心肌细胞和成心肌细胞。由于肌肉组织易于进入循环系统，因此体内由肌细胞和组织产生和分泌的蛋白质将逻辑上进入血液以产生全身性益处，由此提供来自肌肉的持续治疗水平的蛋白质分泌。
术语“定向进化”是指体外和/或体内衣壳工程改造方法，其通过多轮迭代的遗传多样化和选择过程模拟自然进化，由此积累逐渐改进生物分子的功能的有益突变。定向进化通常涉及被称为“生物淘选(biopanning)”的体内方法，其用于从库中选择AAV变异体，所述变异体具有相关细胞或组织类型的更有效水平的感染性。
具体实施方式
腺相关病毒(AAV)是一种细小病毒家族，其具有包含在无包膜衣壳内的 4.7kb的单链DNA基因组。天然存在的AAV的病毒基因组具有2个反向末端重复序列(ITR)-其作为复制和包装信号的病毒源起作用-侧接为2个主要开放阅读框(ORF)：rep(编码在病毒复制、转录调节、位点特异性整合和病毒粒子组装中起作用的蛋白质)和cap。cap ORF对3种结构蛋白进行编码，所述三种结构蛋白组装以形成60-mer病毒衣壳。已经分离出许多天然存在的AAV变异体和血清型，并且没有一种与人类疾病相关。
AAV的重组版本可以用作基因递送载体，其中相关标记或治疗基因插入取代rep和cap的ITR之间。这些载体已经展示出在体外和体内转导分裂和非分裂细胞两者，并且可以在有丝分裂后组织中产生稳定的转基因表达多年。参见例如，Knipe DM、Howley PM，《费氏病毒学(Fields’Virology)》，美国宾夕法尼亚州费城Lippincott Williams&Wilkins，2007年；Gao G-P、Alvira MR、Wang L、Calcedo R、Johnston J、Wilson JM，来自恒河猴的作为人类基因疗法的载体的新颖腺相关病毒。《美国国家科学院院刊》(2002)；99:11854-9；Atchison RW、 Casto BC、Hammon WM，腺病毒相关的缺陷病毒颗粒，《科学(Science)》，1965； 149:754-6；Hoggan MD、Blacklow NR、Rowe WP，在各种腺病毒制剂中发现的小DNA病毒的研究：物理、生物和免疫学特征，《美国国家科学院院刊》 (1966)；55:1467-74；Blacklow NR、Hoggan MD、Rowe WP，从人体中分离腺病毒相关病毒，《美国国家科学院院刊》1967；58:1410-5；Bantel-Schaal U、zur Hausen H，从生殖器部位分离有缺陷的人类细小病毒DNA的表征，《病毒学 (Virology)》，1984；134:52-63；Mayor HD、Melnick JL，含有较小脱氧核糖核酸的病毒(细小核糖核酸病毒(picodnavirus)群)，《自然(Nature)》，1966；210:331-2；Mori S、Wang L、Takeuchi T、Kanda T，来自食蟹猴的两种两种腺相关病毒：衣壳蛋白的假型表征，《病毒学(Virology)》，2004；330:375-83； Flotte TR，基因疗法的进展和前景：重组腺相关病毒(rAAV)载体，《基因疗法 (Gene Ther)》，2004；11:805-10。
重组AAV(在本文中简称为“AAV”)在越来越多的临床试验中产生有前景的结果。然而，基因递送的障碍可能限制AAV的效用，如抗衣壳免疫反应、某些组织的低转导、不能靶向递送到特定细胞类型和相对低的携带能力。在许多情况下，没有足够的机理知识来有效地赋予具有改进AAV的能力的合理设计。作为替代方案，定向进化已成为建立满足特定生物医学需求的新颖AAV变异体的策略。定向进化策略利用遗传多样化和选择过程来积累能够逐步改进生物分子的功能的有益突变。在此过程中，通过若干方法使野生型AAV cap基因多样化以产生经包装以产生病毒粒子库的较大基因库，并且随后施加选择性压力以分离可以克服基因递送障碍的新颖变异体。重要的是，基因递送问题的机理基础不需要为功能的定向进化所知，其可以因此加速增强的载体的发展。
通常，本文公开的变异体是通过使用一种AAV库和/或多种AAV库产生的。通过病毒基因组工程改造领域的技术人员已知且可容易获得的一系列定向进化技术使cap基因突变产生此类一种AAV库或多种AAV库，所述cap基因是一种对AAV衣壳结构蛋白进行编码的基因。参见例如，Bartel等人，AM.Soc. 《基因细胞治疗学(Gene Cell Ther)》，第15Annu.Meet.20,S140(2012)；Bowles,D. 等人，《病毒学杂志(J.Virol.)》77,423-432(2003)；Gray等人，《分子治疗》 18,570-578(2010)；Grimm,D.等人，《病毒学杂志》82,5887-5911；Koerber,J.T. 等人，《分子治疗》16,1703-1709(2008)；Li W.等人，《分子治疗》16,1252-1260 (2008)；Koerber,J.T.等人，《分子生物学方法》434,161-170(2008)；Koerber,J.T.等人，《人类基因疗法》18,367-378(2007)；和Koerber,J.T.等人，《分子治疗》17,2088-2095(2009)。此类技术非限制性地如下：i)用于以预定的可修改的速率将随机点突变引入AAV cap开放阅读框(ORF)的易错PCR；ii)体外或体内病毒重组或“DNA改组”以产生AAV cap基因的随机嵌合体以得到具有多种AAV血清型的基因库；iii)通过在cap ORF中连接简并寡核苷酸而在衣壳的限定位点处的随机肽插入；iv)使用转座子诱变将肽编码序列限定插入AAV cap ORF的随机位置；v)用基于天然AAV血清型和变异体中每个氨基酸位置的保守水平生物信息设计的肽序列库替换AAV衣壳的表面环，以产生“环交换”库；vi)在AAV血清型之间的简并性位置处的随机氨基酸取代以产生祖先变异体的库(Santiago-Ortiz等人，2015)；和其此类技术的组合。
DNA改组产生嵌合体，所述嵌合体以独特并且通常有益的方式组合其亲代特性；然而，有些可能无法进行包装，这实际上会降低库的多样性。通过如但不限于上述iii-iv)的肽插入技术实现衣壳的一个或多个特定区域中的库的多样性浓度。在如上述v)的技术中，库的多样性还集中到衣壳的一个或多个特定区域中，并且此类浓度被引导到位于AAV衣壳的表面暴露环上的多个高变区上。尽管许多技术产生只有一小部分衣壳突变的变异衣壳，但这些技术可以与额外诱变策略配对以修饰完整的衣壳。
一旦产生一个AAV库或多个AAV库，病毒随后就被包装，使得每个AAV 颗粒由围绕对那个衣壳进行编码的cap基因的突变衣壳构成并纯化。然后使库的变异体经受AAV领域的技术人员已知的并且容易获得的体外和/或体内选择性压力技术。参见例如Maheshri,N.等人，《自然生物技术》24,198-204(2006)； Dalkara,D.等人，Sci.Transl.Med.5,189ra76(2013)；Lisowski,L.等人，《自然》 506,382-286(2013)；Yang,L.等人，PNAS.106,3946-3951(2009)；Gao,G.等人，《分子治疗》13,77-87(2006)；和Bell,P.等人，Hum.Gene.Ther.22,985-997 (2011)。例如但非限制性地，可以使用以下选择AAV变异体：i)亲和柱，其中不同级分的洗脱得到具有改变的结合特性的变异体；ii)原代细胞-从模拟人体细胞行为的组织样品或永生细胞系中分离-其产生具有提高的效率和/或组织特异性的AAV变异体；iii)动物模型-其模拟临床基因疗法环境-其产生已成功感染靶组织的AAV变异体；iv)人类异种移植模型，其产生已感染移植的人细胞的AAV变异体；和/或其选择技术的组合。
一旦选择了病毒，就可以通过已知技术回收它们，如但不限于腺病毒介导复制、PCR扩增、下一代测序和克隆等。随后通过重复轮次的选择技术富集病毒克隆，并分离AAVDNA以回收所选择的相关变异cap基因。此类选择的变异体可以经受进一步的修饰或突变，并且因此作为进一步选择步骤的新起点以迭代地增加AAV病毒适合度。然而，在某些情况下，已经产生了成功的衣壳而没有额外的突变。
本文所公开的AAV变异体至少部分地通过使用体内定向进化方法产生，如上文所描述的技术，所述方法涉及在静脉内给予后使用灵长类心肌和骨骼肌筛选。因此，本文所公开的AAV变异衣壳包括氨基酸序列中的一个或多个修饰，其赋予比相应的亲代AAV衣壳蛋白更有效的灵长类动物肌细胞转导。如本文所用，“相应的亲代AAV衣壳蛋白”是指与本发明变异AAV衣壳蛋白相同的野生型或变异AAV血清型的AAV衣壳蛋白，但不包括本发明变异AAV衣壳蛋白的一个或多个氨基酸序列修饰。在特定实施例中，包括如本文所描述的变异AAV衣壳蛋白的AAV在全身性或组织靶向给药之后在整个身体中具有朝向心肌和/或多个骨骼肌群组的全身性向性。
在一些实施例中，相对于相应的亲代AAV衣壳蛋白，本发明变异AAV衣壳蛋白包括通过共价连接插入AAV衣壳蛋白GH环或环IV的约5个氨基酸到约20个氨基酸的异源肽。AAV衣壳蛋白的“GH环”或环IV是指所属领域中称为AAV衣壳蛋白的GH环或环IV的溶剂可及部分。对于AAV衣壳的GH环 /环IV，参见例如van Vliet等人，(2006)《分子治疗》14:809；Padron等人， (2005)《病毒学杂志》79:5047；和Shen等人，(2007)《分子治疗》15:1955。因此，例如，插入位点可以在AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸约411-650内。举例来说，插入位点可以在AAV1 VP1的氨基酸571-612内、AAV2 VP1的氨基酸 570-611内、AAV3AVP1的氨基酸571-612内、在AAV3B VP1的氨基酸571- 612内、在AAV4 VP1的氨基酸569-610内、在AAV5 VP1的氨基酸560-601 内、在AAV6 VP1的氨基酸571到612内、在AAV7 VP1的氨基酸572到613 内、在AAV8 VP1的氨基酸573到614内、在AAV9 VP1的氨基酸571到612 内、或AAV10 VP1的氨基酸573到614内、或其任何变异体的相应氨基酸。基于各种AAV血清型的衣壳蛋白的氨基酸序列的比较，所属领域普通技术人员将知道“对应于AAV2的氨基酸”的插入位点将在任何给定AAV血清型的衣壳蛋白中。还参见图6以了解野生型AAV SEQ ID NO:1-11的比对，其提供野生型 (天然存在的)血清型AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B和AAV4-10之间和跨越其的氨基酸位置。
在某些实施例中，插入位点是位于任何野生型AAV血清型或AAV变异体的VP1的氨基酸570-614之间的两个相邻氨基酸之间的单个插入位点，例如，插入位点在位于任何AAV血清型或变异体的VP1的氨基酸570-610、氨基酸 580-600、氨基酸570-575、氨基酸575-580、氨基酸580-585、氨基酸585-590、氨基酸590-600、或氨基酸600-614的两个相邻氨基酸之间。举例来说，插入位点可以在氨基酸580与581之间、氨基酸581与582之间、氨基酸583与584 之间、氨基酸584与585之间、氨基酸585与586之间、氨基酸586与587之间、氨基酸587与588之间、氨基酸588与589之间、或氨基酸589与590之间。插入位点可以在氨基酸575与576之间、氨基酸576与577之间、氨基酸 577与578之间、氨基酸578与579之间、或氨基酸579与580之间。插入位点可以在氨基酸590与591之间、氨基酸591与592之间、氨基酸592与593 之间、氨基酸593与594之间、氨基酸594与595之间、氨基酸595与596之间、氨基酸596与597之间、氨基酸597与598之间、氨基酸598与599之间、或氨基酸599与600之间。举例来说，插入位点可以在AAV2的氨基酸587与 588之间、AAV1的氨基酸590与591之间、AAV3A的氨基酸588与589之间、 AAV3B的氨基酸588与589之间、AAV4的氨基酸584与585之间、AAV5的氨基酸575与576之间、AAV6的氨基酸590与591之间、AAV7的氨基酸589 与590之间、AAV8的氨基酸590与591之间、AAV9的氨基酸588与589之间、或AAV10的氨基酸588与589之间。
在一些实施例中，本文所公开的肽插入的长度为5个氨基酸、6个氨基酸、 7个氨基酸、8个氨基酸、9个氨基酸、10个氨基酸、11个氨基酸、12个氨基酸、13个氨基酸、14氨基酸、15个氨基酸、16个氨基酸、17个氨基酸、18个氨基酸、19个氨基酸或20个氨基酸。在另一个实施例中，本文所公开的肽插入在本文所公开的肽插入中的任何一种的氨基末端(N-末端)和/或羧基末端(C- 末端)包括1到4个间隔氨基酸。示例性间隔氨基酸包含但不限于亮氨酸(L)、丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和脯氨酸(P)。在某些实施例中，肽插入包括在N-末端处的2个间隔氨基酸和在C-末端处的2个间隔氨基酸。在其它实施例中，肽插入包括在N-末端处的2个间隔氨基酸和在C- 末端处的1个间隔氨基酸。
本文所公开的肽插入先前未描述和/或插入AAV衣壳中。不希望受理论所束缚，所公开的肽插入中的任一个的存在都可能起到降低变异衣壳对硫酸肝素 (heparinsulfate)的亲和力的作用，其可能改变病毒转导途径中的细胞外或细胞内步骤。此外，本文所公开的肽插入基序可通过添加细胞表面受体结合结构域赋予肌细胞(例如心肌细胞)增强的转导。
在一些优选实施例中，插入肽包括下式中的任一个的氨基酸序列。
在一些方面，插入肽可以是式1a的长度为7到10个氨基酸的肽：
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3
其中Y1-Y3中的每一个(如果存在的话)独立地选自Ala、Leu、Gly、Ser、 Thr、Pro
X1选自Ala、Asn、Thr、Gly、Ser、Ala、Gln和Asp
X2选自Lys、Asn、Thr、Ser、Ala和Gln
X3选自Ile、Thr、Lys、Leu、Val、Asn、Asp和Arg
X4选自Gln、Thr、Ile、Lys、Val、Ser和Tyr
X5选自Arg、Asn、Gly、Lys、Leu、Thr、Ala、Ser和Gln
X6选自Thr、Lys、Val、Gly、Ser、Ala、Arg和Pro
X7选自Asp、Thr、Asn、Ile、Ala和Ser。
在某些实施例中，式1a的插入肽包括选自以下的氨基酸序列：NKIQRTD (SEQ IDNO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)、TNKIGVT(SEQ ID NO:15)、 GNLTKGN(SEQ ID NO:16)、NTVKLST(SEQ ID NO:17)、SNTVKAI(SEQ ID NO:18)、ASNITKA(SEQ ID NO:19)、DNTVTRS(SEQID NO:20)、NKISAKD (SEQ ID NO:21)、NQDYTKT(SEQ ID NO:22)、QADTTKN(SEQ ID NO:23)、TNRTSPD(SEQ ID NO:24)、SNTTQKT(SEQ ID NO:25)和ASDSTKA(SEQ ID NO:26)。在其它实施例中，式1a的插入肽不包括选自以下的氨基酸序列： NKTTNKD(SEQ ID NO:14)、QADTTKN(SEQ ID NO:23)、TNRTSPD(SEQ ID NO:24)和NQDYTKT(SEQ ID NO:22)。
在其它方面，插入肽可以是式1b的长度为7到10个氨基酸的肽：
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3
其中Y1-Y3中的每一个(如果存在的话)独立地选自Ala、Leu、Gly、Ser、 Thr、Pro
X1选自Thr和Asn
X2选自Asn和Lys
X3选自Lys、Ile和Thr
X4选自Ile、Gln和Thr
X5选自Gly、Arg和Asn
X6选自Val、Thr和Lys
X7选自Thr和Asp
在某些实施例中，式1b的插入肽包括选自以下的氨基酸序列：NKIQRTD (SEQ IDNO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)和TNKIGVT(SEQ ID NO:15)。在其它实施例中，式1a的插入肽不包括氨基酸序列NKTTNKD(SEQ ID NO:14)。
在其它方面，插入肽可以是式1c的长度为7到10个氨基酸的肽：
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3
其中Y1-Y3中的每一个(如果存在的话)独立地选自Ala、Leu、Gly、Ser、 Thr、Pro
X1选自Thr和Asn
X2选自Asn和Lys
X3选自Lys和Ile
X4选自Ile和Gln
X5选自Gly和Arg
X6选自Val和Thr
X7选自Thr和Asp
在某些实施例中，式1c的插入肽包括选自以下的氨基酸序列：NKIQRTD (SEQ IDNO:13)和TNKIGVT(SEQ ID NO:15)。
在其它方面，插入肽可以是式1d的长度为7到10个氨基酸的肽：
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3
其中Y1-Y3中的每一个(如果存在的话)独立地选自Ala、Leu、Gly、Ser、 Thr、Pro
X1选自Asn和Thr
X2选自Asn和Lys
X3选自Lys和Thr
X4选自Ile和Thr
X5选自Gly、Lys和Thr
X6选自Lys、Arg和Val
X7选自Asp、Thr和Asn
在某些实施例中，式1d的插入肽包括氨基酸序列TNKIGVT(SEQ ID NO:15)。
在其它实施例中，插入肽包括选自以下的氨基酸序列：NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)和TNKIGVT(SEQ ID NO:15)。在相关实施例中，插入肽包括选自以下的氨基酸序列：NKIQRTD(SEQ ID NO:13)和 TNKIGVT(SEQ ID NO:15)。
在一些实施例中，插入肽包括选自以下的氨基酸序列：NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)、TNKIGVT(SEQ ID NO:15)、GNLTKGN (SEQ ID NO:16)、NTVKLST(SEQ ID NO:17)、SNTVKAI(SEQ ID NO:18)、 ASNITKA(SEQ ID NO:19)、DNTVTRS(SEQ IDNO:20)、NKISAKD(SEQ ID NO:21)、NQDYTKT(SEQ ID NO:22)、QADTTKN(SEQ ID NO:23)、TNRTSPD (SEQ ID NO:24)、SNTTQKT(SEQ ID NO:25)和ASDSTKA(SEQ ID NO:26)。
在其它优选实施例中，插入肽在选自以下的氨基酸序列的氨基和/或羧基末端处具有1到3个间隔氨基酸(Y1-Y3)：NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD (SEQ ID NO:14)、TNKIGVT(SEQ ID NO:15)、GNLTKGN(SEQ ID NO:16)、 NTVKLST(SEQ ID NO:17)、SNTVKAI(SEQ ID NO:18)、ASNITKA(SEQ ID NO:19)、DNTVTRS(SEQ ID NO:20)、NKISAKD(SEQ ID NO:21)、NQDYTKT (SEQ ID NO:22)、QADTTKN(SEQ ID NO:23)、TNRTSPD(SEQ ID NO:24)、SNTTQKT(SEQ ID NO:25)和ASDSTKA(SEQ ID NO:26)。在某些此类实施例中，插入肽选自以下组成的组：LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、 LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)、LATNKIGVTA(SEQID NO:29)、 LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)、LANTVKLSTA(SEQ ID NO:31)、 LASNTVKAIA(SEQID NO:32)、LAASNITKAA(SEQ ID NO:33)、 LADNTVTRSA(SEQ ID NO:34)、LANKISAKDA(SEQID NO:35)、 LANQDYTKTA(SEQ ID NO:36)、LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)、 LATNKIGVTA(SEQID NO:38)、LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)、 LATNRTSPDA(SEQ ID NO:40)、LASNTTQKTA(SEQID NO:41)和 LAASDSTKAA(SEQ ID NO:42)。
在一些实施例中，本发明变异AAV衣壳蛋白不包含除GH环或环IV中约 5个氨基酸到约20个氨基酸的肽插入之外的任何其它氨基酸序列修饰。举例来说，在一些实施例中，本发明变异AAV衣壳蛋白包括肽插入，所述肽插入包括选自以下组成的组的氨基酸序列：NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)、TNKIGVT(SEQ ID NO:15)、GNLTKGN(SEQID NO:16)、NTVKLST (SEQ ID NO:17)、SNTVKAI(SEQ ID NO:18)、ASNITKA(SEQ ID NO:19)、DNTVTRS(SEQ ID NO:20)、NKISAKD(SEQ ID NO:21)、NQDYTKT(SEQ ID NO:22)、QADTTKN(SEQID NO:23)、TNRTSPD(SEQ ID NO:24)、SNTTQKT (SEQ ID NO:25)、ASDSTKA(SEQ ID NO:26)、LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、 LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)、LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)、LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)、LANTVKLSTA(SEQ ID NO:31)、 LASNTVKAIA(SEQ ID NO:32)、LAASNITKAA(SEQ ID NO:33)、 LADNTVTRSA(SEQ ID NO:34)、LANKISAKDA(SEQ ID NO:35)、LANQDYTKTA(SEQ ID NO:36)、LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)、 LATNKIGVTA(SEQ ID NO:38)、LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)、 LATNRTSPDA(SEQ ID NO:40)、LASNTTQKTA(SEQ ID NO:41)和LAASDSTKAA(SEQ ID NO:42)，并且所述变异AAV衣壳不包含任何其它氨基酸取代、插入或缺失(即，变异AAV衣壳蛋白包括所述插入，并且在其它方面与相应的AAV衣壳蛋白相同)。换句话说，包括所述插入的变异AAV衣壳蛋白在其它方面与已插入肽的亲代AAV衣壳蛋白相同。作为另一个实例，本发明变异AAV衣壳蛋白包括肽插入，所述肽插入包括选自以下的氨基酸序列： NKIQRTD(SEQ ID NO:13),NKTTNKD(SEQ ID NO:14),TNKIGVT(SEQ ID NO:15),GNLTKGN(SEQ ID NO:16),NTVKLST(SEQ ID NO:17),SNTVKAI (SEQ ID NO:18),ASNITKA(SEQ ID NO:19),DNTVTRS(SEQ ID NO:20), NKISAKD(SEQ ID NO:21),NQDYTKT(SEQ IDNO:22),QADTTKN(SEQ ID NO:23),TNRTSPD(SEQ ID NO:24),SNTTQKT(SEQ ID NO:25),ASDSTKA(SEQ ID NO:26),LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27),LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28),LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29),LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30), LANTVKLSTA(SEQ ID NO:31),LASNTVKAIA(SEQ ID NO:32),LAASNITKAA (SEQ ID NO:33),LADNTVTRSA(SEQ ID NO:34),LANKISAKDA(SEQ ID NO:35),LANQDYTKTA(SEQ ID NO:36),LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37),LATNKIGVTA(SEQ ID NO:38),LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39),LATNRTSPDA (SEQ ID NO:40),LASNTTQKTA(SEQ ID NO:41)和LAASDSTKAA(SEQ ID NO:42)，其中肽插入位于AAV2衣壳的VP1的氨基酸587与588之间；位于AAV3A、AAV3B、AAV9或AAV10的VP1的氨基酸588与589之间；位于 AAV7的VP1的氨基酸589与590之间；位于AAV1、AAV6或AAV8的VP1 的氨基酸590与591之间；位于AAV4的VP1的氨基酸584到585之间或位于 AAV5的氨基酸575与576之间，其中变异AAV衣壳蛋白序列在其它方面与相应的亲代AAV衣壳蛋白序列相同，例如SEQ ID NO:1-12中的任一个。
在其它实施例中，与亲代AAV衣壳蛋白相比，本发明变异AAV衣壳蛋白除了在GH环中包括例如如本文所公开的或如所属领域中已知的肽插入之外，包括约1个到约100个氨基酸取代或缺失，例如1个到约5个、约2个到约4 个、约2个到约5个、约5个到约10个、约10个到约15个、约15个到约20 个、约20个到约25个、约25-50个、约50-100个氨基酸取代或缺失。因此，在一些实施例中，本发明变异衣壳蛋白包括与相应的亲代AAV衣壳具有85％或更高、90％或更高、95％或更高、或98％或更高例如或99％一致性的序列一致性，例如如SEQ IDNO:1-12中所示的野生型衣壳蛋白。
在另一个实施例中，所述一个或多个氨基酸取代位于如肽插入前所编号的 AAV2VP1衣壳蛋白的一个或多个氨基酸残基35、109、195、213、222、229、 312、319、330、333、347、363、427、447、449、453、490、527、551、581、 585、588、593、606、649、651、694、698、708和/或735处或另一种AAV衣壳蛋白的相应的一个或多个氨基酸残基处。在一些此类实施例中，一个或多个氨基酸取代选自以下组成的组：如肽插入前所编号的AAV2 VP1衣壳蛋白的 A35P、S109T、P195L、D213N、G222S、V229I、N312K、A319T、T330A、A333S、 E347K、P363L、A427D、V447F、N449D、N449K、G453R、A490T、K527Q、 N551S、A581T、Y585S、R588M、A593E、W606C、K649E、R651H、W694C、 I698V、V708I和L735Q或另一种AAV衣壳蛋白的相应的一个或多个氨基酸残基。
在优选实施例中，提供了一种变异AAV衣壳蛋白，其包括a)在衣壳蛋白的GH-环中的插入肽，其中肽插入包括选自以下的氨基酸序列：NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQID NO:14)和TNKIGVT(SEQ ID NO:15)，和 b)与AAV2的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)相比，以下氨基酸取代中的一个或多个或另一个AAV亲代血清型(即除了AAV2之外)的相应取代，其中取代的一个或多个氨基酸不天然存在于相应的位置：A35P、S109T、P195L、D213N、 G222S、V229I、N312K、A319T、T330A、A333S、E347K、P363L、A427D、 V447F、N449D、N449K、G453R、A490T、K527Q、N551S、A581T、Y585S、 R588M、A593E、W606C、K649E、R651H、W694C、I698V、V708I、L735Q和其组合处。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代选自以下组成的组：V708I、 V708I+A593E、V708I+S109T、V708I+T330A、A35P、V708I+R588M、 V708I+W606C、V708I+W694C、I698V、N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q、 N312K+N449D+N551S+I698V+V708I+L735Q、V708I+N449K和V708I+G222S。优选地，肽插入位点位于AAV2衣壳的氨基酸587与588之间；AAV2衣壳的氨基酸587与588之间；AAV3A、AAV3B、AAV9或AAV10衣壳的氨基酸588与589之间；AAV7衣壳的氨基酸589与590之间；AAV1、AAV6或AAV8衣壳的氨基酸590到591之间；AAV4衣壳的氨基酸584与585之间或AAV5衣壳的氨基酸575与576之间。
在特别优选的实施例中，变异AAV衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列NKIQRTD(SEQ ID NO:13)或包括在AAV2的VP1的氨基酸587与588 或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、主要由在AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)组成或由其组成，并且相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)进一步包括氨基酸序列残基708处的V708I氨基酸取代，并且任选地，相对于AAV2进一步包括A593E和/或S109T 和/或T330A和/或R588M取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，其中取代的一个或多个氨基酸不会天然地存在相应的位置处。在另一个特别优选的实施例中，变异AAV衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列NKIQRTD (SEQ ID NO:13)或包括在AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、主要由在 AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LANKIQRTDA(SEQID NO:27)组成或由其组成，并且相对于AAV2 衣壳(SEQ ID NO:2)进一步包括氨基酸序列残基35处的A35P氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代。变异AAV衣壳可以与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的整个长度或相应的亲代AAV衣壳具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或至少约99％或更高的氨基酸序列一致性。在特别优选的实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约 85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列 100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA NKIQRTDARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSINVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:43)
在另一个特别优选的实施例中，变异AAV衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列NKIQRTD(SEQ ID NO:13)或包括在AAV2衣壳蛋白的氨基酸 587与588之间或另一种AAV血清型的衣壳蛋白中的相应位置的氨基酸序列 LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、主要由在AAV2衣壳蛋白的氨基酸587与588 之间或另一种AAV血清型的衣壳蛋白中的相应位置的氨基酸序列 LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)组成或由其组成，并且包括与AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列相比的N312K氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型的相应取代，并且任选地进一步包括与AAV2衣壳的氨基酸序列或另一种AAV亲代血清型的相应取代相比的(i)N449D、N551S、I698V和L735Q或(ii)N449D、 N551S、I698V、L735Q和V708I氨基酸取代。变异AAV衣壳可以与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的整个长度具有至少约85％、至少约90％、至少约 95％、至少约98％或更高的氨基酸序列一致性。在特别优选的实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLKFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTDTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTSVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA NKIQRTDARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNQ(SEQ ID NO:44)
在另一个实施例中，提供了一种变异AAV衣壳蛋白，其包括a)位于 AAV3A、AAV3B、AAV9或AAV10的VP1的氨基酸588与589之间、AAV7 的氨基酸589与590之间、AAV1、AAV6或AAV8的氨基酸590到591之间、 AAV4的氨基酸584与585之间或AAV5的氨基酸575与576之间的肽插入，所述肽插入包括选自NKIQRTD(SEQ ID NO:13)和LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列，和b)AAV3A或AAV3B的氨基酸709处的缬氨酸到异亮氨酸取代、AAV1或AAV6的位置709处的丙氨酸到异亮氨酸取代、AAV4 的氨基酸707处或AAV9的氨基酸709处的天冬酰胺到异亮氨酸取代、或AAV7 的氨基酸710处或AAV8或AAV10的氨基酸711处的苏氨酸到异亮氨酸取代、或AAV5的氨基酸697处的谷氨酰胺到异亮氨酸取代，并且任选地在其它方面与SEQID NO:1和3-12中的任一个相同。在优选实施例中，变异衣壳蛋白包括 a)肽插入，其包括氨基酸序列NKIQRTD(SEQ ID NO:13)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、主要由氨基酸序列NKIQRTD(SEQ ID NO:13)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与 588之间的氨基酸序列LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)组成或由其组成，和 b)与AAV2的氨基酸序列相比的氨基酸708处的缬氨酸到异亮氨酸氨基酸取代，其中变异衣壳蛋白包括2个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代。
在又一实施例中，变异衣壳蛋白包括a)肽插入，其包括氨基酸序列 NKIQRTD(SEQID NO:13)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、主要由AAV2衣壳的氨基酸587与 588之间的氨基酸序列LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)组成或由其组成，和b)与AAV2的氨基酸序列相比的氨基酸708处的缬氨酸到异亮氨酸氨基酸取代，并且在其它方面与氨基酸序列SEQ ID NO:2一致。
在又一实施例中，变异衣壳蛋白包括a)肽插入，其包括氨基酸序列 NKIQRTD(SEQID NO:13)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、主要由AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)组成或由其组成，并且在其它方面与氨基酸序列SEQ ID NO:2一致。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约 98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA NKIQRTDARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:45)
在另一个特别优选的实施例中，变异AAV衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列TNKIGVT(SEQ ID NO:15)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与 588之间或另一种AAV血清型衣壳蛋白中的相应位置的氨基酸序列LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)或LATNKIGVTS(SEQ IDNO:37)、主要由 AAV2衣壳的氨基酸587与588之间或另一种AAV血清型衣壳蛋白中的相应位置的氨基酸序列LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)或LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)组成或由其组成，并且与AAV2的氨基酸序列相比包括V708I氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，并且任选地，相对于AAV2进一步包括N449K和/或G222S取代或另一种AAV亲代血清型的衣壳蛋白中的相应取代，其中经取代氨基酸并不自然地存在于相应位置。在另一个优选实施例中，变异AAV衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列TNKIGVT(SEQ ID NO:15)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间或另一种AAV血清型的衣壳蛋白中的相应位置的氨基酸序列LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)或 LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)，并且与AAV2的氨基酸序列相比包括N312K、 N449D、N551S、I698V和L735Q并且任选地V708I氨基酸取代或另一种AAV 亲代血清型中的一个或多个相应取代，其中经取代的一个或多个氨基酸并不天然地存在于相应位置处。变异AAV衣壳可以与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的整个长度具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高的氨基酸序列一致性。在特别优选的实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA TNKIGVTARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSINVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:46)
在另一个实施例中，提供了一种变异AAV衣壳蛋白，其包括a)位于 AAV3A、AAV3B、AAV9或AAV10的VP1的氨基酸588与589之间、AAV7 的氨基酸589与590之间、AAV1、AAV6或AAV8的氨基酸590到591之间、 AAV4的氨基酸584与585之间或AAV5的氨基酸575与576之间的肽插入，所述肽插入包括选自TNKIGVT(SEQ ID NO:15)、LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)和LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列，和b)AAV3A或 AAV3B的氨基酸709处的缬氨酸到异亮氨酸取代、AAV1或AAV6的位置709 处的丙氨酸到异亮氨酸取代、AAV4的氨基酸707处或AAV9的氨基酸709处的天冬酰胺到异亮氨酸取代、或AAV7的氨基酸710处或AAV8或AAV10的氨基酸711处的苏氨酸到异亮氨酸取代、或AAV5的氨基酸697处的谷氨酰胺到异亮氨酸取代。在优选实施例中，变异AAV衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列TNKIGVT(SEQID NO:15)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与 588之间的氨基酸序列LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)或LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)、主要由AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)或LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)组成或由其组成，并且包括与AAV2的氨基酸序列相比的氨基酸708(V708I)处的缬氨酸到异亮氨酸氨基酸取代，其中变异衣壳蛋白包括2个到5个、5个到10个、或10个到15个氨基酸取代，并且与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的整个长度优选地具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高的氨基酸序列一致性。
在又一个实施例中，变异衣壳蛋白包括a)肽插入，其包括氨基酸序列 TNKIGVT(SEQ ID NO:15)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LATNKIGVTA(SEQ IDNO:29)或LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)、主要由AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)或LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)组成或由其组成，和b)与AAV2的氨基酸序列相比的氨基酸708处的缬氨酸到异亮氨酸氨基酸取代，并且在其它方面与氨基酸序列SEQ ID NO:2一致。
在又一个实施例中，变异衣壳蛋白包括a)肽插入，其包括氨基酸序列 TNKIGVT(SEQ ID NO:15)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LATNKIGVTA(SEQ IDNO:29)或LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)、主要由AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)或LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)组成或由其组成，并且在其它方面与氨基酸序列SEQ ID NO:2一致。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA TNKIGVTARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:47)
在另一个优选的实施例中，变异AAV衣壳包括肽插入，所述肽插入包括在 AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列NKTTNKD(SEQ ID NO:14) 或LANKTTNKDA(SEQ IDNO:28)，并且相对于AAV2衣壳氨基酸序列(SEQ ID NO:2)进一步包括残基708处的V708I氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型的相应取代，并且任选地，与AAV2的氨基酸序列相比进一步包括S109T和 /或W694C和/或W606C氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型的相应取代，其中一个或多个经取代的氨基酸并不天然存在于相应位置。在另一个特别优选的实施例中，变异AAV衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列NKTTNKD (SEQ ID NO:14)或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)、主要由 AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)组成或由其组成，并且相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列进一步包括残基698或另一种AAV衣壳的相应残基的I698V氨基酸取代。变异AAV衣壳可以与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的整个长度或相应的亲代AAV衣壳具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高的氨基酸序列一致性。在特别优选的实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约 95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA NKTTNKDARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSINVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:48)
在另一个特别优选的实施例中，变异AAV衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列NKTTNKD(SEQ ID NO:14)或包括在AAV2衣壳蛋白的氨基酸 587与588之间或另一种AAV血清型的衣壳蛋白中的相应位置的氨基酸序列 LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)、主要由在AAV2衣壳蛋白的氨基酸587与 588之间或另一种AAV血清型的衣壳蛋白中的相应位置的氨基酸序列 LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)组成或由其组成，并且包括与AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列相比的N312K氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型的相应取代，并且任选地进一步包括与AAV2衣壳的氨基酸序列相比的N449D、 N551S、I698V和L735Q和任选的V708I氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代。变异AAV衣壳可以与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列的整个长度具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或更高的氨基酸序列一致性。在特别优选的实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLKFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTDTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTSVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA NKTTNKDARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEVQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNQ(SEQ ID NO:49)
在另一个实施例中，提供了一种变异AAV衣壳蛋白，其包括a)位于 AAV3A、AAV3B、AAV9或AAV10的VP1的氨基酸588与589之间、AAV7 的氨基酸589与590之间、AAV1、AAV6或AAV8的氨基酸590到591之间、 AAV4的氨基酸584与585之间或AAV5的氨基酸575与576之间的肽插入，所述肽插入包括选自NKTTNKD(SEQ ID NO:14)和LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列，和b)AAV3A或AAV3B的氨基酸709处的缬氨酸到异亮氨酸取代、AAV1或AAV6的位置709处的丙氨酸到异亮氨酸取代、AAV4 的氨基酸707处或AAV9的氨基酸709处的天冬酰胺到异亮氨酸取代、或AAV7 的氨基酸710处或AAV8或AAV10的氨基酸711处的苏氨酸到异亮氨酸取代、或AAV5的氨基酸697处的谷氨酰胺到异亮氨酸取代，并且任选地在其它方面与SEQID NO:1和3-12中的任一个相同。在优选实施例中，变异衣壳蛋白包括 a)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列NKTTNKD(SEQ ID NO:14)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)、主要由AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)组成或由其组成，和b)与AAV2的氨基酸序列相比的氨基酸708处的缬氨酸到异亮氨酸氨基酸取代，其中变异衣壳蛋白包括2个到5个、5个到10个、或10个到15个氨基酸取代。
在又一个实施例中，变异衣壳蛋白包括a)肽插入，所述肽插入氨基酸序列NKTTNKD(SEQ ID NO:14)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)、主要由AAV2衣壳的氨基酸587 与588之间的氨基酸序列LANKTTNKDA(SEQID NO:28)组成或由其组成，和b)与AAV2的氨基酸序列相比的氨基酸708处的缬氨酸到异亮氨酸氨基酸取代，并且在其它方面与氨基酸序列SEQ ID NO:2一致。
在另一个实施例中，变异衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列 NKTTNKD(SEQ ID NO:14)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LANKTTNKDA(SEQ IDNO:28)、主要由AAV2衣壳的氨基酸587 与588之间的氨基酸序列LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)组成或由其组成，并且在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约 95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA NKTTNKDARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:50)
在其它实施例中，提供一种变异AAV衣壳蛋白，其包括a)在衣壳蛋白的 GH环中的肽插入，其中所述肽插入包括选自以下的氨基酸序列：GNLTKGN (SEQ ID NO:16)、NTVKLST(SEQ ID NO:17)、SNTVKAI(SEQ ID NO:18)、 ASNITKA(SEQ ID NO:19)、DNTVTRS(SEQ IDNO:20)、NKISAKD(SEQ ID NO:21)、NQDYTKT(SEQ ID NO:22)、QADTTKN(SEQ ID NO:23)、TNRTSPD (SEQ ID NO:24)、SNTTQKT(SEQ ID NO:25)和ASDSTKA(SEQ ID NO:26)，和b)与AAV2的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)相比的以下氨基酸取代中的一个或多个或另一种AAV亲代血清型(即除AAV2外)中的相应取代：其中经取代的一个或多个氨基酸并不天然地存在于相应的位置：A35P、S109T、P195L、 D213N、G222S、V229I、N312K、A319T、T330A、A333S、E347K、P363L、 A427D、V447F、N449D、N449K、G453R、A490T、K527Q、N551S、A581T、 Y585S、R588M、A593E、W606C、K649E、R651H、W694C、I698V、V708I、 L735Q和其组合。在一些实施例中，一个或多个氨基酸取代选自以下组成的组： V708I、S109T、R651H、A319T、P195L、P363L、I698V、D213N、G453R和其组合。在一些优选实施例中，一个或多个氨基酸取代包括至少V708I和/或P363L 氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代。优选地，肽插入位点位于 AAV2衣壳的氨基酸587与588之间或另一种AAV血清型的衣壳蛋白中的相应位置。
在一些实施例中，变异AAV衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列GNLTKGN(SEQ ID NO:16)或包括AAV2的VP1氨基酸587与588或另一种 AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)、主要由AAV2的VP1氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)组成或由其组成，并且相对于 AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列进一步包括以下氨基酸取代的一个或多个或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，其中一个或多个经取代的氨基酸并不天然地存在于相应位置：V708I、V708I+S109T、R651H、A319T+P195L、 P363L、P363L+V708I。在一些实施例中，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列GNLTKGN(SEQ ID NO:16)或包括AAV2的VP1氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列 LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)，和(ii)相对于AAV2的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)或另一种AAV衣壳的相应残基的V708I取代，并且包括2个到5个、 5个到10个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在其它实施例中，，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列GNLTKGN(SEQ ID NO:16) 或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列 LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)组成或由其组成，和(ii)相对于AAV2衣壳 (SEQID NO:2)的氨基酸序列或另一种AAV衣壳的相应残基的P363L取代，并且包括2个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代，或在其它方面与SEQ ID NO2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在其它实施例中，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列GNLTKGN (SEQ ID NO:16)或包括AAV2的VP1氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)，和(ii)相对于AAV2衣壳(SEQID NO:2)的氨基酸序列或另一种AAV衣壳的相应残基的R651H取代，并且包括2个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在另一个实施例中，变异衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列GNLTKGN(SEQ ID NO:16)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)、主要由AAV2衣壳的氨基酸587 与588之间的氨基酸序列LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)组成或由其组成，并且在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约 95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA GNLTKGNARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:51)
在一些实施例中，，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列NTVKLST(SEQ ID NO:17)或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588 或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LANTVKLSTA(SEQ ID NO:31)，和(ii)相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的V708I氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，其中一个或多个经取代的氨基酸并不天然地存在于相应位置并且包括2个到5个、5个到10个或10个到 15个氨基酸取代，或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应亲代AAV 衣壳蛋白序列一致。在另一个实施例中，变异衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列NTVKLST(SEQID NO:17)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与 588之间的氨基酸序列LANTVKLSTA(SEQ ID NO:31)、主要由AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LANTVKLSTA(SEQ ID NO:31)组成或由其组成，并且在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA NTVKLSTARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:52)
在一些实施例中，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列SNTVKAI(SEQ ID NO:18)或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588 或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LASNTVKAIA(SEQ ID NO:32)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LASNTVKAIA(SEQ ID NO:32)组成或由其组成，和(ii)相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的V708I氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，并且包括2个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在另一个实施例中，变异衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列SNTVKAI(SEQ ID NO:18)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LASNTVKAIA(SEQ ID NO:32)、主要由 AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LASNTVKAIA(SEQ ID NO:32)组成或由其组成，并且在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约 85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列 100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA SNTVKAIARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:53)
在一些实施例中，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列ASNITKA(SEQ ID NO:19)或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588 或另一种AAV衣壳的相应氨基酸的氨基酸序列LAASNITKAA(SEQ ID NO:33)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸的氨基酸序列LAASNITKAA(SEQ ID NO:33)组成或由其组成，和(ii) 相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的V708I氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，并且包括2个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代 AAV衣壳蛋白序列一致。在另一个实施例中，变异衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列ASNITKA(SEQ ID NO:19)或包括AAV2衣壳的氨基酸587 与588之间的氨基酸序列LAASNITKAA(SEQ ID NO:33)、主要由AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LAASNITKAA(SEQ ID NO:33)组成或由其组成，并且在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约 90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA ASNITKAARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:54)
在一些实施例中，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列DNTVTRS(SEQ ID NO:20)或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588 或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LADNTVTRSA(SEQ ID NO:34)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LADNTVTRSA(SEQ ID NO:34)组成或由其组成，和(ii)相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的V708I氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，并且包括2个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在其它实施例中，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列DNTVTRS(SEQ ID NO:20)或包括AAV2 的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LADNTVTRSA(SEQ ID NO:34)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588 或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LADNTVTRSA(SEQ ID NO:34)组成或由其组成，和(ii)相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的I698V氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，其中经取代的氨基酸并不天然地存在于相应位置，并且包括2个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在另一个实施例中，变异衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列DNTVTRS(SEQ ID NO:20)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LADNTVTRSA(SEQ ID NO:34)、主要由 AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LADNTVTRSA(SEQID NO:34)组成或由其组成，并且在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约 85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列 100％一致的氨基酸序列：
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在一些实施例中，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列NKISAKD(SEQ ID NO:21)或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588 或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LANKISAKDA(SEQ ID NO:35)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LANKISAKDA(SEQ ID NO:35)组成或由其组成，和(ii)相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的V708I氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，并且包括2个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在另一个实施例中，变异衣壳包括肽插入。所述肽插入包括氨基酸序列NKISAKD(SEQ ID NO:21)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LANKISAKDA(SEQ ID NO:35)、主要由 AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LANKISAKDA(SEQ ID NO:35)组成或由其组成，并且在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约 85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列 100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA NKISAKDARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:56)
在一些实施例中，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列NQDYTKT(SEQ ID NO:22)或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588 或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LANQDYTKTA(SEQ ID NO:36)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LANQDYTKTA(SEQ ID NO:36)组成或由其组成，和(ii)相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的V708I氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，并且包括2个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在其它实施例中，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列NQDYTKT(SEQ ID NO:22)或包括AAV2 的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LANQDYTKTA(SEQ ID NO:36)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588 或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LANQDYTKTA(SEQ ID NO:36)组成或由其组成，和(ii)相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的I698V氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型(即除AAV2之外)中的相应取代，其中经取代的氨基酸并不天然地存在于相应位置，，并且包括2个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2 的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在另一个实施例中，变异衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列NQDYTKT(SEQ ID NO:22)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LANQDYTKTA(SEQ ID NO:36)、主要由AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LANQDYTKTA(SEQ ID NO:36)组成或由其组成，并且在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA NQDYTKTARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:57)
在一些实施例中，变异AAV衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列 QADTTKN(SEQ ID NO:23)或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)组成或由其组成，并且相对于AAV2衣壳的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)进一步包括以下氨基酸取代中的一个或多个或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，其中一个或多个经取代的氨基酸并不天然地存在于相应位置：V708I、D213N、P363L、G453R。在一些实施例中，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列 QADTTKN(SEQ ID NO:23)或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)组成或由其组成，和(ii)相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的V708I取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，并且包括2个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在其它实施例中，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列QADTTKN(SEQ ID NO:23)或包括AAV2的VP1的氨基酸 587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAQADTTKNA (SEQ ID NO:39)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)组成或由其组成，和(ii)相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列或另一种AAV 衣壳的相应残基的P363L取代，并且包括2个到5个、5个到10个或10个到 15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV 衣壳蛋白序列一致。在其它实施例中，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列QADTTKN(SEQ ID NO:23)或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588 或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39组成或由其组成，和(ii)相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的D213N取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，并且包括2个到 5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在其它实施例中，变异AAV 衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列QADTTKN(SEQ ID NO:23) 或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列 LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)组成或由其组成，和(ii)相对于AAV2衣壳 (SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的G453R取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，并且包括2个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在另一个实施例中，变异衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列 QADTTKN(SEQ ID NO:23)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)、主要由AAV2衣壳的氨基酸587 与588之间的氨基酸序列LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)组成或由其组成，并且在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约 95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
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在一些实施例中，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列TNRTSPD(SEQ ID NO:24)或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588 或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LATNRTSPDA(SEQ ID NO:40)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LATNRTSPDA(SEQ ID NO:40)组成或由其组成，和 (ii)相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的V708I氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型中的相应相应取代，并且包括2个到5个、5个到10 个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
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在一些实施例中，变异AAV衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列 SNTTQKT(SEQ ID NO:25)或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LASNTTQKTA(SEQ ID NO:41)，并且在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约 85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列 100％一致的氨基酸序列：
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在一些实施例中，变异AAV衣壳包括(i)肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列ASDSTKA(SEQ ID NO:26)或包括AAV2的VP1的氨基酸587与588 或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAASDSTKAA(SEQ ID NO:42)、主要由AAV2的VP1的氨基酸587与588或另一种AAV衣壳的相应氨基酸之间的氨基酸序列LAASDSTKAA(SEQ ID NO:42)组成或由其组成，和(ii)相对于AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的V708I氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型中的相应取代，其中一个或多个经取代的氨基酸并不天然地存在于相应位置，并且包括2个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。在另一个实施例中，变异衣壳包括肽插入，所述肽插入包括氨基酸序列ASDSTKA(SEQ ID NO:26)或包括AAV2衣壳的氨基酸587与588 之间的氨基酸序列LAASDSTKAA(SEQ ID NO:42)、主要由AAV2衣壳的氨基酸587与588之间的氨基酸序列LAASDSTKAA(SEQ ID NO:42)组成或由其组成，并且在其它方面与SEQ IDNO:2中所示的氨基酸序列一致。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHAD AEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHS PVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTN TMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPT YNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINN NWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVL GSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTG NNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLSRTNTPSGTTTQSR LQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQRVSKTSADNNNSEYSWTGATKYHL NGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDE EEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQRGNLA ASDSTKAARQAATADVNTQGVLPG MVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRYLTRNL(SEQ ID NO:61)。
在若干方面，提供了一种变异AAV衣壳蛋白，其相对于相应的亲代AAV 衣壳蛋白包括一个或多个氨基酸取代，其中当存在于AAV病毒粒子中时，与包括相应的亲代AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子对肌细胞的感染性相比，所述变异衣壳蛋白赋予对肌细胞(例如，骨骼或心肌细胞)增加的感染性。
在一些实施例中，变异AAV衣壳蛋白包括与AAV2衣壳(SEQ ID NO:2) 的氨基酸序列相比的氨基酸363处或另一种AAV亲代血清型(即除AAV2之外)中的相应位置的氨基酸取代。在一些优选实施例中，变异衣壳蛋白包括氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的整个长度具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或至少约99％或更大的氨基酸序列一致性，并且包括与AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列相比的氨基酸363处的氨基酸取代。在一些优选实施例中，变异AAV衣壳蛋白包括与AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)、AAV3A衣壳(SEQ ID NO:3)或AAV3B衣壳(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列相比的P363L氨基酸取代；；或与AAV1衣壳 (SEQ ID NO:1)或AAV6衣壳(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列相比的P364L氨基酸取代；或与AAV4衣壳(SEQ ID NO:5)或AAV5衣壳(SEQ IDNO:6)的氨基酸序列相比的P354L氨基酸取代；或与AAV7衣壳(SEQ ID NO:8)或AAV9 衣壳(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列相比的P365L氨基酸取代；或与AAV8衣壳(SEQ ID NO:9)或AAV10衣壳(SEQ ID NO:11)的氨基酸序列相比的P366L 氨基酸取代。在一些优选实施例中，变异衣壳蛋白包括与SEQ ID NO:2de氨基酸序列相比de P363L取代、或与SEQ ID NO:1和3-12中的任一个相比的相应取代，并且具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:1和3-12中的任一个中所示的氨基酸序列的整个长度的至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％或更高的氨基酸序列一致性。在一些优选实施例中，变异衣壳蛋白包括氨基酸序列，所述氨基酸序列包括与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列相比的P363L氨基酸取代，并且在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在相关实施例，变异衣壳蛋白包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比的P363L氨基酸取代或另一种AAV亲代血清型(即除AAV2之外)中的相应取代，其中变异衣壳蛋白与SEQ ID NO:2中所示的AAV2衣壳蛋白的氨基酸序列相比或与另一种AAV亲代血清型中的衣壳蛋白的氨基酸序列相比包括1个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代。在另一个优选实施例中，变异衣壳包括P363L氨基酸取代并且与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比进一步包括一个或多个E347K和/或V708I氨基酸取代，或来自另一种AAV AAV血清型 (即除AAV2之外)的衣壳中的相应取代。在另一个优选实施例中，变异衣壳包括与SEQ ID NO:2的氨基酸序列相比的P363L氨基酸取代或来自另一种AAV亲代血清型衣壳中的相应取代，并且进一步包括肽插入，优选位于AAV2的VP1 的氨基酸587与588之间；AAV3A、AAV3B、AAV9或AAV10的氨基酸588 与589之间；AAV7的VP1的氨基酸589与590；AAV1、AAV6或AAV8的 VP1的氨基酸590到591之间；AAV4的VP1的氨基酸584与585之间；或 AAV5的氨基酸575与576之间，其中肽插入优选包括选自以下的氨基酸序列： NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)、TNKIGVT(SEQ ID NO:15)、GNLTKGN(SEQ ID NO:16)、NTVKLST(SEQ ID NO:17)、SNTVKAI (SEQ ID NO:18)、ASNITKA(SEQ ID NO:19)、DNTVTRS(SEQ ID NO:20)、 NKISAKD(SEQ ID NO:21)、NQDYTKT(SEQ ID NO:22)、QADTTKN(SEQ ID NO:23)、TNRTSPD(SEQ ID NO:24)、SNTTQKT(SEQ ID NO:25)、ASDSTKA (SEQ IDNO:26)、LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)、LATNKIGVTA(SEQ IDNO:29)、LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)、 LANTVKLSTA(SEQ ID NO:31)、LASNTVKAIA(SEQ IDNO:32)、 LAASNITKAA(SEQ ID NO:33)、LADNTVTRSA(SEQ ID NO:34)、 LANKISAKDA(SEQ IDNO:35)、LANQDYTKTA(SEQ ID NO:36)、 LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)、LATNKIGVTA(SEQ IDNO:38)、LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)、LATNRTSPDA(SEQ ID NO:40)、 LASNTTQKTA(SEQ IDNO:41)和LAASDSTKAA(SEQ ID NO:42)，更优选地选自GNLTKGN(SEQ ID NO:16)、LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)、 QADTTKN(SEQ ID NO:23)和LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)，并且任选地包括2个到5个、5个到10个或10个到15个氨基酸取代或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列或相应的亲代AAV衣壳蛋白序列一致。
在其它实施例中，变异AAV衣壳蛋白包括与AAV2衣壳(SEQ ID NO:2) 的氨基酸序列相比的氨基酸593处或另一种AAV亲代血清型(即除AAV2之外)中的相应位置的氨基酸取代。在一些优选实施例中，变异衣壳蛋白包括与 AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列相比的氨基酸593处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的整个长度有至少约85％、至少约 90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％或更大的氨基酸序列一致性，或在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在一些实施例中，变异衣壳蛋白包括与AAV1、AAV3A、AAV6或AAV9的氨基酸序列相比氨基酸594 处、AAV5的氨基酸583处或AAV8或AAV10的氨基酸596处的甘氨酸到谷氨酸氨基酸取代、或AAV3B的氨基酸594处的精氨酸到谷氨酸氨基酸取代、或 AAV4的氨基酸592处的天冬氨酸到谷氨酸氨基酸取代或AAV7的位置595处的谷氨酰胺到谷氨酸氨基酸取代。在其它实施例中，变异衣壳蛋白包括与AAV2的氨基酸序列相比的A593E氨基酸取代，并且不包括与AAV2的氨基酸序列相比的以下氨基酸取代中的一个或多个：I19V、V369A、K26R、N215D、G355S、 V46A和S196P。在相关实施例中，变异衣壳蛋白包括与AAV2的氨基酸序列相比的A593E和V708I氨基酸取代，并且与SEQ IDNO 2中所示的氨基酸序列的整个长度具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约 99％一致性，或在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在相关实施例中，变异衣壳蛋白包括与AAV2的氨基酸序列相比的A593E和S109T氨基酸取代，并且与SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的整个长度具有至少约 85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的一致性，或在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在相关实施例中，变异衣壳蛋白包括与AAV2的氨基酸序列相比的A593E、V708I和S109T氨基酸取代，并且与SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的整个长度具有至少约85％、至少约 90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的一致性，或在其它方面与SEQ IDNO:2一致。在其它实施例中，变异衣壳包括与AAV2的氨基酸序列相比的 A593E、V708I和N551S氨基酸取代，并且与SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的整个长度具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的一致性，或在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在其它实施例中，变异衣壳蛋白包括与AAV2的氨基酸序列相比的A593E、V708I 和K649E氨基酸取代，并且与SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的整个长度具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的一致性，或在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。在其它实施例中，变异衣壳蛋白包括与AAV2的氨基酸序列相比的A593E、V708I、S109T和 K527Q氨基酸取代，并且与ID NO 2众所示的氨基酸序列的整个长度具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％的一致性，或在其它方面与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列一致。
在其它实施例中，变异AAV衣壳蛋白包括与AAV2衣壳(SEQ ID NO:2) 的氨基酸序列相比氨基酸708处或在另一种AAV亲代血清型(即除AAV2之外)中的相应位置的氨基酸取代，其中经取代的氨基酸并不天然地存在于相应的位置。优选地，rAAV病毒粒子不包括与AAV2相比的氨基酸250处或另一种AAV亲代血清型中的相应氨基酸的脯氨酸到丝氨酸取代。在一些实施例中，变异衣壳蛋白包括与AAV2衣壳(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列相比氨基酸708 处的氨基酸取代，并且与SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的整个长度有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约99％或更大的氨基酸序列一致性，或在其它方面与SEQ ID NO:2一致。在优选实施例中，变异衣壳蛋白包括与AAV2衣壳的氨基酸序列相比的氨基酸708处的缬氨酸到异亮氨酸 (V708I)取代，并且与SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的整个长度具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或至少约99％或更大的氨基酸序列一致性，并且在其它方面与氨基酸序列SEQ ID NO:2一致，其中变异衣壳蛋白不包括P250S氨基酸取代。在一些实施例中，变异衣壳蛋白包括AAV3A 或AAV3B的氨基酸709处的缬氨酸到异亮氨酸取代、AAV1或AAV6的位置 709处的丙氨酸到异亮氨酸取代、AAV4的氨基酸707处或AAV9的氨基酸709 处的天冬酰胺到异亮氨酸取代、或AAV7的氨基酸710处或AAV8或AAV10的氨基酸711处的苏氨酸到异亮氨酸取代、或AAV5的氨基酸697处的谷氨酰胺到异亮氨酸取代。在相关实施例中，变异衣壳蛋白包括与AAV2的氨基酸序列相比的V708I氨基酸取代，其中变异衣壳蛋白包括2个到5个、5个到10个或 10个到15个氨基酸取代，并且其中变异衣壳蛋白不包括P250S氨基酸取代。在其它实施例中，变异衣壳蛋白包括V708I氨基酸取代，并且还包括与AAV2 的氨基酸序列相比的A333S和/或S721L氨基酸取代。在其它相关实施例中，变异衣壳包括V708I氨基酸取代并且还包括与AAV2的氨基酸序列相比的 A333S和/或S721L氨基酸取代，并且与SEQ ID NO 2中所示的氨基酸序列的整个长度具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％或至少约 99％或更大的氨基酸序列一致性，或在其它方面与SEQ ID NO:2的氨基酸序列一致。
在其它实施例中，变异AAV衣壳蛋白包括与野生型AAV衣壳序列有至少 85％、至少90％、至少95％或至少98％一致性的氨基酸序列，所述野生型AAV 衣壳序列选自SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、10、11和12组成的组，并且还包括i)选自以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：A35P、D213N、A319T+P195L、P363L、P363L+V708I、G453R、R651H、I698V、V708I、V708I+A593、V708I+S109T、V708I+T330A、V708I+R588M、V708I+W694C、 V708I+W606C、V708I+N449K、V708I+G222S、 N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q、 N312K+N449D+N551S+I698V+V708I+L735Q，和/或(ii)选自以下组成的组的肽插入：NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)、TNKIGVT (SEQ ID NO:15)、GNLTKGN(SEQ ID NO:16)、NTVKLST(SEQ IDNO:17)、 SNTVKAI(SEQ ID NO:18)、ASNITKA(SEQ ID NO:19)、DNTVTRS(SEQ ID NO:20)、NKISAKD(SEQ ID NO:21)、NQDYTKT(SEQ ID NO:22)、QADTTKN (SEQ ID NO:23)、TNRTSPD(SEQ ID NO:24)、SNTTQKT(SEQ ID NO:25)、 ASDSTKA(SEQ ID NO:26)、LANKIQRTDA(SEQ IDNO:27)、LANKTTNKDA (SEQ ID NO:28)、LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)、LAGNLTKGNA(SEQ IDNO:30)、LANTVKLSTA(SEQ ID NO:31)、LASNTVKAIA(SEQ ID NO:32)、 LAASNITKAA(SEQ IDNO:33)、LADNTVTRSA(SEQ ID NO:34)、 LANKISAKDA(SEQ ID NO:35)、LANQDYTKTA(SEQ IDNO:36)、 LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)、LATNKIGVTA(SEQ ID NO:38)、 LAQADTTKNA(SEQ IDNO:39)、LATNRTSPDA(SEQ ID NO:40)、 LASNTTQKTA(SEQ ID NO:41)和LAASDSTKAA(SEQ IDNO:42)。在一些实施例中，变异AAV衣壳包括指定的一个或多个氨基酸取代和/或肽插入，并且在其它方面与选自以下组成的组的序列一致：SEQ ID NO:1-12。
在一些实施例中，变异AAV衣壳蛋白是包括如本文中所描述的一个或多个肽插入和/或氨基酸取代的祖先衣壳蛋白。祖先衣壳蛋白是指今天在自然界中发现的衣壳蛋白的进化祖先，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、 AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13，其是通过在今天自然界中发现的AAV衣壳蛋白之间的简并性位置处的随机氨基酸取代来计算机模拟(silico)产生的。
在其它实施例中，变异AAV衣壳蛋白是包括AAV5衣壳(SEQ ID NO:6) 的氨基酸130-725或与其有至少90％、至少95％或至少98％一致性的氨基酸序列的嵌合体。
在一些方面，变异AAV衣壳蛋白是嵌合体，所述嵌合体包括(i)AAV6(SEQ ID NO:7)的氨基酸1-129或与其有至少90％、至少95％或至少98％一致性的氨基酸序列，和(ii)AAV5(SEQ ID NO:6)的氨基酸130-725或与其有至少 90％、至少95％或至少98％一致性的氨基酸序列，并且相对于AAV5(SEQ ID NO:6)的序列进一步包括V229I、A490T和A581T并且任选地V447F或Y585S 氨基酸取代。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLV LPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNH ADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDD HFPKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGG GPLGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRIVTKSTRTWVLPSYNNHQY REIKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFR PRSLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTE GCLPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFE FTYNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAG RYANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFTTTNRMELEGASYQVP PQPNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQP VNRVAYNVGGQMATNNQSSTTAPTTGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPI WAKIPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFIT QYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRT TRPIGTRYLTRPL(SEQ ID NO:62)
在其他方面，变异AAV衣壳蛋白是嵌合体，所述嵌合体包括(i)AAV2(SEQ ID NO:2)的氨基酸1-61或与其有至少90％、至少95％或至少98％一致性的氨基酸序列；(ii)AAV6(SEQ ID NO:7)的氨基酸62-129或与其有至少90％、至少95％或至少98％一致性的氨基酸序列和(iii)AAV5(SEQ ID NO:6)的氨基酸130-725，并且相对于AAV5(SEQ ID NO:6)的序列进一步包括V229I、A490T 和A581T氨基酸取代。在一些实施例中，变异AAV衣壳具有与以下氨基酸序列具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％序列一致性或与以下氨基酸序列100％一致的氨基酸序列：
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLP GYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHAD AEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPFGLVEEGAKTAPTGKRIDDHF PKRKKARTEEDSKPSTSSDAEAGPSGSQQLQIPAQPASSLGADTMSAGGGGP LGDNNQGADGVGNASGDWHCDSTWMGDRIVTKSTRTWVLPSYNNHQYRE IKSGSVDGSNANAYFGYSTPWGYFDFNRFHSHWSPRDWQRLINNYWGFRPR SLRVKIFNIQVKEVTVQDSTTTIANNLTSTVQVFTDDDYQLPYVVGNGTEGC LPAFPPQVFTLPQYGYATLNRDNTENPTERSSFFCLEYFPSKMLRTGNNFEFT YNFEEVPFHSSFAPSQNLFKLANPLVDQYLYRFVSTNNTGGVQFNKNLAGRY ANTYKNWFPGPMGRTQGWNLGSGVNRASVSAFTTTNRMELEGASYQVPPQ PNGMTNNLQGSNTYALENTMIFNSQPANPGTTATYLEGNMLITSESETQPVN RVAYNVGGQMATNNQSSTTAPTTGTYNLQEIVPGSVWMERDVYLQGPIWAK IPETGAHFHPSPAMGGFGLKHPPPMMLIKNTPVPGNITSFSDVPVSSFITQYSTGQVTVEMEWELKKENSKRWNPEIQYTNNYNDPQFVDFAPDSTGEYRTTRPI GTRYLTRPL(SEQ ID NO:63)
本文所公开的AAV变异体是通过使用体内定向进化产生，所述定向进化涉及在静脉内给予后使用灵长类心肌和骨骼肌筛选。在一些实施例中，当存在于 AAV病毒粒子中时，与通过包括相应亲代AAV衣壳蛋白或野生型AAV的AAV 病毒粒子转导肌细胞相比，本文所公开的变异衣壳蛋白赋予肌细胞增加的转导。举例来说，在一些实施例中，当存在于AAV病毒粒子中时，本文所公开的变异衣壳蛋白赋予灵长类肌细胞比包括相应亲代AAV衣壳蛋白或野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子更有效地转导，例如肌细胞比包括亲代AAV衣壳蛋白或野生型AAV的AAV病毒粒子摄取更多的包括本发明变异AAV衣壳蛋白的 AAV病毒粒子。在一些此类实施例中，与野生型AAV病毒粒子或包括相应相应AAV衣壳蛋白的rAAV对肌细胞的转导相比，AAV变异体病毒粒子或变异 rAAV呈现出至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少 25倍、至少50倍或大于50倍的对肌细胞的增加的转导。在优选实施例中，与野生型AAV8或AAV9病毒粒子对肌细胞的转导相比，AAV变异体病毒粒子或变异rAAV呈现出至少2倍、至少5倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍、至少25倍、至少50倍、至少100倍、至少1000倍或大于1000倍的对肌细胞的增加的转导。在某些此类实施例中，当存在于AAV病毒粒子中时，本文所公开的变异衣壳蛋白赋予灵长类肌细胞比包括相应亲代AAV衣壳蛋白或野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子更广泛的转导。换句话说，变异AAV病毒粒子转导未被包括相应亲代AAV衣壳蛋白的病毒粒子转导的细胞类型，因此肌肉比相应亲代AAV病毒粒子中细胞类型更多。在一些实施例中，AAV变异体病毒粒子优先转导肌细胞，例如，与另一种肌细胞或非肌细胞相比，本发明rAAV病毒粒子以2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍或大于50倍特异性感染肌细胞。在一些实施例中，转导肌细胞是心肌细胞(例如成心肌细胞、心肌成纤维细胞或心肌祖细胞)。在一些实施例中，肌细胞是骨骼肌细胞(例如成肌细胞、肌管或卫星细胞)。通过任何数量的所属领域中用于测量基因表达的方法，可以容易地在体外或体内评估肌细胞转导的增加，例如增加的转导效率、更广泛的转导、更优先的转导等。例如，在普遍存在的或组织特异性启动子的控制下，AAV可以与包括表达盒的基因组一起包装，所述表达盒包括报告基因，例如荧光蛋白，并且通过由例如荧光显微镜检测荧光蛋白来评估转导程度。作为另一个实例，AAV可以与包括带条码的核酸序列的基因组一起包装，并且通过由例如PCR检测核酸序列来评估转导的程度。作为另一个实例，AAV可以与包括表达盒的基因组一起包装，所述表达盒包括用于治疗肌肉疾病的治疗基因，并且通过检测给予AAV的受治疗的患者的肌肉疾病的治疗来评估转导程度。
可以使用变异rAAV载体或病毒粒子和/或本文所公开的方法治疗的包含但不限于单基因病(monogenic disease)、复合病和创伤性损伤。单基因病的实例包含但不限于：肌营养不良，如杜兴氏、贝克、先天性(包含但不限于伯利恒肌病肌(Bethlem myopathy)、乌尔里希肌营养不良(Ullrich muscular dystrophy)、福山肌营养不良(Fukuyama musculardystrophy)、整合素缺乏、分区蛋白缺乏肌营养不良和沃克-沃伯格综合征(Walker-Warburgh syndrome))、末梢(包含但不限于Gowers-Laing、Miyoshi和Nonaka)、艾莫瑞-德雷福斯(Emery-Dreifuss)、面肩肱型(facioscapulohumeral)、肢带(limb girdle)、肌强直性和肌营养不良；先天性肌强直症(myotonia congenita)和先天性肌强直病；肌小管性肌病 (myotubular myopathy)；中央核肌病；肌原纤维性肌病(myofibrillary myopathy)；结蛋白相关病(desmin related)；贫血症；安德森氏综合征(Andersen-Tawil syndrome)；线状体肌病(Nemaline myopathy)；布罗迪病(Brody disease)；溶酶体贮积病(lysosomalstorage disorder)，如α-甘露糖苷贮积症、天冬氨酰葡萄糖胺尿症、β-甘露糖苷贮积症、胱氨酸病、法博病(Farber disease)、岩藻糖苷贮积症、戈谢病(Gaucher disease)、半乳糖唾液酸贮积症、神经节苷脂沉积症 (gangliosidose)(包含但不限于AB变异型、活化剂缺乏症、β-半乳糖苷酶缺乏症、法布里病、桑德霍夫氏(Sandhoff disease)和辛德勒病(Schindler disease))、肝糖贮积(包含但不限于安德森病(Andersen disease)、科里病、达农病(Danon disease)、福布斯病(Forbes disease)、葡萄糖-6-磷酸缺陷、赫氏病(Hersdisease)、乳酸脱氢酶A缺乏症、庞贝病(Pompe disease)、Tarui病和肝糖原累积症(vonGierke disease))、小儿游离唾液酸贮积病(infantile free sialic acid storagedisease)、溶酶体酸脂酶缺乏症(lysosomal acid lipase deficiency)、克拉伯病(Krabbe disease)、异染性脑白质营养不良(Metachromatic Leukodystrophy)、粘多糖贮积(mucopolysaccharidose)(包含但不限于玻尿酸酶缺乏症、亨特综合症 (Huntersyndrome)、赫尔勒综合征(Hurler syndrome)、贺-谢二氏综合征(Hurler- Scheiesyndrome)、马-兰二氏综合征(Maroteaux-Lamy syndrome)、莫基奥综合症(Morquiosyndrome)、沙费利波综合征(Sanfilippo syndrome)、谢氏综合症 (Scheie syndrome)和斯赖综合症(Sly syndrome))、粘脂贮积症(包含但不限于唾液酸贮积症、I-细胞病、粘磷脂1缺乏症(mucolipidin 1deficiency)和贺普二氏多处营养不良(Psuedy-HurlerPolydystrophy))、多发性硫酸酯缺乏症 (multiple sulfase deficiency)、尼曼-皮克氏病(Niemann-Pick disease)、神经元蜡样质褐质病(neuronal ceroid)(包含但不限于巴氏-施氏-沃格特(Batten- Spielmeyer-Vogt disease)、先天性组织蛋白酶D缺乏症、德国/塞尔维亚晚期婴儿(German/Serbian Late Infantile)、詹-比二氏病(Jansky-Bielschowsky disease)、库夫斯病(Kufs disease)、晚期婴儿型、晚期婴儿变异型北方癫痫(Northern Epilepsy)、桑塔沃-哈尔蒂亚病(Santavuori-Haltia disease)和土尔其晚期婴儿)、致密性成骨不全症(pyknodysostosis)、萨拉(Salla disease)、鞘脂活化蛋白B缺乏症、台-萨氏病(Tay-Sach’s disease)和沃尔曼氏病(Wolman disease)；代谢障碍，如腺苷单磷酸脱氨酶缺乏症、黑尿症(alkaptonuria)、肉碱缺乏症(carnitine deficiency)、肉碱软脂酰基转移酶缺乏症、哈氏遗传性病(Hartnup disorder)、高胱氨酸尿症(homocystinuria)、枫糖浆尿病(maple syrup urine disease)、肌磷酸化酶缺乏症(myophosphorylase deficiency)、磷酸岩藻激酶缺乏症 (phosphofuctokinasedeficiency)、磷酸甘油酸激酶缺乏症、磷酸甘油酸变位酶缺乏症、磷酸化酶缺乏症和丹吉尔氏病(Tangier disease)；弗里德希氏共济失调 (Friedreich’s ataxia)；共济失调毛细血管扩张症(ataxia talengiectasia)；维生素 E缺乏的共济失调；周期性麻痹(periodicparalysis)，如甘斯托普病(Gamstorp disease)和低钾性周期性麻痹(hypokalemicperiodic paralysis)；粒线体病，如巴特综合症(Barth syndrome)、卡恩斯-塞尔综合征(Kearns-Sayre syndrome)、粒线体肌病、粒线体脑病乳酸酸中毒和中风样发作、红纤维参差不齐的肌阵挛性癫痫(myoclonic epilepsy with ragged-red fiber)和皮尔逊综合症(Pearson syndrome)；家族性肥大心肌病、扩张心肌病、家族性先天性心脏病，如家族性主动脉瓣膜病(familial aortic valve disease)和先天性心脏病左心室不致密、家族性心律不齐如安德森心律失常定期麻痹(Anderson cardiodysrhythmic periodicparalysis)、具有AV传导缺陷的心房间隔缺陷、布鲁加达综合征(Brugada syndrome)、心脏传导缺陷、性多形性室性心动过速(catecholaminergic polymorphic ventriculartachycardia)和先天性心脏阻滞；家族性血管病如动脉扭曲度综合征、大脑皮层损伤和脑白质病变的大脑常染色体显性动脉病、大脑皮层损伤和脑白质病变的大脑凹入显性动脉病、家族型主动脉瘤、马方综合症 (Marfan syndrome)、埃勒斯-当洛斯综合征(Ehlers-Danlos syndrome)、先天性契约性蛛网膜下腔炎(Beal congenital contractualarachnodactyly)、洛伊-迪茨综合征(Loeys-Dietz syndrome)和弹性假黄色瘤(pseudoxanthoma elasticum)；心律失常性右心室心肌病；家族性心律失常性右心室发育不良；纳索斯病(Naxos disease)；左心室不致密；家族性心房颤动；家族性心室性心博过速；家族性沃尔富-帕金森-怀特综合征(familial Wolff-Parkinson-White syndrome)；长期QT 综合征；短期QT综合征；病窦综合征(sick sinus syndrome)；脂蛋白病如无β脂蛋白血症(abetalipoproteinemia)和脂蛋白脂肪酶缺乏症、α1-抗胰蛋白酶缺乏症、凝血因子VIII缺乏症(A型血友病)或凝血因子IX缺乏症(B型血友病)；地中海贫血；进行性骨化性纤维发育不良(fibrodysplasia ossificans progressive)；核纤层蛋白病(laminopathies)；亨廷顿病(Huntington disease)；先天性肌无力综合征；早衰症(Hutchinson-Gilford Progeria syndrome)；努南综合症(Noonan syndrome)；先天性纤维型不均衡肌病(congenital fibre type disproportion myopathy)；眼外肌肉的先天性纤维化；微小型肌病(minicore myopathy)；波纹肌肉病；施詹二氏综合症(Schwartz-Jampelsyndrome)；管状聚集性肌病(tubular aggregate myopathy)；和复合病的斑马体肌病实例包含但不限于心脏/心血管疾病(例如充血性心脏衰竭、心肌梗塞、心绞痛、冠状动脉疾病、缺血心脏病、心肌病)；癌症；糖尿病；和感染。创伤性损伤的实例包含但不限于肌肉的病毒感染、肌肉撕裂；和肌肉挫伤。在优选实施例中，将变异rAAV载体或病毒粒子和/或本文中所公开的方法用于治疗法布里病、弗里德希氏共济失调、杜兴氏肌营养不良、贝克尔肌营养不良、庞贝病、肌磷酸化酶缺乏症、面肩肱型肌营养不良、肢带型肌营养不良或肌强直性营养不良
在另一个实施例中，本文所公开的变异衣壳包括异源核酸，所述异源核酸包括编码基因产物的核苷酸序列，如但不限于干扰RNA、长非编码RNA、短非编码RNA、反义RNA、适体、多肽、分泌的抗体、单链抗体、VHH结构域、可溶性受体、亲和体(affibody)、打结素(knottin)、DARPin、centurin、伴侣蛋白 (chaperone)、提供基因功能的位点特异性敲低的位点特异性核酸酶或提供转录的基因特异性活化的修饰的位点特异性核酸酶。
本文所公开的rAAV变异体病毒粒子包括异源核酸，所述异源核酸包括编码基因产物的核苷酸序列。在一些实施例中，基因产物是反义RNA、微小RNA (miRNA)、短发夹RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)或其前驱体或模拟物。在一些实施例中，基因产物是长的非编码RNA。在一些实施例中，基因产物是短的非编码RNA。在一些实施例中，基因产物是反义RNA。在一些实施例中，基因产物是适体。在一些实施例中，基因产物是多肽。在一些实施例中，基因产物是分泌的抗体。在一些实施例中，基因产物是单链抗体。在一些实施例中，基因产物是VHH结构域。在一些实施例中，基因产物是可溶性受体。在一些实施例中，基因产物是亲和体。在一些实施例中，基因产物是打结素。在一些实施例中，基因产物是DARPin。在一些实施例中，基因产物是centurin。在一些实施例中，基因产物是伴侣蛋白。在一些实施例中，基因产物是提供基因功能的位点特异性敲低的位点特异性核酸酶。
基因产物的用途包含但不限于：提高细胞中因子的水平；通过分泌因子来提高相邻或远端细胞中因子的水平；降低细胞中因子的水平；或者通过分泌因子来降低相邻或远端细胞中因子的水平。基因产物可以设计为：补充缺失基因产物缺陷的水平；降低缺失基因产物缺陷的水平；引入新的支持基因产物；补充支持基因产物的水平；降低阻碍基因产物的水平；或者降低阻碍基因产物的水平并引入或补充支持基因产物的水平两者。
通过本发明AAV变异体递送的基因产物可以用于改变直接或间接与肌肉疾病和创伤相关的基因产物或基因产物活性的水平。用本发明AAV变异体转导的骨骼、心肌或平滑肌还可以用作产生和分泌治疗性蛋白质的生物工厂以治疗远端器官中的反式疾病。基因产物是直接或间接连接到遗传疾病的基因包含例如编码以下基因产物中的任一种的基因：肌缩蛋白；包含迷你肌缩蛋白和微肌缩蛋白(DMD；例如基因库寄存编号NP_003997.1；SEQ IDNO:64)；titin(TTN)； titin cap(TCAP)α-肌聚糖(SGCA)、β-肌聚糖(SGCB)、γ-肌聚糖(SGCG) 或δ-肌聚糖(SGCD)；α-1-抗胰蛋白酶(A1-AT)；肌球蛋白重链6(MYH6)；肌球蛋白重链7(MYH7)；肌球蛋白重链11(MYH11)；肌球蛋白轻链2(ML2)；肌球蛋白轻链3(ML3)；肌球蛋白轻链激酶2(MYLK2)；肌球蛋白结合蛋白 C(MYBPC3)；结蛋白(DES)；发动蛋白2(dynamin2)(DNM2)；层粘连蛋白α2(LAMA2)；lamin A/C(LMNA)；lamin B(LMNB)；lamin B受体(LBR)；dysferlin(DYSF)；emerin(EMD)；胰岛素；凝血因子，包含但不限于因子VIII 和因子IX；红血球生成素(EPO)；脂蛋白脂肪酶(LPL)；肌质网Ca2++-ATP酶 (SERCA2A)，S100钙结合蛋白A1(S100A1)；肌管素(MTM)；DM1蛋白激酶(DMPK；例如基因库寄存编号NG_009784.1；SEQ IDNO:65)；肝糖磷酸化酶L(PYGL)；肌肉相关肝糖磷酸化酶(PYGM；例如基因库寄存编号NP_005600.1；SEQ ID NO:66)；肝糖合成酶1(GYS1)；肝糖合成酶2(GYS2)；α-半乳糖苷酶A(GLA；例如基因库寄存编号NP_000160.1；SEQ ID NO:67)；α-N-乙酰半乳糖胺酶(NAGA)；酸α-葡糖苷酶(GAA；例如基因库寄存编号 NP_000143.2；SEQ ID NO:68)，鞘磷脂酶磷酸二酯酶1(SMPD1)；溶酶体酸脂肪酶(LIPA)；I型胶原蛋白α1链(COL1A1)；I型胶原蛋白α2链(COL1A2)；III型胶原蛋白α1链(COL3A1)；V型胶原蛋白α1链(COL5A1)；V型胶原蛋白α2链(COL5A2)；VI型胶原蛋白α1链(COL6A1)；VI型胶原蛋白α2链 (COL6A2)；VI型胶原蛋白α3链(COL6A3)；原胶原-离胺酸2-酮戊二酸5-双加氧酶(PLOD1)；溶酶体酸脂肪酶(LIPA)；共济蛋白(FXN；例如基因库寄存编号NP_000135.2；SEQ ID NO:69)；肌肉抑制素(MSTN)；β-N-乙酰基己糖胺酶A(HEXA)；β-N-乙酰氨基己糖苷酶B(HEXB)；β-葡糖脑苷脂酶(GBA)；腺苷单磷酸脱氨酶1(AMPD1)；β-血球蛋白(HBB)；艾杜糖醛酸酶(iduronidase) (IDUA)；艾杜糖醛酸2-硫酸酯(IDS)；肌钙蛋白1(TNNI3)；肌钙蛋白T2 (TNNT2)；肌钙蛋白C(TNNC1)；原肌凝蛋白1(TPM1)；原肌凝蛋白3(TPM3)； N-乙酰基-α-氨基葡糖苷酶(NAGLU)；N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)；乙酰肝素-α-氨基葡糖苷N-乙酰基转移酶(HGSNAT)；整合素α7(IGTA7)；整合素α9(IGTA9)；葡糖胺(N-乙酰基)-6-硫酸酯酶(GNS)；半乳糖胺(N-乙酰基)- 6-硫酸酯酶(GALNS)；β-半乳糖苷酶(GLB1)；β-葡糖苷酸酶(GUSB)；透明质酸氨基葡糖苷酶1(hyaluronoglucosaminidase 1)(HYAL1)；酸神经酰胺酶 (ASAH1)；半乳糖基酰胺酶(galactosylcermidase)(GALC)；组织蛋白酶A (CTSA；组织蛋白酶D(CTSA)；组织蛋白酶K(CTSK)；GM2神经节苷脂活化剂(GM2A)；芳基硫酸酯酶A(ARSA)；芳基硫酸酯酶B(ARSB)；甲酰甘氨酸-产生酶(SUMF1)；神经氨酸苷酶1(NEU1)；N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶α(GNPTA)；N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶β(GNPTB)；N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸转移酶γ(GNPTG)；粘脂蛋白-1(mucolipin-1)(MCOLN1)；NPC胞内转运体1(NPC1)；NPC胞内转运体2(NPC2)；蜡样脂褐质沉积症5 (CLN5)；蜡样脂褐质沉积症6(CLN6)；蜡样脂褐质沉积症8(CLN8)；软脂酰基蛋白质硫酯酶1(PPT1)；三肽基肽酶1(TPP1)；battenin(CLN3)；DNAJ 热冲击蛋白质家庭40成员C5(DNAJC5)；主要促进因子含有8个超家族结构域(MFSD8)；甘露糖苷酶α类2B成员1(MAN2B1)；甘露糖苷酶β(MANBA)；天冬氨酰葡糖胺苷酶(AGA)；α-L-岩藻糖苷酶(FUCA1)；cystinosin，溶酶体半胱氨酸转运体(CTNS)；唾液酸转运蛋白(sialin)溶质载体家族2成员10 (SLC2A10)；溶质载体家族17成员5(SLC17A5)；溶质载体家族6成员19(SLC6A19)；溶质载体家族22成员5(SLC22A5)；溶质载体家族37成员4 (SLC37A4)；溶酶体相关膜蛋白2(LAMP2)；钠电压-门控通道α子单元4 (SCN4A)；钠电压-门控通道β子单元4(SCN4B)；钠电压-门控通道α子单元 5(SCN5A)；钠电压-门控通道α子单元4(SCN4A)；钙电压-门控通道子单元α1c(CACNA1C)；钙电压-门控通道子单元α1s(CACNA1S)；磷酸甘油酸激酶 1(PGK1)；磷酸甘油酸变位酶2(PGAM2)；淀粉-α-1,6-葡糖苷酶，4-α-葡聚糖转移酶(AGL)；钾电压-门控通道ISK-相关子族成员1(KCNE1)；钾电压-门控通道ISK相关子族成员2(KCNE2)；钾电压-门控通道子族J成员2(KCNJ2)；钾电压-门控通道子族J成员5(KCNJ5)；钾电压-门控通道子族H成员2 (KCNH2)；钾电压-门控通道KQT样子族成员1(KCNQ1)；超极化活化环核苷酸-门控钾通道4(HCN4)；氯化物电压-门控通道1(CLCN1)；肉碱棕榈酰基转移酶1A(CPT1A)；利阿诺定受体1(RYR1)；利阿诺定受体2(RYR2)；桥接积分器1(bridgingintegrator 1)(BIN1)；LARGE木糖基-和葡萄糖醛酸基转移酶1(LARGE1)；对接蛋白质7(DOK7)；福蛋白(fukutin；FKTN)；福蛋白相关蛋白质(FKRP)；硒蛋白N(selenoprotein N)(SELENON)；蛋白质 O-甘露糖转移酶1(POMT1)；蛋白质O-甘露糖转移酶2(POMT2)；蛋白质O-键联甘露糖N-乙酰氨基葡萄糖转移酶1(POMGNT1)；蛋白质O-键联甘露糖N-乙酰氨基葡萄糖转移酶2(POMGNT2)；蛋白质-O-甘露糖激酶(POMK)；含有类异戊二烯合成酶结构域(ISPD)；网蛋白(plectin)(PLEC)；胆碱激导性受体烟碱ε子单元(CHRNE)；胆碱O-乙酰基转移酶(CHAT)；胆碱激酶β(CHKB)；不对称乙酰胆碱酯酶类胶原尾子单元(COLQ)；突触的受体相关蛋白质 (RAPSN)；四个和半个LIM结构域1(FHL1)；β-1,4-葡萄糖醛酸基转移酶1 (B4GAT1)；β-1,3-N-乙酰氨基半乳糖基转移酶2(B3GALNT2)；肌营养不良蛋白聚糖1(dystroglycan 1)(DAG1)；跨膜蛋白5(TMEM5)；跨膜蛋白43 (TMEM43)；SECIS结合蛋白2(SECISBP2)；葡糖胺(UDP-N-乙酰基)-2-表异构酶/N-乙酰甘露糖胺激酶(GNE)；anoctamin 5(ANO5)；含有1个染色体柔性铰链结构域的结构维护(SMCHD1)；乳酸脱氢酶A(LDHA)；乳酸脱氢酶B (LHDB)；钙蛋白酶3(CAPN3)；小窝蛋白3(CAV3)；含有32个三联基序 (TRIM32)；CCHC型锌指核酸结合蛋白(CNBP)；伴肌动蛋白(nebulin；NEB)；肌动蛋白,α1,骨骼肌(ACTA1)；肌动蛋白,α1,心肌(ACTC1)；辅肌动蛋白α2 (ACTN2)；聚(A)-结合蛋白核1(PABPN1)；含LEM结构域的蛋白质3(LEMD3)；锌金属蛋白酶STE24(ZMPSTE24)；微粒体三酸甘油酯转移蛋白质(MTTP)；胆碱激导性受体烟碱α1子单元(CHRNA1)；胆碱激导性受体烟碱α2子单元 (CHRNA2)；胆碱激导性受体烟碱α3子单元(CHRNA3)；胆碱激导性受体烟碱α4子单元(CHRNA4)；胆碱激导性受体烟碱α5子单元(CHRNA5)；胆碱激导性受体烟碱α6子单元(CHRNA6)；胆碱激导性受体烟碱α7子单元(CHRNA7)；胆碱激导性受体烟碱α8子单元(CHRNA8＝；胆碱激导性受体烟碱α9子单元(CHRNA9)；胆碱激导性受体烟碱α10子单元(CHRNA10)；胆碱激导性受体烟碱β1子单元(CHRNB1)；胆碱激导性受体烟碱β2子单元 (CHRNB2)；胆碱激导性受体烟碱β3子单元(CHRNB3)；胆碱激导性受体烟碱β4子单元(CHRNB4)；胆碱激导性受体烟碱γ子单元(CHRNG1)；胆碱激导性受体烟碱
Figure BDA0002478843290000861
子单元(CHRND)；胆碱激导性受体烟碱ε子单元(CHRNE1)；ATP黏结晶匣子族A成员1(ABCA1)；ATP黏结晶匣子族C成员6(ABCC6)； ATP黏结晶匣子族C成员9(ABCC9)；ATP黏结晶匣子族D成员1(ABCD1)； ATP酶肌质/内质网Ca2+转运1(ATP2A1)；ATM丝氨酸/苏氨酸激酶(ATM)；□生育酚转移酶蛋白质(TTPA)；驱动蛋白家庭成员21A(KIF21A)；类成对同源盒2a(PHOX2A)；硫酸乙酰肝素蛋白聚糖2(HSPG2)；间质互动分子1(STIM1)；notch 1(NOTCH1)；notch 3(NOTCH3)；肌养蛋白α(dystrobrevin) (DTNA)；蛋白激酶AMP-被活化，非催化γ2(PRKAG2)；富含半胱氨酸-和甘氨酸-蛋白质3(CSRP3)；viniculin(VCL)；myozenin 2(MyoZ2)；肌钯蛋白 (myopalladin)(MYPN)；亲联蛋白2(junctophilin2)(JPH2)；受磷蛋白 (phospholamban)(PLN)；钙网蛋白3(CALR3)；微管连接蛋白F-肌动蛋白-结合蛋白(NEXN)；LIM结构域黏结3(LDB3)；孔眼不存在4(EYA4)；亨廷顿蛋白(huntingtin)(HTT)；雄激素受体(AR)；蛋白质酪氨酸磷酸非受体型11 (PTPN11)；接合点盘状球蛋白(junction plakoglobin)(JUP)；桥粒蛋白 (desmoplakin)(DSP)；桥粒斑菲素蛋白2(plakophilin 2)(PKP2)；桥粒芯蛋白 2(DSG2)；桥粒糖蛋白2(DSC2)；连环蛋白α3(CTNNA3)；NK2同源盒5 (NKX2-5)；A-激酶锚定物蛋白质9(AKAP9)；A-激酶锚定物蛋白质10(AKAP10)；鸟嘌呤核苷酸-结合蛋白α-抑制活性多肽2(GNAI2)；锚蛋白2 (ANK2)；互生蛋白α-1(SNTA1)；调钙蛋白1(CALM1)；调钙蛋白2(CALM2)； HTRA丝氨酸肽酶1(HTRA1)；肌原纤维蛋白1(FBN1)；肌原纤维蛋白2 (FBN2)；木糖基转移酶1(xylosyltransferase 1)(XYLT1)；木糖基转移酶2 (XYLT2)；tafazzin(TAZ)；尿黑酸1,2-双加氧酶(HGD)；葡萄糖-6-磷酸酶催化(G6PC)；1,4-α-葡聚糖酶1(GBE1)；磷酸果糖激酶，肌肉(PFKM)；磷酸化酶激酶调节子单元α1(PHKA1)；磷酸化酶激酶调节子单元α2(PHKA2)；磷酸化酶激酶调节子单元β(PHKB)；磷酸化酶激酶催化子单元γ2(PHKG2)；磷酸甘油酸变位酶2(PGAM2)；胱硫醚-β-合成酶(CBS)；亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase)(MTHFR)；5-亚甲基四氢叶酸-高半胱氨酸甲基转移酶(MTR)；5-亚甲基四氢叶酸-高半胱氨酸甲基转移酶还原酶(MTRR)；甲基丙二酸酸尿和高胱氨酸尿症、cblD型(MMADHC)；粒线体DNA，包含但不限于编码NADH的线粒体：泛醌氧化还原酶核心子单元1(MT-ND1)；编码NADH的线粒体：泛醌氧化还原酶核心子单元5(MT-ND5)；编码tRNA 谷氨酸的线粒体(MT-TE)；编码tRNA组氨酸的线粒体(MT-TH)；编码tRNA 白胺酸1的线粒体(MT-TL1)；编码tRNA离胺酸的线粒体(MT-TK)；编码tRNA丝氨酸1的线粒体(MT-TS1)；编码tRNA缬氨酸的线粒体(MT-TV)；丝裂原活化蛋白激酶激酶1(MAP2K1)；B-Raf原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶 (BRAF)；raf-1原癌基因，丝氨酸/苏氨酸激酶(RAF1)；生长因子，包含但不限于胰岛素生长因子1(IGF-1)；转型生长因子β3(TGFβ3)；转型生长因子β受体，I型(TGFβR1)；转型生长因子β受体，II型(TGFβR2)、成纤维细胞生长因子2(FGF2)、成纤维细胞生长因子4(FGF4)、血管内皮生长因子A(VEGF- A)、血管内皮生长因子B(VEGF-B)；血管内皮生长因子C(VEGF-C)、血管内皮生长因子D(VEGF-D)、血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)和血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；白介素；免疫粘附素；细胞因子；和抗体。
在优选实施例中，由本发明AAV变异体递送的基因产物是选自α半乳糖苷酶A(GLA)、共济蛋白(FXN)、肌缩蛋白(DMD)、酸α葡糖苷酶(GAA) 和肌肉肝糖磷酸化酶(PYGM)。在一些优选实施例中，本发明AAV变异体包括核酸区段，所述核酸区段包括编码(i)包括示为SEQ ID NO:67的氨基酸序列或由其组成的GLA多肽；(ii)包括示为SEQ ID NO:69的氨基酸序列或由其组成的FXN多肽；(iii)包括示为SEQ ID NO:64的氨基酸序列的功能片段(例如微肌缩蛋白，优选包括完整肌动蛋白-结合结构域，24个血影蛋白样重复的至少4个和肌营养不良蛋白聚糖-结合结构域)或由其组成的DMD多肽；(iv)包括示为SEQ ID NO:68的氨基酸序列或由其组成的GAA多肽；(v)包括示为SEQ ID NO:66的氨基酸序列或由其组成的PYGM多肽；(vi)或(v)与SEQ ID NO:64和66-69中的任一个有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％一致性的氨基酸序列。
在另一个优选实施例中，本发明AAV变异体包括编码干扰RNA的转基因，例如反义RNA、miRNA、shRNA或siRNA，其降低DMPK的表达。在一些方面，干扰RNA降低由具有如SEQ IDNO:65阐述的核苷酸序列或与SEQ ID NO:65有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％一致性的序列的核酸编码的DMPK的表达。
基因产物诱导或促进细胞凋亡的基因在本文中称为“促凋亡基因”，并且那些基因(mRNA；蛋白质)的产物被称为“促凋亡基因产物”。促凋亡靶标包含例如Bax基因产物；Bid基因产物；Bak基因产物；Bad基因产物；Bcl-2；Bcl- X1。抗凋亡基因产物包含X连锁的凋亡抑制剂。
基因产物诱导或促进血管生成的基因在本文中称为“促血管生成基因”，那些基因(mRNA；蛋白质)的产物被称为“促血管生成基因产物”。促血管生成靶标包含例如血管内皮生长因子(VEGFa、VEGFb、VEGFc、VEGFd)；血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Fms相关酪氨酸激酶1(Flt1)；胎盘生长因子(PGF)；血小板衍生的生长因子(PDGF)；血管生成素；音猬因子(sonic hedgehog)。基因产物抑制血管生成的基因在本文中称为“抗血管生成基因”，并且那些基因(mRNA；蛋白质)的产物被称为“抗血管生成基因产物”。抗血管生成基因产物包含内皮抑制素；肿瘤抑素 (tumstatin)；血管生长抑素；色素上皮衍生因子(PEDF)，和对促血管生成靶标和/或其受体具有特异性的融合蛋白或抗体，例如VEGF-特异性抗体AvastinTM等。
基因产物充当免疫调节剂的基因例如补体因子、铎样受体，被称为“免疫调节基因”。示例性免疫调节基因包含细胞因子、趋化因子和对其和/或其受体具有特异性的融合蛋白或抗体，例如抗IL-6融合蛋白RilonaceptTM，补体因子 H-特异性抗体兰帕单抗(lampamizumab)等。基因产物充当肌肉保护因子的基因，例如胰岛素生长因子1(IGF-1)；转型生长因子β(TGFβ)；成纤维细胞生长因子(FGF)。
在一些情况下，所关注的基因产物是位点特异性核酸内切酶，其提供基因功能的位点特异性敲低，例如，其中核酸内切酶敲除与肌肉疾病相关的等位基因(allele)。举例来说，在显性等位基因编码当野生型为肌肉结构蛋白和/或提供正常肌肉功能时的基因有缺陷拷贝的情况下，可以将位点特异性核酸内切酶靶向缺陷等位基因并敲除缺陷等位基因。
除了敲除缺陷等位基因外，位点特异性核酸酶还可以用于刺激具有供体 DNA的同源重组，所述供体DNA编码由缺陷等位基因编码的蛋白质的功能性拷贝。因此，例如，本发明rAAV病毒粒子可以用于递送敲除缺陷等位基因的位点特异性核酸内切酶，并且可以用于递送缺陷等位基因的功能性拷贝，从而导致缺陷等位基因的修复，由此提供用于产生功能性肌肉蛋白(例如，功能性 lamin A/C、功能性肌原纤维蛋白、功能性胶原蛋白VI型等)。在一些实施例中，本文所公开的rAAV病毒粒子包括编码位点特异性核酸内切酶的异源核苷酸序列；和编码缺陷等位基因的功能性拷贝的异源核苷酸序列，其中功能性拷贝编码功能性肌肉蛋白。功能性肌肉蛋白包含例如laminA/C、肌原纤维蛋白1、 COL6A1、COL6A2、COL6A3等。
适合使用的位点特异性核酸内切酶包含例如大范围核酸酶；锌指核酸酶 (ZFN)；转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)；以及有规律地聚集的间隙短回文重复/CRISPR相关(Cas)，其中此类位点特异性核酸内切酶是非天然存在的，并被修饰以靶向特定基因。可以工程化此类位点特异性核酸酶以切割基因组内的特定位置，并且随后非同源末端连接可以在插入或缺失若干核苷酸时修复断裂。此类位点特异性核酸内切酶(也称为“INDEL”)随后将蛋白质抛出框架并有效地敲除基因。参见，例如美国专利公开第2011/0301073号。
在本文所公开的变异rAAV载体的一些实施例中，编码所关注的基因产物的核苷酸序列与组成型启动子可操作地连接。适合的构成性启动子包含例如巨细胞病毒启动子(CMV)(Stinski等人，(1985)《病毒学杂志(Journal of Virology)》 55(2):431-441)、CMV早期强化子/鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子/兔β-球蛋白内含子(CAG)(Miyazaki等人，(1989)《基因》79(2):269-277、CBSB(Jacobson 等人，(2006)《分子治疗》13(6):1074-1084)、人延伸因子1α启动子(EF1α) (Kim等人，(1990)《基因》91(2):217-223)、人磷酸甘油酸激酶启动子(PGK) (Singer-Sam等人，(1984)《基因》32(3):409-417)、粒线体重链启动子(Loderio 等人，(2012)PNAS 109(17):6513-6518)、泛素启动子(Wulff等人，(1990) FEBS Letters261:101-105)。在其它实施例中，编码所关注的基因产物的核苷酸序列与诱导型启动子可操作地连接。在一些情况下，编码所关注的基因产物的核苷酸序列与组织特异性或细胞类型特异性调节要素可操作地连接。举例来说，在一些情况下，编码所关注的基因产物的核苷酸序列与肌肉特异性调节要素(例如，心肌特异性启动子或骨骼肌特异性启动子)可操作地连接，例如赋予肌细胞中的可操作地连接的基因的选择性表达的调节要素。适合的肌肉特异性调节要素包含例如骨骼肌α-肌动蛋白启动子(Muscat和Kedes(1987)Mol.Cell.Biol.7: 4089-4099)；心肌α-肌动蛋白启动子(Minty和Kedes(1986)Mol.Cell.Biol.6: 2125-2136)；平滑肌α-肌动蛋白启动子(Nakano等人，(1991)《基因》99:285- 289)；血管平滑肌α-肌动蛋白启动子(Keogh等人，(1999)《分子治疗》6(4): 616-628)；肌肉肌酸激酶启动子(Bartlett等人，(1996)《细胞移植(Cell Transplantation)》5(3):411-419)；肌球蛋白轻链1和肌球蛋白轻链3启动子 (Seidel和Arnold(1989)《生物化学杂志》264(27):16109-16117)；肌球蛋白轻链2v(MLC2v)启动子(Su等人，(2004)PNAS 101(46):16280-16285)；肌原性因子5(Myf5)启动子(Fujimaki等人，(2004)《生物化学方法杂志》289(11): 7399-7412)；肌原分化1(Myod1)启动子(Zingg等人，(1994)《核酸研究》 22(12):2234-2241)；肌细胞生成素(Myog)启动子(Salminen等人，(1991) 《细胞生物学杂志》115(4):905-917)；成对框基因7(Pax7)启动子(Murmann 等人，(2000)Biol Chem.381(4):331-335)；成对样同源结构域3(Pitx3)启动子(Coulon等人，(2007)《生物化学方法杂志》282:33192-33200)；MHCK7启动子(Salva等人，(2007)《分子治疗》15(2):320-329)；MCK/SV40启动子 (Takeshita等人，(2007)《分子药物国际杂志》19:309-315)；C5-12启动子(Li等人，(1999)《自然·生物技术》17:241-245)；二级和三级串联MCK强化子/启动子(Wang等人，(2008)《基因疗法》15:1489-1499)；肌球蛋白重链7(MYH7) 启动子；(Iwaki等人，(2104)PLoS ONE 9(4):e88610)；肌球蛋白重链6(MYH6) 启动子(Pacak等人，(2008)Genet.Vaccines Ther.6:13)；心肌肌钙蛋白T(TNNT2) 启动子(Farza等人，(1998)J.Mol.Cell Cardiol.30(6):1247-53)；α-原肌凝蛋白启动子(Helfman等人，(1986)《分子和细胞生物学(Molecular and Cellular Biology)》6(11):3582-3595)；心肌肌钙蛋白C(TNNC1)启动子(Scheier等人， (1990)《生物化学方法杂志》34(5):21247-21253)；心肌肌球蛋白-结合蛋白C 启动子(Lin等人，(2013)PLoS ONE 8(7):e69671)；心肌肌钙蛋白I(TNNI3) 启动子(Bhavsar等人，(1996)《基因组学(Genomics)》35(1):11-23)；结蛋白启动子(Li等人，(1991)《生物化学方法杂志》10(5):6562-6570)；钠-钙交换剂(NCX1)启动子(Scheller等人，(1997)《生物化学方法杂志》273(13):7643- 7649)；心房利钠因子启动子(Durocher等人，(1996)《分子和细胞生物学》16(9): 4648-4655)；和SM22α启动子(Kemp等人，(1995)《生物化学杂志》310(3): 1037-1043。
出于本发明的目的，本文的公开内容提供了分离核酸，其包括编码如上所描述的变异AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。分离核酸可以是AAV载体，例如重组AAV载体。
本文的公开内容还提供了一种治疗肌肉疾病的方法，所述方法包括向有此需要的个体给予有效量的rAAV变异体病毒粒子，其包括如上文所描述和本文所公开的关注的转基因。所属领域的普通技术人员将容易地能够确定本发明 rAAV病毒粒子的有效量，并且所述疾病已通过测试一个或多个功能性或解剖学参数中的改变来治疗，例如肌肉活检随后进行免疫组织化学、血清采样随后进行ELISA或酶活性分析、行走测试、峰值最大耗氧量、生物标记分析左心室射血分数、左心室收缩末期容积、手持式测力仪、最大举重、定时功能测试、Hammersmith马达能力得分、从地板上定时爬升或9孔钉测试。
用于评估肌肉功能和其变化的非限制性方法包含评估行走测试、峰值最大耗氧量、生物标记分析、左心室射血分数、左心室收缩末期容积、Vignos量表、定时功能测试、Hammersmith马达能力得分、从地板上定时爬升、运动功能测量量表、北极星动态评估、9孔钉测试或费城儿童医院神经肌肉病症婴儿测试。
在一些实施例中，有效量的本发明rAAV病毒粒子导致肌肉功能、解剖学完整性或肌肉量的丧失速率降低，例如丧失速率和因此疾病的进展降低2倍、 3倍、4倍或5倍或更多，例如丧失速率和因此疾病的进展降低10倍或更多。在一些实施例中，有效量的本发明rAAV病毒粒子导致肌肉功能增加、肌肉强度增加、肌肉量增加和/或解剖学肌肉完整性或生物标记改进，例如肌肉功能、肌肉强度、肌肉量的2倍、3倍、4倍或5倍改进或更多倍，和/或解剖学肌肉完整性或生物标记的改进，例如肌肉功能、肌肉强度、肌肉量的10倍改进或更多倍，和/或解剖学肌肉完整性或生物标记的改进。如所属领域的普通技术人员将容易了解，实现所要的治疗作用所需的剂量通常将在1×108到约1×1016个重组病毒粒子的范围内，通常由所属领域的普通技术人员称为1×108到约1×1016个“载体基因组”，并且优选地将在约1×1011到约1×1015个重组病毒粒子的范围内。
本发明rAAV病毒粒子可通过血管内(静脉内或动脉内)给药、腹膜内给药、肢体灌注和/或直接肌肉内注射或通过将导致rAAV病毒粒子递送到骨骼肌的任何其它方便的给药模式或途径递送到骨骼肌。rAAV病毒粒子可通过血管内(静脉内或动脉内)给药、直接心肌(到左心房、右心房、右心室和/或隔膜)、顺行或逆行输注到冠状动脉(经由左前降支或左回旋冠状动脉)、再循环、心包内注射、心内膜注射或通过将导致rAAV病毒粒子递送到心肌的任何其它方便的给药模式或途径递送到心肌。在一个优选实施例中，本发明rAAV病毒粒子是通过全身性静脉内给予递送到骨骼和/或心肌。当通过静脉内注射给药时，与野生型AAV病毒粒子或包括相应亲代AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子的能力相比，本发明rAAV病毒粒子能够更有效地移动通过循环系统并且转导肌细胞。
本文所公开的变异衣壳蛋白被分离，例如纯化。在一些实施例中，本文所公开的变异衣壳蛋白包含在AAV载体或重组AAV(rAAV)病毒粒子中。在其它实施例中，此类AAV变异体载体和/或AAV变异体病毒粒子用于治疗灵长类心肌或骨骼肌中的肌肉疾病的体内或体外方法。
本文的公开内容进一步提供了宿主细胞，如但不限于包括本发明核酸的分离的(遗传修饰的)宿主细胞。根据本文所公开的本发明的宿主细胞可以是分离的细胞，如来自体外细胞培养物的细胞。如本文所描述，此类宿主细胞用于产生本发明rAAV变异体病毒粒子。在一个实施例中，用核酸对此类宿主细胞进行稳定地遗传修饰。在其它实施例中，用核酸对宿主细胞进行瞬时遗传修饰。使用已确立的技术将此类核酸稳定地或瞬时地引入宿主细胞中，所述技术包含但不限于电穿孔、磷酸钙沉淀、脂质体介导的转染等。为了稳定转化，核酸通常进一步包含可选择标记，例如，若干众所周知的可选择标记中的任何一种，如新霉素抗性等。通过将核酸引入多种细胞中的任何一种中来产生此类宿主细胞，例如哺乳动物细胞，包含例如小鼠细胞和灵长类细胞(例如人类细胞)。示例性哺乳动物细胞包含但不限于原代细胞和细胞系，其中示例性细胞系包含但不限于HEK293细胞、HEK293T细胞、COS细胞、HeLa细胞、Vero细胞、3T3 小鼠成纤维细胞、C3H10T1/2成纤维细胞、CHO细胞等。示例性宿主细胞包含但不限于：HeLa细胞(例如，美国菌种保藏中心(American Type CultureCollection；ATCC)编号CCL-2)、CHO细胞(例如，ATCC编号：CRL9618、 CCL61、CRL9096)、293细胞(例如，ATCC编号CRL-1573)、Vero细胞、NIH 3T3细胞(例如，ATCC编号CRL-1658)、Huh-7细胞、BHK细胞(例如，ATCC 编号CCL10)、PC12细胞(ATCC编号CRL1721)、COS细胞、COS-7细胞(ATCC编号CRL1651)、RAT1细胞、小鼠L细胞(ATCC编号CCLI.3)、人类胚肾(HEK293)细胞(ATCC编号CRL1573)、HLHepG2细胞等。宿主细胞还可以使用杆状病毒来感染产生AAV的昆虫细胞(如Sf9细胞)来制备(参见例如第7,271,002号美国专利；第12/297,958号美国专利申请)。在一些实施例中，除了包括对变异AAV衣壳蛋白进行编码的核苷酸序列的核酸之外，遗传修饰的宿主细胞包含如上文所描述的核酸，所述核酸包括对一种或多种AAV rep蛋白进行编码的核苷酸序列。在其它实施例中，宿主细胞进一步包括rAAV变异体载体。可以使用此类宿主细胞产生rAAV变异体病毒粒子。产生rAAV病毒粒子的方法描述于例如第2005/0053922号美国专利公开和第2009/0202490号美国专利公开中。
本文公开内容另外提供了一种药物组合物，其包括：a)如上文所描述和本文所公开的rAAV变异体病毒粒子；b)药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或缓冲剂。在一些实施例中，药学上可接受的载剂、稀释剂、赋形剂或缓冲剂适用于人类或非人类患者。此类赋形剂、载剂、稀释剂和缓冲剂包含可以在没有过度毒性的情况下给药的任何药剂。药学上可接受的赋形剂包含但不局限于液体，如水、生理盐水、甘油和乙醇。药学上可接受的盐可以包含于其中，例如无机酸盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、磷酸盐、硫酸盐等；和有机酸的盐，如乙酸盐、丙酸盐、丙二酸盐、苯甲酸盐等。另外，辅助物质，如湿润剂或乳化剂、表面活性剂、pH缓冲物质等可存在于此类媒剂中。多种药学上可接受的赋形剂是所属领域中已知的，并且无需在本文中详细地论述。药学上可接受的赋形剂已充分描述于多种公开中，包含例如A.Gennaro(2000)“《雷明顿：医药科学和实践(Remington:The Science and Practice ofPharmacy)》”第20版，Lippincott, Williams,&Wilkins；《药物剂型和药物递送体系(Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems)》(1999)H.C.安塞尔等人编辑，第7版，Lippincott, Williams,&Wilkins；和《药物赋形剂手册(Handbook ofPharmaceutical Excipients)》(2000)A.H.Kibbe等人编辑，第3版，Amer.PharmaceuticalAssoc。在本发明的一些方面，本发明提供了一种药物组合物，其包括约1×108到约 1×1016个重组病毒或1×108到约1×1016个载体基因组，其中每个所述重组病毒包括对一种或多种基因产物进行编码的基因组。
在以下条目1到54中例示了本发明的一些实施例：
1.一种变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包括在所述衣壳蛋白的GH环中的肽插入，其中所述插入处于除AAV2或AAV变异体之外的野生型AAV血清型的衣壳部分中的AAV2或相应位置处，并且其中所述肽插入选自以下组成的组：NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)、TNKIGVT (SEQ ID NO:15)、GNLTKGN(SEQ ID NO:16)、NTVKLST(SEQ IDNO:17)、 SNTVKAI(SEQ ID NO:18)、ASNITKA(SEQ ID NO:19)、DNTVTRS(SEQ ID NO:20)、NKISAKD(SEQ ID NO:21)、NQDYTKT(SEQ ID NO:22)、QADTTKN (SEQ ID NO:23)、TNRTSPD(SEQ ID NO:24)、SNTTQKT(SEQ ID NO:25)、 ASDSTKA(SEQ ID NO:26)、LANKIQRTDA(SEQ IDNO:27)、LANKTTNKDA (SEQ ID NO:28)、LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)、LAGNLTKGNA(SEQ IDNO:30)、LANTVKLSTA(SEQ ID NO:31)、LASNTVKAIA(SEQ ID NO:32)、 LAASNITKAA(SEQ IDNO:33)、LADNTVTRSA(SEQ ID NO:34)、 LANKISAKDA(SEQ ID NO:35)、LANQDYTKTA(SEQ IDNO:36)、 LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)、LATNKIGVTA(SEQ ID NO:38)、LAQADTTKNA(SEQ IDNO:39)、LATNRTSPDA(SEQ ID NO:40)、 LASNTTQKTA(SEQ ID NO:41)和LAASDSTKAA(SEQ IDNO:42)。
2.根据条目1所述的变异AAV，其中所述衣壳蛋白相对于AAV2包括一个或多个点突变或相对于其它野生型AAV血清型或AAV变异体包括一个或多个相应的点突变。
3.根据条目2所述的变异AAV，其中所述一个或多个点突变选自以下组成的组：A35P、S109T、P195L、D213N、G222S、V229I、N312K、A319T、T330A、 A333S、E347K、P363L、A427D、V447F、N449D、N449K？、G453R、A490T、 K527Q、N551S、A581T、Y585S、R588M、A593E、W606C、K649E、R651H、 W694C、I698V、V708I和L735Q，并且优选选自以下组成的组：V708I、V708I+A593E、V708I+S109T、V708I+T330A、A35P、V708I+R588M、 V708I+W606C、V708I+W694C、I698V、N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q、 N312K+N449D+N551S+I698V+V708I+L735Q、V708I+N449K和V708I+G222S。
4.根据条目1的变异AAV，其中所述肽插入被插入在AAV2的VP1中的位置570-671中的氨基酸的任一种之后或在另一种野生型AAV血清型或AAV变异体中的相应位置。
5.根据条目4所述的变异AAV，其中所述肽插入被插入AAV2的VP1中的氨基酸587之后或另一种AAV血清型中的相应位置。
6.一种感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其包括：(a)根据条目 1到5中任一项所述的变异AAV衣壳蛋白和异源核酸。
7.根据条目6所述的rAAV，其中所述异源核酸包括编码RNA干扰剂或多肽的核苷酸序列。
8.一种将异源核酸递送到靶细胞的方法，其包括使靶细胞与根据条目7所述的rAAV病毒粒子接触。
9.根据条目8所述的方法，其中所述靶细胞为心肌和/或骨骼肌细胞。
10.根据条目8所述的方法，其中所述靶细胞在体外。
11.根据条目8所述的方法，其中所述靶细胞在体内。
12.一种包括编码变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列的分离核酸，所述变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白包括所述衣壳蛋白的GH-环中的肽插入，其中所述插入处于除AAV2或AAV变异体之外的野生型AAV血清型的衣壳部分中的AAV2或相应位置处，并且其中所述肽插入选自以下组成的组： NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)、TNKIGVT(SEQ ID NO:15)、GNLTKGN(SEQ ID NO:16)、NTVKLST(SEQ ID NO:17)、SNTVKAI(SEQ ID NO:18)、ASNITKA(SEQ ID NO:19)、DNTVTRS(SEQ ID NO:20)、 NKISAKD(SEQ IDNO:21)、NQDYTKT(SEQ ID NO:22)、QADTTKN(SEQ ID NO:23)、TNRTSPD(SEQ ID NO:24)、SNTTQKT(SEQ ID NO:25)、ASDSTKA (SEQ ID NO:26)、LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)、LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)、LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)、LANTVKLSTA(SEQ ID NO:31)、LASNTVKAIA(SEQ ID NO:32)、 LAASNITKAA(SEQ ID NO:33)、LADNTVTRSA(SEQ ID NO:34)、 LANKISAKDA(SEQ ID NO:35)、LANQDYTKTA(SEQ ID NO:36)、LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)、LATNKIGVTA(SEQ ID NO:38)、 LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)、LATNRTSPDA(SEQ ID NO:40)、 LASNTTQKTA(SEQ ID NO:41)和LAASDSTKAA(SEQ ID NO:42)。
13.一种包括根据条目12所述的核酸的分离的宿主细胞。
14.一种变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其相对于亲代AAV衣壳蛋白包括肽插入，所述肽插入对应于AAV2的VP1的氨基酸570与611之间的位置处的两个相邻氨基酸，其中所述插入包括氨基酸序列Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3，并且其中X1选自T和N；X2选自N和K；X3选自K、I和T；X4选自I、Q和 T；X5选自G、R和N；X6选自V、T和K；并且X7选自T和D。。
15.根据条目14所述的变异AAV，其中所述肽插入选自以下组成的组： NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)和TNKIGVT(SEQ ID NO:15)。
16.根据条目15所述的变异AAV，其中所述肽插入侧接有N-末端氨基酸 LA和C-末端氨基酸A。
17.根据条目15所述的变异AAV，其中所述肽插入是在AAV2的VP1的氨基酸587与588之间或另一种野生型AAV血清型或AAV变异体中的对应位置。
18.一种感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其包括：(a)根据条目 14到17中的任一项所述的变异AAV衣壳蛋白和异源核酸。
19.根据条目18所述的rAAV，其中所述异源核酸包括RNA干扰剂或编码多肽的核苷酸序列。
20.一种将异源核酸递送到靶细胞的方法，其包括使所述靶细胞与根据条目 18所述的rAAV病毒粒子接触。
21.根据条目20所述的方法，其中所述靶细胞为心肌和/或骨骼细胞。
22.根据条目21所述的方法，其中所述靶细胞在体外或在体内。
23.一种变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包括i)与选自SEQ ID NO:1- 10和11组成的组的野生型AAV有至少90％一致性的AAV氨基酸序列；和ii) 选自以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：P363L、P363L+V708I、 P363L+E347K、V708I+A593E、V708I+A333S、V708I+S721L、 V708I+A593E+N551S、V708I+A593E+K649E、V708I+A593E+S109T、 V708I+A593E+S109T+K527Q、A593E+S109T，其中所述一个或多个取代相对于 AAV2或所述一个或多个相应取代相对于其它AAV血清型。
24.根据条目23所述的变异AAV，其中所述衣壳蛋白包括肽插入。
25.根据条目24所述的变异AAV，其中所述肽插入选自以下组成的组：NKIQRTD(SEQID NO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)、TNKIGVT(SEQ ID NO:15)、GNLTKGN(SEQ ID NO:16)、NTVKLST(SEQ ID NO:17)、SNTVKAI (SEQ ID NO:18)、ASNITKA(SEQ ID NO:19)、DNTVTRS(SEQ ID NO:20)、 NKISAKD(SEQ ID NO:21)、NQDYTKT(SEQ ID NO:22)、QADTTKN(SEQ IDNO:23)、TNRTSPD(SEQ ID NO:24)、SNTTQKT(SEQ ID NO:25)、ASDSTKA (SEQ ID NO:26)、LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)、LANKTTNKDA(SEQ ID NO:28)、LATNKIGVTA(SEQ ID NO:29)、LAGNLTKGNA(SEQ ID NO:30)、 LANTVKLSTA(SEQ ID NO:31)、LASNTVKAIA(SEQ ID NO:32)、LAASNITKAA(SEQ ID NO:33)、LADNTVTRSA(SEQ ID NO:34)、 LANKISAKDA(SEQ ID NO:35)、LANQDYTKTA(SEQ ID NO:36)、 LATNKIGVTS(SEQ ID NO:37)、LATNKIGVTA(SEQ ID NO:38)、LAQADTTKNA(SEQ ID NO:39)、LATNRTSPDA(SEQ ID NO:40)、 LASNTTQKTA(SEQ ID NO:41)和LAASDSTKAA(SEQ ID NO:42)。
26.根据条目23所述的变异AAV，其中所述AAV氨基酸序列与所述野生型AAV至少95％一致。
27.根据条目23所述的变异AAV，其中所述AAV氨基酸序列与所述野生型AAV至少99％一致。
28.根据条目23所述的变异AAV，其中所述衣壳蛋白为嵌合衣壳蛋白或为祖先衣壳蛋白。
29.一种感染性重组腺相关病毒(rAAV)病毒粒子，其包括：(a)根据条目 23到28中任一项所述的变异AAV衣壳蛋白和异源核酸。
30.根据条目29所述的rAAV，其中所述异源核酸包括编码RNA干扰剂或多肽的核苷酸序列。
31.一种将异源核酸递送到靶细胞的方法，其包括使所述靶细胞与根据条目 29所述的rAAV病毒粒子接触。
32.根据条目31所述的方法，其中所述靶细胞为心肌和/或骨骼肌细胞。
33.根据条目32所述的方法，其中所述心肌细胞选自心肌细胞、成心肌细胞、心肌成纤维细胞和心肌祖细胞组成的组。
34.根据条目31所述的方法，其中所述靶细胞在体外。
35.根据条目31所述的方法，其中所述靶细胞在体内。
36.一种包括编码变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白的核苷酸序列的分离核酸，所述变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白包括与选自SEQ ID NO:1-12组成的组的野生型AAV或AAV变异体有至少90％一致性的氨基酸序列；和ii)选自以下组成的组的一个或多个氨基酸取代：P363L、P363L+V708I、P363L+E347K、 V708I+A593E、V708I+A333S、V708I+S721L、V708I+A593E+N551S、 V708I+A593E+K649E、V708I+A593E+S109T、V708I+A593E+S109T+K527Q、A593E+S109T。
37.一种包括根据条目36所述的核酸的分离的宿主细胞。
38.一种变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包括在所述衣壳蛋白的GH- 环中的肽插入并且任选地包括一个或多个点突变，其中所述肽插入选自 NKIQRTD(SEQ ID NO:13)和LANKIQRTDA(SEQ ID NO:26)组成的组。
39.根据条目38所述的变异AAV衣壳蛋白，其包括V708I氨基酸取代。
40.根据条目39所述的变异AAV衣壳蛋白，其包括V708I+A593E、 V708I+S109T、V708I+T330A、V708I+R588M或 V708I+N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q氨基酸取代。
41.根据条目38所述的变异AAV衣壳蛋白，其包括A35P氨基酸取代。
42.根据条目38所述的变异AAV衣壳蛋白，其包括 N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q氨基酸取代。
43.一种变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包括在所述衣壳蛋白的GH- 环中的肽插入并且任选地包括一个或多个点突变，其中所述肽插入选自NKTTNKD(SEQ ID NO:14)和LANKTTNKDA(SEQ ID NO:27)组成的组。
44.根据条目43所述的变异AAV衣壳蛋白，其包括V708I氨基酸取代。
45.根据条目44所述的变异AAV衣壳蛋白，其包括V708I+S109T、 V708I+W694C、V708I+W606C或V708I+N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q 氨基酸取代。
46.根据条目43所述的变异AAV衣壳蛋白，其包括I698V氨基酸取代。
47.根据条目46所述的变异AAV衣壳蛋白，其包括 N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q氨基酸取代。
48.一种变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包括在所述衣壳蛋白的GH- 环中的肽插入并且任选地包括一个或多个点突变，其中所述肽插入选自 TNKIGVT(SEQ ID NO:15)、LATNKIGVTA(SEQ ID NO:28)和LATNKIGVTS (SEQ ID NO:36)组成的组。
49.根据条目48所述的变异AAV衣壳蛋白，其包括V708I氨基酸取代。
50.根据条目49所述的变异AAV衣壳蛋白，其包括V708I+N449K、 V708I+G222S或V708I+N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q氨基酸取代。
51.根据条目48所述的变异AAV衣壳蛋白，其包括 N312K+N449D+N551S+I698V+L735Q氨基酸取代。
52.一种变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包括SEQ ID NO:62的序列或与其有至少90％一致性的序列，其中所述变异AAV衣壳蛋白相对于AAV5衣壳包括以下氨基酸取代：V229I+A490T+A581T。
53.根据条目52所述的变异AAV衣壳蛋白，其相对于AA5衣壳进一步包括Y585S或V447F氨基酸取代。
54.一种变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白，其包括SEQ ID NO:63的序列或与其有至少90％一致性的序列，其中所述变异AAV衣壳蛋白相对于AAV5衣壳包括以下氨基酸取代：V229I+A427D+A490T+A581T。
实例
提出以下实例以便向所属领域的普通技术人员完整地公开并且描述如何制备和使用本发明，并且并不意欲限制本发明人视为其发明的范围，也不旨在表示下文实验是所进行的全部或唯一实验。已努力确保关于所使用的数量(例如量、温度等)的准确性，但应当说明存在一些实验性误差和偏差。除非另外指明，否则份数是重量份，分子量是重量平均分子量，温度是摄氏度，并且压力是大气压或接近大气压。
可以在此类标准教科书中找到分子和细胞生物化学的一般方法，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》第3版，(Sambrook 等人，HarborLaboratory Press 2001)；《精编分子生物学指南(Short Protocols in MolecularBiology)》第4版，(Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons 1999)；《蛋白质法(ProteinMethods)》(Bollag等人，John Wiley&Sons 1996)；《用于基因疗法的非病毒载体(NonviralVectors for Gene Therapy)》(Wagner等人编辑，Academic Press 1999)；《病毒载体(Viral Vectors)》(Kaplift&Loewy编辑， Academic Press 1995)；《免疫学方法手册(Immunology Methods Manual)》(I. Lefkovits编辑，Academic Press 1997)；和《细胞和组织培养：生物技术的实验室程序(Cell and Tissue Culture:Laboratory Proceduresin Biotechnology)》(Doyle &Griffiths，John Wiley&Sons 1998)，其公开内容以引用的方式并入本文中。本公开中所提及的用于基因操作的试剂、克隆载体和套组可购自市售供应商，如伯乐(BioRad)、斯塔津(Stratagene)、英杰(Invitrogen)、西格玛-阿尔德里奇(Sigma-Aldrich)和克隆科技(ClonTech)。
实例1
静脉内注射和组织采集。对于每一轮选择，通过大隐静脉的静脉内注射给药年龄为3-10岁且体重至少3kg的单只雄性食蟹猕猴(食蟹猴)。将动物麻醉并且给药1-5mL的库(在第一轮中，库由使用图1A中所描述的所有突变诱发技术产生的变异体构成；在每一后续轮中，从先前轮分离变异体)，在一些情况下，在37℃下用人类IVIG预培育30分钟。
取决于选择，在第14±3天或21±3天，由经过培训的兽医人员使用100 mg/kg戊巴比妥钠静脉内注射进行安乐死。去除来自四头肌的心肌和/或骨骼肌组织，并且从组织中分离DNA。在一些情况下，心肌组织划分成若干区域：心房、心室中隔(ventricular septum)、左乳头肌、右乳头肌、左心室和右心室。
定向进化。图1A-1E中示出了定向进化过程。简单地说，创建了包括20多种DNA突变技术和cap基因的专有组合的病毒衣壳库(图1A)。随后包装病毒 (图1B)-使得每个颗粒由围绕对那个衣壳进行编码的cap基因的突变衣壳构成 -并且被纯化。将衣壳库置于体内选择性压力下。采集相关组织或细胞材料以分离已成功感染那个靶标的AAV变异体，并回收成功的病毒。通过重复选择来富集成功的克隆(阶段I-图1D)。随后将所选择的cap基因进行专有的再分散，并通过进一步的选择步骤富集以迭代地增加病毒适应性(阶段2-图1D)。在载体选择阶段1和2期间鉴别的变异体证明了转导灵长类肌细胞的能力(图1E)。
AAV衣壳基因组的成功回收。从每轮选择中回收的衣壳用于包装注射的文库以引发随后的一轮选择。从组织中回收衣壳基因表示库载体成功地内化到相关组织中。图2展示了从代表性的一轮选择中从心肌骨骼肌组织中回收病毒基因组。框内的条带表示病毒基因组的成功回收。
测序分析。在包含对心肌组织或骨骼肌组织静脉内递送的选择性压力的选择的第3-4轮和包含在中和抗体存在下对心肌组织静脉内递送的选择性压力的选择的第1-2轮期间，对库内的个别克隆进行测序以确定群体中变异体的频率。评估变异体在测序数据中是否存在基序。基于在多个序列中发生的统一变异体 (例如，衣壳内一致位置中的特异性点突变或特异性肽插入序列)的存在，将变异体分组为基序。在两轮或更多轮选择中代表至少5％测序群体的基序，或在一轮或多轮选择中代表至少10％的测序群体的基序表示于图3A(对静脉内递送到心肌组织的选择性压力进行第4轮测序分析)、图3B(在中和抗体存在下，对静脉内递送到心肌组织的选择性压力进行第2轮测序分析)和图3C(提供对静脉内递送到骨骼肌组织的选择性压力进行第3轮测序分析。
下表1中列出了鉴别为赋予心肌和/或骨骼肌细胞增加的感染性的若干个代表性克隆(每个克隆含有鉴别的一个或多个取代和/或肽插入，并且在其它方面与SEQ ID NO:2一致；列出了针对每个克隆的选择轮次、序列编号和频率(在括号中))：
表1.对赋予心肌和/或骨骼肌细胞的增加的感染性的AAV VP1衣壳蛋白的氨基酸序列修饰。第2列中列出的取代是基于野生型AAV2的氨基酸序列，即不存在插入的肽。第5列中的“心肌+NAb”表明氨基酸序列修饰应赋予除心肌细胞的增加的感染性之外的抗AAV抗体对中和的增加的抗性。
Figure BDA0002478843290001051
Figure BDA0002478843290001061
Figure BDA0002478843290001071
Figure BDA0002478843290001081
Figure BDA0002478843290001091
Figure BDA0002478843290001101
也被鉴别为衣壳赋予对心肌细胞增加的感染性和抗AAV抗体对中和增加的抗性的为以下嵌合体：
具有(i)AAV6的氨基酸1-129和(ii)AAV5的氨基酸130-725并且相对于AAV5具有以下氨基酸取代的嵌合体：V229I+A490T+A581T(SEQ ID NO:62 的序列)。
具有(i)AAV2的氨基酸1-61、(ii)AAV6的氨基酸62-129和(iii)AAV5 的氨基酸130-725并且相对于AAV5具有以下氨基酸取代的嵌合体： V229I+A490T+A581T(SEQ ID NO:63的序列)。
具有(i)AAV6的氨基酸1-129和(ii)AAV5的氨基酸130-725并且相对于AAV5具有以下氨基酸取代的嵌合体：V229I+A490T+A581T+Y585S
具有(i)AAV6的氨基酸1-129和(ii)AAV5的氨基酸130-725并且相对于AAV5具有以下氨基酸取代的嵌合体：V229I+A447F+A490T+A581T
本文所公开的AAV变异体病毒粒子可以并入合理的合理设计参数、特征、修饰、优点和变化，其是所属领域的普通技术人员在工程改造AAV病毒载体领域中显而易见的。
实例2
使用自人类胚胎干细胞(ESC)产生的心肌细胞，体外评估用于心肌细胞的包括新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I(SEQ ID NO:43)、 LANKTTNKDA+V708I(SEQ ID NO:48)和LATNKIGVTA+V708I(SEQ ID NO:46)的重组AAV病毒粒子的细胞向性。
使用标准方法制造包括AAV1衣壳、AAV2衣壳、AAV9衣壳、新颖变异衣壳LANKIQRTDA+V708I、新颖变异衣壳LANKTTNKDA+V708I或新颖变异衣壳LATNKIGVTA+V708I；和包括可操作地连接于CAG启动子的绿色荧光蛋白 (EGFP)转基因的基因组的重组AAV病毒粒子(分别地，AAV1.CAG.EGFP、 AAV2.CAG.EGFP、AAV9.CAG.EGFP、LANKIQRTDA+V708I.CAG.EGFP、LANKTTNKDA+V708I.CAG.EGFP和LATNKIGVTA+V708I.CAG.GFP)。通过使用小分子调节Wnt信号传导，从人类胚胎干细胞系ESI-017产生心肌细胞。在心肌中胚层诱导14天后，通过葡萄糖剥夺进一步使培养物富含心肌细胞。在分化大约24天后，大多数细胞表达了心肌细胞标记物、心肌肌钙蛋白T(cTnT) 和心室特异性标记物MLC-2V。评估所产生的心肌细胞对间隙接合蛋白连接蛋白43、膜电位波动、钙处理和收缩功能的表达以确保所产生的心肌细胞在载体表征之前达到成熟状态。
相对于AAV1、AAV2和AAV9，在感染后六天如通过免疫荧光(图6A)、流式细胞测量术(图6B)和蛋白质印迹分析(图6C-D)确定 LANKIQRTDA+V708I、LANKTTNKDA+V708I和LATNKIGVTA+V708I变异体提供了显著提高人类心肌细胞培养物中的转导效率和转基因表达。此外，相对于AAV1、AAV2和AAV9，如通过免疫荧光(图6E)确定， LANKIQRTDA+V708I、LANKTTNKDA+V708I和LATNKIGVTA+V708I提供了更快的人类心肌细胞培养物中基因表达的开始时间。相对于展现心肌和骨骼肌细胞向性的AAV8和AAV9，对于LANKIQRTDA+V708I和LANKTTNKDA+V708I来说，每个给药病毒基因组的感染单位的数量高出多个数量级。(图10A)本研究说明包括NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD (SEQ ID NO:14)和TNKIGVT(SEQ IDNO:15)的AAV衣壳变异体将基因递送到心肌细胞的优良能力。
实例3
使用自人类胚胎干细胞(ESC)产生的心肌细胞在体外评估包括心肌细胞的新颖AAV变异AAV6/AAV5嵌合体的重组AAV病毒粒子的细胞向性。
使用标准方法制造包括AAV1衣壳、AAV8衣壳、AAV9衣壳或新颖变异衣壳AAV6/AAV5嵌合体(具有SEQ ID NO:62)和包括可操作地连接于CAG启动子的绿色荧光蛋白(EGFP)转基因的基因组的重组AAV病毒粒子(分别地， AAV1.CAG.EGFP、AAV8.CAG.EGFP、AAV9.CAG.EGFP、AAV6/AAV5嵌合体.CAG.EGFP)。通过使用小分子调节Wnt信号传导，从人类胚胎干细胞系ESI- 017产生心肌细胞。在心肌中胚层诱导14天后，通过葡萄糖剥夺进一步使培养物富含心肌细胞。在分化大约24天后，大多数细胞表达了心肌细胞标记物、心肌肌钙蛋白T(cTnT)和心室特异性标记物MLC-2V。评估所产生的心肌细胞对间隙接合蛋白连接蛋白43、膜电位波动、钙处理和收缩功能的表达以确保所产生的心肌细胞在载体表征之前达到成熟状态。
相对于AAV1、AAV8和AAV9，在感染后六天如通过免疫荧光(图7A)、流式细胞测量术(图7B)和蛋白质印迹分析(图7C-D)确定AAV6/AAV5嵌合体提供了显著提高人类心肌细胞培养物中的转导效率和转基因表达。此外，相对于AAV8，如通过免疫荧光(图7E)确定，AAV6/AAV5嵌合体提供了更快的人类心肌细胞培养物中基因表达的开始时间。相对于AAV8和AAV9，对于 AAV6/AAV5嵌合体来说，每个给药病毒基因组的感染单位的数量高出多个数量级。(图10A)本研究说明包括SEQ ID NO:62的AAV衣壳变异体将基因递送到心肌细胞的优良能力。
实例4
使用自原代人类成肌细胞产生的骨骼肌纤维在体外评估包括骨骼肌纤维的新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I、LANKTTNKDA+V708I和 AAV6/AAV5嵌合体的重组AAV病毒粒子的细胞向性。
使用标准方法制造包括AAV8衣壳、AAV9衣壳、新颖变异衣壳 LANKIQRTDA+V708I、新颖变异衣壳LANKTTNKDA+V708I或新颖变异衣壳 AAV6/AAV5嵌合体，和包括可操作地连接于CAG启动子的绿色荧光蛋白 (EGFP)转基因的基因组的重组AAV病毒粒子(分别地，AAV8.CAG.EGFP、 AAV9.CAG.EGFP、LANKIQRTDA+V708I.CAG.EGFP、 LANKTTNKDA+V708I.CAG.EGFP和AAV6/AAV5嵌合体.CAG.GFP)。骨骼肌纤维是从健康的51岁男性(CookMyosites)获得的原代人类骨骼成肌细胞产生的。将成肌细胞分化30天以形成成熟的多核骨骼肌纤维。评估所产生的骨骼肌纤维的肌球蛋白重链(MHC)和肌缩蛋白的表达以确保大部分所产生的骨骼肌纤维在载体表征之前达到成熟状态。
相对于AAV8和AAV9，在感染后七天如通过免疫荧光(图8A)和流式细胞测量术(图8B)确定LANKIQRTDA+V708I、LANKTTNKDA+V708I和 AAV6/AAV5嵌合体提供了显著提高人类骨骼肌纤维培养物中的转导效率和转基因表达。此外，相对于AAV8和AAV9，如通过免疫荧光(图8C)确定， LANKIQRTDA+V708I和LANKTTNKDA+V708I提供了更快的人类骨骼肌纤维培养物中基因表达的开始时间。相对于AAV8和AAV9，对于 LANKIQRTDA+V708I、LANKTTNKDA+V708I和AAV6/5嵌合体来说，每个给药病毒基因组的感染单位的数量高出好几倍(图10B)。本研究说明包括 NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)和SEQ ID NO:62的变异体将基因递送到骨骼肌纤维的优良能力。
实例5
使用自源自成纤维细胞的人类诱导多能干细胞(FB-iPSC)或人类胚胎干细胞(ESC)产生的骨骼肌祖细胞在体外评估包括骨骼肌祖细胞的新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I、LANKTTNKDA+V708I和AAV6/AAV5嵌合体的重组AAV病毒粒子的细胞向性。
使用标准方法制造包括AAV9衣壳、新颖变异衣壳LANKIQRTDA+V708I、新颖变异衣壳LANKTTNKDA+V708I或新颖变异衣壳AAV6/AAV5嵌合体和包括可操作地连接于CAG启动子的绿色荧光蛋白(EGFP)转基因的基因组的重组AAV病毒粒子(分别地，AAV8.CAG.EGFP、AAV9.CAG.EGFP、 LANKIQRTDA+V708I.CAG.EGFP、LANKTTNKDA+V708I.CAG.EGFP和 AAV6/AAV5嵌合体.CAG.GFP)。骨骼肌祖细胞是由人类胚胎干细胞系ESI-017 (ESI-BIO)遵循描述于Shelton等人，《方法(Methods)》2016年作了小幅修改的分化策略产生。在分化大约40天后，在使用培养物进行载体表征之前，通过大多数细胞中PAX7和MyoD的表达证实了对骨骼肌祖细胞的谱系限制。
相对于AAV9，在感染后六天如通过免疫荧光(图9A)和流式细胞测量术 (图9B)确定LANKIQRTDA+V708I、LANKTTNKDA+V708I和AAV6/AAV5 嵌合体提供了显著提高人类骨骼肌祖细胞培养物中的转导效率和转基因表达。本研究说明包括NKIQRTD(SEQ ID NO:13)、NKTTNKD(SEQ ID NO:14)和 SEQ ID NO:62的AAV衣壳变异体将基因递送到骨骼肌祖细胞的优良能力。
实例6
采用定向进化通过在静脉内(IV)给药后将优良的基因递送到心肌和骨骼肌细胞来发现新颖腺相关病毒(AAV)变异体，给药途径显著优于将基因递送到人心脏和骨骼肌的其它方法(实例1)。在肌内给药包括新颖AAV变异体的重组AAV病毒粒子后评估小鼠体内的细胞向性作为包括含NKIQRTD(SEQ ID NO:13)的AAV衣壳变异体的rAAV病毒粒子将转导到肌细胞的能力的代表性实例，所述新颖AAV变异体包括V708I取代和插入在氨基酸587与588(LANKIQRTDA+V708I；SEQ ID NO:43)之间的肽LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)。
使用标准方法制造包括新颖变异衣壳LANKIQRTDA+V708I和包括可操作地连接于CAG启动子的荧光素酶转基因的基因组的重组AAV病毒粒子 (LANKIQRTDA+V708I.CAG.荧光素酶)。B6 Albino(C57BL/6)经由尾静脉静脉内注射来注射2×1012vg，并且转导是通过生命荧光素酶成像和通过死后组织荧光素酶活性评估的。在给药后第14天(左)和第28天(右)的荧光素酶的生命成像表明，新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I衣壳可在体内转导小鼠细胞(图11A)。在给药后56天，心脏，隔膜和四头肌中的荧光素酶活性表明，新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I衣壳可在体内转导小鼠心肌和骨骼肌(图11B)。
本研究说明了通过数种临床上可接受的给药途径中的一种，通过包括 NKIQRTD(SEQ ID NO:13)的变异体进行基因递送。用包括此肽插入基序的其它变异体可实现类似的功效。同样地，使用本文所公开的使用相同的定向进化方法鉴别的其它变异体可以实现类似的功效。
实例7
采用定向进化通过在静脉内(IV)给药后将优良的基因递送到心肌和骨骼肌细胞来发现新颖腺相关病毒(AAV)变异体，给药途径显著优于将基因递送到人心脏和骨骼肌的其它方法(实例1)。在肌内给药包括新颖AAV变异体的重组AAV病毒粒子后评估非人类灵长类动物(NHP)体内的细胞向性作为包括含NKIQRTD(SEQ ID NO:13)的AAV衣壳变异体的rAAV变异体将转导到肌细胞的能力的代表性实例，所述新颖AAV变异体包括V708I取代和插入在氨基酸587与588(LANKIQRTDA+V708I；SEQ ID NO:43)之间的肽 LANKIQRTDA(SEQ ID NO:27)。
使用标准方法制造包括新颖变异衣壳LANKIQRTDA+V708I和包括可操作地连接于CAG启动子的绿色荧光蛋白(GFP)转基因的基因组的重组AAV病毒粒子(LANKIQRTDA+V708I.CAG.GFP)。通过肌内注射将载体的三个剂量 (1x1011 vg)注射到食蟹猕猴的股外侧肌部位，并通过免疫荧光成像评估死后骨骼肌细胞的转导。苏木精和曙红(H&E)以及抗GFP抗体染色的近端活检部位横切面在2倍、4倍和20倍放大倍数下的代表性图像表明，新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I衣壳可以在体内转导灵长类骨骼肌(图12A)。苏木精和曙红(H&E)以及抗GFP抗体染色的远端活检部位的纵切面在2倍、4倍和20 倍放大倍数下的代表性图像表明，新颖AAV变异体LANKIQRTDA+V708I衣壳可以在体内转导灵长类骨骼肌细胞(图12B)。
本研究说明了通过数种临床上可接受的给药途径中的一种，通过包括 NKIQRTD(SEQ ID NO:13)的变异体进行基因递送。用包括此肽插入基序的其它变异体可实现类似的功效。同样地，使用本文所公开的使用相同的定向进化方法鉴别的其它变异体可以实现类似的功效。
前述内容仅说明了本发明的原理。将了解，所属领域的普通技术人员将能够设计各种布置，尽管本文中未明确地描述或展示所述布置，但其体现本发明的原理并包括于其精神和范围内。此外，本文所列举的所有实施例和条件性语言主要旨在辅助读者理解本发明的原理，和由发明人所提供的概念以深化所属领域的发展，并应将其视为并不限制此类特定所列举的实施例和条件。
此外，引用本发明的原理、方面、和实施例的所有本文的陈述连同其具体实例旨在涵盖其结构和功能同等物两者。另外，预期此类同等物包含当前已知的同等物和未来开发的同等物两者，即不论结构而执行发展相同功能的任何要素。因此，本发明的范围并不旨在受限于本文所展示和描述的示例性实施例。相反，由所附权利要求书体现本发明的范围和精神。

Claims (39)

1.一种选自以下组成的组的变异腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白：
(i)AAV衣壳蛋白，其相对于相应的亲代AAV衣壳蛋白包括肽插入，其中所述肽插入包括氨基酸序列NKIQRTD(SEQ ID NO:13)或NKTTNKD(SEQ ID NO:14)，其中插入位点位于AAV2的VP1的氨基酸570与611之间的位置处的两个相邻氨基酸之间或另一种AAV血清型的所述衣壳蛋白中的相应位置，和
(ii)AAV衣壳蛋白，其包括(a)与SEQ ID NO:62中所示的氨基酸序列的整个长度有至少85％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性或100％一致性的氨基酸序列，和(b)相对于AAV5衣壳(SEQ ID NO:6)的以下氨基酸取代：V229I+A490T+A581T，
其中与包括野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子对肌细胞的感染性相比，所述变异AAV衣壳蛋白赋予感染性重组AAV(rAAV)病毒粒子对所述肌细胞增加的感染性。
2.一种变异AAV衣壳蛋白，其相对于亲代AAV衣壳蛋白包括肽插入，所述肽插入对应于AAV2的VP1的氨基酸570与611之间的位置处的两个相邻氨基酸，其中所述插入包括氨基酸序列Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3，并且其中Y1-Y3中的每一个，如果存在，独立地选自Ala、Leu、Gly、Ser、Thr、Pro；X1选自Ala、Asn、Thr、Gly、Ser、Ala、Gln和Asp；X2选自Lys、Asn、Thr、Ser、Ala和Gln；X3选自Ile、Thr、Lys、Leu、Val、Asn、Asp和Arg；X4选自Gln、Thr、Ile、Lys、Val、Ser和Tyr；X5选自Arg、Asn、Gly、Lys、Leu、Thr、Ala、Ser和Gln；X6选自Thr、Lys、Val、Gly、Ser、Ala、Arg和Pro；并且X7选自Asp、Thr、Asn、Ile、Ala和Ser。
3.根据权利要求2所述的变异AAV衣壳蛋白，其中X1选自Thr和Asn；X2选自Asn和Lys；X3选自Lys、Ile和Thr；X4选自Ile、Gln和Thr；X5选自Gly、Arg和Asn；X6选自Val、Thr和Lys；并且X7选自Thr和Asp。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括肽插入，其中所述插入位点位于对应于AAV2的VP1的氨基酸587与588的氨基酸之间或另一种AAV血清型的所述衣壳蛋白中的相应位置。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包括肽插入，并且其中所述肽插入包括氨基酸序列NKIQRTD(SEQ ID NO:13)或LANKIQRTDA(SEQ IDNO:26)。
6.根据权利要求5所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白相对于AAV2(SEQ IDNO:2)的VP1或另一种AAV血清型的所述衣壳蛋白中的相应位置包括V708I氨基酸取代。
7.根据权利要求6所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白相对于AAV2(SEQ IDNO:2)的VP1或另一种AAV血清型的所述衣壳蛋白中的一个或多个相应位置进一步包括S109T氨基酸取代、R588M氨基酸取代和A593氨基酸取代中的一种或多种。
8.根据权利要求6所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白相对于AAV2(SEQ IDNO:2)的VP1或另一种AAV血清型的所述衣壳蛋白中的一个或多个相应位置进一步包括A35P氨基酸取代。
9.根据权利要求6所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包括与SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列的整个长度有至少85％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性或100％一致性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1到4中任一项所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包括肽插入，并且其中所述肽插入包括氨基酸序列NKTTNKD(SEQ ID NO:14)或LANKTTNKDA(SEQID NO:27)。
11.根据权利要求10所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白相对于AAV2(SEQID NO:2)的VP1或另一种AAV血清型的所述衣壳蛋白中的相应位置包括V708I氨基酸取代。
12.根据权利要求11所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白相对于AAV2(SEQID NO:2)的VP1或另一种AAV血清型的所述衣壳蛋白中的一个或多个相应位置进一步包括S109T氨基酸取代、W606C氨基酸取代和W694C氨基酸取代中的一种或多种。
13.根据权利要求11所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白相对于AAV2(SEQID NO:2)的VP1或另一种AAV血清型的所述衣壳蛋白中的一个或多个相应位置进一步包括I698V氨基酸取代。
14.根据权利要求11所述的变异AAV衣壳蛋白，其中所述AAV衣壳蛋白包括与示为SEQID NO:48的氨基酸序列的整个长度有至少85％一致性、至少90％一致性、至少95％一致性或100％一致性的氨基酸序列。
15.根据权利要求1到14中任一项所述的变异AAV衣壳，其中与包括野生型AAV衣壳蛋白的AAV病毒粒子对所述肌细胞的感染性相比，所述衣壳蛋白赋予感染性rAAV病毒粒子增加至少2倍或至少5倍的肌细胞的感染性。
16.根据权利要求1到15中任一项所述的变异AAV衣壳蛋白，其中与包括相应的所述亲代AAV衣壳蛋白的AAV相比，所述衣壳蛋白通过中和抗体进一步赋予感染性rAAV病毒粒子对中和增加的抗性，优选地增加至少2倍或至少5倍的抗性。
17.一种分离核酸，其包括编码根据权利要求1到16中任一项所述的变异AAV衣壳蛋白的核苷酸序列。
18.一种感染性重组AAV(rAAV)病毒粒子，其包括根据权利要求1到16中任一项所述的变异AAV衣壳蛋白。
19.根据权利要求18所述的rAAV病毒粒子，其进一步包括异源核酸，优选包括编码基因产物的核苷酸序列的异源核酸。
20.一种将基因产物递送到个体的肌细胞的方法，其包括向所述个体给予根据权利要求19所述的rAAV病毒粒子，优选地其中所述rAAV病毒粒子经静脉内给予或通过肌肉内注射给予。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述肌细胞为心肌和/或骨骼肌细胞。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述基因产物为蛋白质、小干扰RNA、反义RNA、微RNA、短发夹RNA或小干扰RNA。
23.根据权利要求20所述的方法，其中所述基因产物是选自α半乳糖苷酶A(GLA)、共济蛋白(frataxin)(FXN)、肌缩蛋白(DMD)或其功能片段、酸性α葡糖苷酶(GAA)和肌肉糖原磷酸化酶(PYGM)，优选其中所述蛋白质包括SEQ ID NO:64和66-69中的任一个中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:64和66-69中的任一个中所示的氨基酸序列有至少80％一致性的氨基酸序列或由其组成。
24.根据权利要求20所述的方法，其中所述个体患有选自以下的疾病：法布里病(Fabrydisease)、弗里德希氏共济失调(Friedreich’s ataxia)、杜兴氏肌营养不良(Duchennemuscular dystrophy)、贝克肌营养不良(Becker muscular dystrophy)、庞贝病(Pompedisease)、肌磷酸化酶缺乏症(myophosphorylase deficiency)、面肩肱型肌营养不良(facioscapulohumeralmuscular dystrophy)、肢带型肌营养不良(limb girdle musculardystrophy)和肌强直性营养不良(myotonic dystrophy)。
25.一种药物组合物，其包括根据权利要求19所述的rAAV病毒粒子和药学上可接受的赋形剂。
26.根据权利要求15所述的变异AAV衣壳，其中与包括野生型AAV9衣壳蛋白的AAV病毒粒子对所述心肌细胞或骨骼肌细胞的感染性相比，所述变异或嵌合衣壳蛋白赋予感染性重组AAV(rAAV)病毒粒子对心肌细胞的感染性增加至少50倍和/或对骨骼肌细胞的感染性增加至少2倍。
27.一种感染性重组AAV(rAAV)病毒粒子，其包括具有与SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列的整个长度有至少95％，优选地至少99％一致性的氨基酸序列的变异AAV衣壳蛋白，并且进一步包括可操作地连接于CAG启动子的编码α半乳糖苷酶A(GLA)的核苷酸序列。
28.根据权利要求27所述的感染性rAAV，其包括变异AAV衣壳蛋白，所述变异AAV衣壳蛋白包括SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。
29.一种将编码GLA的核苷酸序列递送到哺乳动物的方法，其包括将根据权利要求27或28所述的rAAV以引起GLA在所述哺乳动物中提供治疗作用的水平表达的条件下给予所述哺乳动物。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述rAAV经静脉内给予所述哺乳动物和/或通过肌肉内注射给予。
31.根据权利要求29或30所述的方法，其中所述哺乳动物为患有法布里病的人类。
32.根据权利要求27到31中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列编码GLA多肽，所述GLA多肽包括示为SEQ ID NO:67的氨基酸序列或与其有至少80％一致性的序列或由其组成。
33.一种感染性重组AAV(rAAV)病毒粒子，其包括具有与SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列的整个长度有至少95％一致性的氨基酸序列的变异AAV衣壳蛋白，并且进一步包括可操作地连接于CAG启动子的编码肌肉肝糖磷酸化酶(PYGM)的核苷酸序列。
34.根据权利要求33所述的感染性rAAV，其包括变异AAV衣壳蛋白，所述变异AAV衣壳蛋白包括SEQ ID NO:43中所示的氨基酸序列。
35.一种将编码PYGM的核苷酸序列递送到哺乳动物的方法，其包括将根据权利要求33或34所述的rAAV以引起PYGM在所述哺乳动物中提供治疗作用的水平表达的条件下给予所述哺乳动物。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述rAAV经静脉内给予所述哺乳动物和/或通过肌肉内注射给予。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述哺乳动物为患有肌磷酸化酶缺乏症(麦卡德尔病(McArdledisease))的人类。
38.根据权利要求33到37中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列编码PYGM多肽，所述PYGM多肽包括示为SEQ ID NO:66的氨基酸序列或与其有至少80％一致性的序列或由其组成。
39.一种药物组合物，其包括根据权利要求27、28、33和34中任一项所述的rAAV病毒粒子和药学上可接受的赋形剂。
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