CN117264912A - 一种重组腺相关病毒颗粒、重组腺相关病毒载体系统及其应用 - Google Patents
一种重组腺相关病毒颗粒、重组腺相关病毒载体系统及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117264912A CN117264912A CN202311243577.0A CN202311243577A CN117264912A CN 117264912 A CN117264912 A CN 117264912A CN 202311243577 A CN202311243577 A CN 202311243577A CN 117264912 A CN117264912 A CN 117264912A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- recombinant adeno
- associated virus
- vector system
- adeno
- virus particle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 title claims abstract description 126
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 41
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 27
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 claims abstract description 11
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims abstract description 8
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims abstract description 8
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 claims abstract description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 37
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 21
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 19
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 6
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- 108091093126 WHP Posttrascriptional Response Element Proteins 0.000 claims description 3
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 108700029229 Transcriptional Regulatory Elements Proteins 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 claims 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 abstract description 20
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 abstract description 20
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 abstract description 9
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 8
- 208000036187 Genetic neurodegenerative disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 208000030309 inherited neurodegenerative disease Diseases 0.000 abstract description 7
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 abstract description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 11
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 4
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 3
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 3
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 1
- 241000300529 Adeno-associated virus 13 Species 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N iodixanol Chemical compound IC=1C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C=1N(C(=O)C)CC(O)CN(C(C)=O)C1=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C(I)C(C(=O)NCC(O)CO)=C1I NBQNWMBBSKPBAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004359 iodixanol Drugs 0.000 description 1
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/46—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. skin, bone, milk, cotton fibre, eggshell, oxgall or plant extracts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14123—Virus like particles [VLP]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Virology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供了一种重组腺相关病毒颗粒、重组腺相关病毒载体系统及其应用。本发明制备了一种高效跨血脑屏障的新型重组腺相关病毒，命名为rAAV32.eB，其衣壳为AAVhu.32衣壳蛋白的突变体，包括A587D、Q588G两个位点的突变，且在第588和589位氨基酸之间插入7个氨基酸的肽段TLAVPFK。本发明还构建了相应的重组腺相关病毒载体系统，构建了AAV32.eB血清型质粒。本发明还发现rAAV32.eB跨血脑屏障转导神经细胞的效率更高，将其用于更高效的基因递送，能够为神经科学研究以及全脑系统性遗传疾病、神经退行性疾病等治疗提供更好的工具，具有广阔的应用价值和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程以及生物技术领域，尤其涉及一种重组腺相关病毒颗粒、重组腺相关病毒载体系统及其应用。
背景技术
目前神经科学研究和神经系统基因治疗的主要难题之一，是如何突破血脑屏障高效递送目的基因。递送目的基因至神经系统，需要工具载体。在众多现有的工具载体中，腺相关病毒(adeno associated virus,AAV)载体因其出色的基因递送效率、稳定的安全性和相对较低的细胞毒性等特性而广受欢迎。腺相关病毒是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的细小单链DNA病毒，迄今为止，尚未发现与AAV相关的疾病报道，因此被公认为是最安全的病毒载体，成为目前基因治疗载体研究的热点。
AAV血清型众多，不同血清型有不同的靶向感染特性，其中，9型AAV(AAV9)是少数能够跨血脑屏障感染神经细胞的自然血清型AAV。此外，有研究报道其他血清型AAV也能跨血脑屏障，如AAVhu.32(Yoon et.al.,2020,143；2058-2072)。然而，尽管AAVhu.32跨血脑屏障效率优于AAV9，但其效率依然很低，无法满足突破血脑屏障高效递送的目的，递送效率有待进一步提高。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组腺相关病毒颗粒、重组腺相关病毒载体系统及其应用，旨在解决目前的腺相关病毒载体跨血脑屏障效率低的问题。
本发明的技术方案如下：
一种重组腺相关病毒颗粒，其中，包含AAVhu.32衣壳蛋白突变体；相对于野生型AAVhu.32衣壳蛋白，所述AAVhu.32衣壳蛋白突变体包括第587和588两个氨基酸位点的突变，且在第588和589位氨基酸之间插入了如SEQ.ID NO.1所示的氨基酸片段。
所述的重组腺相关病毒颗粒，其中，所述AAVhu.32衣壳蛋白突变体第587氨基酸位点的丙氨酸突变为天冬氨酸，第588氨基酸位点的谷氨酰胺突变为甘氨酸。
所述的重组腺相关病毒颗粒，其中，所述重组腺相关病毒颗粒的基因组中包含编码目的基因产物的核苷酸序列的外源目的基因。
所述的重组腺相关病毒颗粒，其中，所述目的基因产物为蛋白质、多肽或干扰RNA。
一种重组腺相关病毒载体系统，其中，包含一种或多种载体，其中至少一种载体为重组腺相关病毒包装质粒，所述重组腺相关病毒包装质粒中包含用于编码如上所述的AAVhu.32衣壳蛋白突变体的核酸片段。
所述的重组腺相关病毒载体系统，其中，至少一种载体为腺相关病毒核心质粒，所述腺相关病毒核心质粒包含两端反向末端重复序列ITR、启动子、外源目的基因、转录调节元件WPRE和转录终止序列hGH polyA。
所述的重组腺相关病毒载体系统，其中，至少一种载体为腺病毒元件辅助质粒。
一种药物组合物，其特征在于，包含如上任一项所述的重组腺相关病毒颗粒，和/或如上任一项所述的重组腺相关病毒载体系统。
一种如上任一项所述的重组腺相关病毒颗粒和/或如上任一项所述的重组腺相关病毒载体系统在中枢神经系统基因递送中的应用。
一种如上任一项所述的重组腺相关病毒颗粒和/或如上任一项所述的重组腺相关病毒载体系统在制备全脑系统性遗传疾病或神经退行性疾病治疗药物中的应用。
有益效果：本发明提供了一种重组腺相关病毒颗粒、重组腺相关病毒载体系统及其应用。本发明制备了一种高效跨血脑屏障的新型重组腺相关病毒(rAAV)，命名为rAAV32.eB，其衣壳为AAVhu.32衣壳蛋白的突变体，相较于野生型AAVhu32衣壳蛋白VP1主要有3个位置变化，包括A587D、Q588G两个位点的突变，且在第588和589位氨基酸之间插入7个氨基酸的肽段TLAVPFK。同时，本发明还构建了相应的重组腺相关病毒载体系统，构建了AAV32.eB血清型质粒。不仅如此，本发明制备的重组腺相关病毒rAAV32.eB经静脉注射感染，与rAAVhu.32相比，rAAV32.eB跨血脑屏障转导神经细胞的效率更高。最终，本发明通过工程改造获得了一种新型重组腺相关病毒rAAV32.eB，并将其用于更高效的基因递送，能够为神经科学研究以及全脑系统性遗传疾病、神经退行性疾病等治疗提供更好的工具，具有广阔的应用价值和市场前景。
附图说明
图1为本发明实施例构建得到的pAAV2/32.eB血清型质粒图谱示意图。
图2为本发明实施例提供的脑组织切片成像结果示意图。
具体实施方式
本发明提供一种重组腺相关病毒颗粒、重组腺相关病毒载体系统及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种重组腺相关病毒颗粒，所述重组腺相关病毒颗粒包含AAVhu.32衣壳蛋白突变体；相对于野生型AAVhu.32衣壳蛋白，所述AAVhu.32衣壳蛋白突变体包括第587和588两个氨基酸位点的突变，且在第588和589位氨基酸之间插入了如SEQ.IDNO.1所示的氨基酸片段。
SEQ.ID NO.1：TLAVPFK
在一些实施方式中，所述AAVhu.32衣壳蛋白突变体第587氨基酸位点的丙氨酸突变为天冬氨酸(A587D)，第588氨基酸位点的谷氨酰胺突变为甘氨酸(Q588G)。
本发明中，“AAV”是腺相关病毒的缩写，并且可用于指病毒本身或其衍生物。除非另有需要时，所述术语包括亚型及自然存在和重组形式。缩写“rAAV”指重组腺相关病毒，也称为重组AAV载体。术语“AAV”可以用于指代不同血清型的腺相关病毒，而不同亚型AAV的基因组序列，以及天然末端重复序列(ITR)、Rep蛋白和衣壳亚基的序列在本领域中已知。此类序列可在文献或公用数据库例如基因库中找到。重组腺相关病毒颗粒(简称为“AAV病毒颗粒”或“AAV病毒”)指由至少一种AAV衣壳蛋白和壳体化多核苷酸rAAV载体构成的病毒颗粒，本发明涉及的重组腺相关病毒颗粒(命名为rAAV32.eB)包含上述的AAVhu.32衣壳蛋白突变体。
为了解决rAAVhu.32跨血脑屏障效率低的难题，本发明通过基因工程改造获得了一种高效跨血脑屏障的新型的重组腺相关病毒(rAAV)，新型重组腺相关病毒命名为rAAV32.eB，其衣壳为AAVhu.32衣壳蛋白的突变体，相较于AAVhu32衣壳蛋白VP1主要有3个位置变化，包括A587D、Q588G两个位点的突变，且插入了7个氨基酸的肽段TLAVPFK，插入位置在对应于野生型AAVhu.32衣壳蛋白第588位点和第589位点之间。本发明制备的重组腺相关病毒rAAV32.eB经静脉注射感染，相较于rAAVhu.32，rAAV32.eB跨血脑屏障转导神经细胞的效率更高。最终，本发明通过工程改造获得了一种新型重组腺相关病毒rAAV32.eB(也可称之为重组腺相关病毒颗粒)，并将其用于更高效的基因递送，能够为神经科学研究以及全脑系统性遗传疾病、神经退行性疾病等治疗提供更好的工具，具有广阔的应用价值和市场前景。
在一些实施方式中，所述重组腺相关病毒颗粒的基因组中包含编码目的基因产物的核苷酸序列的外源目的基因。
“外源”指源自和与之比较的其余实体基因型不同的实体。例如，通过基因工程技术引入源自不同物种的质粒或载体中的核苷酸为外源核苷酸。包括编码外源目的基因产物的外源核酸的rAAV是包括在自然存在的野生型AAV中一般不包括的核酸的rAAV，并且编码的外源目的基因产物是一般并非自然存在的野生型AAV编码的基因产物。
在一些实施方式中，所述目的基因产物为蛋白质。
在一些实施方式中，所述目的基因产物为多肽。
在一些实施方式中，所述目的基因产物为干扰RNA。
具体的，所述干扰RNA可以选自siRNA或shRNA。
本发明构建了一种全新的rAAVhu.32突变体(rAAV32.eB)并将其用于基因递送；相较于原始的AAVhu.32，rAAV32.eB跨血脑屏障递送外源基因的效率更高。
本发明实施例还提供一种重组腺相关病毒载体系统，其包含一种或多种载体，其中至少一种载体为重组腺相关病毒包装质粒，所述重组腺相关病毒包装质粒中包含用于编码上述的AAVhu.32衣壳蛋白突变体的核酸片段。
在一些实施方式中，所述的AAVhu.32衣壳蛋白突变体包括第587和588两个氨基酸位点的突变，且在第588和589位氨基酸之间插入了氨基酸片段TLAVPFK。
衣壳蛋白的核酸片段在本发明中通常用Cap基因片段表示。AAV的rep和Cap基因指编码腺相关病毒的复制和壳体化蛋白的多核苷酸序列。rep和Cap基因可位于相同或不同质粒上。
在一些实施方式中，所述重组腺相关病毒包装质粒以pAAV2/hu.32为骨架。是通过合成hu.32(GenBank:AY530597.1)衣壳的全长基因序列，然后替换pAAV2/2(布林凯斯(深圳)生物技术有限公司)上的衣壳(cap2)对应的全长基因序列而获得。
在一些实施方式中，所述重组腺相关病毒包装质粒包含二型腺相关病毒的rep基因片段。
在一些实施方式中，所述重组腺相关病毒包装质粒的AAV32.eB序列经AAVhu.32突变且肽段插入获得，其Cap基因序列如SEQ ID NO.2所示，相较于AAVhu.32Cap有A587D、Q588G两个位点的突变，且在588位点后插入7个氨基酸的肽段TLAVPFK。
在一些实施方式中，所述的重组腺相关病毒载体系统中至少一种载体为腺相关病毒核心质粒。
具体的，所述腺相关病毒核心质粒包含两端反向末端重复序列ITR、启动子、外源目的基因、转录调节元件WPRE和转录终止序列hGH polyA。
更具体的，所述外源目的基因包括报告基因；
更具体的，所述报告基因为EGFP；
在一个具体的实施例中，所述腺相关病毒核心质粒为pAAV-CMV-EGFP-WPRE-hGHpolyA。
在一些实施方式中，所述的重组腺相关病毒载体系统中至少一种载体为腺病毒元件辅助质粒。
具体的，所述腺病毒元件辅助质粒为pAd-Helper。
在本发明提供的一些实施方式中，所述的重组腺相关病毒颗粒，由所述的重组腺相关病毒包装质粒、腺相关病毒核心质粒和腺病毒元件辅助质粒共转染包装细胞系获得。
在一些实施方式中，所述包装细胞系选自HEK-293细胞、HEK-293T细胞或HEK-293FT细胞；
在一些实施方式中，所述的重组腺相关病毒包装质粒、腺相关病毒核心质粒和腺病毒元件辅助质粒的分子数为1:1:1。
本发明构建了一种重组腺相关病毒包装质粒，AAV32.eB血清型质粒，并将其用于重组腺相关病毒颗粒的包装，制备了重组腺相关病毒rAAV32.eB-CMV-EGFP-WPRE-hGHpolyA，并验证本发明制备的重组腺相关病毒rAAV32.eB经静脉注射感染，相较于rAAVhu.32，rAAV32.eB跨血脑屏障转导神经细胞的效率更高。可以为神经科学研究和全脑系统性遗传疾病、神经退行性疾病等治疗提供了更好的工具，具有广阔的应用价值和市场前景。
本发明实施例还提供一种药物组合物，其包含如上所述的重组腺相关病毒颗粒和/或如上所述的重组腺相关病毒载体系统。
在一些实施方式中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或赋型剂。
具体的，所述载体如添加剂、香味剂制成各种剂型，所述剂型包括散剂、片剂、微丸、胶囊、微囊、颗粒剂或液体等。
本发明实施例还提供一种如上所述的重组腺相关病毒颗粒和/或如上所述的重组腺相关病毒载体系统在中枢神经系统基因递送中的应用。
本发明实施例还提供一种如上所述的重组腺相关病毒颗粒和/或如上所述的重组腺相关病毒载体系统在制备全脑系统性遗传疾病或神经退行性疾病治疗药物中的应用。
本发明提供了一种高效跨血脑屏障靶向神经细胞递送外源基因的重组腺相关病毒载体系统及其包装得到的重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒为hu.32型腺相关病毒(rAAVhu.32)的突变体，命名为rAAV32.eB。本发明将携带目的基因的rAAV32.eB尾静脉注射至小鼠，可高效跨血脑屏障转导中枢神经系统。最终，本发明构建了一种全新的rAAVhu.32突变体(rAAV32.eB)并将其用于基因递送，且rAAV32.eB相较于原始的AAVhu.32跨血脑屏障递送外源基因的效率更高，为全脑范围神经结构与功能研究以及基因递送等提供了新的病毒载体，在中枢神经系统网络解析、疾病模型建立和基因治疗等领域具有广泛的应用价值和广阔的市场前景。
下面通过具体实施例对本发明一种重组腺相关病毒颗粒、重组腺相关病毒载体系统及其应用做进一步的解释说明：
一般地，本发明描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学等使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行。
实施例1rAAV32.eB载体的构建
AAV32.eB序列经AAVhu.32突变且肽段插入获得，其Cap基因序列如SEQ.ID NO.2所示，相较于AAVhu.32Cap有A587D、Q588G两个位点的突变，且在588位点后插入7个氨基酸的肽段TLAVPFK。
为构建AAV32.eB血清型质粒，本实施例合成了引物Mu-32.eB-F(SEQ.ID NO.3)与Mu-32.eB-R(SEQ.ID NO.4)，采用点突变的方法，以质粒pAAV2/hu.32为模板(该质粒通过合成hu.32(GenBank:AY530597.1)衣壳的全长基因序列，然后替换pAAV2/2(布林凯斯(深圳)生物技术有限公司)上的衣壳(cap2)对应的全长基因序列而获得)，使用Fast MutagenesisSystem试剂盒经PCR反应获得pAAV2/32.eB。具体如下：
SEQ.ID NO.3
GATGGGACTTTGGCGGTGCCTTTTAAGGCACAGGCGCAGACCGG CTGGGTTCAAAACCAAGGAATA
SEQ.ID NO.4
CTTAAAAGGCACCGCCAAAGTCCCATCACTCTGGTGGTTTGTGG CCACTTGTCCA
PCR的反应体系为：
2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix,25μl；
10μM正向引物，1μl；
10μM反向引物，1μl；
模板pAAV2/hu.32，2μl；
ddH2O，31μl。
反应程序为：98℃,5min；{98℃,30s；60℃,30s；72℃,5min；72℃,10min}36个循环；16℃,30min。
PCR产物需添加1μl模板消化酶DMT，37℃消化模板1小时。消化后的产物取5μl用来转化感受态Stbl3，16小时后挑单菌落活化并接种到15毫升LB液体培养基中，培养扩增后抽提质粒测序。构建获得的重组腺相关病毒血清型包装质粒pAAV2/32.eB表达载体的图谱如图1所示。本ssl所有PCR使用引物、基因合成和测序均由商业公司完成。
实施例2重组腺相关病毒的制备
病毒包装方法参考AAV13 Enables Precise Targeting of Local NeuralPopulations，Han et.al.；Int.J.Mol.Sci,2022,23(21),12806；doi:10.3390/ijms232112806，采用三质粒包装系统包装腺相关病毒方法，将装载核心元件的质粒pAAV-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA、腺病毒元件辅助质粒pAd-Helper与pAAV2/32.eB(或pAAV2/hu.32)血清型质粒，按质粒分子数1:1:1共转染HEK-293T细胞，转染72小时后分别收集上清和细胞沉淀，用碘克沙醇梯度离心法进行浓缩和纯化，最后用SYBR Green qPCR法检测重组腺相关病毒滴度，最终获得rAAV32.eB-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA病毒的滴度为1.0×1013VG/mL，rAAVhu.32-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA病毒的滴度为1.0×1013VG/mL。
实施例3重组腺相关病毒的应用
将制备的rAAV32.eB-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA与rAAVhu.32-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA(作为对照)病毒分别通过尾静脉注射方式注射至8-10周龄C57BL/6小鼠(购自商业公司)，病毒滴度1.0×1013VG/mL，每只小鼠注射剂量为100μL，3周后灌流取脑组织。小鼠脑组织经DEPC处理过的PFA溶液固定4小时后再用DEPC处理过的30％蔗糖-PBS溶液脱水48小时，将脱水后的鼠脑用组织包埋剂充分包埋并用冰冻切片机切成40μm厚度的切片。贴片并使用玻片扫描仪显微成像。C57BL/6小鼠尾静脉注射rAAV32.eB-CMV-EGFP-WPRE-hGHpolyA与rAAhu.32-CMV-EGFP-WPRE-hGH polyA病毒载体后，脑组织切片成像结果如图2所示，可以看出在全脑区域，感染rAAV32.eB病毒比rAAVhu.32病毒表现出更强的荧光及更多的阳性细胞数。
综上所述，本发明提供了一种重组腺相关病毒颗粒、重组腺相关病毒载体系统及其应用。本发明制备了一种高效跨血脑屏障的新型重组腺相关病毒(rAAV)，命名为rAAV32.eB，其衣壳为AAVhu.32衣壳蛋白的突变体，相较于野生型AAVhu32衣壳蛋白VP1主要有3个位置变化，包括A587D、Q588G两个位点的突变，且在第588和589位氨基酸之间插入7个氨基酸的肽段TLAVPFK。同时，本发明还构建了相应的重组腺相关病毒载体系统，构建了AAV32.eB血清型质粒。不仅如此，本发明制备的重组腺相关病毒rAAV32.eB经静脉注射感染，与rAAVhu.32相比，rAAV32.eB跨血脑屏障转导神经细胞的效率更高。最终，本发明通过工程改造获得了一种新型重组腺相关病毒rAAV32.eB，并将其用于更高效的基因递送，能够为神经科学研究以及全脑系统性遗传疾病、神经退行性疾病等治疗提供更好的工具，具有广阔的应用价值和市场前景。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，包含AAVhu.32衣壳蛋白突变体；相对于野生型AAVhu.32衣壳蛋白，所述AAVhu.32衣壳蛋白突变体包括第587和588两个氨基酸位点的突变，且在第588和589位氨基酸之间插入了如SEQ.ID NO.1所示的氨基酸片段。
2.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，所述AAVhu.32衣壳蛋白突变体第587氨基酸位点的丙氨酸突变为天冬氨酸，第588氨基酸位点的谷氨酰胺突变为甘氨酸。
3.根据权利要求1所述的重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，所述重组腺相关病毒颗粒的基因组中包含编码目的基因产物的核苷酸序列的外源目的基因。
4.根据权利要求3所述的重组腺相关病毒颗粒，其特征在于，所述目的基因产物为蛋白质、多肽或干扰RNA。
5.一种重组腺相关病毒载体系统，其特征在于，包含一种或多种载体，其中至少一种载体为重组腺相关病毒包装质粒，所述重组腺相关病毒包装质粒中包含用于编码如权利要求1中所述的AAVhu.32衣壳蛋白突变体的核酸片段。
6.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒载体系统，其特征在于，至少一种载体为腺相关病毒核心质粒，所述腺相关病毒核心质粒包含两端反向末端重复序列ITR、启动子、外源目的基因、转录调节元件WPRE和转录终止序列hGH polyA。
7.根据权利要求5所述的重组腺相关病毒载体系统，其特征在于，至少一种载体为腺病毒元件辅助质粒。
8.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1-4任一项所述的重组腺相关病毒颗粒，和/或权利要求5-7任一项所述的重组腺相关病毒载体系统。
9.一种如权利要求1-4任一项所述的重组腺相关病毒颗粒和/或权利要求5-7任一项所述的重组腺相关病毒载体系统在中枢神经系统基因递送中的应用。
10.一种如权利要求1-4任一项所述的重组腺相关病毒颗粒和/或权利要求5-7任一项所述的重组腺相关病毒载体系统在制备全脑系统性遗传疾病或神经退行性疾病治疗药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311243577.0A CN117264912A (zh) | 2023-09-25 | 2023-09-25 | 一种重组腺相关病毒颗粒、重组腺相关病毒载体系统及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202311243577.0A CN117264912A (zh) | 2023-09-25 | 2023-09-25 | 一种重组腺相关病毒颗粒、重组腺相关病毒载体系统及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN117264912A true CN117264912A (zh) | 2023-12-22 |
Family
ID=89217326
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202311243577.0A Pending CN117264912A (zh) | 2023-09-25 | 2023-09-25 | 一种重组腺相关病毒颗粒、重组腺相关病毒载体系统及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN117264912A (zh) |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170166926A1 (en) * | 2015-12-11 | 2017-06-15 | California Institute Of Technology | TARGETING PEPTIDES FOR DIRECTING ADENO-ASSOCIATED VIRUSES (AAVs) |
| CN111825772A (zh) * | 2020-07-30 | 2020-10-27 | 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 | 具有变异衣壳蛋白的腺相关病毒及其应用 |
| US20220042044A1 (en) * | 2020-05-13 | 2022-02-10 | Voyager Therapeutics, Inc. | Redirection of tropism of aav capsids |
| US20230227802A1 (en) * | 2020-07-27 | 2023-07-20 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency |
| US20230285596A1 (en) * | 2020-07-27 | 2023-09-14 | Voyager Therapeutics, Inc | Compositions and methods for the treatment of niemann-pick type c1 disease |
-
2023
- 2023-09-25 CN CN202311243577.0A patent/CN117264912A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170166926A1 (en) * | 2015-12-11 | 2017-06-15 | California Institute Of Technology | TARGETING PEPTIDES FOR DIRECTING ADENO-ASSOCIATED VIRUSES (AAVs) |
| US20220042044A1 (en) * | 2020-05-13 | 2022-02-10 | Voyager Therapeutics, Inc. | Redirection of tropism of aav capsids |
| US20230227802A1 (en) * | 2020-07-27 | 2023-07-20 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for the treatment of neurological disorders related to glucosylceramidase beta deficiency |
| US20230285596A1 (en) * | 2020-07-27 | 2023-09-14 | Voyager Therapeutics, Inc | Compositions and methods for the treatment of niemann-pick type c1 disease |
| CN111825772A (zh) * | 2020-07-30 | 2020-10-27 | 中国科学院精密测量科学与技术创新研究院 | 具有变异衣壳蛋白的腺相关病毒及其应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2019200949B2 (en) | High-transduction-efficiency raav vectors, compositions, and methods of use | |
| JP6619454B2 (ja) | キャプシド | |
| JP2023076606A5 (zh) | ||
| AU2024200001A1 (en) | Variant aav and compositions, methods and uses for gene transfer to cells, organs and tissues | |
| US8784799B2 (en) | Duplexed parvovirus vectors | |
| JP2020537544A5 (zh) | ||
| WO2012158757A1 (en) | Proviral plasmids for production of recombinant adeno-associated virus | |
| WO2021156609A1 (en) | Process for making adenoassociated viral vectors | |
| CN111718420B (zh) | 一种用于基因治疗的融合蛋白及其应用 | |
| WO2024067153A1 (zh) | 一种用于在昆虫细胞中产生rAAV的核酸、VP1衣壳蛋白突变体及应用 | |
| CN112899276A (zh) | 迷你启动子pHSP90AA1及其应用 | |
| CN112680443A (zh) | 一种启动子pCalm1及其应用 | |
| CN108588097B (zh) | 改造后的hbv基因组和相关组合物及其应用 | |
| CN117264912A (zh) | 一种重组腺相关病毒颗粒、重组腺相关病毒载体系统及其应用 | |
| GB2599212A (en) | Stable cell lines for inducible production of rAAV virions | |
| EP3792367A1 (en) | Method for the production of raav and method for the in vitro generation of genetically engineered, linear, single-stranded nucleic acid fragments containing itr sequences flanking a gene of interest | |
| CN102071206A (zh) | 一种腺相关病毒衣壳蛋白基因、相应的蛋白及其应用 | |
| CN117018231B (zh) | 用于治疗神经病变的基因疗法及其应用 | |
| WO2024027632A1 (en) | Novel plasmid backbone to reduce dna impurities in raav preparation | |
| WO2024046403A1 (zh) | 能够提高腺相关病毒滴度的腺相关病毒结构质粒 | |
| WO2023102736A1 (zh) | 一种重组腺相关病毒包装质粒、重组腺相关病毒及其应用 | |
| WO2020187272A1 (zh) | 一种用于基因治疗的融合蛋白及其应用 | |
| WO2022187679A1 (en) | Viral vector constructs incorporating dna for inhibiting toll like receptors and methods of using the same | |
| EP4326881A1 (en) | Dna amplification method using care elements | |
| WO2022251096A1 (en) | Promoter sequence and related products and uses thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |