CN116096734A - Aav衣壳的向性的重定向 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于制备、使用和/或配制腺相关病毒衣壳蛋白的组合物、方法和工艺，其中所述衣壳蛋白包含靶向肽插入物以获得针对靶组织的增强的向性。

Description

AAV衣壳的向性的重定向
相关申请
本申请要求2020年5月13日提交的美国临时申请63/023,927和2020年12月7日提交的美国临时申请63/122,300的优先权，所述申请的全部内容由此以引用的方式并入。
序列表的引用
本申请与呈电子格式的序列表一起提交。所述序列表是以2021年3月31日创建的标题为2057_1119PCT_SL的文件形式提供，所述文件的大小为7,087,883字节。所述电子格式的序列表中的信息以全文引用的方式并入本文中。
发明领域
本公开涉及用于制备、使用和/或配制腺相关病毒衣壳蛋白的组合物、方法和工艺，其中所述衣壳蛋白包含例如靶向肽插入物的肽以获得针对靶细胞或组织的增强的向性。
背景技术
向成人中枢神经系统(CNS)的基因递送仍为基因疗法中的重大难题。具有改进的脑向性的经工程改造的腺相关病毒(AAV)衣壳代表对CNS递送的限制的有吸引力的解决方案。
AAV衍生的载体由于其非病原性性质、其低免疫原性概况、宿主基因组中的低整合速率和非分裂细胞中的长期转基因表达而为用于临床基因转移的有前景工具。然而，某些器官中AAV天然变体的转导效率对于临床应用来说过低，并且通过预先存在的中和抗体进行的衣壳中和可能会阻碍大比例患者的治疗。出于这些原因，已付出相当大的努力来获得具有增强特性的新颖衣壳变体。在迄今所测试的许多方法中，使用衣壳变体的体外或体内选择进行的AAV衣壳的定向演化已产生重大进展，所述衣壳变体是通过使用易错PCR进行的衣壳序列随机化、各种亲本血清型的改组或所界定位置处完全随机化短肽的插入而产生。
在全身施用时提供具有例如改进的针对靶细胞或组织的向性的改进的特性的AAV衣壳的尝试已取得有限成功。因此，需要产生AAV衣壳的改进方法，并且所得AAV衣壳用于将所关注的有效载荷递送至例如CNS细胞或组织或肌肉细胞或组织的靶细胞或组织。
发明内容
本公开至少部分涉及用于产生并且使用包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒的组合物和方法。在一些实施方案中，对于例如CNS组织、CNS细胞、肌肉组织或肌肉细胞的组织或细胞，AAV衣壳变体具有增强的向性。所述向性可适用于将例如本文所述的有效载荷的有效载荷递送至细胞或组织、适用于治疗例如神经或神经系统变性病症、肌肉或神经肌肉病症或神经肿瘤病症的病症。
因此，一方面，本公开提供例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽，所述AAV衣壳多肽包含：SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列来说包含不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或来自SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述氨基酸序列存在于环VIII中。在一些实施方案中，所述氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586、588或589之后存在。在一些实施方案中，所述AAV衣壳变体包含SEQID NO:3636-3647中的任一者的氨基酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。
另一方面，本公开提供例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽，所述AAV衣壳多肽包含：具有插入物的亲本氨基酸序列，其中所述插入物包含SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列来说包含不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或来自SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述亲本序列包含有包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列；和/或SEQ IDNO:138的氨基酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述插入物存在于所述亲本氨基酸序列的环VIII中，例如插入其中。在一些实施方案中，所述插入物紧随所述亲本序列的位置586、588或589之后存在，例如插入。在一些实施方案中，所述AAV衣壳变体还包含所述亲本氨基酸序列的位置587处的缺失和/或位置588处的缺失。
另一方面，本公开提供肽(例如靶向肽)，所述肽包含：至少SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列来说包含不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或来自SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列的3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述肽由以下编码：SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核酸序列；或包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码所述肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核酸序列或包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
另一方面，本公开提供编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸，其中所述AAV衣壳变体包含SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列；相对于SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列来说包含不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或来自SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:3623-3635中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列。
另一方面，本公开提供包含例如AAV衣壳变体的本文所述的AAV衣壳多肽的AAV颗粒。在一些实施方案中，所述AAV颗粒包含编码有效载荷的核酸序列。在一些实施方案中，所述AAV颗粒还包含有包含有效地连接至编码有效载荷的核酸的启动子的病毒基因组。
另一方面，本公开提供制造包含例如AAV衣壳变体的本文所述的AAV衣壳多肽的AAV颗粒的方法。所述方法包括提供包含病毒基因组的宿主细胞，并且在适合于将病毒基因组封闭在例如本文所述的AAV衣壳变体的AAV衣壳变体中的条件下孵育宿主细胞，由此制造AAV颗粒。
另一方面，本公开提供一种将有效载荷递送至细胞或组织(例如CNS细胞、CNS组织、肌肉细胞或肌肉组织)的方法。所述方法包括施用有效量的包含本文所述的AAV衣壳变体的AAV颗粒。
另一方面，本公开提供一种治疗患有或经诊断患有例如神经系统变性病症的神经病症的受试者的方法。所述方法包括施用有效量的包含本文所述的AAV衣壳变体的AAV颗粒。
另一方面，本公开提供一种治疗患有或经诊断患有肌肉病症或神经肌肉病症的受试者的方法。所述方法包括施用有效量的包含本文所述的AAV衣壳变体的AAV颗粒。
另一方面，本公开提供一种治疗患有或经诊断患有神经肿瘤病症的受试者的方法。所述方法包括施用有效量的包含本文所述的AAV衣壳变体的AAV颗粒。
本公开提供包含选自SEQ ID NO:1-1724中的任一者的亲本氨基酸序列的AAV衣壳蛋白，所述AAV衣壳蛋白中可插入有至少一种选自SEQ ID NO:1725-3622中的任何成员的肽。
在某些实施方案中，插入的肽选自SEQ ID NO:1725-3622并且插入亲本氨基酸序列中。
在某些实施方案中，所述肽插入氨基酸586-592，包括亲本氨基酸序列的氨基酸586-592之间的任何氨基酸位置处。在此类实施方案中，所述肽可插入亲本氨基酸序列的氨基酸588-589之间。
在一些实施方案中，亲本氨基酸序列可以是SEQ ID NO:138或SEQ ID NO:11。
本公开还提供包含选自由SEQ ID NO:1725-3622组成的组的氨基酸序列的肽。
在其他方面，本公开提供包含本文所公开的AAV衣壳蛋白和病毒基因组的AAV颗粒。在这些方面，病毒基因组可包含编码有效载荷的核酸序列。在一些实施方案中，有效载荷可以是RNAi剂，所述RNAi剂可由dsRNA、siRNA、shRNA、前体miRNA(pre-miRNA)、初级miRNA(pri-miRNA)、miRNA、miRNA前体、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA组成。
在另外的方面，有效载荷可以是肽、多肽、抗体或抗体片段。
本公开还提供包含AAV颗粒和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，以及一种通过向受试者施用药物组合物来治疗所述受试者的疾病的方法。
本领域技术人员应认识到或能够仅使用常规实验来确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等效物。此类等效物意图由以下所列实施方案涵盖。
所列出的实施方案
1.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含：
(a)SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列；
(b)来自SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；或
(c)相对于SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列来说包含不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
2.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含：
(a)SEQ ID NO:3648-3659中的任一者的氨基酸序列；
(b)来自SEQ ID NO:3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；或
(c)相对于SEQ ID NO:3648-3659中的任一者的氨基酸序列来说包含不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
3.如实施方案1或2的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含来自SEQ ID NO:3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。
4.如实施方案1-3中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述3个连续氨基酸包含PLN。
5.如实施方案1-4中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述4个连续氨基酸包含PLNG(SEQ ID NO:3678)。
6.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述5个连续氨基酸包含PLNGA(SEQ ID NO:3679)。
7.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述6个连续氨基酸包含PLNGAV(SEQ ID NO:3680)。
8.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述7个连续氨基酸包含PLNGAVH(SEQ ID NO:3681)。
9.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述8个连续氨基酸包含PLNGAVHL(SEQ ID NO:3682)。
10.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述9个连续氨基酸包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)。
11.如实施方案1-3中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述3个连续氨基酸包含YST。
12.如实施方案1-3或11中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述4个连续氨基酸包含YSTD(SEQ ID NO:3690)。
13.如实施方案1-3或11-12中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述5个连续氨基酸包含YSTDE(SEQ ID NO:3691)或YSTDV(SEQ ID NO:3700)。
14.如实施方案1-3或11-13中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述6个连续氨基酸包含YSTDER(SEQ ID NO:3692)或YSTDVR(SEQ ID NO:3701)。
15.如实施方案1-3中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述3个连续氨基酸包含IVM。
16.如实施方案1-3或15中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述4个连续氨基酸包含IVMN(SEQ ID NO:3693)。
17.如实施方案1-3或15-16中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述5个连续氨基酸包含IVMNS(SEQ ID NO:3694)。
18.如实施方案1-3或15-17中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述6个连续氨基酸包含IVMNSL(SEQ ID NO:3695)。
19.如实施方案1-3或15-18中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述7个连续氨基酸包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)。
20.如实施方案1-19中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含相对于SEQ ID NO:3648-3659中的任一者的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
21.如实施方案1-10或20中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列或相对于PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列，任选地，其中位置7为H。
22.如实施方案1-3或20中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)的氨基酸序列或相对于RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
23.如实施方案1-3或15-20中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列或相对于IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
24.如实施方案1-3、11-14或20中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)的氨基酸序列或相对于YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
25.如实施方案1-3或20中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含RESPRGL(SEQ ID NO:3652)的氨基酸序列或相对于RESPRGL(SEQ ID NO:3652)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的序列。
26.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3648-3659中的任一者的氨基酸序列。
27.如实施方案1-26中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含：
(i)由SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列编码的氨基酸序列；或
(ii)由包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
28.如实施方案1-27中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中编码所述AAV衣壳变体的核苷酸序列包含：
(i)SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
29.如实施方案1-10、20-21或26-28中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含由以下编码的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:3660的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3660的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
30.如实施方案1-10、20-21或26-29中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中编码所述AAV衣壳变体的核苷酸序列包含：
(i)SEQ ID NO:3660的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3660的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
31.如实施方案1-3、20、22或26-28中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含由以下编码的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:3661的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3661的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
32.如实施方案1-3、20、22、26-28或31中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中编码所述AAV衣壳变体的核苷酸序列包含：
(i)SEQ ID NO:3661的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3661的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
33.如实施方案1-3、11-14、20、24或26-28中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含由以下编码的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:3662的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3662的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
34.如实施方案1-3、11-14、20、24、26-28或33中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中编码所述AAV衣壳变体的核苷酸序列包含：
(i)SEQ ID NO:3662的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3662的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
35.如实施方案1-3、15-20、23或26-28中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含由以下编码的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:3663的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3663的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
36.如实施方案1-3、15-20、23、26-28或35中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中编码所述AAV衣壳变体的核苷酸序列包含：
(i)SEQ ID NO:3663的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3663的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
37.如实施方案1-3、20或25-28中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含由以下编码的氨基酸序列：
(i)SEQ ID NO:3664的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3664的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
38.如实施方案1-3、20、25-28或37中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中编码所述AAV衣壳变体的核苷酸包含：
(i)SEQ ID NO:3664的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3664的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
39.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述氨基酸序列存在于环VIII中。
40.如实施方案1-10、20-21、26-30或39中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在。
41.如实施方案1-3、15-20、23、26-28、35-36或39中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置588之后存在。
42.如实施方案1-3、11-14、20、22、24-28、31-34、37-38或39中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置589之后存在。
43.如实施方案1-42中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:138编号的位置587处除“A”以外的氨基酸残基和/或位置588处除“Q”以外的氨基酸残基。
44.如实施方案1-10、20-21、26-30、39-40或43中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列，其中PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在。
45.如实施方案1-3、20、26-28、39-40或43中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列，其中GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在。
46.如实施方案1-3、15-20、23、26-28、35-36、39或41中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列，其中IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置588之后存在。
47.如实施方案1-3、11-14、20、22、24-28、31-34、37-38、39或42中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3649、3650、3652、3653或3655-3659中的任一者的氨基酸序列，其中前述序列中的任一者的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置589之后存在。
48.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽还包含根据SEQ ID NO:138编号的K449R氨基酸取代。
49.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽还包含环I、II、IV和/或VI中的修饰，例如插入、取代和/或缺失。
50.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列。
51.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。
52.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列。
53.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含由SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列编码的氨基酸序列。
54.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中编码所述衣壳变体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列。
55.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白或其组合。
56.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含对应于SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的位置138-743的氨基酸序列，例如VP2，或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列。
57.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含对应于SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的位置203-743的氨基酸序列，例如VP3，或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列。
58.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的氨基酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。
59.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含具有SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列。
60.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含由SEQ ID NO:3623-3635中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
61.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中编码所述衣壳变体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3623-3635中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列。
62.如实施方案1-10、20-21、26-30、39-40、43-44或48-61中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中编码所述衣壳变体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3623的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列。
63.如实施方案1-3、15-20、23、26-28、35-36、39、41、46或48-61中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中编码所述衣壳变体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3627的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列。
64.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中编码所述衣壳变体的核苷酸序列经密码子优化。
65.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含如实施方案1-10、20-21、26-30、39-40、43-44、48-62或64中任一项的氨基酸序列并且还包含与SEQ ID NO:3636至少95％同一的氨基酸序列。
66.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3636的氨基酸序列。
67.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含如实施方案1-3、20、22、26-28、31-32、39、42、47-61或64中任一项的氨基酸序列并且还包含与SEQ ID NO:3637至少95％同一的氨基酸序列。
68.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3637的氨基酸序列。
69.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含如实施方案1-3、11-12、20、24、26-28、33-34、39、42、47-61或64中任一项的氨基酸序列并且还包含与SEQ IDNO:3638至少95％同一的氨基酸序列。
70.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3638的氨基酸序列。
71.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含如实施方案1-3、15-20、23、26-28、35-36、39、41、46、48-61或63-64中任一项的氨基酸序列并且还包含与SEQID NO:3639至少95％同一的氨基酸序列。
72.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3639的氨基酸序列。
73.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含如实施方案1-3、20、25-28、37-39、42、47-61或64中任一项的氨基酸序列并且还包含与SEQ ID NO:3640至少95％同一的氨基酸序列。
74.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3640的氨基酸序列。
75.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3641的氨基酸序列。
76.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3642的氨基酸序列。
77.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3643的氨基酸序列。
78.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3644的氨基酸序列。
79.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3645的氨基酸序列。
80.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3646的氨基酸序列。
81.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3647的氨基酸序列。
82.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含由SEQ ID NO:3623-3635中的任一者的核苷酸序列或与其至少95％同一的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
83.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含具有例如靶向肽的插入物的亲本氨基酸序列，其中所述插入物包含：
(a)SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列；
(b)来自SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；或
(c)相对于SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列来说包含不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
84.如实施方案83的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述亲本序列包含：
(i)SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列；和/或
(ii)包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
85.如实施方案83或84的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述亲本序列还包含位置K449处的取代，例如K449R取代。
86.如实施方案83-85中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述亲本序列包含由SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
87.如实施方案83-86中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中编码亲本序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。
88.如实施方案83-87中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述亲本序列包含：
(i)SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列；和/或
(ii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列；
任选地，其限制条件在于SEQ ID NO:11的位置449不为K，例如为R。
89.如实施方案83-88中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述插入物包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列。
90.如实施方案83-88中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述插入物包含GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列。
91.如实施方案83-88中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述插入物包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列。
92.如实施方案83-88中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述插入物包含选自以下的氨基酸序列：RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)、YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)、RESPRGL(SEQ ID NO:3652)、SFNDTRA(SEQ ID NO:3653)、YGLPKGP(SEQ ID NO:3655)或STGTLRL(SEQ ID NO:3656)。
93.如实施方案83-92中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述插入物存在于所述亲本氨基酸序列的环VIII中。
94.如实施方案83-90或93中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述插入物紧随所述亲本氨基酸序列中的位置586之后存在。
95.如实施方案83-89或93-94中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述插入物包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列并且紧随所述亲本氨基酸序列的位置586之后插入。
96.如实施方案83-88、90或93-94中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述插入物包含GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列并且紧随所述亲本氨基酸序列的位置586之后插入。
97.如实施方案83-90、93-96中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含所述亲本序列的位置587处除“A”以外的氨基酸和/或位置588处除“Q”以外的氨基酸。
98.如实施方案83-90或93-97中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽还包含所述亲本氨基酸序列的位置587处的氨基酸“A”的缺失和/或位置588处的氨基酸“Q”的缺失。
99.如实施方案83-89、93-95或97-98中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含：
(i)紧随所述亲本氨基酸序列的位置586之后插入的包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列的插入物；和
(ii)所述亲本氨基酸序列的位置587和588处的氨基酸“AQ”的缺失。
100.如实施方案83-88、90、93-94或96-98中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含：
(i)紧随所述亲本氨基酸序列的位置586之后插入的包含GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列的插入物；和
(ii)所述亲本氨基酸序列的位置587和588处的氨基酸“AQ”的缺失。
101.如实施方案83-88、91或93中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述插入物紧随所述亲本氨基酸序列中的位置588之后插入。
102.如实施方案83-88、91、93或101中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述插入物包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列并且紧随所述亲本氨基酸序列的位置588之后插入。
103.如实施方案83-88或92-93的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述插入物紧随所述亲本氨基酸序列中的位置589之后插入。
104.如实施方案83-88、92-93或103中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述插入物包含选自以下的氨基酸序列：RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)、YSTDVRM(SEQ IDNO:3650)、RESPRGL(SEQ ID NO:3652)、SFNDTRA(SEQ ID NO:3653)、YGLPKGP(SEQ ID NO:3655)或STGTLRL(SEQ ID NO:3656)，并且紧随所述亲本氨基酸序列的位置589之后插入。
105.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽不包含紧随相对于SEQ ID NO:138编号的位置586、588或589之后存在、具有对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的至少5个连续氨基酸、属于SEQ ID NO:1-1724中的任一者的插入序列，例如表6中所述。
106.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽不包含紧随根据SEQ ID NO:138编号的位置588之后存在的TLAVPFK(SEQ ID NO:1262)的氨基酸序列。
107.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽相对于包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的参考序列的向性来说，具有增加的针对CNS细胞或组织(例如脑细胞、脑组织、脊髓细胞或脊髓组织)的向性。
108.如实施方案1-12、15-44、46-74、82-89、91-95、97-99、101-107中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽转导例如选自齿状核、小脑皮质、大脑皮质、脑干、海马体、丘脑和壳核的脑区，任选地，其中例如当通过例如免疫组织化学分析、qRT-PCR或RT-ddPCR分析(例如如实施例5中所述)的分析进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，转导水平高至少5、10、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000或10,000倍。
109.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，例如当通过如实施例4中所述的分析进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，所述AAV衣壳多肽在脑中富集至少约5、6、7、8、9或10倍。
110.如实施方案1-14、20-22、24-34、39-40、42-44、47-62、64-70、79-80、82-89、92-95、97-99或103-109中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，例如当通过如实施例4中所述的分析进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，所述AAV衣壳多肽在脑中富集至少约20、30、40或50倍。
111.如实施方案1-10、20-22、26-32、39-40、42-44、47-62、64至68、82-89、92-95、97-99或103-110中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，例如当通过如实施例4中所述的分析进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，所述AAV衣壳多肽在脑中富集至少约100、200、300或400倍。
112.如实施方案1-10、20-21、26-30、39-40、43-44、48-62、64-66、82-89、93-95、97-99或105-111中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，例如当通过例如qRT-PCR或RT-ddPCR分析的分析(例如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，所述AAV衣壳多肽向脑区递送增加水平的病毒基因组，任选地，其中所述病毒基因组的水平增加至少5、10、20、30、40或50倍。
113.如实施方案1-12、15-44、46-74、82-89、91-95、97-99、101-112中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，例如当通过例如qRT-PCR或RT-ddPCR分析的分析(例如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，所述AAV衣壳多肽向脑区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中有效载荷的水平增加至少5、10、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000或10,000倍。
114.如实施方案113的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体。
115.如实施方案1-12、15-44、46-74、82-89、91-95、97-99、101-114中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽向脊髓区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如qRT-PCR分析的分析(例如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ IDNO:138的参考序列相比，有效载荷的水平增加至少10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800或900倍。
116.如实施方案115的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中脊髓区包含颈部区域、胸部区域和/或腰部区域。
117.如实施方案1-3、15-20、23、26-28、35-36、39、41、46、48-61、63-64、71-72、83-88、91、93、101-102、105-109或113-116中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽显示相对于在背根神经节(DRG)中转导来说优先在脑区中转导。
118.如实施方案1-10、20-21、26-30、39-40、43-44、48-62、64-66、82-89、93-95、97-99或105-116中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述衣壳变体：
(i)例如当通过如实施例4中所述的分析进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，在脑中富集至少约300或400倍；
(ii)转导例如选自齿状核、小脑皮质、大脑皮质、脑干、海马体、丘脑和壳核的脑区，其中例如当通过例如免疫组织化学分析、qRT-PCR或RT-ddPCR分析、例如如实施例5中所述的分析进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，转导水平高至少500、1,000、2,000、5,000或10,000倍；
(iii)向脑区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如qRT-PCR或RT-ddPCR分析的分析(例如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，有效载荷的水平增加至少500、1,000、2,000、5,000或10,000倍，任选地，其中脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体；
(iv)向脊髓区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如qRT-PCR分析的分析(例如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，有效载荷的水平增加至少50、100、200、300、400、500、600、700、800或900倍，任选地，其中脊髓区包含颈部区域、胸部区域和/或腰部区域；和/或
(v)向脑区递送增加水平的病毒基因组，任选地，其中例如当通过例如qRT-PCR或RT-ddPCR分析的分析(例如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，病毒基因组的水平增加至少5、10、20、30、40或50倍，任选地，其中脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体。
119.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含：(a)PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列；(b)相对于PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或(c)来自PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；并且其中所述衣壳变体：
(i)例如当通过如实施例4中所述的分析进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，在脑中富集至少约300或400倍；
(ii)转导例如选自齿状核、小脑皮质、大脑皮质、脑干、海马体、丘脑和壳核的脑区，其中例如当通过例如免疫组织化学分析、qRT-PCR或RT-ddPCR分析、例如如实施例5中所述的分析进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，转导水平高至少500、1,000、2,000、5,000或10,000倍；
(iii)向脑区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如qRT-PCR或RT-ddPCR分析的分析(例如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，有效载荷的水平增加至少500、1,000、2,000、5,000或10,000倍，任选地，其中脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体；
(iv)向脊髓区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如qRT-PCR分析的分析(例如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，有效载荷的水平增加至少50、100、200、300、400、500、600、700、800或900倍，任选地，其中脊髓区包含颈部区域、胸部区域和/或腰部区域；和/或
(v)向脑区递送增加水平的病毒基因组，任选地，其中例如当通过例如qRT-PCR或RT-ddPCR分析的分析(例如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，病毒基因组的水平增加至少5、10、20、30、40或50倍，任选地，其中脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体。
120.如实施方案1-3、15-20、23、26-28、35-36、39、41、46、48-61、63-64、71-72、83-88、91、93、101-102、105-109或113-117中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中所述AAV衣壳变体相对于包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的参考序列的向性来说，具有增加的针对例如心脏组织的肌肉细胞或组织的向性。
121.如实施方案1-3、15-20、23、26-28、35-36、39、41、46、48-61、63-64、71-72、83-88、91、93、101-102、105-109、113-117或120中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽向肌肉区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如IHC分析或RT-ddPCR分析的分析(例如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，有效载荷的水平增加至少10、15、20、30或40倍。
122.如实施方案120或121的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中肌肉区包含心脏肌肉区、四头肌区和/或隔膜肌区。
123.如实施方案120-122中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，其中肌肉区包含例如心房肌肉区或心室肌肉区的心脏肌肉区。
124.如前述实施方案中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽为分离的，例如重组的。
125.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码多肽，例如编码如实施方案1-124中任一项的AAV衣壳变体。
126.如实施方案125的多核苷酸，所述多核苷酸包含：
(i)包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列；或
(ii)SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。
127.如实施方案125或126的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:3623-3635中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列。
128.如实施方案125-127中任一项的多核苷酸，所述多核苷酸包含经密码子优化的核苷酸序列。
129.一种肽，例如靶向肽，所述肽包含：
(a)SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列；
(b)相对于SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列来说包含不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或
(c)来自SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。
130.一种肽，例如靶向肽，所述肽包含如实施方案1-106中任一项的氨基酸序列。
131.一种肽，例如靶向肽，所述肽包含：
(i)PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列；
(ii)相对于PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或
(iii)来自PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。
132.一种肽，例如靶向肽，所述肽由以下编码：
(i)SEQ ID NO:3660的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3660的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
133.一种肽，例如靶向肽，其中编码所述肽的核苷酸序列包含：
(i)SEQ ID NO:3660的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3660的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
134.一种肽，例如靶向肽，所述肽包含：
(i)IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列；
(ii)相对于IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或
(iii)来自IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。
135.一种肽，例如靶向肽，所述肽由以下编码：
(i)SEQ ID NO:3663的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3663的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
136.一种肽，例如靶向肽，其中编码所述肽的核苷酸序列包含：
(i)SEQ ID NO:3663的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3663的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
137.一种肽，例如靶向肽，所述肽包含：
(i)RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)的氨基酸序列；
(ii)相对于RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或
(iii)来自RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。
138.一种肽，例如靶向肽，所述肽由以下编码：
(i)SEQ ID NO:3661的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3661的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
139.一种肽，例如靶向肽，其中编码所述肽的核苷酸序列包含：
(i)SEQ ID NO:3661的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3661的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
140.一种肽，例如靶向肽，所述肽包含：
(i)YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)的氨基酸序列；
(ii)相对于YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或
(iii)来自YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。
141.一种肽，例如靶向肽，所述肽由以下编码：
(i)SEQ ID NO:3662的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3662的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
142.一种肽，例如靶向肽，其中编码所述肽的核苷酸序列包含：
(i)SEQ ID NO:3662的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3662的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
143.一种肽，例如靶向肽，所述肽包含：
(i)RESPRGL(SEQ ID NO:3652)的氨基酸序列；
(ii)相对于RESPRGL(SEQ ID NO:3652)的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或
(iii)来自RESPRGL(SEQ ID NO:3652)的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。
144.一种肽，例如靶向肽，所述肽由以下编码：
(i)SEQ ID NO:3664的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3664的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
145.一种肽，例如靶向肽，其中编码所述肽的核苷酸序列包含：
(i)SEQ ID NO:3664的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3664的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
146.一种AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，所述AAV衣壳多肽包含如实施方案129-145中任一项的肽，例如靶向肽。
147.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如实施方案129-145中任一项的肽，例如靶向肽。
148.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码AAV衣壳多肽，例如编码AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：
(a)SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列；
(b)相对于SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列来说包含不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或
(c)来自SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；
任选地，其中(a)、(b)和/或(c)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586、588或589之后存在。
149.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码AAV衣壳多肽，例如编码AAV衣壳变体，其中所述AAV衣壳变体包含：
(i)PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列；
(ii)相对于PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或
(iii)来自PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；
任选地，其中(i)、(ii)和/或(iii)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在。
150.如实施方案149的多核苷酸，所述多核苷酸包含：
(i)SEQ ID NO:3660的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3660的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
151.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码AAV衣壳多肽，例如编码AAV衣壳变体，其中所述AAV衣壳变体包含：
(i)IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列；
(ii)相对于IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或
(iii)来自IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；
任选地，其中(i)、(ii)和/或(iii)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置588之后存在。
152.如实施方案151的多核苷酸，所述多核苷酸包含：
(i)SEQ ID NO:3663的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3663的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
153.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码AAV衣壳多肽，例如编码AAV衣壳变体，其中所述AAV衣壳变体包含：
(i)RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)的氨基酸序列；
(ii)相对于RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或
(iii)来自RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；
任选地，其中(i)、(ii)和/或(iii)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置589之后存在。
154.如实施方案153的多核苷酸，所述多核苷酸包含：
(i)SEQ ID NO:3661的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3661的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
155.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码AAV衣壳多肽，例如编码AAV衣壳变体，其中所述AAV衣壳变体包含：
(i)YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)的氨基酸序列；
(ii)相对于YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或
(iii)来自YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；
任选地，其中(i)、(ii)和/或(iii)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置589之后存在。
156.如实施方案155的多核苷酸，所述多核苷酸包含：
(i)SEQ ID NO:3662的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3662的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
157.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码AAV衣壳多肽，例如编码AAV衣壳变体，其中所述AAV衣壳变体包含：
(i)RESPRGL(SEQ ID NO:3652)的氨基酸序列；
(ii)相对于RESPRGL(SEQ ID NO:3652)的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列；或
(iii)来自RESPRGL(SEQ ID NO:3652)的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；
任选地，其中(i)、(ii)和/或(iii)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置589之后存在。
158.如实施方案157的多核苷酸，所述多核苷酸包含：
(i)SEQ ID NO:3664的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或
(ii)包含SEQ ID NO:3664的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
159.如实施方案147-158中任一项的多核苷酸，其中所述AAV衣壳变体包含：
(i)SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的氨基酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；或
(ii)具有SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列。
160.如实施方案147-159中任一项的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:3623-3635中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列。
161.如实施方案125-160中任一项的多核苷酸、肽或例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽，其为分离的，例如重组的。
162.一种AAV颗粒，所述AAV颗粒包含如实施方案1-124或146中任一项的AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体。
163.如实施方案162的AAV颗粒，所述AAV颗粒包含编码有效载荷的核苷酸序列。
164.如实施方案163的AAV颗粒，其中经编码的有效载荷包含治疗蛋白或其功能变体；抗体或抗体片段；酶；基因编辑系统的组分；RNAi剂(例如dsRNA、siRNA、shRNA、前体miRNA、初级miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其组合。
165.如实施方案164的AAV颗粒，其中所述治疗蛋白或其功能变体(例如重组蛋白)与神经或神经系统变性病症、肌肉或神经肌肉病症或神经肿瘤病症相关(例如在其中异常表达)。
166.如实施方案164或165的AAV颗粒，所述治疗蛋白或其功能变体选自载脂蛋白E(APOE)(例如ApoE2、ApoE3和/或ApoE4)；人类运动神经元存活因子(SMN)1或SMN2；葡糖脑苷脂酶(GBA1)；芳族L-氨基酸脱羧酶(AADC)；天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)；三肽基肽酶I(CLN2)；β-半乳糖苷酶(GLB1)；N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)；N-乙酰基-α-氨基葡糖苷酶(NAGLU)；艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)；细胞内胆固醇转运体(NPC1)；巨轴索神经病蛋白(GAN)；或其组合。
167.如实施方案164的AAV颗粒，其中所述抗体或抗体结合片段结合至：
(i)CNS相关靶，例如与神经或神经系统变性病症相关的抗原，例如β-淀粉样蛋白、APOE、tau、SOD1、TDP-43、亨廷顿蛋白(huntingtin，HTT)和/或突触核蛋白；
(ii)肌肉或神经肌肉相关靶，例如与肌肉或神经肌肉病症相关的抗原；或
(iii)神经肿瘤相关靶，例如与神经肿瘤病症相关的抗原，例如HER2或EGFR(例如EGFRvIII)。
168.如实施方案164的AAV颗粒，其中所述酶包含兆核酸酶、锌指核酸酶、TALEN、重组酶、整合酶、碱基编辑器、Cas9或其片段。
169.如实施方案164的AAV颗粒，其中所述基因编辑系统的组分包含CRISPR-Cas系统的一种或多种组分。
170.如实施方案164或169的AAV颗粒，其中所述CRISPR-Cas系统的所述一种或多种组分包含Cas9(例如Cas9直系同源物或Cpf1)以及单向导RNA(sgRNA)，任选地，其中：
(i)sgRNA位于cas9酶的上游(5')；或
(ii)sgRNA位于cas9酶的下游(3')。
171.如实施方案164的AAV颗粒，其中所述RNAi剂(例如dsRNA、siRNA、shRNA、前体miRNA、初级miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)调节(例如抑制)CNS相关基因、mRNA和/或蛋白的表达。
172.如实施方案171的AAV颗粒，其中所述CNS相关基因选自SOD1、MAPT、APOE、HTT、C9ORF72、TDP-43、APP、BACE、SNCA、ATXN1、ATXN3、ATXN7、SCN1A-SCN5A、SCN8A-SCN11A或其组合。
173.如实施方案162-172中任一项的AAV颗粒，所述AAV颗粒包含有包含有效地连接至编码有效载荷的核酸序列的启动子的病毒基因组。
174.如实施方案173的AAV颗粒，其中所述启动子选自人类延长因子1α-亚单位(EF1α)、巨细胞病毒(CMV)即刻早期增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)和其衍生物CAG、β葡萄糖醛酸酶(GUSB)或泛素C(UBC)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)、细胞间黏附分子2(ICAM-2)、突触蛋白(Syn)、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)、神经丝轻链(NFL)或重链(NFH)、β球蛋白微小基因nβ2、前脑啡肽原(PPE)、脑啡肽(Enk)和兴奋性氨基酸转运体2(EAAT2)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、心血管启动子(例如αMHC、cTnT和CMV-MLC2k)、肝启动子(例如hAAT、TBG)、骨胳肌启动子(例如结蛋白、MCK、C512)或其片段(例如截短片段)或功能变体。
175.如实施方案173或174中任一项的AAV颗粒，其中所述病毒基因组还包含polyA信号序列。
176.如实施方案173-175中任一项的AAV颗粒，其中所述病毒基因组还包含反向末端重复(ITR)序列。
177.如实施方案173-176中任一项的AAV颗粒，其中所述病毒基因组包含相对于经编码的有效载荷来说位于5'的ITR序列。
178.如实施方案173-177中任一项的AAV颗粒，其中所述病毒基因组包含相对于经编码的有效载荷来说位于3'的ITR序列。
179.如实施方案173-178中任一项的AAV颗粒，其中所述病毒基因组包含相对于经编码的有效载荷来说位于5'的ITR序列和相对于经编码的有效载荷来说位于3'的ITR序列。
180.如实施方案173-179中任一项的AAV颗粒，其中所述病毒基因组还包含增强子、Kozak序列、内含子区和/或外显子区。
181.如实施方案173-180中任一项的AAV颗粒，其中所述病毒基因组还包含miR结合位点，例如在表达对应miRNA的细胞或组织中调节(例如减少)由所述病毒基因组编码的所述有效载荷的表达的miR结合位点。
182.如实施方案173-181中任一项的AAV颗粒，其中所述病毒基因组包含miR结合位点的至少1-5个拷贝，例如至少1个、2个、3个、4个或5个拷贝。
183.如实施方案173-182中任一项的AAV颗粒，其中所述病毒基因组包含miR结合位点的至少3个拷贝，任选地，其中全部三个拷贝包含相同miR结合位点，或所述拷贝中的至少一个、两个或全部包含不同miR结合位点。
184.如实施方案173-182中任一项的AAV颗粒，其中所述病毒基因组包含miR结合位点的至少4个拷贝，任选地，其中全部四个拷贝包含相同miR结合位点，或所述拷贝中的至少一个、两个、三个或全部包含不同miR结合位点。
185.如实施方案181-184中任一项的AAV颗粒，其中所述miR结合位点包含miR122结合位点、miR183结合位点、miR-142-3p或其组合，任选地，其中：
(i)所述miR122结合位点包含SEQ ID NO:3672的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO:3672的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列；
(ii)所述miR183结合位点包含SEQ ID NO:3675的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO:3675的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列；和/或
(iii)所述miR-142-3p结合位点包含SEQ ID NO:3674的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO:3674的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
186.如实施方案173-185中任一项的AAV颗粒，其中所述病毒基因组为单链的。
187.如实施方案173-186中任一项的AAV颗粒，其中所述病毒基因组还包含编码例如非结构蛋白的Rep蛋白的核苷酸序列，其中所述Rep蛋白包含Rep78蛋白、Rep68、Rep52蛋白和/或Rep40蛋白。
188.如实施方案187的AAV颗粒，其中所述Rep78蛋白、所述Rep68蛋白、所述Rep52蛋白和/或所述Rep40蛋白由至少一个Rep基因编码。
189.如实施方案173-188中任一项的AAV颗粒，其中所述病毒基因组还包含编码如实施方案1-124或146中任一项的AAV衣壳变体的核酸序列。
190.如实施方案162-189中任一项的AAV颗粒，所述AAV颗粒为分离的，例如重组的。
191.一种多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:1-1724中的任一者的亲本氨基酸序列，所述多肽中插入有一个或多个靶向肽插入物，所述靶向肽插入物个别地包含选自SEQ IDNO:1725-3622的靶向肽中的任一者的2-9个氨基酸的连续氨基酸序列区。
192.如实施方案191的多肽，其中所述多肽具有第一靶向肽插入物，所述第一靶向肽插入物具有选自SEQ ID NO:1725-3622的靶向肽中的任一者的至少5个氨基酸的连续氨基酸区。
193.一种AAV衣壳，所述AAV衣壳包含VP1、VP2和VP3蛋白，其中所述VP1、VP2和VP3蛋白中的每一者包含如实施方案191或192中任一项的多肽。
194.如实施方案191的多肽，其中所述亲本氨基酸序列为SEQ ID NO:138。
195.如实施方案194的多肽，其中所述亲本氨基酸序列具有取代K449R。
196.如实施方案194或195的多肽，其中所述第一靶向肽插入物包含紧随所述亲本氨基酸序列的氨基酸586之后插入的氨基酸序列PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)。
197.如实施方案196的多肽，所述多肽还包含所述亲本氨基酸序列的位置587-588处的氨基酸“AQ”的缺失。
198.如实施方案194或195的多肽，其中所述第一靶向肽插入物包含紧随所述亲本氨基酸序列的氨基酸586之后插入的氨基酸序列GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)。
199.如实施方案198的多肽，所述多肽还包含所述亲本氨基酸序列的位置587-588处的氨基酸“AQ”的缺失。
200.如实施方案194或195的多肽，其中所述第一靶向肽插入物包含紧随所述亲本氨基酸序列的氨基酸589之后插入的选自以下的7个氨基酸的序列：RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)、YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)、RESPRGL(SEQ ID NO:3652)、SFNDTRA(SEQ ID NO:3653)、YGLPKGP(SEQ ID NO:3655)或STGTLRL(SEQ ID NO:3656)。
201.如实施方案194或195的多肽，其中所述第一靶向肽插入物包含紧随所述亲本氨基酸序列的氨基酸588之后插入的7个氨基酸的序列IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)。
202.如实施方案191的多肽，其中所述亲本氨基酸序列为SEQ ID NO:5。
203.如实施方案202的多肽，其中所述亲本氨基酸序列具有取代K449R。
204.一种AAV衣壳，所述AAV衣壳包含VP1、VP2和VP3蛋白，其中所述VP1、VP2和VP3蛋白中的每一者包含如实施方案194-203中任一项的多肽。
205.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如实施方案191-204中任一项的多肽或衣壳蛋白。
206.如实施方案205的多核苷酸，所述多核苷酸为DNA并且DNA序列经密码子优化。
207.一种AAV颗粒，所述AAV颗粒包含如实施方案193或205中任一项的衣壳和编码治疗性有效载荷的载体基因组。
208.如实施方案207的AAV颗粒，其中所述治疗性有效载荷为所关注的基因。
209.如实施方案208的AAV颗粒，其中所述治疗性有效载荷编码治疗性RNA。
210.一种AAV VP1衣壳，所述AAV VP1衣壳选自由SEQ ID NO:3636-3647中的任一者组成的组。
211.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如实施方案210的AAV VP1衣壳蛋白中的任一者。
212.一种载体，所述载体包含编码如实施方案1-124或146中任一项的AAV衣壳变体的多核苷酸、如实施方案126-128、147-161、205-206或211中任一项的多核苷酸、编码如实施方案129-145或161中任一项的肽(例如靶向肽)的多核苷酸或编码如实施方案191-192或194-203中任一项的多肽的多核苷酸。
213.一种细胞，例如宿主细胞，所述细胞包含如实施方案1-124或146中任一项的AAV衣壳变体、如实施方案126-128、147-161、205-206或211中任一项的多核苷酸、如实施方案129-145或161中任一项的肽、如实施方案191-192或194-203中任一项的多肽、如实施方案162-190或207-209中任一项的AAV颗粒或如实施方案212的载体。
214.如实施方案213的细胞，其中所述细胞为哺乳动物细胞或昆虫细胞。
215.如实施方案213或214的细胞，其中所述细胞为脑区或脊髓区的细胞，任选地为额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、尾核、齿状核、小脑皮质、大脑皮质、脑干、海马体、丘脑、壳核、颈部脊髓区域、胸部脊髓区域和/或腰部脊髓区域的细胞。
216.如实施方案213或214的细胞，其中所述细胞为神经元、感觉神经元、运动神经元、星形胶质细胞或肌肉细胞(例如心脏、隔膜或四头肌的细胞)。
217.一种制造AAV颗粒的方法，所述方法包括
(i)提供包含病毒基因组的宿主细胞；和
(ii)在适合于将病毒基因组封闭在如实施方案1-124或146中任一项的AAV衣壳变体或由如实施方案125-128或147-161中任一项的多核苷酸编码的AAV衣壳变体中的条件下孵育宿主细胞；
由此制造所述AAV颗粒。
218.如实施方案217的方法，所述方法还包括在步骤(i)之前将包含所述病毒基因组的第一核酸分子引入宿主细胞中。
219.如实施方案217或218的方法，其中所述宿主细胞包含编码所述衣壳变体的第二核酸。
220.如实施方案217-219中任一项的方法，其中在第一核酸分子之前、与第一核酸分子并行或在第一核酸分子之后将第二核酸分子引入宿主细胞中。
221.一种药物组合物，所述药物组合物包含如实施方案162-190中任一项的AAV颗粒、包含如实施方案1-124或146中任一项的衣壳变体的AAV颗粒、包含如实施方案129-145或161中任一项的肽的AAV颗粒或包含如实施方案191-192或194-203中任一项的多肽的AAV颗粒以及药学上可接受的赋形剂。
222.一种将有效载荷递送至细胞或组织(例如CNS细胞、CNS组织、肌肉细胞或肌肉组织)的方法，所述方法包括施用有效量的如实施方案221的药物组合物、如实施方案162-190中任一项的AAV颗粒、包含如实施方案1-124或146中任一项的衣壳变体的AAV颗粒、包含如实施方案129-145或161中任一项的肽的AAV颗粒或包含如实施方案191-192或194-203中任一项的多肽的AAV颗粒。
223.如实施方案222的方法，其中所述细胞为脑区或脊髓区的细胞，任选地为额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、尾核、齿状核、小脑皮质、大脑皮质、脑干、海马体、丘脑、壳核、颈部脊髓区域、胸部脊髓区域和/或腰部脊髓区域的细胞。
224.如实施方案222或223的方法，其中所述细胞为神经元、感觉神经元、运动神经元、星形胶质细胞或肌肉细胞(例如心脏、隔膜或四头肌的细胞)。
225.如实施方案222-224中任一项的方法，其中所述细胞或组织是在受试者内。
226.如实施方案225的方法，其中所述受试者患有、经诊断患有或有风险患有神经病症，例如神经系统变性病症。
227.如实施方案225的方法，其中所述受试者患有、经诊断患有或有风险患有肌肉病症或神经肌肉病症。
228.如实施方案225的方法，其中所述受试者患有、经诊断患有或有风险患有神经肿瘤病症。
229.一种治疗患有或经诊断患有例如神经系统变性病症的神经病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案221的药物组合物、如实施方案162-190中任一项的AAV颗粒、包含如实施方案1-124或146中任一项的衣壳变体的AAV颗粒、包含如实施方案129-145或161中任一项的肽的AAV颗粒或包含如实施方案191-192或194-203中任一项的多肽的AAV颗粒。
230.一种治疗患有或经诊断患有肌肉病症或神经肌肉病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案221的药物组合物、如实施方案162-190中任一项的AAV颗粒、包含如实施方案1-124或146中任一项的衣壳变体的AAV颗粒、包含如实施方案129-145或161中任一项的肽的AAV颗粒或包含如实施方案191-192或194-203中任一项的多肽的AAV颗粒。
231.一种治疗患有或经诊断患有神经肿瘤病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如实施方案221的药物组合物、如实施方案162-190中任一项的AAV颗粒、包含如实施方案1-124或146中任一项的衣壳变体的AAV颗粒、包含如实施方案129-145或161中任一项的肽的AAV颗粒或包含如实施方案191-192或194-203中任一项的多肽的AAV颗粒。
232.如实施方案229-231中任一项的方法，其中治疗包括预防所述受试者的疾病或病症的进展。
233.如实施方案225-232的方法，其中所述受试者为人类。
234.如实施方案225-233中任一项的方法，其中所述AAV颗粒肌肉内、静脉内、大脑内、鞘内、脑室内、经由实质内施用或经由大池内注射(ICM)来施用于受试者。
235.如实施方案225-233中任一项的方法，其中所述AAV颗粒经由聚焦式超声波(FUS)，例如联合微气泡静脉内施用(FUS-MB)，或MRI引导的FUS联合静脉内施用来施用于受试者。
236.如实施方案225-235中任一项的方法，其中所述AAV颗粒静脉内施用于受试者。
237.如实施方案222-236中任一项的方法，其中所述AAV颗粒的施用引起基因、mRNA、蛋白或其组合的存在、水平和/或活性减少。
238.如实施方案222-148中任一项的方法，其中所述AAV颗粒的施用引起基因、mRNA、蛋白或其组合的存在、水平和/或活性增加。
239.如实施方案221的药物组合物、如实施方案162-190中任一项的AAV颗粒、包含如实施方案1-124或146中任一项的衣壳变体的AAV颗粒、包含如实施方案129-145或161中任一项的多肽的AAV颗粒或包含如实施方案191-192或194-203中任一项的多肽的AAV颗粒，其用于将有效载荷递送至细胞或组织的方法中。
240.如实施方案221的药物组合物、如实施方案162-190中任一项的AAV颗粒、包含如实施方案1-124或196中任一项的衣壳变体的AAV颗粒、包含如实施方案129-145或161中任一项的多肽的AAV颗粒或包含如实施方案191-192或194-203中任一项的多肽的AAV颗粒，其用于治疗神经病症、神经系统变性病症、肌肉病症、神经肌肉病症或神经肿瘤病症的方法中。
241.如实施方案221的药物组合物、如实施方案162-190中任一项的AAV颗粒、包含如实施方案1-124或146中任一项的衣壳变体的AAV颗粒、包含如实施方案129-145或161中任一项的肽的AAV颗粒或包含如实施方案191-192或194-203中任一项的多肽的AAV颗粒，其用于药剂制造中。
242.如实施方案221的药物组合物、如实施方案162-190中任一项的AAV颗粒、包含如实施方案1-124或146中任一项的衣壳变体的AAV颗粒、包含如实施方案129-145或161中任一项的肽的AAV颗粒或包含如实施方案191-192或194-203中任一项的多肽的AAV颗粒的用途，其用于制造用以治疗神经病症、神经系统变性病症、肌肉病症、神经肌肉病症或神经肿瘤病症的药剂。
附图说明
前述和其他目标、特点和优点将从如附图中所绘示的本公开的特定实施方案的以下描述显而易见。图式未必按比例绘制，相反侧重绘示本公开的各个实施方案的原理。
图1A和图1B提供非人类灵长类动物(NHP)TRACERAAV衣壳库的鉴定和设计的图。
图2提供TRACER AAV衣壳库的正交演化的图。
图3提供非人类灵长类动物中通过下一代测序进行的高通量筛检的图。
图4提供示例性TRACER AAV库设计(SEQ ID NO:3696-3699)的图。
图5提供替代性TRACER骨架构建体的图。
图6A、图6B和图6C显示使用qRT-PCR进行的NHP组织中的AAV颗粒转导的mRNA定量。
图7显示使用ddPCR进行的NHP组织中的AAV颗粒转导的mRNA定量。
图8显示NHP的脊髓和背根神经节中的AAV颗粒转导的mRNA定量。
图9A、图9B、图9C和图9D显示NHP组织中的病毒基因组定量。
图10A和图10B显示AAV颗粒转导之后呈相对于TBP转录物来说的倍数(图10A)形式和呈相对于AAV9来说的倍数(图10B)形式的周围组织中的有效载荷-HA定量。
图11A和图11B显示呈相对于TBP(管家基因)来说的倍数形式的脑转基因mRNA表达(RT-ddPCR)。
图12A和图12B显示呈载体基因组/细胞形式的脑病毒DNA生物分布(ddPCR)。
图13A和图13B显示呈相对于AAV9来说的倍数形式的脑转基因mRNA表达(RT-ddPCR)。
图14A和图14B显示呈相对于AAV9来说的倍数形式的脑病毒DNA生物分布(ddPCR)。
图15A和图15B显示呈相对于TATA盒结合蛋白来说的倍数形式的脊髓(图15A)和DRG(图15B)转基因mRNA表达。
图16A和图16B显示呈载体基因组/细胞形式的脊髓(图16A)和DRG(图16B)病毒基因组生物分布。
图17A和图17B显示呈相对于AAV9来说的倍数形式的脊髓(图17A)和DRG(图17B)mRNA表达。
图18A和图18B显示呈相对于AAV9来说的倍数形式的脊髓(图18A)和DRG(图18B)病毒基因组生物分布。
图19A、图19B、图19C、图19D和图19E显示如通过齿状核(图19A)、小脑皮质(图19B)、皮质(图19C)、脑干、海马体、丘脑和壳核(图19D)以及背根神经节(图19E)的免疫组织化学分析所测定，TTD-001和AAV9的脑转导概况的图像。
图20A和图20B显示相较于AAV9来说衣壳变体TTD-004的DRG脱靶特征的免疫组织化学图像。
图21A和图21B显示以载体基因组/细胞形式定量的周围组织中的病毒基因组生物分布。
图22A、图22B和图22C显示在静脉内施用包含TTD-001衣壳变体、TTD-004衣壳变体或野生型AAV9对照衣壳多肽的AAV颗粒后第14天雌性NHP的心脏的免疫组织化学图像。图22A提供心脏肌肉的一系列全局图像，图22B提供心脏左心室的一系列图像，并且图22C提供心脏右心室的一系列图像。对于图22A-22C中的各系列图像，左上图显示施用包含TTD-001衣壳变体的AAV颗粒后的染色，右上图显示施用包含TTD-004衣壳变体的AAV颗粒后的染色，并且下部图显示施用包含野生型AAV9对照衣壳变体的AAV颗粒后的染色。
具体实施方式
本公开的一个或多个实施方案的细节阐述于以下随附描述中。尽管可使用与本文所述的材料和方法类似或等效的任何材料和方法来实践或测试本公开，但现在描述优选材料和方法。本公开的其他特点、目标和优点将根据描述显而易见。在所述描述中，除非上下文另外清楚地规定，否则单数形式也包括复数形式。除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语皆具有与本公开所属领域的一般技术者通常所理解的含义相同的含义。在有冲突的情况下，以本说明书为准。某些术语在定义部分中和通篇进行定义。
本文尤其描述包含例如AAV衣壳变体(例如本文所述的AAV衣壳变体)的AAV衣壳多肽的组合物以及其制造和使用方法。一般说来，AAV衣壳变体具有针对细胞或组织的增强的向性，例如以将有效载荷递送至所述细胞或组织，例如CNS组织、CNS细胞、肌肉细胞或肌肉组织。
如下文实施例中所展示，本文所述的某些AAV衣壳变体显示多个优于野生型AAV9的优点，所述优点包括(i)在静脉内施用之后增加的透过血脑屏障的渗透率，(ii)更宽的遍及多个脑区的分布，所述脑区例如为额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体，和/或(iii)增加的在多个脑区中的有效载荷表达。在不希望受理论束缚的情况下，据信这些优点可部分归因于AAV衣壳变体通过脑脉管系统的散布。在一些实施方案中，本文所述的AAV衣壳增强有效载荷向多个脑区的递送，所述脑区包括例如额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体。
根据本公开，提供具有针对靶组织(例如CNS)的增强的向性的AAV颗粒以及其靶向、制备、配制和使用的相关工艺。还提供肽(例如靶向肽)和编码肽(例如靶向肽)的核酸序列。这些肽(例如靶向肽)可插入AAV衣壳蛋白序列中以体内、离体或体外更改针对特定细胞类型、组织、器官或生物的向性。
先前已使用数种用于产生具有针对例如CNS细胞或组织的细胞或组织的增强的向性的AAV衣壳的方法。一种方法使用经培养细胞(Grimm等人,2008，其内容以全文引用的方式并入本文中)或原位动物组织(Lisowski等人,2014，其内容以全文引用的方式并入本文中)与腺病毒的共同感染以便触发感染性AAV DNA的指数复制。另一方法涉及使用细胞特异性CRE转基因小鼠(Deverman等人,2016.其内容以全文引用的方式并入本文中)，从而允许特定地在星形胶质细胞中进行病毒DNA重组，接着回收CRE重组衣壳变体。两种方法均已取得有限成功。
Deverman等人(2016)所使用的转基因CRE系统在其他动物物种中具有有限的易处理性，并且在小鼠组织中通过定向演化选择的AAV变体在大型动物中不显示类似特性。先前所描述的转导特异性方法不适合于大型动物研究，这是因为：1)许多所关注的组织(例如CNS)不易于发生腺病毒共同感染，2)特异性腺病毒向性本身将使库分布偏移，和3)大型动物通常不经受转基因或基因工程改造以在所界定的细胞类型中表达CRE重组酶。
为了解决这些限制，已经研发广泛适用于非转基因动物中的细胞类型特异性生物淘选的功能性AAV衣壳库筛检平台并且描述于所附实施例中。在TRACER(通过RNA的细胞类型特异性表达进行的AAV的向性重定向)平台系统中，在不存在辅助病毒共同感染的情况下将衣壳基因放置于细胞类型特异性启动子控制下以驱动衣壳mRNA表达。在不希望受理论束缚的情况下，据信这种RNA驱动筛检增加选择性压力以便于转导特异性细胞类型的衣壳变体。所述TRACER平台允许生成AAV衣壳库，由此在不需要转基因动物或辅助病毒共同感染的情况下达成在经转导细胞中表达的衣壳mRNA的特异性回收和亚克隆。在不希望受理论束缚的情况下，据信由于mRNA转录是完全转导的标志，因此本文所公开的方法允许鉴定完全感染性AAV衣壳突变体，并且除了其较高严格度之外，这种方法还允许使用经设计以表达处于任何细胞特异性启动子控制下的CAP mRNA的库来鉴定具有针对特定细胞类型的高向性的衣壳，所述细胞特异性启动子诸如但不限于突触蛋白-1启动子(神经元)、GFAP启动子(星形胶质细胞)、TBG启动子(肝)、CAMK启动子(骨骼肌)、MYH6启动子(心肌细胞)。本文描述使用TRACER方法生成的新颖AAV衣壳变体，所述新颖AAV衣壳变体在例如CNS细胞、CNS组织、肌肉细胞或肌肉组织中展现增强向性。
本公开的AAV颗粒和有效载荷可递送至一个或多个靶细胞、组织、器官或生物。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒展现针对靶细胞类型、组织或器官的增强的向性。作为非限制性实例，AAV颗粒可具有针对中枢神经系统或周围神经系统(分别为CNS和PNS)的细胞和组织或肌肉的细胞和组织的增强的向性。另外或可替代地，本公开的AAV颗粒可具有针对非所需靶细胞类型、组织或器官的降低的向性。
在一些实施方案中，AAV包含微小病毒科的小非包膜二十面体衣壳病毒并且特征在于单链DNA病毒基因组。微小病毒科病毒由两个亚科组成：感染脊椎动物的微小病毒亚科和感染无脊椎动物的浓核病毒亚科(Densovirinae)。微小病毒科包含能够在包括但不限于人类、灵长类动物、牛、犬科动物、马和绵羊物种的脊椎动物宿主中复制的包括AAV的依赖病毒(Dependovirus)属。
微小病毒和微小病毒科中的其他成员一般描述于Kenneth I.Berns,“Parvoviridae:The Viruses and Their Replication”,FIELDS VIROLOGY(第3版1996)中的第69章中，所述文献的内容以全文引用的方式并入。
在一些实施方案中，AAV由于相对简单的结构、其在不整合至宿主基因组中的情况下和在不复制的情况下感染广泛范围的细胞(包括静止细胞和分裂细胞)的能力和其相对良性的免疫原性概况而用作生物工具。所述病毒的基因组可经操纵以含有最少用于组装功能性重组病毒或病毒颗粒的组分，所述功能性重组病毒或病毒颗粒负载有特定组织和所需有效载荷或经工程改造以靶向特定组织并且表达或递送所需有效载荷。
在一些实施方案中，AAV为天然存在的AAV(例如野生型AAV)或重组AAV。在一些实施方案中，野生型AAV载体基因组是长度为大致5,000个核苷酸(nt)的线性、单链DNA(ssDNA)分子。在一些实施方案中，反向末端重复序列(ITR)在5'端和3'端处对病毒基因组加帽，从而为病毒基因组提供复制起点。在一些实施方案中，AAV病毒基因组通常包含两个ITR序列。这些ITR在ssDNA的5'端和3'端处具有由自身互补区(145个nt于野生型AAV中)界定的特征性T形发夹结构，由此形成能量上稳定的双链区。双链发夹结构包含多种功能，包括但不限于通过充当宿主病毒复制细胞的内源DNA聚合酶复合体的引物来充当DNA复制起点。
在一些实施方案中，野生型AAV病毒基因组还包含用于两个开放阅读框的核苷酸序列，一个开放阅读框是用于四种非结构性Rep蛋白(Rep78、Rep68、Rep52、Rep40，由Rep基因编码)并且一个开放阅读框是用于三种衣壳或结构性蛋白(VP1、VP2、VP3，由衣壳基因或Cap基因编码)。Rep蛋白是用于复制和包装，而衣壳蛋白经组装以产生AAV或例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的蛋白壳层。替代性剪接和替代性起始密码子和启动子引起由单一开放阅读框生成四种不同Rep蛋白和由单一开放阅读框生成三种衣壳蛋白。尽管其因AAV血清型而变化，但作为非限制性实例，对于AAV9/hu.14(US7,906,111的SEQ ID NO:123，所述申请的内容以全文引用的方式并入本文中)，VP1是指氨基酸1-736，VP2是指氨基酸138-736，并且VP3是指氨基酸203-736。在一些实施方案中，对于SEQ ID NO:3636-3647的氨基酸序列中的任一者，VP1包含氨基酸1-743，VP2包含氨基酸138-743，并且VP3包含氨基酸203-743。换句话说，VP1为全长衣壳序列，而VP2和VP3为整体的较短组分。因此，VP3区中的序列的变化还为VP1和VP2的变化，然而，VP3相较于亲本序列的差异百分比将最大，这是因为它是三者中的最短序列。尽管本文中关于氨基酸序列进行描述，但可类似地描述编码这些蛋白的核酸序列。三种衣壳蛋白一起组装以产生AAV衣壳蛋白。尽管不希望受理论束缚，但AAV衣壳蛋白通常包含1:1:10摩尔比的VP1:VP2:VP3。
本公开的AAV载体可以重组方式产生并且可基于腺相关病毒(AAV)亲本序列或参考序列。除了单链AAV病毒基因组(例如ssAAV)之外，本公开还提供自身互补型AAV(scAAV)病毒基因组。scAAV载体基因组含有一起退火以形成双链DNA的DNA链。通过跳过第二链合成，scAAV允许在经转导细胞中快速表达。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒为scAAV。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒为ssAAV。
用于产生和/或修饰诸如假型AAV载体的AAV颗粒的方法公开于本领域中(PCT专利公布号WO200028004；WO200123001；WO2004112727；WO2005005610；和WO2005072364，所述PCT专利公布中的每一者的内容以全文引用的方式并入本文中)。
如本文所述，包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽和病毒基因组的本公开的AAV颗粒具有针对例如CNS细胞类型、区域或组织或肌肉细胞类型或组织的细胞类型或组织的增强的向性。在一些实施方案中，包含具有例如靶向肽的插入肽的衣壳和病毒基因组的本公开的AAV颗粒可具有针对人类CNS或肌肉的细胞类型、区域或组织的增强的向性。
肽，例如靶向肽
本文公开肽(例如靶向肽)和包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的相关AAV颗粒，所述AAV衣壳多肽具有例如靶向肽插入物的肽以增强或改进靶组织(例如CNS或PNS的细胞)的转导。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)为分离的、例如重组的肽(例如靶向肽)。在一些实施方案中，编码所述肽(例如靶向肽)的核酸为分离的核酸，例如重组核酸。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可将AAV颗粒引导至CNS的细胞、区域或组织。CNS的细胞可以是但不限于脑的神经元(例如兴奋性、抑制性、运动、感觉、自主、交感性、副交感性、浦肯野(Purkinje)、贝兹(Betz)等)、胶质细胞(例如小神经胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞)和/或支持细胞(诸如免疫细胞(例如T细胞))。CNS的组织可以是但不限于皮质(例如额叶、顶叶、枕骨、颞叶)、丘脑、下丘脑、纹状体、壳核、尾核、海马体、内嗅皮质、基底神经节或深小脑核。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可将AAV颗粒引导至PNS的细胞、区域或组织。PNS的细胞或组织可以是但不限于背根神经节(DRG)。
在一些实施方案中，在静脉内施用之后，所述肽(例如靶向肽)可将AAV颗粒引导至CNS(例如皮质)。在一些实施方案中，在聚焦式超声波(FUS)，例如联合微气泡静脉内施用(FUS-MB)，或MRI引导的FUS联合静脉内施用之后，所述肽(例如靶向肽)可将AAV颗粒引导至CNS(例如皮质)。
在一些实施方案中，在静脉内施用之后，所述肽(例如靶向肽)可将AAV颗粒引导至PNS(例如DRG)。在一些实施方案中，在聚焦式超声波(FUS)，例如联合微气泡静脉内施用(FUS-MB)，或MRI引导的FUS联合静脉内施用之后，所述肽(例如靶向肽)可将AAV颗粒引导至PNS(例如DRG)。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可将AAV颗粒引导至肌肉细胞、区域或组织。在一些实施方案中，肌肉为心脏肌肉。在一些实施方案中，在静脉内施用之后，所述肽(例如靶向肽)可将AAV颗粒引导至肌肉细胞、区域或组织。
肽(例如靶向肽)的长度可变化。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的长度为约3至约20个氨基酸。作为非限制性实例，靶向肽的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20or 3-5、3-8、3-10、3-12、3-15、3-18、3-20、5-10、5-15、5-20、10-12、10-15、10-20、12-20或15-20个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度包含约6至12个氨基酸，例如长度包含约9个氨基酸。在一些实施方案中，肽的长度包含约5至10个氨基酸，例如长度包含约7个氨基酸。
肽(例如靶向肽)可以是相连(或连续)的或在两个或更多个氨基酸序列中通过长度可变化的介入氨基酸序列而为非相连(或不连续)的或分割的或分裂的。相连的肽(例如靶向肽)的长度可变化。作为非限制性实例，相连的肽(例如靶向肽)的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或3-5、3-8、3-10、3-12、3-15、3-18、3-20、5-10、5-15、5-20、10-12、10-15、10-20、12-20或15-20个氨基酸。非相连或分割的肽(例如靶向肽)的长度可变化。作为非限制性实例，非相连或分割的肽(例如靶向肽)的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或3-5、3-8、3-10、3-12、3-15、3-18、3-20、5-10、5-15、5-20、10-12、10-15、10-20、12-20或15-20个氨基酸。介入氨基酸序列的长度可变化。作为非限制性实例，介入的肽(例如靶向肽)的长度可以是3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或3-5、3-8、3-10、3-12、3-15、3-18、3-20、5-10、5-15、5-20、10-12、10-15、10-20、12-20或15-20个氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的肽(例如靶向肽)可通过本领域中已知的任何滑动窗算法来鉴定和/或设计。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)和相关AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可由例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的库鉴定。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可以是5-10个氨基酸序列，例如6-10个氨基酸序列、6-9个氨基酸序列、7-10个氨基酸序列、7-9个氨基酸序列、8-10个氨基酸序列、7个氨基酸序列、8个氨基酸序列或9个氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可以是5个氨基酸序列(5聚体)。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可以是6个氨基酸序列(6聚体)。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可以是7个氨基酸序列(7聚体)。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可以是9个氨基酸序列(9聚体)。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)的不同之处也可在于其产生或设计方法，其中非限制性实例包括随机肽选择、位点饱和诱变和/或特定肽区(例如侧接区或中央核心)优化。
在一些实施方案中，肽库(例如靶向肽库)包含通过PCR随机生成的长度为7个氨基酸的靶向肽(7聚体)。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)库包含具有3个突变氨基酸的肽(例如靶向肽)。在一些实施方案中，这3个突变氨基酸为连续或相连的氨基酸。在另一实施方案中，这3个突变氨基酸为不连续或非相连或分割的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)为5聚体。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)为6聚体。在一些实施方案中，亲本肽(例如靶向肽)为7聚体。在另一实施方案中，亲本肽为9聚体。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)库包含7聚体的肽(例如靶向肽)，其中所述肽(例如靶向肽)的氨基酸和/或侧接序列经由3个连续氨基酸的位点饱和诱变而演化。在一些实施方案中，NNK(N＝任何碱基；K＝G或T)密码子是用于生成位点饱和突变序列。
生成包含具有肽(例如靶向肽)插入物的衣壳蛋白(例如AAV衣壳变体)的AAV颗粒并且将编码报告基因(例如GFP)的病毒基因组封装于其内。随后，通过静脉内递送至尾部静脉来将这些包含AAV衣壳变体的AAV颗粒(或AAV衣壳库)施用于转基因啮齿动物(例如小鼠)。向表达cre的小鼠施用这些衣壳库由于Cre表达而引起报告基因有效载荷在靶组织中的表达。
在一些实施方案中，AAV衣壳mRNA表达可经细胞类型特异性启动子调节，例如处于细胞类型特异性启动子的控制下，或由细胞类型特异性启动子驱动。此类衣壳可包含肽(例如靶向肽)插入物和编码封装于其内的报告基因的病毒基因组，可例如通过静脉内递送至尾部静脉来施用于非转基因啮齿动物(例如小鼠，诸如但不限于C57BL/6小鼠、BALB/C小鼠和大鼠)。向非转基因啮齿动物施用此类衣壳库可由于细胞类型特异性启动子而引起报告基因有效载荷在靶组织中的表达。
在一些实施方案中，AAV衣壳mRNA表达可处于细胞类型特异性启动子的控制下或由细胞类型特异性启动子驱动。此类衣壳可包含例如靶向肽插入物的肽和编码封装于其内的报告基因的病毒基因组，可例如通过静脉内递送至隐静脉来施用于非人类灵长类动物，诸如但不限于食蟹猴和恒河猴。向非人类灵长类动物施用此类衣壳库可由于细胞类型特异性启动子而引起报告基因有效载荷在靶组织中的表达。
在一些实施方案中，包含具有肽(例如靶向肽)插入物的衣壳蛋白的AAV颗粒也可在下文中称为肽展示衣壳库。
AAV颗粒和/或病毒基因组可从靶组织回收以鉴定肽(例如靶向肽)和富集的相关AAV颗粒，所述富集指示靶组织转导增强。诸如但不限于下一代测序(NGS)、病毒基因组定量、生物化学分析、免疫组织化学和/或靶组织样品成像的本领域中的标准方法可用于测定富集。
靶组织可以是受试者的任何细胞、组织或器官。作为非限制性实例，样品可从以下收集：脑、脊髓、背根神经节和相关根、肝、心脏、腓肠肌、比目鱼肌、胰腺、肾、脾、肺、肾上腺、胃、坐骨神经、隐静脉神经、甲状腺、眼睛(有或无视神经)、脑下腺、骨胳肌(股直肌)、结肠、十二指肠、回肠、空肠、腿部皮肤、上颈神经节、膀胱、卵巢、子宫、前列腺、睾丸和/或经鉴定为具有病灶或受到关注的任何位点。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)可包含如表1中所阐述的序列。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)可包含如表2中所阐述的序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含例如表2中所述的肽1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)为分离的，例如重组的。
表1.示例性肽序列，例如靶向肽
Figure BDA0004048892440000621
Figure BDA0004048892440000631
Figure BDA0004048892440000641
Figure BDA0004048892440000651
Figure BDA0004048892440000661
Figure BDA0004048892440000671
Figure BDA0004048892440000681
Figure BDA0004048892440000691
Figure BDA0004048892440000701
Figure BDA0004048892440000711
Figure BDA0004048892440000721
Figure BDA0004048892440000731
Figure BDA0004048892440000741
Figure BDA0004048892440000751
Figure BDA0004048892440000761
Figure BDA0004048892440000771
Figure BDA0004048892440000781
Figure BDA0004048892440000791
Figure BDA0004048892440000801
表2.示例性肽，例如靶向肽序列
Figure BDA0004048892440000802
Figure BDA0004048892440000811
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含来自SEQ ID NO:1725-3622中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述肽包含来自SEQ ID NO:3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。
在一些实施方案中，所述3个连续氨基酸包含PLN。在一些实施方案中，所述4个连续氨基酸包含PLNG(SEQ ID NO:3678)。在一些实施方案中，所述5个连续氨基酸包含PLNGA(SEQ ID NO:3679)。在一些实施方案中，所述6个连续氨基酸包含PLNGAV(SEQ ID NO:3680)。在一些实施方案中，所述7个连续氨基酸包含PLNGAVH(SEQ ID NO:3681)。在一些实施方案中，所述8个连续氨基酸包含PLNGAVHL(SEQ ID NO:3682)。在一些实施方案中，所述9个连续氨基酸包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)。
在一些实施方案中，所述四个连续氨基酸包含NGAV(SEQ ID NO:3683)。在一些实施方案中，所述四个连续氨基酸包含GAVH(SEQ ID NO:3684)。在一些实施方案中，所述五个连续氨基酸包含NGAVH(SEQ ID NO:3685)。在一些实施方案中，所述五个连续氨基酸包含GAVHL(SEQ ID NO:3686)。在一些实施方案中，所述五个连续氨基酸包含AVHLY(SEQ ID NO:3687)。在一些实施方案中，所述六个连续氨基酸包含NGAVHL(SEQ ID NO:3688)。在一些实施方案中，所述七个连续氨基酸包含NGAVHLY(SEQ ID NO:3689)。
在一些实施方案中，所述3个连续氨基酸包含YST。在一些实施方案中，所述4个连续氨基酸包含YSTD(SEQ ID NO:3690)。在一些实施方案中，所述5个连续氨基酸包含YSTDE(SEQ ID NO:3691)。在一些实施方案中，所述5个连续氨基酸包含YSTDV(SEQ ID NO:3700)。在一些实施方案中，所述6个连续氨基酸包含YSTDER(SEQ ID NO:3692)。在一些实施方案中，所述6个连续氨基酸包含YSTDVR(SEQ ID NO:3701)。在一些实施方案中，所述7个连续氨基酸包含YSTDERM(SEQ ID NO:3657)。在一些实施方案中，所述7个连续氨基酸包含YSTDERK(SEQ ID NO:3658)。在一些实施方案中，所述7个连续氨基酸包含YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)。
在一些实施方案中，所述3个连续氨基酸包含IVM。在一些实施方案中，所述4个连续氨基酸包含IVMN(SEQ ID NO:3693)。在一些实施方案中，所述5个连续氨基酸包含IVMNS(SEQ ID NO:3694)。在一些实施方案中，所述6个连续氨基酸包含IVMNSL(SEQ ID NO:3695)。在一些实施方案中，所述7个连续氨基酸包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含相对于SEQ ID NO:1725-3622中的任一者的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含相对于SEQ ID NO:3648-3659中的任一者的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列或相对于PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列，任选地，其中位置7为H。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)的氨基酸序列或相对于RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列或相对于IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)的氨基酸序列或相对于YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含RESPRGL(SEQ ID NO:3652)的氨基酸序列或相对于RESPRGL(SEQ ID NO:3652)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的序列。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含SEQ ID NO:1725-3622中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽包含SEQ ID NO:3648-3659中的任一者的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含与表1或表2中所示的序列中的任一者具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含SEQ ID NO:3648的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含SEQ ID NO:3649的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含SEQ ID NO:3650的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含SEQ ID NO:3651的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含SEQ ID NO:3652的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含SEQID NO:3653的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含SEQ ID NO:3654的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含SEQ ID NO:3655的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含SEQ ID NO:3656的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含SEQ ID NO:3657的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含SEQ ID NO:3658的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含SEQ ID NO:3659的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含SEQ ID NO:1725。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含SEQ ID NO:1726。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含SEQ ID NO:1729。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含SEQ ID NO:1760。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含SEQ ID NO:1769。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含SEQ ID NO:3622。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含SEQ ID NO:1798。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含SEQ ID NO:1785。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含SEQ ID NO:1767。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含SEQ ID NO:1734。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含SEQ ID NO:1737。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含SEQ ID NO:1819。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)可包含本文所公开的肽(例如靶向肽)中的任一者的4个或更多个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含如表1或表2中所阐述的序列中的任一者的4个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含如表1或表2中所阐述的序列中的任一者的5个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包含如表1或表2中所阐述的序列中的任一者的6个连续氨基酸。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含由本文所述的核苷酸序列(例如表2的核苷酸序列)编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽包含由包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽包含由SEQID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含由包含SEQ ID NO:3660的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽包含由SEQ ID NO:3660的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)包含由包含SEQ ID NO:3663的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述肽包含由SEQ ID NO:3663的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码本文所述的肽(例如靶向肽)(例如肽1-12)的核苷酸序列包含本文所述的核苷酸序列(例如表2中所述)。在一些实施方案中，编码本文所述的肽的核酸序列包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码本文所述的肽的核酸序列包含有包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码本文所述的肽(例如靶向肽)的核苷酸序列为分离的，例如重组的。
在一些实施方案中，编码本文所述的肽(例如靶向肽)的核苷酸序列包含有包含SEQ ID NO:3660的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码本文所述的肽的核酸序列包含有包含SEQ ID NO:3660的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码本文所述的肽的核酸包含有包含SEQ ID NO:3663的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码本文所述的肽的核酸包含有包含SEQ ID NO:3663的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒包含具有肽(例如靶向肽)插入物的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳(例如AAV衣壳变体)，其中所述肽(例如靶向肽)具有如表1或表2中的任一者中所阐述的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒包含具有肽(例如靶向肽)插入物的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽(例如AAV衣壳变体)，其中所述肽具有相对于表1或表2中的任一者中的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒包含具有肽(例如靶向肽)插入物的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽(例如AAV衣壳变体)，其中所述肽(例如靶向肽)具有包含如表1或表2中的任一者中所阐述的序列中的任一者的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒包含具有肽(例如靶向肽)插入物的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳(例如AAV衣壳变体)，其中所述肽(例如靶向肽)具有与如表1或表2中的任一者中所阐述的序列中的任一者大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置1处的氨基酸至位置2处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置1处的氨基酸至位置3处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置2处的氨基酸至位置3处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置1处的氨基酸至位置4处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置2处的氨基酸至位置4处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置3处的氨基酸至位置4处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置1处的氨基酸至位置5处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置2处的氨基酸至位置5处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置3处的氨基酸至位置5处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置4处的氨基酸至位置5处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置1处的氨基酸至位置6处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置2处的氨基酸至位置6处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置3处的氨基酸至位置6处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置4处的氨基酸至位置6处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置5处的氨基酸至位置6处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置1处的氨基酸至位置7处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置2处的氨基酸至位置7处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置3处的氨基酸至位置7处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置4处的氨基酸至位置7处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置5处的氨基酸至位置7处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置6处的氨基酸至位置7处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置1处的氨基酸至位置8处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置2处的氨基酸至位置8处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置3处的氨基酸至位置8处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置4处的氨基酸至位置8处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置5处的氨基酸至位置8处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置6处的氨基酸至位置8处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置7处的氨基酸至位置8处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置1处的氨基酸至位置9处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置2处的氨基酸至位置9处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置3处的氨基酸至位置9处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置4处的氨基酸至位置9处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置5处的氨基酸至位置9处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置6处的氨基酸至位置9处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置7处的氨基酸至位置9处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659的位置8处的氨基酸至位置9处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622的位置1处的氨基酸至位置10处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622的位置2处的氨基酸至位置10处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622的位置3处的氨基酸至位置10处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622的位置4处的氨基酸至位置10处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622的位置5处的氨基酸至位置10处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622的位置6处的氨基酸至位置10处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622的位置7处的氨基酸至位置10处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ IDNO:1725-3622的位置8处的氨基酸至位置10处的氨基酸。在一些实施方案中，所述肽(例如靶向肽)可包括SEQ ID NO:1725-3622的位置9处的氨基酸至位置10处的氨基酸。
本公开还提供编码上文所描述的肽(例如靶向肽)和AAV衣壳多肽(例如AAV衣壳变体)、包含其的AAV颗粒、载体和细胞中的任一者的核酸或多核苷酸。
在一些实施方案中，与亲本氨基酸序列相比，向例如亲本序列的亲本AAV衣壳中插入肽(例如靶向肽)引起组合插入/置换。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的全部氨基酸插入亲本AAV衣壳序列中。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的一个氨基酸置换亲本AAV衣壳中的一个氨基酸，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸插入亲本AAV衣壳序列中。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的两个氨基酸置换亲本AAV衣壳中的两个氨基酸，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸插入亲本AAV衣壳序列中。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的三个氨基酸置换亲本AAV衣壳中的三个氨基酸，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸插入亲本AAV衣壳序列中。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的四个氨基酸置换亲本AAV衣壳中的四个氨基酸，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸插入亲本AAV衣壳序列中。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的五个氨基酸置换亲本AAV衣壳中的五个氨基酸，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸插入亲本AAV衣壳序列中。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的六个氨基酸置换亲本AAV衣壳中的六个氨基酸，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸插入亲本AAV衣壳序列中。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的七个氨基酸置换亲本AAV衣壳中的七个氨基酸，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸插入亲本AAV衣壳序列中。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的八个氨基酸置换亲本AAV衣壳中的八个氨基酸，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸插入亲本AAV衣壳序列中。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的九个氨基酸置换亲本AAV衣壳中的九个氨基酸，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸插入亲本AAV衣壳序列中。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的一个氨基酸插入例如亲本序列的亲本AAV衣壳中，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的对应氨基酸。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的两个氨基酸插入亲本AAV衣壳中，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的对应氨基酸。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的三个氨基酸插入亲本AAV衣壳中，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的对应氨基酸。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的四个氨基酸插入亲本AAV衣壳中，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的对应氨基酸。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的五个氨基酸插入亲本AAV衣壳中，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的对应氨基酸。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的六个氨基酸插入亲本AAV衣壳中，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的对应氨基酸。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的七个氨基酸插入亲本AAV衣壳中，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的对应氨基酸。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的八个氨基酸插入亲本AAV衣壳中，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的对应氨基酸。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的九个氨基酸插入亲本AAV衣壳中，而肽(例如靶向肽)的剩余氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的对应氨基酸。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)的某些氨基酸可经锚定和/或保留，如在例如亲本序列的原始亲本AAV衣壳序列中一样。在某些实施方案中，这些经锚定的氨基酸居中位于肽(例如靶向肽)中，从而产生分割插入-锚定-插入设计。同样，作为非限制性实例，插入肽(例如靶向肽)可产生分割插入-置换-插入设计。作为非限制性实例，向亲本AAV衣壳序列中插入肽(例如靶向肽)可产生分割置换-插入-置换设计。作为非限制性实例，分割设计肽(例如靶向肽)可如图4中所示(例如TNHQSXXXXAVXXXAQAQT(SEQ ID NO:3699))。
在一些实施方案中，向例如亲本序列的亲本AAV衣壳序列中插入肽(例如靶向肽)可引起亲本AAV衣壳的至少一个氨基酸的置换或突变。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的第一个氨基酸(N端)置换亲本AAV衣壳序列中的一个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的前两个氨基酸(N端)置换亲本AAV衣壳序列中的两个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的前三个氨基酸(N端)置换亲本AAV衣壳序列中的三个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的前四个氨基酸(N端)置换亲本AAV衣壳序列中的四个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的前五个氨基酸(N端)置换亲本AAV衣壳序列中的五个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的前六个氨基酸(N端)置换亲本AAV衣壳序列中的六个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的前七个氨基酸(N端)置换亲本AAV衣壳序列中的七个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的前八个氨基酸(N端)置换亲本AAV衣壳序列中的八个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的前九个氨基酸(N端)置换亲本AAV衣壳序列中的九个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的前十个氨基酸(N端)置换亲本AAV衣壳序列中的十个氨基酸。
在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的最后一个氨基酸(C端)置换亲本AAV衣壳序列中的一个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的后两个氨基酸(C端)置换亲本AAV衣壳序列中的两个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的后三个氨基酸(C端)置换亲本AAV衣壳序列中的三个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的后四个氨基酸(C端)置换亲本AAV衣壳序列中的四个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的后五个氨基酸(C端)置换亲本AAV衣壳序列中的五个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的后六个氨基酸(C端)置换亲本AAV衣壳序列中的六个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的后七个氨基酸(C端)置换亲本AAV衣壳序列中的七个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的后八个氨基酸(C端)置换亲本AAV衣壳序列中的八个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的后九个氨基酸(C端)置换亲本AAV衣壳序列中的九个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的后十个氨基酸(C端)置换亲本AAV衣壳序列中的十个氨基酸。
在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的第一个(N端)氨基酸和最后一个(C端)氨基酸可置换例如亲本序列的亲本AAV衣壳序列中的氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的前两个(N端)氨基酸和后两个(C端)氨基酸可置换亲本AAV衣壳序列中的氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的前三个(N端)氨基酸和后三个(N端)氨基酸可置换亲本AAV衣壳序列中的氨基酸。在某些实施方案中，置换就N端和C端置换来说为不对称的并且可以是以上置换中的任一者的任何组合。
在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的一个氨基酸置换例如亲本序列的亲本AAV衣壳序列中的一个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的两个氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的两个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的三个氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的三个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的四个氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的四个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的五个氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的五个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的六个氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的六个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的七个氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的七个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的八个氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的八个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的九个氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的九个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的十个氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的十个氨基酸。在某些实施方案中，肽(例如靶向肽)的全部氨基酸置换亲本AAV衣壳序列中的相同数目的氨基酸。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可包含编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸还包含核酸插入物(例如靶向核酸插入物)，其中所述核酸插入物具有大体上包含如Hanlon等人,2019(Hanlon等人,Mol Ther Methods ClinDev.2019年10月23日；15:320-332，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)中所述的核苷酸序列中的任一者的核苷酸序列。作为非限制性，所述核酸插入物(例如靶向核酸插入物)具有大体上包含AAV-S的核苷酸序列。作为非限制性实例，所述靶向核酸插入物具有大体上包含AAV-F的核苷酸序列。
包含核酸插入物(例如靶向核酸插入物)的本公开的AAV颗粒可具有与亲本衣壳序列具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的编码衣壳多肽的多核苷酸序列。
包含肽(例如靶向肽)插入物的本公开的AAV颗粒可具有与亲本衣壳序列具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多同一性的氨基酸序列。
AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)插入多肽中、包括于多肽中或另外并入多肽中。在一些实施方案中，此类多肽可称为“亲本多肽”或“起始多肽”或“亲本氨基酸序列”并且此类插入物可称为“靶向肽插入物”、“肽插入物”或“氨基酸序列插入物”。在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含肽(例如靶向肽)插入物和本文所述的多肽(例如较大多肽)。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽具有比亲本AAV衣壳长的氨基酸序列。在其他实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽具有长度与亲本AAV衣壳相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽具有比亲本AAV衣壳短的氨基酸序列。
在包括具有5-50个连续氨基酸的序列的肽(例如靶向肽)插入亲本多肽中的情况下，插入可在亲本多肽中的两个氨基酸之间进行。插入也可以是分割插入，由此肽插入物的一个相连部分插入亲本多肽中的第一组两个氨基酸之间，并且肽的第二部分插入亲本多肽中的第二组两个氨基酸之间，例如插入不同位点之间。亲本多肽的任何数目的氨基酸均可保留在这一第一位点与第二位点之间。在一些实施方案中，亲本多肽中的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个氨基酸可保留在第一肽插入物与第二肽插入物之间。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)插入物可完全或部分置换亲本多肽中的一个或多个氨基酸。举例说来，具有4个氨基酸的肽插入物可紧随亲本多肽中的位置586之后插入，其中肽插入物的后两个氨基酸置换亲本多肽的位置587和588处的氨基酸。因此，新形成的多肽的长度将增加仅两个氨基酸，例如插入2个氨基酸并且取代2个氨基酸。在一些实施方案中，组合插入型/取代型(i/s)变体可包含一个或多个氨基酸插入和一个或多个氨基酸取代，例如各自的长度为1至15个氨基酸并且数目为1至15个。
肽(例如靶向肽)可以是独立肽或可插入亲本序列中或结合至亲本序列。在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)插入AAV颗粒的衣壳蛋白中。
一个或多个肽(例如靶向肽)可插入亲本AAV衣壳序列中以生成本公开的AAV颗粒。
肽(例如靶向肽)可插入亲本AAV衣壳序列中的任何位置中，从而产生全功能AAV颗粒，例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒。肽(例如靶向肽)可插入VP1、VP2和/或VP3中。氨基酸残基的编号可在AAV血清型上不同。如本文所用，亲本AAV衣壳序列的氨基酸位置是使用AAV9(SEQ ID NO:138)作为参考来加以描述。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)插入AAV衣壳序列的高变区中。此类高变区的非限制性实例包括亲本AAV衣壳的环I、环II、环IV、环VI和环VIII。尽管不希望受理论束缚，但据信在一些实施方案中，也可在下文中称为表面环的这些表面暴露环通常为非结构化并且不良保守的，从而使其成为适用于肽(例如靶向肽)插入的区域。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)插入环I中。在另一实施方案中，肽(例如靶向肽)是用于置换环I的一部分或全部。作为非限制性实例，向亲本AAV衣壳序列中添加肽(例如靶向肽)可引起亲本AAV衣壳的至少一个氨基酸的置换或突变。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)插入环II中。在另一实施方案中，靶向肽是用于置换环II的一部分或全部。作为非限制性实例，向亲本AAV衣壳序列中添加靶向肽可引起亲本AAV衣壳的至少一个氨基酸的置换或突变。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)插入环IV中。在另一实施方案中，肽(例如靶向肽)是用于置换环IV的一部分或全部。作为非限制性实例，向亲本AAV衣壳序列中添加肽(例如靶向肽)可引起亲本AAV衣壳的至少一个氨基酸的置换或突变。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)插入环VI中。在另一实施方案中，肽(例如靶向肽)是用于置换环VI的一部分或全部。作为非限制性实例，向亲本AAV衣壳序列中添加肽(例如靶向肽)可引起亲本AAV衣壳的至少一个氨基酸的置换或突变。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)插入环VIII中。在另一实施方案中，肽(例如靶向肽)是用于置换环VIII的一部分或全部。作为非限制性实例，向亲本AAV衣壳序列中添加肽(例如靶向肽)可引起亲本AAV衣壳的至少一个氨基酸的置换或突变。
在一些实施方案中，超过一种肽(例如靶向肽)插入亲本AAV衣壳序列中。作为非限制性实例，肽(例如靶向肽)可插入同一亲本AAV衣壳序列中的环IV和环VIII两者处。
肽(例如靶向肽)可插入亲本AAV衣壳序列的任何氨基酸位置处，诸如但不限于位置586-592、588-589、586-589、452-458、262-269、464-473、491-495、546-557和/或659-668处的氨基酸之间。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)插入亲本AAV衣壳序列中的位置588和589处的氨基酸之间(环VIII)。在一些实施方案中，亲本AAV衣壳为AAV9(SEQ ID NO:138)。在一些实施方案中，亲本AAV衣壳为K449R AAV9(SEQ ID NO:11)。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)插入亲本AAV衣壳序列中的位置454、455、457、458、459、460和/或461处的氨基酸之间(环IV)。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)插入亲本AAV衣壳序列中的位置586、587、588、589和/或590处的氨基酸之间(环VIII)。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)插入亲本AAV衣壳序列环IV中。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是AAV5。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是AAV9。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是AAV9hu.14(SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138)。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是AAV9 K449R(SEQ ID NO:11)。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是PHP.B(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6)。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是PHP.N(SEQ ID NO:4)。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是VOY101(SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2)。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是VOY201(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:1724)。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)插入亲本AAV衣壳序列环VIII中。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是AAV5。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是AAV9。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是AAV9hu.14(SEQ ID NO:137或SEQ ID NO:138)。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是AAV9 K449R(SEQ ID NO:11)。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是PHP.B(SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6)。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是PHP.N(SEQ ID NO:4)。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是VOY101(SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2)。作为非限制性实例，亲本AAV衣壳可以是VOY201(SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:1724)。
在一些实施方案中，肽(例如靶向肽)存在于例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的环VIII中。在一些实施方案中，本文所述的AAV衣壳变体的肽相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在。在一些实施方案中，本文所述的AAV衣壳变体的肽相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置588之后存在。在一些实施方案中，本文所述的AAV衣壳变体的肽相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置589之后存在。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的肽(例如靶向肽)包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列，其中PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的肽(例如靶向肽)包含GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列，其中GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的肽(例如靶向肽)包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列，其中IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置588之后存在。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的肽(例如靶向肽)包含SEQ ID NO:3649、3650、3652、3653或3655-3659中的任一者的氨基酸序列，其中前述序列中的任一者的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置589之后存在。
与缺乏肽(例如靶向肽)插入物的亲本AAV颗粒相比，本文所述的肽(例如靶向肽)可增加本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)向靶组织的转导。在一些实施方案中，与缺乏肽(例如靶向肽)插入物的亲本AAV颗粒相比，肽(例如靶向肽)使AAV颗粒向靶组织的转导增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。
在一些实施方案中，与缺乏肽(例如靶向肽)插入物的亲本AAV颗粒相比，肽(例如靶向肽)使AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)向CNS细胞、区域或组织(例如脑细胞、脑组织、脑区、脊髓细胞、脊髓区或脊髓组织)的转导增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。在一些实施方案中，脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体。在一些实施方案中，脊髓区包含颈部区域、胸部区域和/或腰部区域。
在一些实施方案中，与缺乏肽(例如靶向肽)插入物的亲本AAV颗粒相比，肽(例如靶向肽)使AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)向PNS细胞或组织的转导增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。
在一些实施方案中，与缺乏肽(例如靶向肽)插入物的亲本AAV颗粒相比，肽(例如靶向肽)使AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)向DRG细胞或组织的转导增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。
在一些实施方案中，与缺乏靶向肽插入物的亲本AAV颗粒相比，肽(例如靶向肽)使AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)向肌肉细胞、区域或组织的转导增加至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、200％、300％、400％、500％或更多。在一些实施方案中，肌肉区可包含心脏肌肉区、四头肌区和/或隔膜肌区。在一些实施方案中，肌肉区包含心脏肌肉区，例如心房肌肉区或心室肌肉区。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒包含AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体。在一些实施方案中，AAV衣壳变体包含如表1或表2中所述的肽(例如靶向肽)序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含来自SEQ ID NO:1725-3622中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。在一些实施方案中，AAV衣壳变体包含来自SEQ ID NO:3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述氨基酸序列存在于环VIII中。在一些实施方案中，所述氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586、588或589之后存在。
在一些实施方案中，所述3个连续氨基酸包含PLN。在一些实施方案中，所述4个连续氨基酸包含PLNG(SEQ ID NO:3678)。在一些实施方案中，所述5个连续氨基酸包含PLNGA(SEQ ID NO:3679)。在一些实施方案中，所述6个连续氨基酸包含PLNGAV(SEQ ID NO:3680)。在一些实施方案中，所述7个连续氨基酸包含PLNGAVH(SEQ ID NO:3681)。在一些实施方案中，所述8个连续氨基酸包含PLNGAVHL(SEQ ID NO:3682)。在一些实施方案中，所述9个连续氨基酸包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)。
在一些实施方案中，所述3个连续氨基酸包含YST。在一些实施方案中，所述4个连续氨基酸包含YSTD(SEQ ID NO:3690)。在一些实施方案中，所述5个连续氨基酸包含YSTDE(SEQ ID NO:3691)。在一些实施方案中，所述5个连续氨基酸包含YSTDV(SEQ ID NO:3700)。在一些实施方案中，所述6个连续氨基酸包含YSTDER(SEQ ID NO:3692)。在一些实施方案中，所述6个连续氨基酸包含YSTDVR(SEQ ID NO:3701)。在一些实施方案中，所述7个连续氨基酸包含YSTDERM(SEQ ID NO:3657)。在一些实施方案中，所述7个连续氨基酸包含YSTDERK(SEQ ID NO:3658)。在一些实施方案中，所述7个连续氨基酸包含YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)。
在一些实施方案中，所述3个连续氨基酸包含IVM。在一些实施方案中，所述4个连续氨基酸包含IVMN(SEQ ID NO:3693)。在一些实施方案中，所述5个连续氨基酸包含IVMNS(SEQ ID NO:3694)。在一些实施方案中，所述6个连续氨基酸包含IVMNSL(SEQ ID NO:3695)。在一些实施方案中，所述7个连续氨基酸包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含相对于SEQ ID NO:1725-3622中的任一者的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV衣壳变体包含相对于SEQ ID NO:3648-3659中的任一者的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述氨基酸序列存在于环VIII中。在一些实施方案中，所述氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586、588或589之后存在。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列或相对于PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列，任选地，其中位置7为H。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)的氨基酸序列或相对于RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列或相对于IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)的氨基酸序列或相对于YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含RESPRGL(SEQ ID NO:3652)的氨基酸序列或相对于RESPRGL(SEQ ID NO:3652)的氨基酸序列来说具有至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:1725-3622中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV衣壳变体包含SEQ ID NO:3648-3659中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述氨基酸序列存在于本文所述的AAV衣壳变体的环VIII中。在一些实施方案中，所述氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在。在一些实施方案中，所述氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置588之后存在。在一些实施方案中，所述氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置589之后存在。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体(例如本文所述的AAV衣壳变体)的AAV衣壳多肽包含由SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳包含由包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体(例如本文所述的AAV衣壳变体)的AAV衣壳多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码例如本文所述的AAV衣壳变体的AAV衣壳变体的核酸序列包含有包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体(例如本文所述的AAV衣壳变体)的AAV衣壳多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3660的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码AAV衣壳变体的核酸序列包含有包含SEQ ID NO:3660的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体(例如本文所述的AAV衣壳变体)的AAV衣壳多肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3663的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码AAV衣壳变体的核酸序列包含有包含SEQ ID NO:3663的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含根据SEQ ID NO:138编号的位置587处除“A”以外的氨基酸残基和/或位置588处除“Q”以外的氨基酸残基。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列，其中PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列相对于根据SEQ IDNO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的多肽包含GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列，其中GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列，其中IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置588之后存在。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3649、3650、3652、3653或3655-3659中的任一者的氨基酸序列，其中前述序列中的任一者的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置589之后存在。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽还包含根据SEQ ID NO:138编号的位置K449处的取代，例如K449R取代。在一些实施方案中，AAV衣壳变体还包含环I、II、IV和/或VI中的修饰，例如插入、取代和/或缺失。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽还包含具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV衣壳变体还包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV衣壳变体还包含由SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列编码的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含具有例如肽(例如靶向肽)的插入物的亲本氨基酸序列，其中所述插入物包含SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述插入物包含来自SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。在一些实施方案中，所述插入物包含相对于SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个修饰、但不超过四个修饰(例如取代)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的亲本序列包含有包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列。在一些实施方案中，亲本序列包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，亲本序列还包含位置K449处的取代，例如K449R取代。在一些实施方案中，亲本序列包含由SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，编码本文所述的亲本序列的多核苷酸包含SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的亲本序列包含有包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列，例如其限制条件在于SEQ ID NO:11的位置449不为K，例如为R。在一些实施方案中，本文所述的AAV衣壳变体的亲本序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列，例如其限制条件在于SEQ ID NO:11的位置449不为K，例如为R。
在一些实施方案中，AAV衣壳变体的插入物插入本文所述的亲本氨基酸序列的环VIII中。在一些实施方案中，所述插入物紧随本文所述的亲本氨基酸序列中的位置586、588或589之后插入。
在一些实施方案中，AAV衣壳变体还包含本文所述的亲本序列的位置587处除“A”以外的氨基酸和/或位置588处除“Q”以外的氨基酸。在一些实施方案中，AAV衣壳变体还包含本文所述的亲本氨基酸序列的位置587处的缺失和/或位置588处的缺失。在一些实施方案中，AAV衣壳变体包含本文所述的亲本氨基酸序列的位置587-588处的氨基酸“AQ”的缺失。
在一些实施方案中，本文所述的AAV衣壳变体的插入物包含PLNGAVHLY(SEQ IDNO:3648)的氨基酸序列。在一些实施方案中，PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的插入序列紧随所述亲本氨基酸序列的位置586之后插入。在一些实施方案中，AAV衣壳变体还包含所述亲本氨基酸序列的位置587-588处的氨基酸“AQ”的缺失。在一些实施方案中，AAV衣壳变体包含紧随所述亲本氨基酸序列的位置586之后插入的包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列的插入物以及亲本氨基酸序列的位置587-588处的氨基酸“AQ”的缺失。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的插入物包含GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列。在一些实施方案中，GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的插入序列紧随所述亲本氨基酸序列的位置586之后插入。在一些实施方案中，AAV衣壳变体还包含所述亲本氨基酸序列的位置587-588处的氨基酸“AQ”的缺失。在一些实施方案中，AAV衣壳变体包含紧随所述亲本氨基酸序列的位置586之后插入的包含GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列的插入物以及亲本氨基酸序列的位置587-588处的氨基酸“AQ”的缺失。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的插入物包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列。在一些实施方案中，IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的插入序列紧随所述亲本氨基酸序列的位置588之后插入。在一些实施方案中，AAV衣壳变体包含紧随所述亲本氨基酸序列的位置589之后插入的包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列的插入物。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的插入物包含以下氨基酸序列：RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)、YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)、RESPRGL(SEQ IDNO:3652)、SFNDTRA(SEQ ID NO:3653)、YGLPKGP(SEQ ID NO:3655)或STGTLRL(SEQ ID NO:3656)。在一些实施方案中，RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)、YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)、RESPRGL(SEQ ID NO:3652)、SFNDTRA(SEQ ID NO:3653)、YGLPKGP(SEQ ID NO:3655)或STGTLRL(SEQ ID NO:3656)的插入序列紧随所述亲本氨基酸序列的位置589之后插入。在一些实施方案中，AAV衣壳变体包含紧随所述亲本氨基酸序列的位置589之后插入的包含以下氨基酸序列的插入物：RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)、YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)、RESPRGL(SEQ ID NO:3652)、SFNDTRA(SEQ ID NO:3653)、YGLPKGP(SEQ ID NO:3655)或STGTLRL(SEQID NO:3656)。
在一些实施方案中，本公开的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含如本文所述的氨基酸序列，例如选自TTD-001、TTD-002、TTD-003、TTD-004、TTD-005、TTD-006、TTD-007、TTD-008、TTD-009、TTD-010、TTD-011或TTD-012的AAV衣壳变体的氨基酸序列，例如表3和表4中所述。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含有包含本文所述的氨基酸序列的VP1、VP2和/或VP3蛋白，例如选自TTD-001、TTD-002、TTD-003、TTD-004、TTD-005、TTD-006、TTD-007、TTD-008、TTD-009、TTD-010、TTD-011或TTD-012的AAV衣壳变体的氨基酸序列，例如表3和表4中所述。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含由如本文所述的核苷酸序列编码的氨基酸序列，例如选自TTD-001、TTD-002、TTD-003、TTD-004、TTD-005、TTD-006、TTD-007、TTD-008、TTD-009、TTD-010、TTD-011或TTD-012的AAV衣壳变体的核苷酸序列，例如表3和表5中所述。
在一些实施方案中，编码本公开的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸包含本文所述的核苷酸序列，例如选自TTD-001、TTD-002、TTD-003、TTD-004、TTD-005、TTD-006、TTD-007、TTD-008、TTD-009、TTD-010、TTD-011或TTD-012的AAV衣壳变体的核苷酸序列，例如表3和表5中所述。
在一些实施方案中，向亲本AAV序列中插入核酸序列、靶向核酸序列或肽(例如靶向肽)会生成非限制性示例性全长衣壳序列，例如AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体，如表3、表4和表5中所述。
表3.示例性全长衣壳序列(具有插入物的VP1)
Figure BDA0004048892440001091
Figure BDA0004048892440001101
表4.示例性全长衣壳氨基酸序列
Figure BDA0004048892440001102
Figure BDA0004048892440001111
Figure BDA0004048892440001121
Figure BDA0004048892440001131
Figure BDA0004048892440001141
Figure BDA0004048892440001151
表5.示例性全长衣壳核酸序列
Figure BDA0004048892440001161
Figure BDA0004048892440001171
Figure BDA0004048892440001181
Figure BDA0004048892440001191
Figure BDA0004048892440001201
Figure BDA0004048892440001211
Figure BDA0004048892440001221
Figure BDA0004048892440001231
Figure BDA0004048892440001241
Figure BDA0004048892440001251
Figure BDA0004048892440001261
在一些实施方案中，编码本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:3623-3635中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码本文所述的AAV衣壳变体的多核苷酸包含SEQ ID NO:3623的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码本文所述的AAV衣壳变体的多核苷酸包含SEQ ID NO:3627的核苷酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，编码本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的核酸序列经密码子优化。
在一些实施方案中，编码AAV颗粒的例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与本文所述的核酸序列中的任一者具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或由SEQ ID NO:3623-3635中的任一者提供的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3623-3635中的任一者具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3623-3635中的任一者具有至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽的多核苷酸是由与SEQ ID NO:3623-3635中的任一者具有至少90％同一性的核酸序列编码。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3623-3635中的任一者具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3623-3635中的任一者具有至少96％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ IDNO:3623-3635中的任一者具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3623-3635中的任一者具有至少98％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3623-3635中的任一者具有至少99％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含SEQ ID NO:3623-3635中的任一者所载的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3623具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3623具有至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3623具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3623具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3623具有至少96％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3623具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3623具有至少98％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ IDNO:3623具有至少99％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可具有包含SEQ ID NO:3623的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可具有由SEQ ID NO:3623组成的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3624或3625具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3624或3625具有至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3624或3625具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3624或3625具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3624或3625具有至少96％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3624或3625具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3624或3625具有至少98％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3624或3625具有至少99％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可具有包含SEQ ID NO:3624或3625的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可具有由SEQ ID NO:3624或3625组成的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3626具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3626具有至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3626具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3626具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3626具有至少96％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3626具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3626具有至少98％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3626具有至少99％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可具有包含SEQ ID NO:3626的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可具有由SEQ ID NO:3626组成的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3627具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3627具有至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3627具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3627具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3627具有至少96％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3627具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3627具有至少98％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3627具有至少99％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可具有包含SEQ ID NO:3627的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可具有由SEQ ID NO:3627组成的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3628具有至少80％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3628具有至少85％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3628具有至少90％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3628具有至少95％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3628具有至少96％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3628具有至少97％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3628具有至少98％同一性的核酸序列。在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可包含与SEQ ID NO:3628具有至少99％同一性的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可具有包含SEQ ID NO:3628的核酸序列。
在一些实施方案中，编码例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸可具有由SEQ ID NO:3628组成的核酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含有包含SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的对应于位置138-743的氨基酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列的VP2蛋白。在一些实施方案中，AAV衣壳包含有包含SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的对应于位置203-743的氨基酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列的VP3蛋白。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体(例如本文所述的AAV衣壳变体)的AAV衣壳多肽包含SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的氨基酸序列或与其具有至少80％(例如至少约85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体(例如本文所述的AAV衣壳变体)的AAV衣壳多肽包含具有SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列。
在一些实施方案中，AAV颗粒的例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽可包含与本文所述的氨基酸序列中的任一者具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性或作为SEQ ID NO:3636-3647中的任一者提供的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽可包含与SEQ IDNO:3636-3647中的任一者具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV衣壳(例如VP1)可包含与SEQ ID NO:3636-3647中的任一者具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3636-3647中的任一者具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3636-3647中的任一者具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3636-3647中的任一者具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3636-3647中的任一者具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3636-3647中的任一者具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3636-3647中的任一者具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽可具有包含SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体(例如VP1)的AAV衣壳多肽可具有由SEQ ID NO:3636-3647中的任一者组成的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3636具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3636具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3636具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3636具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ IDNO:3636具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3636具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3636具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3636具有至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可具有包含SEQ ID NO:3636的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV衣壳变体包含SEQ ID NO:3636的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可具有由SEQ ID NO:3636组成的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含作为SEQ ID NO:3636给出的氨基酸序列的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽是由包含SEQ ID NO:3623的核酸序列编码。在一些实施方案中，包含作为SEQ ID NO:3636给出的氨基酸序列的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽是由与SEQ IDNO:3623具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的经密码子优化的核酸序列编码。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3637具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3637具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3637具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3637具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ IDNO:3637具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3637具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3637具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3637具有至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可具有包含SEQ ID NO:3637的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV衣壳变体包含SEQ ID NO:3637的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可具有由SEQ ID NO:3637组成的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含作为SEQ ID NO:3637给出的氨基酸序列的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽是由包含SEQ ID NO:3624或3625的核酸序列编码。在一些实施方案中，包含作为SEQ ID NO:3637给出的氨基酸序列的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽是由与SEQID NO:3624或3625具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的经密码子优化的核酸序列编码。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3638具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3638具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳可包含与SEQ ID NO:3638具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3638具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3638具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3638具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3638具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3638具有至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可具有包含SEQ ID NO:3638的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV衣壳变体包含SEQ ID NO:3638的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可具有由SEQ ID NO:3638组成的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含作为SEQ ID NO:3638给出的氨基酸序列的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽是由包含SEQ ID NO:3626的核酸序列编码。在一些实施方案中，包含作为SEQ ID NO:3638给出的氨基酸序列的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽是由与SEQ IDNO:3626具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的经密码子优化的核酸序列编码。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3639具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3639具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3639具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3639具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ IDNO:3639具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3639具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3639具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3639具有至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可具有包含SEQ ID NO:3639的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV衣壳变体包含SEQ ID NO:3639的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可具有由SEQ ID NO:3639组成的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含作为SEQ ID NO:3639给出的氨基酸序列的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽是由包含SEQ ID NO:3627的核酸序列编码。在一些实施方案中，包含作为SEQ ID NO:3639给出的氨基酸序列的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽是由与SEQ IDNO:3627具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的经密码子优化的核酸序列编码。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3640具有至少80％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3640具有至少85％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3640具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3640具有至少95％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ IDNO:3640具有至少96％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3640具有至少97％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3640具有至少98％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可包含与SEQ ID NO:3640具有至少99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可具有包含SEQ ID NO:3640的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV衣壳变体包含SEQ ID NO:3640的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽可具有由SEQ ID NO:3640组成的氨基酸序列。
在一些实施方案中，包含作为SEQ ID NO:3640给出的氨基酸序列的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽是由包含SEQ ID NO:3628的核酸序列编码。在一些实施方案中，包含作为SEQ ID NO:3640给出的氨基酸序列的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽是由与SEQ IDNO:3628具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的经密码子优化的核酸序列编码。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽相对于包含SEQID NO:138的氨基酸序列的参考序列的向性来说，具有增加的针对CNS细胞或组织(例如脑细胞、脑组织、脊髓细胞或脊髓组织)的向性。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽转导例如选自齿状核、小脑皮质、大脑皮质、脑干、海马体、丘脑和壳核的脑区。在一些实施方案中，与SEQ IDNO:138的参考序列相比，所述脑区的转导水平高至少5、10、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000或10,000倍。
在一些实施方案中，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽在脑中富集至少约5、6、7、8、9或10倍。在一些实施方案中，与SEQ IDNO:138的参考序列相比，本文所述的AAV衣壳变体在脑中富集至少约20、30、40或50倍。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，本文所述的AAV衣壳变体在脑中富集至少约100、200、300或400倍。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽将增加水平的病毒基因组递送至脑区。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，病毒基因组的水平增加至少5、10、20、30、40或50倍。在一些实施方案中，脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽将增加水平的有效载荷递送至脑区。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，有效载荷的水平增加至少5、10、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000或10,000倍。在一些实施方案中，脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽将增加水平的有效载荷递送至脊髓区。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，有效载荷的水平增加至少10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800或900倍。在一些实施方案中，脊髓区包含颈部区域、胸部区域和/或腰部区域。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽显示相对于在背根神经节(DRG)中转导来说优先在脑区中转导。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽相对于包含SEQID NO:138的氨基酸序列的参考序列的向性来说，具有增加的针对例如心脏细胞或组织的肌肉细胞或组织的向性。在一些实施方案中，AAV衣壳变体将增加水平的有效载荷递送至肌肉区。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，有效载荷增加至少10、15、20、30或40倍。在一些实施方案中，肌肉区包含心脏肌肉区、四头肌区和/或隔膜肌区。在一些实施方案中，肌肉区包含例如心房肌肉区或心室肌肉区的心脏肌肉区。
在一些实施方案中，本公开的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽为分离的，例如重组的。在一些实施方案中，编码本公开的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的多核苷酸为分离的，例如重组的。
在本文所提及和/或描述的DNA和RNA序列中的任一者中，单字母符号具有以下描述：A是腺嘌呤；C是胞嘧啶；G是鸟嘌呤；T是胸腺嘧啶；U是尿嘧啶；W是诸如腺嘌呤或胸腺嘧啶的弱碱基；S是诸如胞嘧啶和鸟嘌呤的强核苷酸；M是诸如腺嘌呤和胞嘧啶的氨基核苷酸；K是诸如鸟嘌呤和胸腺嘧啶的酮基核苷酸；R是嘌呤：腺嘌呤和鸟嘌呤；Y是嘧啶：胞嘧啶和胸腺嘧啶；B是任何非A碱基(例如胞嘧啶、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)；D是任何非C碱基(例如腺嘌呤、鸟嘌呤和胸腺嘧啶)；H是任何非G碱基(例如腺嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)；V是任何非T碱基(例如腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤)；N是任何核苷酸(它不是空位)；并且Z是零。
在本文所提及和/或描述的氨基酸序列中的任一者中，单字母符号具有以下描述：G(Gly)是甘氨酸；A(Ala)是丙氨酸；L(Leu)是亮氨酸；M(Met)是甲硫氨酸；F(Phe)是苯丙氨酸；W(Trp)是色氨酸；K(Lys)是赖氨酸；Q(Gln)是谷氨酰胺；E(Glu)是谷氨酸；S(Ser)是丝氨酸；P(Pro)是脯氨酸；V(Val)是缬氨酸；I(Ile)是异亮氨酸；C(Cys)是半胱氨酸；Y(Tyr)是酪氨酸；H(His)是组氨酸；R(Arg)是精氨酸；N(Asn)是天冬酰胺；D(Asp)是天冬氨酸；T(Thr)是苏氨酸；B(Asx)是天冬氨酸或天冬酰胺；J(Xle)是亮氨酸或异亮氨酸；O(Pyl)是吡咯赖氨酸；U(Sec)是硒半胱氨酸；X(Xaa)是任何氨基酸；并且Z(Glx)是谷氨酰胺或谷氨酸。
本文还提供编码上文所描述的AAV衣壳变体以及包含其的AAV颗粒、载体和细胞中的任一者的多核苷酸序列。
AAV血清型和衣壳
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可包含或衍生自任何天然或重组AAV血清型。AAV血清型的不同之处可在于诸如但不限于包装、向性、转导和免疫原性概况的特征。尽管不希望受理论束缚，但据信在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳蛋白可调节(例如引导)AAV颗粒针对特定组织的向性。
在一些实施方案中，AAV颗粒可具有例如AAV衣壳变体的衣壳蛋白和衍生自其亲本血清型的ITR序列(例如AAV2衣壳和AAV2ITR)。在另一实施方案中，AAV颗粒可以是假型AAV颗粒，其中衣壳蛋白和ITR序列是衍生自不同亲本血清型(例如AAV9衣壳和AAV2 ITR；AAV2/9)。
本公开的AAV颗粒可包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳蛋白，其中亲本序列中插入有肽(例如靶向肽)。亲本衣壳或血清型可包含或衍生自任何天然或重组AAV血清型。如本文所用，”亲本”序列是其中插入有靶向序列的核苷酸或氨基酸序列(例如插入核酸序列中的核苷酸或插入氨基酸序列中的氨基酸序列)。
在某些实施方案中，例如亲本核酸序列的亲本AAV衣壳核苷酸序列是如SEQ IDNO:137中所阐述。在一些实施方案中，亲本AAV衣壳核苷酸序列包含SEQ ID NO:137的核酸序列或至少与其大体上同一(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核酸序列。在一些实施方案中，例如亲本序列的亲本AAV衣壳氨基酸序列是由SEQ ID NO:137的核酸序列或至少与其大体上同一(例如具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核酸序列编码。
在一些实施方案中，亲本AAV衣壳核苷酸序列为SEQ ID NO:137的K449R变体，其中氨基酸序列(核苷酸1345-1347)中的位置449处的编码赖氨酸的密码子(例如AAA或AAG)更换为编码精氨酸的密码子(CGT、CGC、CGA、CGG、AGA、AGG)。在一些实施方案中，K449R变体具有与野生型AAV9相同的功能。
在一些实施方案中，例如亲本氨基酸序列的亲本AAV衣壳氨基酸序列是如SEQ IDNO:138中所阐述。
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在一些实施方案中，亲本序列包含相对于SEQ ID NO:138的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列。在一些实施方案中，亲本序列包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。在一些实施方案中，亲本序列包含位置K449处的取代，例如K449R取代。
在一些实施方案中，例如亲本氨基酸序列的亲本AAV衣壳氨基酸序列是如SEQ IDNO:11中所阐述。在一些实施方案中，亲本序列包含相对于SEQ ID NO:11的氨基酸序列来说包含至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列。在一些实施方案中，亲本序列包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可如Jackson等人(Frontiers in Molecular Neuroscience 9:154(2016))中所述，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，本文所述的亲本AAV衣壳的AAV血清型为PHP.B或AAV9。在一些实施方案中，与当使用更泛在的启动子(例如CBA或CMV)时相比，亲本AAV衣壳或AAV衣壳变体的AAV血清型与突触蛋白启动子配对以增强神经元转导。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳为AAV9或其变体。在一些实施方案中，AAV9衣壳包含氨基酸序列SEQ ID NO:138。在一些实施方案中，AAV9氨基酸序列是由包含SEQ ID NO:137的核苷酸序列编码。在一些实施方案中，AAV9衣壳包含与SEQ ID NO:138至少70％，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，AAV9衣壳包含与SEQ ID NO:137至少70％，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一的核苷酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳为AAV9K449R或其变体。在一些实施方案中，AAV9 K449R衣壳包含氨基酸序列SEQ ID NO:11。在一些实施方案中，AAV9 K449R衣壳包含与SEQ ID NO:11至少70％，诸如70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或大于99％同一的氨基酸序列。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳包含AAVDJ序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳包含AAVDJ8序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳包含AAVrh10序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳包含AAV1序列。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳包含AAVF7/HSC7(WO2016049230的SEQ ID NO:8和27)。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳包含AAVF15/HSC15(WO2016049230的SEQ ID NO:16和33)。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳包含AAVF17/HSC17(WO2016049230的SEQ ID NO:13和35)。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳包含AAV5序列。作为非限制性实例，AAV5序列为美国专利号6,984,517的SEQ ID NO:4，所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽允许静脉内施用后的血脑屏障渗透。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳允许聚焦式超声波(FUS)，例如联合微气泡静脉内施用(FUS-MB)，或MRI引导的FUS联合静脉内施用后的血脑屏障渗透。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳允许增加的向脑区的分布。在一些实施方案中，脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、尾核、齿状核、小脑皮质、大脑皮质、脑干、海马体、丘脑、壳核或其组合。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳显示相对于在背根神经节(DRG)中转导来说优先在脑区中转导。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽允许增加的向脊髓区的分布。在一些实施方案中，脊髓区包含颈部脊髓区域、胸部脊髓区域和/或腰部脊髓区域。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽适用于肌肉内施用和/或肌纤维转导。在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽允许增加的向肌肉区的分布。在一些实施方案中，肌肉区包含心脏肌肉区、四头肌区、隔膜肌区或其组合。在一些实施方案中，肌肉区包含例如心房肌肉区或心室肌肉区的心脏肌肉区。
在一些实施方案中，一个或多个靶向序列插入亲本AAV衣壳序列或例如AAV衣壳变体序列的AAV衣壳多肽序列中。作为非限制性实例，一个靶向序列可插入亲本AAV衣壳序列或AAV衣壳变体序列中。作为非限制性实例，两个靶向序列可插入亲本AAV衣壳序列或AAV衣壳变体序列中。作为非限制性实例，三个靶向序列可插入亲本AAV衣壳序列或AAV衣壳变体序列中。作为非限制性实例，超过三个靶向序列可插入亲本AAV衣壳序列或AAV衣壳变体序列中。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含具有例如表1或表2中所述的氨基酸序列的插入物的亲本AAV衣壳序列。在一些实施方案中，亲本序列可包含至少1个、2个、3个或更多个插入序列。
尽管不希望受理论束缚，但应理解，亲本AAV衣壳序列或例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含VP1区。在一些实施方案中，亲本AAV衣壳序列或AAV衣壳变体包含VP1、VP2和/或VP3区或其任何组合。
在一些实施方案中，用于翻译例如衣壳变体的AAV VP1衣壳蛋白的起始密码子可以是如美国专利号US8163543中所述的CTG、TTG或GTG，所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中。
本公开涉及由衣壳(Cap)基因编码的结构性衣壳蛋白(包括VP1、VP2和VP3)。这些衣壳蛋白形成诸如AAV的病毒载体的蛋白质结构性外壳(即衣壳)。由Cap多核苷酸合成的VP衣壳蛋白一般包括甲硫氨酸作为肽序列中的第一氨基酸(Met1)，所述第一氨基酸与对应Cap核苷酸序列中的起始密码子(AUG或ATG)相关。然而，第一甲硫氨酸(Met1)残基或一般说来任何第一氨基酸(AA1)在多肽合成之后或期间由诸如Met-氨基肽酶的蛋白处理酶裂解是常见的。这一“Met/AA-截断”过程常常与多肽序列中的第二氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、丝氨酸、苏氨酸等)的对应乙酰化相关。Met-截断通常在VP1和VP3衣壳蛋白的情况下发生，但也可在VP2衣壳蛋白的情况下发生。
在Met/AA-截断不完全的情况下，可产生包含病毒衣壳的一种或多种(一种、两种或三种)VP衣壳蛋白的混合物，其中一些可包括Met1/AA1氨基酸(Met+/AA+)并且其中一些可由于Met/AA-截断而缺乏Met1/AA1氨基酸(Met-/AA-)。对于关于衣壳蛋白中的Met/AA-截断的进一步论述，参见Jin等人Direct Liquid Chromatography/Mass SpectrometryAnalysis for Complete Characterization of Recombinant Adeno-Associated VirusCapsid Proteins.Hum Gene Ther Methods.2017年10月28(5):255-267；Hwang等人N-Terminal Acetylation of Cellular Proteins Creates Specific DegradationSignals.Science.2010年2月19日.327(5968):973-977；所述文献的内容各自以全文引用的方式并入本文中。
根据本公开，对例如AAV衣壳变体的衣壳蛋白的提及不限于经截断的(Met-/AA-)或未经截断的(Met+/AA+)，并且在上下文中可指独立衣壳蛋白、包含衣壳蛋白的混合物的病毒衣壳和/或编码、描述、产生或生成本公开的衣壳蛋白的多核苷酸序列(或其片段)。对衣壳蛋白或衣壳多肽(诸如VP1、VP2或VP2)的直接提及也可包含包括Met1/AA1氨基酸的VP衣壳蛋白(Met+/AA+)以及由于Met/AA-截断而缺乏Met1/AA1氨基酸的对应VP衣壳蛋白(Met-/AA-)。
此外，根据本公开，对分别包含或编码一种或多种包括Met1/AA1氨基酸的衣壳蛋白(Met+/AA+)的特异性SEQ ID NO:(蛋白或核酸)的提及应理解为教导缺乏Met1/AA1氨基酸的VP衣壳蛋白，如在评述所述序列时显而易见地，所述序列为仅缺乏第一个所列氨基酸(无论是否为Met1/AA1)的任何序列。
作为非限制性实例，对长度为736个氨基酸并且包括由AUG/ATG起始密码子编码的“Met1”氨基酸的VP1多肽序列(Met+)的提及也可理解为教导长度为735个氨基酸并且不包括736个氨基酸的Met+序列的“Met1”氨基酸的VP1多肽序列(Met-)。作为第二非限制性实例，对长度为736个氨基酸并且包括由任何NNN起始密码子编码的“AA1”氨基酸的VP1多肽序列(AA1+)的提及也可理解为教导长度为735个氨基酸并且不包括736个氨基酸AA1+序列的“AA1”氨基酸的VP1多肽序列(AA1-)。
对由VP衣壳蛋白形成的病毒衣壳的提及(诸如对特异性AAV衣壳血清型的提及)可并有包括Met1/AA1氨基酸的VP衣壳蛋白(Met+/AA1+)、由于Met/AA1-截断而缺乏Met1/AA1氨基酸的对应VP衣壳蛋白(Met-/AA1-)以及其组合(Met+/AA1+和Met-/AA1-)。
作为非限制性实例，AAV衣壳血清型可包括VP1(Met+/AA1+)、VP1(Met-/AA1-)或VP1(Met+/AA1+)与VP1(Met-/AA1-)的组合。AAV衣壳血清型也可包括VP3(Met+/AA1+)、VP3(Met-/AA1-)或VP3(Met+/AA1+)与VP3(Met-/AA1-)的组合；并且也可包括类似的任选的VP2(Met+/AA1)与VP2(Met-/AA1-)的组合。
另外的AAV序列
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽包含以下或亲本AAV衣壳经修饰以使得紧随相对于SEQ ID NO:138编号的位置586、588或589之后AAV衣壳变体或亲本AAV衣壳多肽包含以下：SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的至少3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳不包含紧随相对于SEQ ID NO:138编号的位置586、588或589之后存在、具有对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的至少5个连续氨基酸、属于SEQ ID NO:1-1724中的任一者的插入序列，例如表6中所述。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可包含与本文所述的氨基酸序列中的任一者具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
在本文所述的实施方案中的任一者中，除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置可通过以下来鉴定：提供参考序列与查询序列的比对，其中参考序列为SEQ ID NO:138，并且鉴定对应于查询序列中的位置的残基，查询序列中的所述位置对应于参考序列中的位置586至594。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可由与本文所述的核酸序列中的任一者具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的核酸序列编码。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是AAV9。在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是AAV9hu.14(SEQ IDNO:137或138)。在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是AAV9 K449R(SEQ ID NO:11)。在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是PHP.B(SEQ ID NO:5或6)。在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是PHP.N(SEQ ID NO:4)。在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ IDNO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是VOY101(SEQ ID NO:1或2)。在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是VOY201(SEQ ID NO:3或1724)。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是AAV5。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可选自以下任一者：VOY101、VOY201、AAVPHP.B(PHP.B)、AAVPHP.A(PHP.A)、AAVG2B-26、AAVG2B-13、AAVTH1.1-32、AAVTH1.1-35、AAVPHP.B2(PHP.B2)、AAVPHP.B3(PHP.B3)、AAVPHP.N/PHP.B-DGT、AAVPHP.B-EST、AAVPHP.B-GGT、AAVPHP.B-ATP、AAVPHP.B-ATT-T、AA VPHP.B-DGT-T、AAVPHP.B-GGT-T、AAVPHP.B-SGS、AAVPHP.B-AQP、AAVPHP.B-QQP、AAVPHP.B-SNP(3)、AAVPHP.B-SNP、AAVPHP.B-QGT、AAVPHP.B-NQT、AAVPHP.B-EGS、AAVPHP.B-SGN、AAVPHP.B-EGT、AAVPHP.B-DST、AAVPHP.B-DST、AAV PHP.B-STP、AAVPHP.B-PQP、AAVPHP.B-SQP、AAVPHP.B-QLP、AAVPHP.B-TMP、AAVPHP.B-TTP、AAVPHP.S/G2A12、AAVG2A1 5/G2A3(G2A3)、AAVG2B4(G2B4)、AAVG2B5(G2B5)、PHP.S、AAV1、AAV2、AAV2G9、AAV3、AAV3a、AAV3b、AAV3-3、AAV4、AAV4-4、AAV5、AAV6、AAV6.1、AAV6.2、AAV6.1.2、A AV7、AAV7.2、AAV8、AAV9、AAV9K449R、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84、AAV9.9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV16.3、A AV24.1、AAV27.3、AAV42.12、AAV42-1b、AAV42-2、AAV42-3a、AAV42-3b、AAV42-4、AAV42-5a、AAV42-5b、AAV42-6b、AAV42-8、AAV42-10、AAV42-11、AAV42-12、AAV42-13、AAV42-15、AAV42-aa、AAV43-1、AAV43-12、AAV43-20、AAV43-21、AAV43-23、AAV43-25、AAV43-5、AAV44.1、AAV44.2、AAV44.5、AA V223.1、AAV223.2、AAV223.4、AAV223.5、AAV223.6、AAV223.7、AAV1-7/rh.48、AAV1-8/rh.49、AAV2-15/rh.62、AAV2-3/rh.61、A AV2-4/rh.50、AAV2-5/rh.51、AAV3.1/hu.6、AAV3.1/hu.9、AAV3-9/rh.52、AAV3-11/rh.53、AAV4-8/r11.64、AAV4-9/rh.54、AAV4-19/rh.55、AAV5-3/rh.57、AAV5-22/rh.58、AAV7.3/hu.7、AAV16.8/hu.10、AAV16.12/hu.11、AAV29.3/bb.1、AAV29.5/bb.2、AAV106.1/hu.37、AAV114.3/hu.40、AAV127.2/hu.41、AAV127.5/hu.42、AAV128.3/hu.44、AAV130.4/hu.48、AAV145.1/hu.53、AAV145.5/hu.54、AAV145.6/hu.55、AAV161.10/hu.60、AAV161.6/hu.61、AAV33.12/hu.17、AA V33.4/hu.15、AAV33.8/hu.16、AAV52/hu.19、AAV52.1/hu.20、AAV 58.2/hu.25、AAVA3.3、AAVA3.4、AAVA3.5、AAVA3.7、AAVC1、AAVC2、AAVC5、AAV-DJ、AAV-DJ8、AAVF3、AAVF5、AAVH 2、AAVrh.72、AAVhu.8、AAVrh.68、AAVrh.70、AAVpi.1、AAVpi.3、AAVpi.2、AAVrh.60、AAVrh.44、AAVrh.65、AAVrh.55、AAVr h.47、AAVrh.69、AAVrh.45、AAVrh.59、AAVhu.12、AAVH6、AA VLK03、AAVH-1/hu.1、AAVH-5/hu.3、AAVLG-10/rh.40、AAVLG-4/rh.38、AAVLG-9/hu.39、AAVN721-8/rh.43、AAVCh.5、AAVCh.5R1、AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVCy.5R1、AAV Cy.5R2、AAVCy.5R3、AAVCy.5R4、AAVcy.6、AAVhu.1、AAVhu.2、AAVhu.3、AAVhu.4、AAVhu.5、AAVhu.6、AAVhu.7、AAVhu.9、AAVhu.10、AAVhu.11、AAVhu.13、AAVhu.15、AAVhu.16、AA Vhu.17、AAVhu.18、AAVhu.20、AAVhu.21、AAVhu.22、AAVhu.23.2、AAVhu.24、AAVhu.25、AAVhu.27、AAVhu.28、AAVhu.29、A AVhu.29R、AAVhu.31、AAVhu.32、AAVhu.34、AAVhu.35、AAVh u.37、AAVhu.39、AAVhu.40、AAVhu.41、AAVhu.42、AAVhu.43、AAVhu.44、AAVhu.44R1、AAVhu.44R2、AAVhu.44R3、AAVhu.45、AAVhu.46、AAVhu.47、AAVhu.48、AAVhu.48R1、AAVhu.48R2、AAVhu.48R3、AAVhu.49、AAVhu.51、AAVhu.52、AAVhu.54、AAV hu.55、AAVhu.56、AAVhu.57、AAVhu.58、AAVhu.60、AAVhu.61、AAVhu.63、AAVhu.64、AAVhu.66、AAVhu.67、AAVhu.14/9、AAVhu.t 19、AAVrh.2、AAVrh.2R、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.12、AAVrh.13、AAVrh.13R、AAVrh.14、AAVrh.17、AAVr h.18、AAVrh.19、AAVrh.20、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、A AVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh.37R2、AAVrh.38、AAVr h.39、AAVrh.40、AAVrh.46、AAVrh.48、AAVrh.48.1、AAVrh.48.1.2、AAVrh.48.2、AAVrh.49、AAVrh.51、AAVrh.52、AAVrh.53、AAVrh.54、AAVrh.56、AAVrh.57、AAVrh.58、AAVrh.61、AAVrh.64、AAVrh.64R1、AAVrh.64R2、AAVrh.67、AAVrh.73、AAVrh.74、AA Vrh8R、AAVrh8R A586R突变体、AAVrh8R R533A突变体、AAA V、BAAV、山羊AAV、牛AAV、AAVhE1.1、AAVhEr1.5、AAVh ER1.14、AAVhEr1.8、AAVhEr1.16、AAVhEr1.18、AAVhEr1.35、A AVhEr1.7、AAVhEr1.36、AAVhEr2.29、AAVhEr2.4、AAVhEr2.16、AAVhEr2.30、AAVhEr2.31、AAVhEr2.36、AAVhER1.23、AAVhEr 3.1、AAV2.5T、AAV-PAEC、AAV-LK01、AAV-LK02、AAV-LK03、AAV-LK04、AAV-LK05、AAV-LK06、AAV-LK07、AAV-LK08、A AV-LK09、AAV-LK10、AAV-LK11、AAV-LK12、AAV-LK13、AA V-LK14、AAV-LK15、AAV-LK16、AAV-LK17、AAV-LK18、AAV-LK19、AAV-PAEC2、AAV-PAEC4、AAV-PAEC6、AAV-PAEC7、AAV-PAEC8、AAV-PAEC11、AAV-PAEC12、AAV-2-前体miRNA-101、AAV-8h、AAV-8b、AAV-h、AAV-b、AAV SM 10-2、AAV改组100-1、AAV改组100-3、AAV改组100-7、AAV改组10-2、A AV改组10-6、AAV改组10-8、AAV改组100-2、AAV SM 10-1、AAV SM 10-8、AAV SM 100-3、AAV SM 100-10、BNP61 AAV、BNP62 AAV、BNP63 AAV、AAVrh.50、AAVrh.43、AAVrh.62、A AVrh.48、AAVhu.19、AAVhu.11、AAVhu.53、AAV4-8/rh.64、AAV LG-9/hu.39、AAV54.5/hu.23、AAV54.2/hu.22、AAV54.7/hu.24、AA V54.1/hu.21、AAV54.4R/hu.27、AAV46.2/hu.28、AAV46.6/hu.29、A AV128.1/hu.43、真型AAV(ttAAV)、UPENN AAV 10、日本AAV10血清型、AAV CBr-7.1、AAV CBr-7.10、AAV CBr-7.2、AAV C Br-7.3、AAV CBr-7.4、AAV CBr-7.5、AAV CBr-7.7、AAV CBr-7.8、AAVCBr-B7.3、AAV CBr-B7.4、AAV CBr-E1、AAV CBr-E2、AAV CBr-E3、AAV CBr-E4、AAV CBr-E5、AAV CBr-e5、AAV CBr-E6、AAV CBr-E7、AAV CBr-E8、AAV CHt-1、AAV CHt-2、AAV CHt-3、AAVCHt-6.1、AAV CHt-6.10、AAV CHt-6.5、AAV CHt-6.6、AAV CHt-6.7、AAV CHt-6.8、AAV CHt-P1、AAV CHt-P2、AAV CHt-P5、AAV CHt-P6、AAV CHt-P8、AAV CHt-P9、A AV CKd-1、AAV CKd-10、AAV CKd-2、AAV CKd-3、AAV CKd-4、AAV CKd-6、AAV CKd-7、AAV CKd-8、AAV CKd-B1、AAV CKd-B2、AAV CKd-B3、AAV CKd-B4、AAV CKd-B5、AAV CKd-B6、AAV CKd-B7、AAV CKd-B8、AAV CKd-H1、AAV CK d-H2、AAV CKd-H3、AAV CKd-H4、AAV CKd-H5、AAV CKd-H6、AAV CKd-N3、AAV CKd-N4、AAV CKd-N9、AAV CLg-F1、AAV CLg-F2、AAV CLg-F3、AAV CLg-F4、AAV CLg-F5、AAV CLg-F6、AAV CLg-F7、AAV CLg-F8、AAV CLv-1、AAV CLv1-1、AAV Clv1-10、AAVCLv1-2、AAV CLv-12、AAV CLv1-3、A AV CLv-13、AAV CLv1-4、AAV Clv1-7、AAV Clv1-8、AAVCl v1-9、AAV CLv-2、AAV CLv-3、AAV CLv-4、AAV CLv-6、AA V CLv-8、AAV CLv-D1、AAVCLv-D2、AAV CLv-D3、AAV CL v-D4、AAV CLv-D5、AAV CLv-D6、AAV CLv-D7、AAV CLv-D 8、AAV CLv-E1、AAV CLv-K1、AAV CLv-K3、AAV CLv-K6、A AV CLv-L4、AAV CLv-L5、AAV CLv-L6、AAV CLv-M1、AAV CLv-M11、AAV CLv-M2、AAV CLv-M5、AAV CLv-M6、AAV C Lv-M7、AAVCLv-M8、AAV CLv-M9、AAV CLv-R1、AAV CLv-R2、AAV CLv-R3、AAV CLv-R4、AAV CLv-R5、AAVCLv-R6、AAV CLv-R7、AAV CLv-R8、AAV CLv-R9、AAV CSp-1、AAV CSp-10、AAV CSp-11、AAVCSp-2、AAV CSp-3、AAV CSp-4、A AV CSp-6、AAV CSp-7、AAV CSp-8、AAV CSp-8.10、AAVCSp-8.2、AAV CSp-8.4、AAV CSp-8.5、AAV CSp-8.6、AAV CSp-8.7、AAV CSp-8.8、AAV CSp-8.9、AAV CSp-9、AAV.hu.48R3、AAV.VR-355、AAV3B、AAV4、AAV5、AAVF1/HSC1、AAVF11/HSC11、AAVF12/HSC12、AAVF13/HSC13、AAVF14/HSC14、AAVF15/HSC 15、AAVF16/HSC16、AAVF17/HSC17、AAVF2/HSC2、AAVF3/HS C3、AAVF4/HSC4、AAVF5/HSC5、AAVF6/HSC6、AAVF7/HSC7、AAVF8/HSC8和/或AAVF9/HSC9以及其变体。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如美国公布号US20030138772中所述的序列，所述美国公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAV1(US20030138772的SEQ ID NO:6和64)、AAV2(US20030138772的SEQ ID NO:7和70)、AAV3(US20030138772的SEQ ID NO:8和71)、AAV4(US20030138772的SEQ ID NO:63)、AAV5(US20030138772的SEQ ID NO:114)、AAV6(US20030138772的SEQ ID NO:65)、AAV7(US20030138772的SEQ ID NO:1-3)、AAV8(US20030138772的SEQ ID NO:4和95)、AAV9(US20030138772的SEQ ID NO:5和100)、AAV10(US20030138772的SEQ ID NO:117)、AAV11(US20030138772的SEQ ID NO:118)、AAV12(US20030138772的SEQ ID NO:119)、AAVrh10(US20030138772的SEQ ID NO:81的氨基酸1至738)、AAV16.3(US20030138772 SEQ ID NO:10)、AAV29.3/bb.1(US20030138772 SEQ IDNO:11)、AAV29.4(US20030138772 SEQ ID NO:12)、AAV29.5/bb.2(US20030138772SEQ IDNO:13)、AAV1.3(US20030138772 SEQ ID NO:14)、AAV13.3(US20030138772 SEQ ID NO:15)、AAV24.1(US20030138772 SEQ ID NO:16)、AAV27.3(US20030138772 SEQ ID NO:17)、AAV7.2(US20030138772 SEQ ID NO:18)、AAVC1(US20030138772 SEQ ID NO:19)、AAVC3(US20030138772 SEQ ID NO:20)、AAVC5(US20030138772 SEQ ID NO:21)、AAVF1(US20030138772 SEQ ID NO:22)、AAVF3(US20030138772 SEQ ID NO:23)、AAVF5(US20030138772 SEQ ID NO:24)、AAVH6(US20030138772 SEQ ID NO:25)、AAVH2(US20030138772 SEQ ID NO:26)、AAV42-8(US20030138772 SEQ ID NO:27)、AAV42-15(US20030138772 SEQ ID NO:28)、AAV42-5b(US20030138772 SEQ ID NO:29)、AAV42-1b(US20030138772 SEQ ID NO:30)、AAV42-13(US20030138772 SEQ ID NO:31)、AAV42-3a(US20030138772 SEQ ID NO:32)、AAV42-4(US20030138772 SEQ ID NO:33)、AAV42-5a(US20030138772 SEQ ID NO:34)、AAV42-10(US20030138772 SEQ ID NO:35)、AAV42-3b(US20030138772 SEQ ID NO:36)、AAV42-11(US20030138772 SEQ ID NO:37)、AAV42-6b(US20030138772 SEQ ID NO:38)、AAV43-1(US20030138772 SEQ ID NO:39)、AAV43-5(US20030138772 SEQ ID NO:40)、AAV43-12(US20030138772 SEQ ID NO:41)、AAV43-20(US20030138772 SEQ ID NO:42)、AAV43-21(US20030138772 SEQ ID NO:43)、AAV43-23(US20030138772 SEQ ID NO:44)、AAV43-25(US20030138772 SEQ ID NO:45)、AAV44.1(US20030138772 SEQ ID NO:46)、AAV44.5(US20030138772 SEQ ID NO:47)、AAV223.1(US20030138772 SEQ ID NO:48)、AAV223.2(US20030138772 SEQ ID NO:49)、AAV223.4(US20030138772 SEQ ID NO:50)、AAV223.5(US20030138772 SEQ ID NO:51)、AAV223.6(US20030138772 SEQ ID NO:52)、AAV223.7(US20030138772 SEQ ID NO:53)、AAVA3.4(US20030138772 SEQ ID NO:54)、AAVA3.5(US20030138772 SEQ ID NO:55)、AAVA3.7(US20030138772 SEQ ID NO:56)、AAVA3.3(US20030138772 SEQ ID NO:57)、AAV42.12(US20030138772 SEQ ID NO:58)、AAV44.2(US20030138772 SEQ ID NO:59)、AAV42-2(US20030138772 SEQ ID NO:9)或其变体。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如美国公布号US20150159173中所述的序列，所述美国公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAV2(US20150159173的SEQ ID NO:7和23)、rh20(US20150159173的SEQ ID NO:1)、rh32/33(US20150159173的SEQ ID NO:2)、rh39(US20150159173的SEQ ID NO:3、20和36)、rh46(US20150159173的SEQ ID NO:4和22)、rh73(US20150159173的SEQ ID NO:5)、rh74(US20150159173的SEQ ID NO:6)、AAV6.1(US20150159173的SEQ ID NO:29)、rh.8(US20150159173的SEQ ID NO:41)、rh.48.1(US20150159173的SEQ ID NO:44)、hu.44(US20150159173的SEQ ID NO:45)、hu.29(US20150159173的SEQ ID NO:42)、hu.48(US20150159173的SEQ ID NO:38)、rh54(US20150159173的SEQ ID NO:49)、AAV2(US20150159173的SEQ ID NO:7)、cy.5(US20150159173的SEQ ID NO:8和24)、rh.10(US20150159173的SEQ ID NO:9和25)、rh.13(US20150159173的SEQ ID NO:10和26)、AAV1(US20150159173的SEQ ID NO:11和27)、AAV3(US20150159173的SEQ ID NO:12和28)、AAV6(US20150159173的SEQ ID NO:13和29)、AAV7(US20150159173的SEQ ID NO:14和30)、AAV8(US20150159173的SEQ ID NO:15和31)、hu.13(US20150159173的SEQ ID NO:16和32)、hu.26(US20150159173的SEQ ID NO:17和33)、hu.37(US20150159173的SEQ ID NO:18和34)、hu.53(US20150159173的SEQ ID NO:19和35)、rh.43(US20150159173的SEQ ID NO:21和37)、rh2(US20150159173的SEQ ID NO:39)、rh.37(US20150159173的SEQ ID NO:40)、rh.64(US20150159173的SEQ ID NO:43)、rh.48(US20150159173的SEQ ID NO:44)、ch.5(US20150159173的SEQ ID NO 46)、rh.67(US20150159173的SEQ ID NO:47)、rh.58(US20150159173的SEQ ID NO:48)或其包括但不限于Cy5R1、Cy5R2、Cy5R3、Cy5R4、rh.13R、rh.37R2、rh.2R、rh.8R、rh.48.1、rh.48.2、rh.48.1.2、hu.44R1、hu.44R2、hu.44R3、hu.29R、ch.5R1、rh64R1、rh64R2、AAV6.2、AAV6.1、AAV6.12、hu.48R1、hu.48R2和hu.48R3的变体。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如美国专利号US 7198951中所述的序列，所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAV9(US 7198951的SEQ ID NO:1-3)、AAV2(US 7198951的SEQID NO:4)、AAV1(US 7198951的SEQ ID NO:5)、AAV3(US 7198951的SEQ ID NO:6)和AAV8(US7198951的SEQ ID NO:7)。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如N Pulicherla等人(Molecular Therapy 19(6):1070-1078(2011)，以全文引用的方式并入本文中)所描述的AAV9序列中的突变，所述序列诸如但不限于AAV9.9、AAV9.11、AAV9.13、AAV9.16、AAV9.24、AAV9.45、AAV9.47、AAV9.61、AAV9.68、AAV9.84。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，AAV血清型、亲本AAV衣壳多肽或AAV衣壳变体可以是或具有如美国专利号US 6156303中所述的序列，所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAV3B(US 6156303的SEQ ID NO:1和10)、AAV6(US 6156303的SEQID NO:2、7和11)、AAV2(US 6156303的SEQ ID NO:3和8)、AAV3A(US 6156303的SEQ ID NO:4和9)或其衍生物。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，AAV血清型、亲本AAV衣壳多肽或AAV衣壳变体可以是或具有如美国公布号US20140359799中所述的序列，所述美国公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAV8(US20140359799的SEQ ID NO:1)、AAVDJ(US20140359799的SEQ ID NO:2和3)或其变体。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是AAVDJ或诸如AAVDJ8(或AAV-DJ8)的其变体，如Grimm等人(Journal of Virology 82(12):5887-5911(2008)，以全文引用的方式并入本文中)所描述。在一些实施方案中，AAVDJ8的氨基酸序列可包含两个或更多个突变以便去除肝素结合域(HBD)。在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可包含在美国专利号7,588,772中描述为SEQ ID NO:1的AAV-DJ序列，所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如国际公布号WO1998011244中所述的AAV4的序列，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于AAV4(WO1998011244的SEQ ID NO:1-20)。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有AAV2序列中的突变以生成AAV2G9，如国际公布号WO2014144229中所述并且所述国际公布以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如国际公布号WO2005033321中所述的序列，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAV3-3(WO2005033321的SEQ ID NO:217)、AAV1(WO2005033321的SEQ ID NO:219和202)、AAV106.1/hu.37(WO2005033321的SEQ ID No:10)、AAV114.3/hu.40(WO2005033321的SEQ ID No:11)、AAV127.2/hu.41(WO2005033321的SEQ ID NO:6和8)、AAV128.3/hu.44(WO2005033321的SEQ ID No:81)、AAV130.4/hu.48(WO2005033321的SEQ ID NO:78)、AAV145.1/hu.53(WO2005033321的SEQ ID No:176和177)、AAV145.6/hu.56(WO2005033321的SEQ ID NO:168和192)、AAV16.12/hu.11(WO2005033321的SEQ ID NO:153和57)、AAV16.8/hu.10(WO2005033321的SEQ ID NO:156和56)、AAV161.10/hu.60(WO2005033321的SEQ ID No:170)、AAV161.6/hu.61(WO2005033321的SEQ ID No:174)、AAV1-7/rh.48(WO2005033321的SEQ ID NO:32)、AAV1-8/rh.49(WO2005033321的SEQ ID NOs:103和25)、AAV2(WO2005033321的SEQ ID NO:211和221)、AAV2-15/rh.62(WO2005033321的SEQ ID No:33和114)、AAV2-3/rh.61(WO2005033321的SEQID NO:21)、AAV2-4/rh.50(WO2005033321的SEQ ID No:23和108)、AAV2-5/rh.51(WO2005033321的SEQ ID NO:104和22)、AAV3.1/hu.6(WO2005033321的SEQ ID NO:5和84)、AAV3.1/hu.9(WO2005033321的SEQ ID NO:155和58)、AAV3-11/rh.53(WO2005033321的SEQID NO:186和176)、AAV3-3(WO2005033321的SEQ ID NO:200)、AAV33.12/hu.17(WO2005033321的SEQ ID NO:4)、AAV33.4/hu.15(WO2005033321的SEQ ID No:50)、AAV33.8/hu.16(WO2005033321的SEQ ID No:51)、AAV3-9/rh.52(WO2005033321的SEQ IDNO:96和18)、AAV4-19/rh.55(WO2005033321的SEQ ID NO:117)、AAV4-4(WO2005033321的SEQ ID NO:201和218)、AAV4-9/rh.54(WO2005033321的SEQ ID NO:116)、AAV5(WO2005033321的SEQ ID NO:199和216)、AAV52.1/hu.20(WO2005033321的SEQ ID NO:63)、AAV52/hu.19(WO2005033321的SEQ ID NO:133)、AAV5-22/rh.58(WO2005033321的SEQ IDNo:27)、AAV5-3/rh.57(WO2005033321的SEQ ID NO:105)、AAV5-3/rh.57(WO2005033321的SEQ ID No:26)、AAV58.2/hu.25(WO2005033321的SEQ ID No:49)、AAV6(WO2005033321的SEQ ID NO:203和220)、AAV7(WO2005033321的SEQ ID NO:222和213)、AAV7.3/hu.7(WO2005033321的SEQ ID No:55)、AAV8(WO2005033321的SEQ ID NO:223和214)、AAVH-1/hu.1(WO2005033321的SEQ ID No:46)、AAVH-5/hu.3(WO2005033321的SEQ ID No:44)、AAVhu.1(WO2005033321的SEQ ID NO:144)、AAVhu.10(WO2005033321的SEQ ID NO:156)、AAVhu.11(WO2005033321的SEQ ID NO:153)、AAVhu.12(WO2005033321 SEQ ID NO:59)、AAVhu.13(WO2005033321的SEQ ID NO:129)、AAVhu.14/AAV9(WO2005033321 SEQ ID NO:123和3)、AAVhu.15(WO2005033321的SEQ ID NO:147)、AAVhu.16(WO2005033321 SEQ IDNO:148)、AAVhu.17(WO2005033321的SEQ ID NO:83)、AAVhu.18(WO2005033321的SEQ IDNO:149)、AAVhu.19(WO2005033321的SEQ ID NO:133)、AAVhu.2(WO2005033321的SEQ IDNO:143)、AAVhu.20(WO2005033321的SEQ ID NO:134)、AAVhu.21(WO2005033321的SEQ IDNO:135)、AAVhu.22(WO2005033321的SEQ ID NO:138)、AAVhu.23.2(WO2005033321的SEQ IDNO:137)、AAVhu.24(WO2005033321的SEQ ID NO:136)、AAVhu.25(WO2005033321的SEQ IDNO:146)、AAVhu.27(WO2005033321的SEQ ID NO:140)、AAVhu.29(WO2005033321的SEQ IDNO:132)、AAVhu.3(WO2005033321的SEQ ID NO:145)、AAVhu.31(WO2005033321的SEQ IDNO:121)、AAVhu.32(WO2005033321的SEQ ID NO:122)、AAVhu.34(WO2005033321的SEQ IDNO:125)、AAVhu.35(WO2005033321的SEQ ID NO:164)、AAVhu.37(WO2005033321的SEQ IDNO:88)、AAVhu.39(WO2005033321的SEQ ID NO:102)、AAVhu.4(WO2005033321的SEQ ID NO:141)、AAVhu.40(WO2005033321的SEQ ID NO:87)、AAVhu.41(WO2005033321的SEQ ID NO:91)、AAVhu.42(WO2005033321的SEQ ID NO:85)、AAVhu.43(WO2005033321的SEQ ID NO:160)、AAVhu.44(WO2005033321的SEQ ID NO:144)、AAVhu.45(WO2005033321的SEQ ID NO:127)、AAVhu.46(WO2005033321的SEQ ID NO:159)、AAVhu.47(WO2005033321的SEQ ID NO:128)、AAVhu.48(WO2005033321的SEQ ID NO:157)、AAVhu.49(WO2005033321的SEQ ID NO:189)、AAVhu.51(WO2005033321的SEQ ID NO:190)、AAVhu.52(WO2005033321的SEQ ID NO:191)、AAVhu.53(WO2005033321的SEQ ID NO:186)、AAVhu.54(WO2005033321的SEQ ID NO:188)、AAVhu.55(WO2005033321的SEQ ID NO:187)、AAVhu.56(WO2005033321的SEQ ID NO:192)、AAVhu.57(WO2005033321的SEQ ID NO:193)、AAVhu.58(WO2005033321的SEQ ID NO:194)、AAVhu.6(WO2005033321的SEQ ID NO:84)、AAVhu.60(WO2005033321的SEQ ID NO:184)、AAVhu.61(WO2005033321的SEQ ID NO:185)、AAVhu.63(WO2005033321的SEQ ID NO:195)、AAVhu.64(WO2005033321的SEQ ID NO:196)、AAVhu.66(WO2005033321的SEQ ID NO:197)、AAVhu.67(WO2005033321的SEQ ID NO:198)、AAVhu.7(WO2005033321的SEQ ID NO:150)、AAVhu.8(WO2005033321 SEQ ID NO:12)、AAVhu.9(WO2005033321的SEQ ID NO:155)、AAVLG-10/rh.40(WO2005033321的SEQ ID No:14)、AAVLG-4/rh.38(WO2005033321的SEQ IDNO:86)、AAVLG-4/rh.38(WO2005033321的SEQ ID No:7)、AAVN721-8/rh.43(WO2005033321的SEQ ID NO:163)、AAVN721-8/rh.43(WO2005033321的SEQ ID No:43)、AAVpi.1(WO2005033321 SEQ ID NO:28)、AAVpi.2(WO2005033321 SEQ ID NO:30)、AAVpi.3(WO2005033321 SEQ ID NO:29)、AAVrh.38(WO2005033321的SEQ ID NO:86)、AAVrh.40(WO2005033321的SEQ ID NO:92)、AAVrh.43(WO2005033321的SEQ ID NO:163)、AAVrh.44(WO2005033321 SEQ ID NO:34)、AAVrh.45(WO2005033321 SEQ ID NO:41)、AAVrh.47(WO2005033321 SEQ ID NO:38)、AAVrh.48(WO2005033321的SEQ ID NO:115)、AAVrh.49(WO2005033321的SEQ ID NO:103)、AAVrh.50(WO2005033321的SEQ ID NO:108)、AAVrh.51(WO2005033321的SEQ ID NO:104)、AAVrh.52(WO2005033321的SEQ ID NO:96)、AAVrh.53(WO2005033321的SEQ ID NO:97)、AAVrh.55(WO2005033321 SEQ ID NO:37)、AAVrh.56(WO2005033321的SEQ ID NO:152)、AAVrh.57(WO2005033321的SEQ ID NO:105)、AAVrh.58(WO2005033321的SEQ ID NO:106)、AAVrh.59(WO2005033321 SEQ ID NO:42)、AAVrh.60(WO2005033321 SEQ ID NO:31)、AAVrh.61(WO2005033321的SEQ ID NO:107)、AAVrh.62(WO2005033321的SEQ ID NO:114)、AAVrh.64(WO2005033321的SEQ ID NO:99)、AAVrh.65(WO2005033321 SEQ ID NO:35)、AAVrh.68(WO2005033321 SEQ ID NO:16)、AAVrh.69(WO2005033321 SEQ ID NO:39)、AAVrh.70(WO2005033321 SEQ ID NO:20)、AAVrh.72(WO2005033321 SEQ ID NO:9)或包括但不限于AAVcy.2、AAVcy.3、AAVcy.4、AAVcy.5、AAVcy.6、AAVrh.12、AAVrh.17、AAVrh.18、AAVrh.19、AAVrh.21、AAVrh.22、AAVrh.23、AAVrh.24、AAVrh.25、AAVrh.25/42 15、AAVrh.31、AAVrh.32、AAVrh.33、AAVrh.34、AAVrh.35、AAVrh.36、AAVrh.37、AAVrh14的其变体。变体的非限制性实例包括WO2005033321的SEQ ID NO:13、15、17、19、24、36、40、45、47、48、51-54、60-62、64-77、79、80、82、89、90、93-95、98、100、101、109-113、118-120、124、126、131、139、142、151、154、158、161、162、165-183、202、204-212、215、219、224-236，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，AAV血清型、亲本AAV衣壳多肽或AAV衣壳变体可以是或具有如国际公布号WO2015168666中所述的序列，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAVrh8R(WO2015168666的SEQ ID NO:9)、AAVrh8R A586R突变体(WO2015168666的SEQ ID NO:10)、AAVrh8R R533A突变体(WO2015168666的SEQ ID NO:11)或其变体。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如美国专利号US9233131中所述的序列，所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAVhE1.1(US9233131的SEQ ID NO:44)、AAVhEr1.5(US9233131的SEQ ID NO:45)、AAVhER1.14(US9233131的SEQ ID NO:46)、AAVhEr1.8(US9233131的SEQID NO:47)、AAVhEr1.16(US9233131的SEQ ID NO:48)、AAVhEr1.18(US9233131的SEQ IDNO:49)、AAVhEr1.35(US9233131的SEQ ID NO:50)、AAVhEr1.7(US9233131的SEQ ID NO:51)、AAVhEr1.36(US9233131的SEQ ID NO:52)、AAVhEr2.29(US9233131的SEQ ID NO:53)、AAVhEr2.4(US9233131的SEQ ID NO:54)、AAVhEr2.16(US9233131的SEQ ID NO:55)、AAVhEr2.30(US9233131的SEQ ID NO:56)、AAVhEr2.31(US9233131的SEQ ID NO:58)、AAVhEr2.36(US9233131的SEQ ID NO:57)、AAVhER1.23(US9233131的SEQ ID NO:53)、AAVhEr3.1(US9233131的SEQ ID NO:59)、AAV2.5T(US9233131的SEQ ID NO:42)或其变体。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如美国专利公布号US20150376607中所述的序列，所述美国专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAV-PAEC(US20150376607的SEQ ID NO:1)、AAV-LK01(US20150376607的SEQ ID NO:2)、AAV-LK02(US20150376607的SEQ ID NO:3)、AAV-LK03(US20150376607的SEQ ID NO:4)、AAV-LK04(US20150376607的SEQ ID NO:5)、AAV-LK05(US20150376607的SEQ ID NO:6)、AAV-LK06(US20150376607的SEQ ID NO:7)、AAV-LK07(US20150376607的SEQ ID NO:8)、AAV-LK08(US20150376607的SEQ ID NO:9)、AAV-LK09(US20150376607的SEQ ID NO:10)、AAV-LK10(US20150376607的SEQ ID NO:11)、AAV-LK11(US20150376607的SEQ ID NO:12)、AAV-LK12(US20150376607的SEQ ID NO:13)、AAV-LK13(US20150376607的SEQ ID NO:14)、AAV-LK14(US20150376607的SEQ ID NO:15)、AAV-LK15(US20150376607的SEQ ID NO:16)、AAV-LK16(US20150376607的SEQ ID NO:17)、AAV-LK17(US20150376607的SEQ ID NO:18)、AAV-LK18(US20150376607的SEQ ID NO:19)、AAV-LK19(US20150376607的SEQ ID NO:20)、AAV-PAEC2(US20150376607的SEQ ID NO:21)、AAV-PAEC4(US20150376607的SEQ ID NO:22)、AAV-PAEC6(US20150376607的SEQ ID NO:23)、AAV-PAEC7(US20150376607的SEQ ID NO:24)、AAV-PAEC8(US20150376607的SEQ ID NO:25)、AAV-PAEC11(US20150376607的SEQ ID NO:26)、AAV-PAEC12(US20150376607的SEQ IDNO:27)或其变体。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如美国专利号US9163261中所述的序列，所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于AAV-2-前体miRNA-101(US9163261的SEQ ID NO:1)或其变体。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如美国专利公布号US20150376240中所述的序列，所述美国专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于AAV-8h(US20150376240的SEQ ID NO:6)、AAV-8b(US20150376240的SEQ ID NO:5)、AAV-h(US20150376240的SEQ ID NO:2)、AAV-b(US20150376240的SEQ ID NO:1)或其变体。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如美国专利公布号US20160017295中所述的序列，所述美国专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAV SM 10-2(US20160017295的SEQ ID NO:22)、AAV改组100-1(US20160017295的SEQ ID NO:23)、AAV改组100-3(US20160017295的SEQ IDNO:24)、AAV改组100-7(US20160017295的SEQ ID NO:25)、AAV改组10-2(US20160017295的SEQ ID NO:34)、AAV改组10-6(US20160017295的SEQ ID NO:35)、AAV改组10-8(US20160017295的SEQ ID NO:36)、AAV改组100-2(US20160017295的SEQ ID NO:37)、AAVSM 10-1(US20160017295的SEQ ID NO:38)、AAV SM 10-8(US20160017295的SEQ ID NO:39)、AAV SM 100-3(US20160017295的SEQ ID NO:40)、AAV SM 100-10(US20160017295的SEQ ID NO:41)或其变体。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如美国专利公布号US20150238550中所述的序列，所述美国专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：BNP61 AAV(US20150238550的SEQ ID NO:1)、BNP62 AAV(US20150238550的SEQ ID NO:3)、BNP63 AAV(US20150238550的SEQ ID NO:4)或其变体。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如美国专利公布号US20150315612中所述的序列，所述美国专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAVrh.50(US20150315612的SEQ ID NO:108)、AAVrh.43(US20150315612的SEQ ID NO:163)、AAVrh.62(US20150315612的SEQ ID NO:114)、AAVrh.48(US20150315612的SEQ ID NO:115)、AAVhu.19(US20150315612的SEQ IDNO:133)、AAVhu.11(US20150315612的SEQ ID NO:153)、AAVhu.53(US20150315612的SEQ IDNO:186)、AAV4-8/rh.64(US20150315612的SEQ ID No:15)、AAVLG-9/hu.39(US20150315612的SEQ ID No:24)、AAV54.5/hu.23(US20150315612的SEQ ID No:60)、AAV54.2/hu.22(US20150315612的SEQ ID No:67)、AAV54.7/hu.24(US20150315612的SEQ ID No:66)、AAV54.1/hu.21(US20150315612的SEQ ID No:65)、AAV54.4R/hu.27(US20150315612的SEQID No:64)、AAV46.2/hu.28(US20150315612的SEQ ID No:68)、AAV46.6/hu.29(US20150315612的SEQ ID No:69)、AAV128.1/hu.43(US20150315612的SEQ ID No:80)或其变体。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如国际公布号WO2015121501中所述的序列，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于真型AAV(ttAAV)(WO2015121501的SEQ ID NO:2)、“UPennAAV10”(WO2015121501的SEQ ID NO:8)、“日本AAV10”(WO2015121501的SEQ ID NO:9)或其变体。
根据本公开，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可选自或衍生自各种物种。在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是禽类AAV(AAAV)。在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，AAV血清型、亲本AAV衣壳多肽或AAV衣壳变体可以是或具有如美国专利号US 9238800中所述的序列，所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于AAAV(US 9,238,800的SEQ ID NO:1、2、4、6、8、10、12和14)或其变体。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如美国专利号US 9,193,769中所述的序列，所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于BAAV(US 9193769的SEQ ID NO:1和6)或其变体。在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，AAV血清型、亲本AAV衣壳多肽或AAV衣壳变体可以是包含如美国专利号US7427396中所述的序列的BAAV血清型，所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于BAAV(US7427396的SEQ ID NO:5和6)或其变体。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是山羊AAV。在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，AAV血清型、亲本AAV衣壳多肽或AAV衣壳变体可以是或具有、可以是包含如美国专利号US7427396中所述的序列的山羊AAV血清型，所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于山羊AAV(US7427396的SEQ ID NO:3)或其变体。
在其他实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可经两个或更多个血清型(例如亲本血清型)工程改造为杂交AAV。在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，AAV血清型、亲本AAV衣壳多肽或AAV衣壳变体可以是、可以是包含来自AAV2和AAV9的序列的AAV2G9，例如其中AAV2G9 AAV血清型可以是或具有如美国专利公布号US20160017005中所述的序列，所述美国专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是由具有氨基酸390-627(VP1编号)中的突变的AAV9衣壳库生成的血清型，如Pulicherla等人(Molecular Therapy 19(6):1070-1078(2011)所描述，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。血清型以及对应核苷酸和氨基酸取代可以是但不限于AAV9.1(G1594C；D532H)、AAV6.2(T1418A和T1436X；V473D和I479K)、AAV9.3(T1238A；F413Y)、AAV9.4(T1250C和A1617T；F417S)、AAV9.5(A1235G、A1314T、A1642G、C1760T；Q412R、T548A、A587V)、AAV9.6(T1231A；F411I)、AAV9.9(G1203A、G1785T；W595C)、AAV9.10(A1500G、T1676C；M559T)、AAV9.11(A1425T、A1702C、A1769T；T568P、Q590L)、AAV9.13(A1369C、A1720T；N457H、T574S)、AAV9.14(T1340A、T1362C、T1560C、G1713A；L447H)、AAV9.16(A1775T；Q592L)、AAV9.24(T1507C、T1521G；W503R)、AAV9.26(A1337G、A1769C；Y446C、Q590P)、AAV9.33(A1667C；D556A)、AAV9.34(A1534G、C1794T；N512D)、AAV9.35(A1289T、T1450A、C1494T、A1515T、C1794A、G1816A；Q430L、Y484N、N98K、V606I)、AAV9.40(A1694T、E565V)、AAV9.41(A1348T、T1362C；T450S)、AAV9.44(A1684C、A1701T、A1737G；N562H、K567N)、AAV9.45(A1492T、C1804T；N498Y、L602F)、AAV9.46(G1441C、T1525C、T1549G；G481R、W509R、L517V)、9.47(G1241A、G1358A、A1669G、C1745T；S414N、G453D、K557E、T582I)、AAV9.48(C1445T、A1736T；P482L、Q579L)、AAV9.50(A1638T、C1683T、T1805A；Q546H、L602H)、AAV9.53(G1301A、A1405C、C1664T、G1811T；R134Q、S469R、A555V、G604V)、AAV9.54(C1531A、T1609A；L511I、L537M)、AAV9.55(T1605A；F535L)、AAV9.58(C1475T、C1579A；T492I、H527N)、AAV.59(T1336C；Y446H)、AAV9.61(A1493T；N498I)、AAV9.64(C1531A、A1617T；L511I)、AAV9.65(C1335T、T1530C、C1568A；A523D)、AAV9.68(C1510A；P504T)、AAV9.80(G1441A,；G481R)、AAV9.83(C1402A、A1500T；P468T、E500D)、AAV9.87(T1464C、T1468C；S490P)、AAV9.90(A1196T；Y399F)、AAV9.91(T1316G、A1583T、C1782G、T1806C；L439R、K528I)、AAV9.93(A1273G、A1421G、A1638C、C1712T、G1732A、A1744T、A1832T；S425G、Q474R、Q546H、P571L、G578R、T582S、D611V)、AAV9.94(A1675T；M559L)以及AAV9.95(T1605A；F535L)。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如国际公布号W O2016049230中所述的序列，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAVF1/HSC1(WO2016049230的SEQ ID NO:2和20)、AAVF2/HSC2(WO2016049230的SEQ ID NO:3和21)、AAVF3/HSC3(WO2016049230的SEQ ID NO:5和22)、AAVF4/HSC4(WO2016049230的SEQ ID NO:6和23)、AAVF5/HSC5(WO2016049230的SEQ IDNO:11和25)、AAVF6/HSC6(WO2016049230的SEQ ID NO:7和24)、AAVF7/HSC7(W O2016049230的SEQ ID NO:8和27)、AAVF8/HSC8(WO2016049230的SEQ ID NO:9和28)、AAVF9/HSC9(WO2016049230的SE Q ID NO:10和29)、AAVF11/HSC11(WO2016049230的SEQ ID NO:4和26)、AAVF12/HSC12(WO2016049230的SEQ ID NO:12和30)、AAVF13/HSC13(WO2016049230的SEQ ID NO:14和31)、AAVF14/HSC14(WO2016049230的SEQ ID NO:15和32)、AAVF15/HSC15(WO2016049230的SEQ ID NO:16和33)、AAVF16/HSC16(WO2016049230的SEQ ID NO:17和34)、AAVF17/HSC17(WO2016049230的SEQ ID NO:13和35)或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如美国专利号US8734809中所述的序列，所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAV CBr-E1(US8734809的SEQ ID NO:13和87)、AAV CBr-E2(US8734809的SEQ ID NO:14和88)、AAV CBr-E3(US8734809的SEQ ID NO:15和89)、AAVCBr-E4(US8734809的SEQ ID NO:16和90)、AAV CBr-E5(US8734809的SEQ ID NO:17和91)、AAV CBr-e5(US8734809的SEQ ID NO:18和92)、AAV CBr-E6(US8734809的SEQ ID NO:19和93)、AAV CBr-E7(US8734809的SEQ ID NO:20和94)、AAV CBr-E8(US8734809的SEQ ID NO:21和95)、AAV CLv-D1(US8734809的SEQ ID NO:22和96)、AAV CLv-D2(US8734809的SEQ IDNO:23和97)、AAV CLv-D3(US8734809的SEQ ID NO:24和98)、AAV CLv-D4(US8734809的SEQID NO:25和99)、AAV CLv-D5(US8734809的SEQ ID NO:26和100)、AAV CLv-D6(US8734809的SEQ ID NO:27和101)、AAV CLv-D7(US8734809的SEQ ID NO:28和102)、AAV CLv-D8(US8734809的SEQ ID NO:29和103)、AAV CLv-E1(US8734809的SEQ ID NO:13和87)、AAVCLv-R1(US8734809的SEQ ID NO:30和104)、AAV CLv-R2(US8734809的SEQ ID NO:31和105)、AAV CLv-R3(US8734809的SEQ ID NO:32和106)、AAV CLv-R4(US8734809的SEQ IDNO:33和107)、AAV CLv-R5(US8734809的SEQ ID NO:34和108)、AAV CLv-R6(US8734809的SEQ ID NO:35和109)、AAV CLv-R7(US8734809的SEQ ID NO:36和110)、AAV CLv-R8(US8734809的SEQ ID NO:X和X)、AAV CLv-R9(US8734809的SEQ ID NO:X和X)、AAV CLg-F1(US8734809的SEQ ID NO:39和113)、AAV CLg-F2(US8734809的SEQ ID NO:40和114)、AAVCLg-F3(US8734809的SEQ ID NO:41和115)、AAV CLg-F4(US8734809的SEQ ID NO:42和116)、AAV CLg-F5(US8734809的SEQ ID NO:43和117)、AAV CLg-F6(US8734809的SEQ IDNO:43和117)、AAV CLg-F7(US8734809的SEQ ID NO:44和118)、AAV CLg-F8(US8734809的SEQ ID NO:43和117)、AAV CSp-1(US8734809的SEQ ID NO:45和119)、AAV CSp-10(US8734809的SEQ ID NO:46和120)、AAV CSp-11(US8734809的SEQ ID NO:47和121)、AAVCSp-2(US8734809的SEQ ID NO:48和122)、AAV CSp-3(US8734809的SEQ ID NO:49和123)、AAV CSp-4(US8734809的SEQ ID NO:50和124)、AAV CSp-6(US8734809的SEQ ID NO:51和125)、AAV CSp-7(US8734809的SEQ ID NO:52和126)、AAV CSp-8(US8734809的SEQ ID NO:53和127)、AAV CSp-9(US8734809的SEQ ID NO:54和128)、AAV CHt-2(US8734809的SEQ IDNO:55和129)、AAV CHt-3(US8734809的SEQ ID NO:56和130)、AAV CKd-1(US8734809的SEQID NO:57和131)、AAV CKd-10(US8734809的SEQ ID NO:58和132)、AAV CKd-2(US8734809的SEQ ID NO:59和133)、AAV CKd-3(US8734809的SEQ ID NO:60和134)、AAV CKd-4(US8734809的SEQ ID NO:61和135)、AAV CKd-6(US8734809的SEQ ID NO:62和136)、AAVCKd-7(US8734809的SEQ ID NO:63和137)、AAV CKd-8(US8734809的SEQ ID NO:64和138)、AAV CLv-1(US8734809的SEQ ID NO:35和139)、AAV CLv-12(US8734809的SEQ ID NO:66和140)、AAV CLv-13(US8734809的SEQ ID NO:67和141)、AAV CLv-2(US8734809的SEQ ID NO:68和142)、AAV CLv-3(US8734809的SEQ ID NO:69和143)、AAV CLv-4(US8734809的SEQ IDNO:70和144)、AAV CLv-6(US8734809的SEQ ID NO:71和145)、AAV CLv-8(US8734809的SEQID NO:72和146)、AAV CKd-B1(US8734809的SEQ ID NO:73和147)、AAV CKd-B2(US8734809的SEQ ID NO:74和148)、AAV CKd-B3(US8734809的SEQ ID NO:75和149)、AAV CKd-B4(US8734809的SEQ ID NO:76和150)、AAV CKd-B5(US8734809的SEQ ID NO:77和151)、AAVCKd-B6(US8734809的SEQ ID NO:78和152)、AAV CKd-B7(US8734809的SEQ ID NO:79和153)、AAV CKd-B8(US8734809的SEQ ID NO:80和154)、AAV CKd-H1(US8734809的SEQ IDNO:81和155)、AAV CKd-H2(US8734809的SEQ ID NO:82和156)、AAV CKd-H3(US8734809的SEQ ID NO:83和157)、AAV CKd-H4(US8734809的SEQ ID NO:84和158)、AAV CKd-H5(US8734809的SEQ ID NO:85和159)、AAV CKd-H6(US8734809的SEQ ID NO:77和151)、AAVCHt-1(US8734809的SEQ ID NO:86和160)、AAV CLv1-1(US8734809的SEQ ID NO:171)、AAVCLv1-2(US8734809的SEQ ID NO:172)、AAV CLv1-3(US8734809的SEQ ID NO:173)、AAVCLv1-4(US8734809的SEQ ID NO:174)、AAV Clv1-7(US8734809的SEQ ID NO:175)、AAVClv1-8(US8734809的SEQ ID NO:176)、AAV Clv1-9(US8734809的SEQ ID NO:177)、AAVClv1-10(US8734809的SEQ ID NO:178)、AAV.VR-355(US8734809的SEQ ID NO:181)、AAV.hu.48R3(US8734809的SEQ ID NO:183)或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如国际公布号W O2016065001中所述的序列，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAV CHt-P2(WO2016065001的SEQ ID NO:1和51)、AAVCHt-P5(WO2016065001的SEQ ID NO:2和52)、AAV CHt-P9(WO2016065001的SEQ ID NO:3和53)、AAV CBr-7.1(WO2016065001的SEQ ID NO:4和54)、AAV CBr-7.2(WO2016065001的SEQID NO:5和55)、AAV CBr-7.3(WO2016065001的SEQ ID NO:6和56)、AAV CBr-7.4(WO2016065001的SEQ ID NO:7和57)、AAV CBr-7.5(WO2016065001的SEQ ID NO:8和58)、AAV CBr-7.7(WO2016065001的SEQ ID NO:9和59)、AAV CBr-7.8(WO2016065001的SEQ IDNO:10和60)、AAV CBr-7.10(WO2016065001的SEQ ID NO:11和61)、AAV CKd-N3(WO2016065001的SEQ ID NO:12和62)、AAV CKd-N4(WO2016065001的SEQ ID NO:13和63)、AAV CKd-N9(WO2016065001的SEQ ID NO:14和64)、AAV CLv-L4(WO2016065001的SEQ IDNO:15和65)、AAV CLv-L5(WO2016065001的SEQ ID NO:16和66)、AAV CLv-L6(WO2016065001的SEQ ID NO:17和67)、AAV CLv-K1(WO2016065001的SEQ ID NO:18和68)、AAV CLv-K3(WO2016065001的SEQ ID NO:19和69)、AAV CLv-K6(WO2016065001的SEQ ID NO:20和70)、AAV CLv-M1(WO2016065001的SEQ ID NO:21和71)、AAV CLv-M11(WO2016065001的SEQ IDNO:22和72)、AAV CLv-M2(WO2016065001的SEQ ID NO:23和73)、AAV CLv-M5(WO2016065001的SEQ ID NO:24和74)、AAV CLv-M6(WO2016065001的SEQ ID NO:25和75)、AAV CLv-M7(WO2016065001的SEQ ID NO:26和76)、AAV CLv-M8(WO2016065001的SEQ ID NO:27和77)、AAV CLv-M9(WO2016065001的SEQ ID NO:28和78)、AAV CHt-P1(WO2016065001的SEQ IDNO:29和79)、AAV CHt-P6(WO2016065001的SEQ ID NO:30和80)、AAV CHt-P8(WO2016065001的SEQ ID NO:31和81)、AAV CHt-6.1(WO2016065001的SEQ ID NO:32和82)、AAV CHt-6.10(WO2016065001的SEQ ID NO:33和83)、AAV CHt-6.5(WO2016065001的SEQ ID NO:34和84)、AAV CHt-6.6(WO2016065001的SEQ ID NO:35和85)、AAV CHt-6.7(WO2016065001的SEQ IDNO:36和86)、AAV CHt-6.8(WO2016065001的SEQ ID NO:37和87)、AAV CSp-8.10(WO2016065001的SEQ ID NO:38和88)、AAV CSp-8.2(WO2016065001的SEQ ID NO:39和89)、AAV CSp-8.4(WO2016065001的SEQ ID NO:40和90)、AAV CSp-8.5(WO2016065001的SEQ IDNO:41和91)、AAV CSp-8.6(WO2016065001的SEQ ID NO:42和92)、AAV CSp-8.7(WO2016065001的SEQ ID NO:43和93)、AAV CSp-8.8(WO2016065001的SEQ ID NO:44和94)、AAV CSp-8.9(WO2016065001的SEQ ID NO:45和95)、AAV CBr-B7.3(WO2016065001的SEQ IDNO:46和96)、AAV CBr-B7.4(WO2016065001的SEQ ID NO:47和97)、AAV3B(WO2016065001的SEQ ID NO:48和98)、AAV4(WO2016065001的SEQ ID NO:49和99)、AAV5(WO2016065001的SEQID NO:50和100)或其变体或衍生物。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有选自表6中可见的血清型中的任一者的血清型。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有表6中的序列中的任一者的序列、其片段或变体。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可由如表6中所述的序列、片段或变体编码。
表6.AAV序列
Figure BDA0004048892440001741
Figure BDA0004048892440001751
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Figure BDA0004048892440001821
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Figure BDA0004048892440001891
Figure BDA0004048892440001901
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Figure BDA0004048892440001921
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Figure BDA0004048892440001961
Figure BDA0004048892440001971
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Figure BDA0004048892440002011
Figure BDA0004048892440002021
表6中所列的专利、申请和/或公布中的每一者均特此以全文引用的方式并入。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如国际专利公布WO2015038958中所述的序列，所述国际专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAV9(WO2015038958的SEQ ID NO:2和11或本文中相应地SEQ ID NO:138和137)、PHP.B(WO2015038958的SEQ ID NO:8和9、本文中的SEQ ID NO:5和6)、G2B-13(WO2015038958的SEQ ID NO:12、本文中的SEQ ID NO:7)、G2B-26(WO2015038958的SEQ ID NO:13、本文中的SEQ ID NO:5)、TH1.1-32(WO2015038958的SEQID NO:14、本文中的SEQ ID NO:8)、TH1.1-35(WO2015038958的SEQ ID NO:15、本文中的SEQID NO:9)或其变体。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳不包含以下插入序列：紧随相对于SEQ ID NO:138编号的位置586、588或589之后存在；具有对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的至少5个连续氨基酸；属于以下氨基酸序列中的任一者：TLAVPFK(SEQ ID NO:1262)、KFPVALT(SEQ ID NO:1263)、LAVPFK(SEQ IDNO:1264)、AVPFK(SEQ ID NO:1265)、VPFK(SEQ ID NO:1266)、TLAVPF(SEQ ID NO:1267)、TLAVP(SEQ ID NO:1268)、TLAV(SEQ ID NO:1269)、SVSKPFL(SEQ ID NO:1270)、FTLTTPK(SEQ ID NO:1271)、MNATKNV(SEQ ID NO:1272)、QSSQTPR(SEQ ID NO:1273)、ILGTGTS(SEQID NO:1274)、TRTNPEA(SEQ ID NO:1275)、NGGTSSS(SEQ ID NO:1276)或YTLSQGW(SEQ IDNO:1277)；或由以下任一者的核苷酸序列编码：SEQ ID NO:1278、SEQ ID NO:1279、SEQ IDNO:1280、SEQ ID NO:1281、SEQ ID NO:1282、SEQ ID NO:1283、SEQ ID NO:1284、SEQ IDNO:1285、SEQ ID NO:1286或SEQ ID NO:1287。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如国际专利公布WO2017100671中所述的序列，所述国际专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于AAV9(SEQ ID NO:11)、PHP.N(SEQ ID NO:4)、PHP.S(SEQ ID NO:10)或其变体。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳不包含紧随相对于SEQ ID NO:138编号的位置586、588或589之后存在、具有对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的至少5个连续氨基酸、属于WO2017100671中所述的靶向肽或氨基酸插入物的插入序列。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳不包含以下插入序列：紧随相对于SEQ ID NO:138编号的位置586、588或589之后存在；具有对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的至少5个连续氨基酸；属于以下氨基酸序列中的任一者：AQTLAVPFKAQ(SEQ ID NO:1288)、AQSVSKPFLAQ(SEQ ID NO:1289)、AQFTLTTPKAQ(SEQ ID NO:1290)、DGTLAVPFKAQ(SEQ ID NO:1291)、ESTLAVPFKAQ(SEQ IDNO:1292)、GGTLAVPFKAQ(SEQ ID NO:1293)、AQTLATPFKAQ(SEQ ID NO:1294)、ATTLATPFKAQ(SEQ ID NO:1295)、DGTLATPFKAQ(SEQ ID NO:1296)、GGTLATPFKAQ(SEQ ID NO:1297)、SGSLAVPFKAQ(SEQ ID NO:1298)、AQTLAQPFKAQ(SEQ ID NO:1299)、AQTLQQPFKAQ(SEQ IDNO:1300)、AQTLSNPFKAQ(SEQ ID NO:1301)、AQTLAVPFSNP(SEQ ID NO:1302)、QGTLAVPFKAQ(SEQ ID NO:1303)、NQTLAVPFKAQ(SEQ ID NO:1304)、EGSLAVPFKAQ(SEQ ID NO:1305)、SGNLAVPFKAQ(SEQ ID NO:1306)、EGTLAVPFKAQ(SEQ ID NO:1307)、DSTLAVPFKAQ(SEQ IDNO:1308)、AVTLAVPFKAQ(SEQ ID NO:1309)、AQTLSTPFKAQ(SEQ ID NO:1310)、AQTLPQPFKAQ(SEQ ID NO:1311)、AQTLSQPFKAQ(SEQ ID NO:1312)、AQTLQLPFKAQ(SEQ ID NO:1313)、AQTLTMPFKAQ(SEQ ID NO:1314)、AQTLTTPFKAQ(SEQ ID NO:1315)、AQYTLSQGWAQ(SEQ IDNO:1316)、AQMNATKNVAQ(SEQ ID NO:1317)、AQVSGGHHSAQ(SEQ ID NO:1318)、AQTLTAPFKAQ(SEQ ID NO:1319)、AQTLSKPFKAQ(SEQ ID NO:1320)、QAVRTSL(SEQ ID NO:1321)、YTLSQGW(SEQ ID NO:1277)、LAKERLS(SEQ ID NO:1322)、TLAVPFK(SEQ ID NO:1262)、SVSKPFL(SEQID NO:1270)、FTLTTPK(SEQ ID NO:1271)、MNSTKNV(SEQ ID NO:1323)、VSGGHHS(SEQ IDNO:1324)、SAQTLAVPFKAQAQ(SEQ ID NO:1325)、SXXXLAVPFKAQAQ(其中X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:1326)、SAQXXXVPFKAQAQ(其中X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:1327)、SAQTLXXXFKAQAQ(其中X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:1328)、SAQTLAVXXXAQAQ(其中X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:1329)、SAQTLAVPFXXXAQ(其中X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:1330)、TNHQSAQ(SEQ ID NO:1331)、AQAQTGW(SEQ ID NO:1332)、DGTLATPFK(SEQ ID NO:1333)、DGTLATPFKXX(其中X可以是任何氨基酸；SEQ ID NO:1334)、LAVPFKAQ(SEQ ID NO:1335)、VPFKAQ(SEQ ID NO:1336)、FKAQ(SEQ ID NO:1337)、AQTLAV(SEQ ID NO:1338)、AQTLAVPF(SEQ ID NO:1339)、QAVR(SEQ ID NO:1340)、AVRT(SEQ ID NO:1341)、VRTS(SEQID NO:1342)、RTSL(SEQ ID NO:1343)、QAVRT(SEQ ID NO:1344)、AVRTS(SEQ ID NO:1345)、VRTSL(SEQ ID NO:1346)、QAVRTS(SEQ ID NO:1347)、or AVRTSL(SEQ ID NO:1348)；或由以下任一者的核苷酸序列编码：SEQ ID NO:1349、SEQ ID NO:1350、SEQ ID NO:1351、SEQ IDNO:1352、SEQ ID NO:1353、SEQ ID NO:1354、SEQ ID NO:1355、SEQ ID NO:1356、SEQ IDNO:1357、SEQ ID NO:1358(其中N可以是A、C、T或G)、SEQ ID NO:1359(其中N可以是A、C、T或G)、SEQ ID NO:1360(其中N可以是A、C、T或G)、SEQ ID NO:1361(其中N可以是A、C、T或G)、SEQ ID NO:1362(其中N可以是A、C、T或G)、SEQ ID NO:1279、SEQ ID NO:1280、SEQ ID NO:1281、SEQ ID NO:1287或SEQ ID NO:1363。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如美国专利号US 9624274中所述的序列，所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于：AAV1(US9624274的SEQ ID NO:181)、AAV6(US9624274的SEQ IDNO:182)、AAV2(US9624274的SEQ ID NO:183)、AAV3b(US9624274的SEQ ID NO:184)、AAV7(US9624274的SEQ ID NO:185)、AAV8(US9624274的SEQ ID NO:186)、AAV10(US9624274的SEQ ID NO:187)、AAV4(US9624274的SEQ ID NO:188)、AAV11(US9624274的SEQ ID NO:189)、bAAV(US9624274的SEQ ID NO:190)、AAV5(US9624274的SEQ ID NO:191)、GPV(US9624274的SEQ ID NO:192；本文中的SEQ ID NO:879)、B19(US9624274的SEQ ID NO:193；本文中的SEQ ID NO:880)、MVM(US9624274的SEQ ID NO:194；本文中的SEQ ID NO:881)、FPV(US9624274的SEQ ID NO:195；本文中的SEQ ID NO:882)、CPV(US9624274的SEQID NO:196；本文中的SEQ ID NO:883)或其变体。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳不包含紧随相对于SEQ ID NO:138编号的位置586、588或589之后存在、具有对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的至少5个连续氨基酸、属于US 9624274中所述的结构蛋白插入序列中的任一者或以下氨基酸序列中的任一者的插入序列：VNLTWSRASG(SEQ IDNO:1364)、EFCINHRGY WVCGD(SEQ ID NO:1365)、EDGQVMDVDLS(SEQ ID NO:1366)、EKQRNGTLT(SEQ ID NO:1367)、TYQCRVTHPHLPRALMR(SEQ ID NO:1368)、RHSTTQPRKTKGSG(SEQ ID NO:1369)、DSNPRGVSAYLSR(SEQ ID NO:1370)、TITCLWDLAPSK(SEQ ID NO:1371)、KTKGSGFFVF(SEQ ID NO:1372)、THPHLPRALMRS(SEQ ID NO:1373)、GETYQCRVTHPHLPRALMRSTTK(SEQ ID NO:1374)、LPRALMRS(SEQ ID NO:1375)、INHRGYWV(SEQID NO:1376)、CDAGSVRTNAPD(SEQ ID NO:1377)、AKAVSNLTESRSESLQS(SEQ ID NO:1378)、SLTGDEFKKVLET(SEQ ID NO:1379)、REAVAYRFEED(SEQ ID NO:1380)、INPEIITLDG(SEQ IDNO:1381)、DISVTGAPVITATYL(SEQ ID NO:1382)、DISVTGAPVITA(SEQ ID NO:1383)、PKTVSNLTESSSESVQS(SEQ ID NO:1384)、SLMGDEFKAVLET(SEQ ID NO:1385)、QHSVAYTFEED(SEQ ID NO:1386)、INPEIITRDG(SEQ ID NO:1387)、DISLTGDPVITASYL(SEQ ID NO:1388)、DISLTGDPVITA(SEQ ID NO:1389)、DQSIDFEIDSA(SEQ ID NO:1390)、KNVSEDLPLPTFSPTLLGDS(SEQ ID NO:1391)、KNVSEDLPLPT(SEQ ID NO:1392)、CDSGRVRTDAPD(SEQ ID NO:1393)、FPEH LLVDFLQSLS(SEQ ID NO:1394)、DAEFRHDSG(SEQ ID NO:1395)、HYAAAQWDFGNTMCQL(SEQ ID NO:1396)、YAAQWD FGNTMCQ(SEQ ID NO:1397)、RSQKEGLHYT(SEQ ID NO:1398)、SSRTPSDKPVAHWANPQAE(SEQ ID NO:1399)、SRTPSDKPVAHWANP(SEQ ID NO:1400)、SSRTPSDKP(SEQ ID NO:1401)、NADGNVDYHMNSVP(SEQ ID NO:1402)、DGNVDYHMNSV(SEQ ID NO:1403)、RSFKEFLQSSLRALRQ(SEQ ID NO:1404)；FKEFLQSSLRA(SEQ ID NO:1405)或QMWAPQWGPD(SEQID NO:1406)。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，AAV血清型、亲本AAV衣壳多肽或AAV衣壳变体可以是或具有如美国专利号US9475845中所述的序列，所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳不包含紧随相对于SEQ ID NO:138编号的位置586、588或589之后存在、具有对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的至少5个连续氨基酸、属于以下氨基酸序列中的任一者的插入序列：RGNRQA(SEQ ID NO:1407)、SSSTDP(SEQ ID NO:1408)、SSNTAP(SEQ ID NO:1409)、SNSNLP(SEQ ID NO:1410)、SSTTAP(SEQ ID NO:1411)、AANTAA(SEQ ID NO:1412)、QQNTAP(SEQ ID NO:1413)、SAQAQA(n SEQ ID NO:1414)、QANTGP(SEQ ID NO:1415)、NATTAP(SEQ ID NO:1416)、SSTAGP(SEQ ID NO:1417)、QQNTAA(SEQ ID NO:1418)、PSTAGP(SEQ IDNO:1419)、NQNTAP(SEQ ID NO:1420)、QAANAP(SEQ ID NO:1421)、SIVGLP(SEQ ID NO:1422)、AASTAA(SEQ ID NO:1423)、SQNTTA(SEQ ID NO:1424)、QQDTAP(SEQ ID NO:1425)、QTNTGP(SEQ ID NO:1426)、QTNGAP(SEQ ID NO:1427)、QQNAAP(SEQ ID NO:1428)或AANTQA(SEQ ID NO:1429)。
在一些实施方案中，本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳还可包含根据AAV2衣壳蛋白编号的氨基酸位置262至265或具有例如以下氨基酸序列中的任一者的靶向序列的另一AAV的衣壳蛋白中的对应位置的氨基酸修饰(例如取代或插入)：NGRAHA(SEQ ID NO:1430)、QPEHSST(SEQ ID NO:1431)、VNTANST(SEQ ID NO:1432)、HGPMQKS(SEQ ID NO:1433)、PHKPPLA(SEQ ID NO:1434)、IKNNEMW(SEQ ID NO:1435)、RNLDTPM(SEQ ID NO:1436)、VDSHRQS(SEQ ID NO:1437)、YDSKTKT(SEQ ID NO:1438)、SQLPHQK(SEQ ID NO:1439)、STMQQNT(SEQ ID NO:1440)、TERYMTQ(SEQ ID NO:1441)、DASLSTS(SEQ ID NO:1442)、DLPNKKT(SEQ ID NO:1443)、DLTAARL(SEQ ID NO:1444)、EPHQFNY(SEQ ID NO:1445)、EPQSNHT(SEQ ID NO:1446)、MSSWPSQ(SEQ ID NO:1447)、NPKHNAT(SEQ ID NO:1448)、PDGMRTT(SEQ ID NO:1449)、PNNNKTT(SEQ ID NO:1450)、QSTTHDS(SEQ ID NO:1451)、TGSKQKQ(SEQ ID NO:1452)、SLKHQAL(SEQ ID NO:1453)、SPIDGEQ(SEQ ID NO:1454)、WIFPWIQL(SEQ ID NO:1455)、CDCRGDCFC(SEQ ID NO:1456)、CNGRC(SEQ ID NO:1457)、CPRECES(SEQ ID NO:1458)、CTTHWGFTLC(SEQ ID NO:1459)、CGRRAGGSC(SEQ ID NO:1460)、CKGGRAKDC(SEQ ID NO:1461)、CVPELGHEC(SEQ ID NO:1462)、CRRETAWAK(SEQ ID NO:1463)、VSWFSHRYSPFAVS(SEQ ID NO:1464)、GYRDGYAGPILYN(SEQ ID NO:1465)、XXXYXXX(SEQ ID NO:1466)、YXNW(SEQ ID NO:1467)、RPLPPLP(SEQ IDNO:1468)、APPLPPR(SEQ ID NO:1469)、DVFYPYPYASGS(SEQ ID NO:1470)、MYWYPY(SEQ IDNO:1471)、DITWDQLWDLMK(SEQ ID NO:1472)、CWDDXWLC(SEQ ID NO:1473)、EWCEYLGGYLRCYA(SEQ ID NO:1474)、YXCXXGPXTWXCXP(SEQ ID NO:1475)、IEGPTLRQWLAARA(SEQ ID NO:1476)、LWXXX(SEQ ID NO:1477)、XFXXYLW(SEQ ID NO:1478)、SSIISHFRWGLCD(SEQ ID NO:1479)、MSRPACPPNDKYE(SEQ ID NO:1480)、CLRSGRGC(SEQ ID NO:1481)、CHWMFSPWC(SEQ IDNO:1482)、WXXF(SEQ ID NO:1483)、CSSRLDAC(SEQ ID NO:1484)、CLPVASC(SEQ ID NO:1485)、CGFECVRQCPERC(SEQ ID NO:1486)、CVALCREACGEGC(SEQ ID NO:1487)、SWCEPGWCR(SEQ ID NO:1488)、YSGKWGW(SEQ ID NO:1489)、GLSGGRS(SEQ ID NO:1490)、LMLPRAD(SEQID NO:1491)、CSCFRDVCC(SEQ ID NO:1492)、CRDVVSVIC(SEQ ID NO:1493)、MARSGL(SEQ IDNO:1494)、MARAKE(SEQ ID NO:1495)、MSRTMS(SEQ ID NO:1496、KCCYSL(SEQ ID NO:1497)、MYWGDSHWLQYWYE(SEQ ID NO:1498)、MQLPLAT(SEQ ID NO:1499)、EWLS(SEQ ID NO:1500)、SNEW(SEQ ID NO:1501)、TNYL(SEQ ID NO:1502)、WDLAWMFRLPVG(SEQ ID NO:1503)、CTVALPGGYVRVC(SEQ ID NO:1504)、CVAYCIEHHCWTC(SEQ ID NO:1505)、CVFAHNYDYLVC(SEQID NO:1506)、CVFTSNYAFC(SEQ ID NO:1507)、VHSPNKK(SEQ ID NO:1508)、CRGDGWC(SEQ IDNO:1509)、XRGCDX(SEQ ID NO:1510)、PXXX(SEQ ID NO:1511)、SGKGPRQITAL(SEQ ID NO:1512)、AAAAAAAAAXXXXX(SEQ ID NO:1513)、VYMSPF(SEQ ID NO:1514)、ATWLPPR(SEQ IDNO:1515)、HTMYYHHYQHHL(SEQ ID NO:1516)、SEVGCRAGPLQWLCEKYFG(SEQ ID NO:1517)、CGLLPVGRPDRNVWRWLC(SEQ ID NO:1518)、CKGQCDRFKGLPWEC(SEQ ID NO:1519)、SGRSA(SEQID NO:1520)、WGFP(SEQ ID NO:1521)、AEPMPHSLNFSQYLWYT(SEQ ID NO:1522)、WAYXSP(SEQID NO:1523)、IELLQAR(SEQ ID NO:1524)、AYTKCSRQWRTCMTTH(SEQ ID NO:1525)、PQNSKIPGPTFLDPH(SEQ ID NO:1526)、SMEPALPDWWWKMFK(SEQ ID NO:1527)、ANTPCGPYTHDCPVKR(SEQ ID NO:1528)、TACHQHVRMVRP(SEQ ID NO:1529)、VPWMEPAYQRFL(SEQ ID NO:1530)、DPRATPGS(SEQ ID NO:1531)、FRPNRAQDYNTN(SEQ ID NO:1532)、CTKNSYLMC(SEQ ID NO:1533)、CXXTXXXGXGC(SEQ ID NO:1534)、CPIEDRPMC(SEQ ID NO:1535)、HEWSYLAPYPWF(SEQ ID NO:1536)、MCPKHPLGC(SEQ ID NO:1537)、RMWPSSTVNLSAGRR(SEQ ID NO:1538)、SAKTAVSQRVWLPSHRGGEP(SEQ ID NO:1539)、KSREHVNNSACPSKRITAAL(SEQ ID NO:1540)、EGFR(SEQ ID NO:1541)、AGLGVR SEQ ID NO:1542)、GTRQGHTMRLGVSDG(SEQ ID NO:1543)、IAGLATPGWSHWLAL(SEQ ID NO:1544)、SMSIARL(SEQ ID NO:1545)、HTFEPGV(SEQ ID NO:1546)、NTSLKRISNKRIRRK(SEQ ID NO:1547)、LRIKRKRRKRKKTRK(SEQID NO:1548)、GGG、GFS、LWS、EGG、LLV、LSP、LBS、AGG、GRR、GGH和GTV。
在一些实施方案中，在除对应于相对于SEQ ID NO:138编号的位置586至594的5个连续氨基酸以外的位置处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或具有如美国公布号US20160369298中所述的序列，所述美国公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于AAV2(US 20160369298的SEQ ID NO:97；本文中的SEQ IDNO:1549)或其变体的位点特异性突变衣壳蛋白，其中特异性位点是选自VP1或其片段的位点R447、G453和/或S662的至少一个位点。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳还可包含US20160369298中所述的突变序列中的任一者，例如以下序列中的任一者：SDSGASN(SEQ IDNO:1550)、SPSGASN(SEQ ID NO:1551)、SHSGASN(SEQ ID NO:1552)、SRSGASN(SEQ ID NO:1553)、SKSGASN(SEQ ID NO:1554)、SNSGASN(SEQ ID NO:1555)、SGSGASN(SEQ ID NO:1556)、SASGASN(SEQ ID NO:1557)、SESGTSN(SEQ ID NO:1558)、STTGGSN(SEQ ID NO:1559)、SSAGSTN(SEQ ID NO:1560)、NNDSQA(SEQ ID NO:1561)、NNRNQA(SEQ ID NO:1562)、NNNKQA(SEQ ID NO:1563)、NAKRQA(SEQ ID NO:1564)、NDEHQA(SEQ ID NO:1565)、NTSQKA(SEQ ID NO:1566)、YYLSRTNTPSGTDTQSRLVFSQAGA(SEQ ID NO:1567)、YYLSRTNTDSGTETQSGLDFSQAGA(SEQ ID NO:1568)、YYLSRTNTESGTPTQSALEFSQAGA(SEQ IDNO:1569)、YYLSRTNTHSGTHTQSPLHFSQAGA(SEQ ID NO:1570)、YYLSRTNTSSGTITISHLIFSQAGA(SEQ ID NO:1571)、YYLSRTNTRSGIMTKSSLMFSQAGA(SEQ ID NO:1572)、YYLSRTNTKSGRKTLSNLSFSQAGA(SEQ ID NO:1573)、YYLSRTNDGSGPVTPSKLRFSQRGA(SEQ IDNO:1574)、YYLSRTNAASGHATHSDLKFSQPGA(SEQ ID NO:1575)、YYLSRTNGQAGSLTMSELGFSQVGA(SEQ ID NO:1576)、YYLSRTNSTGGNQTTSQLLFSQLSA(SEQ ID NO:1577)、YFLSRTNNNTGLNTNSTLNFSQGRA(SEQ ID NO:1578)、SKTGADNNNSEYSWTG(SEQ ID NO:1579)、SKTDADNNNSEYSWTG(SEQ ID NO:1580)、SKTEADNNNSEYSWTG(SEQ ID NO:1581)、SKTPADNNNSEYSWTG(SEQ ID NO:1582)、SKTHADNNNSEYSWTG(SEQ ID NO:1583)、SKTQADNNNSEYSWTG SEQ ID NO:1584)、SKTIADNNNSEYSWTG(SEQ ID NO:1585)、SKTMADNNNSEYSWTG(SEQ ID NO:1586)、SKTRADNNNSEYSWTG(SEQ ID NO:1587)、SKTNADNNNSEYSWTG(SEQ ID NO:1588)、SKTVGRNNNSEYSWTG(SEQ ID NO:1589)、SKTADRNNNSEYSWTG(SEQ ID NO:1590)、SKKLSQNNNSKYSWQG(SEQ ID NO:1591)、SKPTTGNNNSDYSWPG(SEQ ID NO:1592)、STQKNENNNSNYSWPG(SEQ ID NO:1593)、HKDDEGKF(SEQ ID NO:1594)、HKDDNRKF(SEQ ID NO:1595)、HKDDTNKF(SEQ ID NO:1596)、HEDSDKNF(SEQ ID NO:1597)、HRDGADSF(SEQ ID NO:1598)、HGDNKSRF(SEQ ID NO:1599)、KQGSEKTNVDFEEV(SEQ ID NO:1600)、KQGSEKTNVDSEEV(SEQ ID NO:1601)、KQGSEKTNVDVEEV(SEQ ID NO:1602)、KQGSDKTNVDDAGV(SEQ ID NO:1603)、KQGSSKTNVDPREV(SEQ ID NO:1604)、KQGSRKTNVDHKQV(SEQ ID NO:1605)、KQGSKGGNVDTNRV(SEQ ID NO:1606)、KQGSGEANVDNGDV(SEQ ID NO:1607)、KQDAAADNIDYDHV(SEQ ID NO:1608)、KQSGTRSNAAASSV(SEQ ID NO:1609)、KENTNTNDTELTNV(SEQ ID NO:1610)、QRGNNVAATADVNT(SEQ ID NO:1611)、QRGNNEAATADVNT(SEQ ID NO:1612)、QRGNNPAATADVNT(SEQ ID NO:1613)、QRGNNHAATADVNT(SEQ ID NO:1614)、QEENNIAATPGVNT(SEQ ID NO:1615)、QPPNNMAATHEVNT(SEQ ID NO:1616)、QHHNNSAATTIVNT(SEQ ID NO:1617)、QTTNNRAAFNMVET(SEQ ID NO:1618)、QKKNNNAASKKVAT(SEQ ID NO:1619)、QGGNNKAADDAVKT(SEQ ID NO:1620)、QAAKGGAADDAVKT(SEQ ID NO:1621)、QDDRAAAANESVDT(SEQ ID NO:1622)、QQQHDDAAYQRVHT(SEQ ID NO:1623)、QSSSSLAAVSTVQT(SEQ ID NO:1624)、QNNQTTAAIRNVTT(SEQ ID NO:1625)、NYNKKSDNVDFT(SEQ ID NO:1626)、NYNKKSENVDFT(SEQ ID NO:1627)、NYNKKSLNVDFT(SEQ ID NO:1628)、NYNKKSPNVDFT(SEQ ID NO:1629)、NYSKKSHCVDFT(SEQ ID NO:1630)、NYRKTIYVDFT(SEQ ID NO:1631)、NYKEKKDVHFT(SEQ ID NO:1632)、NYGHRAIVQFT(SEQ IDNO:1633)、NYANHQFVVCT(SEQ ID NO:1634)、NYDDDPTGVLLT(SEQ ID NO:1635)、NYDDPTGVLLT(SEQ ID NO:1636)、NFEQQNSVEWT(SEQ ID NO:1637)、SQSGASN(SEQ ID NO:1638)、NNGSQA(SEQ ID NO:1639)、YYLSRTNTPSGTTTWSRLQFSQAGA(SEQ ID NO:1640)、SKTSADNNNSEYSWTG(SEQ ID NO:1641)、HKDDEEKF(SEQ ID NO:1642)、KQGSEKTNVDIEEV(SEQ ID NO:1643)、QRGNNQAATADVNT(SEQ ID NO:1644)、NYNKKSVNVDFT(SEQ ID NO:1645)、SQSGASNYNTPSGTTTQSRLQFSTSADNNNSEYSWTGATKYH(SEQ ID NO:1646)、SASGASNFNSEGGSLTQSSLGFSTDGENNNSDFSWTGATKYH(SEQ ID NO:1647)、SQSGASNYNTPSGTTTQSRLQFSTDGENNNSDFSWTGATKYH(SEQ IDNO:1648)、SASGASNYNTPSGTTTQSRLQFSTSADNNN SEFSWPGATTYH(SEQ ID NO:1649)、SQSGASNFNSEGGSLTQ SSLGFSTDGENNNSDFSWTGATKYH(SEQ ID NO:1650)、SASGASNYNTPSGSLTQSSLGFSTDGENNNSDFSWTGATKYH(SEQ ID NO:1651)、SQSGASNYNTPSGTTTQSRLQFSTSADNNNSDFSWTGATKYH(SEQ ID NO:1652)、SGAGASNFNSEGGSLTQSSLGF STDGENNNSDFSWTGATKYH(SEQ IDNO:1653)、SGAGASN(SEQ ID NO:1654)、NSEGGSLTQSSLGFS(SEQ ID NO:1655)、TDGENNNSDFS(SEQ ID NO:1656)、SEFSWPGATT(SEQ ID NO:1657)、TSADNNNSDFSWT(SEQ ID NO:1658)、SQSGASNY(SEQ ID NO:1659)、NTPSGTTTQSRLQFS(SEQ ID NO:1660)、TSADNNNSEYSWTGATKYH(SEQ ID NO:1661)、SASGASNF(SEQ ID NO:1662)、TDGENNNSDFSWTGATKYH(SEQ ID NO:1663)、SASGASNY(SEQ ID NO:1664)、TSADNNNSEFSWPGATTYH(SEQ IDNO:1665)、NTPSGSLTQSSLGFS(SEQ ID NO:1666)、TSADNNNSDFSWTGATKYH(SEQ ID NO:1667)、SGAGASNF(SEQ ID NO:1668)、CTCCAGVVSVVSMRSRVCVNSGCAGC TDHCVVSRNSGTCVMSACACAA(SEQ ID NO:1669)、CTCCAGAGAGGCAACAGACAAGCAGCTACCGCAGATGTCAACACACAA(SEQ ID NO:1670)、SAAGASN(SEQ ID NO:1671)、YFLSRTNTESGSTTQSTLRFSQAG(SEQ ID NO:1672)、SKTSADNNNSDFS(SEQ ID NO:1673)、KQGSEKTDVDIDKV(SEQ ID NO:1674)、STAGASN(SEQ IDNO:1675)、YFLSRTNTTSGIETQSTLRFSQAG(SEQ ID NO:1676)、SKTDGENNNSDFS(SEQ ID NO:1677)、KQGAAADDVEIDGV(SEQ ID NO:1678)、SEAGASN(SEQ ID NO:1679)、YYLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAG(SEQ ID NO:1680)、SKTSADNNNSEYS SEQ ID NO:1681)、KQGSEKTNVDIEKV(SEQ ID NO:1682)、YFLSRTNDASGSDTKSTLLFSQAG(SEQ ID NO:1683)、STTPSENNNSEYS(SEQ ID NO:1684)、SAAGATN(SEQ ID NO:1685)、YFLSRTNGEAGSATLSELRFSQAG(SEQ ID NO:1686)、HGDDADRF(SEQ ID NO:1687)、KQGAEKSDVEVDRV(SEQ ID NO:1688)、KQDSGGDNIDIDQV(SEQ ID NO:1689)、SDAGASN(SEQ IDNO:1690)、YFLSRTNTEGGHDTQSTLRFSQAG(SEQ ID NO:1691)、KEDGGGSDVAIDEV(SEQ ID NO:1692)、SNAGASN(SEQ ID NO:1693)和YFLSRTNGEAGSATLSELRFSQPG(SEQ ID NO:1694)；或可编码以下任一者的氨基酸突变位点的核苷酸序列：SEQ ID NO:1695、SEQ ID NO:1696、SEQID NO:1697、SEQ ID NO:1698、SEQ ID NO:1699、SEQ ID NO:1700、SEQ ID NO:1701、SEQ IDNO:1702、SEQ ID NO:1703、SEQ ID NO:1704、SEQ ID NO:1705、SEQ ID NO:1706、SEQ IDNO:1707、SEQ ID NO:1708、SEQ ID NO:1709、SEQ ID NO:1710、SEQ ID NO:1711、SEQ IDNO:1712、SEQ ID NO:1713、SEQ ID NO:1714、SEQ ID NO:1715、SEQ ID NO:1716和SEQ IDNO:1717。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳还可包含眼细胞靶向肽，例如国际专利公布WO2016134375中所述，所述国际专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中，诸如但不限于SEQ ID NO:9；和WO2016134375的SEQ ID NO:10。此外，WO2016134375中所述的眼细胞靶向肽或氨基酸中的任一者可插入诸如但不限于以下的任何亲本AAV衣壳序列中：AAV2(WO2016134375的SEQ ID NO:8；本文中的SEQ ID NO:1718)，或AAV9(WO2016134375的SEQ ID NO:11；本文中的SEQ ID NO:1719)。眼细胞靶向肽可以是但不限于以下氨基酸序列中的任一者：GSTPPPM(SEQ ID NO:1720)或GETRAPL(SEQ ID NO:1721)。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可如美国公布US 20170145405中所述经修饰，所述美国公布的内容以全文引用的方式并入本文中。AAV血清型可包括经修饰的AAV2(例如在Y444F、Y500F、Y730F和/或S662V处的修饰)、经修饰的AAV3(例如在Y705F、Y731F和/或T492V处的修饰)和经修饰的AAV6(例如在S663V和/或T492V处的修饰)。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可如国际公布WO2017083722中所述经修饰，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。AAV血清型可包括AAV1(Y705+731F+T492V)、AAV2(Y444+500+730F+T491V)、AAV3(Y705+731F)、AAV5、AAV 5(Y436+693+719F)、AAV6(VP3变体Y705F/Y731F/T492V)、AAV8(Y733F)、AAV9、AAV9(VP3变体Y731F)和AAV10(Y733F)。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可包含有包含氨基酸SPAKFA(WO2017015102的SEQ ID NO:24；本文中的SEQ ID NO:1722)或NKDKLN(WO2017015102的SEQ ID NO:2；本文中的SEQ ID NO:1723)的经工程改造的表位，如国际专利公布WO2017015102中所述，所述国际专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中。所述表位可插入基于AAV8(WO2017015102的SEQ ID NO:3)的VP1衣壳的编号的氨基酸665至670和/或AAV3B(SEQ ID NO:3)的残基664-668的区域中。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可以是或可具有如国际专利公布WO2017058892中所述的序列，所述国际专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中，所述序列诸如但不限于具有衣壳蛋白的AAV变体，所述衣壳蛋白可包含呈任何组合形式的AAV1的氨基酸残基262-268、370-379、451-459、472-473、493-500、528-534、547-552、709-710、716-722或AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV或禽类AAV中的等效氨基酸残基中的一个或多个(例如2个、3个、4个、5个、6个或7个)处的取代。氨基酸取代可以是但不限于WO2017058892中所述的氨基酸序列中的任一者。在一些实施方案中，AAV可包含以下残基处的氨基酸取代：呈任何组合形式的AAV1(WO2017058892的SEQ ID NO:l)的256L、258K、259Q、261S、263A、264S、265T、266G、272H、385S、386Q、S472R、V473D、N500E 547S、709A、710N、716D、717N、718N、720L、A456T、Q457T、N458Q、K459S、T492S、K493A、S586R、S587G、S588N、T589R和/或722T；呈任何组合形式的AAV5(WO2017058892的SEQ ID NO:5)的244N、246Q、248R、249E、250I、251K、252S、253G、254S、255V、256D、263Y、377E、378N、453L、456R、532Q、533P、535N、536P、537G、538T、539T、540A、541T、542Y、543L、546N、653V、654P、656S、697Q、698F、704D、705S、706T、707G、708E、709Y和/或710R；呈任何组合形式的AAV5(WO2017058892的SEQ ID NO:5)的248R、316V、317Q、318D、319S、443N、530N、531S、532Q 533P、534A、535N、540A、541T、542Y、543L、545G、546N、697Q、704D、706T、708E、709Y和/或710R；呈任何组合形式的AAV6(WO2017058892的SEQ ID NO:6)的264S、266G、269N、272H和/或457Q；呈任何组合形式的AAV8(WO2017058892的SEQ ID NO:8)的457T、459N、496G、499N和/或500N；呈任何组合形式的AAV9(WO2017058892的SEQ ID NO:9)的451I、452N、453G、454S、455G、456Q、457N和/或458Q。
在一些实施方案中，在VP1的位置155、156和157处或在VP2的位置17、18、19和20处，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳可包括如国际公布号WO 2017066764中所述的氨基酸序列，所述国际公布的内容以全文引用的方式并入本文中。氨基酸序列可以是但不限于N-S-S、S-X-S、S-S-Y、N-X-S、N-S-Y、S-X-Y和N-X-Y，其中N、X和Y独立地为但不限于非丝氨酸或非苏氨酸氨基酸，其中AAV可以是但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。在一些实施方案中，AAV可包括VP1的位置156、157或158处或VP2的位置19、20或21处的至少一个氨基酸的缺失，其中AAV可以是但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11和AAV12。
在一些实施方案中，例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽或亲本AAV衣壳还包含由基于Cre重组的AAV靶向演化(CREATE)生成的一种或多种组分，如Deverman等人(NatureBiotechnology34(2):204-209(2016))所描述，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，以这种方式生成的AAV血清型与其他AAV血清型相比具有改进的CNS转导和/或神经元和星形胶质细胞向性。
启动子
在一些实施方案中，包含本公开的新颖衣壳的AAV颗粒也可在下文中称为包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒(例如TRACER AAV颗粒)，其包含至少一个用于增强靶特异性和表达的元件(参见例如Powell等人Viral Expression Cassette Elementsto Enhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy,2015；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)。用于增强靶特异性和表达的元件的非限制性实例包括启动子、内源性miRNA、转录后调节元件(PRE)、多腺苷酸化(PolyA)信号序列和上游增强子(USE)、CMV增强子和内含子。
本领域技术人员可认识到，多肽在靶细胞中的表达可能需要特异性启动子，包括但不限于具有物种特异性、可诱导性、组织特异性或细胞周期特异性的启动子(Parr等人,Nat.Med.3:1145-9(1997)；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，当启动子驱动一种或多种由本文所述的AAV衣壳mRNA编码的多肽的表达时，所述启动子被视为有效的。在一些实施方案中，当启动子驱动一种或多种由封装于本文所述的衣壳内的病毒基因组编码的多肽的表达时，所述启动子被视为有效的。
在一些实施方案中，启动子驱动靶向组织中的多肽(例如AAV衣壳多肽)的表达持续一段时间。由启动子驱动的表达可持续1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3周、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年的时段。表达可持续1-5小时、1-12小时、1-2天、1-5天、1-2周、1-3周、1-4周、1-2个月、1-4个月、1-6个月、2-6个月、3-6个月、3-9个月、4-8个月、6-12个月、1-2年、1-5年、2-5年、3-6年、3-8年、4-8年或5-10年。
在一些实施方案中，启动子驱动多肽(例如AAV衣壳多肽)的表达持续至少1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、11年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、21年、22年、23年、24年、25年、26年、27年、28年、29年、30年、31年、32年、33年、34年、35年、36年、37年、38年、39年、40年、41年、42年、43年、44年、45年、46年、47年、48年、49年、50年、55年、60年、65年或超过65年。
启动子可以是天然存在的或非天然存在的。启动子的非限制性实例包括病毒启动子、植物启动子和哺乳动物启动子。在一些实施方案中，启动子可以是人类启动子。在一些实施方案中，启动子可以是截短的。
驱动或促进大部分组织中的表达的启动子包括但不限于人类延长因子1α-亚单位(EF1α)、巨细胞病毒(CMV)即刻早期增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA；诸如但不限于如Miyazaki等人(Gene.1989年7月15日；79(2):269-77，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)中所述的CBA启动子)和其衍生物CAG、β葡萄糖醛酸酶(GUSB)或泛素C(UBC)。组织特异性表达元件可用于将表达限于某些细胞类型，诸如但不限于肌肉特异性启动子、B细胞启动子、单核细胞启动子、白细胞启动子、巨噬细胞启动子、胰腺腺泡细胞启动子、内皮细胞启动子、肺组织启动子、星形胶质细胞启动子或可用于将表达限于神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞的神经系统启动子。
肌肉特异性启动子的非限制性实例包括哺乳动物肌肉肌酸激酶(MCK)启动子、哺乳动物结蛋白(DES)启动子、哺乳动物肌钙蛋白I(TNNI2)启动子和哺乳动物骨胳α-肌动蛋白(ASKA)启动子(参见例如美国专利公布US20110212529，所述美国专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中)。肌肉特异性启动子也可包括Mb启动子、肌球蛋白启动子、肌萎缩蛋白启动子、dMCK和tMCK。作为非限制性实例，肌肉特异性启动子可用于驱动或促进某些细胞类型(诸如但不限于肌细胞和肌肉干细胞)中的表达。
血液特异性启动子的非限制性实例包括B29启动子、免疫球蛋白重链启动子、CD45启动子、小鼠INF-β启动子、CD45 SV40/CD45启动子、WASP启动子、CD43启动子、CD43 SV40/CD43启动子、CD68启动子、GPIIb启动子、CD14启动子和CD2启动子。作为非限制性实例，血液特异性启动子可用于驱动或促进某些细胞类型(诸如但不限于B细胞、造血细胞、白细胞、血小板、巨噬细胞、巨核细胞、单核细胞和/或T细胞)中的表达。
骨特异性启动子的非限制性实例包括骨钙蛋白、骨唾液蛋白和OG-2启动子。作为非限制性实例，骨特异性启动子可用于驱动或促进于某些细胞类型(诸如但不限于成骨细胞和成牙质细胞)中的表达。
眼特异性启动子的非限制性实例包括Chx10、PrP、Dkk3、Math5、Ptf1a、Pcp2、Nefh、γ-突触核蛋白基因(SNCG)、Grik4、Pdgfra、Chat、Thy1.2、hVmd2、Thy1、经修饰的αA-晶体蛋白、hRgp、mMo、Opn4、RLBP1、Glast、Foxg1、hVmd2、Trp1、Six3、cx36、Grm6-SV40真核启动子、hVmd2、Dct、Rpc65、mRho、Irbp、hRho、Pcp2、视紫红质和mSo。作为非限制性实例，眼特异性启动子可用于驱动或促进某些细胞类型(诸如但不限于视网膜神经元、水平细胞、双极性细胞、神经节细胞(GC)、ONL米勒细胞(ONL Müller cell)、无长突细胞、晶状体细胞、S-锥状细胞、M-锥状细胞、表达视黑素的GC、神经元、双极性ON、视神经细胞、色素细胞、视网膜色素上皮细胞、棒状细胞、棒状双极性细胞和棒状感光受体)中的表达。
心脏特异性启动子的非限制性实例包括MLC2v启动子、αMHC启动子、大鼠肌钙蛋白T(Tnnt2)、Tie2和Tcf21。作为非限制性实例，心脏特异性启动子可用于驱动或促进某些细胞类型(诸如但不限于心肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞)中的表达。
肾特异性启动子的非限制性实例包括ECAD、NKCC2、KSPC、NPHS1和SGLT2。作为非限制性实例，肾特异性启动子可用于驱动或促进某些细胞类型(诸如但不限于集合管细胞、亨利环细胞(loop of Henle cell)、肾元细胞、足细胞和近端管状细胞)中的表达。
肝特异性启动子的非限制性实例包括SV40/bAlb启动子、SV40/hAlb启动子、乙型肝炎病毒核心启动子和甲胎蛋白。作为非限制性实例，肝特异性启动子可用于驱动或促进某些细胞类型(诸如但不限于肝细胞)中的表达。
肺特异性启动子的非限制性实例包括表面活性物质蛋白B启动子和表面活性物质蛋白C启动子。作为非限制性实例，肺特异性启动子可用于驱动或促进某些细胞类型(诸如但不限于AT II细胞和克拉拉细胞(Clara cell))中的表达。
胰腺特异性启动子的非限制性实例包括弹性蛋白酶-1启动子、PDX1启动子和胰岛素启动子。作为非限制性实例，胰腺特异性启动子可用于驱动或促进某些细胞类型(诸如但不限于腺泡细胞、β细胞和朗格汉斯细胞(Langerhans cell))中的表达。
血管或脉管系统特异性启动子的非限制性实例包括Slco1c1、tie、钙黏着蛋白、ICAM-2、密封蛋白1、Cldn5、Flt-1启动子和内皮联蛋白启动子。作为非限制性实例，血管特异性启动子可用于驱动或促进某些细胞类型(诸如内皮细胞)中的表达。作为非限制性实例，内皮细胞为血脑屏障内皮细胞。
用于神经元的组织特异性表达元件的非限制性实例包括神经元特异性烯醇化酶(NSE)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)、突触蛋白(Syn或Syn1)、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)、神经丝轻链(NFL)或重链(NFH)、β球蛋白微小基因nβ2、前脑啡肽原(PPE)、脑啡肽(Enk)、VGF和兴奋性氨基酸转运体2(EAAT2)启动子。用于神经外胚层干细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例为神经上皮干细胞蛋白。
用于星形胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括胶质原纤维酸性蛋白(GFAP、GFabc1D)和EAAT2启动子。用于少突胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子。
在一些实施方案中，启动子可小于1kb。启动子的长度可以是200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超过800个核苷酸。启动子的长度可在200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800之间。
在一些实施方案中，启动子可以是相同或不同起始或亲本启动子(诸如但不限于CMV和CBA)的两种或更多种组分的组合。各组分的长度可以是200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、610、620、630、640、650、660、670、680、690、700、710、720、730、740、750、760、770、780、790、800或超过800。各组分的长度可在200-300、200-400、200-500、200-600、200-700、200-800、300-400、300-500、300-600、300-700、300-800、400-500、400-600、400-700、400-800、500-600、500-700、500-800、600-700、600-800或700-800之间。在一些实施方案中，启动子是382个核苷酸的CMV-增强子序列和260个核苷酸的CBA-启动子序列的组合。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含泛在的启动子。泛在的启动子的非限制性实例包括CMV、CBA(包括衍生物CAG、CB6、CBh等)、EF-1α、PGK、UBC、GUSB(hGBp)和UCOE(HNRPA2B1-CBX3的启动子)。
Yu等人(Molecular Pain 2011,7:63；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)使用慢病毒载体来评估eGFP在CAG、EFIα、PGK和UBC启动子下在大鼠DRG细胞和初级DRG细胞中的表达，并且发现UBC所显示的表达比其他3种启动子弱并且全部启动子皆仅看到10％-12％神经胶质表达。Soderblom等人(E.Neuro 2015；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)评估在运动皮质中注射之后，eGFP在具有CMV和UBC启动子的AAV8中的表达和在具有CMV启动子的AAV2中的表达。鼻内施用含有UBC或EFIα启动子的质粒显示持续气管表达，所述气管表达大于在CMV启动子情况下的表达(参见例如Gill等人,Gene Therapy2001,第8卷,1539-1546；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)。Husain等人(Gene Therapy 2009；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)评估具有hGUSB启动子、HSV-1LAT启动子和NSE启动子的HβH构建体，并且发现与NSE相比，HβH构建体在小鼠脑中所显示的表达较弱。Passini和Wolfe(J.Virol.2001,12382-12392，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)评估在新生小鼠中心室内注射之后HβH载体的长期作用，并且发现存在至少1年的持续表达。Xu等人(Gene Therapy 2001,8,1323-1332；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)发现，当与CMV-lacZ、CMV-luc、EF、GFAP、hENK、nAChR、PPE、PPE+wpre、NSE(0.3kb)、NSE(1.8kb)和NSE(1.8kb+wpre)相比，使用NFL和NFH启动子时，全部脑区中的表达较低。Xu等人发现，启动子活性按降序为NSE(1.8kb)、EF、NSE(0.3kb)、GFAP、CMV、hENK、PPE、NFL和NFH。NFL为650个核苷酸的启动子并且NFH为920个核苷酸的启动子，所述启动子皆不存在于肝中，但NFH在感觉本体感受性神经元、脑和脊髓中是充足的并且NFH存在于心脏中。Scn8a是在DRG、脊髓和脑中表达的470个核苷酸的启动子，并且发现在海马体神经元和小脑浦肯野细胞(Purkinje cell)、皮质、丘脑和下丘脑中的表达尤其高(参见例如Drews等人Identification of evolutionary conserved,functional noncodingelements in the promoter region of the sodium channel gene SCN8A,Mamm Genome(2007)18:723-731；和Raymond等人Expression of Alternatively Spliced SodiumChannelα-subunit genes,Journal of Biological Chemistry(2004)279(44)46234-46241；所述文献中每一者的内容以全文引用的方式并入本文中)。
前述Yu、Soderblom、Gill、Husain、Passini、Xu、Drews或Raymond所教导的启动子中的任一者均可用于本公开中。
在一些实施方案中，启动子为泛在的。在一些实施方案中，启动子不是细胞特异性的。
在一些实施方案中，启动子为泛素c(UBC)启动子。UBC启动子的尺寸可以是300-350个核苷酸。作为非限制性实例，UBC启动子为332个核苷酸。
在一些实施方案中，启动子为β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)启动子。GUSB启动子的尺寸可以是350-400个核苷酸。作为非限制性实例，GUSB启动子为378个核苷酸。
在一些实施方案中，启动子为神经丝轻链(NFL)启动子。NFL启动子的尺寸可以是600-700个核苷酸。作为非限制性实例，NFL启动子为650个核苷酸。
在一些实施方案中，启动子为神经丝重链(NFH)启动子。NFH启动子的尺寸可以是900-950个核苷酸。作为非限制性实例，NFH启动子为920个核苷酸。
在一些实施方案中，启动子为scn8a启动子。scn8a启动子的尺寸可以是450-500个核苷酸。作为非限制性实例，scn8a启动子为470个核苷酸。
在一些实施方案中，启动子为磷酸甘油酸激酶1(PGK)启动子。
在一些实施方案中，启动子为鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子或其变体。
在一些实施方案中，启动子为CB6启动子。
在一些实施方案中，启动子为最小CB启动子。
在一些实施方案中，启动子为P40启动子。在一些实施方案中，P40启动子位于AAV衣壳REP基因的3'中。
在一些实施方案中，启动子为巨细胞病毒(CMV)启动子。
在一些实施方案中，CMV启动子为杂交CMV增强子/鸡β-肌动蛋白启动子序列，诸如由Niwa等人,1991所描述，其内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，启动子为CAG启动子。
在一些实施方案中，启动子为GFAP启动子。
在一些实施方案中，启动子为突触蛋白(syn或syn1)启动子。
在一些实施方案中，启动子为肝或骨胳肌启动子。肝启动子的非限制性实例包括人类α-1-抗胰蛋白酶(hAAT)和甲状腺素结合球蛋白(TBG)。骨胳肌启动子的非限制性实例包括结蛋白、MCK或合成C5-12。
在一些实施方案中，启动子为RNA pol III启动子。作为非限制性实例，RNA polIII启动子为U6。作为非限制性实例，RNA pol III启动子为H1。
在一些实施方案中，启动子可视所需的向性加以选择。启动子的非限制性实例描述于WO2020072683中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，在不存在辅助病毒共同感染的情况下，启动子驱动衣壳mRNA表达。
在一些实施方案中，AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)包含两种启动子。作为非限制性实例，启动子为P40启动子和CMV启动子。作为另一非限制性实例，启动子为P40启动子和细胞类型特异性启动子(例如突触蛋白)。
在一些实施方案中，AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)包含经工程改造的启动子。
在另一实施方案中，AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)包含来自天然表达的蛋白的启动子。
在一些实施方案中，使AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)REP基因的一部分缺失以适应启动子插入。启动子可插入AAV颗粒CAP基因的上游或下游。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)包含用于驱动衣壳mRNA表达的细胞类型特异性启动子。作为非限制性实例，启动子为细胞类型特异性的。细胞类型特异性启动子可以是突触蛋白。细胞类型特异性启动子可以是胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)。AAV颗粒可包含P40启动子和细胞类型特异性启动子。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)包含如图4中所示的结构。在一些实施方案中，替代骨架可用于生成衣壳库。在替代骨架中，正向版本变成反向版本，此举可在体内演化期间避免衣壳蛋白表达和针对这些外来衣壳蛋白的可能免疫反应。在一些实施方案中，也可将一个或多个另外的WPRE元件添加至骨架中以在病毒库RNA回收期间改进RNA产量。在一些实施方案中，用于TRACER方法的骨架是如图5中所示。
AAV选择
本公开提供针对组织和/或细胞类型特异性转导的AAV选择的方法，由此鉴定并且选择具有针对一种或多种组织和/或一种或多种细胞类型的高向性的AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)以供使用。在一些实施方案中，AAV选择包括通过本领域中已知的标准方法(例如静脉内)将AAV颗粒施用于细胞和/或受试者。在一些实施方案中，AAV选择可包含从特异性组织和/或细胞类型提取由AAV颗粒编码的例如衣壳RNA的多核苷酸。在一些实施方案中，组织可以是非神经系统组织，诸如但不限于肝、脾和心脏。细胞类型可以是例如肝细胞、朗格汉斯细胞小岛和心肌细胞。在一些实施方案中，组织可以是神经系统组织，诸如但不限于脑组织、脊髓组织和背根神经节组织。细胞类型可以是例如神经元、星形胶质细胞或少突胶质细胞。在一些实施方案中，所提取的RNA经富集、反转录和/或扩增。在一些实施方案中，所提取的RNA允许使用例如反转录聚合酶链反应(RT-PCR)的各种生产方法从特异性组织和/或细胞类型回收一个或多个全长衣壳“扩增子”。如本文所用，扩增子可指形成为例如PCR的扩增事件产物的RNA或DNA的任何片段。在一些实施方案中，全长衣壳扩增子可用作下一代测序(NGS)库生成的模板。全长衣壳扩增子可用于克隆至DNA库中以生成AAV TRACER颗粒来进行任何另外的轮数的如上文所描述的AAV选择。在一些实施方案中，AAV选择可反复或重复执行任何次数或轮数。更一般说来，上文所描述的AAV颗粒选择也可在本文中称为生物淘选。
在一些实施方案中，AAV选择包括通过本领域中已知的标准方法(例如感染)将AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)施用于细胞。作为非限制性实例，细胞为HEK293细胞。作为另一非限制性实例，细胞为神经系统细胞，诸如但不限于神经元和/或胶质细胞。作为另一非限制性实例，细胞为脑微血管内皮细胞(BMVEC)。BMVEC可以是人类BMVEC(hBMVEC)。BMVEC可以是非人类灵长类动物(NHP)BMVEC。
在一些实施方案中，AAV选择包括通过本领域中已知的标准方法(例如静脉内)将AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)施用于啮齿动物。啮齿动物可以是转基因啮齿动物或非转基因(例如野生型)啮齿动物。作为非限制性实例，啮齿动物为大鼠或小鼠。大鼠的非限制性实例包括史泊格多利(Sprague Dawley)大鼠、威斯达白化(Wistar Albino)大鼠和长伊凡氏(Long Evans)大鼠。小鼠的非限制性实例包括BALB/C、FVB和C57BL/6小鼠。
在一些实施方案中，AAV选择包括通过本领域中已知的标准方法(例如静脉内)将AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)施用于非人类灵长类动物(NHP)。NHP的非限制性实例包括恒河猴(rhesus macaque/Macaca mulatta)和食蟹猴(cynomolgus macaque/Macaca fascicularis)。
在一些实施方案中，AAV选择包括将AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)施用于啮齿动物、非人类灵长类动物和/或人类细胞。在一些实施方案中，AAV选择包括将AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)施用于啮齿动物、非人类灵长类动物和/或人类受试者。
在一些实施方案中，AAV选择可在单细胞或受试者类型内反复或重复执行任何次数或轮数，其中单细胞或受试者类型可在AAV选择轮中保持不变或相同。细胞类型可以是例如HEK293细胞、hBMVEC和NHP BMVEC。受试者类型可以是例如史泊格多利大鼠、威斯达白化大鼠、长伊凡氏大鼠、BALB/C小鼠、FVB小鼠、C57BL/6小鼠、恒河猴、食蟹猴和人类。作为非限制性实例，AAV选择是在hBMVEC细胞中在一轮、两轮和/或三轮或更多轮AAV选择中执行。作为非限制性实例，AAV选择是在诸如但不限于BALB/C小鼠的小鼠中在一轮、两轮和/或三轮或更多轮中执行。作为非限制性实例，AAV选择是在诸如但不限于食蟹猴的NHP中在一轮、两轮和/或三轮或更多轮中执行，如图1A和图1B中所展现。
AAV选择可在任何数目的细胞类型和/或受试者类型内反复或重复执行任何次数或轮数，其中细胞类型和/或受试者类型可在AAV选择轮中变化或不同。作为非限制性实例，AAV选择是在恒河猴中执行第一轮，并且在史泊格多利大鼠中执行另外的(例如后续的)一轮、两轮和/或三轮或更多轮。
AAV选择可在任何数目的细胞类型和/或受试者类型内反复或重复执行任何次数或轮数，并且可另外在任何AAV选择轮时包含如本文所公开的任何AAV衣壳血清型或其变体或衍生物与AAV颗粒池的组合和/或比较。作为非限制性实例，AAV衣壳血清型包含AAVF7/HSC7(WO2016049230的SEQ ID NO:8和27)。作为另一非限制性实例，AAV衣壳血清型包含AAVF15/HSC15(WO2016049230的SEQ ID NO:16和33)。作为另一非限制性实例，AAV衣壳血清型包含AAVF17/HSC17(WO2016049230的SEQ ID NO:13和35)。AAV选择轮可以是第一、第二、第三或第四AAV选择轮。
正交演化
本公开的AAV选择的方法可包含正交演化。在一些实施方案中，正交演化为一种方法，其中在一组任何数目的可来自不同物种和/或品系的细胞类型和/或受试者类型中施用AAV颗粒以用于第一轮如本文所述的AAV选择，并且其中在一组任何数目的可来自不同物种和/或品系的细胞类型和/或受试者类型中或在一组任何数目的可来自相同物种和/或品系的细胞类型和/或受试者类型中执行任何另外的(例如后续的)AAV选择轮，如图2中所展现。细胞类型可以是例如HEK293细胞、hBMVEC和NHP BMVEC。受试者类型可以是例如史泊格多利大鼠、威斯达白化大鼠、长伊凡氏大鼠、BALB/C小鼠、FVB小鼠、C57BL/6小鼠、恒河猴、食蟹猴和人类。
AAV颗粒的病毒基因组
包含肽(例如靶向肽)和/或通过TRACER方法选择的如本文所述的AAV颗粒(例如包含本文所述的AAV衣壳多肽(例如AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体)的AAV颗粒)可用于将病毒基因组递送至例如靶组织(例如CNS、DRG和/或肌肉)的组织。在一些实施方案中，包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒可用于将病毒基因组递送至例如CNS、DRG或肌肉细胞或组织的组织或细胞。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒为重组AAV颗粒。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒为分离的AAV颗粒。
病毒基因组可编码任何有效载荷，诸如但不限于多肽(例如治疗性多肽)、抗体、酶、RNAi剂和/或基因编辑系统的组分。在一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒是用于在静脉内递送之后将有效载荷递送至CNS细胞。在另一实施方案中，本文所述的AAV颗粒是用于在静脉内递送之后将有效载荷递送至DRG细胞。在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒是用于在静脉内递送之后将有效载荷递送至例如心脏肌肉细胞的肌肉细胞。
包含如本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒的病毒基因组包含具有至少一个编码有效载荷的有效载荷区和至少一个ITR的核酸序列。病毒基因组通常包含两个ITR序列，5'端和3'端中的每一者处各一个。此外，本文所述的AAV颗粒的病毒基因组可包含用于另外的组分的核酸序列，诸如但不限于调节元件(例如启动子)、非翻译区(UTR)、多腺苷酸化序列(polyA)、充填序列或填充序列、内含子和/或接头序列，以增强表达。
这些病毒基因组组分可经选择和/或经工程改造以进一步调适靶组织(例如CNS、肌肉或DRG)中的给定有效载荷的特异性和表达效率。
病毒基因组组分：反向末端重复序列(ITR)
在一些实施方案中，包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒包含具有至少一个ITR和一个有效载荷区的病毒基因组。在一个实施方案中，病毒基因组具有两个ITR。这两个ITR在5'端和3'端处侧接有效载荷区。ITR充当包含用于复制的识别位点的复制起点。ITR包含可互补并且对称布置的序列区。并入如本文所述的病毒基因组中的ITR可包含天然存在的多核苷酸序列或以重组方式衍生的多核苷酸序列。
ITR可衍生自与例如衣壳变体的衣壳多肽相同的血清型，所述血清型是选自已知血清型中的任一者或其衍生物。ITR可具有与衣壳不同的血清型。在一个实施方案中，AAV颗粒具有超过一个ITR。在一非限制性实例中，AAV颗粒具有包含两个ITR的病毒基因组。在一个实施方案中，ITR具有彼此相同的血清型。在另一实施方案中，ITR具有不同血清型。非限制性实例包括具有与衣壳相同的血清型的ITR中的零个、一个或两个。在一个实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组的两个ITR均为AAV2 ITR。
独立地，各ITR的长度可以是约100至约150个核苷酸。ITR的长度可以是约100-105个核苷酸，长度可以是约106-110个核苷酸，长度可以是约111-115个核苷酸，长度可以是约116-120个核苷酸，长度可以是约121-125个核苷酸，长度可以是约126-130个核苷酸，长度可以是约131-135个核苷酸，长度可以是约136-140个核苷酸，长度可以是约141-145个核苷酸或长度可以是约146-150个核苷酸。在一个实施方案中，ITR的长度为140-142个核苷酸。ITR长度的非限制性实例为102、105、130、140、141、142、145个核苷酸长度。本公开所涵盖的ITR包括与已知AAV血清型ITR序列具有至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的ITR。
病毒基因组组分：启动子
在一个实施方案中，病毒基因组的有效载荷区包含至少一个用于增强有效载荷靶特异性和表达的元件(参见例如Powell等人Viral Expression Cassette Elements toEnhance Transgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy,2015；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)。用于增强有效载荷靶特异性和表达的元件的非限制性实例包括启动子、内源性miRNA、转录后调节元件(PRE)、多腺苷酸化(PolyA)信号序列和上游增强子(USE)、CMV增强子和内含子。
本领域技术人员可认识到，有效载荷在靶细胞中的表达可能需要特异性启动子，包括但不限于具有物种特异性、可诱导性、组织特异性或细胞周期特异性的启动子(Parr等人,Nat.Med.3:1145-9(1997)；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一个实施方案中，当启动子驱动由AAV颗粒的病毒基因组编码的有效载荷的表达时，所述启动子被视为有效的。
在一个实施方案中，当启动子驱动于所靶向的细胞中的表达时，所述启动子是被视为有效的启动子。
在一个实施方案中，启动子是具有针对所靶向的细胞的向性的启动子。
在一个实施方案中，启动子驱动有效载荷在靶向组织中的表达持续一段时间。由启动子驱动的表达可持续1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、8天、9天、10天、11天、12天、13天、2周、15天、16天、17天、18天、19天、20天、3周、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、13个月、14个月、15个月、16个月、17个月、18个月、19个月、20个月、21个月、22个月、23个月、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年或超过10年的时段。表达可持续1-5小时、1-12小时、1-2天、1-5天、1-2周、1-3周、1-4周、1-2个月、1-4个月、1-6个月、2-6个月、3-6个月、3-9个月、4-8个月、6-12个月、1-2年、1-5年、2-5年、3-6年、3-8年、4-8年或5-10年。作为非限制性实例，启动子经选择用于有效载荷在中枢或周围神经系统的组织和/或细胞中的持续表达。
启动子可以是天然存在的或非天然存在的。启动子的非限制性实例包括衍生自病毒、植物、哺乳动物或人类的启动子。在一些实施方案中，启动子可以是衍生自人类细胞或系统的启动子。在一些实施方案中，启动子可以是截短的或突变的。
驱动或促进大部分组织中的表达的启动子包括但不限于人类延长因子1α-亚单位(EF1α)启动子、巨细胞病毒(CMV)即刻早期增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)启动子和其衍生物CAG、β葡萄糖醛酸酶(GUSB)启动子或泛素C(UBC)启动子。组织特异性启动子可用于将表达限于某些细胞类型，诸如但不限于中枢或周围神经系统的细胞、其内的靶向区域(例如额叶皮质)和/或其中的细胞子组(例如兴奋性神经元)。作为非限制性实例，细胞类型特异性启动子可用于将有效载荷的表达限于兴奋性神经元(例如谷氨酸性)、抑制性神经元(例如GABA能)、交感或副交感神经系统的神经元、感觉神经元、背根神经节的神经元、运动神经元或诸如小神经胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞和/或施万细胞(Schwanncell)的神经系统的支持细胞。
还存在用于身体其他组织的细胞类型特异性启动子，其中非限制性实例包括肝启动子(例如hAAT、TBG)、骨胳肌特异性启动子(例如结蛋白、MCK、C512)、B细胞启动子、单核细胞启动子、白细胞启动子、巨噬细胞启动子、胰腺腺泡细胞启动子、内皮细胞启动子、肺组织启动子和/或心脏或心血管启动子(例如αMHC、cTnT和CMV-MLC2k)。
用于将有效载荷表达靶向中枢神经系统组织和细胞的组织特异性启动子的非限制性实例包括突触蛋白(Syn)、谷氨酸囊泡转运体(VGLUT)、囊泡GABA转运体(VGAT)、小清蛋白(PV)、钠离子通道Nav 1.8、酪氨酸羟化酶(TH)、胆碱乙酰基转移酶(ChaT)、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)、神经丝轻链(NFL)或重链(NFH)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、β球蛋白微小基因nβ2、前脑啡肽原(PPE)、脑啡肽(Enk)和兴奋性氨基酸转运体2(EAAT2)启动子。用于星形胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和EAAT2启动子。用于少突胶质细胞的组织特异性表达元件的非限制性实例包括髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子。
在一些实施方案中，用于驱动有效载荷在靶组织中的表达的病毒基因组的启动子可以是本文所指出的用于AAV颗粒中的启动子中的任一者。
病毒基因组组分：非翻译区(UTR)
在一些实施方案中，基因的野生型非翻译区(UTR)经转录，但未经翻译。一般说来，5'UTR起始于转录起始位点并且结束于起始密码子，并且3'UTR紧随终止密码子之后起始并且一直延续到转录终止信号。
通常可见于特异性靶器官(例如CNS组织、肌肉或DRG)的充分表达的基因中的特征可经工程改造至UTR中以增强稳定性和蛋白产生。作为非限制性实例，通常表达于脑中的来自mRNA的5'UTR(例如亨廷顿蛋白)可用于本文所述的AAV颗粒的病毒基因组中以增强神经元细胞或中枢神经系统的其他细胞中的表达。
尽管不希望受理论束缚，但野生型5'非翻译区(UTR)包括在翻译起始时起作用的特征。通常已知参与使核糖体启动许多基因的翻译的过程的Kozak序列通常包括于5'UTR中。Kozak序列具有共同CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(ATG)上游三个碱基处的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后为另一‘G’。
在一个实施方案中，病毒基因组中的5'UTR包括Kozak序列。
在一个实施方案中，病毒基因组中的5'UTR不包括Kozak序列。
尽管不希望受理论束缚，但已知野生型3'UTR中嵌有腺苷和尿苷的延伸部。这些富AU标签尤其普遍存在于转换率高的基因中。富AU元件(ARE)基于其序列特点和功能特性而可分成三类(Chen等人,1995，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)：I类ARE，诸如但不限于c-Myc和MyoD，在富U区内含有AUUUA基序的数个分散拷贝。II类ARE，诸如但不限于GM-CSF和TNF-a，具有两个或更多个重叠UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。III类ARE，诸如但不限于c-Jun和成肌素(Myogenin)，定义不太明确。这些富U区不含AUUUA基序。已知大部分结合至ARE的蛋白使信使去稳定，而已记录到ELAV家族成员(最显著地为HuR)增加mRNA的稳定性。HuR结合至所有三类的ARE。将HuR特异性结合位点工程改造至核酸分子的3'UTR中将引起HuR结合，并且因此引起体内消息稳定。
3'UTR富AU元件(ARE)的引入、去除或修饰可用于调节多核苷酸的稳定性。在对例如病毒基因组的有效载荷区的特异性多核苷酸进行工程改造时，可引入ARE的一个或多个拷贝以降低多核苷酸的稳定性，并且由此减少所得蛋白的翻译并且减少其产生。同样，可鉴定出ARE并且将其去除或使其突变以增加细胞内稳定性，并且因此增加所得蛋白的翻译和产生。
在一个实施方案中，病毒基因组的3'UTR可包括用于模板化添加poly-A尾的oligo(dT)序列。
在一个实施方案中，病毒基因组可包括至少一个miRNA种子、结合位点或完整序列。微小RNA(或miRNA或miR)是结合至核酸靶的位点并且通过降低核酸分子稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达的19-25个核苷酸的非编码RNA。在一些实施方案中，微小RNA序列包含例如成熟微小RNA的位置2-8的区域中的序列的种子区，所述种子区与核酸的miRNA靶序列具有Watson-Crick序列完全或部分互补性。
在一个实施方案中，病毒基因组可经工程改造以包括、更改或去除至少一个miRNA结合位点、完整序列或种子区。
来自本领域中已知的任何基因的任何UTR均可并入AAV颗粒的病毒基因组中。这些UTR或其部分可以与选出它们的基因相同的取向放置，或其取向或位置可更改。在一个实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组中所用的UTR可倒置、缩短、延长、用本领域中已知的一个或多个其他5'UTR或3'UTR制造。如本文所用，术语“更改”在与UTR相关时意指UTR已以某种方式相对于参考序列发生变化。举例说来，3'UTR或5'UTR可如上文所教导通过改变取向或位置而相对于野生型或天然UTR发生更改，或可通过包括另外的核苷酸、核苷酸缺失、核苷酸交换或转位而发生更改。
在一个实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组包含至少一个人工UTR，所述人工UTR不为野生型UTR的变体。
在一个实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组包含选自转录物家族的UTR，所述转录物家族的蛋白具有共同的功能、结构、特点或特性。
病毒基因组组分：多腺苷酸化序列
本文所述的AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的病毒基因组可包含至少一个多腺苷酸化序列。在一个实施方案中，AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的病毒基因组包含介于有效载荷编码区的3'端与3'ITR的5'端之间的多腺苷酸化序列。
在一个实施方案中，多腺苷酸化序列或“polyA序列”的长度可在不存在核苷酸至约500个核苷酸的范围内。在一些实施方案中，polyA序列包含约100-600个核苷酸，例如约100-500个核苷酸、约100-400个核苷酸、约100-300个核苷酸、约100-200个核苷酸、约200-600个核苷酸、约200-500个核苷酸、约200-400个核苷酸、约200-300个核苷酸、约300-600个核苷酸、约300-500个核苷酸、约300-400个核苷酸、约400-600个核苷酸、约400-500个核苷酸或约500-600个核苷酸的长度。在一些实施方案中，polyA信号区包含约100至150个核苷酸，例如约127个核苷酸的长度。在一些实施方案中，polyA序列包含约450至500个核苷酸，例如约477个核苷酸的长度。在一些实施方案中，polyA序列包含约520至约560个核苷酸，例如约552个核苷酸的长度。在一些实施方案中，polyA序列包含约127个核苷酸的长度。
病毒基因组组分：内含子
在一个实施方案中，如本文所述的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的病毒基因组包含至少一个用于增强有效载荷靶特异性和表达的元件(诸如内含子)(参见例如Powell等人Viral Expression Cassette Elements to EnhanceTransgene Target Specificity and Expression in Gene Therapy,Discov.Med,2015,19(102):49-57；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)。内含子的非限制性实例包括MVM(67-97bp)、F.IX截短内含子1(300bp)、β球蛋白SD/免疫球蛋白重链剪接受体(250bp)、腺病毒剪接供体/免疫球蛋白剪接受体(500bp)、SV40晚期剪接供体/剪接受体(19S/16S)(180bp)和杂交腺病毒剪接供体/IgG剪接受体(230bp)。
在一个实施方案中，内含子或内含子部分的长度可以是100-500个核苷酸。内含子的长度可以是80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490或500个核苷酸。内含子的长度可在80-100、80-120、80-140、80-160、80-180、80-200、80-250、80-300、80-350、80-400、80-450、80-500、200-300、200-400、200-500、300-400、300-500或400-500个之间的核苷酸。
病毒基因组组分：填充序列
在一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的病毒基因组包含至少一个用于改进包装效率和表达的元件(诸如填充序列或充填序列)。填充序列的非限制性实例包括白蛋白和/或α-1抗胰蛋白酶。任何已知的病毒序列、哺乳动物序列或植物序列可经操纵以用作填充序列。
在一个实施方案中，填充序列或充填序列的长度可以是约100-3500个核苷酸。填充序列的长度可以是约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900或3000个核苷酸。
病毒基因组组分：miRNA
在一个实施方案中，病毒基因组包含至少一个编码miRNA的序列以减少有效载荷在“脱靶”组织中的表达。如本文所用，“脱靶”指示本文所述的AAV颗粒无意靶向的组织类型或细胞类型。miRNA和其靶向组织为本领域中众所周知的。例如，“脱靶”组织或细胞在靶向DRG(背根神经节)时可以是其他神经节的神经元，诸如交感或副交感神经系统的那些。在一些实施方案中，例如miR183、miR182和/或miR96的miRNA可在病毒基因组中经编码以调节(例如减少)病毒基因组在DRG神经元中的表达。作为另一非限制性实例，miR-122miRNA可在病毒基因组中经编码以调节(例如减少)病毒基因组在肝中的表达。在一些实施方案中，例如miR-142-3p的miRNA可在病毒基因组中经编码以调节(例如减少)病毒基因组在包括例如免疫细胞(例如抗原呈递细胞或APC，包括树突状细胞(DC)、巨噬细胞和B淋巴细胞)的造血谱系的细胞或组织中的表达。
病毒基因组组分：miR结合位点
本公开的AAV病毒颗粒的组织或细胞特异性表达可通过引入例如启动子、增强子、微小RNA结合位点(例如脱靶位点)的组织或细胞特异性调节序列来增强。在不希望受理论束缚的情况下，据信miR结合位点可基于对应内源性微小RNA(miRNA)或对应受控外源性miRNA在例如非靶向细胞或组织的组织或细胞中的表达来调节(例如阻碍、遏制或另外抑制)所关注的基因在本公开的病毒基因组上的表达。在一些实施方案中，miR结合位点调节(例如减少)由本文所述的AAV颗粒的病毒基因组编码的有效载荷在对应mRNA表达的细胞或组织中的表达。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒的病毒基因组包含微小RNA结合位点，例如脱靶位点。在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒的病毒基因组包含用于miR结合位点、微小RNA结合位点系列(miR BSs)或其反向补体的编码序列。
在一些实施方案中，miR结合位点系列或miR结合位点位于病毒基因组的3'-UTR区(例如相对于编码有效载荷的核酸序列的3')中，例如在polyA序列之前，位于病毒基因组的5'-UTR区(例如相对于编码有效载荷的核酸序列的5')中，或两者。
在一些实施方案中，miR结合位点系列包含miR结合位点(miR BS)的至少1-5个拷贝，例如至少1-3、2-4、3-5、1、2、3、4、5个或更多个拷贝。在一些实施方案中，全部拷贝皆为相同的，例如包含相同miR结合位点。在一些实施方案中，miR结合位点系列内的miR结合位点为连续的并且未由间隔子隔开。在一些实施方案中，miR结合位点系列内的miR结合位点是由例如非编码序列的间隔子隔开。在一些实施方案中，间隔子的核苷酸长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。在一些实施方案中，间隔子包含(i)GGAT、(ii)CACGTG、(iii)GCATGC中的一者或多者或(i)-(iii)中的一者或多者的重复序列。
在一些实施方案中，miR结合位点系列包含miR结合位点(miR BS)的至少1-5个拷贝，例如至少1-3、2-4、3-5、1、2、3、4、5个或更多个拷贝。在一些实施方案中，所述拷贝中的至少1、2、3、4、5个或全部为不同的，例如包含不同miR结合位点。在一些实施方案中，miR结合位点系列内的miR结合位点为连续的并且未由间隔子隔开。在一些实施方案中，miR结合位点系列内的miR结合位点是由例如非编码序列的间隔子隔开。在一些实施方案中，间隔子的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。在一些实施方案中，间隔子包含(i)GGAT、(ii)CACGTG、(iii)GCATGC中的一者或多者或(i)-(iii)中的一者或多者的重复序列。
在一些实施方案中，miR结合位点与宿主细胞中的miR大体上同一(例如至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％同一)。在一些实施方案中，miR结合位点与宿主细胞中的miR包含至少1、2、3、4或5个错配或不超过6、7、8、9或10个错配。在一些实施方案中，错配核苷酸为相连的。在一些实施方案中，错配核苷酸为非相连的。在一些实施方案中，错配核苷酸存在于miR结合位点的种子区结合序列外部，诸如存在于miR结合位点的一或两端处。在一些实施方案中，miR结合位点与宿主细胞中的miR 100％同一。
在一些实施方案中，miR结合位点或序列区的长度为至少约10至约125个核苷酸，例如长度为至少约10至50个核苷酸、10至100个核苷酸、50至100个核苷酸、50至125个核苷酸或100至125个核苷酸。在一些实施方案中，miR结合位点或序列区的长度为至少约7至约28个核苷酸，例如长度为至少约8-28个核苷酸、7-28个核苷酸、8-18个核苷酸、12-28个核苷酸、20-26个核苷酸、22个核苷酸、24个核苷酸或26个核苷酸，并且其任选地包含至少一个与miRNA(例如miR122、miR142、miR183)的种子序列互补的连续区(例如7或8个核苷酸)。
在一些实施方案中，miR结合位点与诸如miR122的在肝或肝细胞中表达的miR互补。在一些实施方案中，miR结合位点或miR结合位点系列包含miR122结合位点序列。在一些实施方案中，miR122结合位点包含ACAAACACCATTGTCACACTCCA(SEQ ID NO:3672)的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3672具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性或具有SEQ ID NO:3672的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列，例如其中修饰可能会导致miR结合位点与对应miRNA之间的错配。在一些实施方案中，miR122结合位点包含miR122结合位点的至少3、4或5个拷贝，任选地包含以下核苷酸序列：ACAAACACCATTGTCACACTCCACACAAACACCATTGTCACAC TCCACACAAACACCATTGTCACACTCCA(SEQ ID NO:3673)，或与SEQ ID NO:3673具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性或具有SEQ ID NO:3673的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的序列，例如其中修饰可能会导致miR结合位点与对应miRNA之间的错配。在一些实施方案中，miR122结合位点中的至少两个直接连接，例如不经间隔子连接。在其他实施方案中，miR122结合位点中的至少两个是由长度为例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的间隔子隔开，所述间隔子位于两个或更多个连续miR122结合位点序列之间。在实施方案中，间隔子的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。在一些实施方案中，间隔子包含(i)GGAT、(ii)CACGTG、(iii)GCATGC中的一者或多者或其重复序列。在一些实施方案中，miR结合位点系列包含具有或不具有间隔子的miR122结合位点的至少3-5个拷贝，例如4个拷贝，其中间隔子的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。
在一些实施方案中，miR结合位点与在包括免疫细胞(例如抗原呈递细胞或APC，包括树突状细胞(DC)、巨噬细胞和B淋巴细胞)的造血谱系中表达的miR互补。在一些实施方案中，miR结合位点与在包含例如US 2018/0066279中所公开的核苷酸序列的造血谱系中表达的miR互补，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，miR结合位点或miR结合位点系列包含miR-142-3p结合位点序列。在一些实施方案中，miR-142-3p结合位点包含TCCATAAAGTAGGAAACACTACA(SEQ ID NO:3674)的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3674具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性或具有SEQ ID NO:3674的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的序列，例如其中修饰可能会导致miR结合位点与对应miRNA之间的错配。在一些实施方案中，miR-142-3p结合位点包含miR-142-3p结合位点的至少3、4或5个拷贝。在一些实施方案中，miR结合位点系列包含具有或不具有间隔子的miR-142-3p结合位点的至少3-5个拷贝，例如4个拷贝，其中间隔子的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。
在一些实施方案中，miR结合位点与在DRG(背根神经节)神经元(例如miR183、miR182和/或miR96结合位点)中表达的miR互补。在一些实施方案中，miR结合位点与在包含例如WO2020/132455中所公开的核苷酸序列的DRG神经元中表达的miR互补，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，miR结合位点或miR结合位点系列包含miR183结合位点序列。在一些实施方案中，miR183结合位点包含
Figure BDA0004048892440002421
(SEQID NO:3675)的核苷酸序列或与SEQ ID NO:3675具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性或具有SEQ ID NO:3675的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的序列，例如其中修饰可能会导致miR结合位点与对应miRNA之间的错配。在一些实施方案中，与种子序列互补的序列对应于miR-183结合位点序列中的双下划线。在一些实施方案中，miR183结合位点包含miR183结合位点的至少3、4或5个拷贝。在一些实施方案中，miR结合位点系列包含具有或不具有间隔子的miR183结合位点的至少3-5个拷贝，例如4个拷贝，其中间隔子的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。
在一些实施方案中，miR结合位点或miR结合位点系列包含miR182结合位点序列。在一些实施方案中，miR182结合位点包含AGTGTGAGTTCTACCATTGCCAAA(SEQ ID NO:3676)的核苷酸序列、与SEQ ID NO:3676具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性或具有SEQ ID NO:3676的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的序列，例如其中修饰可能会导致miR结合位点与对应miRNA之间的错配。在一些实施方案中，miR182结合位点包含miR182结合位点的至少3、4或5个拷贝。在一些实施方案中，miR结合位点系列包含具有或不具有间隔子的miR182结合位点的至少3-5个拷贝，例如4个拷贝，其中间隔子的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。
在某些实施方案中，miR结合位点或miR结合位点系列包含miR96结合位点序列。在一些实施方案中，miR96结合位点包含AGCAAAAATGTGCTAGTGCCAAA(SEQ ID NO:3677)的核苷酸序列、与SEQ ID NO:3677具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、至少95％、至少99％或100％序列同一性或具有SEQ ID NO:3677的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的序列，例如其中修饰可能会导致miR结合位点与对应miRNA之间的错配。在一些实施方案中，miR96结合位点包含miR96结合位点的至少3、4或5个拷贝。在一些实施方案中，miR结合位点系列包含具有或不具有间隔子的miR96结合位点的至少3-5个拷贝，例如4个拷贝，其中间隔子的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。
在一些实施方案中，miR结合位点系列包含miR122结合位点、miR142结合位点、miR183结合位点、miR182结合位点、miR 96结合位点或其组合。在一些实施方案中，miR结合位点系列包含miR122结合位点、miR142结合位点、miR183结合位点、miR182结合位点、miR96结合位点或其组合的至少3、4或5个拷贝。在一些实施方案中，miR结合位点中的至少两个直接连接，例如不经间隔子连接。在其他实施方案中，miR结合位点中的至少两个是由长度为例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的间隔子隔开，所述间隔子位于两个或更多个连续miR结合位点序列之间。在实施方案中，间隔子的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。在一些实施方案中，间隔子包含(i)GGAT、(ii)CACGTG、(iii)GCATGC中的一者或多者或(i)-(iii)中的一者或多者的重复序列。在一些实施方案中，miR结合位点系列包含具有或不具有间隔子的miR122结合位点、miR142结合位点、miR183结合位点、miR182结合位点、miR96结合位点中的至少两个、三个、四个、五个或全部的组合的至少3-5个拷贝，例如4个拷贝，其中间隔子的长度为至少约5至10个核苷酸，例如约7-8个核苷酸。
病毒基因组组分：可选标记物
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的病毒基因组任选地编码可选标记物。所述可选标记物可包含细胞表面标记物，诸如在细胞表面上表达的任何蛋白，包括但不限于受体、CD标记物、凝集素、整合素或其截短版本。
在一些实施方案中，可选标记物报告基因描述于国际公布号WO1996023810和WO1996030540；Heim等人,Current Biology 2:178-182(1996)；Heim等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)；或Heim等人,Science 373:663-664(1995)中，所述文献中每一者的内容以全文引用的方式并入本文中。
基因组尺寸
在一个实施方案中，本文所述的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可包含单链或双链病毒基因组。病毒基因组的尺寸可以是小尺寸、中等尺寸、大尺寸或最大尺寸。如上文所描述，病毒基因组可包含启动子和polyA尾。
在一个实施方案中，病毒基因组可以是小单链病毒基因组。小单链病毒基因组的尺寸可以是2.1至3.5kb，诸如但不限于尺寸可以是约2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4和3.5kb。
在一个实施方案中，病毒基因组可以是小双链病毒基因组。小双链病毒基因组的尺寸可以是1.3至1.7kb，诸如但不限于尺寸可以是约1.3、1.4、1.5、1.6和1.7kb。
在一个实施方案中，病毒基因组可以是中型单链病毒基因组。中型单链病毒基因组的尺寸可以是3.6至4.3kb，诸如但不限于尺寸可以是约3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2和4.3kb。
在一个实施方案中，病毒基因组可以是中型双链病毒基因组。中型双链病毒基因组的尺寸可以是1.8至2.1kb，诸如但不限于尺寸可以是约1.8、1.9、2.0和2.1kb。
在一个实施方案中，病毒基因组可以是大单链病毒基因组。大单链病毒基因组的尺寸可以是4.4至6.0kb，诸如但不限于尺寸可以是约4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9和6.0kb。
在一个实施方案中，病毒基因组可以是大双链病毒基因组。大双链病毒基因组的尺寸可以是2.2至3.0kb，诸如但不限于尺寸可以是约2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9和3.0kb。
有效载荷
本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)包含具有至少一个有效载荷区的病毒基因组。在一些实施方案中，有效载荷区可以是本文所述的AAV颗粒的病毒基因组内的编码有效载荷的核酸序列，其中有效载荷为RNAi剂或多肽。本公开的有效载荷可以是但不限于肽、多肽、蛋白、抗体、RNAi剂等。
在一些实施方案中，有效载荷区可包含编码核酸序列与非编码核酸序列的组合。在一些实施方案中，有效载荷区可对编码RNA或非编码RNA进行编码。
在一个实施方案中，AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)包含具有编码超过一种所关注的有效载荷的有效载荷区的病毒基因组。在此类实施方案中，编码超过一种有效载荷的病毒基因组可经复制并且包装于病毒颗粒中。经包含超过一种有效载荷的病毒颗粒转导的靶细胞可使有效载荷中每一者在单一细胞中表达。
在一些实施方案中，例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒的本文所述的AAV颗粒包含编码有效载荷的核酸。在一些实施方案中，经编码的有效载荷包含治疗性蛋白、抗体、酶、基因组编辑系统的一种或多种组分和/或RNAi剂(例如dsRNA、siRNA、shRNA、前体miRNA、初级miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)。在一些实施方案中，经编码的有效载荷调节(例如增加或减少)例如细胞或组织中的基因、mRNA、蛋白或其组合的存在、水平和/或活性。
多肽
在一些实施方案中，包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒的有效载荷包含例如本文所述的多肽的多肽。在有效载荷区编码多肽的情况下，多肽可以是肽或蛋白。有效载荷区可编码任何已知基因和/或其重组版本的产物。作为非限制性实例，有效载荷区可编码载脂蛋白E(APOE)(诸如但不限于ApoE2、ApoE3和/或ApoE4)的至少一个等位基因。在一个实施方案中，有效载荷区编码ApoE2(cys112、cys158)。在一个实施方案中，有效载荷区编码ApoE3(cys112、arg158)。在一个实施方案中，有效载荷区编码ApoE4(arg112、arg158)。作为另一非限制性实例，有效载荷区可编码芳族L-氨基酸脱羧酶(AADC)。作为另一非限制性实例，有效载荷区可编码抗体或其片段。作为另一非限制性实例，有效载荷区可编码人类运动神经元存活因子(SMN)1或SMN2或其片段或变体。作为另一非限制性实例，有效载荷区可编码葡糖脑苷脂酶(GBA1)或其片段或变体。作为另一非限制性实例，有效载荷区可编码颗粒体蛋白前体或前驱颗粒体蛋白(GRN)或其片段或变体。作为另一非限制性实例，有效载荷区可编码天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)或其片段或变体。作为另一非限制性实例，有效载荷区可编码三肽基肽酶I(CLN2)或其片段或变体。作为另一非限制性实例，有效载荷区可编码β-半乳糖苷酶(GLB1)或其片段或变体。作为另一非限制性实例，有效载荷区可编码N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)或其片段或变体。作为另一非限制性实例，有效载荷区可编码N-乙酰基-α-氨基葡糖苷酶(NAGLU)或其片段或变体。作为另一非限制性实例，有效载荷区可编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)或其片段或变体。作为另一非限制性实例，有效载荷区可编码细胞内胆固醇转运体(NPC1)或其片段或变体。作为另一非限制性实例，有效载荷区可编码巨轴索神经病蛋白(GAN)或其片段或变体。编码本文所述的多肽的AAV病毒基因组可用于人类疾病、病毒、感染兽医学应用的领域和多种体内和体外环境中。
由本文所述的病毒基因组的有效载荷区编码的氨基酸序列可经翻译为可独立地由一个或多个核酸、核酸片段或前述任一者的变体编码的全多肽、多个多肽或多肽片段。
抗体和抗体结合片段
在一些实施方案中，包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒的有效载荷包含抗体或抗体结合片段。在有效载荷区编码抗体的情况下，“抗体”可以是形成展现所需生物活性的“功能性抗体”的完整抗体、其片段或任何衍生物。作为非限制性实例，抗体可以是天然抗体(例如具有两个重链和两个轻链)、重链可变区、轻链可变区、重链恒定区、轻链恒定区、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或scFv片段、双功能抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体、胞内抗体、一个或多个重链互补决定区(CDR)、一个或多个轻链CDR、双特异性抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、抗体模拟物、抗体变体、微型化抗体、单抗体、最大抗体和/或嵌合抗原受体。
本文所述的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的有效载荷区可编码形成或充当任何抗体的多肽，所述抗体包括本领域中已知的抗体和/或市售抗体。经编码的抗体或抗体结合片段可以是治疗性、诊断性或用于研究目的。经编码的抗体或抗体结合片段可适用于治疗神经疾病、神经系统变性病症、肌肉疾病、神经肌肉病症、神经肿瘤病症或与中枢和/或周围神经系统相关的任何病症。
在一些实施方案中，AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的病毒基因组可包含已经工程改造以致能或增强抗体或其抗体结合片段的表达的核酸。
在一些实施方案中，包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒的有效载荷的经编码的抗体包含至少一个免疫球蛋白可变域序列。抗体可包括例如全长、成熟抗体和抗体的抗原结合片段。举例说来，抗体可包括重(H)链可变域序列(VH)和轻(L)链可变域序列(VL)。在另一实例中，抗体包括两个重(H)链可变域序列和两个轻(L)链可变域序列，由此形成两个抗原结合位点，诸如Fab、Fab'、F(ab')2、Fc、Fd、Fd'、Fv、单链抗体(例如scFv)、单一可变域抗体、双功能抗体(Dab)(二价和双特异性)和嵌合(例如人源化)抗体，所述抗体可通过修饰全抗体或使用重组DNA技术重新合成的抗体来产生。这些功能性抗体片段(例如抗体结合片段)保留与其各自的抗原或受体选择性结合的能力。
在一些实施方案中，抗体结合片段包含完整抗体或其重组变体的至少一部分，并且指足以使抗体片段识别并且特异性结合诸如抗原的靶的抗原结合域(例如完整抗体的抗原决定可变区)。抗原结合片段的实例包括：(i)Fab片段，即由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，即包含在铰链区通过双硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1域组成；(iv)Fv片段，其由抗体的单臂的VL和VH域组成；(v)双功能抗体(dAb)片段，其由VH域组成；(vi)骆驼科动物或骆驼化可变域；(vii)单链Fv(scFv)，参见例如Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；和(viii)单域抗体。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术来获得，并且所述片段是以与完整抗体相同的方式来筛检以供使用。抗体片段也可并入单域抗体、最大抗体、微型抗体、纳米抗体、胞内抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、v-NAR和双scFv中(参见例如Hollinger和Hudson,NatureBiotechnology 23:1126-1136,2005)。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒的有效载荷的经编码的抗体包含多特异性抗体，例如其包含多个免疫球蛋白可变域序列，其中所述多个免疫球蛋白可变域序列中的第一免疫球蛋白可变域序列对第一表位具有结合特异性，并且所述多个免疫球蛋白可变域序列中的第二免疫球蛋白可变域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施方案中，第一表位和第二表位处于同一抗原上，例如处于同一蛋白(或多聚体蛋白的亚单位)上。在一些实施方案中，第一表位与第二表位重叠。在一些实施方案中，第一表位与第二表位不重叠。在一些实施方案中，第一表位和第二表位处于不同抗原上，例如处于不同蛋白(或多聚体蛋白的不同亚单位)上。在一些实施方案中，多特异性抗体包含第三、第四或第五免疫球蛋白可变域。在一些实施方案中，多特异性抗体为双特异性抗体、三特异性抗体或四特异性抗体。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒的有效载荷的经编码的多特异性抗体为经编码的双特异性抗体。双特异性抗体对不超过两种抗原具有特异性。双特异性抗体的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变域序列。在一些实施方案中，第一表位和第二表位处于同一抗原上，例如处于同一蛋白(或多聚体蛋白的亚单位)上。在一些实施方案中，第一表位与第二表位重叠。在一些实施方案中，第一表位与第二表位不重叠。在一些实施方案中，第一表位和第二表位处于不同抗原上，例如处于不同蛋白(或多聚体蛋白的不同亚单位)上。
在本文所述的AAV颗粒的有效载荷区中编码的抗体或抗体结合片段可以是但不限于结合至β-淀粉样蛋白、APOE、tau、SOD1、TDP-43、亨廷顿蛋白和/或突触核蛋白的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，经编码的有效载荷包含结合至例如HER2、EGFR(例如EGFRvIII)的神经肿瘤相关靶的抗体或抗体片段。
基因编辑系统
在一些实施方案中，包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒的有效载荷包含基因编辑系统或其一种或多种组分。在一些实施方案中，基因编辑系统包含编码蛋白的核酸序列，所述蛋白具有酶活性以：(i)在DNA或RNA序列中选择性诱导双链或单链断裂，或(ii)在DNA或RNA中不存在双链或单链断裂的情况下取代、插入或缺失DNA或RNA序列的一个特定碱基或一组碱基。在一些实施方案中，基因编辑系统包括但不限于CRISPR-Cas系统(包括不同Cas或Cas相关核酸酶)、锌指核酸酶、兆核酸酶、TALEN或碱基编辑器。在一些实施方案中，基因编辑系统包含例如在不存在外源性核酸酶或酶实体的情况下通过微小病毒载体引入的转基因的染色体整合。
RNAi剂
在一些实施方案中，包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒的有效载荷包含例如本文所述的RNAi剂的RNAi剂。RNAi(还称为转录后基因沉默(PTGS)、压制或共同遏制)为转录后基因沉默过程，在所述过程中，RNA分子以序列特异性方式抑制基因表达，所述抑制通常通过对特异性mRNA分子造成破坏来进行。RNAi介导的基因沉默可特异性抑制靶向基因表达。在本文所述的AAV颗粒的病毒基因组的有效载荷区编码RNAi剂的情况下，RNAi剂可以是但不限于dsRNA、siRNA、shRNA、前体miRNA、初级miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA。RNAi剂的靶基因的非限制性实例包括SOD1、MAPT、APOE、HTT、C9ORF72、TDP-43、APP、BACE、SNCA、ATXN1、ATXN3、ATXN7、SCN1A-SCN5A或SCN8A-SCN11A。
本文所述的AAV颗粒可包含编码RNAi剂的病毒基因组，其中RNAi剂靶向所关注的基因的mRNA以干扰基因表达和/或蛋白产生。所述AAV颗粒可用作治疗、诊断或用于研究目的。
在一个实施方案中，RNAi剂可沿所关注的基因各自的核苷酸序列的任何区段来靶向所关注的基因。
在一个实施方案中，RNAi剂可在核苷酸序列内的单核苷酸多态性(SNP)或变体的位置处靶向所关注的基因。
在一些实施方案中，编码RNAi剂或RNAi剂的单链的核酸序列插入AAV颗粒的病毒基因组中并且引入细胞中，具体说来，所述细胞为中枢神经系统中的细胞或DRG细胞。
RNAi剂可以是siRNA双链体，其中siRNA双链体含有杂交在一起形成双链体结构的反义链(引导链)和有义链(过客链)，其中反义链与靶向基因的核酸序列互补，并且其中有义链与靶向基因的核酸序列同源。在一些方面，反义链的5'端具有5'磷酸酯基，并且有义链的3'端含有3'羟基。在其他方面，在各链的3'端处不存在、存在1个或2个核苷酸悬突。
靶向所关注的基因的siRNA双链体的各链的长度可以是约19至25、19至24或19至21个核苷酸，优选地长度可以是约19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸或25个核苷酸。
在一个实施方案中，siRNA或dsRNA包括至少两个彼此互补的序列。dsRNA包括具有第一序列的有义链和具有第二序列的反义链。反义链包括与编码靶基因的mRNA的至少一部分大体上互补的核苷酸序列，并且互补区的长度为30个或更少个核苷酸和至少15个核苷酸。一般说来，dsRNA的长度为19至25、19至24或19至21个核苷酸。在一些实施方案中，dsRNA的长度为约15至约25个核苷酸，并且在其他实施方案中，dsRNA的长度为约25至约30个核苷酸。在一些实施方案中，dsRNA的长度为约15个核苷酸，长度为约16个核苷酸，长度为约17个核苷酸，长度为约18个核苷酸，长度为约19个核苷酸、20个核苷酸、21个核苷酸、22个核苷酸、23个核苷酸、24个核苷酸，长度为约25个核苷酸，长度为约26个核苷酸，长度为约27个核苷酸，长度为约28个核苷酸，长度为约29个核苷酸或长度为约30个核苷酸。
无论直接施用抑或在AAV颗粒中的病毒基因组中编码，dsRNA均在与表达靶蛋白的细胞接触后，诸如当通过本领域中已知的方法分析时，抑制蛋白表达至少10％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％或至少40％或更多。
在一个实施方案中，RNAi剂可用于使靶蛋白表达减少至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，靶蛋白表达可减少50-90％。
在一个实施方案中，RNAi剂可用于使靶mRNA表达减少至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，靶mRNA表达可减少50-90％。
在一个实施方案中，RNAi剂可用于减少靶蛋白和/或mRNA在CNS的至少一个区域中的表达。靶蛋白和/或mRNA在CNS的至少一个区域中的表达减少至少约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％。作为非限制性实例，靶蛋白和mRNA在神经元(例如皮质神经元)中的表达减少50-90％。作为非限制性实例，靶蛋白和mRNA在神经元(例如皮质神经元)中的表达减少40-50％。
在一些实施方案中，向有需要的受试者施用包含编码至少一个靶向所关注的基因的RNAi剂的病毒基因组的本文所述的AAV颗粒以治疗和/或改善疾病，例如神经病症或与中枢或周围神经系统相关的任何疾病。
在一个实施方案中，RNAi剂为siRNA。
siRNA设计
本文所述的AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可包含编码一个或多个siRNA分子(例如siRNA双链体或经编码的dsRNA)的病毒基因组，所述一个或多个siRNA分子特定地经设计以靶向所关注的基因并且遏制靶基因表达和蛋白产生。在一些方面，siRNA分子经设计并且用于选择性“敲除”细胞中的靶基因变体，例如在神经疾病中鉴定的转录物。在一些方面，siRNA分子经设计并且用于选择性“敲低”细胞中的靶基因变体。
在一些实施方案中，靶向所关注的基因的siRNA分子可使用任何可用设计工具来设计。
本领域中已提出一些siRNA(用于插入本文所述的AAV颗粒的病毒基因组中)设计指南。这些指南一般建议生成靶向待沉默基因中的一个区域的19-核苷酸双链体区、对称2-3核苷酸3'悬突、5-磷酸酯基和3-羟基。可管理siRNA序列偏好的其他规则包括但不限于(i)反义链的5'端处有A/U；(ii)有义链的5'端处有G/C；(iii)反义链的5'端三分之一中有至少五个A/U残基；和(iv)不存在长度超过9个核苷酸的任何GC延伸部。根据此类考虑，可易于设计抑制哺乳动物靶基因表达所必需的高效siRNA分子以及靶基因的特异性序列。
在一个实施方案中，有义链和/或反义链是基于欧洲专利公布号EP1752536中所概述的方法和规则来设计，所述欧洲专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中。作为非限制性实例，所述序列的3'端碱基为腺嘌呤、胸腺嘧啶或尿嘧啶。作为非限制性实例，所述序列的5'端碱基为鸟嘌呤或胞嘧啶。作为非限制性实例，3'端序列包含七种富含腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶中的一种或多种碱基的碱基。
在一个实施方案中，siRNA分子包含有义链和互补反义链，其中两条链杂交在一起以形成双链体结构。反义链与靶mRNA序列具有足够互补性以引导靶特异性RNAi，例如siRNA分子具有足以通过RNAi机制或过程触发对靶mRNA的破坏的序列。
在一些实施方案中，反义链与靶mRNA序列具有100％互补性。反义链可与靶mRNA序列的任何部分互补。有义序列的同一性或反义序列的同源性均不需要与靶100％互补。
在其他实施方案中，反义链与靶mRNA序列包含至少一个错配。作为非限制性实例，反义链与靶mRNA序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％互补性。
siRNA分子的长度可以是约10-50个或更多个核苷酸，例如各链包含10-50个核苷酸(或核苷酸类似物)。优选地，siRNA分子的长度在各链中为约15-30，例如15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸，其中一条链与靶区域足够互补。在一个实施方案中，siRNA分子的长度为约19至25、19至24或19至21个核苷酸。
在一些实施方案中，siRNA分子可以是包含约19个核苷酸至约25个核苷酸和3'端处的两个悬突核苷酸的合成RNA双链体。
siRNA分子可包含反义序列和有义序列或其片段或变体。作为非限制性实例，反义序列与有义序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-99％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-99％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-99％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-99％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-99％、70-80％、70-90％、70-95％、70-99％、80-90％、80-95％、80-99％、90-95％、90-99％或95-99％互补性。
有义序列和反义序列可在其长度的实质部分中完全互补。在其他实施方案中，有义序列和反义序列可在独立地链长度的至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％中至少70％、80％、90％、95％或99％互补。
在一些实施方案中，siRNA双链体的有义链和反义链是通过短间隔子序列连接，从而引起称为短发夹RNA(shRNA)的茎环结构的表达。所述发夹是由Dicer识别并且裂解，因此生成成熟siRNA分子。
在一些实施方案中，siRNA分子以及相关间隔子和/或侧接区一旦经设计，即可由本文所述的AAV颗粒的病毒基因组编码以递送至细胞。
分子骨架
在一些实施方案中，siRNA分子可在还包含分子骨架的调节性多核苷酸中经编码。
在一些实施方案中，包含有效载荷(例如siRNA、miRNA或本文所述的其他RNAi剂)的调节性多核苷酸包括分子骨架，所述分子骨架包含至少一个可具有任何长度并且可完全或部分衍生自野生型微小RNA序列或为完全人工的5'侧接序列。3'侧接序列可在尺寸和起源上反映5'侧接序列。任一侧接序列均可能不存在。在一个实施方案中，5'和3'侧接序列均不存在。3'侧接序列可任选地含有一个或多个CNNC基序，其中“N”表示任何核苷酸。
在一些实施方案中，5'和3'侧接序列的长度相同。
在一些实施方案中，5'侧接序列的长度为1-10个核苷酸，长度为5-15个核苷酸，长度为10-30个核苷酸，长度为20-50个核苷酸，长度为多于40个核苷酸，长度为多于50个核苷酸，长度为多于100个核苷酸或长度为多于200个核苷酸。
在一些实施方案中，5'侧接序列的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500个核苷酸。
在一个实施方案中，分子骨架包含至少一个3'侧接区。作为非限制性实例，3'侧接区可包含可具有任何长度并且可完全或部分衍生自野生型微小RNA序列或为完全人工序列的3'侧接序列。
在一些实施方案中，3'侧接序列的长度为1-10个核苷酸，长度为5-15个核苷酸，长度为10-30个核苷酸，长度为20-50个核苷酸，长度为多于40个核苷酸，长度为多于50个核苷酸，长度为多于100个核苷酸或长度为多于200个核苷酸。
在一些实施方案中，3'侧接序列的长度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302、303、304、305、306、307、308、309、310、311、312、313、314、315、316、317、318、319、320、321、322、323、324、325、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、342、343、344、345、346、347、348、349、350、351、352、353、354、355、356、357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、372、373、374、375、376、377、378、379、380、381、382、383、384、385、386、387、388、389、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、400、401、402、403、404、405、406、407、408、409、410、411、412、413、414、415、416、417、418、419、420、421、422、423、424、425、426、427、428、429、430、431、432、433、434、435、436、437、438、439、440、441、442、443、444、445、446、447、448、449、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、461、462、463、464、465、466、467、468、469、470、471、472、473、474、475、476、477、478、479、480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、491、492、493、494、495、496、497、498、499或500个核苷酸。
在一些实施方案中，5'和3'侧接序列为相同序列。在一些实施方案中，当其彼此比对时相差2％、3％、4％、5％、10％、20％或超过30％。
形成茎环结构的茎的是最少至少一个有效载荷序列。在一些实施方案中，有效载荷序列包含至少一个与靶序列部分互补或将与靶序列杂交的核酸序列。在一些实施方案中，有效载荷为siRNA分子或siRNA分子的片段。
在一些实施方案中，茎环的5'臂包含有义序列。
在一些实施方案中，茎环的3'臂包含反义序列。在一些情况下，反义序列在5'最末端处包含“G”核苷酸。
在其他实施方案中，有义序列可存在于茎环结构的茎的3'臂上，而反义序列存在于5'臂上。
茎环结构的有义序列与反义序列是由环(还称为环基序)隔开。所述环可具有以下任何长度：在4-30个之间的核苷酸、在4-20个之间的核苷酸、在4-15个之间的核苷酸、在5-15个之间的核苷酸、在6-12个之间的核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、11个核苷酸和/或12个核苷酸。
在一些实施方案中，所述环包含至少一个UGUG基序。在一些实施方案中，UGUG基序位于所述环的5'端处。
间隔子区可存在于调节性多核苷酸中以将一个或多个模块彼此隔开。可存在一个或多个此类间隔子区。
在一个实施方案中，具有在8-20个之间(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)核苷酸的间隔子区可存在于有义序列与侧接序列之间。
在一个实施方案中，间隔子为13个核苷酸并且位于有义序列的5'端与侧接序列之间。在一个实施方案中，间隔子具有足以形成序列的大致一个螺旋转角(helical turn)的长度。
在一个实施方案中，具有在8-20个之间(例如8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)核苷酸的间隔子区可存在于反义序列与侧接序列之间。
在一个实施方案中，间隔子序列为在10-13个之间(例如10、11、12或13个)核苷酸，并且位于反义序列的3'端与侧接序列之间。在一个实施方案中，间隔子具有足以形成序列的大致一个螺旋转角的长度。
在一个实施方案中，调节性多核苷酸在5'至3'方向上包含5'侧接序列、5'臂、环基序、3'臂和3'侧接序列。作为非限制性实例，5'臂可包含有义序列并且3'臂包含反义序列。在另一非限制性实例中，5'臂包含反义序列并且3'臂包含有义序列。
在一个实施方案中，5'臂、有效载荷(例如有义序列和/或反义序列)、环基序和/或3'臂序列可发生更改(例如取代1或多个核苷酸、添加核苷酸和/或使核苷酸缺失)。所述更改可引起构建体功能发生有利变化(例如增加靶序列的敲低、减少构建体的降解、减少脱靶作用、增加有效载荷的效率和减少有效载荷的降解)。
在一个实施方案中，调节性多核苷酸的分子骨架经比对以便使引导链或反义链的切除率高于过客链或有义链的切除率。引导链或过客链的切除率可独立地为1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或超过99％。作为非限制性实例，引导链的切除率为至少80％。作为另一非限制性实例，引导链的切除率为至少90％。
在一个实施方案中，引导链的切除率高于过客链的切除率。一方面，引导链的切除率可比过客链高至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或超过99％。
在一个实施方案中，引导链的切除效率为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或超过99％。作为非限制性实例，引导链的切除效率高于80％。
在一个实施方案中，来自分子骨架的引导链的切除效率高于过客链的切除效率。来自分子骨架的引导链的切除效率可比过客链的切除效率高2、3、4、5、6、7、8、9、10倍或超过10倍。
在一个实施方案中，分子骨架包含双重功能靶向调节性多核苷酸。
在一个实施方案中，分子骨架可包含本领域中已知的一个或多个接头。所述接头可使区域或一个分子骨架与另一分子骨架隔开。作为非限制性实例，分子骨架可以是多顺反子的。
在一个实施方案中，调节性多核苷酸是使用以下特性中的至少一者来设计：环变体、种子错配/凸出/摆动变体、茎错配、环变体和基部茎错配变体、种子错配和基部茎错配变体、茎错配和基部茎错配变体、种子摆动和基部茎摆动变体或茎序列变体。
AAV产生
本文所公开的病毒产生描述用于产生AAV颗粒(具有增强、改进和/或增加的针对靶组织的向性)的工艺和方法，所述AAV颗粒例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒，可用于接触靶细胞以递送有效载荷。
在一些实施方案中，本文公开一种制造本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的方法，所述方法包括：(i)提供包含本文所述的病毒基因组的宿主细胞和(ii)在适合于将病毒基因组封闭在例如本文所述的AAV衣壳变体(例如表3、4或5中所列的AAV衣壳变体)的AAV衣壳变体中的条件下孵育宿主细胞，由此制造AAV颗粒。在一些实施方案中，所述方法包括在步骤(i)之前，将包含病毒基因组的第一核酸引入细胞中。在一些实施方案中，宿主细胞包含编码AAV衣壳变体的第二核酸。在一些实施方案中，在第一核酸分子之前、与第一核酸分子并行或在第一核酸分子之后将第二核酸引入宿主细胞中。在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒为分离的AAV颗粒。在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒为重组AAV颗粒。
本公开提供用于生成包含肽(例如靶向肽)的AAV颗粒(例如包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的方法。在一些实施方案中，AAV颗粒是通过在病毒复制细胞中进行病毒基因组复制来制备。本领域中已知的任何方法均可用于制备AAV颗粒。在一些实施方案中，AAV颗粒是在哺乳动物细胞(例如HEK293)中产生。在另一实施方案中，AAV颗粒是在昆虫细胞(例如Sf9)中产生。
制造AAV颗粒的方法是本领域中众所周知的并且描述于例如美国专利号US6204059、US5756283、US6258595、US6261551、US6270996、US6281010、US6365394、US6475769、US6482634、US6485966、US6943019、US6953690、US7022519、US7238526、US7291498和US7491508、US5064764、US6194191、US6566118、US8137948；或国际公布号WO1996039530、WO1998010088、WO1999014354、WO1999015685、WO1999047691、WO2000055342、WO2000075353和WO2001023597；Methods In Molecular Biology,编辑Richard,Humana Press,NJ(1995)；O'Reilly等人,Baculovirus Expression Vectors,ALaboratory Manual,Oxford Univ.Press(1994)；Samulski等人,J.Vir.63:3822-8(1989)；Kajigaya等人,Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 88:4646-50(1991)；Ruffing等人,J.Vir.66:6922-30(1992)；Kimbauer等人,Vir.,219:37-44(1996)；Zhao等人,Vir.272:382-93(2000)中；所述文献中每一者的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，AAV颗粒是使用国际专利公布WO2015191508中所述的方法来制造，所述国际专利公布的内容以全文引用的方式并入本文中。
治疗应用
本公开提供一种用于治疗包括人类受试者在内的哺乳动物受试者的疾病、病症和/或疾患的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的AAV颗粒，例如包含例如AAV衣壳变体(例如本文所述的AAV衣壳变体)的AAV衣壳多肽的AAV颗粒，或向受试者施用所描述组合物中的任一种，包括本文所述的药物组合物。
在一些实施方案中，向受试者预防性施用本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)以预防疾病发作。在另一实施方案中，施用本公开的AAV颗粒(例如包含AAV衣壳变体的AAV颗粒)以治疗疾病或其症状(减轻疾病或其症状的影响)。在另一实施方案中，施用本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)以治愈(消除)疾病。在另一实施方案中，施用本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)以预防疾病或减缓疾病进展。在另一实施方案中，使用本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)以逆转疾病的不利影响。疾病状态和/或进展可通过本领域中已知的标准方法来测定或监测。
在一些实施方案中，本文提供用于治疗受试者的神经病症和/或神经系统变性病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的药物组合物或包含本文所述的AAV衣壳变体的AAV颗粒(例如多个颗粒)。在一些实施方案中，神经病症和/或神经系统变性病症的治疗包含对所述神经病症和/或神经病症的预防。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)适用于用以治疗、预防、减缓或改善神经疾病和/或病症的药品的领域。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)适用于用以治疗、预防、减缓或改善tau蛋白病变(tauopathy)的药品的领域。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)适用于用以治疗、预防、减缓或改善阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disease)的药品的领域。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)适用于用以治疗、预防、减缓或改善弗里德赖希共济失调(Friedreich'sataxia)或源于共济蛋白损失或部分损失的任何疾病的药品的领域。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)适用于用以治疗、预防、减缓或改善帕金森氏病(Parkinson's Disease)的药品的领域。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)适用于用以治疗、预防、减缓或改善肌萎缩性侧索硬化的药品的领域。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)适用于用以治疗、预防、减缓或改善亨廷顿氏病(Huntington's Disease)的药品的领域。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)适用于用以治疗、预防、减缓或改善慢性疼痛或神经病变性疼痛的药品的领域。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)适用于用以治疗、预防、减缓或改善与中枢神经系统相关的疾病的药品的领域。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)适用于用以治疗、预防、减缓或改善与周围神经系统相关的疾病的药品的领域。
在一些实施方案中，向患有本文所述的疾病或症状中的至少一种的受试者施用本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)。在一些实施方案中，向患有或经诊断患有本文所述的疾病或病症的受试者施用本公开的AAV颗粒。
在一些实施方案中，本文提供一种用于治疗受试者的肌肉病症和/或神经肌肉病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的药物组合物或包含本文所述的AAV衣壳变体的AAV颗粒(例如多个颗粒)。在一些实施方案中，肌肉病症和/或神经肌肉病症的治疗包含对所述肌肉病症和/或神经肌肉病症的预防。
在一些实施方案中，本文提供一种用于治疗受试者的神经肿瘤病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的药物组合物或包含本文所述的AAV衣壳变体的AAV颗粒(例如多个颗粒)。在一些实施方案中，神经肿瘤病症的治疗包含对所述神经肿瘤病症的预防。在一些实施方案中，神经肿瘤病症包含初级CNS起源(例如CNS细胞、组织或区域)的癌症或CNS细胞、组织或区域中的转移癌。
任何神经疾病或病症、神经系统变性病症、肌肉病症、神经肌肉病症和/或神经肿瘤病症均可用包括但不限于以下的本公开的AAV颗粒或其药物组合物治疗：透明隔不存在、酸性脂肪酶疾病、酸性麦芽糖酶缺乏症、后天性癫痫样失语症、急性播散性脑脊髓炎、注意力缺陷过动症(ADHD)、艾迪氏瞳孔(Adie's Pupil)、艾迪氏综合征(Adie's Syndrome)、肾上腺脑白质营养不良、胼胝体无发育、认知障碍症、艾卡迪综合征(Aicardi Syndrome)、艾卡迪-古蒂耶尔综合征病症(Aicardi-Goutieres Syndrome Disorder)、AIDS神经并发症、亚历山大氏疾病(Alexander Disease)、阿尔珀斯氏疾病(Alpers'Disease)、交替性半身麻痹、阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、无脑、动脉瘤、安格尔曼氏综合征(Angelman Syndrome)、血管瘤病、缺氧症、抗磷脂综合征、失语症、失用症、蜘蛛膜囊肿、蜘蛛膜炎、阿诺德-希阿里畸形(Arnold-Chiari Malformation)、动静脉畸形、亚斯伯格综合征(Asperger Syndrome)、运动失调、运动失调毛细血管扩张症、运动失调和小脑或脊髓小脑退化、心房震颤和中风、注意力缺陷过动症、泛自闭症障碍、自主神经机能异常、背痛、巴特综合征(Barth Syndrome)、巴氏病(Batten Disease)、贝克氏肌强直(Becker'sMyotonia)、比切特氏疾病(Bechet's Disease)、伯耳氏瘫(Bell's Palsy)、良性自发性睑痉挛、良性局部肌萎缩、良性颅内高血压、伯罗二氏综合征(Bernhardt-Roth Syndrome)、贝瓦克氏疾病(Binswanger's Disease)、睑痉挛、布洛赫-苏兹贝格综合征(Bloch-Sulzberger Syndrome)、肱神经丛产伤、肱神经丛损伤、布瑞德伯里-埃格尔斯顿综合征(Bradbury-Eggleston Syndrome)、脑和脊髓肿瘤、脑动脉瘤、脑损伤、布斯二氏综合征(Brown-Sequard Syndrome)、延髓性瘫痪、延髓肌肉萎缩症、大脑体染色体显性动脉病伴皮质下梗塞和脑白质病(CADASIL)、卡纳万疾病(Canavan Disease)、腕隧道综合征、灼性神经痛、海绵状血管瘤(Cavernomas/Cavernous Angioma)、海绵状畸形、中枢颈髓综合征、脊髓空洞综合征、中枢性疼痛综合征、中央脑桥脊髓溶解、头部病症、神经酰胺酶缺乏症、小脑退化、小脑发育不全、大脑动脉瘤、大脑动脉硬化、脑萎缩、大脑脚气病、大脑海绵状畸形、大脑巨人症、大脑缺氧、脑性麻痹、脑-眼-面-骨骼综合征(Cerebro-Oculo-Facio-SkeletalSyndrome，COFS)、恰克-马利-杜斯氏病(Charcot-Marie-Tooth Disease)、希阿里畸形(Chiari Malformation)、胆固醇酯贮积病、舞蹈症、舞蹈型棘细胞增多症、慢性发炎性脱髓鞘多发性神经病(CIDP)、慢性直立性不耐受、慢性疼痛、II型科凯恩氏综合征(CockayneSyndrome Type II)、科芬－劳里综合征(Coffin Lowry Syndrome)、空洞脑、昏迷、复杂区域疼痛综合征、同心性硬化(巴洛氏硬化(Baló's sclerosis))、先天性两侧面瘫、先天性肌无力、先天性肌病变、先天性血管海绵状畸形、皮质基底核退化、颅骨动脉炎、颅缝线封闭过早、克里脑炎(Cree encephalitis)、库贾氏疾病(Creutzfeldt-Jakob Disease)、慢性进行性外部眼肌麻痹、累积性创伤病症、库欣氏综合征(Cushing's Syndrome)、巨细胞包涵体疾病、巨细胞病毒感染、眼阵挛-肌阵挛综合征、丹迪-沃克综合征(Dandy-Walker Syndrome)、道生疾病(Dawson Disease)、德莫西氏综合征(De Morsier's Syndrome)、代-克二氏瘫痪(Dejerine-Klumpke Palsy)、痴呆、痴呆-多发性梗塞、语义性痴呆、皮质下痴呆、路易体痴呆(Dementia With Lewy Bodies)、脱髓鞘疾病、齿状小脑运动失调、齿状红核萎缩症、皮肌炎、发育运用障碍、德维克氏综合征(Devic's Syndrome)、糖尿病性神经病变、弥漫性硬化、远端遗传性运动神经元病、德拉韦综合征(Dravet Syndrome)、自主神经障碍、书写障碍、阅读障碍、吞咽困难、运用障碍、肌阵挛性小脑性失调症、进行性小脑性失调症、肌张力障碍、早期婴儿癫痫性脑病、空蝶鞍综合征、脑炎、昏睡性脑炎、脑膨出、脑脊髓炎、脑病、脑病(家族性婴儿)、脑三叉神经血管瘤病、癫痫、癫痫性半身麻痹、间歇性运动失调、艾尔布氏瘫痪(Erb's Palsy)、艾尔布-杜兴氏和代-克二氏瘫痪(Erb-Duchenne and Dejerine-KlumpkePalsy)、自发性震颤、桥脑外髓鞘溶解症、费伯氏疾病(Faber's disease)、法布里疾病(Fabry Disease)、法氏综合征(Fahr's Syndrome)、昏厥、家族性自主神经障碍、家族性血管瘤、家族性特发性基底神经节钙化、家族性周期性瘫痪、家族性痉挛性瘫痪、法伯氏疾病(Farber's Disease)、发热性癫痫发作、纤维肌性发育不良、费舍尔综合征(FisherSyndrome)、婴儿松弛综合征、垂足、弗里德赖希运动失调(Friedreich's Ataxia)、额颞叶型痴呆、高歇氏病(Gaucher Disease)、全身性神经节苷脂沈积症(GM1、GM2)、格斯特曼氏综合征(Gerstmann's Syndrome)、格斯特曼-史特劳斯勒-申克疾病(Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease)、巨大轴索神经病变、巨大细胞动脉炎、巨大细胞包涵疾病、球状细胞脑白质营养不良、舌咽神经痛、肝糖贮积病、格巴二氏综合征(Guillain-BarréSyndrome)、哈-斯二氏疾病(Hallervorden-Spatz Disease)、头部损伤、头痛、持续性偏头痛、半面痉挛、交叉性半身麻痹、遗传性神经病变、遗传性痉挛性截瘫、多神经炎型遗传性运动失调、带状疱疹、耳部带状疱疹、平山综合征(Hirayama Syndrome)、霍姆斯-艾迪氏综合征(Holmes-Adie syndrome)、前脑无裂畸形、HTLV-1相关脊髓病、休斯综合征(Hughes Syndrome)、亨廷顿氏病(Huntington's Disease)、贺勒侯症群(Hurler syndrome)、脑内积水、脑积水、脑积水-法向压力、脊髓积水、皮质醇增多症、嗜睡、张力亢进、张力减退、缺氧、免疫介导的脑脊髓炎、包涵体肌炎、色素失禁症、婴儿张力减退、婴儿神经轴索营养不良、婴儿植烷酸贮积病、婴儿雷夫苏姆疾病(Infantile Refsum Disease)、婴儿痉挛、发炎性肌病变、枕骨裂露脑畸形、肠脂质营养不良、颅内囊肿、颅内高血压、伊萨克斯氏综合征(Isaacs'Syndrome)、朱伯特综合征(Joubert Syndrome)、卡恩斯-塞尔综合征(Kearns-Sayre Syndrome)、肯尼迪氏疾病(Kennedy's Disease)、金斯布林纳氏综合征(Kinsbourne syndrome)、克莱恩-莱文综合征(Kleine-Levin Syndrome)、克-费二氏综合征(Klippel-Feil Syndrome)、克-特二氏综合征(Klippel-Trenaunay Syndrome，KTS)、克鲁尔-布西综合征(Klüver-BucySyndrome)、高沙可夫氏健忘综合征(Korsakoff's Amnesic Syndrome)、克拉培疾病(Krabbe Disease)、库格尔贝格-韦兰德疾病(Kugelberg-Welander Disease)、库鲁病(Kuru)、蓝伯-伊顿重肌无力综合征(Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome)、蓝道-克利夫综合征(Landau-Kleffner Syndrome)、股外侧皮肤神经嵌压、外侧延髓综合征、学习障碍、莱氏疾病(Leigh's Disease)、雷诺斯-加斯图综合征(Lennox-Gastaut Syndrome)、莱希-尼亨综合征(Lesch-Nyhan Syndrome)、脑白质营养不良、莱文-克里奇利综合征(Levine-Critchley Syndrome)、路易体性痴呆、利什特海姆氏疾病(Lichtheim's disease)、脂质贮积病、类脂蛋白沈积症、平脑症、闭锁综合征(Locked-In Syndrome)、卢·贾里格氏病(LouGehrig's Disease)、狼疮神经后遗症、莱姆病(Lyme Disease)神经并发症、溶酶体贮积病、马查多-约瑟夫疾病(Machado-Joseph Disease)、巨脑、巨脑症、梅-罗综合征(Melkersson-Rosenthal Syndrome)、脑膜炎、脑膜炎和脑炎、门克斯疾病(Menkes Disease)、异常性股痛、异染性脑白质营养不良、小头畸形、偏头痛、米勒费舍尔综合征(Miller FisherSyndrome)、小中风、粒线体肌病变、粒线体DNA耗乏综合征、牟比士综合征(MoebiusSyndrome)、单体肌萎缩、莫旺综合征(Morvan Syndrome)、运动神经元疾病、毛毛样血管疾病(Moyamoya Disease)、粘脂贮积症、粘多醣贮积症、多梗塞性痴呆、多灶性运动神经病变、多发性硬化症、多发性系统萎缩症、多发性系统萎缩症伴直立性低血压、肌肉萎缩症、先天性肌无力、重症肌无力、弥漫性脱髓鞘硬化症、脊髓炎、婴儿肌痉挛脑病、肌阵挛、肌阵挛癫痫、肌病变、先天性肌病变、甲状腺肌病变、肌强直、先天性肌强直、嗜睡症、NARP(神经病变、运动失调和色素性视网膜炎)、神经性棘红细胞增多症、神经退化伴脑铁积聚、神经退化性疾病、神经纤维瘤、抗精神病药恶性综合征、AIDS神经并发症、莱姆病神经并发症、巨细胞病毒感染的神经结果、庞培病(Pompe Disease)的神经表达、狼疮神经后遗症、视神经脊髓炎、神经肌强直、神经性类蜡脂褐质病、神经元迁移病症、神经病变性疼痛、遗传性神经病变、神经病变、神经系统结节病、神经梅毒、神经毒性、海绵状痣、尼曼-匹克疾病(Niemann-PickDisease)、奥沙利文-麦克劳德综合征(O'Sullivan-McLeod Syndrome)、枕骨神经痛、大田原综合征(Ohtahara Syndrome)、橄榄体脑桥小脑萎缩、斜视眼阵挛肌阵挛、直立性低血压、过度使用综合征、慢性疼痛、泛酸激酶相关神经退化、副肿瘤综合征、感觉异常、帕金森氏病(Parkinson's Disease)、阵发性舞蹈指痉病、阵发性偏头痛、帕-罗二氏病(Parry-Romberg)、佩利措伊斯-梅茨巴赫病(Pelizaeus-Merzbacher Disease)、佩娜-舒凯尔II型综合征(Pena Shokeir II Syndrome)、神经周囊肿、腓骨肌萎缩症、周期性瘫痪、周围神经病变、脑室周围白质软化症(Periventricular Leukomalacia)、持续性植物状态、广泛性进展障碍、植烷酸贮积病、匹克病(Pick's Disease)、夹神经、梨状肌综合征、脑垂体肿瘤、多发性肌炎、庞培病、脑穿通畸形、小儿麻痹后综合征、疱疹后遗神经痛、感染后脑脊髓炎、姿势性低血压、端坐性心搏过速综合征、体位性心搏过速综合征、原发性齿状体萎缩症、原发性侧索硬化症、原发性进行性失语症、普里昂疾病(Prion Disease)、进行性延髓性瘫痪、进行性半面萎缩症、进行性运动失调(Progressive Locomotor Ataxia)、进行性多病灶脑白质病、进行性肌肉萎缩症、进行性硬化性灰质萎缩、进行性核上瘫痪、脸孔失认症、假延髓性瘫痪、假性Torch综合征(Pseudo-Torch syndrome)、假弓虫症综合征、大脑假肿瘤、心因性运动、I型拉姆齐亨特综合征(Ramsay Hunt Syndrome I)、II型拉姆齐亨特综合征、罗斯苗逊氏脑炎(Rasmussen's Encephalitis)、反射性交感神经失养症综合征、雷夫苏姆疾病(Refsum Disease)、婴儿雷夫苏姆疾病、重复运动病症、重复应激损伤、不宁腿综合征、反转录病毒相关脊髓病、雷特氏综合征(Rett Syndrome)、雷氏综合征(Reye's Syndrome)、风湿性脑炎、莱利-戴综合征(Riley-Day Syndrome)、荐骨神经根囊肿、圣维特斯舞蹈症(SaintVitus Dance)、唾液腺疾病、桑多霍夫疾病(Sandhoff Disease)、希尔逗病(Schilder'sDisease)、裂脑症、赛特贝格疾病(Seitelberger Disease)、癫痫发作症、语义性痴呆、脑室中隔缺损合并视神经发育不全、婴儿期重度肌痉挛癫痫症(SMEI)、婴儿摇晃综合征、带状疱疹(Shingles)、希-德二氏综合征(Shy-Drager Syndrome)、休格连氏综合征(
Figure BDA0004048892440002721
Syndrome)、睡眠呼吸中止症、昏睡病、索托氏综合征(Sotos Syndrome)、痉挛、脊柱裂、脊髓梗塞、脊髓损伤、脊髓肿瘤、脊髓性肌肉萎缩症、脊髓小脑失调、脊髓小脑萎缩症、脊髓小脑退化、偶发性运动失调、斯-里-奥三氏综合征(Steele-Richardson-Olszewski Syndrome)、僵体综合征(Stiff-Person Syndrome)、纹状体黑质退化、中风、斯特奇-韦伯综合征(Sturge-Weber Syndrome)、亚急性硬化性泛脑炎、皮质下动脉硬化脑病、单侧短暂性神经痛样(SUNCT)头痛、吞咽障碍、西登哈姆舞蹈病(Sydenham Chorea)、晕厥、梅毒性脊髓硬化、脊髓积水空洞(Syringohydromyelia)、脊髓空洞病、全身性红斑狼疮、运动失调(TabesDorsalis)、迟发性运动不能、塔勒夫囊肿(Tarlov Cyst)、戴萨克斯疾病(Tay-SachsDisease)、颞动脉炎、脊髓栓是综合征、汤姆森氏肌强直(Thomsen's Myotonia)、胸廓出口综合征、甲状腺毒性肌病变、三叉神经痛、托德氏瘫痪(Todd's Paralysis)、妥瑞氏综合征(Tourette Syndrome)、短暂局部缺血发作、传染性海绵状脑病、横贯性脊髓炎、创伤性脑损伤、震颤、三叉神经痛、热带痉挛性截瘫、特洛伊综合征(Troyer Syndrome)、结节性硬化症、血管勃起肿瘤、中枢和周围神经系统的血管炎综合征、维生素B12缺乏症、冯·伊科诺莫氏疾病(Von Economo's Disease)、冯·希伯-林道疾病(Von Hippel-Lindau Disease，VHL)、冯·雷克林豪森氏疾病(Von Recklinghausen's Disease)、瓦伦堡氏综合征(Wallenberg's Syndrome)、沃尼克-霍夫曼疾病(Werdnig-Hoffman Disease)、魏尼克-科尔萨科夫综合征(Wernicke-Korsakoff Syndrome)、韦斯特综合征(West Syndrome)、挥鞭症(Whiplash)、惠普尔疾病(Whipple's Disease)、威廉姆斯综合征(Williams Syndrome)、威尔逊疾病(Wilson Disease)、沃尔曼疾病(Wolman's Disease)、X性联脊髓延髓肌肉萎缩。
药物组合物和制剂
根据本公开，包含本文所述的例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒可经制备为药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物包含至少一种活性成分。在一些实施方案中，所述药物组合物包含药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含AAV衣壳多肽(例如AAV衣壳多肽，例如AAV衣壳变体)的AAV颗粒)可使用赋形剂来配制，所述赋形剂是用于：(1)增加稳定性；(2)增加细胞转染或转导；(3)准许有效载荷的持续或延迟表达；(4)更改生物分布(例如使病毒颗粒靶向特异性组织或细胞类型)；(5)增加经编码蛋白的翻译；(6)更改经编码蛋白的释放曲线；和/或(7)允许有效载荷的可调节表达。本公开的制剂可包括但不限于生理盐水、脂质体、脂质纳米颗粒、聚合物、肽、蛋白、经病毒载体转染的细胞(例如用于转移或移植至受试者中)和其组合。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物中的活性成分(例如本文所述的AAV颗粒)、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量可视所治疗的受试者的身分、体型和/或条件并且进一步视组合物施用途径而变化。举例说来，所述组合物可包含在0.1％(w/w)与99％(w/w)之间的活性成分。举例说来，所述组合物可包含在0.1％(w/w)与100％(w/w)之间，例如在0.5％(w/w)与50％(w/w)之间、在1-30％(w/w)之间、在5-80％(w/w)之间、至少80％(w/w)的活性成分。
在一些实施方案中，包含本文所述的AAV颗粒的药物组合物可在具有或不具有药学上可接受的赋形剂的情况下包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽和编码有效载荷(例如本文所述的有效载荷)的病毒基因组。
在一些实施方案中，本公开还提供一种适合施用于例如人类的受试者的药物组合物。在一些实施方案中，所述药物组合物是施用于例如人类的受试者。
施用
在一些实施方案中，本文所公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可通过例如局部递送途径或全身递送途径的递送途径施用于受试者。在一些实施方案中，AAV颗粒是通过产生治疗有效结果的递送途径施用于受试者。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可经由使得其能够穿过血脑屏障、血管屏障或其他上皮屏障的途径来施用。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可以任何合适形式，以液体溶液或悬浮液形式、以适用于液体溶液或在液体溶液中的悬浮液的固体形式施用。在一些实施方案中，AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可与任何适当并且药学上可接受的赋形剂一起配制。
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)肌肉内、静脉内、大脑内、鞘内、脑室内、经由实质内施用或经由大池内注射(ICM)来施用。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可经由单一途径施用递送至受试者。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可经由多位点施用途径递送至受试者。在一些实施方案中，受试者可在2、3、4、5个或超过5个位点处施用。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)是经由推注输注来施用。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒是经数分钟、数小时或数天的时段经由持续递送来施用。在一些实施方案中，输注速率可视受试者、分布、配制和/或另一递送参数而改变。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒是使用受控释放，例如符合特定释放模式的释放曲线来施用以实现治疗结果。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒是使用持续释放，例如符合规定时段内的释放速率的释放曲线来施用。
在一些实施方案中，AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可通过超过一种施用途径来递送。作为组合施用的非限制性实例，AAV颗粒可通过鞘内和脑室内或通过静脉内和实质内施用来递送。
静脉内施用
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可通过全身施用来施用于受试者。在一些实施方案中，全身施用为静脉内施用。在另一实施方案中，全身施用为动脉内施用。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可通过静脉内施用来施用于受试者。在一些实施方案中，静脉内施用可通过皮下递送来达成。在一些实施方案中，AAV颗粒是经由聚焦式超声波(FUS)，例如联合微气泡静脉内施用(FUS-MB)，或MRI引导的FUS联合静脉内施用来施用于受试者，例如Terstappen等人(Nat RevDrug Discovery,https://doi.org/10.1038/s41573-021-00139-y(2021))中所述，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，AAV颗粒是静脉内施用于受试者。在一些实施方案中，受试者为人类。
向CNS施用
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可通过直接注射至脑中来递送。作为非限制性实例，脑递送可通过海马体内施用来进行。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可通过实质内施用来施用于受试者。在一些实施方案中，实质内施用是针对中枢神经系统的组织。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可通过颅内递送施用于受试者(参见例如美国专利号8119611；所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中)。在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒可通过注射至CSF途径中来递送。递送至CSF途径的非限制性实例包括鞘内和脑室内施用。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可通过全身递送来递送至脑。作为非限制性实例，全身递送可通过血管内施用来进行。作为非限制性实例，全身或血管内施用可以是静脉内施用。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可通过眼内递送途径来递送。眼内施用的非限制性实例包括玻璃体内注射。
肌肉内施用
在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可通过肌肉内施用来递送。在不希望受理论束缚的情况下，据信在一些实施方案中，肌肉细胞的多核性质在AAV递送之后提供基因转导优势。在一些实施方案中，肌肉细胞能够表达具有适当翻译后修饰的重组蛋白。在不希望受理论束缚的情况下，据信在一些实施方案中，肌肉组织富集血管结构允许转移至血流和全身(whole-body)递送。肌肉内施用的实例包括全身(例如静脉内)施用、皮下施用或直接施用于肌肉中。在一些实施方案中，施用超过一种注射剂。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可通过肌肉内递送途径来递送。(参见例如美国专利号6506379；所述美国专利的内容以全文引用的方式并入本文中)。肌肉内施用的非限制性实例包括静脉内注射或皮下注射。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)施用于受试者并且转导受试者的肌肉。作为非限制性实例，AAV颗粒是通过肌肉内施用来施用。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可通过皮下施用来施用于受试者。在一些实施方案中，肌肉内施用是经由全身递送来进行。在一些实施方案中，肌肉内施用是经由静脉内递送来进行。在一些实施方案中，肌肉内施用是经由直接注射至肌肉中来进行。
在一些实施方案中，通过例如肌肉内施用的施用来转导肌肉。在一些实施方案中，肌肉内递送包含在一个位点处的施用。在一些实施方案中，肌肉内递送包含在超过一个位点处的施用。在一些实施方案中，肌肉内递送包含在两个、三个、四个或更多个位点处的施用。在一些实施方案中，肌肉内递送与至少一种其他施用方法组合。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可通过周围注射施用于受试者。周围注射的非限制性实例包括腹膜内、肌肉内、静脉内、结膜或关节注射。本领域中已公开，AAV载体的周围施用可输送至中枢神经系统，例如输送至运动神经元(例如美国专利公布号US20100240739和US20100130594；所述美国专利公布中每一者的内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可通过实质内施用来施用于受试者。在一些实施方案中，实质内施用是针对肌肉组织。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒是如Bright等人2015(Neurobiol Aging.36(2):693-709)中所述来递送，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒是施用于受试者的腓肠肌。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒是施用于受试者的股二头肌。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒是施用于胫骨前肌。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒是施用于比目鱼肌。
储槽施用(Depot administration)
如本文所述，在一些实施方案中，本公开的药物组合物和/或AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)是在用于延长释放的储槽中配制。一般说来，特定器官或组织经靶向用于施用。
在一些实施方案中，本公开的药物组合物和/或AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)在空间上保留于靶组织内或附近。提供向哺乳动物受试者的靶组织提供药物组合物、AAV颗粒的方法，所述方法是通过在使得药物组合物和/或AAV颗粒大体上保留于靶组织(其包含一个或多个靶细胞)中，例如使得组合物的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％保留于靶组织中的条件下使靶组织与药物组合物和/或AAV颗粒接触来进行。在一些实施方案中，保留是通过测量进入一个靶细胞或多个靶细胞中的药物组合物和/或AAV颗粒的量来测定。举例说来，在施用后一段时间，施用于受试者的药物组合物和/或AAV颗粒的至少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％、99.99％或大于99.99％存在于细胞内。举例说来，肌肉内注射至受试者可使用包含本公开的药物组合物和/或AAV颗粒以及转染试剂的水性组合物来执行，并且保留是通过测量存在于肌肉细胞或多个肌肉细胞中的药物组合物和/或AAV颗粒的量来测定。
在一些实施方案中，本文公开向受试者的组织提供本公开的药物组合物和/或AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的方法，所述方法是通过在使得药物组合物和/或AAV颗粒大体上保留于组织(包含细胞，例如包含多个细胞)中的条件下使组织与药物组合物和/或AAV颗粒接触来进行。在一些实施方案中，本文所述的药物组合物和/或AAV颗粒包含足量活性成分以使得在至少一个细胞中产生所关注的效果。在一些实施方案中，药物组合物和/或AAV颗粒一般包含一种或多种细胞渗透剂。在一些实施方案中，本公开提供具有或不具有药学上可接受的载体的裸制剂(诸如不具有细胞渗透剂或其他剂)。
治疗方法
编码蛋白有效载荷的AAV颗粒
本公开提供用于将本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)引入细胞中的方法，所述方法包括将载体中的任一种以足以调节(例如增加)靶mRNA和/或蛋白产生的量引入所述细胞中。在一些方面，细胞可以是诸如但不限于运动神经元、海马体神经元、内嗅神经元、丘脑神经元、皮质神经元、感觉神经元、交感神经元或副交感神经元的神经元以及诸如星形胶质细胞、小神经胶质细胞和/或少突胶质细胞的胶质细胞。在其他方面，细胞可以是例如隔膜、四头肌或心脏(例如心房或心室)细胞的肌肉细胞。
本公开公开了用于治疗需要治疗的受试者的与例如靶蛋白的蛋白的功能/存在异常(例如不足或增加)相关的神经疾病/病症或神经系统变性病症、肌肉或神经肌肉病症或神经肿瘤病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含本公开的AAV颗粒的组合物。作为非限制性实例，AAV颗粒可增加受试者中的靶基因表达、增加靶蛋白产生并且因此减少神经疾病的一种或多种症状以使得受试者得到治疗性治疗。
在一些实施方案中，包含本公开的AAV颗粒的组合物是经由全身施用来施用于受试者的中枢神经系统。在一些实施方案中，全身施用为静脉内(IV)注射。在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒或包含本文所述的AAV颗粒的药物组合物是通过聚焦式超声波(FUS)，例如联合微气泡静脉内施用(FUS-MB)，或MRI引导的FUS联合静脉内施用来施用。
在一些实施方案中，包含本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物是经由心室内施用来施用于受试者的中枢神经系统。在一些实施方案中，心室内施用为大池内注射(ICM)。
在一些实施方案中，包含本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物是经由心室内注射和静脉内注射施用于受试者的中枢神经系统。
在一些实施方案中，包含本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物是经由ICM注射和静脉内注射以比剂量/受试者施用于受试者的中枢神经系统。作为非限制性实例，AAV颗粒是经由ICM注射以1×104个VG/受试者的剂量施用。作为非限制性实例，AAV颗粒是经由IV注射以2×1013个VG/受试者的剂量施用
在一些实施方案中，包含本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物是施用于受试者的中枢神经系统。在其他实施方案中，包含本公开的AAV颗粒的组合物是施用于受试者的CNS组织(例如受试者的壳核、丘脑或皮质)。
在一些实施方案中，包含本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物是经由实质内注射施用于受试者的中枢神经系统。实质内注射的非限制性实例包括壳核内、皮质内、丘脑内、纹状体内、海马体内或注射至内嗅皮质中。
在一些实施方案中，包含本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物是经由实质内注射和静脉内注射施用于受试者的中枢神经系统。
在一些实施方案中，包含本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物是经由心室内注射、实质内注射和静脉内注射施用于受试者的中枢神经系统。
在一些实施方案中，包含本公开的多个颗粒中的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物是经由静脉内注射施用于受试者的肌肉。在一些实施方案中，包含本公开的多个颗粒中的AAV颗粒的组合物是经由肌肉内注射施用于受试者的肌肉。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可递送至包括但不限于以下的特定类型的靶向细胞中：丘脑神经元、海马体神经元、内嗅神经元、皮质神经元、运动神经元、感觉神经元、兴奋性神经元、抑制性神经元、交感神经元或副交感神经元；胶质细胞，包括少突胶质细胞、星形胶质细胞和小神经胶质细胞；和/或围绕神经元的其他细胞，诸如T细胞。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可递送至例如四头肌、隔膜、肝和/或心脏细胞的肌肉细胞中。
在一些实施方案中，本公开的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可递送至壳核、丘脑和/或皮质中的神经元。
在一些实施方案中，本公开的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对神经疾病的疗法。
在一些实施方案中，本公开的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对tau蛋白病变的疗法。
在一些实施方案中，本公开的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对阿尔茨海默氏病的疗法。
在一些实施方案中，本公开的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对肌萎缩性侧索硬化的疗法。
在一些实施方案中，本公开的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对亨廷顿氏病的疗法。
在一些实施方案中，本公开的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对帕金森氏病的疗法。
在一些实施方案中，本公开的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对弗里德赖希共济失调的疗法。
在一些实施方案中，本公开的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对慢性疼痛或神经病变性疼痛的疗法。
在一些实施方案中，本公开的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对肌肉病症或神经肌肉病症的疗法。
在一些实施方案中，本公开的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对神经肿瘤病症的疗法。在一些实施方案中，神经肿瘤病症为初级CNS起源的癌症(例如CNS细胞和/或CNS组织癌症)。在一些实施方案中，神经肿瘤病症为CNS细胞、CNS区域和/或CNS组织中的转移癌。
在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可增加受试者中的靶蛋白水平。受试者中的靶蛋白水平可增加约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％，诸如但不限于在受试者的CNS、CNS区或CNS特异性细胞、或肌肉、肌肉区或肌肉细胞中。作为非限制性实例，AAV颗粒可使靶蛋白的蛋白水平增加至少50％。作为非限制性实例，AAV颗粒可使靶蛋白的蛋白水平增加至少40％。作为非限制性实例，受试者的靶蛋白可增加10％。作为非限制性实例，AAV颗粒可使靶蛋白的蛋白水平相对于基线成倍增加。在一些实施方案中，AAV颗粒导致靶蛋白水平高5-6倍。
在一些实施方案中，向受试者施用本文所述的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可增加受试者中的靶蛋白表达。受试者中的靶蛋白表达可增加约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％，诸如但不限于在受试者的CNS、CNS区或CNS特异性细胞、或肌肉、肌肉区或肌肉细胞中。作为非限制性实例，AAV颗粒可使靶蛋白表达增加至少50％。作为非限制性实例，AAV颗粒可使靶蛋白表达增加至少40％。
在一些实施方案中，向受试者静脉内施用本文所述的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可增加受试者的靶蛋白的CNS表达或肌肉中表达。受试者中的靶蛋白表达可增加约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％，诸如但不限于在受试者的CNS、CNS区或CNS特异性细胞、或肌肉、肌肉区或肌肉细胞中。作为非限制性实例，AAV颗粒可使靶蛋白在CNS中的表达增加至少50％。作为非限制性实例，AAV颗粒可使靶蛋白在CNS中的表达增加至少40％。在一些实施方案中，AAV颗粒可使靶蛋白在肌肉中的表达增加至少50％。在一些实施方案中，AAV颗粒可使靶蛋白在肌肉中的表达增加至少50％。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于增加靶蛋白在星形胶质细胞中的表达以便治疗神经疾病。星形胶质细胞中的靶蛋白可增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在一些实施方案中，AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于增加小神经胶质细胞中的靶蛋白。小神经胶质细胞中的靶蛋白增加可独立地为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％增加。
在一些实施方案中，AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于增加皮质神经元中的靶蛋白。皮质神经元中的靶蛋白增加可独立地为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％增加。
在一些实施方案中，AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于增加海马体神经元中的靶蛋白。海马体神经元中的靶蛋白增加可独立地为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％增加。
在一些实施方案中，AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于增加DRG和/或交感神经元中的靶蛋白。DRG和/或交感神经元中的靶蛋白增加可独立地为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％增加。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于增加感觉神经元中的靶蛋白以便治疗神经疾病。感觉神经元中的靶蛋白可增加5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于增加受试者中的靶蛋白并且减少神经疾病症状。靶蛋白增加和/或神经疾病症状减少可独立地更改(经改进以用于产生靶蛋白并且减少神经疾病症状)5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于减少功能能力和日常生活活动的减退，如通过标准评估系统(诸如但不限于总功能能力(TFC)量表)所测量。
在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于改进用于测量神经疾病的症状的任何评估的效能。此类评估包括但不限于阿兹海默病认知评估量表(Alzheimer Disease Assessment Scale-cognitive，ADAS-cog)、简易精神状态检查(Mini-Mental State Examination，MMSE)、老人忧郁量表(Geriatric Depression Scale，GDS)、功能活动问卷(Functional ActivitiesQuestionnaire，FAQ)、日常生活活动(Activities of Daily Living，ADL)、全科医师认知评估(General Practitioner Assessment of Cognition，GPCOG)、简易认知量表(Mini-Cog)、简略心理测试评分(Abbreviated Mental Test Score，AMTS)、画钟测试(Clock-drawing test)、6项认知障碍测试(6-item Cognitive Impairment Test，6-CIT)、记忆力测试(Test Your Memory，TYM)、蒙特利尔认知评估(Montreal Cognitive Assessment，MoCa)、阿登布鲁克斯认知评估(Addenbrookes Cognitive Assessment，ACE-R)、记忆障碍筛检(Memory Impairment Screen，MIS)、布里斯托尔日常生活活动量表(BristolActivities of Daily Living Scale，BADLS)、巴式指数(Barthel Index)、功能独立性测量(Functional Independence Measure)、工具性日常生活活动(InstrumentalActivities of Daily Living)、老人认知减退知情者问卷(Informant Questionnaire onCognitive Decline in the Elderly，IQCODE)、神经精神评估量表(NeuropsychiatricInventory)、柯恩-曼斯菲尔德激动情绪行为量表(The Cohen-Mansfield AgitationInventory)、BEHAVE-AD、EuroQol、简表-36(Short Form-36)和/或MBR照顾者压力量表(Caregiver Strain Instrument)，或如Sheehan B(Ther Adv Neurol Disord.5(6):349-358(2012))中所述的其他测试中的任一种，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施方案中，本公开的组合物是作为单独治疗剂或作为组合治疗剂施用以治疗神经疾病/病症或神经系统变性病症、肌肉病症或神经肌肉病症和/或神经肿瘤病症。
编码靶蛋白的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可与一种或多种其他治疗剂组合使用。在一些实施方案中，组合物可与一种或多种其他所需治疗剂或医疗程序并行、在其之前或在其在后施用。一般说来，各剂将以针对所述剂所确定的剂量和/或时程来施用。
可与本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)组合使用的治疗剂可以是小分子化合物，所述小分子化合物为抗氧化剂、消炎剂、抗细胞凋亡剂、钙调节剂、抗谷氨酸性剂、结构蛋白抑制剂、参与肌肉功能的化合物和参与金属离子调节的化合物。作为非限制性实例，组合疗法可与一种或多种神经保护剂，诸如对运动神经元退化的神经保护作用已经过测试的小分子化合物、生长因子和激素组合。
可与本文所述的AAV颗粒组合使用的经测试用于治疗神经疾病的化合物包括但不限于胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐(donepezil)、雷斯替明(rivastigmine)、加兰他敏(galantamine))；NMDA受体拮抗剂，诸如美金刚胺；抗精神病药；抗抑郁药；抗惊厥药(例如针对肌阵挛的丙戊酸钠和左乙拉西坦(levetiracetam))；分泌酶抑制剂；淀粉样蛋白聚集抑制剂；铜或锌调节剂；BACE抑制剂；tau聚集抑制剂，诸如亚甲基蓝、吩噻嗪、蒽醌、n-苯胺或罗丹明(rhodamine)；微管稳定剂，诸如NAP、紫杉醇或太平洋紫杉醇；激酶或磷酸酶抑制剂，诸如靶向GSK3β的激酶或磷酸酶抑制剂(锂)或靶向PP2A的激酶或磷酸酶抑制剂；Aβ肽或tau磷酸表位免疫接种；抗tau或抗淀粉样蛋白抗体；多巴胺耗乏剂(例如针对舞蹈病的丁苯那嗪(tetrabenazine))；苯并二氮杂卓(benzodiazepine)(例如针对肌阵挛、舞蹈病、肌张力不全症、僵硬和/或痉挛的氯硝西泮(clonazepam))；多巴胺的氨基酸前体(例如针对僵硬的左旋多巴(levodopa))；骨骼肌松弛剂(例如针对僵硬和/或痉挛的氯苯胺丁酸(baclofen)、替扎尼定(tizanidine))；神经肌肉结合点处引起肌肉瘫痪的乙酰胆碱释放的抑制剂(例如针对睡中磨牙和/或肌张力不全症的肉毒杆菌毒素(botulinum toxin))；非典型精神安定剂(例如针对精神病和/或烦躁易怒的奥氮平(olanzapine)和喹硫平(quetiapine)；针对精神病、舞蹈病和/或烦躁易怒的利培酮(risperidone)、舒必利(sulpiride)和氟哌啶醇(haloperidol)；针对耐治疗性精神病的氯氮平；针对具有显要阴性症状的精神病的阿立哌唑(aripiprazole))；选择性血清素再吸收抑制剂(SSRI)(例如针对抑郁症、焦虑症、强迫行为和/或烦躁易怒的西它普兰(citalopram)、氟西汀(fluoxetine)、帕罗西汀(paroxetine)、舍曲林(sertraline)、米氮平(mirtazapine)、文拉法辛(venlafaxine))；安眠药(例如针对睡眠-觉醒周期更改的佐匹克隆(xopiclone)和/或唑吡坦(zolpidem))；抗惊厥药(例如针对躁狂或轻躁狂的丙戊酸钠和卡马西平(carbamazepine))和情绪稳定剂(例如针对躁狂或轻躁狂的锂)。
神经营养因子可用于与本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合疗法中以治疗神经疾病。一般说来，神经营养因子是定义为促进神经元的存活、生长、分化、增殖和/或成熟或刺激神经元活性增加的物质。在一些实施方案中，本公开方法还包括将一种或多种营养因子递送至需要治疗的受试者中。营养因子可包括但不限于IGF-I、GDNF、BDNF、CTNF、VEGF、科里弗林(Colivelin)、扎利罗登(Xaliproden)、促甲状腺素释放激素和ADNF以及其变体。
一方面，本文所述的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可与诸如以下的表达神经营养因子的AAV颗粒共同施用：AAV-IGF-I(参见例如Vincent等人,Neuromolecular medicine,2004,6,79-85；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)和AAV-GDNF(参见例如Wang等人,J Neurosci.,2002,22,6920-6928；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，向受试者施用AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)将调节(例如增加或减少)受试者中的靶蛋白的表达，并且靶蛋白的存在、水平、活性和/或表达的调节(例如增加或减少)将减少受试者的神经疾病/病症或神经系统变性病症、肌肉病症或神经肌肉病症和/或神经肿瘤病症的影响和/或症状。
作为非限制性实例，靶蛋白可以是治疗性蛋白或其功能变体或抗体或其抗体结合片段。
包含RNAi剂或调节性多核苷酸的AAV颗粒
本公开提供用于将包含具有编码包含siRNA分子的有效载荷的核酸序列的病毒基因组的本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)引入细胞中的方法，所述方法包括将载体中的任一种以足以发生靶mRNA降解、由此活化细胞中的靶特异性RNAi的量引入所述细胞中。在一些方面，细胞可以是诸如但不限于运动神经元、海马体神经元、内嗅神经元、丘脑神经元、皮质神经元、感觉神经元、交感神经元或副交感神经元的神经元以及诸如星形胶质细胞、小神经胶质细胞和/或少突胶质细胞的胶质细胞。在其他方面，细胞可以是例如隔膜、四头肌或心脏(例如心房或心室)细胞的肌肉细胞。
本公开公开用于治疗需要治疗的受试者的与靶蛋白表达的功能障碍和/或异常(例如增加或减少)相关的神经疾病/病症或神经系统变性病症、肌肉或神经肌肉病症或神经肿瘤病症的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的包含AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物，所述AAV颗粒包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组。作为非限制性实例，siRNA分子可使受试者中的靶基因表达沉默、抑制靶蛋白产生并且减少神经疾病的一种或多种症状以使得受试者得到治疗性治疗。
在一些实施方案中，包含有包含编码一种或多种siRNA分子的病毒基因组的本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物包含允许在静脉内施用之后增强CNS和/或PNS细胞的转导的AAV衣壳。
在一些实施方案中，包含具有编码至少一种siRNA分子的病毒基因组的本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物是施用于受试者的中枢神经系统。在其他实施方案中，包含本公开的AAV颗粒的组合物是施用于受试者的组织(例如受试者的壳核、丘脑或皮质)。
在一些实施方案中，包含有包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物是经由全身施用来施用于受试者的中枢神经系统。在一些实施方案中，全身施用为静脉内注射。在一些实施方案中，本文所述的AAV颗粒或包含本文所述的AAV颗粒的药物组合物是通过聚焦式超声波(FUS)，例如联合微气泡静脉内施用(FUS-MB)，或MRI引导的FUS联合静脉内施用来施用。
在一些实施方案中，包含有包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的本公开的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物是经由实质内注射施用于受试者的中枢神经系统。实质内注射的非限制性实例包括壳核内、皮质内、丘脑内、纹状体内、海马体内或注射至内嗅皮质中。
在一些实施方案中，包含有包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物是经由实质内注射和静脉内注射施用于受试者的中枢神经系统。
在一些实施方案中，包含本公开的多个颗粒中的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合物是经由静脉内注射施用于受试者的肌肉。在一些实施方案中，包含本公开的多个颗粒中的AAV颗粒的组合物是经由肌肉内注射施用于受试者的肌肉。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可递送至包括但不限于以下的特定类型的靶向细胞中：丘脑神经元、海马体神经元、内嗅神经元、皮质神经元、运动神经元、感觉神经元、兴奋性神经元、抑制性神经元、交感神经元或副交感神经元；包括少突胶质细胞、星形胶质细胞和小神经胶质细胞的胶质细胞；和/或诸如T细胞的其他神经元周围细胞。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可递送至例如四头肌、隔膜、肝和/或心脏细胞的肌肉细胞中。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可递送至壳核、丘脑和/或皮质中的神经元。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对神经疾病的疗法。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对tau蛋白病变的疗法。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对阿尔茨海默氏病的疗法。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对肌萎缩性侧索硬化的疗法。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对亨廷顿氏病的疗法。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对帕金森氏病的疗法。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对弗里德赖希共济失调的疗法。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对肌肉病症或神经肌肉病症的疗法。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的例如多个颗粒的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用作针对神经肿瘤病症的疗法。在一些实施方案中，神经肿瘤病症为初级CNS起源的癌症(例如CNS细胞和/或CNS组织癌症)。在一些实施方案中，神经肿瘤病症为CNS细胞、CNS区域和/或CNS组织中的转移癌。
在一些实施方案中，向受试者施用包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可降低受试者中的靶蛋白水平。受试者中的靶蛋白水平可降低约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％，诸如但不限于在受试者的CNS、CNS区或CNS特异性细胞、或肌肉、肌肉区或肌肉细胞中。作为非限制性实例，AAV颗粒可使靶蛋白的蛋白水平降低至少50％。作为非限制性实例，AAV颗粒可使靶蛋白的蛋白水平降低至少40％。
在一些实施方案中，向受试者施用包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可降低受试者中的靶蛋白表达。受试者中的靶蛋白表达可降低约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％，诸如但不限于在受试者的CNS、CNS区或CNS特异性细胞、或肌肉、肌肉区或肌肉细胞中。作为非限制性实例，AAV颗粒可使靶蛋白表达降低至少50％。作为非限制性实例，AAV颗粒可使靶蛋白表达降低至少40％。
在一些实施方案中，向受试者施用包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可降低受试者的CNS中的靶蛋白表达。受试者中的靶蛋白表达可降低约30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％和100％，或至少20-30％、20-40％、20-50％、20-60％、20-70％、20-80％、20-90％、20-95％、20-100％、30-40％、30-50％、30-60％、30-70％、30-80％、30-90％、30-95％、30-100％、40-50％、40-60％、40-70％、40-80％、40-90％、40-95％、40-100％、50-60％、50-70％、50-80％、50-90％、50-95％、50-100％、60-70％、60-80％、60-90％、60-95％、60-100％、70-80％、70-90％、70-95％、70-100％、80-90％、80-95％、80-100％、90-95％、90-100％或95-100％，诸如但不限于在受试者的CNS、CNS区或CNS特异性细胞、或肌肉、肌肉区或肌肉细胞中。作为非限制性实例，AAV颗粒可使靶蛋白表达降低至少50％。作为非限制性实例，AAV颗粒可使靶蛋白表达降低至少40％。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于遏制星形胶质细胞中的靶蛋白以便治疗神经疾病。星形胶质细胞中的靶蛋白可经遏制5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。可减少的星形胶质细胞中的靶蛋白可以是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于遏制小神经胶质细胞中的靶蛋白。小神经胶质细胞中的靶蛋白遏制可独立地为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％遏制。减少可以是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于遏制皮质神经元中的靶蛋白。皮质神经元中的靶蛋白遏制可独立地为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％遏制。减少可以是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于遏制海马体神经元中的靶蛋白。海马体神经元中的靶蛋白遏制可独立地为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％遏制。减少可以是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于遏制DRG和/或交感神经元中的靶蛋白。DRG和/或交感神经元中的靶蛋白遏制可独立地为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％遏制。减少可以是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于遏制感觉神经元中的靶蛋白以便治疗神经疾病。感觉神经元中的靶蛋白可经遏制5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。可减少的感觉神经元中的靶蛋白可以是5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于遏制受试者中的靶蛋白并且减少神经疾病症状。靶蛋白遏制和/或神经疾病症状减少可独立地经减少或遏制5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或超过95％、5-15％、5-20％、5-25％、5-30％、5-35％、5-40％、5-45％、5-50％、5-55％、5-60％、5-65％、5-70％、5-75％、5-80％、5-85％、5-90％、5-95％、10-20％、10-25％、10-30％、10-35％、10-40％、10-45％、10-50％、10-55％、10-60％、10-65％、10-70％、10-75％、10-80％、10-85％、10-90％、10-95％、15-25％、15-30％、15-35％、15-40％、15-45％、15-50％、15-55％、15-60％、15-65％、15-70％、15-75％、15-80％、15-85％、15-90％、15-95％、20-30％、20-35％、20-40％、20-45％、20-50％、20-55％、20-60％、20-65％、20-70％、20-75％、20-80％、20-85％、20-90％、20-95％、25-35％、25-40％、25-45％、25-50％、25-55％、25-60％、25-65％、25-70％、25-75％、25-80％、25-85％、25-90％、25-95％、30-40％、30-45％、30-50％、30-55％、30-60％、30-65％、30-70％、30-75％、30-80％、30-85％、30-90％、30-95％、35-45％、35-50％、35-55％、35-60％、35-65％、35-70％、35-75％、35-80％、35-85％、35-90％、35-95％、40-50％、40-55％、40-60％、40-65％、40-70％、40-75％、40-80％、40-85％、40-90％、40-95％、45-55％、45-60％、45-65％、45-70％、45-75％、45-80％、45-85％、45-90％、45-95％、50-60％、50-65％、50-70％、50-75％、50-80％、50-85％、50-90％、50-95％、55-65％、55-70％、55-75％、55-80％、55-85％、55-90％、55-95％、60-70％、60-75％、60-80％、60-85％、60-90％、60-95％、65-75％、65-80％、65-85％、65-90％、65-95％、70-80％、70-85％、70-90％、70-95％、75-85％、75-90％、75-95％、80-90％、80-95％或90-95％。
在一些实施方案中，包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可用于减少功能能力和日常生活活动的减退，如通过标准评估系统(诸如但不限于总功能能力(TFC)量表)所测量。
在一些实施方案中，本公开的组合物是作为单独治疗剂或作为组合治疗剂施用以治疗神经疾病/病症或神经系统变性病症、肌肉病症或神经肌肉病症和/或神经肿瘤病症。
包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可与一种或多种其他治疗剂组合使用。在一些实施方案中，组合物可与一种或多种其他所需治疗剂或医疗程序并行、在其在前或在其之后施用。一般说来，各剂将以针对所述剂所确定的剂量和/或时程来施用。
可与包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)组合使用的治疗剂可以是小分子化合物，所述小分子化合物为抗氧化剂、消炎剂、抗细胞凋亡剂、钙调节剂、抗谷氨酸性剂、结构蛋白抑制剂、参与肌肉功能的化合物和参与金属离子调节的化合物。
可与包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒组合使用的经测试用于治疗神经疾病的化合物包括但不限于胆碱酯酶抑制剂(多奈哌齐、雷斯替明、加兰他敏)；NMDA受体拮抗剂，诸如美金刚胺；抗精神病药；抗抑郁药；抗惊厥药(例如针对肌阵挛的丙戊酸钠和左乙拉西坦)；分泌酶抑制剂；淀粉样蛋白聚集抑制剂；铜或锌调节剂；BACE抑制剂；tau聚集抑制剂，诸如亚甲基蓝、吩噻嗪、蒽醌、n-苯胺或罗丹明；微管稳定剂，诸如NAP、紫杉醇或太平洋紫杉醇；激酶或磷酸酶抑制剂，诸如靶向GSK3β的激酶或磷酸酶抑制剂(锂)或靶向PP2A的激酶或磷酸酶抑制剂；Aβ肽或tau磷酸表位免疫接种；抗tau或抗淀粉样蛋白抗体；多巴胺耗乏剂(例如针对舞蹈病的丁苯那嗪)；苯并二氮杂卓(例如针对肌阵挛、舞蹈病、肌张力不全症、僵硬和/或痉挛的氯硝西泮)；多巴胺的氨基酸前体(例如针对僵硬的左旋多巴)；骨骼肌松弛剂(例如针对僵硬和/或痉挛的氯苯胺丁酸、替扎尼定)；神经肌肉结合点处引起肌肉瘫痪的乙酰胆碱释放的抑制剂(例如针对睡中磨牙和/或肌张力不全症的肉毒杆菌毒素)；非典型精神安定剂(例如针对精神病和/或烦躁易怒的奥氮平和喹硫平；针对精神病、舞蹈病和/或烦躁易怒的利培酮、舒必利和氟哌啶醇；针对耐治疗性精神病的氯氮平；针对具有显要阴性症状的精神病的阿立哌唑)；选择性血清素再吸收抑制剂(SSRI)(例如针对抑郁症、焦虑症、强迫行为和/或烦躁易怒的西它普兰、氟西汀、帕罗西汀、舍曲林、米氮平、文拉法辛)；安眠药(例如针对睡眠-觉醒周期更改的佐匹克隆和/或唑吡坦)；抗惊厥药(例如针对躁狂或轻躁狂的丙戊酸钠和卡马西平)和情绪稳定剂(例如针对躁狂或轻躁狂的锂)。
神经营养因子可用于与包含具有编码一种或多种siRNA分子的核酸序列的病毒基因组的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)的组合疗法中以治疗神经疾病。一般说来，神经营养因子是定义为促进神经元的存活、生长、分化、增殖和/或成熟或刺激神经元活性增加的物质。在一些实施方案中，本公开方法还包括将一种或多种营养因子递送至需要治疗的受试者中。营养因子可包括但不限于IGF-I、GDNF、BDNF、CTNF、VEGF、科里弗林、扎利罗登、促甲状腺素释放激素和ADNF以及其变体。
一方面，编码用于至少一种靶向所关注的基因的siRNA双链体的核酸序列的AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)可与诸如以下的表达神经营养因子的AAV颗粒共同施用：AAV-IGF-I(参见例如Vincent等人,Neuromolecular medicine,2004,6,79-85；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)和AAV-GDNF(参见例如Wang等人,J Neurosci.,2002,22,6920-6928；所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中)。
在一些实施方案中，向受试者施用AAV颗粒(例如包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳多肽的AAV颗粒)将调节(例如减少)受试者中的靶基因、mRNA和/或蛋白的存在、水平、活性和/或表达，并且靶蛋白表达的减少将减少受试者的神经疾病/病症或神经系统变性病症、肌肉病症或神经肌肉病症和/或神经肿瘤病症的影响和/或症状。
定义
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语皆具有与本公开所属领域的一般技术者通常所理解的含义相同的含义。
除非相反地指示或另外从上下文显而易见，否则诸如“一(a/an)”和“所述(the)”的冠词可意指一个或超过一个。除非相反地指示或另外从上下文显而易见，否则如果组成员中的一个、超过一个或全部存在于、用于给定产物或工艺中或另外与给定产物或工艺有关，那么在所述组的一个或多个成员之间包括“或”的技术方案或描述被视为得到满足。本公开包括其中组的恰好一个成员存在于、用于给定产物或工艺中或另外与给定产物或工艺有关的实施方案。本公开包括其中超过一个或整个组成员存在于、用于给定产物或工艺中或另外与给定产物或工艺有关的实施方案。
还应注意，术语“包含”意图为开放的并且准许但不要求包括另外的要素或步骤。当本文使用术语“包含”时，因此还涵盖并且公开术语“由……组成”和“基本上由……组成”。
当给出范围的情况下，端点包括在内。此外，应理解，除非另外指示或另外从上下文和本领域技术人员的理解显而易见，否则表示为范围的值可假设本公开的不同实施方案中所陈述范围内的任何特定值或子范围，除非上下文另外清楚地规定，否则达到所述范围的下限的单位的十分之一。
腺相关病毒：如本文所用，术语“腺相关病毒”或“AAV”是指依赖病毒属的成员或其变体(例如功能变体)。在一些实施方案中，AAV为野生型或天然存在的。在一些实施方案中，AAV为重组的。
AAV颗粒：如本文所用，“AAV颗粒”是指包含例如AAV衣壳变体的AAV衣壳和例如病毒基因组或载体基因组的多核苷酸的颗粒或病毒颗粒。在一些实施方案中，AAV颗粒的病毒基因组包含至少一个有效载荷区和至少一个ITR。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒是包含例如具有至少一种肽(例如靶向肽)插入物的亲本衣壳序列的AAV衣壳多肽的AAV颗粒。在一些实施方案中，AAV颗粒能够将编码有效载荷的核酸(例如有效载荷区)递送至细胞，通常为哺乳动物(例如人类)细胞。在一些实施方案中，本公开的AAV颗粒可以重组方式产生。在一些实施方案中，AAV颗粒可衍生自本文所述或本领域中已知的包括血清型组合的任何血清型(例如“假型”AAV)，或衍生自各种基因组(例如单链的或自身互补的)。在一些实施方案中，AAV颗粒可以是复制缺陷型和/或经靶向的。在一些实施方案中，AAV颗粒可包含存在于(例如插入)衣壳中以增强针对所需靶组织的向性的肽(例如靶向肽)。应理解，对本公开的AAV颗粒的提及也包括其药物组合物，即使未明确地叙述。
施用：如本文所用，术语“施用”是指向受试者提供药剂或药物组合物。
改善：如本文所用，术语“改善(amelioration/ameliorating)”是指疾患或疾病的至少一个指标的严重程度减轻。举例说来，在神经退化病症的情形下，改善包括神经元损失的减少。
扩增子：如本文所用，“扩增子”可指形成为例如PCR的扩增事件产物的RNA或DNA的任何片段。在一些实施方案中，全长衣壳扩增子可用作下一代测序(NGS)库生成的模板。全长衣壳扩增子可用于克隆至DNA库中以进行任何数目的另外的如本文所述的AAV选择轮。
动物：如本文所用，术语“动物”是指动物界的任何成员。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的人类。在一些实施方案中，“动物”是指处于任何发育阶段的非人类动物。在某些实施方案中，非人类动物为哺乳动物(例如啮齿动物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、猫、绵羊、牛、灵长类动物或猪)。在一些实施方案中，动物包括但不限于哺乳动物、鸟、爬行动物、两栖动物、鱼和蠕虫。在一些实施方案中，动物为转基因动物、经基因工程改造的动物或克隆。
反义链：如本文所用，术语siRNA分子的“反义链”或“第一链”或“引导链”是指与经靶向达成沉默的基因的mRNA的约10-50个核苷酸(例如约15-30、16-25、18-23或19-22个核苷酸)的区段大体上互补的链。反义链或第一链具有与所需靶mRNA序列充分互补的序列以引导靶特异性沉默，例如足以通过RNAi机制或过程触发对所需靶mRNA的破坏的互补性。
大致：如本文所用，如应用于所关注的一个或多个值的术语“大致”或“约”是指类似于所陈述参考值的值。在某些实施方案中，除非另外说明或另外从上下文显而易见，否则术语“大致”或“约”是指在任一方向上(大于或小于)处于所陈述参考值的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小百分比之内的一系列值(但此类数字将超出可能值的100％的情况除外)。
生物淘选：如本文所用，术语“生物淘选”是指AAV衣壳库选择过程，所述过程包括施用具有增强的针对细胞和/或受试者的组织和/或细胞类型特异性转导的AAV颗粒；从所述经转导的组织和/或细胞类型特异性提取由所述AAV颗粒编码的核苷酸；和使用所提取的核苷酸以克隆至核苷酸库中来生成AAV颗粒以用于其后续轮。
衣壳：如本文所用，术语“衣壳”是指大体上(例如>50％、>60％、>70％、>80％、>90％、>95％、>99％或100％)为蛋白的病毒颗粒(例如AAV颗粒)的外部(例如蛋白壳)。在一些实施方案中，衣壳是包含本文所述的AAV衣壳蛋白(例如VP1、VP2和/或VP3多肽)的AAV衣壳。AAV衣壳蛋白可以是野生型AAV衣壳蛋白或变体，例如来自野生型或参考衣壳蛋白的结构和/或功能变体，它在本文中称为“AAV衣壳变体”。在一些实施方案中，本文所述的AAV衣壳变体具有封闭(例如封装)病毒基因组的能力和/或能够进入细胞(例如哺乳动物细胞)中。在一些实施方案中，本文所述的AAV衣壳变体可具有与野生型AAV衣壳(例如对应野生型衣壳)的向性相比经调节的向性。
互补和大体上互补：如本文所用，术语“互补”是指多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反平行多核苷酸链中的核苷酸单元之间的氢键形成。互补多核苷酸链可以Watson-Crick方式(例如A与T、A与U、C与G)或以允许形成双链体的任何其他方式形成碱基对。随着本领域技术人员意识到，当相对于DNA使用RNA时，尿嘧啶而非胸腺嘧啶是被视为与腺嘌呤互补的碱基。然而，除非另外说明，否则当在本公开的上下文中指示U时，暗示能够取代T。完美互补性或100％互补性是指一个多核苷酸链的各核苷酸单元可与第二多核苷酸链的核苷酸单元一起形成氢键的情形。次完美互补性是指两条链的核苷酸单元中的一些而非全部可彼此形成氢键的情形。举例说来，对于两个20聚体，如果各链上仅两个碱基对可彼此形成氢键，那么多核苷酸链展现10％互补性。在同一实例中，如果各链上的18个碱基对可彼此形成氢键，那么多核苷酸链展现90％互补性。如本文所用，术语“互补”可涵盖完全互补、部分互补或大体上互补。如本文所用，术语“大体上互补”意指siRNA具有足以结合所需靶mRNA并且触发靶mRNA的RNA沉默的序列(例如在反义链中)。“完全互补”、“完美互补性”或“100％互补性”是指一个多核苷酸或寡核苷酸链的各核苷酸单元可与第二多核苷酸或寡核苷酸链的核苷酸单元进行碱基配对的情形。
控制元件：如本文所用，“控制元件”、“调节性控制元件”或“调节性序列”是指提供接受细胞中的编码序列的复制、转录和翻译的启动子区、多腺苷酸化信号、转录终止序列、上游调节域、复制起点、内部核糖体进入位点(“IRES”)、增强子等。并非所有这些控制元件皆需要始终存在，只要所选择的编码序列能够在适当宿主细胞中进行复制、转录和/或翻译即可。
递送：如本文所用，“递送”是指递送AAV颗粒、化合物、物质、实体、部分、负荷物或有效载荷的动作或方式。
元件：如本文所用，术语“元件”是指实体的不同部分。在一些实施方案中，元件可以是并入较长多核苷酸序列中的具有特定目的的多核苷酸序列。
封装：如本文所用，术语“封装”意指封闭、包围或包覆。例如，例如AAV衣壳变体的衣壳蛋白常常封装病毒基因组。在一些实施方案中，封装于例如AAV衣壳变体的衣壳内涵盖由衣壳进行的100％覆盖以及小于100％覆盖，例如95％、90％、85％、80％、70％、60％或更小覆盖。举例说来，例如在进入细胞中之前，空位或不连续可存在于衣壳中，只要病毒基因组保留于衣壳中即可。
经工程改造：如本文所用，当本公开的实施方案经设计以具有从起始点、野生型或原生分子变化的特点或特性(无论结构上抑或化学上)时，所述实施方案是“经工程改造的”。
有效量：如本文所用，术语剂的“有效量”是足以实现有益或所需的结果(例如临床结果)的量，并且因此“有效量”是视其应用情形而定。举例说来，在施用治疗癌症的剂的情形下，剂的有效量是例如与在未施用所述剂的情况下所获得的反应相比足以达成如本文所定义的癌症治疗的量。
表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一者或多者：(1)由DNA序列产生RNA模板(例如通过转录)；(2)加工RNA转录物(例如通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'端加工)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白；和(4)多肽或蛋白的翻译后修饰。
制剂：如本文所用，“制剂”包括至少一种AAV颗粒(活性成分)和赋形剂和/或非活性成分。
片段：如本文所用，“片段”是指一部分。举例说来，抗体片段可包含CDR或重链可变区或scFv等。
功能性：如本文所用，“功能性”生物分子是呈展现一种特性和/或活性的形式的生物分子。
双重功能靶向：如本文所用，“双重功能靶向”调节性多核苷酸是引导链和过客链均敲低同一靶或引导链和过客链敲低不同靶的多核苷酸。
基因表达：术语“基因表达”是指核酸序列进行转录和/或翻译以产生蛋白或肽的过程。为了清楚起见，当提及“基因表达”的测量时，它应理解为意指可测量转录的核酸产物，例如RNA或mRNA；或翻译的氨基酸产物，例如多肽或肽。测量RNA、mRNA、多肽和肽的量或水平的方法为本领域中已知的。
同源性：如本文所用，术语“同源性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。在一些实施方案中，如果聚合物分子的序列至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％同一或类似，那么所述聚合物分子被视为彼此“同源”。术语“同源”必然指在至少两个序列(多核苷酸或多肽序列)之间的比较。根据本公开，如果对于具有至少约20个氨基酸的至少一个延伸部，两个多核苷酸序列所编码的多肽至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或甚至99％同一，那么所述两个多核苷酸序列被视为同源的。在一些实施方案中，同源多核苷酸序列的特征在于编码具有至少4-5个独特地指定的氨基酸的延伸部的能力。对于长度少于60个核苷酸的多核苷酸序列，同源性是由编码具有至少4-5个独特地指定的氨基酸的延伸部的能力来测定。根据本公开，如果对于具有至少约20个氨基酸的至少一个延伸部，两个蛋白为至少约50％、60％、70％、80％或90％同一，那么所述两个蛋白序列被视为同源的。
同一性：如本文所用，术语“同一性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。举例说来，两个多核苷酸序列的同一性百分比的计算可通过出于最佳比较目的而比对两个序列来执行(例如出于比较目的，可将空位引入第一和第二核酸序列中的一者或两者中以进行最佳比对并且可忽略非同一序列)。在某些实施方案中，出于比较目的而比对的序列的长度为参考序列的长度的至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。接着，比较在对应核苷酸位置处的核苷酸。当第一序列中的位置由与第二序列中的对应位置相同的核苷酸占据时，那么所述分子在所述位置处同一。考虑到为了最佳比对两个序列而需要引入的空位数目和各空位长度，两个序列之间的同一性百分比随所述序列共有的同一位置数目变化。可使用数学算法来实现序列比较和两个序列之间的同一性百分比测定。举例说来，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用诸如以下文献中所述的方法的方法来测定：Computational Molecular Biology,Lesk,A.M编,Oxford UniversityPress,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W编,Academic Press,New York,1993；Sequence Analysis in Molecular Biology,vonHeinje,G.,Academic Press,1987；Computer Analysis of Sequence Data,第I部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G编,Humana Press,New Jersey,1994；和Sequence AnalysisPrimer,Gribskov,M.和Devereux,J编,M Stockton Press,New York,1991；所述文献中每一者的内容以全文引用的方式并入本文中。举例说来，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用已并入ALIGN程序(2.0版本)中的Meyers和Miller(CABIOS,1989,4:11-17)算法、使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4来测定。可替代地，两个核苷酸序列之间的同一性百分比可使用GCG套装软件中的GAP程序、使用NWSgapdna.CMP矩阵来测定。通常用于测定序列之间的同一性百分比的方法包括但不限于Carillo,H.和Lipman,D.,SIAMJ Applied Math.,48:1073(1988)中所公开的方法，所述文献以引用的方式并入本文中。用于测定同一性的技术编撰于公开可获得的计算机程序中。用于测定两个序列之间的同源性的示例性计算机软件包括但不限于GCG套装程序(Devereux,J.等人,Nucleic AcidsResearch,12(1),387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.,215,403(1990))。
抑制基因表达：如本文所用，措辞“抑制基因表达”意指使基因表达产物的量减少。表达产物可以是从基因转录的RNA(例如mRNA)或由从基因转录的mRNA翻译的多肽。通常来说，mRNA水平的减少引起从它翻译的多肽的水平减少。表达水平可使用测量mRNA或蛋白的标准技术来测定。
插入物：如本文所用，术语“插入物”在提及多肽时是指向氨基酸序列(例如亲本AAV衣壳序列)中添加一个或多个氨基酸(例如肽，例如靶向肽序列)。在一些实施方案中，插入可引起氨基酸序列(例如亲本AAV衣壳序列)的一个或多个氨基酸的置换。在一些实施方案中，插入可未引起氨基酸序列(例如亲本AAV衣壳序列)的变化，一个或多个氨基酸(例如肽，例如靶向肽序列)的添加除外。
反向末端重复序列：如本文所用，术语“反向末端重复序列”或“ITR”是指用于将多核苷酸序列包装至病毒衣壳中的顺式调节元件。
分离的：如本文所用，术语“分离的”是指物质或实体从天然状态更改或去除，例如从在天然状态中与它相关的组分中的至少一些更改或去除。举例说来，天然存在于活动物中的核酸或肽并非“分离的”，但从其天然状态的共存材料部分或完全分离的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以大体上纯化形式存在，或可存在于诸如宿主细胞的非天然环境中。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，并且仍经分离以使得此类载体或组合物不是自然界中发现它的环境的一部分。在一些实施方案中，分离的核酸为重组的，例如并入载体中。
库：如本文所用，术语“库”是指线性多肽、多核苷酸、病毒颗粒或病毒载体的多样集合。例如，库可以是DNA库或AAV衣壳库。
分子骨架：如本文所用，“分子骨架”是形成序列或结构性基础的框架或起始分子，在所述基础上设计或制造后续分子。
神经疾病：如本文所用，“神经疾病”是与中枢或周围神经系统和其组分(例如神经元)相关的任何疾病。
天然存在的：如本文所用，“天然存在的”或“野生型”是指物质或实体尚未从天然状态更改(例如结构上更改)或去除，例如从在天然状态中与它相关的组分中的至少一些去除。在一些实施方案中，天然存在的在提及序列时是指与野生型序列或其天然存在的变体同一的序列。
正交演化：如本文所用，术语“正交演化”是指一种方法，其中在一组任何数目的可来自不同物种和/或品系的细胞类型和/或受试者类型中施用AAV颗粒以用于第一轮如本文所述的AAV选择，并且其中在一组任何数目的可来自不同物种和/或品系的细胞类型和/或受试者类型中或在一组任何数目的可来自相同物种和/或品系的细胞类型和/或受试者类型中执行任何数目的另外的(例如后续)AAV选择轮。
开放阅读框：如本文所用，“开放阅读框”或“ORF”是指在给定阅读框中不含终止密码子的序列。
亲本序列：如本文所用，“亲本序列”是衍生出变体的核酸或氨基酸序列。在一些实施方案中，亲本序列是其中插入有异源序列的序列。换句话说，亲本序列可被视为接受(acceptor/recipient)序列。在一些实施方案中，亲本序列是其中插入有靶向序列的AAV衣壳序列。
颗粒：如本文所用，“颗粒”是包含至少两种组分(即蛋白衣壳和封闭于衣壳内的多核苷酸序列)的病毒。
患者：如本文所用，“患者”是指可能寻求或需要治疗、要求治疗、正在接受治疗、即将接受治疗的受试者或受到经过训练的专业人员针对特定疾病或疾患的照护的受试者。
有效载荷区：如本文所用，“有效载荷区”是编码一种或多种本公开的“有效载荷”的任何核酸序列(例如在病毒基因组内)。作为非限制性实例，有效载荷区可以是AAV颗粒的病毒基因组内的编码有效载荷的核酸序列，其中有效载荷为RNAi剂或多肽。本公开的有效载荷可以是但不限于肽、多肽、蛋白、抗体、RNAi剂等。
多肽：如本文所用，“多肽”意指最常通过肽键连接在一起的氨基酸残基(天然或非天然)的聚合物。如本文所用，所述术语是指具有任何尺寸、结构或功能的蛋白、多肽和肽。在一些情况下，经编码的多肽小于约50个氨基酸，那么将所述多肽称为肽。如果所述多肽为肽，那么其长度将为至少约2、3、4或至少5个氨基酸残基。因此，多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直系同源物、旁系同源物、前述各物的片段和其他等效物、变体和类似物。多肽可以是单分子或可以是多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。它们也可包含单链或多链多肽，并且可以是缔合的或连接的。术语多肽也可应用于其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物。
多肽变体：术语“多肽变体”是指氨基酸序列与天然或参考序列不同的分子。与天然或参考序列相比，氨基酸序列变体可在氨基酸序列内的某些位置处具有取代、缺失和/或插入。在一些实施方案中，变体包含与天然或参考序列具有至少约50％、至少约80％或至少约90％同一性(同源性)的序列。
肽：如本文所用，“肽”的长度为少于或等于50个氨基酸，例如长度为约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸。
药学上可接受的：措辞“药学上可接受的”在本文中用于指在合理医学判断范畴内适合与人类和动物的组织接触使用而无过度毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症、与合理效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。
预防(Preventing)：如本文所用，术语“预防(preventing/prevention)”是指部分或完全延迟感染、疾病、病症和/或疾患的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特点或临床表达的发作；部分或完全延迟特定感染、疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状、特点或表达的发作；部分或完全延迟感染、特定疾病、病症和/或疾患的进展；和/或降低罹患与感染、疾病、病症和/或疾患相关的病变的风险。
预防性：如本文所用，“预防性”是指用于预防疾病扩散的治疗或作用过程。
预防：如本文所用，“预防”是指为维持健康并且预防疾病扩散而采取的措施。
区域(Region)：如本文所用，术语“区域”是指区带(zone)或一般区域(area)。在一些实施方案中，当提及蛋白或蛋白模块时，区域可包含沿着蛋白或蛋白模块的线性氨基酸序列，或可包含三维区域、表位和/或表位簇。在一些实施方案中，区域包含末端区。如本文所用，术语“末端区”是指位于给定剂的端部或末端处的区域。当提及蛋白时，末端区可包含N端和/或C端。
在一些实施方案中，当提及多核苷酸时，区域可包含沿着多核苷酸的线性核酸序列，或可包含三维区域、二级结构或三级结构。在一些实施方案中，区域包含末端区。如本文所用，术语“末端区”是指位于给定剂的端部或末端处的区域。当提及多核苷酸时，末端区可包含5'端和/或3'端。
RNA或RNA分子：如本文所用，术语“RNA”或“RNA分子”或“核糖核酸分子”是指核糖核苷酸的聚合物；术语“DNA”或“DNA分子”或“脱氧核糖核酸分子”是指脱氧核糖核苷酸的聚合物。DNA和RNA可例如分别通过DNA复制和DNA转录来天然地合成；或以化学方式合成。DNA和RNA可以是单链的(即，分别为ssRNA或ssDNA)或多链的(例如双链的，即，分别为dsRNA和dsDNA)。如本文所用，术语“mRNA”或“信使RNA”是指编码一个或多个多肽链的氨基酸序列的单链RNA。
RNA干扰或RNAi：如本文所用，术语“RNA干扰”或“RNAi”是指由RNA分子介导的序列特异性调节机制，所述介导引起对对应蛋白编码基因的表达的抑制或干扰或“沉默”。已在许多类型的生物中观测到RNAi，所述生物包括植物、动物和真菌。RNAi天然存在于细胞中以去除外来RNA(例如病毒RNA)。天然RNAi经由从游离dsRNA裂解的片段前进，所述片段将降解机制引导至其他类似RNA序列。RNAi受RNA诱导的沉默复合体(RISC)控制并且由细胞的细胞质中的短/小dsRNA分子启动，在所述细胞质中它们与催化性RISC组分AGO蛋白(argonaute)相互作用。可将dsRNA分子外源地引入细胞中。外源性dsRNA通过活化核糖核酸酶蛋白Dicer启动RNAi，所述核糖核酸酶蛋白Dicer结合并且裂解dsRNA以产生具有21-25个碱基对的双链片段，其中各端上有几个未配对的悬突碱基。这些短双链片段被称为小干扰RNA(siRNA)。
RNAi剂：如本文所用，术语“RNAi剂”是指可诱导对靶基因和/或其蛋白产物的表达的抑制、干扰或“沉默”的RNA分子或其衍生物。RNAi剂可剔除(几乎消除或消除)表达，或敲低(衰减或减少)表达。RNAi剂可以是但不限于dsRNA、siRNA、shRNA、前体miRNA、初级miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA。
miR结合位点：如本文所用，“miR结合位点”包含能够经由完全或部分杂交来完全或部分结合、或经由完全或部分杂交来完全或部分结合至微小RNA(miR)的核酸序列(无论RNA抑或DNA，例如相差RNA的“U”或DNA中的“T”)。通常来说，此类结合在反向补体取向上发生在miR与miR结合位点之间。在一些实施方案中，miR结合位点是由编码miR结合位点的AAV载体基因组转录。
在一些实施方案中，miR结合位点可经串联编码或转录。此类“miR结合位点系列”或“miR BSs”可包括两个或更多个具有相同或不同核酸序列的miR结合位点。
间隔子：如此处所用，“间隔子”一般是位于两个或更多个连续miR结合位点序列之间的例如长度为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸的任何所选核酸序列。间隔子的长度也可以是超过10个核苷酸，例如20、30、40或50个或超过50个核苷酸。
样品：如本文所用，术语“样品”或“生物样品”是指它的组织、细胞、核酸或组分部分的子集(例如体液，包括但不限于血液、血清、粘液、淋巴液、滑液、脑脊髓液、唾液、羊水、羊膜脐带血、尿液、阴道液和精液)。样品还可包括由全生物或它的组织、细胞或组分部分的子集或其馏份或部分(包括但不限于例如血浆；血清；脊髓液；淋巴液；皮肤、呼吸道、肠道和生殖泌尿道的外部切片；泪液；唾液；乳汁；血球；肿瘤；器官)制备的均质物、溶胞物或提取物。样品进一步指可含有诸如蛋白或核酸分子的细胞组分的培养基，诸如营养肉汤或凝胶。
自身互补病毒颗粒：如本文所用，“自身互补病毒颗粒”是包含至少两种组分(即蛋白衣壳和封闭于衣壳内的自身互补病毒基因组)的颗粒。
有义链：如本文所用，术语siRNA分子的“有义链”或“第二链”或“过客链”是指与反义链或第一链互补的股。siRNA分子的反义链与有义链杂交以形成双链体结构。如本文所用，“siRNA双链体”包括与经靶向达成沉默的基因的mRNA的约10-50个核苷酸的区段具有足够互补性的siRNA链以及具有足够互补性以与另一siRNA链形成双链体的siRNA链。
相似性：如本文所用，术语“相似性”是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子(例如DNA分子和/或RNA分子)之间和/或多肽分子之间的总体相关性。聚合物分子彼此的相似性百分比的计算可以与同一性百分比的计算相同的方式执行，不同之处在于相似性百分比的计算考虑如本领域中所理解的保守性取代。
短干扰RNA或siRNA：如本文所用，术语“短干扰RNA”、“小干扰RNA”或“siRNA”是指能够引导或介导RNAi的包含在约5-60个之间的核苷酸(或核苷酸类似物)的RNA分子(或RNA类似物)。优选地，siRNA分子包含在约15-30个之间的核苷酸或核苷酸类似物，诸如在约16-25个之间的核苷酸(或核苷酸类似物)、在约18-23个之间的核苷酸(或核苷酸类似物)、在约19-22个之间的核苷酸(或核苷酸类似物)(例如19、20、21或22个核苷酸或核苷酸类似物)、在约19-25个之间的核苷酸(或核苷酸类似物)和在约19-24个之间的核苷酸(或核苷酸类似物)。术语“短”siRNA是指包含5-23个核苷酸、优选21个核苷酸(或核苷酸类似物)、例如19、20、21或22个核苷酸的siRNA。术语“长”siRNA是指包含24-60个核苷酸、优选约24-25个核苷酸、例如23、24、25或26个核苷酸的siRNA。在一些情况下，短siRNA可包括少于19个核苷酸，例如16、17或18个核苷酸，或少至5个核苷酸，其限制条件在于较短siRNA保留介导RNAi的能力。同样地，在一些情况下，长siRNA可包括超过26个核苷酸，例如27、28、29、30、35、40、45、50、55或甚至60个核苷酸，其限制条件在于较长siRNA保留介导RNAi或翻译抑制而不需进一步加工(例如酶加工)成短siRNA的能力。siRNA可以是单链RNA分子(ss-siRNA)或包含杂交以形成称为siRNA双链体的双链体结构的有义链和反义链的双链RNA分子(ds-siRNA)。
受试者：如本文所用，术语“受试者”或“患者”是指例如出于实验、诊断、预防和/或治疗目的而可施用根据本公开的组合物的任何生物。典型受试者包括动物(例如哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、兔、非人类灵长类动物和人类)和/或植物。
大体上：如本文所用，术语“大体上”是指展现所关注的特征或特性的全部或接近全部限度或程度的定性状况。生物领域中的技术人员应理解，生物和化学现象很少(若曾有)进行完整和/或继续达到完整或达成或避免绝对结果。因此，术语“大体上”在本文中用于获得许多生物和化学现象中所固有的完整性的潜在缺乏。
靶向肽：如本文所用，“靶向肽”是指长度为3-20个氨基酸的肽。这些靶向肽可插入亲本氨基酸序列中或连接至亲本氨基酸序列以更改母蛋白的特征(例如向性)。作为非限制性实例，靶向肽可插入AAV衣壳序列中以增强对所需细胞类型、组织、器官或生物的靶向。应理解，靶向肽是由可类似地插入亲本多核苷酸序列中的靶向多核苷酸编码。因此，“靶向序列”是指用于插入适当亲本序列(分别为氨基酸或多核苷酸)中的肽或多核苷酸序列。
靶细胞：如本文所用，“靶细胞”或“靶组织”是指任一个或多个所关注的细胞。细胞可见于体外、体内、原位或可见于生物的组织或器官中。生物可以是动物，优选地哺乳动物，更优选地人类并且最优选地患者。
治疗剂：术语“治疗剂”是指当向受试者施用时具有治疗、诊断和/或预防效果和/或引发所需生物学和/或药理学效果的任何剂。
治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指当向患有或易患感染、疾病、病症和/或疾患的受试者施用时足以治疗感染、疾病、病症和/或疾患、改善其症状、对其进行诊断、预防和/或延迟其发作的待递送的药剂(例如核酸、药物、治疗剂、诊断剂、预防剂等)的量。在一些实施方案中，治疗有效量是以单次剂量形式提供。
治疗有效结果：如本文所用，术语“治疗有效结果”意指在患有或易患感染、疾病、病症和/或疾患的受试者中足以治疗感染、疾病、病症和/或疾患、改善其症状、对其进行诊断、预防和/或延迟其发作的结果。
治疗：如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全减缓、改善、改进、减轻特定感染、疾病、病症和/或疾患、延迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或降低其一种或多种症状或特点的发生率。举例说来，“治疗”癌症可指抑制肿瘤的存活、生长和/或扩散。出于降低罹患与疾病、病症和/或疾患相关的病变的风险的目的，可向未展现疾病、病症和/或疾患的病征的受试者和/或向仅展现疾病、病症和/或疾患的早期病征的受试者施用治疗。
变体：如本文所用，术语“变体”是指具有与参考序列大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％序列同一性)的氨基酸或核苷酸序列的多肽或多核苷酸。在一些实施方案中，变体为功能变体。
功能变体：如本文所用，术语“功能变体”是指具有参考序列的至少一种活性的多肽变体或多核苷酸变体。
插入型变体：当提及多肽时，“插入型变体”是例如紧邻氨基酸序列中的一个位置或紧随其后插入有一个或多个氨基酸的变体。“紧邻氨基酸”或“紧随氨基酸之后”意指连接至氨基酸的α-羧基或α-氨基官能团。
缺失型变体：当提及多肽时，“缺失型变体”是相对于参考蛋白来说缺失一个或多个氨基酸的变体。
载体：如本文所用，术语“载体”是转运、转导或另外充当异源分子的运载体的任何分子或部分。在一些实施方案中，载体可以是质粒。在一些实施方案中，载体可以是病毒。AAV颗粒为载体的实例。本公开的载体可以重组方式产生，并且可基于和/或可包含腺相关病毒(AAV)亲本序列或参考序列。异源分子可以是多核苷酸和/或多肽。
病毒基因组：如本文所用，术语“病毒基因组”或“载体基因组”是指封装于AAV颗粒中的一个或多个核酸序列。病毒基因组包含具有至少一个编码有效载荷的有效载荷区和至少一个ITR的核酸序列。
等效方案和范畴
本文所引用的每一专利、专利申请和公布的公开内容均特此以全文引用的方式并入本文中。本领域技术人员将认识到或能够仅使用常规实验即可确定本文所述的公开的具体实施方案的许多等效方案。本公开的范畴不意图受限于以上描述，而是如所附权利要求书中所阐述。
另外，应理解，属于现有技术内的本公开的任何特定实施方案可从任一个或多个技术方案中明确排除。因为认为此类实施方案是本领域技术人员已知的，因此可对其进行排除，即使未在本文中明确地阐述所述排除。出于任何原因，无论是否与现有技术的存在有关，本公开的组合物的任何特定实施方案(例如任何抗生素、治疗性或活性成分；任何产生方法；任何使用方法；等)均可从任一个或多个技术方案中排除。
应理解，已使用的措辞为描述性而非限制性措辞，并且可在不背离本公开在其较广泛方面的真实范畴和精神的情况下，在所附权利要求书的范围内作出改变。
尽管已相对于所描述的若干实施方案以一定长度和一定特殊性描述本公开，但并非意指本公开应受限于任何此类细节或实施方案或任何特定实施方案，而是应参考所附权利要求书进行解释，以便考虑到现有技术提供对此类技术方案的尽可能最广泛的解释，因此有效地涵盖本公开的预期范畴。
本公开由以下非限制性实施例进一步说明。
实施例
实施例1.肽呈递衣壳库配置
通过将诸如但不限于5聚体、6聚体、7聚体和/或9聚体氨基酸的随机化n聚体氨基酸插入包括AAV5、AAV6或AAV-DJ8以及AAV9衣壳的任何AAV衣壳血清型和/或其变体的表面暴露的高变环I、环IV、环VI和/或环VIII区中来配置肽呈递衣壳库。编码肽呈递衣壳库的基因视所需向性而处于任何启动子的控制下，所述启动子例如为神经元特异性突触蛋白启动子(SYN或Syn)或星形胶质细胞特异性GFAP启动子。
进一步配置肽呈递衣壳库以使得一个或多个n聚体肽插入遵循相连(或连续)设计和/或非相连(或非连续)或分割设计或其组合，其中一个或多个插入位置是使用滑动窗算法来定位。作为非限制性实例，肽插入可以是具有源于例如氨基酸454-461的任何氨基酸位置处的滑动窗的AAV9 6聚体相连肽插入。作为另一非限制性实例，肽插入可以是具有源于例如氨基酸586-588的任何氨基酸位置处的滑动窗的AAV9 3聚体肽分割设计或相连肽插入。作为另一非限制性实例，肽插入可以是具有源于例如氨基酸585-590的任何氨基酸位置处的滑动窗的AAV9 6聚体和/或7聚体肽相连肽插入。
任何数目的此类经配置的肽呈递衣壳库可以汇集在包括非人类灵长类动物(NHP)细胞和/或受试者在内的细胞和/或受试者中，并且经由包括但不限于IV和/或ICM注射的任何途径以任何VG/细胞和/或VG/受试者剂量施用于任何组织(例如中枢神经系统组织)。作为非限制性实例，六个经配置的肽呈递衣壳库经汇集并且经由1×1014个VG/NHP剂量的静脉内施用来施用于NHP的中枢神经系统。作为另一非限制性实例，六个库经汇集并且经由2×1013个VG/NHP剂量的心室内施用，诸如但不限于作为大池内注射(ICM)的心室内施用来施用于NHP的中枢神经系统。
实施例2.非人类灵长类动物AAV衣壳库的鉴定和设计
根据与WO2020072683中所述的方法类似或等效的方法来开发并且实施用于非人类灵长类动物(NHP)中增加的神经系统组织转导的TRACER RNA驱动库选择，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中，特别地涉及TRACER方法。
所生成的AAV库(例如AAV9库)是通过任何途径以给定的VG剂量/只动物施用于NHP。向多组NHP中施用衍生自野生型AAV9侧接序列的启动子驱动(例如SYN驱动或GFAP驱动)库，而其他组接受含有野生型AAV血清型序列、PHP.eB衍生的AAV血清型序列或其他AAV血清型序列的汇集库。在一段时间之后，从诸如但不限于脊髓和脑组织的组织提取RNA。使RNA制剂经受mRNA富集。将富集的mRNA反转录成cDNA。扩增所述cDNA。这种方法允许从组织样品回收充足的扩增子。
使用全长衣壳扩增子作为用于NGS库生成以及克隆至DNA库中的模板以用于一个或多个随后或后续轮的生物淘选(图1A和图1B)。可执行任何轮数的AAV选择。在AAV选择轮中，独特衣壳变体的总数可减少一倍量。衣壳库可在任何步骤中与本文所述的任何其他衣壳库汇集或组合。
在RNA回收和PCR扩增之后，执行系统性NGS富集分析。评估衣壳富集比，包括与基准的比较和序列收敛。
使用本文所述的方法中的任一种来评估并且优化肽库候选物，并且例如使用与WO2020072683中所述的方法类似或等效的方法来实施，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中，尤其实施例8、9和10的主题。生成最高级肽变体并且如WO2020072683中所述来评估转导效力，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中，尤其实施例10、12和13的主题。
实施例3.正交演化AAV衣壳库的鉴定和设计
这一研究涉及正交演化的使用，其中可在一组任何数目的可来自不同物种和/或品系的细胞类型和/或受试者类型中施用AAV颗粒以用于第一轮AAV选择；并且其中在一组任何数目的可来自不同物种和/或品系的细胞类型和/或受试者类型中或在一组任何数目的可来自相同物种和/或品系的细胞类型和/或受试者类型中执行任何另外的(即后续的)AAV选择轮，如图2中所展现。
根据与WO2020072683中所述的方法类似或等效的方法来开发并且实施用于一组任何数目的可来自不同物种和/或品系的细胞类型和/或受试者类型中增加的神经系统组织转导的基于ATRACER的RNA驱动库选择，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中，尤其实施例7的主题。通过任何途径以给定的VG剂量/受试者和/或细胞向非人类灵长类动物(NHP)、啮齿动物(例如大鼠)和/或细胞(例如人类脑微血管内皮细胞或hBMVEC)施用所生成的AAV库(例如AAV9库)以用于第一轮AAV选择(生物淘选)。向多组NHP、啮齿动物和/或细胞中施用衍生自野生型AAV9序列的启动子驱动(例如SYN驱动或GFAP驱动)库，而其他组接受含有野生型AAV血清型序列、PHP.eB衍生的AAV血清型序列或其他AAV血清型序列的汇集库。在一段时间之后，从诸如但不限于脊髓和脑组织的组织提取RNA。使RNA制剂经受mRNA富集。将富集的mRNA反转录成cDNA。扩增所述cDNA。这种方法允许从组织样品回收充足的扩增子。
使用全长衣壳扩增子作为用于NGS库生成以及克隆至DNA库中的模板以用于一个或多个随后或后续轮的生物淘选。在如用于上文所描述的第一轮中的一组任何数目的可来自不同物种和/或品系的细胞类型和/或受试者类型中或在如用于上文所描述的第一轮中的一组任何数目的可来自相同物种和/或品系的细胞类型和/或受试者类型中执行后续轮的生物淘选。执行任何轮数的选择。在AAV选择轮中，独特衣壳变体的总数可减少一倍量。衣壳库可在任何步骤中与本文所述的任何其他衣壳库汇集或组合(图2)。
在RNA回收和PCR扩增之后，执行系统性NGS富集分析。评估衣壳富集比，包括与基准的比较和序列收敛。
使用本文所述的方法中的任一种来评估并且优化肽库候选物，并且例如使用与WO2020072683中所述的方法类似或等效的方法来实施，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。生成最高级肽变体并且如WO2020072683中来评估转导效力。
实施例4.TRACER AAV库的NHP高通量筛检
如WO2020072683中所述的基于TRACER的方法经调适用于非人类灵长类动物(NHP)中，所述文献的内容以全文引用的方式并入本文中。使如图2中所例示的正交演化方法(例如NHP和BMVEC)与如图3中所示的NHP中的NGS高通量筛检组合。简单说来，将如图4中所示由突触蛋白启动子或GFAP启动子驱动的AAV9/AAV5起始库静脉内施用于非人类灵长类动物(NHP)以用于反复地执行的体内AAV选择(生物淘选)。以1e14个VG/只动物(大致3e13个VG/kg)的剂量静脉内注射全部库。在hBMVEC细胞中使用相同起始库正交地进行生物淘选。在NHP中的第二轮生物淘选中，仅使用由突触蛋白启动子驱动的库。在一段时间(例如1个月)之后，从例如脑和脊髓的神经组织提取RNA。在RNA回收和RT-PCR扩增之后，执行系统性NGS富集分析并且鉴定表1中所示的靶向肽。评估衣壳富集比，包括计算例如P2/P1读数和与基准(例如AAV9)的比较的比率。
相对于基准AAV9，表1的靶向肽在P3 NHP脑中的候选库富集资料在表7中示出。资料是作为富集倍数提供。相对于AAV9，五十一种变体显示高于10倍的富集。相对于AAV9具有0.0富集的变体未包括于表7中。
表7.NHP NGS AAV9富集
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来自NHP生物淘选的靶向肽变体子集显示相对于AAV9和PHP.B对照极强烈并且一致的富集。此外，SEQ ID NO:1725的靶向肽不仅显示相对于AAV9在脑中的强烈富集，并且还显示在脊髓中的强烈富集，这是因为它引起相对于AAV9在脊髓中125.6倍的富集。在去除最不可靠的变体之后，鉴定出一组22种相对于AAV9来说富集因子在7倍至>400倍范围内的变体。这些变体交叉参考经平行筛检的非合成PCR扩增库，并且12种候选物在两项分析中显示可靠富集和高一致性。在这些变体中，保留5种在两项分析中具有最高富集分数并且在动物和组织中具有最高一致性的候选物以用于个别评估。如上表3中所示，候选衣壳经标记为TTD-001、TTD-002、TTD-003、TTD-004和TTD-005。
在NHP中的3轮AAV9肽插入库筛检之后，许多衣壳在血脑屏障(BBB)渗透方面胜过其亲本衣壳AAV9。包含靶向肽的衣壳中的一些在来自相同动物的不同脑组织样品中并且在不同动物中显示高富集分数和高一致性。还观测到NNK密码子和NNM密码子中的一致性。22种衣壳变体展现相对于AAV9来说在脑组织中在7倍至>400倍范围内的富集因子。这些变体的大部分还展现相对于AAV9来说在脊髓中高达125倍的高富集因子。在这些变体中，选择5种具有多样插入序列的候选物以作为个别衣壳进行进一步评估。
实施例5.个别衣壳表征
这些实验的目标在于测定在NHP(食蟹猴)中的血管内输注之后相对于AAV9来说选自实施例4中所述的研究的5种衣壳候选物中每一者的转导水平和空间分布。如上表3中所概述，5种所选衣壳候选物为TTD-001(SEQ ID NO:3623和SEQ ID NO:3636，包含靶向肽SEQID NO:1725或SEQ ID NO:3648)、TTD-002(SEQ ID NO:3623、SEQ ID NO:3625和SEQ ID NO:3637，包含靶向肽SEQ ID NO:1726或SEQ ID NO:3649)、TTD-003(SEQ ID NO:3626和SEQ IDNO:3638，包含靶向肽SEQ ID NO:1729或SEQ ID NO:3650)、TTD-004(SEQ ID NO:3627和SEQID NO:3639，包含靶向肽SEQ ID NO:1760或SEQ ID NO:3651)和TTD-005(SEQ ID NO:3629和SEQ ID NO:3641，包含靶向肽SEQ ID NO:1769或SEQ ID NO:3652)。
生成具有这5种衣壳中每一者的AAV颗粒，所述衣壳封装编码与HA标签融合的有效载荷(有效载荷-HA)的转基因并且通过HEK293T细胞中的三重转染由全长CMV/鸡β肌动蛋白启动子驱动并且在药学上可接受的溶液中进行配制。
通过静脉内提供两(2)个雌性NHP，以2e13个VG/kg的剂量配制AAV颗粒来测试各测试衣壳和AAV9对照。寿命期为14天，并且随后收集一组CNS和周围组织以定量转基因mRNA、转基因蛋白和病毒DNA(生物分布)。还收集样品，固定并且包埋石蜡以用于免疫组织化学染色。
在通过qRT-PCR和RT-ddPCR进行的RNA定量的第一遍筛检中，由3-mm冲头从脑的各种区域(皮质、纹状体、海马体、小脑)、脊髓切片、肝和心脏提取总RNA，并且通过qRT-PCR使用对合成CAG外显子-外显子结合点具特异性的专用Taqman装置进行分析。使用食蟹猴TBP(TATA盒结合蛋白)作为管家基因。资料在图6A、图6B和图6C中示出。
TRACER衣壳在至少一种动物中显示相对于AAV9在全部脑区中的RNA表达增加。在衣壳TTD-003和TTD-004的情况下观测到脑转导中的最高并且最一致的增加(视各种解剖位置而定，8倍至200倍)。在这一初始筛检中，由于交错式动物给药，不评估TTD-001。在全脑切片中一致地观测到约10倍至12倍增加(等效于多个区域的平均值)，所述倍数与下一代测序(NGS)分析中所指示的值一致。为了增加资料稳健性，与qRT-PCR平行地执行微滴式数字RT-PCR(ddPCR)并且确认如图7中所示的qPCR资料所指示的趋势。
有趣的是，在脊髓和背根神经节中执行的RNA定量指示衣壳变体之间的重要差异。脊髓转导概况与脑一致，其中在TTD-003衣壳和TTD-004衣壳的情况下有强烈并且一致的增加，但有趣的是，DRG转导表明TTD-004衣壳的实质脱靶，而TTD-003衣壳显示强烈增加的RNA表达，如图8中所示。
从与RNA相同的脑组织提取总DNA，并且通过ddPCR使用对CMV启动子序列具特异性的Taqman装置来测量生物分布。使用RNAseP基因作为拷贝数参考物。通过qPCR和ddPCR测定载体基因组(VG)/细胞值。在大部分脑区中观测到TTD-004衣壳的增加的生物分布，但出乎意料地，其他候选物中无一者显示与AAV9相比显著的增加。这与RNA定量资料的明显矛盾可表明，一些衣壳可在连接后机制而非CNS实质中的严格载体易位中呈现相对于AAV9改进的特性。有趣的是，DNA分析确认由DRG进行的TTD-004衣壳的实质脱靶(图9A-9D)。
为了进一步探究衣壳变体TTD-004的行为，由从心房、心室、四头肌、肝(左侧和右侧)和隔膜收集的组织完成病毒基因组(VG)定量，并且与如在相同组织中由AAV9递送的载体基因组存在进行比较。资料在图10A和图10B中示出。
对于TTD-003和TTD-004，初始免疫组织化学分析表明有效载荷-HA的存在程度大于在包括齿状核的小脑组织中的AAV9递送的情况下所见。免疫组织化学确认如与TTD-003和AAV9相比，衣壳变体TTD-004的背根神经节的脱靶。
将所述变体中每一者的资料汇编为平均mRNA(相对于TBP的倍数)或DNA(VG/细胞)定量/衣壳变体/组织，分别如下表8和图11A-11B以及图12A-12B中所示。
表8.示例性衣壳变体的表征
Figure BDA0004048892440003481
Figure BDA0004048892440003491
当作为相对于AAV9的倍数计算时，资料是如下表9和图13A-13B以及图14A-14B中所示。
表9.示例性衣壳变体的表征
Figure BDA0004048892440003492
Figure BDA0004048892440003501
衣壳变体TTD-001显示如与AAV9相比并且通过qRT-PCR所测量并且针对TBP标准化，递送至脑的有效载荷-HA水平的高于5,000倍增加。在所测量的所有CNS组织中，TTD-001显示如与AAV9相比急剧增强的有效载荷-HA递送。
表8和表9中概述的脊髓和背根神经节测量结果的图形表示在图15A-15B、图16A-16B、图17A-17B和图18A-18B中示出。
固定的脑组织的免疫组织化学披露通过齿状核、小脑皮质、大脑皮质、脑干、海马体、丘脑和壳核的TTD-001所测试到的NHP中的剧烈转导。相比来说，齿状核、小脑皮质、大脑皮质、海马体、丘脑和壳核的AAV9转导似乎是可忽略的。因此，TTD-001在NHP中的静脉内施用之后在脑中展现宽泛并且稳健的表达和分布。在背根神经节中，TTD-001和AAV9均显示类似IHC模式。这些染色的图像在图19A-19E中示出。
衣壳变体TTD-004的DRG脱靶性质(如上文所指出)的免疫组织化学支持在图20A-20B中示出。
通过变体衣壳或AAV9递送至周围组织的病毒基因组的生物分布的图形表示在图21A-21B中示出。
实施例6.心脏中的个别衣壳表征
这一实施例表征TTD-001(SEQ ID NO:3623和SEQ ID NO:3636，包含靶向肽SEQ IDNO:1725或SEQ ID NO:3648)和TTD-004(SEQ ID NO:3627和SEQ ID NO:3639，包含靶向肽SEQ ID NO:1760或SEQ ID NO:3651)衣壳变体在心脏肌肉中的转导水平和空间分布。
生成具有封装编码与HA标签融合的有效载荷(有效载荷-HA)的转基因并且由全长CMV/鸡β肌动蛋白启动子驱动的TTD-001和TTD-004衣壳变体或野生型AAV9衣壳多肽对照中每一者的AAV颗粒。将包含TTD-001或TTD-004衣壳变体或野生型AAV9衣壳对照的AAV颗粒以2e13个VG/kg的剂量静脉内施用于2个雌性NHP。在AAV颗粒施用后第14天，收集心脏组织，固定并且包埋石蜡以用于免疫组织化学染色。抗HA抗体(Cell Signal Technology)用于对心脏组织进行染色以肉眼观测所研究的AAV衣壳变体的转导和分布。收集并且分析左心室和右心室样品。
如图22A-22C中所示，在左心室(图22B)和右心室(图22C)中，固定的心脏组织和心肌细胞的免疫组织化学展现通过TTD-001和TTD-004进行的转导。然而，如与TTD-001和野生型AAV9对照相比，TTD-004在心脏的左心室区和右心室区中引起最大转导(图22B-22C)，如增加的IHC染色所证明。TTD-001和野生型AAV9对照在心脏的两个区域中展现类似转导水平，如类似IHC染色模式所证明。这些资料表明，TTD-001和TTD-004衣壳变体均可用于转导有效载荷(例如本文所述的有效载荷)和/或将它递送至心脏肌肉。

Claims (51)

1.一种AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：
(a)SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列；或
(b)来自SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；
任选地，其中所述衣壳变体包含：
(i)SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；和/或
(ii)具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的AAV衣壳变体，其中所述氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586、588或589之后存在。
3.如权利要求1或2所述的AAV衣壳变体，其中：
(i)所述5个连续氨基酸包含PLNGA(SEQ ID NO:3679)；
(ii)所述6个连续氨基酸包含PLNGAV(SEQ ID NO:3680)；
(iii)所述7个连续氨基酸包含PLNGAVH(SEQ ID NO:3681)；
(iv)所述8个连续氨基酸包含PLNGAVHL(SEQ ID NO:3682)；和/或
(v)所述9个连续氨基酸包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)；
任选地，其中(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)的所述氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在。
4.如权利要求1或2所述的AAV衣壳变体，其中：
(i)所述5个连续氨基酸包含YSTDE(SEQ ID NO:3691)或YSTDV(SEQ ID NO:3700)；
(ii)所述6个连续氨基酸包含YSTDER(SEQ ID NO:3692)或YSTDVR(SEQ ID NO:3701)；和/或
(iii)所述7个连续氨基酸包含YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)、YSTDERM(SEQ ID NO:3657)或YSTDERK(SEQ ID NO:3658)；
任选地，其中(i)、(ii)或(iii)的所述氨基酸序列相对于根据SEQ IDNO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置589之后存在。
5.如权利要求1或2所述的AAV衣壳变体，其中：
(i)所述5个连续氨基酸包含IVMNS(SEQ ID NO:3694)；
(ii)所述6个连续氨基酸包含IVMNSL(SEQ ID NO:3695)；和/或
(iii)所述7个连续氨基酸包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)，
任选地，其中(i)、(ii)或(iii)的所述氨基酸序列相对于根据SEQ IDNO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置588之后存在。
6.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：
(i)PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列，其中所述PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列相对于根据SEQ IDNO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在；
(ii)GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列，其中所述GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)的氨基酸序列相对于根据SEQ IDNO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置586之后存在；
(iii)IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列，其中所述IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置588之后存在；或
(iv)SEQ ID NO:3649、3650、3652、3653或3655-3659中的任一者的氨基酸序列，其中前述序列中的任一者的氨基酸序列相对于根据SEQ ID NO:138的氨基酸序列编号的参考序列来说紧随位置589之后存在。
7.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，其中：
(i)所述衣壳变体包含由SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
(ii)所述衣壳变体包含由包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列编码的氨基酸序列；
(iii)编码所述衣壳变体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列；和/或
(iv)编码所述衣壳变体的核苷酸序列包含有包含SEQ ID NO:3660-3671中的任一者的核苷酸序列的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
8.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，其中：
(i)所述衣壳变体还包含根据SEQ ID NO:138编号的位置K449处的取代，例如K449R取代；
(ii)所述衣壳变体还包含环I、II、IV和/或VI中的修饰，例如插入、取代和/或缺失；
(iii)所述衣壳变体包含根据SEQ ID NO:138编号的位置587处除“A”以外的氨基酸残基和/或位置588处除“Q”以外的氨基酸残基；
(iv)所述衣壳变体包含具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列；
(v)所述衣壳变体包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；
(vi)所述衣壳变体包含由SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列编码的氨基酸序列；和/或
(vii)编码所述衣壳变体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列。
9.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：
(i)VP1蛋白、VP2蛋白、VP3蛋白或其组合；
(ii)对应于SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的位置138-743的的氨基酸序列，例如VP2，或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列；
(iii)对应于SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的位置203-743的氨基酸序列，例如VP3，或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的序列；
(iv)SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的氨基酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；
(v)具有SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列；
(vi)由SEQ ID NO:3623-3635中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列。
10.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，其中编码所述衣壳变体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3623-3635中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列，任选地，其中编码所述衣壳变体的核苷酸序列经密码子优化。
11.一种AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：
(i)如权利要求1-3或6-10中任一项所述的氨基酸序列，并且还包含与SEQ ID NO:3636至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)同一的氨基酸序列；或
(ii)SEQ ID NO:3636的氨基酸序列。
12.一种AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：
(i)如权利要求1、2、4或6-10中任一项所述的氨基酸序列，并且还包含与SEQ ID NO:3638或3645-3646至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)同一的氨基酸序列；或
(ii)SEQ ID NO:3638或3645-3646的氨基酸序列。
13.一种AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：
(i)如权利要求1、2、5-10中任一项所述的氨基酸序列，并且还包含与SEQ ID NO:3639至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)同一的氨基酸序列；或
(ii)SEQ ID NO:3639的氨基酸序列。
14.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的氨基酸序列或与其至少95％同一的氨基酸序列。
15.一种AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含具有例如靶向肽的插入物的亲本氨基酸序列，其中所述插入物包含：
(a)SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列；或
(b)来自SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。
16.如权利要求15所述的AAV衣壳变体，其中：
(i)所述亲本序列包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列；
(ii)所述亲本序列包含有包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰(例如取代)的氨基酸序列；
(iii)所述亲本序列包含在位置K449处的取代，例如K449R取代；
(iv)所述亲本序列包含由SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列；和/或
(v)编码亲本序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO:137的核苷酸序列或与其具有至少90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的核苷酸序列。
17.如权利要求15或16所述的AAV衣壳变体，其中所述插入物包含选自以下的氨基酸序列：PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)、GGTLAVVSL(SEQ ID NO:3654)、IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)、RDSPKGW(SEQ ID NO:3649)、YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)、RESPRGL(SEQ ID NO:3652)、SFNDTRA(SEQ ID NO:3653)、YGLPKGP(SEQ ID NO:3655)或STGTLRL(SEQ ID NO:3656)，任选地，其中所述插入物在所述亲本氨基酸序列中紧随位置586、588或589之后插入。
18.如权利要求15-17中任一项所述的AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：
(i)亲本序列的位置587处除“A”以外的氨基酸和/或位置588处除“Q”以外的氨基酸；或
(ii)所述亲本氨基酸序列的位置587处的缺失和/或位置588处的缺失。
19.如权利要求15-18中任一项所述的AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：
(i)紧随所述亲本氨基酸序列的位置586之后插入的包含PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列的插入物，和所述亲本氨基酸序列的位置587-588处的氨基酸“AQ”的缺失；
(ii)紧随所述亲本氨基酸序列的位置588之后插入的包含IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列的插入物；
(iii)包含选自以下的氨基酸序列的插入物：RDSPKGW(SEQ IDNO:3649)、YSTDVRM(SEQID NO:3650)、RESPRGL(SEQ ID NO:3652)、SFNDTRA(SEQ ID NO:3653)、YGLPKGP(SEQ IDNO:3655)或STGTLRL(SEQ ID NO:3656)，所述插入物紧随所述亲本氨基酸序列的位置589之后插入。
20.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体相对于包含SEQID NO:138的氨基酸序列的参考序列的向性来说，具有增加的针对CNS细胞或组织(例如脑细胞、脑组织、脊髓细胞或脊髓组织)和/或肌肉细胞或组织的向性，任选地，其中：
(i)所述脑细胞或组织为额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体的细胞或组织；
(ii)所述脊髓细胞或组织为颈部区域、胸部区域和/或腰部区域的细胞或组织；和/或
(iii)所述肌肉细胞或组织为心脏肌肉(例如心房肌肉区或心室肌肉区)、四头肌和/或隔膜肌的细胞或组织。
21.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体，其中所述衣壳变体：
(i)例如当通过如实施例4中所述的分析进行测量时，与SEQ IDNO:138的参考序列相比，在脑中富集至少约5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、100、200、300或400倍；
(ii)转导例如选自齿状核、小脑皮质、大脑皮质、脑干、海马体、丘脑和壳核的脑区，其中例如当通过例如免疫组织化学分析、qRT-PCR或RT-ddPCR分析的分析，例如如实施例5中所述的分析进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，转导水平高至少5、10、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000或10,000倍；
(iii)向脑区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如qRT-PCR或RT-ddPCR分析的分析(例如如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，所述有效载荷的所述水平增加至少500、1,000、2,000、5,000或10,000倍，任选地，其中所述脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体；
(iv)向脊髓区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如qRT-PCR分析的分析(例如如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，所述有效载荷的所述水平增加至少10、20、50、100、200、300、400、500、600、700、800或900倍，任选地，其中所述脊髓区包含颈部区域、胸部区域和/或腰部区域；和/或
(v)向脑区递送增加水平的病毒基因组，任选地，其中例如当通过例如qRT-PCR或RT-ddPCR分析的分析(例如如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，病毒基因组的所述水平增加至少5、10、20、30、40或50倍，任选地，其中所述脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体。
22.如权利要求1-2、5、6-10、13-17或19-21中任一项所述的AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体显示相对于在背根神经节(DRG)中转导来说优先在脑区中的转导。
23.如权利要求1-3、6-11、14-21中任一项所述的AAV衣壳变体，其中所述衣壳变体：
(i)例如当通过如实施例4中所述的分析进行测量时，与SEQ IDNO:138的参考序列相比，在脑中富集至少约300或400倍；
(ii)转导例如选自齿状核、小脑皮质、大脑皮质、脑干、海马体、丘脑和壳核的脑区，其中例如当通过例如免疫组织化学分析、qRT-PCR或RT-ddPCR分析的分析，例如如实施例5中所述的分析进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，转导水平高至少500、1,000、2,000、5,000或10,000倍；
(iii)向脑区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如qRT-PCR或RT-ddPCR分析的分析(例如如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，所述有效载荷的所述水平增加至少500、1,000、2,000、5,000或10,000倍，任选地，其中所述脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体；
(iv)向脊髓区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如qRT-PCR分析的分析(例如如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，所述有效载荷的所述水平增加至少50、100、200、300、400、500、600、700、800或900倍，任选地，其中所述脊髓区包含颈部区域、胸部区域和/或腰部区域；和/或
(v)向脑区递送增加水平的病毒基因组，任选地，其中例如当通过例如qRT-PCR或RT-ddPCR分析的分析(例如如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，病毒基因组的所述水平增加至少5、10、20、30、40或50倍，任选地，其中所述脑区包含额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、壳核、丘脑、小脑皮质、齿状核、尾核和/或海马体。
24.如权利要求1、2、5、6-10、13-17或19-22中任一项所述的AAV衣壳变体，其中：
(i)所述AAV衣壳变体相对于包含SEQ ID NO:138的氨基酸序列的参考序列的向性来说，具有增加的针对例如心脏组织的肌肉细胞或组织的向性；和/或
(ii)向肌肉区递送增加水平的有效载荷，任选地，其中例如当通过例如IHC分析或RT-ddPCR分析的分析(例如如实施例5中所述)进行测量时，与SEQ ID NO:138的参考序列相比，所述有效载荷的所述水平增加至少10、15、20、30或40倍，任选地，其中所述肌肉区包含心脏肌肉区(例如心房肌肉区或心室肌肉区)、四头肌区和/或隔膜肌区。
25.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码多肽，例如编码如权利要求1-24中任一项所述的AAV衣壳变体。
26.如权利要求25所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ IDNO:3623-3635中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列。
27.一种肽，例如靶向肽，所述肽包含：
(i)SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列；或
(ii)来自SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。
28.一种肽，例如靶向肽，所述肽包含：
(i)PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列或来自所述PLNGAVHLY(SEQ ID NO:3648)的氨基酸序列的至少5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；
(ii)IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列或来自所述IVMNSLK(SEQ ID NO:3651)的氨基酸序列的至少5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；
(iii)YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)、YSTDERM(SEQ ID NO:3657)或YSTDERK(SEQ ID NO:3658)的氨基酸序列或来自所述YSTDVRM(SEQ ID NO:3650)、YSTDERM(SEQ ID NO:3657)或YSTDERK(SEQ ID NO:3658)的氨基酸序列的至少5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸；或
(iv)SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列或来自SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。
29.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码AAV衣壳变体，所述AAV衣壳变体包含：
(a)SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列；或
(b)来自SEQ ID NO:1725-3622或3648-3659中的任一者的氨基酸序列的至少5个、6个、7个、8个或9个连续氨基酸。
30.如权利要求29所述的多核苷酸，其中：
(i)所述AAV衣壳变体包含SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的氨基酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的氨基酸序列；
(ii)所述AAV衣壳变体包含具有SEQ ID NO:3636-3647中的任一者的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过30个、20个或10个修饰的氨基酸序列；和/或
(iii)所述多核苷酸包含SEQ ID NO:3623-3635中的任一者的核苷酸序列或与其具有至少90％(例如至少约95％、96％、97％、98％或99％)序列同一性的核苷酸序列。
31.一种AAV颗粒，所述AAV颗粒包含如权利要求1-24中任一项所述的AAV衣壳变体、由如权利要求25-26或29-30中任一项所述的多核苷酸编码的AAV衣壳变体或包含如权利要求27-28中任一项所述的肽(例如靶向肽)的AAV衣壳变体。
32.如权利要求31所述的AAV颗粒，所述AAV颗粒包含编码有效载荷的核苷酸序列，任选地，其中经编码的有效载荷包含治疗蛋白或其功能变体；抗体或抗体片段；酶；基因编辑系统的组分；RNAi剂(例如dsRNA、siRNA、shRNA、前体miRNA、初级miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)；或其组合。
33.如权利要求32所述的AAV颗粒，其中：
(i)所述治疗蛋白或其功能变体(例如重组蛋白)与神经或神经系统变性病症、肌肉或神经肌肉病症或神经肿瘤病症相关(例如在其中异常表达)，任选地，其中所述治疗蛋白或其功能变体选自载脂蛋白E(APOE)(例如ApoE2、ApoE3和/或ApoE4)；人类运动神经元存活因子(SMN)1或SMN2；葡糖脑苷脂酶(GBA1)；芳族L-氨基酸脱羧酶(AADC)；天冬氨酸酰基转移酶(ASPA)；三肽基肽酶I(CLN2)；β-半乳糖苷酶(GLB1)；N-磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH)；N-乙酰基-α-氨基葡糖苷酶(NAGLU)；艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)；细胞内胆固醇转运体(NPC1)；巨轴索神经病蛋白(GAN)；或其组合；
(ii)所述抗体或抗体结合片段结合至
(a)CNS相关靶，例如与神经或神经系统变性病症相关的抗原，例如β-淀粉样蛋白、APOE、tau、SOD1、TDP-43、亨廷顿蛋白(huntingtin，HTT)和/或突触核蛋白；
(b)肌肉或神经肌肉相关靶，例如与肌肉或神经肌肉病症相关的抗原；或
(c)神经肿瘤相关靶，例如与神经肿瘤病症相关的抗原，例如HER2或EGFR(例如EGFRvIII)；
(iii)所述酶包含兆核酸酶、锌指核酸酶、TALEN、重组酶、整合酶、碱基编辑器、Cas9或其片段；
(iv)所述基因编辑系统的组分包含CRISPR-Cas系统的一种或多种组分，任选地，其中所述CRISPR-Cas系统的所述一种或多种组分包含Cas9(例如Cas9直系同源物或Cpf1)以及单向导RNA(sgRNA)，其中：
(a)所述sgRNA位于cas9酶的上游(5')；和/或
(b)所述sgRNA位于cas9酶的下游(3')；和/或
(v)所述RNAi剂(例如dsRNA、siRNA、shRNA、前体miRNA、初级miRNA、miRNA、stRNA、lncRNA、piRNA或snoRNA)调节(例如抑制)CNS相关基因、mRNA和/或蛋白的表达，任选地，其中所述CNS相关基因选自SOD1、MAPT、APOE、HTT、C9ORF72、TDP-43、APP、BACE、SNCA、ATXN1、ATXN3、ATXN7、SCN1A-SCN5A、SCN8A-SCN11A或其组合。
34.如权利要求31-33中任一项所述的AAV颗粒，所述AAV颗粒包含有包含有效地连接至编码所述有效载荷的核酸序列的启动子的病毒基因组，任选地，其中所述启动子选自人类延长因子1α-亚单位(EF1α)、巨细胞病毒(CMV)即刻早期增强子和/或启动子、鸡β-肌动蛋白(CBA)和其衍生物CAG、β葡萄糖醛酸酶(GUSB)或泛素C(UBC)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血小板衍生生长因子B链(PDGF-β)、细胞间黏附分子2(ICAM-2)、突触蛋白(Syn)、甲基-CpG结合蛋白2(MeCP2)、Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II(CaMKII)、代谢型谷氨酸受体2(mGluR2)、神经丝轻链(NFL)或重链(NFH)、β球蛋白微小基因nβ2、前脑啡肽原(PPE)、脑啡肽(Enk)和兴奋性氨基酸转运体2(EAAT2)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、心血管启动子(例如αMHC、cTnT和CMV-MLC2k)、肝启动子(例如hAAT、TBG)、骨胳肌启动子(例如结蛋白、MCK、C512)或其片段(例如截短片段)或功能变体。
35.如权利要求34所述的AAV颗粒，其中所述病毒基因组还包含：
(i)polyA信号序列；
(ii)反向末端重复(ITR)序列，任选地，其中所述ITR序列相对于所述经编码的有效载荷来说位于5'和/或所述ITR序列相对于所述经编码的有效载荷来说位于3'；
(iii)增强子、Kozak序列、内含子区和/或外显子区；
(iv)miR结合位点，例如在表达对应miRNA的细胞或组织中调节(例如减少)由所述病毒基因组编码的所述有效载荷的表达的miR结合位点；和/或
(v)编码例如非结构蛋白的Rep蛋白的核苷酸序列，其中所述Rep蛋白包含Rep78蛋白、Rep68、Rep52蛋白和/或Rep40蛋白，任选地，其中所述Rep78蛋白、所述Rep68蛋白、所述Rep52蛋白和/或所述Rep40蛋白由至少一个Rep基因编码。
36.如权利要求34或35所述的AAV颗粒，其中所述病毒基因组包含：
(i)miR结合位点的至少1-5个拷贝，例如至少1个、2个、3个、4个或5个拷贝；
(ii)miR结合位点的至少3个拷贝，任选地，其中全部三个拷贝包含相同miR结合位点，或所述拷贝中的至少一个、两个或全部包含不同miR结合位点；和/或
(iii)miR结合位点的至少4个拷贝，任选地，其中全部四个拷贝包含相同miR结合位点，或所述拷贝中的至少一个、两个、三个或全部包含不同miR结合位点。
37.如权利要求36所述的AAV颗粒，其中所述miR结合位点包含miR122结合位点、miR183结合位点、miR-142-3p或其组合，任选地，其中：
(i)所述miR122结合位点包含SEQ ID NO:3672的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO:3672的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列；
(ii)所述miR183结合位点包含SEQ ID NO:3675的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO:3675的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列；和/或
(iii)所述miR-142-3p结合位点包含SEQ ID NO:3674的核苷酸序列或与其大体上同一(例如具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性)的核苷酸序列；或具有SEQ ID NO:3674的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个或七个修饰、但不超过十个修饰的核苷酸序列。
38.如权利要求34-37中任一项所述的AAV颗粒，其中所述病毒基因组：
(i)为单链的；和/或
(ii)还包含编码如权利要求1-24中任一项所述的AAV衣壳变体的核酸序列。
39.如前述权利要求中任一项所述的AAV衣壳变体、多核苷酸、肽或AAV颗粒，其为分离的，例如重组的。
40.一种载体，所述载体包含编码如权利要求1-24或39中任一项所述的AAV衣壳变体的多核苷酸、如权利要求25-26、29-30或39中任一项所述的多核苷酸或编码如权利要求27-28或39中任一项所述的肽(例如靶向肽)的多核苷酸。
41.一种细胞，例如宿主细胞，所述细胞包含如权利要求1-24或39中任一项所述的AAV衣壳变体、如权利要求25-26、29-30或39中任一项所述的多核苷酸、如权利要求27-28或39中任一项所述的肽、如权利要求31-39中任一项所述的AAV颗粒或如权利要求40所述的载体，任选地，其中：
(i)所述细胞为哺乳动物细胞或昆虫细胞；
(ii)所述细胞为脑区或脊髓区的细胞，任选地，为额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、尾核、齿状核、小脑皮质、大脑皮质、脑干、海马体、丘脑、壳核、颈部脊髓区域、胸部脊髓区域和/或腰部脊髓区域的细胞；和/或
(iii)神经元、感觉神经元、运动神经元、星形胶质细胞或肌肉细胞(例如心脏、隔膜或四头肌的细胞)。
42.一种制造AAV颗粒的方法，所述方法包括
(i)提供包含病毒基因组的宿主细胞；和
(ii)在适合于将所述病毒基因组封闭在如权利要求1-24或39中任一项所述的AAV衣壳变体、由如权利要求25-26、29-30或39中任一项所述的多核苷酸编码的AAV衣壳变体或包含如权利要求27-28或39中任一项所述的肽(例如靶向肽)的AAV衣壳变体中的条件下孵育所述宿主细胞；
由此制造所述AAV颗粒。
43.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求31-39中任一项所述的AAV颗粒、包含如权利要求1-24或39中任一项所述的衣壳变体的AAV颗粒或包含如权利要求27-28或39中任一项所述的肽的AAV颗粒以及药学上可接受的赋形剂。
44.一种将有效载荷递送至细胞或组织(例如CNS细胞、CNS组织、肌肉细胞或肌肉组织)的方法，所述方法包括施用有效量的如权利要求43所述的药物组合物、如权利要求31-39中任一项所述的AAV颗粒、包含如权利要求1-24或39中任一项所述的衣壳变体的AAV颗粒或包含如权利要求27-28或39中任一项所述的肽的AAV颗粒。
45.如权利要求44所述的方法，其中：
(i)所述细胞或组织为脑区或脊髓区的细胞或组织，任选地，为额叶皮质、感觉皮质、运动皮质、尾核、齿状核、小脑皮质、大脑皮质、脑干、海马体、丘脑、壳核、颈部脊髓区域、胸部脊髓区域和/或腰部脊髓区域的细胞或组织；
(ii)所述细胞为神经元、感觉神经元、运动神经元、星形胶质细胞或肌肉细胞(例如心脏、隔膜或四头肌的细胞)；和/或
(iii)所述细胞或组织是在受试者内，任选地，其中所述受试者患有、经诊断患有或有风险患有神经病症、神经系统变性病症、肌肉病症、神经肌肉病症或神经肿瘤病症。
46.一种治疗患有或经诊断患有神经病症、神经系统变性病症、肌肉病症、神经肌肉病症或神经肿瘤病症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如权利要求43所述的药物组合物、如权利要求31-39中任一项所述的AAV颗粒、包含如权利要求1-24或39中任一项所述的衣壳变体的AAV颗粒或包含如权利要求27-28或39中任一项所述的肽的AAV颗粒。
47.如权利要求46所述的方法，其中治疗包括预防所述受试者的所述疾病或病症的进展，任选地，其中所述受试者为人类。
48.如权利要求45-47中任一项所述的方法，其中将所述AAV颗粒经如下途径施用于所述受试者：
(i)肌肉内、静脉内、大脑内、鞘内、脑室内、经由实质内施用或经由大池内注射(ICM)；
(ii)经由聚焦式超声波(FUS)，例如联合微气泡静脉内施用(FUS-MB)，或经由MRI引导的FUS联合静脉内施用；和/或
(iii)静脉内。
49.如权利要求43所述的药物组合物、如权利要求31-39中任一项所述的AAV颗粒、包含如权利要求1-24或39中任一项所述的衣壳变体的AAV颗粒或包含如权利要求27-28或39中任一项所述的多肽的AAV颗粒，其用于将有效载荷递送至细胞或组织的方法中。
50.如权利要求43所述的药物组合物、如权利要求31-39中任一项所述的AAV颗粒、包含如权利要求1-24或39中任一项所述的衣壳变体的AAV颗粒或包含如权利要求27-28或39中任一项所述的多肽的AAV颗粒，其用于治疗神经病症、神经系统变性病症、肌肉病症、神经肌肉病症或神经肿瘤病症的方法中。
51.如权利要求43所述的药物组合物、如权利要求31-39中任一项所述的AAV颗粒、包含如权利要求1-24或39中任一项所述的衣壳变体的AAV颗粒或包含如权利要求27-28或39中任一项所述的多肽的AAV颗粒，其用于药剂制造中。
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