CN108588097B - 改造后的hbv基因组和相关组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一系列改造后的HBV基因组及其对应的组合物。HBV基因组中含有siRNA表达单元，表达产生靶向HBV基因保守区的siRNA，降解天然HBV RNA。HBV基因组表达产生的类HBV基因组竞争性地抑制天然HBV基因组的包装。用高效转导肝脏的AAV载体携带改造后的HBV基因组，将其高效转运至体内肝细胞，可有效地抑制HBV病毒的复制和包装，从而达到治疗慢性乙肝的目的。

Description

改造后的HBV基因组和相关组合物及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一系列改造后的HBV基因组及其对应的组合物，并将其应用于慢性乙肝的基因治疗药物的开发。
背景技术
乙肝是由HBV病毒感染引起的肝损伤性疾病。HBV属嗜肝DNA病毒科，是已知最小的感染人类的DNA病毒，基因组大小仅为3.2kb左右（Will H, et al. Princess TakamatsuSymp. 1982; 12: 237-247.）。同大多数包膜病毒一样，HBV病毒的生活周期主要包括黏附、胞吞、脱壳、复制、包装和分泌等过程（Dandri M, et al. Gut. 2012; 61(Suppl 1): i6-i17.）。目前，对病毒的基因组成、复制、包装、分泌等过程都了解得比较清楚。但由于缺乏简单易得的HBV体外感染细胞模型，HBV感染的早期机制如HBV的黏附、胞吞、脱壳等过程尚未得到阐明。HBV cccDNA在HBV病毒生活周期中处于核心地位。它既能转录产生表达HBV各种蛋白的mRNA，还能转录得到HBV的前基因组RNA（pregenomic RNA, pgRNA），作为逆转录形成HBV基因组DNA的模板（Perri S, et al. J Virol. 1996; 70: 6803-6809. Kidd AH, etal. Nucleic Acids Res. 1996; 24: 3295-3301.）。此外，它还随细胞基因组复制而复制，保证了其在肝细胞中长期存在（Chong CL, et al. J Biomed Sci. 2011; 18: 96.）。
HBV感染肝脏后对肝细胞无直接的损伤作用，其造成的病理损害主要是它复制所激发的免疫反应所致。免疫反应的强弱，尤其是细胞免疫应答的程度决定了HBV感染的转归。在急性HBV感染中，HBV特异的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic lymphocyte, CTL）反应是多克隆的、强烈的（Sprengers D, et al. J Hepatol. 2006; 45: 182-189.），而在慢性HBV感染中，CTL反应则是非常弱的，甚至测不到（Bertoletti A, et al. J Exp Med.1994; 180: 933-943.）。然而，由于缺乏合适的HBV感染动物模型，特别是HBV慢性感染动物模型，现有的研究结果仍未完全阐明HBV感染转归与不同程度的T细胞反应之间的因果关系。虽然如此，已有的研究结果表明CTL反应和体液免疫都在控制HBV感染中发挥重要作用（Guidotti LG, et al. Annu Rev Pathol. 2006; 1: 23-61. Chisari FV, et al.Pathol Biol(Paris). 2010; 58: 258-266.）。CTL反应能够有效地抑制感染HBV肝细胞中HBV的复制，在少数情况下还能够杀死感染HBV的肝细胞（Phillips S, et al. J Immunol.2010; 184: 287-295.）；体液免疫能够阻断HBV病毒感染新的肝细胞（Golsaz Shirazi F,et al. J Gastroenterol Hepatol. 2014; 29: 1083-1091.）。两种免疫反应相互协作，共同清除HBV病毒。两种免疫反应都应在病毒清除过程中保持一定的强度，确保病毒的有效清除。
根据HBV的致病机制和自身特点，已有和正在研发的乙肝治疗药物主要分为两大类。一类直接作用于HBV生活周期的某一阶段，阻断其进程，降低体内的HBV病毒载量，达到治疗的目的。该类药物主要包括抑制HBV DNA聚合酶功能的各种核苷酸类似物（Anand AC,et al. Trop Gastroenterol. 2008; 29: 71-75.）、影响生活周期其他阶段的小分子物质（Campagna MR, et al. J Virol. 2013; 87: 6931-6942.）以及针对HBV基因的siRNA（XieQ, et al. Acta Virol. 2012; 56: 49-55.）等。另一类则是以免疫反应为基础，试图打破HBV在肝脏中诱导产生的免疫耐受，增强机体对HBV病毒的清除作用，主要包括细胞因子（Jost S, et al. J Virol. 2007; 81: 10588-10596.）、治疗性疫苗（Michel ML, et al.Med Microbiol Immunol. 2015; 204: 121-129.）、天然免疫增强剂（Menne S, et al. JHepatol. 2015; pii: S01688-8287(14)00955-6.）等。现有的乙肝治疗药物主要有核苷酸类似物、干扰素和聚乙二醇化干扰素等（Wang XY, et al. World J Gastroenterol.2014; 20: 7707-7717.）。虽然这些药物的应用有效地控制了HBV的流行，但其都存在一定的不足之处，如长期使用出现耐药性、副作用较大等。而且它们对慢性乙肝患者的HBsAg转归率较低，对大多数患者只能缓解病情进程而不能治愈疾病。为了改进现有药物存在的不足之处，多家制药公司又设计开发多种治疗HBV的候选药物（Wang XY, et al. World JGastroenterol. 2014; 20: 7707-7717.），正处于临床前和临床研究阶段。
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种近年来获得迅猛发展的新的基因阻断技术，具有特异、有效的基因沉默效应，能够简单、高效地阻抑特定基因的表达（Zhou Y, etal. Nucleic Acids Res. 2002; 30: 1664-1669.）。而且HBV的基因组重复利用率高，一段基因组序列常常被多个编码蛋白反复多次利用（Bichko V, et al. FEBS Lett. 1985;185: 208-212），靶向基因组中特定序列的siRNA往往能够干扰多个编码蛋白的表达。因此基于siRNA的治疗药物具有广阔的开发前景。直接使用合成siRNA面临着大规模制备成本高、合成的siRNA稳定性差半衰期短、患者需要反复给药以及如何应用有效的给药方式等一系列的技术难题。
针对化学合成siRNA的不足之处，我们拟对HBV基因组进行改造，保留HBV基因组中基因组复制、病毒包装和基因表达所必须的序列，通过缺失、移码突变等方式使HBV各种蛋白无法表达，得到改造后的HBV基因组，即类HBV基因组。在此基础上，设计并合成多个基因组拷贝的类HBV基因组，同时在多个基因组拷贝的类HBV基因组中引入两个靶向HBV的siRNA基因表达单元。然后用高嗜肝性的AAV载体携带含有siRNA基因表达框的类HBV基因组，通过病毒感染高效转导肝细胞表达产生类HBV前体基因组RNA和靶向HBV的siRNA序列，在HBV病毒的包装、病毒基因组复制和蛋白表达等多个阶段阻断HBV病毒的生活周期，显著降低体内的HBV病毒载量，从而开发出一种治疗乙肝的基因药物。
腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）因在腺病毒制品中发现而得名（Atchison RW, et al. Science. 1965; 149: 754-756.Hoggan MD, et al. Proc Natl Sci USA. 1966; 55: 1467-1474.）。AAV是微小病毒科（Parvovirus）成员，包含多种血清型，其基因组为单链DNA（Rose JA, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1969; 64: 863-869.），其中AAV2的基因组大小为4682个核苷酸。AAV是依赖性病毒，需要其它病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒和人乳头瘤病毒（Geoffroy MC, et al. Curr Gene Ther. 2005; 5(3):265-271.），或辅助因素提供辅助功能才能复制。在没有辅助病毒存在时，AAV感染细胞后其基因组将整合到细胞染色体中成为潜伏状态（Chiorini JA, et al. Curr Top Microbiol Immunol. 1996; 218:25-33.），而不产生子代病毒。
最早分离到的AAV病毒是血清型2型AAV（AAV2）（Atchison RW, et al. Science.1965; 149: 754-756.）。AAV2基因组长约4.7kb,基因组两端为长度145bp的 “反向末端重复序列”（inverted terminal repeat, ITR），呈回文-发卡结构（Lusby E, et al. J Virol. 1980; 34: 402-409.）。基因组中有两个大开放阅读框（ORF），分别编码rep和cap基因。AAV2的全长基因组已克隆至大肠杆菌质粒中（Samulski RJ, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1982; 79: 2077-2081. Laughlin CA, et al. Gene. 1983; 23: 65-73.）。
ITR是AAV载体基因组的顺式作用元件，在AAV病毒的整合、拯救、复制和基因组包装中发挥重要作用（Xiao X, et al. J Virol. 1997; 71(2): 941-948.）。ITR序列中包含Rep蛋白结合位点（Rep binding site, RBS）和末端解链位点trs（terminal resolutionsite），能够被Rep蛋白结合识别并在trs处产生切口（Linden RM, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 1996; 93(15): 7966-7972.）。ITR序列还可形成独特的“T”字母型二级结构，在AAV病毒的生活周期中发挥重要作用（Ashktorab H, et al. J Virol. 1989; 63(7):3034-3039.）。
AAV2基因组其余部分可分为2个功能区，rep基因区和cap基因区（Srivastava A,et al. J Virol. 1983; 45(2): 555-564.）。rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs（terminal resolution site）和GAGY重复基序（repeat motif）特异性结合（Hüser D, et al. PLoS Pathog. 2010; 6(7): e1000985.），启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序是AAV基因组复制的中心，因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同，但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。在AAV2基因组图谱位置19处有p19启动子，分别表达Rep52和Rep40。Rep52和Rep40没有结合DNA的功能，而有ATP依赖的DNA解旋酶活性。cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中，VP3分子量最小，但数量最多，在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的；VP2协助VP3进入细胞核；VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。
随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解，AAV病毒被改造成了一种高效的外源基因转移工具，即AAV载体。改造后的AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带转运的外源基因表达框，病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过外源质粒反式提供，降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。加之，AAV病毒本身不具有致病性，使AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs（terminal resolution site）序列还能够使包装得到的重组AAV病毒载体携带基因组自我互补，形成双链，显著提高AAV载体的体内外转导效率（Wang Z, et al. Gene Ther.2003;10(26):2105-2111. McCarty DM, et al. Gene Ther. 2003;10(26):2112-2118.）。包装得到的病毒成为scAAV（self-complementary AAV）病毒，即所谓的双链AAV病毒。不同于双侧ITR均未突变的ssAAV（single-stranded AAV），即传统的AAV病毒。scAAV病毒的包装容量更小，仅为ssAAV包装容量的一半，约为2.2kb-2.5kb，但感染细胞后转导效率更高。AAV病毒血清型众多，不同的血清型具有不同的组织感染嗜性，因此应用AAV载体能够将外源基因转运至特定的器官和组织（Wu Z, et al. Mol Ther. 2006; 14(3): 316-327.）。某些血清型AAV载体还可穿越血脑屏障，将外源基因导致大脑神经元中，为靶向大脑的基因转导提供了可能（Samaranch L, et al. Hum Gene Ther. 2012; 23(4): 382-389.）。此外，AAV载体的理化性质稳定，对酸碱和高温体现出较强的耐受性（Gruntman AM, et al. Hum Gene Ther Methods. 2015; 26(2): 71-76.），容易开发出稳定性较高的生物制品。
AAV载体还具有相对成熟的包装系统，便于规模化生产。目前国内外常用的AAV载体包装系统主要包括三质粒共转染系统、腺病毒为辅助病毒系统、单纯疱疹病毒（Herpessimplex virus type 1，HSV1）为辅助病毒的包装系统以及基于杆状病毒的包装系统。其中，三质粒转染包装系统因无需辅助病毒，安全性高，是应用最为广泛的AAV载体包装系统，也是目前国际上主流的生产系统。略显不足的是，高效大规模转染方法的缺失限制了三质粒转染系统在AAV载体大规模制备中的应用。Yuan等建立以腺病毒为辅助病毒的AAV大规模包装系统（Yuan Z, et al. Hum Gene Ther. 2011; 22(5): 613-624.），该系统生产效率高，但包装系统中腺病毒在最后AAV成品中的痕量存在，影响了AAV成品的安全性。HSV1作为辅助病毒的包装系统是另一类应用较为广泛的AAV载体包装系统。伍志坚和Conway等几乎同时在国际上提出了以HSV1为辅助病毒的AAV2载体包装策略（伍志坚，吴小兵等。科学通报，1999; 44(5): 506-509. Conway JE, et al. Gene Ther. 1999; 6: 986-993.）。随后Wustner等提出了以HSV1为辅助病毒的AAV5载体包装策略（Wustner JT, et al. Mol Ther. 2002; 6(4): 510-518.）。在此基础上，Booth等利用两个HSV1分别携带AAV的rep/cap基因和AAV的反向末端序列（Inverted terminal repeat, ITR）/外源基因表达框，然后两个重组HSV1病毒共同感染生产细胞，包装产生AAV病毒（Booth MJ, et al. Gene Ther.2004; 11: 829-837.）。Thomas等进一步建立双HSV1病毒AAV生产的悬浮细胞系统（ThomasDL, et al. Gene Ther. 2009; 20: 861-870.），使更大规模的AAV病毒生产成为可能。另外，Urabe等利用三个杆状病毒分别携带AAV的结构、非结构和ITR/外源基因表达框，构建了AAV载体的杆状病毒包装系统。考虑到杆状病毒携带外源基因的不稳定性，随后减少了生产系统中所需杆状病毒的个数，逐渐从最开始的需要三个杆状病毒到需要两或一个杆状病毒（Chen H. Mol Ther. 2008; 16(5): 924-930. Galibert L,et al. J Invertebr Pathol. 2011; 107 Suppl: S80-93.）以及一个杆状病毒加一株诱导细胞株策略（Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther. 2014; 25: 212-222. Mietzsch M, et al. Hum Gene Ther. 2015; 26(10): 688-697.）。每种包装系统都各具特点，可根据需要做出合适的选择。
由于上述特点，AAV载体逐渐成为一种广泛应用于基因治疗，特别是遗传病的基因治疗的外源基因转运工具。截至2017年11月，世界上批准的机遇AAV载体的基因治疗临床试验方案有204项（http://www.abedia.com/wiley/vectors.php）。更为重要的是，基于AAV载体的脂蛋白脂酶基因治疗药物Glybera已于2012年被欧洲药监局批准上市，成为西方世界批准的第一个基因治疗药物（Ylä-Herttuala S. Mol Ther. 2012; 20(10): 1831-1832.）；2017年12月19日美国FDA批准先天性黑曚症（RPE65基因突变引起）基因治疗药物Luxturna上市，成为美国第一个罕见病的基因治疗药物（https://www.fda.gov/newsevents/newsroom/pressannouncements/ucm589467.htm）。血友病B（Kay MA, et al.Nat Genet. 2000; 24(3): 257-261.）的AAV载体基因治疗药物均取得不错的临床试验效果，预期在不久的将来会上市销售，造福广大患者。
本发明中，我们选择AAV载体来携带改造后的HBV基因组，主要是基于AAV载体的以下特点。其一，AAV载体仅保留野生型病毒中病毒包装需要的两个ITR序列，不含有野生型病毒基因组中的蛋白编码基因（Salgenik M, et al. Microbiol Spectr. 2015; 3(4).），免疫原性低。其二，AAV通常以不整合的染色体外遗传物质形式实现携带基因读框的持续稳定表达（Chen ZY, et al. Mol Ther. 2001; 3(3): 403-410.），避免引导入基因随机整合而带来的安全性问题。其三，AAV载体通过静脉注射对肝脏具有较高的转导效率（Sands MS.Methods Mol Biol. 2011; 807: 141-157. Wang L, et al. Mol Ther. 2015; 23(12):1877-1887.），保证改造后的HBV基因组能够在肝脏内高效地表达靶向HBV的siRNA和类HBV前体基因组RNA。
根据以上设计思路，我们制备得到一系列携带类HBV基因组的重组AAV病毒。应用携带多个基因组拷贝的HBV基因组的重组AAV病毒，评价了含有类HBV基因组的重组AAV病毒的体内外功能。结果显示，携带类HBV基因组的重组AAV病毒高效转导体内后，能够有效地表达产生类HBV前体基因组RNA和靶向HBV的siRNA，显著降低体内的HBV病毒载量，阻断HBV病毒的生活周期，显示出巨大的慢性乙肝的治疗潜力。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一系列改造后的HBV基因组及其组合物。组合物是指携带改造后的HBV基因组的重组AAV病毒。改造后的HBV基因组保留了HBV基因组复制、基因表达和病毒包装所必需的顺式作用元件，通过缺失突变、移码突变等方式使HBV编码蛋白基因无法表达。将改造后的HBV基因组命名为类HBV基因组，即mini-HBV。进一步设计构建得到多个拷贝数大小的mini-HBV，如1.1个拷贝的mini-HBV（1.1mini-HBV）、1.2个拷贝的mini-HBV（1.2mini-HBV）和1.3个拷贝的mini-HBV（1.3mini-HBV）。在多个拷贝数的mini-HBV基因组中插入两个靶向HBV的siRNA表达框，表达产生的siRNA以所有HBV基因型的保守区域序列为靶标，抑制多种HBV蛋白编码基因的表达。而且多个拷贝的mini-HBV基因组表达产生的类HBV RNA，同天然的HBV基因组类似，可竞争性地抑制天然HBV pgRNA的包装，降低具有感染活性的HBV病毒颗粒的产生。选择高度靶向肝脏的AAV血清型携带多个拷贝数的mini-HBV，系统给药后能够高效地转导肝细胞，表达产生阻断HBV生活周期的类HBV RNA和siRNA，从而达到降低血液中HBV病毒载量，治疗慢性乙肝的目的。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一系列改造后的HBV基因组及其组合物，其特征在于，该组合物为携带改造后的HBV基因组的重组AAV载体，利用AAV载体通过静脉注射高效地把改造后的HBV基因组导入肝脏中，表达产生阻断HBV生活周期的效应分子，阻断HBV的生活周期，显著降低血液中的HBV载量，从而达到治疗慢性乙肝的目的。为了实现改造后的HBV基因组的高效转导肝脏，根据不同血清型AAV的转导特点，选择的AAV血清型主要为AAV3B、AAV5和AAV8。
本发明提供的一系列改造后的HBV基因组及其组合物，其特征在于，改造后的HBV基因组含有HBV基因复制、病毒包装和病毒蛋白基因表达所需的顺式作用元件，通过缺失突变和移码突变等方式使HBV蛋白编码基因无法表达。而且改造后的HBV基因组为多拷贝，通常含有1.1-1.3个拷贝数基因组DNA，这样基因组导入肝脏后能够利用自身的表达元件表达产生改造后的前体基因组RNA。前体基因组RNA具有同天然HBV前体基因组RNA类似的基因组结构，在病毒基因组包装过程中竞争性地抑制天然HBV前体基因组RNA的包装，降低包装得到含有天然HBV 前体基因组RNA的病毒颗粒含量。
本发明提供的一系列改造后的HBV基因组及其组合物，其特征还在于，改造后的HBV基因组中含有2个靶向HBV的siRNA表达框。2个siRNA表达框采用不同的策略表达siRNA，1个siRNA表达框利用基于内含子的siRNA表达策略，通过HBV基因组中核心抗原启动子调控其表达；另1个siRNA表达框采用类似于miRNA的表达方式进行表达，表达的siRNA以miR-30前体为基本骨架，借用HBV基因组中X蛋白基因启动子调控其表达。两种siRNA表达策略，使改造后的HBV基因组导入肝脏后能够表达产生两种针对HBV基因的siRNA。而且基于miRNA表达策略的siRNA的基因仍然保留在表达产生的类HBV前体基因组RNA中，理论上仍可能被包装入携带类HBV DNA且具有感染活性的HBV病毒颗粒，分泌出细胞，重新感染新的细胞，再次表达产生靶向HBV的siRNA，起到抑制病毒复制的作用。虽然由于HBV病毒特性的限制，没有在实施例中进行验证，但理论预测在人体中存在发生的可能性。而且两个HBV siRNA针对的靶序列均位于所有基因型HBV基因组的高度保守区，对所有基因型的HBV均可产生明显的抑制作用。
本发明提供的一系列改造后的HBV基因组及其组合物，其特征在于，该组合物经静脉注射至体内后，能够持续地表达产生类HBV前体基因组RNA和2个靶向HBV的siRNA，表达产生的3种RNA分子从HBV生活周期的不同阶段阻断HBV的生活周期，从而显著降低体内的HBV病毒载量，为慢性乙肝治疗提供新的选择。而且改造后的HBV基因组具有同天然HBV基因组相似的基因组结构，理论上可随着天然HBV基因组的消失而消失，避免了疾病治愈后HBVsiRNA和类HBV前体基因组RNA持续表达带来的安全隐患，因此安全性更高。
本发明用到的重要原始实验材料如下所示：
pHelper质粒，来源于AAV Helper Free System（Agilent Technologies，美国），由本公司购自AgilentTechnologies公司并保存。该质粒包含三质粒共转染HEK293细胞制备重组AAV病毒所需要的腺病毒来源辅助功能基因E2A、E4和VA RNA等。
pAAV-R2C3B质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV3B基因组（GenBank ID：AF028705）中外壳蛋白编码序列Cap3B（基因组中第2208至4418位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C3B质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C3B质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C3B质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII至PmeI之间序列，获得pAAV-R2C3B质粒。pAAV-R2C3B质粒包含完整的AAV3B的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV3B病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV3B外壳蛋白。
pAAV-R2C5质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV基因组（GenBank ID：NC_006152.1）中外壳蛋白编码序列Cap5（基因组中第2207至4381位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C5质粒序列。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C5质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C5质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII至PmeI之间序列，获得pAAV-R2C5质粒。pAAV-R2C5质粒包含完整的AAV5的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV5病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV5外壳蛋白。
pAAV-R2C8质粒，由本公司构建保存。以AAV Helper Free System（AgilentTechnologies，美国）中的pAAV-RC质粒为基本骨架，用AAV8基因组（GenBank ID：AF513852）中外壳蛋白编码序列Cap8（基因组中第2121至4337位序列）替换pAAV-RC质粒中第2013至4220位序列，即得pAAV-R2C8质粒。简要的构建过程为，根据前述思路获得pAAV-R2C8质粒序列信息，人工合成pAAV-R2C8质粒中HindIII至PmeI酶切位点之间序列，采用标准的分子克隆方法，用合成序列替换pAAV-RC质粒HindIII至PmeI之间序列，获得pAAV-R2C8质粒。pAAV-R2C8质粒包含完整的AAV8的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAV8病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAV8外壳蛋白。
pAAV-DJ质粒，包含完整的AAVDJ的cap基因和AAV2的rep基因，在三质粒共转染包装制备重组AAVDJ病毒中提供包装所必须的4种Rep蛋白（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40）和AAVDJ外壳蛋白。由本公司购自美国Cell Biolabs公司并保存。
C57BL/6小鼠：购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1 pAAV2neo载体结构示意图。本公司保存的两侧ITR均为145bp野生型ITR的AAV载体pAAV2neo（Dong X, et al. PLoS ONE. 2010; 5(10): e13479.）。ITR，invertedterminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、KpnI、EcoRI、SalI、BglII、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。
图2 pAAV2-EGFP载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。CMV promoter，人巨细胞病毒早期启动子。BGH polyA，牛生长激素的多聚核苷酸加尾信号。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。EGFP，增强型绿色荧光蛋白编码区序列。
图3 pAAV2-1.1mini-HBV载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。1.1mini-HBV为改造后的1.1个拷贝的类HBV基因组。
图4 pAAV2-1.2mini-HBV载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。1.2mini-HBV为改造后的1.2个拷贝的类HBV基因组。
图5 pAAV2-1.3mini-HBV载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。1.3mini-HBV为改造后的1.3个拷贝的类HBV基因组。
图6 pAAV2-1.1mini-HBV-diRNA载体结构示意图。ITR，inverted terminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。1.1mini-HBV-diRNA为人工设计的含有2种siRNA表达结构的1.1个拷贝的类HBV基因组。Intronic shRNA，人工设计的内含子序列中插入针对HBV基因组的short hairpin RNA（shRNA）表达结构，可表达产生针对HBV病毒的siRNA。miR-30-bsiRNA，利用人miR-30前体结构的siRNA表达结构，该结构借用miRNA表达机制产生针对HBV基因的siRNA。
图7 pAAV2-1.2mini-HBV-diRNA载体结构示意图。ITR，inverted terminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。1.2mini-HBV-diRNA为人工设计的含有2种siRNA表达结构的1.2个拷贝的类HBV基因组。Intronic shRNA，人工设计的内含子序列中插入针对HBV基因组的short hairpin RNA（shRNA）表达结构，可表达产生针对HBV病毒的siRNA。miR-30-bsiRNA，利用人miR-30前体结构的siRNA表达结构，该结构借用miRNA表达机制产生针对HBV基因的siRNA。
图8 pAAV2-1.3mini-HBV-diRNA载体结构示意图。ITR，inverted terminalrepeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、BamHI和ApaI均为限制性酶切位点。1.3mini-HBV-diRNA为人工设计的含有2种siRNA表达结构的1.3个拷贝的类HBV基因组。Intronic shRNA，人工设计的内含子序列中插入针对HBV基因组的short hairpin RNA（shRNA）表达结构，可表达产生针对HBV病毒的siRNA。miR-30-bsiRNA，利用人miR-30前体结构的siRNA表达结构，该结构借用miRNA表达机制产生针对HBV基因的siRNA。
图9 pAAV-MS载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。XhoI、BamHI、MluI、SalI和ApaI均为限制性酶切位点。
图10 pAAV2-1.3HBV-A载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。MluI和SalI均为限制性酶切位点。1.3HBV-A，1.3个拷贝数的基因A型HBV基因组，单个拷贝的A型HBV基因组序列信息来源于GenBank，序列ID号为AY161142。
图11 pAAV2-1.3HBV-B载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。MluI和SalI均为限制性酶切位点。1.3HBV-B，1.3个拷贝数的基因B型HBV基因组，单个拷贝的B型HBV基因组序列信息来源于GenBank，序列ID号为U87747。
图12 pAAV2-1.3HBV-C载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。MluI和SalI均为限制性酶切位点。1.3HBV-C，1.3个拷贝数的基因C型HBV基因组，该序列信息来源于GenBank，序列ID号为KX449554.1。
图13 pAAV2-1.3HBV-D载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。MluI和SalI均为限制性酶切位点。1.3HBV-D，1.3个拷贝数的基因D型HBV基因组，该序列信息来源于GenBank，序列ID号为KX470733.1。
图14 pAAV2-1.3HBV-E载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。MluI和SalI均为限制性酶切位点。1.3HBV-E，1.3个拷贝数的基因E型HBV基因组，单个拷贝的E型HBV基因组序列信息来源于GenBank，序列ID号为X75657。
图15 pAAV2-1.3HBV-F载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。MluI和SalI均为限制性酶切位点。1.3HBV-F，1.3个拷贝数的基因F型HBV基因组，单个拷贝的F型HBV基因组序列信息来源于GenBank，序列ID号为X75658。
图16 pAAV2-1.3HBV-G载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。MluI和SalI均为限制性酶切位点。1.3HBV-G，1.3个拷贝数的基因F型HBV基因组，单个拷贝的G型HBV基因组序列信息来源于GenBank，序列ID号为AF241409。
图17 pAAV2-1.3HBV-H载体结构示意图。ITR，inverted terminal repeat，长度为145bp的反向末端重复序列。Amp，氨苄青霉素抗性基因读框。Neo，新霉素抗性基因读框。MluI和SalI均为限制性酶切位点。1.3HBV-H，1.3个拷贝数的基因H型HBV基因组，单个拷贝的H型HBV基因组序列信息来源于GenBank，序列ID号为AB059659。
图18 重组AAV病毒信息表。表中总结本发明中用到的重组AAV名称及其对应的AAV载体血清型和携带基因信息。
图19 携带多拷贝HBV基因组的重组AAV病毒感染Huh7细胞后细胞培养上清中HBsAg表达水平检测。包装得到多种携带1.3个拷贝不同基因型HBV基因组的重组AAV病毒，血清型为AAVDJ。重组AAV病毒以10000vg/cell的剂量感染Huh7细胞。48h后，取细胞培养上清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。Control，感染rAAVDJ-EGFP病毒对照。mini，感染rAAVDJ-1.3mini-HBV细胞培养上清。HBV-A，感染rAAVDJ-1.3HBV-A细胞培养上清。HBV-B，感染rAAVDJ-1.3HBV-B细胞培养上清。HBV-C，感染rAAVDJ-1.3HBV-C细胞培养上清。HBV-D，感染rAAVDJ-1.3HBV-D细胞培养上清。HBV-E，感染rAAVDJ-1.3HBV-E细胞培养上清。HBV-F，感染rAAVDJ-1.3HBV-F细胞培养上清。HBV-G，感染rAAVDJ-1.3HBV-G细胞培养上清。HBV-H，感染rAAVDJ-1.3HBV-H细胞培养上清。
图20 定量PCR检测引物和探针信息。总结了本发明病毒体内外功能评价使用的各种定量PCR检测引物和探针信息。HBV-A至HBV-H分别表示不同的HBV基因型，如HBV-A表示基因型为A的HBV。Mini-HBV表达改造过的HBV基因组。序列名称中“-F”和“-R”分别表示上游和下游引物，“-P”表示探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerry quencher。引物和探针由Thermofisher Scientific合成。
图21 携带多拷贝HBV基因组的重组AAV病毒感染Huh7细胞后细胞培养上清中HBVDNA拷贝数检测。包装得到多种携带1.3个拷贝不同基因型HBV基因组的重组AAV病毒，血清型为AAVDJ。重组AAV病毒以10000vg/cell的剂量感染Huh7细胞。48h后，取细胞培养上清，用定量PCR方法测定HBV DNA拷贝数，检测过程详见实施例3。Control，感染rAAVDJ-EGFP病毒对照。mini，感染rAAVDJ-1.3mini-HBV细胞培养上清。HBV-A，感染rAAVDJ-1.3HBV-A细胞培养上清。HBV-B，感染rAAVDJ-1.3HBV-B细胞培养上清。HBV-C，感染rAAVDJ-1.3HBV-C细胞培养上清。HBV-D，感染rAAVDJ-1.3HBV-D细胞培养上清。HBV-E，感染rAAVDJ-1.3HBV-E细胞培养上清。HBV-F，感染rAAVDJ-1.3HBV-F细胞培养上清。HBV-G，感染rAAVDJ-1.3HBV-G细胞培养上清。HBV-H，感染rAAVDJ-1.3HBV-H细胞培养上清。
图22 两种重组AAV病毒共感染Huh7细胞后细胞培养上清中HBsAg表达水平检测。包装得到多种携带1.3个拷贝不同基因型HBV基因组的重组AAV病毒，血清型为AAVDJ。rAAVDJ-1.3mini-HBV（mini）或rAAVDJ-EGFP（Control）与携带不同基因型HBV基因组AAV病毒共感染Huh7细胞，每种病毒的感染剂量为10000vg/cell。48h后，取细胞培养上清，用HBVHBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。
图23 两种重组AAV病毒共感染Huh7细胞后细胞培养上清中HBV DNA拷贝数检测。包装得到多种携带1.3个拷贝不同基因型HBV基因组的重组AAV病毒，血清型为AAVDJ。rAAVDJ-1.3mini-HBV（mini）或rAAVDJ-EGFP（Control）与携带不同基因型HBV基因组AAV病毒共感染Huh7细胞，每种病毒的感染剂量为10000vg/cell。48h后，取细胞培养上清，提取培养上清中DNA，用特异性检测完整HBV DNA（w）和mini-HBV DNA（m）的引物及探针，QPCR检测完整HBV DNA（w）及mini-HBV DNA（m）的拷贝数。Control(m)，共感染对照病毒后mini-HBVDNA检测结果。Control（w），共感染对照病毒后完整HBV DNA检测结果。mini(m)，共感染rAAVDJ-1.3mini-HBV病毒后mini-HBV DNA检测结果。mini（w），共感染rAAVDJ-1.3mini-HBV病毒后完整HBV DNA检测结果。
图24 携带多拷贝HBV基因组的重组AAV病毒注射C57BL/6小鼠后血清中HBsAg表达水平检测。包装得到多种携带1.3个拷贝不同基因型HBV基因组的重组AAV病毒，血清型为AAV8。重组AAV病毒以1×1011vg/只的剂量经尾静脉注射C57BL/6小鼠。注射病毒4w后，尾静脉采血，分离血清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。Control，注射rAAV8-EGFP病毒对照小鼠。mini，注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒小鼠。HBV-A，注射rAAV8-1.3HBV-A病毒小鼠。HBV-B，注射rAAV8-1.3HBV-B病毒小鼠。HBV-C，注射rAAV8-1.3HBV-C病毒小鼠。HBV-D，注射rAAV8-1.3HBV-D病毒小鼠。HBV-E，注射rAAV8-1.3HBV-E病毒小鼠。HBV-F，注射rAAV8-1.3HBV-F病毒小鼠。HBV-G，注射rAAV8-1.3HBV-G病毒小鼠。HBV-H，注射rAAV8-1.3HBV-H病毒小鼠。
图25 携带多拷贝HBV基因组的重组AAV病毒注射C57BL/6小鼠后血清中HBV DNA拷贝数检测。包装得到多种携带1.3个拷贝不同基因型HBV基因组的重组AAV病毒，血清型为AAV8。重组AAV病毒以1×1011vg/只的剂量经尾静脉注射C57BL/6小鼠。注射病毒4w后，尾静脉采血，分离血清，用定量PCR方法测定HBV DNA拷贝数，检测过程详见实施例3。Control，注射病毒rAAV8-EGFP病毒对照小鼠。mini，注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒小鼠。HBV-A，注射rAAV8-1.3HBV-A病毒小鼠。HBV-B，注射rAAV8-1.3HBV-B病毒小鼠。HBV-C，注射rAAV8-1.3HBV-C病毒小鼠。HBV-D，注射rAAV8-1.3HBV-D病毒小鼠。HBV-E，注射rAAV8-1.3HBV-E病毒小鼠。HBV-F，注射rAAV8-1.3HBV-F病毒小鼠。HBV-G，注射rAAV8-1.3HBV-G病毒小鼠。HBV-H，注射rAAV8-1.3HBV-H病毒小鼠。
图26 两种重组AAV病毒共注射C57BL/6小鼠后血清中HBsAg表达水平检测。包装得到多种携带1.3个拷贝不同基因型HBV基因组的重组AAV病毒，血清型为AAV8。rAAV8-1.3mini-HBV（mini）或rAAV8-EGFP（Control）与携带不同基因型HBV基因组AAV病毒经尾静脉共注射C57BL/6小鼠，每种病毒的注射剂量为1×1011vg。注射病毒4w后，尾静脉采血，分离血清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。
图27 两种重组AAV病毒共注射C57BL/6小鼠后血清中HBV DNA拷贝数检测。包装得到多种携带1.3个拷贝不同基因型HBV基因组的重组AAV病毒，血清型为AAV8。rAAV8-1.3mini-HBV（mini）或rAAV8-EGFP（Control）与携带不同基因型HBV基因组AAV病毒经尾静脉共注射C57BL/6小鼠，每种病毒的注射剂量为1×1011vg。注射病毒4w后，尾静脉采血，提取血液中DNA，用特异性检测完整HBV DNA（w）和mini-HBV DNA（m）的引物及探针，QPCR检测完整HBV DNA（w）及mini-HBV DNA（m）的拷贝数。Control（m），共注射对照病毒后mini-HBV DNA检测结果。Control（w），共注射对照病毒后完整HBV DNA检测结果。mini（m），共注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒后mini-HBV DNA检测结果。mini（w），共注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒后完整HBV DNA检测结果。
图28 不同拷贝数的mini-HBV基因组对HBsAg表达的抑制作用。包装得到携带1.1个拷贝（1.1copies）、1.2个拷贝（1.2copies）和1.3个拷贝（1.3copies）mini-HBV基因组的重组AAV病毒，血清型为AAV8。携带不同拷贝数的mini-HBV基因组的AAV8病毒或rAAV8-EGFP（Control）与携带1.3个拷贝数基因型D的HBV基因组的AAV8病毒共注射C57BL/6小鼠，每种病毒的注射剂量为1×1011vg。注射病毒4w后，尾静脉采血，分离血清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。
图29不同拷贝数的mini-HBV基因组对HBV DNA表达的抑制作用。包装得到携带1.1个拷贝（1.1copies）、1.2个拷贝（1.2copies）和1.3个拷贝（1.3copies）mini-HBV基因组的重组AAV病毒，血清型为AAV8。携带不同拷贝数的mini-HBV基因组的AAV8病毒或rAAV8-EGFP（Control）与携带1.3个拷贝数基因型D的HBV基因组的AAV8病毒共注射C57BL/6小鼠，每种病毒的注射剂量为1×1011vg。注射病毒4w后，尾静脉采血，提取血液中DNA，用特异性检测完整HBV DNA（w）和mini-HBV DNA（m）的引物及探针，QPCR检测完整HBV DNA（w）及mini-HBVDNA（m）的拷贝数。Control，注射rAAV8-EGFP病毒组。1.1copies，注射rAAV8-1.1mini-HBV病毒组。1.2copies，注射rAAV8-1.2mini-HBV病毒组。1.3copies，注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒组。w，完整HBV DNA检测结果。m，mini-HBV DNA检测结果。
图30 携带mini-HBV-diRNA重组AAV病毒对HBsAg的抑制作用。rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA（diRNA）、rAAV8-1.3mini-HBV（mini）或rAAV8-EGFP（Control）与携带不同基因型1.3拷贝的HBV基因组AAV病毒经尾静脉共注射C57BL/6小鼠，每种病毒的注射剂量为1×1011vg。注射病毒4w后，尾静脉采血，分离血清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。
图31 携带mini-HBV-diRNA重组AAV病毒对HBV DNA的抑制作用。rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA（diRNA）、rAAV8-1.3mini-HBV（mini）或rAAV8-EGFP（Control）与携带不同基因型1.3拷贝的HBV基因组AAV病毒经尾静脉共注射C57BL/6小鼠，每种病毒的注射剂量为1×1011vg。注射病毒4w后，尾静脉采血，提取血液中DNA，用特异性检测完整HBV DNA(w)、mini-HBV DNA(m)和mini-HBV-diRNA(m)的引物及探针，QPCR检测完整HBV DNA（w）、mini-HBV DNA(m) 和mini-HBV-diRNA(m)的拷贝数。Control(m)，共注射对照病毒后mini-HBV DNA检测结果。Control(w)，共注射对照病毒后完整HBV DNA检测结果。mini(m)，共注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒后mini-HBV DNA检测结果。mini(w)，共注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒后完整HBV DNA检测结果。diRNA(m)，共注射rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA病毒后mini-HBV-diRNADNA检测结果。diRNA(w)，共注射rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA病毒后完整HBV DNA检测结果。
图32 不同拷贝数的mini-HBV-diRNA基因组对HBsAg表达的抑制作用。包装得到携带1.1个拷贝（1.1copies-diRNA）、1.2个拷贝（1.2copies-diRNA）和1.3个拷贝（1.3copies-diRNA）mini-HBV-diRNA基因组的重组AAV病毒，血清型为AAV8。携带不同拷贝数的mini-HBV-diRNA基因组的AAV8病毒、携带不同拷贝数的mini-HBV基因组的AAV8病毒或rAAV8-EGFP（Control）与携带1.3个拷贝数基因型D的HBV基因组的AAV8病毒共注射C57BL/6小鼠，每种病毒的注射剂量为1×1011vg/只。注射病毒4w后，尾静脉采血，分离血清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。
图33 不同拷贝数的mini-HBV-diRNA基因组对HBV DNA表达的抑制作用。包装得到携带1.1个拷贝（1.1copies-diRNA）、1.2个拷贝（1.2copies-diRNA）和1.3个拷贝（1.3copies-diRNA）mini-HBV-diRNA基因组的重组AAV病毒，血清型为AAV8。携带不同拷贝数的mini-HBV-diRNA基因组的AAV8病毒、携带不同拷贝数的mini-HBV基因组的AAV8病毒或rAAV8-EGFP（Control）与携带1.3个拷贝数基因型D的HBV基因组的AAV8病毒共注射C57BL/6小鼠，每种病毒的注射剂量为1×1011vg。注射病毒4w后，尾静脉采血，提取血液中DNA，用特异性检测完整HBV DNA（w）、mini-HBV DNA（m）和mini-HBV-diRNA DNA（m）的引物及探针，QPCR检测完整HBV DNA（w）、mini-HBV DNA（m）和mini-HBV-diRNA DNA（m）的拷贝数。Control，注射rAAV8-EGFP病毒组。1.1copies，注射rAAV8-1.1mini-HBV病毒组。1.2copies，注射rAAV8-1.2mini-HBV病毒组。1.3copies，注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒组。1.1copies-diRNA，注射rAAV8-1.1mini-HBV-diRNA病毒组。1.2copies-diRNA，注射rAAV8-1.2mini-HBV-diRNA病毒组。1.3copies-diRNA，注射rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA病毒组。w，完整HBVDNA检测结果。m，mini-HBV DNA或mini-HBV-diRNA DNA检测结果。
图34 不同感染用MOI对HepG2.2.15细胞表达产生HBsAg的抑制作用。包装得到携带1.3个拷贝mini-HBV DNA或1.3个拷贝mini-HBV-diRNA DNA的重组AAV病毒，血清型为AAVDJ。rAAVDJ-1.3mini-HBV（mini）、rAAVDJ-1.3mini-HBV-diRNA（mini-diRNA）或rAAVDJ-EGFP（Control）分别以不同的MOI（100、1000、10000和100000）感染HepG2.2.15细胞。48h后，取细胞培养上清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。
图35 不同感染用MOI对HepG2.2.15细胞产生HBV DNA的抑制作用。 包装得到携带1.3个拷贝mini-HBV DNA或1.3个拷贝mini-HBV-diRNA DNA的重组AAV病毒，血清型为AAVDJ。rAAVDJ-1.3mini-HBV（mini）、rAAVDJ-1.3mini-HBV-diRNA（mini-diRNA）或rAAVDJ-EGFP（Control）分别以不同的MOI（100、1000、10000和100000）感染HepG2.2.15细胞。48h后，取细胞培养上清，提取培养上清中DNA，用定量PCR方法测定HBV DNA拷贝数。Control，感染对照病毒。mini，感染rAAVDJ-1.3mini-HBV病毒。mini-diRNA，感染rAAVDJ-1.3mini-HBV-diRNA病毒。
图36 不同剂量对体内HBsAg表达的抑制作用。不同剂量的rAAV8-EGFP（Control）、rAAV8-1.3mini-HBV（mini）或rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA（mini-diRNA）与rAAV8-1.3HBV-D经尾静脉共注射至C57BL/6小鼠体内。Control、mini和mini-diRNA的注射剂量设置4个梯度，分别为1×109vg/只、1×1010vg/只、1×1011vg/只和1×1012vg/只。rAAV8-1.3HBV-D的注射剂量为1×1011vg/只。注射病毒4w后，尾静脉采血，分离血清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。
图37 不同剂量对体内HBV DNA的抑制作用。不同剂量的rAAV8-EGFP（Control）、rAAV8-1.3mini-HBV（mini）或rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA（mini-diRNA）与rAAV8-1.3HBV-D经尾静脉注射至C57BL/6小鼠体内。Control、mini和mini-diRNA的注射剂量设置4个梯度，分别为1×109vg/只、1×1010vg/只、1×1011vg/只和1×1012vg/只。rAAV8-1.3HBV-D的注射剂量为1×1011vg/只。注射病毒4w后，尾静脉采血，提取血液中DNA，用特异性检测完整HBVDNA(w)、mini-HBV DNA(m)和mini-HBV-diRNA DNA（m）的引物及探针，QPCR检测完整HBV DNA（w）、mini-HBV DNA(m)或mini-HBV-diRNA DNA（m）的拷贝数。Control(m)，共注射对照病毒后mini-HBV DNA检测结果。Control(w)，共注射对照病毒后完整HBV DNA检测结果。mini(m)，共注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒后mini-HBV DNA检测结果。mini(w)，共注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒后完整HBV DNA检测结果。diRNA(m)，共注射rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA病毒后mini-HBV DNA检测结果。diRNA(w)，共注射rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA病毒后完整HBVDNA检测结果。
图38 不同AAV血清型对体内HBsAg表达的抑制作用。选择AAV3B、AAV5和AAV8三种不同的AAV血清型包装得到相应的Control、mini和mini-diRNA病毒。然后将每种病毒与rAAV8-1.3HBV-D经尾静脉注射至C57BL/6小鼠体内。每种病毒的注射剂量为1×1011vg/只。注射病毒4w后，尾静脉采血，分离血清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。
图39 不同AAV血清型对体内HBV DNA表达的抑制作用。选择AAV3B、AAV5和AAV8三种不同的AAV血清型包装得到相应的Control、mini和mini-diRNA病毒。然后将每种病毒与rAAV8-1.3HBV-D经尾静脉注射至C57BL/6小鼠体内。每种病毒的注射剂量为1×1011vg/只。注射病毒4w后，尾静脉采血，提取血液中DNA，用特异性检测完整HBV DNA（w）、mini-HBV DNA（m）和mini-HBV-diRNA DNA（m）的引物及探针，QPCR检测完整HBV DNA（w）、mini-HBV DNA（m）或mini-HBV-diRNA DNA（m）的拷贝数。Control（m），共注射对照病毒后mini-HBV DNA检测结果。Control（w），共注射对照病毒后完整HBV DNA检测结果。mini（m），共注射rAAV-1.3mini-HBV病毒后mini-HBV DNA检测结果。Mini（w），共注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒后完整HBVDNA检测结果。diRNA（m），共注射rAAV-1.3mini-HBV-diRNA病毒后mini-HBV DNA检测结果。diRNA（w），共注射rAAV-1.3mini-HBV-diRNA病毒后完整HBV DNA检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一系列改造后的HBV基因组及其对应的组合物，包含组合物的设计、小量制备及功能验证，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。其中，如无特殊说明，实施例中涉及的各种反应试剂均可以通过商业渠道购买得到。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1 质粒载体构建
为了包装获得本专利发明过程需要用到的AAV病毒，需要构建一系列AAV质粒载体。这些AAV质粒载体可分为三类，第一类为对照病毒包装需要的质粒载体pAAV2-EGFP；第二类为携带改造HBV基因组的AAV质粒载体；第三类为携带1.3个拷贝HBV基因组的AAV质粒载体。所有的AAV质粒载体构建均以本公司构建保存的pAAV2neo载体为基础，pAAV2neo的结构如图1所示。
（1）对照病毒包装需要的质粒载体pAAV2-EGFP构建
以pCMV-C-EGFP（碧云天生物技术有限公司，中国）为模板，设计引物EGFP-F/EGFP-R，PCR扩增EGFP基因编码区序列，EGFP-F和EGFP-R引物中分别含有KpnI和EcoRI酶切位点。扩增得到EGFP编码区序列片段，用EcoRI和KpnI双酶切消化后回收备用。用EcoRI和KpnI分别双酶切消化pAAV2neo载体，回收线性化的pAAV2neo载体片段（约6.9kb）。将两个回收片段连接后转化E.coli JM109感受态细胞（宝生物，大连），筛选、鉴定后得到含有EGFP基因表达框的AAV质粒载体pAAV2-EGFP（见附图2）。
EGFP-F: 5’-ataggtaccgccaccatggtgagcaag-3’ (SEQ ID NO.1)
EGFP-R: 5’-gcggaattcttacttgtacagctcgtc-3’ (SEQ ID No.2)
（2）携带改造HBV基因组的AAV质粒载体
以GenBank数据库中报道的基因型D的HBV基因组（Gene ID KX470733.1）为基础，参考文献（Patel N, et al. Nat Microbiol. 2017; 2: 17098.）分析找出该HBV基因组中的3个PS位点序列。所谓的PS位点指的是HBV病毒颗粒形成过程中，病毒外壳蛋白优先结合识别的前体基因组RNA中特征序列，为“preferred site”的简写。删除不含有PS位点的HBsAg（L、M和S）启动子及编码序列。同时对HBcAg和HBeAg蛋白编码区进行突变，将“5’-ACCATG-3’”突变为“5’-TG-3’”。对Polymerase和X protein的终止密码子做删除突变，将“5’-ACCGTGA-3’”突变为“5’-ACC-3’”。同时考虑到后续克隆的方便，进一步对序列进行了点突变，删除了序列中存在的BglII、BamHI和XhoI酶切位点，得到1个拷贝的改造HBV基因组，命名为mini-HBV。序列信息见SEQ ID NO.3。在此基础上，进一步设计了1.1个拷贝、1.2个拷贝和1.3个拷贝的mini-HBV基因组序列，序列5’端引入XhoI酶切位点、3’端引入BglII和BamHI酶切位点，分别命名为1.1mini-HBV、1.2mini-HBV和1.3mini-HBV。1.1mini-HBV的序列信息见SEQ ID NO.4。1.2mini-HBV的序列信息见SEQ ID NO.5。1.3mini-HBV的序列信息见SEQ ID NO.6。
将设计完成的1.1mini-HBV、1.2mini-HBV和1.3mini-HBV序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成序列克隆入pUC57-1.8K载体，得到pUC57-1.8K-1.1mini-HBV、pUC57-1.8K-1.2mini-HBV和pUC57-1.8K-1.3mini-HBV等三个载体。
用XhoI和BglII双酶切消化pUC57-1.8K-1.1mini-HBV载体，产生1.8kb和2.2kb两个片段，回收长度为2.2kb片段。用XhoI和BamHI双酶切消化pAAV2neo载体，得到1.0kb和6.0kb两个片段，回收长度为6.0kb片段。将两个回收片段连接后，得到pAAV2-1.1mini-HBV载体，载体结构如图3所示。
用XhoI和BglII双酶切消化pUC57-1.8K-1.2mini-HBV载体，产生1.8kb和2.4kb两个片段，回收长度为2.4kb片段。用XhoI和BamHI双酶切消化pAAV2neo载体，得到1.0kb和6.0kb两个片段，回收长度为6.0kb片段。将两个回收片段连接后，得到pAAV2-1.2mini-HBV载体，载体结构如图4所示。
用XhoI和BglII双酶切消化pUC57-1.8K-1.3mini-HBV载体，产生1.8kb和2.6kb两个片段，回收长度为2.6kb片段。用XhoI和BamHI双酶切消化pAAV2neo载体，得到1.0kb和6.0kb两个片段，回收长度为6.0kb片段。将两个回收片段连接后，得到pAAV2-1.3mini-HBV载体，载体结构如图5所示。
参考文献（Nature biotechnology. 2005; 23(8): 1002-1007.），选取两条HBV基因组间高度保守序列作为siRNA作用的靶序列。两条靶序列的序列信息如下：
靶序列1: 5’-ggacttctctcaattttct-3’
靶序列2: 5’-gcacttcgcttcacctctg-3’。
两条靶序列的完全互补配对序列即为表达产生的siRNA分子序列。采用两种不同的策略来表达产生siRNA分子。其中靶序列1的siRNA分子采用内含子中插入shRNA序列的策略表达，靶序列2的siRNA分子采用RNA polymerase II启动子调控的miRNA表达策略表达。
参考文献（Biochemical and Biophysical Research Communications. 2003;310: 754-760. Gene. 2005; 356: 32-38.），设计针对靶序列1的siRNA分子基于内含子的shRNA表达序列，序列信息如SEQ ID NO.7。
参考文献（Methods Enzymol. 2005; 392: 371-380.），基于pre-miR-30骨架设计针对靶序列2的siRNA分子表达序列。序列信息如SEQ ID NO.8所示。利用HBV X蛋白启动子调控针对靶序列2的siRNA分子的转录表达。
将SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8同时插入1.1mini-HBV序列中，得到包含2个siRNA表达结构的1.1个拷贝改造后HBV基因组，命名为1.1mini-HBV-diRNA，序列信息见SEQ IDNO.9。把SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8同时插入1.2mini-HBV序列中，获得包含2个siRNA表达结构的1.2个拷贝改造后HBV基因组，命名为1.2mini-HBV-diRNA，序列信息见SEQ IDNO.10。SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8同时引入1.3mini-HBV序列中，得到包含2个siRNA表达结构的1.3个拷贝改造后HBV基因组，命名为1.3mini-HBV-diRNA，序列信息见SEQ IDNO.11。
将设计完成的1.1mini-HBV-diRNA、1.2mini-HBV-diRNA和1.3mini-HBV-diRNA序列发送南京金斯瑞生物科技有限公司合成。合成序列克隆入pUC57-1.8K载体，得到pUC57-1.8K-1.1mini-HBV-diRNA、pUC57-1.8K-1.2mini-HBV-diRNA和pUC57-1.8K-1.3mini-HBV-diRNA等三个载体。
用XhoI和BglII双酶切消化pUC57-1.8K-1.1mini-HBV-diRNA载体，产生1.8kb和2.4kb两个片段，回收长度为2.4kb片段。用XhoI和BamHI双酶切消化pAAV2neo载体，得到1.0kb和6.0kb两个片段，回收长度为6.0kb片段。将两个回收片段连接后，得到pAAV2-1.1mini-HBV-diRNA载体，载体结构如图6所示。
用XhoI和BglII双酶切消化pUC57-1.8K-1.2mini-HBV-diRNA载体，产生1.8kb和2.6kb两个片段，回收长度为2.6kb片段。用XhoI和BamHI双酶切消化pAAV2neo载体，得到1.0kb和6.0kb两个片段，回收长度为6.0kb片段。将两个回收片段连接后，得到pAAV2-1.2mini-HBV-diRNA载体，载体结构如图7所示。
用XhoI和BglII双酶切消化pUC57-1.8K-1.3mini-HBV-diRNA载体，产生1.8kb和2.8kb两个片段，回收长度为2.8kb片段。用XhoI和BamHI双酶切消化pAAV2neo载体，得到1.0kb和6.0kb两个片段，回收长度为6.0kb片段。将两个回收片段连接后，得到pAAV2-1.3mini-HBV-diRNA载体，载体结构如图8所示。
（3）携带1.3个拷贝HBV基因组的AAV质粒载体的构建
在GenBank中查找HBV基因型A、B、C、D、E、F、G和H的病毒基因组信息，每个基因型各选择一株病毒。每种HBV基因型选择的基因组信息对应的GenBank ID分别为，基因型A（AY161142）、基因型B（U87747）、基因型C（KX449554.1）、基因型D（KX470733.1）、基因型E（X75657）、基因型F（X75658）、基因型G（AF241409）、基因型H（AB059659）。然后，根据参考文献（J Virol. 1995; 69(10): 6158-6169.）的原则，设计1.3个拷贝的HBV基因组。在1.3个拷贝HBV基因组的5’端引入MluI酶切位点，3’端设计SalI酶切位点。8种HBV基因型对应的1.3个拷贝基因组分别命名为1.3HBV-A、1.3HBV-B、1.3HBV-C、1.3HBV-D、1.3HBV-E、1.3HBV-F、1.3HBV-G、1.3HBV-H。序列信息对应关系为1.3HBV-A（SEQ ID NO.12）、1.3HBV-B(SEQ IDNO.13)、1.3HBV-C(SEQ ID NO.14)、1.3HBV-D(SEQ ID NO.15)、1.3HBV-E(SEQ ID NO.16)、1.3HBV-F(SEQ ID NO.17)、1.3HBV-G(SEQ ID NO.18)和1.3HBV-H(SEQ ID NO.19)。
1.3HBV-A、1.3HBV-B、1.3HBV-C、1.3HBV-D、1.3HBV-E、1.3HBV-F、1.3HBV-G和1.3HBV-H由金斯瑞生物技术有限公司（南京，中国）合成，克隆入pUC57-1.8K载体，得到pUC57-1.8K-1.3HBV-A、pUC57-1.8K-1.3HBV-B、pUC57-1.8K-1.3HBV-C、pUC57-1.8K-1.3HBV-D、pUC57-1.8K-1.3HBV-E、pUC57-1.8K-1.3HBV-F、pUC57-1.8K-1.3HBV-G和pUC57-1.8K-1.3HBV-H。
为了构建携带1.3个拷贝的HBV基因组的AAV载体，我们进一步对pAAV2neo质粒进行了改造。设计合成Oligo-1和Oligo-2两条序列，Oligo-1和Oligo-2退火后形成接头，替换pAAV2neo中XhoI和BamHI之间序列，即得到pAAV2-MS载体，载体结构如图9所示。pAAV2-MS载体中含有MluI和SalI酶切位点，方便人工合成1.3个拷贝HBV基因组的插入。
Oligo-1: 5’-tcgagacgcgtgtcgacg-3’ (SEQ ID NO.20)
Oligo-2: 5’-gatccgtcgacacgcgtc-3’ (SEQ ID NO.21)
用SalI和MluI消化pAAV2-MS载体，得到长度为5293bp的线性化载体，回收备用。用SalI和MluI消化pUC57-1.8K-1.3HBV-A载体，产生1.8kb和4.1kb两个片段，回收长度为4.1kb片段备用。将两个回收片段连接后，得到pAAV2-1.3HBV-A载体，结构如图10所示。按照相同的构建策略，分别构建得到其他7种HBV基因型的1.3个拷贝基因组载体，分别为pAAV2-1.3HBV-B、pAAV2-1.3HBV-C、pAAV2-1.3HBV-D、pAAV2-1.3HBV-E、pAAV2-1.3HBV-F、pAAV2-1.3HBV-G和pAAV2-1.3HBV-H，结构如图11至图17所示。
实施例2 重组AAV病毒制备及检定
参照文献(Xiao X, et al. J Virol. 1998;72(3):2224-2232.)，应用三质粒包装系统包装AAV病毒和氯化铯密度梯度离心分离纯化包装得到重组AAV病毒。简要地，AAV载体质粒（指本发明中名称含有“pAAV2”字样的质粒）、辅助质粒（pHelper）和AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒（指本发明中名称含有“pAAV-R”字样的质粒）按照1:1:1的摩尔比混匀后，采用磷酸钙方法转染HEK293细胞，转染48h后，收获细胞和培养上清，应用氯化铯密度梯度离心法分离纯化重组AAV病毒。包装纯化得到30种重组病毒。具体信息如图18所示。
采用定量PCR方法测定制备得到AAV病毒的基因组滴度。定量PCR检测过程应用TaqMan探针法。包装得到重组AAV病毒用AAV载体通用性定量PCR检测引物和探针测定基因组滴度。定量PCR检测引物探针序列见文献（Aurnhammer C, et al. Hum Gene TherMethods. 2012; 23(1): 18-28.）。具体的序列信息如下，
ITR-F: 5’-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3’ (SEQ ID NO.22)
ITR-R: 5’-CGGCCTCAGTGAGCGA-3’ (SEQ ID NO.23)
ITR-P: 5’-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-3’ (SEQ ID NO.24)
其中ITR-F和ITR-R为引物，ITR-P为探针。探针5’端用FAM荧光蛋白标记，3’端连接BlackBerry quencher。引物和探针由Thermofisher Scientific合成。以ITR-F和ITR-R为引物特异性地扩增包装病毒ITR中长度为62bp片段，采用TaqMan探针结合法，以1μg/μl的pAAV2-EGFP质粒及其10倍梯度稀释的样品为标准品，应用Premix Ex Taq (Probe qPCR)试剂（Takara，大连，中国），使用荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI）检测病毒基因组滴度。操作过程参见Premix Ex Taq (Probe qPCR)试剂说明书。病毒的处理方法参见文献（Aurnhammer C, et al. Hum Gene Ther Methods. 2012; 23(1): 18-28.）。
实施例3 mini-HBV对8种基因型HBV的体内外竞争性包装抑制实验
为了验证设计改造的HBV基因组（mini-HBV）对HBV的体内外竞争性包装抑制作用，我们首先将携带1.3个拷贝mini-HBV的AAV病毒和含有1.3个拷贝HBV基因组的AAV病毒分别单独感染Huh7细胞或者尾静脉注射至C57BL/6小鼠体内，检测HBV DNA和HBsAg的表达水平。然后将携带1.3个拷贝mini-HBV的AAV病毒或携带EGFP报告基因表达框的AAV对照病毒和含有1.3个拷贝HBV基因组的AAV病毒共同转导Huh7细胞或者尾静脉注射至C57BL/6小鼠体内，检测HBV DNA和HBsAg的表达水平。
（1）体外竞争性包装抑制实验
将rAAVDJ-EGFP、rAAVDJ-1.3mini-HBV、rAAVDJ-1.3HBV-A至rAAVDJ-1.3HBV-H分别以10000vg/cell的剂量感染Huh7细胞。病毒感染细胞48h后，收集细胞上清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。检测结果如图19所示。从图19的结果可知，rAAVDJ-1.3HBV-A至rAAVDJ-1.3HBV-H感染Huh7细胞后都能够有效地表达产生HBV HBsAg，表明本发明中设计的8种不同基因型的1.3HBV基因表达框都具有功能。而rAAVDJ-EGFP和rAAVDJ-1.3mini-HBV感染Huh7细胞后均未检测到HBV HBsAg。这是因为rAAVDJ-EGFP病毒不含有HBV表达序列不会表达产生HBV HBsAg。虽然rAAVDJ-1.3mini-HBV含有HBV表达序列，但经过突变设计后，表达框不完整，故也不能表达产生HBV HBsAg。
进一步，我们采用定量PCR方法测定细胞培养上清中HBV DNA的含量，检测试剂为Premix Ex Taq (Probe qPCR)试剂（Takara，大连，中国），使用仪器为荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI），检测引物和探针如图20所示，检测结果见图21。从图21的结果可知，rAAVDJ-1.3HBV-A至rAAVDJ-1.3HBV-H感染Huh7细胞后都能够有效地表达产生HBV DNA，表明8种不同基因型的1.3HBV基因表达框都具有功能。而rAAVDJ-EGFP感染Huh7细胞后未检测到HBV DNA表达，其原因是rAAVDJ-EGFP病毒不含有HBV表达序列不会表达产生HBV DNA。rAAVDJ-1.3mini-HBV感染Huh7细胞后也未检测到HBV DNA表达，其原因是mini-HBV无法表达产生病毒包装所需要的各种蛋白，故无病毒颗粒分离至细胞培养上清中。
在此基础上，将rAAVDJ-1.3HBV-A至rAAVDJ-1.3HBV-H中一种病毒和rAAVDJ-EGFP或rAAVDJ-1.3mini-HBV分别以10000vg/cell的剂量共感染Huh7细胞。病毒共感染细胞48h后，收集细胞上清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。检测结果如图22所示。从图22的结果可知，相比于rAAVDJ-EGFP和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAVDJ病毒（如rAAVDJ-1.3HBV-A）共感染Huh7细胞的培养上清，rAAVDJ-1.3mini-HBV和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAVDJ病毒（如rAAVDJ-1.3HBV-A）共感染Huh7细胞的培养上清中HBV HBsAg的表达水平未见明显差异。
接下来，我们用定量PCR方法检测了共感染细胞培养上清中野生型HBV DNA和改造后mini-HBV DNA的含量。所谓的野生型HBV DNA指的是不同基因型的HBV基因组，定量PCR检测时用针对对应HBV基因型的探针和引物（见图20）。改造后的mini-HBV是指人为改造设计的HBV基因组，定量PCR检测时选择针对mini-HBV基因组的引物和探针（见图20）。检测结果见图23。从图23的结果可知，rAAVDJ-EGFP和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAVDJ病毒（如rAAVDJ-1.3HBV-A）共感染Huh7细胞的培养上清中HBV基因组拷贝数明显高于rAAVDJ-1.3mini-HBV和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAVDJ病毒，提示rAAVDJ-1.3mini-HBV能够竞争性地抑制HBV病毒在Huh7细胞内的复制和包装。对于改造后的mini-HBV基因组，rAAVDJ-EGFP共感染Huh7细胞上清中未检测到mini-HBV基因组，而rAAVDJ-1.3mini-HBV共感染细胞上清中却检测到mini-HBV基因组DNA，说明rAAVDJ-1.3mini-HBV能够有效地表达产生mini-HBV基因组，且表达产生的mini-HBV DNA能够被包装进入HBV病毒颗粒，分泌至细胞培养上清中。
总之，上述体外实验结果表明，rAAVDJ-1.3mini-HBV能够表达产生mini-HBV DNA，包装进入HBV病毒颗粒中，分泌至细胞培养上清中。表达产生的mini-HBV DNA能够竞争性抑制HBV DNA基因组的包装，降低HBV DNA被包装入HBV病毒颗粒然后分泌至细胞培养上清中的概率，从而抑制HBV病毒的扩散。
（2）体内竞争性包装抑制实验
将rAAV8-EGFP、rAAV8-1.3mini-HBV、rAAV8-1.3HBV-A至rAAV8-1.3HBV-H分别经尾静脉注射至C57BL/6小鼠体内，每种病毒的注射剂量为1×1011vg/只，每种病毒注射5只小鼠。注射病毒4w后，小鼠尾静脉采血，分离血清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。检测结果如图24所示。从图24的结果可知，rAAV8-1.3HBV-A至rAAV8-1.3HBV-H注射小鼠体内后都能够有效地表达产生HBV HBsAg，表明在体内本发明中设计的8种不同基因型的1.3HBV基因表达框都具有功能。而rAAV8-EGFP和rAAV8-1.3mini-HBV注射小鼠体内后均未检测到HBV HBsAg。这是因为rAAV8-EGFP病毒不含有HBV表达序列不会表达产生HBVHBsAg。虽然rAAV8-1.3mini-HBV含有HBV表达序列，但经过突变设计后，表达框不完整，故也不能表达产生HBV HBsAg。
接下来，我们采用定量PCR方法测定小鼠血清中HBV DNA的含量，检测试剂为Premix Ex Taq (Probe qPCR)试剂（Takara，大连，中国），使用仪器为荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500 fast，ABI），检测引物和探针如图20所示，检测结果见图25。从图25的结果可知，rAAV8-1.3HBV-A至rAAV8-1.3HBV-H注射小鼠后均在小鼠血清中检测到HBV DNA，表明在体内8种不同基因型的1.3HBV基因表达框都具有功能。而rAAV8-EGFP注射小鼠后未在血清中检测到HBV DNA，其原因是rAAV8-EGFP病毒不含有HBV表达序列不会表达产生HBV DNA。rAAV8-1.3mini-HBV注射小鼠体内后也未在血清中检测到HBV DNA表达，其原因是mini-HBV无法表达产生病毒包装所需要的各种蛋白，故无病毒颗粒分离至细胞培养上清中。
在此基础上，将rAAV8-1.3HBV-A至rAAV8-1.3HBV-H中一种病毒和rAAV8-EGFP或rAAV8-1.3mini-HBV经尾静脉共注射至C57BL/6小鼠体内后，注射剂量为每种病毒1×1011vg/只，每种病毒组合注射5只小鼠。注射病毒4w后，小鼠尾静脉采血，分离血清，用HBVHBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。检测结果如图26所示。从图26的结果可知，相比于rAAV8-EGFP和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAV8病毒（如rAAV8-1.3HBV-A）共注射的小鼠血清，对应的rAAV8-1.3mini-HBV和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAV8病毒（如rAAV8-1.3HBV-A）共注射小鼠血清中HBV HBsAg的表达水平未见明显差异。
接下来，我们用定量PCR方法检测了共注射病毒小鼠血清中野生型HBV DNA和改造后mini-HBV DNA的含量。所谓的野生型HBV DNA指的是不同基因型的HBV基因组，定量PCR检测时用针对对应HBV基因型的探针和引物。改造后的mini-HBV是指人为改造设计的HBV基因组，定量PCR检测时选择针对mini-HBV基因组的引物和探针。检测结果见图27。从图27的结果可知，rAAV8-EGFP和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAV8病毒（如rAAV8-1.3HBV-A）共注射C57BL/6小鼠血清中HBV基因组拷贝数明显高于对应的rAAV8-1.3mini-HBV和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAV8病毒共注射小鼠，提示rAAV8-1.3mini-HBV能够竞争性地抑制HBV病毒在小鼠体内的复制和包装。rAAV8-EGFP共注射小鼠血清中未检测到mini-HBV基因组，而rAAV8-1.3mini-HBV共注射小鼠血清中却检测到mini-HBV基因组DNA，说明rAAV8-1.3mini-HBV能够有效地表达产生mini-HBV基因组，且表达产生的mini-HBV DNA能够被包装进入HBV病毒颗粒，分泌至血液中。
总之，上述体内实验结果表明，rAAV8-1.3mini-HBV能够表达产生mini-HBV DNA，包装进入HBV病毒颗粒中，分泌至血液中。表达产生的mini-HBV DNA能够竞争性抑制HBVDNA基因组的包装，降低HBV DNA被包装入HBV病毒颗粒后分泌至血液中的概率，从而抑制HBV病毒的扩散。
实施例4 不同拷贝数大小的mini-HBV基因组对HBV基因组的竞争性包装实验
将rAAV8-EGFP或携带不同拷贝数大小的改造后的mini-HBV基因组AAV8病毒（rAAV8-1.1mini-HBV、rAAV8-1.2mini-HBV和rAAV8-1.3mini-HBV）同rAAV8-1.3HBV-D病毒经尾静脉注射至C57BL/6小鼠体内，每种病毒的注射剂量为1×1011vg/只，每种病毒组合注射5只小鼠。注射病毒4w后，小鼠尾静脉采血，分离血清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。检测结果如图28所示。从图28的结果可知，相比于rAAV8-EGFP和rAAV8-1.3HBV-D共注射的小鼠血清，携带不同拷贝数的mini-HBV的AAV8病毒和rAAV8-1.3HBV-D共注射小鼠血清中HBV HBsAg的表达水平未见明显差异，且不同拷贝数的mini-HBV间也未见明显差异。
接下来，我们用定量PCR方法检测了共注射病毒小鼠血清中野生型HBV DNA和改造后mini-HBV DNA的含量。所谓的野生型HBV DNA指的是不同基因型的HBV基因组，定量PCR检测时用针对对应HBV基因型的探针和引物。改造后的mini-HBV是指人为改造设计的HBV基因组，定量PCR检测时选择针对mini-HBV基因组的引物和探针。检测结果见图29。从图29的结果可知，rAAV8-EGFP和rAAV8-1.3HBV-D共注射C57BL/6小鼠血清中HBV基因组拷贝数明显高于对应的rAAV8-1.3HBV-D和携带不同拷贝数的mini-HBV基因组的AAV8病毒共注射小鼠，且携带不同拷贝数的mini-HBV基因组的AAV8病毒间未见明显差异，提示mini-HBV基因拷贝数在1.1个至1.3个之间均能够竞争性地抑制HBV病毒在小鼠体内的复制和包装。rAAV8-EGFP共注射小鼠血清中未检测到mini-HBV基因组，而携带不同拷贝数的mini-HBV基因组的AAV8病毒共注射小鼠血清中却检测到mini-HBV基因组DNA，且三者之间未见明显差异，说明不同拷贝数的mini-HBV能够有效地表达产生mini-HBV基因组，且表达产生的mini-HBV DNA能够被包装进入HBV病毒颗粒，分泌至血液中。
总之，上述结果表明，不同拷贝数的mini-HBV都能够有效地表达产生mini-HBVDNA，包装进入HBV病毒颗粒中，分泌至血液中。表达产生的mini HBV DNA能够竞争性抑制HBV DNA基因组的包装，降低HBV DNA被包装入HBV病毒颗粒后分泌至血液中的概率，从而抑制HBV病毒的扩散。说明mini-HBV的基因组拷贝数在1.1个至1.3个之间均可有效地发挥作用。
实施例5 表达HBV siRNA的mini-HBV（mini-diRNA-HBV）对不同基因型HBV病毒的抑制作用
将rAAV8-1.3HBV-A至rAAV8-1.3HBV-H中一种病毒和rAAV8-EGFP或rAAV8-1.3mini-HBV或rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA经尾静脉共注射至C57BL/6小鼠体内后，注射剂量为每种病毒1×1011vg/只，每种病毒组合注射5只小鼠。注射病毒4w后，小鼠尾静脉采血，分离血清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。检测结果如图30所示。从图30的结果可知，相比于rAAV8-EGFP和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAV8病毒（如rAAV8-1.3HBV-A）共注射的小鼠血清，对应的rAAV8-1.3mini-HBV和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAV8病毒（如rAAV8-1.3HBV-A）共注射小鼠血清中HBV HBsAg的表达水平未见明显差异，而对应的rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAV8病毒（如rAAV8-1.3HBV-A）共注射小鼠血清中HBV HBsAg的表达水平显著降低，几乎检测不到。
接下来，我们用定量PCR方法检测了共注射病毒小鼠血清中野生型HBV DNA和改造后mini-HBV DNA的含量。所谓的野生型HBV DNA指的是不同基因型的HBV基因组，定量PCR检测时用针对对应HBV基因型的探针和引物。改造后的mini-HBV或mini-HBV-diRNA是指人为改造设计的HBV基因组，两种改造后的HBV基因组采用相同的定量PCR检测引物和探针。检测结果见图31。从图31的结果可知，rAAV8-EGFP和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAV8病毒（如rAAV8-1.3HBV-A）共注射C57BL/6小鼠血清中HBV基因组拷贝数明显高于对应的rAAV8-1.3mini-HBV和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAV8病毒共注射小鼠以及rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAV8病毒共注射小鼠，而且rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA和携带1.3个拷贝HBV基因组的AAV8病毒共注射小鼠血清中HBV基因组拷贝数最低，提示rAAV8-1.3mini-HBV和rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA都能够竞争性地抑制HBV病毒在小鼠体内的复制和包装，且rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA的抑制作用效果强于rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA。rAAV8-EGFP共注射小鼠血清中未检测到mini-HBV基因组，而rAAV8-1.3mini-HBV或rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA共注射小鼠血清中却检测到mini-HBV或mini-HBV-diRNA基因组DNA，说明rAAV8-1.3mini-HBV或rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA能够有效地表达产生mini-HBV或mini-HBV-diRNA基因组，且表达产生的mini-HBV DNA或mini-HBV-diRNA DNA能够被包装进入HBV病毒颗粒，分泌至血液中。
总之，上述体内实验结果表明，rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA能够表达产生mini-HBV-diRNA DNA，包装进入HBV病毒颗粒中，分泌至血液中。表达产生的mini-HBV-diRNA DNA能够竞争性抑制HBV DNA基因组的包装，降低HBV DNA被包装入HBV病毒颗粒后分泌至血液中的概率。而且rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA还可表达产生两种HBV siRNA，HBV siRNA能够抑制HBV基因的表达如HBsAg，显著降低病毒颗粒的组装，从而体现出比rAAV8-1.3mini-HBV更好的对HBV的抑制效果。
实施例6 不同拷贝数大小的mini-diRNA-HBV对HBV病毒的抑制作用
以rAAV8-EGFP为阴性对照，携带不同拷贝数大小的mini-HBV基因组为阳性对照，将携带不同拷贝数大小的改造后的mini-HBV-diRNA基因组AAV8病毒（rAAV8-1.1mini-HBV-diRNA、rAAV8-1.2mini-HBV-diRNA和rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA）同rAAV8-1.3HBV-D病毒经尾静脉共注射至C57BL/6小鼠体内，每种病毒的注射剂量为1×1011vg/只，每种病毒组合注射5只小鼠。注射病毒4w后，小鼠尾静脉采血，分离血清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。检测结果如图32所示。从图32的结果可知，相比于rAAV8-EGFP和rAAV8-1.3HBV-D共注射的小鼠血清，携带不同拷贝数大小的mini-HBV的AAV8病毒和rAAV8-1.3HBV-D共注射小鼠血清中HBV HBsAg的表达水平未见明显差异，且不同拷贝数大小的mini-HBV间也未见明显差异。相反，携带不同拷贝数大小的mini-HBV-diRNA的AAV8病毒和rAAV8-1.3HBV-D共注射小鼠血清中HBV HBsAg的表达水平显著下降，但不同拷贝数大小的mini-HBV-diRNA之间未见明显差异。
接下来，我们用定量PCR方法检测了共注射病毒小鼠血清中野生型HBV DNA和改造后mini-HBV DNA或mini-HBV-diRNA DNA的含量。所谓的野生型HBV DNA指的是不同基因型D的HBV基因组，定量PCR检测时用针对对应HBV基因型D的探针和引物。改造后的mini-HBV和mini-HBV-diRNA是指人为改造设计的HBV基因组，两者在定量PCR时使用相同的引物和探针。检测结果见图33。从图33的结果可知，注射阴性对照病毒rAAV8-EGFP的小鼠血清中的HBV基因组拷贝数明显高于注射阳性对照病毒组小鼠和注射实验病毒组小鼠。而且实验病毒小鼠血清中HBV基因组拷贝数低于注射阳性对照病毒组，说明实验病毒组对HBV的抑制效果好于阳性病毒对照组。但注射不同拷贝数大小的实验病毒小鼠间，HBV基因组拷贝数未见明显差异，提示mini-HBV-diRNA基因拷贝数在1.1个至1.3个之间均能够竞争性地抑制HBV病毒在小鼠体内的复制和包装。rAAV8-EGFP共注射小鼠血清中未检测到mini-HBV基因组，而携带不同拷贝数的mini-HBV基因组的AAV8病毒共注射小鼠血清中却检测到mini-HBV基因组DNA，且三者之间未见明显差异，说明不同拷贝数的mini-HBV能够有效地表达产生mini-HBV基因组，且表达产生的mini-HBV DNA能够被包装进入HBV病毒颗粒，分泌至血液中。
总之，上述结果表明，不同拷贝数的mini-HBV-diRNA都能够有效地表达产生mini-HBV-diRNA DNA，包装进入HBV病毒颗粒中，分泌至血液中。表达产生的mini-HBV-diRNA DNA能够竞争性抑制HBV DNA基因组的包装，降低HBV DNA被包装入HBV病毒颗粒后分泌至血液中的概率，从而抑制HBV病毒的扩散。而且多拷贝的mini-HBV-diRNA DNA表达产生的HBVsiRNA还能够抑制HBV病毒蛋白的表达，进一步阻断HBV生活周期，产生更好的HBV抑制效果。实验结果还表明不同拷贝数大小的mini-HBV-diRNA DNA对HBV病毒的抑制效果未见明显差异，说明mini-HBV-diRNA的基因组拷贝数在1.1个至1.3个之间均可有效地发挥作用。
实施例7 不同MOI感染HepG2.2.15细胞对其产生子代HBV病毒的抑制作用
将rAAVDJ-EGFP或rAAVDJ-1.3mini-HBV或rAAVDJ-1.3mini-HBV-diRNA分别感染HepG2.2.15细胞。每种病毒的感染剂量设置四个梯度，分别为100vg/cell、1000vg/cell、10000vg/cell和100000vg/cell。病毒感染细胞48h后，收集细胞上清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。检测结果如图34所示。从图34的结果可知，相比于rAAVDJ-EGFP感染HepG2.2.15细胞的培养上清，对应感染剂量的rAAVDJ-1.3mini-HBV感染HepG2.2.15细胞的培养上清中HBV HBsAg的表达水平未见明显差异，且4个不同的感染剂量之间的HBV HBsAg表达水平也未见明显差异。相反，rAAVDJ-1.3min-HBV-diRNA感染HepG2.2.15细胞后，细胞培养上清中HBV HBsAg的表达水平则低于rAAVDJ-EGFP感染HepG2.2.15细胞培养上清，且随着感染剂量的升高，HBsAg表达水平也逐渐降低，直至检测不到。
接下来，我们用定量PCR方法检测了病毒感染细胞培养上清中HBV DNA的含量。检测结果见图35。从图35的结果可知，rAAVDJ-EGFP感染HepG2.2.15细胞的培养上清中HBV基因组拷贝数明显高于rAAVDJ-1.3mini-HBV或rAAVDJ-1.3mini-HBV-diRNA感染HepG2.2.15细胞培养上清，且不同的感染剂量之间未见明显差异。相反，rAAVDJ-1.3mini-HBV和rAAVDJ-1.3mini-HBV-diRNA则随着感染剂量的增加，细胞培养上清中HBV DNA含量逐渐降低，rAAVDJ-1.3mini-HBV-diRNA的降低幅度高于rAAVDJ-1.3mini-HBV。
结果说明提高病毒感染剂量会增强其对HBV 的抑制效果，携带HBV siRNA表达单元的rAAVDJ-1.3mini-HBV-diRNA对HBV病毒的抑制效果强于rAAVDJ-1.3mini-HBV。
实施例8 不同剂量rAAV8-mini-HBV-diRNA对HBV模型小鼠体内HBV病毒的抑制作用
将rAAV8-EGFP或rAAV8-1.3mini-HBV或rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA分别同rAAV8-1.3HBV-D经尾静脉共注射C57BL/6小鼠。rAAV8-EGFP、rAAV8-1.3mini-HBV和rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA的注射剂量设置四个梯度，分别为1×109vg/只、1×1010vg/只、1×1011vg/只和1×1012vg/只，rAAV8-1.3HBV-D的注射剂量为1×1011vg/只。病毒共注射C57BL/6小鼠4w后，小鼠尾静脉采血，分离血清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。检测结果如图36所示。从图36的结果可知，在4个注射剂量下，注射rAAV8-EGFP病毒小鼠的HBV HBsAg表达水平未见明显差异，均较高。注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒的HBV HBsAg小鼠呈现出同注射rAAV8-EGFP病毒小鼠相似的规律，血清中HBV HBsAg表达水平较高，且不同的注射剂量之间未见明显差异。相反，注射rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA病毒小鼠血清中HBVHBsAg表达水平则随着注射剂量的增加而逐渐降低，直至检测不到。
接下来，我们用定量PCR方法检测了共注射病毒小鼠血清中野生型HBV DNA和改造后mini-HBV DNA或mini-HBV-diRNA DNA的含量。所谓的野生型HBV DNA指的是基因型D的HBV基因组，定量PCR检测时用针对对应HBV基因型D的探针和引物。改造后的mini-HBV和mini-HBV-diRNA是指人为改造设计的HBV基因组，两者在定量PCR时使用相同的引物和探针。检测结果见图37。从图37的结果可知，注射rAAV8-EGFP病毒的小鼠血清中的HBV基因组拷贝数明显高于注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒组小鼠和注射rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA病毒组小鼠。而且注射rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA病毒小鼠血清中HBV基因组拷贝数低于注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒组，说明rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA病毒组对HBV的抑制效果好于rAAV8-1.3mini-HBV病毒组。而且注射rAAV8-1.3mini-HBV或rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA病毒小鼠随着病毒注射剂量的增加，血清中HBV DNA拷贝数逐渐降低，直至检测不到。注射rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA病毒小鼠的HBV DNA抑制效果好于注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒小鼠。注射rAAV8-EGFP小鼠血清中未检测到mini-HBV DNA或mini-HBV-diRNA，因为rAAV8-EGFP病毒仅包含EGFP基因表达框，不会表达产生这两种分子。相反，注射rAAV8-1.3mini-HBV病毒小鼠血清中检测到mini-HBV DNA，含量随着注射剂量增加而增加。注射rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA病毒小鼠血清中检测到mini-HBV-DNA，含量随着注射剂量增加而减少，可能是因为rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA表达产生HBV siRNA量随注射剂量增加而增加，导致HBV相关蛋白的表达受到抑制，使新的HBV病毒颗粒无法产生，血清中HBV病毒颗粒减少，故检测到的mini-HBV-diRNA减少。
结果说明增加病毒注射剂量会增强其对HBV 的抑制效果，携带HBV siRNA表达单元的rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA对HBV病毒的抑制效果强于rAAV8-1.3mini-HBV。
实施例9 不同血清AAV对HBV病毒的抑制作用的影响
为了分析不同血清型AAV对HBV病毒抑制作用的影响，我们包装了AAV3B、AAV5和AAV8等三种不同的AAV血清型病毒。AAV病毒携带的基因为EGFP表达框、1.3mini-HBV或1.3mini-HBV-diRNA。总共得到rAAV3B-EGFP、rAAV3B-1.3mini-HBV、rAAV3B-1.3mini-HBV-diRNA、rAAV5-EGFP、rAAV5-1.3mini-HBV、rAAV5-1.3mini-HBV-diRNA、rAAV8-EGFP、rAAV8-1.3mini-HBV、rAAV8-1.3mini-HBV-diRNA等9种病毒。取9种病毒的一种病毒同rAAV8-1.3HBV-D病毒经尾静脉共注射至C57BL/6小鼠体内，得到9组不同的病毒组合注射小鼠。每种病毒的注射剂量为1×1011vg/只，每种病毒组合注射5只小鼠。注射病毒4w后，小鼠尾静脉采血，分离血清，用HBV HBsAg检测试剂盒（万泰生物）测定HBsAg含量。检测结果如图38所示。从图38的结果可知，小鼠血清中HBV HBsAg表达水平在三种AAV血清型之间呈现出相似的规律，即注射携带EGFP表达框的AAV病毒的HBV HBsAg表达水平和携带mini-HBV的AAV病毒的HBV HBsAg表达水平都较高，而且两者之间未见明显差异。相反，注射携带mini-HBV-diRNA的AAV病毒的小鼠血清中HBV HBsAg含量则较低，几乎检测不到，且不同的AAV血清型之间未见明显差异。
接下来，我们用定量PCR方法检测了共注射病毒小鼠血清中野生型HBV DNA和改造后mini-HBV DNA或mini-HBV-diRNA DNA的含量。所谓的野生型HBV DNA指的是不同基因型D的HBV基因组，定量PCR检测时用针对对应HBV基因型D的探针和引物。改造后的mini-HBV和mini-HBV-diRNA是指人为改造设计的HBV基因组，两者在定量PCR时使用相同的引物和探针。检测结果见图39。从图39的结果可知，3种AAV载体血清型呈现出相似的规律，即每种血清型注射EGFP对照病毒的小鼠血清中的HBV基因组拷贝数明显高于注射携带1.3mini-HBVDNA病毒小鼠和注射含有1.3mini-HBV-diRNA DNA病毒小鼠。而且注射含有1.3mini-HBV-diRNA DNA病毒小鼠血清中HBV基因组拷贝数低于注射携带1.3mini-HBV DNA病毒小鼠，说明携带1.3mini-HBV-diRNA DNA病毒的抑制效果好于含有1.3mini-HBV DNA病毒。mini-HBV和mini-HBV-diRNA的检测结果，三种AAV血清型也呈现出相似的规律。注射含有EGFP表达框病毒小鼠血清中未检测到mini-HBV DNA或mini-HBV-diRNA，因为这些病毒仅包含EGFP基因表达框，不会表达产生这两种分子。相反，注射携带1.3mini-HBV DNA病毒小鼠血清中检测到mini-HBV DNA，含量随着注射剂量增加而增加。注射含有1.3mini-HBV-diRNA DNA病毒小鼠血清中检测到mini-HBV-diRNA DNA，含量随着注射剂量增加而减少，可能是因为1.3mini-HBV-diRNA DNA表达产生HBV siRNA量随注射剂量增加而增加，导致HBV相关蛋白的表达受到抑制，使新的HBV病毒颗粒无法产生，血清中HBV病毒颗粒减少，故检测到的mini-HBV-diRNA减少。
总之，上述结果表明，AAV3B、AAV5和AAV8等三种不同的AAV血清型携带1.3mini-HBV DNA或1.3mini-HBV-diRNA DNA同rAAV8-1.3HBV-D共转导C57BL/6小鼠均能够有效地抑制HBV的生活周期，减少血清中的HBV DNA拷贝数。
序列表
<110> 北京五加和分子医学研究所有限公司
<120> 改造后的HBV基因组和相关组合物及其应用
<160> 54
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ataggtaccg ccaccatggt gagcaag 27
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcggaattct tacttgtaca gctcgtc 27
<210> 3
<211> 1871
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accctaacaa aacaaagaga tggggttact ctctgaattt tatgggttat gtcattggaa 60
gttatgggtc cttgccacaa gaacacatca tacaaaaaat caaagaatgt tttagaaaac 120
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aatctaagca ggctttcact ttctcgccaa cttacaaggc ctttctgtgt aaacaatacc 300
tgaaccttta ccccgttgcc cggcaacggc caggtctgtg ccaagtgttt gctgacgcaa 360
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<210> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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<400> 6
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<212> DNA
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<400> 9
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<210> 10
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctcgaggcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg ctgaatcctg cggacgaccc 60
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tctttgtact aggaggctgt aggcataaat tggtctgcgc accagctgca actttttcac 420
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tcgtttttgc cttctgactt ctttccttca gtacgatatc ttctagatac cgcctcagct 600
ctgtatcggg aagccttaga gtctcctgag cattgttcac ctcaccatac tgcactcagg 660
caagcaattc tttgctgggg ggaactaatg actctagcta cctgggtggg tgttaatttg 720
gaagatccag catctagaga cctagtagtc agttatgtca acactaatat gggcctaaag 780
ttcaggcaac tcttgtggtt tcacatttct tgtctcactt ttggaagaga aaccgttata 840
gagtatttgg tgtctttcgg agtgtggatt cgcactcctc cagcttatag accaccaaat 900
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<400> 13
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<210> 15
<211> 4121
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
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gtcctttgtt tacgtcccgt cggcgctgaa tccagcggac gaaccctccc ggggccgctt 3660
ggggctctac cgccctcttc tgcgtctgcc gttccagccg accacgggtc gcacctctct 3720
ttacgcggac tccccgtctg ttccttctca tctgccggtc cgtgtgcact tcgcttcacc 3780
tctgcacgtc gcatggagac caccgtgaac gccccctgga gtttgccaac agtcttacat 3840
aagaggacta ttggactttc aggacggtca atgacctgga tcgaagaata catcaaagac 3900
tgtgtattta aagactggga ggagctgggg gaggagatca ggttaaaggt ctttgtacta 3960
ggaggctgta ggcataaatt ggtctgcgca ccagcaccat gcaacttttt cacctctgcc 4020
taatcatctc ttgtttatgt cccactgttc aagcctccaa gctgtgcctt gggtggcttt 4080
ggggcatgga cattgaccct tataaagaat ttggagcttc tgtggaattg ttctcttttt 4140
tgccttctga cttctttccg tcaatccgtc gac 4173
<210> 18
<211> 4173
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acgcgtgtgg ttaccctgcg ttaatgcctt tgtatgcatg tatacaagct aaacaggctt 60
tcactttctc gccaacttac aaggcctttc tgtgtaaaca atatatgaac ctttaccccg 120
ttgcccggca acggcccggt ctatgccaag tgtttgctga cgcaaccccc actggctggg 180
gcttggccat aggccatcag cgcatgcgtg gaacctttgt ggctcctcta ccgatccata 240
ctgcggaact gctagctgcc tgttttgctc gcagcaggtc tggagcaaaa cttatcggga 300
ctgataattc tgtcgtcctt tcgcggaaat atacatcatt tccatggctg ctaggctgtg 360
ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtttacgt cccgtcggcg ctgaatcctg 420
cggacgaccc ctctcggggc cgcttgggga tctaccgtcc tcttcttcat ctgccgtacc 480
gaccgtccac ggggcgcacc tctctttacg cggtctcccc gtttgtgcct tctcatctgc 540
cggaccgtgt gcacttcgct tcacctctgc acgtcgcatg gagaccaccg tgaacgctca 600
cctgatcttg cccaaggtat tgcataagcg gactcttgga ctctcagcaa tgtcaacgac 660
cgaccttgag gcatacttca aagactgtgt gtttaaagac tgggaggagt tgggggagga 720
gattaggtta atgatctttg tactaggagg ctgtaggcat aaattggtct gttcaccaac 780
accatgcaac tttttcacct ctgcctaatc atctcatgtt catgtcctac tgttcaagcc 840
tccaaactgt gccttgggtg gctttggggc atggacattg acccttataa agaatttgga 900
gcttctgtgg agttactctc ttttttgcct tctgatttct ttccgtctat tcgggacctt 960
ctcgacaccg catcagctct gtatcgggag gccttagagt ctccggaaca ttgttcacct 1020
caccatacag cactcaggca agcagttttg tgttggggtg agttgatgac tctagctacc 1080
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gttaatatgg gcctaaaaat tagacaacta ttatggtttc acatttcctg tcttactttt 1200
ggaagagaaa ctgttcttga gtatttggtg tctttcggag tgtggattcg cactcctccc 1260
gcatacagac cgccaaatgc ccctatctta tcaacacttc cggaaactac tgttgttaga 1320
cgacgaggca ggtcccctag aagaagaact ccctcgcctc gcagacgaag atctcaatcg 1380
ccgcgtcgca gaagatctca atctcgggaa tcccaatgtt agtattcctt ggactcataa 1440
ggtgggaaac tttaccgggc tttattcttc tactgtacct gtctttaatc ctgagtggca 1500
aactccctct tttcctaaca ttcatttgca tgaggacatt atcaataggt gtcaacaatt 1560
tgtgggccct cttacagcta atgaaaaaag aagattgaac ttaatcatgc ctgctaggtt 1620
ctatcctaac cttactaagt atttgccctt agataaagga ataaaacctt attatcctga 1680
gcaggcagtt aatcattatt tcaaaactag gcattattta catactctgt ggaaatctgg 1740
cattctatat aagagagaaa caacacgcag cgcctcattt tgtgggtcac catattcttg 1800
ggaacaagag ctacagcatg ggaggttggt cttccaaacc tcggaaaggc atggggacga 1860
atctttctgt tcccaatcct ctgggatttc ttcccgatca tcagttggac cctgcattcg 1920
gagccaactc aaacaatcca gattgggact tcaaccccaa caaggaccat tggccacaag 1980
cccatcaggt aggagcggga gcattcgggc cagggttcac tcctcctcac ggaggtcttt 2040
tggggtggag ccctcaggct cagggcattt taacaaacgt gccagcagtt cctcctcctg 2100
cctccaccaa tcggcagtca ggaaggcagc caactcccat ctctccacct ctaagagaca 2160
gtcatcctca ggccatgcag tggaactcca caacattcca ccaagctctg caagatccca 2220
gaatcagggg cctgtatttt cctgctggtg gctccagttc aggaacagta aaccctgctc 2280
cgaatattgc ctctcacatc tcatcaatct tcacgaggat tggggaccct gcaacgaaca 2340
tggagaacat cacatcagga ttcctcggac ccctgctcgt gttacaggcg gggtttttct 2400
tgttgacaaa aatcctcaca ataccgcaga gtctagactm gtggtggact tctctcaatt 2460
ttctaggggg agcacccgtg tgtcttggcc aaaattcgca gtccccaacc tccaatcact 2520
caccaacctc ctgtcctcca atttgtcctg gctatcgctg gatgtgtctg cggcgtttta 2580
tcatcttcct cttcatcctg ctgctatgcc tcatcttctt gttggttctt ctggattatc 2640
aaggtatgtt gcccgtttgt cctctaattc caggatcctc gaccaccagt acgggaccat 2700
gcaaaacctg cacgactcct gctcaaggca actctatgta tccctcatgt tgctgtacca 2760
aaccttcgga cggaaattgc acctgtattc ccatcccatc atcttgggct ttcgcaaaat 2820
acctatggga gtgggcctca gcccgtttct cctggctcag tttactagtg ccatttgttc 2880
agtggttcgt agggctttcc cccactgtct ggctttcagt tatatggatg atgtggtatt 2940
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gtctttgggt atacatttaa accctaacaa aactaagaga tggggttatt ccttaaactt 3060
catgggatat gtaattggaa gttggggtac cttgccacaa gatcatatta tacagaaaat 3120
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gaaatataca tcatttccat ggctgctagg ctgtgctgcc aactggatcc tgcgcgggac 3600
gtcctttgtt tacgtcccgt cggcgctgaa tcctgcggac gacccctctc ggggccgctt 3660
ggggatctac cgtcctcttc ttcatctgcc gtaccgaccg tccacggggc gcacctctct 3720
ttacgcggtc tccccgtttg tgccttctca tctgccggac cgtgtgcact tcgcttcacc 3780
tctgcacgtc gcatggagac caccgtgaac gctcacctga tcttgcccaa ggtattgcat 3840
aagcggactc ttggactctc agcaatgtca acgaccgacc ttgaggcata cttcaaagac 3900
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ggggcatgga cattgaccct tataaagaat ttggagcttc tgtggagtta ctctcttttt 4140
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<210> 19
<211> 4173
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
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ttgctcggca acggccaggc ctttgccaag tgtttgctga cgcaaccccc actggctggg 180
gcttggcgat tggccatcag cgcatgcgcg gaacctttgt ggctcctctg ccgatccata 240
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ctgacaactc cgttgtcctt tctcggaagt acacctcctt cccatggctg ctaggctgtg 360
ctgccaactg gatcctgcgc gggacgtcct ttgtctacgt cccgtcggcg ctgaatcctg 420
cggacgaccc ctctcgtggt cgcttggggc tctaccgccc tcttctccgc ctgccgttcc 480
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tgtgtattta aggactggga ggagtcgggg gaggagttga ggttaaaggt ctttgtacta 3960
ggaggctgta ggcataaatt ggtctgttca ccagcaccat gcaacttttt cacctctgcc 4020
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcgagacgcg tgtcgacg 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gatccgtcga cacgcgtc 18
<210> 22
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
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<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cggcctcagt gagcga 16
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cactccctct ctgcgcgctc g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tacacgtagc gcctcattct 20
<210> 26
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tgaccaacct cccatgatgt 20
<210> 27
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cttgttccca agaatatggt gacccgc 27
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aacctacgga cggaaactgt 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
actgagccaa gagaaacgga 20
<210> 30
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cccatcgtct tgggctttcg ca 22
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
caggaatcgt gcaggtcttg 20
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tgcccgtttg tcctctactt 20
<210> 33
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acatcaacta ccagcacggg acca 24
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcctgtcctc caacttgtcc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
atgaggcata gcagcaggat 20
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
acgccgcaga cacatccagc g 21
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tccagtcact caccaacctc 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
atgaggcata gcagcaggat 20
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
acgccgcaga cacatccagc g 21
<210> 40
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
tcccgattgg gacttcaaca 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
cgtaacctcc cactcctacc 20
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
aggacacttg gccaatggca aacaa 25
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
caccaagctc tgcaagatcc 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tcggagcagg gtttactgtt 20
<210> 45
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cctgaactgg agccaccagc agg 23
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cctccaactt gtcctggcta 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
atgaggcata gcagcaggat 20
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
acgccgcaga cacatccaac g 21
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gtctgtgcct tctcatctgc 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
aagaccttgg gcaacattcg 20
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cgcatggaga ccaccacgcc c 21
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
taaacggcca caagttcagc 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gaacttcagg gtcagcttgc 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
tggcatcgcc ctcgccctcg 20

Claims (8)

1.经过一系列改造后的HBV基因组，其特征在于，其序列为SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11。
2.一种重组腺相关病毒载体，其特征在于携带如权利要求1所述的基因组的序列。
3.权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，包括：
（1）体内外转导可表达产生改造后的HBV基因组DNA；和/或
（2）体内外转导可表达产生靶向HBV的干扰RNA，抑制HBV蛋白的表达；和/或
（3）重组腺相关病毒载体血清型包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10。
4.根据权利要求2所述的重组腺相关病毒载体，其特征在于，重组腺相关病毒载体血清型为AAV3B、AAV5或AAV8。
5.一种基因治疗药物，其特征在于，包括如权利要求1所述的HBV基因组，或如权利要求2-4中任一项所述的重组腺相关病毒载体。
6.权利要求5所述的基因治疗药物，其特征在于，给药方式为静脉注射。
7.权利要求5所述的基因治疗药物，其特征在于，一次给药可有效阻断HBV的生活周期，从而达到治疗HBV感染引起疾病的目的。
8.权利要求7所述的基因治疗药物，其中HBV感染引起疾病为慢性乙肝。
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