JP4573437B2 - アデノ随伴ウイルス血清型１核酸配列、ベクターおよび同一物を含有する宿主細胞 - Google Patents
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Description
【０００１】
本研究は、国立保健研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の補助金Ｎｏ．Ｐ３０ ＤＫ４７７５７−０６およびＰＯ１ ＨＤ３２６４９−０４によって援助された。米国政府は、本発明におけるある種の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、ウイルスベクター、そしてより特別には、遺伝子送達のために有用な組み換えウイルスベクターに関する。
【０００３】
発明の背景
アデノ随伴ウイルスは、小さい一本鎖ＤＮＡウイルスであり、有効な複製を可能にするためにヘルパーウイルスを必要とする［Ｋ．Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐ．１００７−１０４１，ｉｎ Ｆ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．２，（Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）（１９９５）］。ＡＡＶの４．７ｋｂゲノムは、２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）、およびそれぞれＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードしている２つの読み枠を特徴とする。Ｒｅｐ読み枠は、分子量７８ｋＤ，６８ｋＤ，５２ｋＤおよび４０ｋＤの４種のタンパク質をコードしている。これらのタンパク質は、主として、ＡＡＶ複製および宿主細胞染色体へのＡＡＶの組み込みの調節において機能している。Ｃａｐ読み枠は、分子量８５ｋＤ（ＶＰ１），７２ｋＤ（ＶＰ２）および６１ｋＤ（ＶＰ３）の３種の構造タンパク質をコードしている［Ｂｅｒｎｓ、前出］。ＡＡＶビリオンにおける全タンパク質の８０％以上がＶＰ３である。２つのＩＴＲは、ＡＡＶ複製、パッケージングおよび組み込みのために必須のｃｉｓ要素のみである。ＡＡＶ ＩＴＲには「フリップ」および「フロップ」と呼ばれる２つのコンホメーションが存在する。コンホメーションにおけるこれらの違いは、ＩＴＲを使用して複製を開始および再開始するアデノ随伴ウイルスの複製モデルから生じる［Ｒ．Ｏ．Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：６０９６−６１０４（１９９３）；Ｋ．Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４：３１６−３２９（１９９０）］。
【０００４】
ＡＡＶは、霊長類、イヌ、鳥類およびヒトを含む、多くの動物種において発見された［Ｆ．Ａ．Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｓｉｘｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ”，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｖｉｅｎｎａ（１９９５）］。５種の既知霊長類ＡＡＶ（ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−５）に加えて、また、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２に密接に関連するその他の血清型が単離された［Ｅ．Ａ．Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：３０９−３１９（１９９８）］。すべての既知ＡＡＶ血清型の中で、ＡＡＶ−２は、その感染性クローンが最初に作られたので、多分、最もよく特徴付けられた血清型である［Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１（１９８２）］。続いて、また、ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−６が決定された［Ｒｕｔｌｅｄｇｅ，前出；Ｊ．Ａ．Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：６８２３−６８３３（１９９７）；Ｓ．Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，２２１：２０８−２１７（１９９６）］。一般に、すべてのＡＡＶは、ヌクレオチド配列において８０％以上の相同性を共有している。
【０００５】
多数のユニークな性質が、ＡＡＶをしてヒト遺伝子治療のための有望なベクターにさせる［Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９（１９９２）］。他のウイルスベクターとは異なり、ＡＡＶは、いかなる既知のヒトの病気にも関連していないことが分かっており、そして一般に、病原性ではないと考えられる。野生型ＡＡＶは、部位特異的様式で宿主染色体中に組み込むことができる［Ｒ．Ｍ．Ｋｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２１１−２２１５（１９９０）−Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０（１２）：３９４１−３９５０（１９９１）］。ｒｅｐタンパク質がｔｒａｎｓにおいて供給される場合は、組み換えＡＡＶベクターは、染色体１９において組織培養細胞中に組み込むことができる［Ｃ．Ｂａｌａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：３２９９−３３０６（１９９７）；Ｒ．Ｔ．Ｓｕｒｏｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：７９５１−７９５９（１９９７）］。ＡＡＶの組み込まれたゲノムは、筋肉、肝臓および脳を含む多くの組織において長期の遺伝子発現を可能にすることが分かった［Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，３（３）：３０６−３１２（１９９７）；Ｒ．Ｏ．Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：２７０−２７６（１９９７）；Ｘ．Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１４４：１１３−１２４（１９９７）；Ｘｉａｏ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０（１１）：８０９８−−８１０８（１９９６）］。
【０００６】
ＡＡＶ−２は、ヒト集団の約８０−９０％において存在することが分かっている。より早期の研究は、ＡＡＶ−２に対する中和抗体が伝播していることを示した［Ｗ．Ｐ．Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２：７１６−７２２（１９７０）］。そのような抗体の存在は、その他のメリットにもかかわらず、ＡＡＶ−２に基づくＡＡＶベクターの有用性を有意に減少するであろう。当該技術分野において必要とされるものは、中和抗体の存在を含む不利益なしに、上記のことを含むＡＡＶ−２の利点を特徴とするベクターである。
【０００７】
発明の概要
１つの態様では、本発明は、配列番号：１、配列番号：１に相補的な鎖、ならびに配列番号：１およびその相補鎖に相補的なｃＤＮＡおよびＲＮＡの中から選ばれる単離されたＡＡＶ−１核酸分子を提供する。
【０００８】
その他の態様では、本発明は、５’ＩＴＲ配列、配列番号：１のｎｔ１〜１４３；３’ＩＴＲ配列、配列番号：１のｎｔ４５７６〜４７１８、およびそれらのフラグメントを含む、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を提供する。
【０００９】
なおその他の態様では、本発明は、ＡＡＶ−１ＩＴＲおよび選ばれた導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を含んでなる組み換えベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、両５’および３’ＡＡＶ−１ＩＴＲを含有し、これらの間に選ばれた導入遺伝子が位置する。
【００１０】
なおその他の態様では、本発明は、配列番号：１のｎｔ２３６〜２９９の配列もしくはその機能性フラグメントをもつＡＡＶ−１Ｐ５プロモーターを含んでなる組み換えベクターを提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、ＡＡＶ−１ｒｅｐコーディング領域およびＡＡＶ−１ｃａｐコーディング領域をコードしている核酸分子を提供する。
【００１２】
なおその他の態様では、本発明は、本発明の組み換えウイルスベクターにより形質導入された宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、本発明のＡＡＶ−１Ｐ５プロモーターにより安定に形質導入された宿主細胞を提供する。
【００１３】
なおさらなる態様では、本発明は、キャリヤーおよび本発明のベクターを含んでなる製薬組成物を提供する。
【００１４】
なおその他の態様では、本発明は、その発現を指図する配列の制御下に選ばれた導入遺伝子およびアデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ−１）ビリオンを含んでなる組み換えウイルスベクターを選ばれた宿主に送達する段階を伴う、宿主への導入遺伝子のＡＡＶに媒介される送達方法を提供する。
【００１５】
その他の態様では、本発明は、本発明のベクターを用いる選ばれた遺伝子産物のイン・ビトロでの生産方法を提供する。
【００１６】
本発明の他の態様および利点は、本発明の詳細な記述より当業者には容易に明らかになるであろう。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１Ａ−１Ｃは、ＡＡＶ−１［配列番号：１］、ＡＡＶ−２［配列番号：１８］およびＡＡＶ−６［配列番号：１９］のヌクレオチドの整列を示す。整列は、Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒ６．０を用いて実施された。ＡＡＶ−１の完全配列は、上の列に示される。ＡＡＶ−１と同一なＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６におけるヌクレオチドは、「・」の記号で表され、そしてギャップは、「−」で表される。ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−６の３’ＩＴＲは、異なる方向で示されることに注目。
【００１８】
図２は、ＡＡＶ−１ ＩＴＲの予想される２次構造を示す。ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６におけるヌクレオチドは、それぞれイタリックおよび太字で示される。
【００１９】
図３Ａは、ＡＡＶ−６が、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２間の相同的組み換えからいかにして生じるの仮説を示す。ＡＡＶ−１の主要素は、グラフにおいて指示される。ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６の間で共有される領域は、波線による四角で示される。
【００２０】
図３Ｂは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６中の７１ｂｐ相同領域の詳細な図示である。これらの血清型において異なるヌクレオチドは矢印によって指示される。
【００２１】
図４Ａは、組み換えＡＡＶ−１および組み換えＡＡＶ−２ウイルスを介するｈＡＡＴの送達に続く、血清中のヒトα１抗トリプシン（α１ＡＴ）の発現レベルを示すバーチャートである。
【００２２】
図４Ｂは、組み換えＡＡＶ−１および組み換えＡＡＶ−２ウイルスを介するエリトロポイエチン（ｅｐｏ）遺伝子の送達に続く、血清中のｅｐｏの発現レベルを示すバーチャートである。
【００２３】
図５Ａは、実施例７に記述されるようにα１ＡＴの送達に続く、肝臓中のα１ＡＴの発現レベルを示すバーチャートである。
【００２４】
図５Ｂは、実施例７に記述されるようにｅｐｏの送達に続く、肝臓中のｅｐｏの発現レベルを示すバーチャートである。
【００２５】
図５Ｃは、実施例７に記述されるように肝臓へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−１に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【００２６】
図５Ｄは、実施例７に記述されるように肝臓へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−２に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【００２７】
図６Ａは、実施例７に記述されるようにα１ＡＴの送達に続く、筋肉中のα１ＡＴの発現レベルを示すバーチャートである。
【００２８】
図６Ｂは、実施例７に記述されるようにｅｐｏの送達に続く、筋肉中のｅｐｏの発現レベルを示すバーチャートである。
【００２９】
図６Ｃは、実施例７に記述されるように筋肉へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−１に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【００３０】
図６Ｄは、実施例７に記述されるように筋肉へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−２に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【００３１】
発明の詳細な記述
本発明は、血清型１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ−１）についての新規な核酸配列を提供する。また、これらのＡＡＶ−１配列のフラグメントが提供される。中でも特に望ましいＡＡＶ−１フラグメントは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、ｒｅｐおよびｃａｐである。これらのフラグメントの各々は、種々のベクター系および宿主細胞において、例えばカセットとして容易に利用することができる。そのようなフラグメントは、それのみで、他のＡＡＶ−１配列もしくはフラグメントと組み合わせて、または他のＡＡＶもしくは非ＡＡＶウイルス配列からの要素と組み合わせて使用することができる。１つの特定の望ましい実施態様では、カセットは、選ばれた導入遺伝子に隣接する本発明のＡＡＶ−１ ＩＴＲを含有してもよい。その他の望ましい実施態様では、カセットは、例えば、組み換え（ｒＡＡＶ）ウイルスの作成における使用のために、ＡＡＶ−１ｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有してもよい。
【００３２】
かくして、ＡＡＶ−１配列およびそのフラグメントは、ｒＡＡＶの作成において有用であり、そしてまたアンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクターもしくはワクチンベクターとして有用である。さらに、本発明は、核酸分子、遺伝子送達ベクター、および本発明のＡＡＶ−１配列を含有する宿主細胞を提供する。また、ＡＡＶベクターを用いる遺伝子送達の新規方法が提供される。
【００３３】
本明細書に記述されるように、本発明のＡＡＶ−１キャプシドタンパク質を含有する本発明のベクターは、中和抗体が、他のＡＡＶ血清型に基づくベクター、ならびに他のウイルスベクターの有効性を減少させる場合の応用における使用のために、特に良好に適合される。本発明のｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ再投与および反復遺伝子治療において特に有利である。
【００３４】
本発明のこれらおよび他の実施態様および利点は、より詳細に以下に記述される。本明細書および請求項を通して使用されるように、用語「含有する」は、他の成分、要素、完全体、段階およびそれに類するものを含めている。
【００３５】
１．ＡＡＶ−１核酸およびタンパク質配列
本発明のＡＡＶ−１核酸配列は、配列番号：１のＤＮＡ配列（図１Ａ−１Ｃ）を含み、これは４７１８ヌクレオチドからなる。さらに、本発明のＡＡＶ−１核酸配列は、配列番号：１に相補的である鎖、ならびに配列番号：１およびその相補鎖に対応するＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列を包含する。また、本発明の核酸配列には、配列番号：１およびその相補鎖の天然の変異体および工学的改変体も含まれる。そのような改変は、例えば、当該技術分野において既知である標識、メチル化、および１個以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体による置換を含む。
【００３６】
さらに、本発明には、配列番号：１に８５％超、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、もっとも好ましくは少なくとも約９８−９９％同一性もしくは相同性である核酸配列が含まれる。核酸配列の文脈中、用語「パーセント配列同一性」もしくは［同一性の」は、最大の対応のために整列された場合に、同じである２配列における残基を指す。配列同一性比較の長さは、全長配列、または少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０−２４ヌクレオチド、少なくとも約２８−３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドにおけるフラグメントにわたっていてもよい。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用できる、当該技術分野において既知の多数の異なる計算法が存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Ｆａｓｔａ，ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａは、疑問および検索配列間において最良のオーバーラップ領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（本明細書に引用によって組み入れられている、Ｐｅｒｓｏｎ，１９９０）。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、Ｆａｓｔａを用いて、引用によって本明細書に組み入れられている、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１において提供されるようなそのデフォルトパラメーター（ワードサイズ６およびスコアマトリックスのためのＮＯＰＡＭファクター）によって決定することができる。
【００３７】
核酸もしくはそのフラグメントに言及する場合、用語「実質的相同性」もしくは「実質的類似性」は、適当なヌクレオチド挿入もしくは欠失に関してその他の核酸（もしくはその相補鎖）と最適に整列された場合、配列の少なくとも約９５−９９％においてヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。
【００３８】
また、配列番号：１のフラグメント、その相補鎖、それに相補的なｃＤＮＡおよびＲＮＡが、本発明内に含まれる。適当なフラグメントは、長さ少なくとも１５ヌクレオチドであり、そして生物学的な興味のある機能性フラグメントを包含する。これらのフラグメントあるものは、図１Ａ−１Ｃを参照して同定することができる。特に望ましい機能性フラグメントの例は、本発明のＡＡＶ−１逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３およびＡＡＶ−４の１４５ｎｔＩＴＲに対して、ＡＡＶ−１ＩＴＲは、１４３ヌクレオチドのみからなることが分かっていて、なお有利には、ＡＡＶ−２ＩＴＲの、部位特異的組み込み指図する能力に関与すると考えられているＴ型ヘアピン構造を特徴とする。さらに、ＡＡＶ−１は、５’および３’ＩＴＲが同一であるという点で、他のＡＡＶ血清型の中でもユニークである。ＡＡＶ−１の全長５’ＩＴＲ配列は、配列番号：１のヌクレオチド１〜１４３（図１Ａ）において提供され、そしてＡＡＶ−１の全長３’ＩＴＲ配列は、配列番号：１のｎｔ４５７６〜４７１８（図１Ｃ）において提供される。当業者は、全長未満の５’および／または３’ＩＴＲ配列を種々の目的のために容易に利用することができ、そして例えばＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１３５−１４３（１９８３）においてＡＡＶ−２ＩＴＲについて記述されているように、慣用の技術を用いて改変ＩＴＲを構築することができる。
【００３９】
ＡＡＶ−１ゲノムのその他の望ましい機能性フラグメントは、決定的な調節要素および機能を維持しながら、ＡＡＶ Ｐ５プロモーター中にユニークな配列をもつＡＡＶ−１のＰ５プロモーターである。このプロモーターは、配列番号：１のｎｔ２３６〜２９９（図１Ａ）内に位置している。興味ある機能性フラグメントの他の例は、ｒｅｐ／ｃａｐの結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）における配列、例えば、ｎｔ２３０６−２２２３にわたる配列、ならびにこの結合のいずれかの側に５０ヌクレオチドを含有してもよいこの結合を包含するより大きいフラグメントを含む。なお他の機能性フラグメントの例は、ｒｅｐタンパク質をコードしている配列を含む。Ｒｅｐ７８は、配列番号：１のｎｔ３３４−２３０６の領域に位置し；Ｒｅｐ６８は、ｎｔ３３４−２２７２の領域に位置し、そして配列番号：１のｎｔ１９２４−２２２０にわたるイントロンを含有する。Ｒｅｐ５２は、配列番号：１のｎｔ１００７−２３０４の領域に位置し；ｒｅｐ４０は、ｎｔ１００７−２２７２の領域に位置し、そして配列番号：１のｎｔ１９２４−２２４６にわたるイントロンを含有する。また、キャプシドタンパク質、ＶＰ１［配列番号：１のｎｔ２２２３−４４３１］、ＶＰ２［配列番号：１のｎｔ２６３４−４４３２］およびＶＰ３［配列番号：１のｎｔ２８２９−４４３２］をコードしている配列も興味深い。興味ある他のフラグメントは、ＡＡＶ−１Ｐ１９配列、ＡＡＶ−１Ｐ４０配列、ｒｅｐ結合部位、および末端分離（ｒｅｓｏｌｕｔｅ）部位（ＴＲＳ）を含んでもよい。
【００４０】
さらに、本発明は、本発明のＡＡＶ−１核酸によってコードされているタンパク質およびそのフラグメントを提供する。特に望ましいタンパク質は、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質であって、これらは先に特定されたヌクレオチド配列によってコードされている。これらのタンパク質は、ｒｅｐ７８［配列番号：５］、ｒｅｐ６８［配列番号：７］、ｒｅｐ５２［配列番号：９］、ｒｅｐ４０［配列番号：１１］、ｖｐ１［配列番号：１３］、ｖｐ２［配列番号：１５］およびｖｐ３［配列番号：１７］、およびそれらの機能性フラグメントを含み、一方、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の配列は、ＡＡＶ−６のそれらと密接に関係していることが分かっているが、アミノ酸配列における差異（下記表１参照）、ならびに免疫系によるこれらのタンパク質の認識における差異が存在する。しかしながら、当業者は、生物学的興味のある他の適当なタンパク質もしくはタンパク質フラグメントを容易に選択するであろう。適当には、そのようなフラグメントは、長さ少なくとも８アミノ酸である。しかしながら、他の所望の長さのフラグメントも、容易に利用できる。そのようなフラグメントは、組み換え的に、または他の適当な手段、例えば化学合成によって作成されてもよい。
【００４１】
本発明の配列、タンパク質およびフラグメントは、組み換え体作成、化学合成もしくは他の合成手段を含む、いかなる適当な手段によって作成されてもよい。そのような作成方法は、当業者の知識内に存在し、そして本発明を限定するものではない。
【００４２】
ＩＩ．ウイルスベクター
その他の態様では、本発明は、標的細胞への異種遺伝子もしくは他の核酸配列の送達のための、フラグメントを含む本発明のＡＡＶ−１配列を利用するベクターを提供する。適当には、これらの異種配列（すなわち導入遺伝子）は、標的細胞において発現されることが可能であるタンパク質もしくは遺伝子産物をコードしている。そのような導入遺伝子は、「ミニジーン（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）」の形態で構築されてもよい。そのような「ミニジーン」は、宿主細胞においてその遺伝子を転写し、そして遺伝子産物を発現するのに必要な選ばれた異種配列および他の調節要素を含む。かくして、遺伝子配列は、それらの転写を許す様式で調節成分に操作可能に結合される。そのような成分は、ウイルスベクターを含有する細胞において導入遺伝子の発現を推進するのに必要な通常の調節要素を含む。また、ミニジーンは、導入遺伝子に結合され、そして他の調節要素とともに、組み換えベクターの選ばれたウイルス配列内に位置する選ばれたプロモーターを含有してもよい。
【００４３】
プロモーターの選択は、日常的な問題であり、そして本発明を限定するものではない。有用なプロモーターは、構成的プロモーターもしくは調節される（誘導性）プロモーターであってもよく、これは、発現されるべき導入遺伝子の時期および量の制御を可能にする。例えば、望ましいプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型プロモーター［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）参照］、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター／エンハンサー、およびニワトリ細胞質β−アクチンプロモーター［Ｔ．Ａ．ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１（２３）：８２８７（１９８３）］を含む。なお他の望ましいプロモーターは、アルブミンプロモーターおよびＡＡＶ Ｐ５プロモーターである。場合によっては、選ばれたプロモーターは、異種のエンハンサーとの結合において使用される、例えば、β−アクチンプロモーターが、ＣＭＶエンハンサーと結合されて使用されてもよい。まだ他の適当なまたは望ましいプロモーターおよびエンハンサーは、当業者によって選択することができる。
【００４４】
また、ミニジーンは、好ましくは、転写物の有効なポリアデニル化（ポリＡもしくはｐＡ）のために要求されるシグナルならびに機能的スプライスドナーおよびアクセプター部位をもつイントロンを提供する配列を含む、ウイルスベクター配列に対して異種の核酸配列を含有してもよい。本発明の代表的なベクターにおいて使用される共通のポリＡ配列は、パポーバウイルスＳＶ−４０由来のものである。ポリＡ配列は、一般に、導入遺伝子配列の下流でウイルスベクター配列の上流のミニジーン中に挿入される。また、共通のイントロン配列は、ＳＶ−４０から得られ、そしてＳＶ４０Ｔイントロン配列として言及される。また、本発明のミニジーンは、望ましくは、プロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子間に位置するようなイントロンを含有してもよい。これらおよび他の共通のベクター要素の選択は慣例的であり［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄｉｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）および本明細書に引用される文献、参照］、そして多くのそのような配列が、商業的および工業的起源ならびにＧｅｎｅｂａｎｋから得ることができる。
【００４５】
導入遺伝子の選択は、本発明を限定するものではない。適当な導入遺伝子は、望ましいリポーター遺伝子、治療遺伝子、および場合によっては、免疫原性ポリペプチドをコードしている遺伝子の中から容易に選ぶことができる。適当なリポーター遺伝子の例は、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む。治療遺伝子の例は、なかんずくサイトカイン、成長因子、ホルモンおよび分化因子を含む。導入遺伝子は、当業者によって容易に選択することができる。例えば、他の適当な導入遺伝子を特定しているＷＯ９８／０９６５７を参照。
【００４６】
適当には、本発明のベクターは、最小でも、ＡＡＶ−１配列のフラグメントおよびタンパク質からなるカセットを含有する。１つの実施態様では、本発明のベクターは、少なくとも１つが本発明のＡＡＶ−１ＩＴＲである、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲによって隣接される選ばれた導入遺伝子を含有する。適当には、本発明のベクターは、本発明のＡＡＶ−１Ｐ５プロモーターを含有してもよい。なおその他の実施態様では、本発明のプラスミドもしくはベクターは、ＡＡＶ−１ｒｅｐ配列を含有する。なおその他の実施態様では、本発明のプラスミドもしくはベクターは、本発明の少なくとも１つのＡＡＶ−１ｃａｐタンパク質を含有する。もっとも適当には、これらのＡＡＶ−１由来のベクターは、本明細書に記述されるように、ウイルスベクター中に組み立てられる。
【００４７】
Ａ．ＡＡＶウイルスベクター
１つの態様では、本発明は、本発明のＡＡＶ−１キャプシドタンパク質を用いて作成される組み換えＡＡＶ−１ウイルスベクターを提供する。本発明のパッケージされたｒＡＡＶ−１ビリオンは、選ばれたミニジーンに加えて、他のＡＡＶ−１配列を含有してもよく、または他のＡＡＶ血清型からの配列を含有してもよい。
【００４８】
ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、そして適当な方法の選択は、本発明を限定するものではない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，７０：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号、参照。１つの適当な方法では、選ばれた宿主細胞は、ｒｅｐタンパク質をコードしているＡＡＶ配列、ＡＡＶｃａｐタンパク質をコードしている遺伝子、およびパッケージングとそれに続く送達のための配列を与えられる。望ましくは、その方法は、本発明のＡＡＶ−１ｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質をコードしている配列を利用する。
【００４９】
１つの実施態様では、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子および送達のための配列は、これらの遺伝子および配列を担持しているベクターのコ・トランスフェクションによって与えられる。１つの現在好適な実施態様では、ｃｉｓ（ベクター）プラスミド、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有しているｔｒａｎｓプラスミド、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を含有しているプラスミドが、適当な細胞系、例えば２９３中にコ・トランスフェクションされる。あるいはまた、これらの機能の１つ以上が、別々のベクターを介してｔｒａｎｓで供給されてもよく、または適当に工作されたパッケージング細胞系において見いだされてもよい。
【００５０】
代表的なｃｉｓプラスミドは、５’から３’の順で、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、選ばれた導入遺伝子およびＡＡＶ３’ＩＴＲを含有できる。１つの望ましい実施態様では、少なくとも１つのＡＡＶＩＴＲは１４３ｎｔＡＡＶ−１ＩＴＲである。しかしながら、他のＡＡＶ血清型ＩＴＲも容易に選択することができる。適当には、全長ＩＴＲが利用される。しかしながら、当業者は、慣用の技術を用いて改変されたＡＡＶＩＴＲを容易に作成することができる。同様に、そのようなプラスミドの構築方法も当業者には周知である。
【００５１】
ｒＡＡＶ−１ビリオン粒子の作成における使用のためのｔｒａｎｓプラスミドは、既知の技術にしたがって作成されてもよい。１つの望ましい実施態様では、このプラスミドは、ＡＡＶ−１のｒｅｐおよびｃａｐタンパク質、またはその機能性フラグメントを含有する。あるいはまた、ｒｅｐ配列は、その他の選ばれたＡＡＶ血清型由来であってもよい。
【００５２】
次に、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓプラスミドは、野生型ヘルパーウイルス（例えば、Ａｄ２，Ａｄ５もしくはヘルペスウイルス）か、またはより望ましくは、複製能欠損アデノウイルスとともに、選ばれた宿主細胞中にコ・トランスフェクションされてもよい。あるいはまた、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓプラスミドは、必要なヘルパー機能を備えているトランスフェクションされるプラスミドと一緒に、選ばれた宿主細胞中にコ・トランスフェクションされてもよい。適当な宿主細胞の選択は、当業者には周知であり、そしてなかんずく、２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞のような哺乳類細胞を含む。
【００５３】
あるいはまた、ｃｉｓプラスミドおよび場合によってはｔｒａｎｓプラスミドは、本発明の所望のＡＡＶ−１配列を含有しているｒＡＡＶの産生に必要な残留ヘルパー機能を備えているパッケージング細胞系中にトランスフェクションされてもよい。適当なパッケージング細胞系の例は、ＡＡＶ−２キャプシドが所望される場合は、相同Ｐ５プロモーターの調節下でＡＡＶ−２ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を安定に発現するＢ−５０である。この細胞系は、コンカテマー（ｃｏｎｃａｔｏｍｅｒ）形態におけるＰ５−ｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子カセットの多数コピー（少なくとも５コピー）の細胞染色体中への組み込みを特徴とする。このＢ−５０細胞系は、ブダペスト条約の約定に従って、寄託番号ＣＲＬ−１２４０１の下、１９９７年９月１８日に、アメリカン タイプ カルチャー コレクション、１０８０１ ユニバーシティ ブールバード、マナサス、バージニア ２０１１０−２２０９（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９）に寄託された。しかしながら、本発明は、パッケージング細胞系の選択に関して限定されるものではない。
【００５４】
ＡＡＶ−１キャプシドタンパク質に基づく代表的な導入ベクターは、実施例４においてより詳細に記述されるように、両イン・ビボおよびイン・ビトロで試験された。これらの研究では、ＡＡＶ−１ビリオンをもつ組み換えＡＡＶベクターが、両マウス肝臓および筋肉に導入できることが例証された。多数のヒト集団において存在しているＡＡＶ−１の中和抗体は、他のＡＡＶ血清型とは異なるパターンを示し、したがってＡＡＶ−１ビリオンを中和しないので、当業者によって作成できるこれら、および他のＡＡＶ−１に基づく遺伝子治療ベクターは、選ばれた宿主細胞および遺伝子治療患者への遺伝子送達のために有益である。当業者は、当業者には既知の種々の技術を用いて、ここに提供されるＡＡＶ−１キャプシドタンパク質を含有している他のｒＡＡＶウイルスベクターを容易に作成することができる。なお、ＡＡＶ−１配列およびその他の血清型のＡＡＶキャプシドを含有する他のｒＡＡＶウイルスベクターも、同様に作成することができる。
【００５５】
Ｂ．他のウイルスベクター
当業者は、本発明のＡＡＶ−１配列が、イン・ビトロ、エクス・ビボもしくはイン・ビボ遺伝子送達のためのこれらおよび他のウイルスベクター系における使用のために容易に適用できることを、容易に理解できる。ＡＡＶ−１ＩＴＲ配列、ＡＡＶ−１ｒｅｐ、ＡＡＶ−１ｃａｐおよびＡＡＶ−１Ｐ５プロモーター配列は、そのようなウイルスベクター系における使用のために特によく適している。
【００５６】
例えば、１つの望ましい実施態様では、本発明のＡＡＶ−１ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ−１５’ＩＴＲ、興味ある非ＡＡＶＤＮＡ配列（例えばミニジーン）および３’ＩＴＲを含み、そして機能性ｒｅｐ／ｃａｐを欠いている発現カセットにおいて使用されてもよい。そのようなＡＡＶ−１ＩＴＲを含有するカセットは、所望の宿主細胞へのその後のトランスフェクションのためのプラスミド、例えば前記ｃｉｓプラスミド上に位置してもよい。さらに、この発現カセットは、細胞の感染を許すために選ばれた血清型のＡＡＶキャプシドを提供されてもよく、またはｒＡＡＶビリオンのパッケージングのために所望の宿主細胞中へ安定にトランスフェクションされてもよい。そのような発現カセットは、アデノウイルス系およびレンチウイルス系を含む他のウイルス系における使用のために容易に適合できる。Ａｄ／ＡＡＶベクターを作成する方法は当業者には周知である。１つの望ましい方法は、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４０１８に記述されている。しかしながら、本発明は、いかなる特定の方法にも限定されるものではない。
【００５７】
本発明のその他の態様は、配列番号：１のｎｔ２３６−２９９にわたる領域に位置する新規なＡＡＶ−１Ｐ５プロモーターである。このプロモーターは、所望の導入遺伝子の発現を推進するために種々のウイルスベクターにおいて有用である。
【００５８】
同様に、当業者は、種々のベクター系における使用のための本発明のＡＡＶ−１ゲノムの他のフラグメントを容易に選択することができる。そのようなベクター系は、例えば、なかんずくレンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルス系を含んでもよい。これらのベクター系の選択は、本発明の限定するものではない。
【００５９】
Ｃ．宿主細胞およびパッケージング細胞系
なおその他の態様では、本発明は、所望の導入遺伝子の発現またはｒＡＡＶ粒子の産生を可能にするために、本発明のＡＡＶ−１核酸配列により、一過性にトランスフェクションされてもよい宿主細胞を提供する。例えば、選ばれた宿主細胞は、慣用の技術を用いてＡＡＶ−１Ｐ５プロモーター配列および／またはＡＡＶ−１５’ＩＴＲ配列によりトランスフェクションされてもよい。本発明のトランスフェクションされた細胞系に対するＡＡＶヘルパー機能の供与は、感染性ｒＡＡＶ粒子としてのｒＡＡＶのパッケージングをもたらす。そのような細胞系は、本発明のＡＡＶ−１配列を使用して、既知技術［例えば米国特許第５，６５８，７８５号、参照］にしたがって作成することができる。
【００６０】
あるいはまた、本発明の宿主細胞は、本発明のｒＡＡＶ発現カセット、およびＡＡＶ−１ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子のコピーを用いて、安定にトランスフェクションされてもよい。適当な親細胞系は、哺乳類細胞系を含み、そして非サル哺乳類細胞由来の宿主細胞を選択することが望ましい。適当な親細胞系の例は、限定されるものではないが、Ｈｅｌａ［ＡＴＣＣ ＣＣＬ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ１８５］，ＫＢ［ＣＣＬ１７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えばＤｅｔｒｏｉｔ５１０，ＣＣＬ７２］およびＷＩ−３８［ＣＣＬ７５］細胞を含む。これらの細胞系は、アメリカン タイプ カルチャー コレクション、１０８０１ ユニバーシティ ブールバード、マナサス、バージニア ２０１１０−２２０９ ＵＳＡからすべて得ることができる。他の適当な親細胞系が、他の起源から得られてもよく、そして本発明のＰ５および／またはＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ配列を含有する安定な細胞系を構築するために使用されてもよい。
【００６１】
上記のように生成された組み換えベクターは、興味あるＤＮＡの細胞への送達のために有用である。
【００６２】
ＩＩＩ．ＡＡＶ−１由来のベクターを介して遺伝子を送達する方法
その他の態様では、本発明は、本発明のＡＡＶ−１配列（もしくはその機能性フラグメント）を用いて生成された組み換えウイルスベクターにより、選ばれた宿主細胞をトランスフェクションするか、または感染させることを伴う宿主への導入遺伝子の送達方法を提供する。送達方法は、当業者には周知であり、そして本発明を限定するものではない。
【００６３】
１つの望ましい実施態様では、本発明は、宿主への導入遺伝子のＡＡＶに媒介される送達方法を提供する。この方法は、導入遺伝子およびＡＡＶ−１キャプシドタンパク質の発現を指図する配列の制御下に選ばれた導入遺伝子を含有する組み換えウイルスベクターにより、選ばれた宿主細胞をトランスフェクションするか、または感染させることを必要とする。
【００６４】
場合によっては、宿主からのサンプルが、最初に、選ばれたＡＡＶ血清型に対する抗体の存在についてアッセイされる。中和抗体を検出するための種々のアッセイ型式が、当業者には周知である。そのようなアッセイの選択は、本発明を限定されるものではない。例えば、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，３（３）：３０６−３１２（Ｍａｒｃｈ １９９７）およびＷ．Ｃ．Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９：４７７−４８５（Ｍａｒｃｈ １，１９９８）、参照。このアッセイの結果は、例えばそのキャプシド血清型に特異的な中和抗体の不在によって、特定の血清型のキャプシドタンパク質を含有するＡＡＶベクターが、送達のために好適であるかを決定するするために使用できる。
【００６５】
この方法の１つの態様では、ＡＡＶ−１キャプシドタンパク質をもつベクターの送達は、異なる血清型ＡＡＶキャプシドタンパク質をもつベクターを介する遺伝子の送達に先行しても、または後に続いてもよい。かくして、ｒＡＡＶベクターを介する遺伝子送達は、選ばれた宿主細胞への反復遺伝子送達のために使用できる。望ましくは、後に投与されるｒＡＡＶベクターは、最初のｒＡＡＶベクターと同じ導入遺伝子を担持しているが、後に投与されるベクターは、最初のベクターとは異なる血清型のキャプシドタンパク質を含有している。例えば、最初のベクターがＡＡＶ−２キャプシドタンパク質をもつ場合は、後に投与されるベクターは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−６を含む、他の血清型の中から選ばれるキャプシドタンパク質を有してもよい。
【００６６】
かくして、本発明のｒＡＡＶ−１由来組み換えウイルスベクターは、生物が、１種以上のＡＡＶ血清型に対する中和抗体をもつ場合でさえも、イン・ビボもしくはエクス・ビボで選ばれた宿主細胞に選ばれた導入遺伝子を送達できる有効な遺伝子伝達を提供する。これらの組成物は、特に、治療目的のための遺伝子送達に良好に適合される。しかしながら、本発明の組成物は、また、免疫化において有用である。さらに、また、本発明の組成物は、イン・ビトロにおいて所望の遺伝子産物の生産のために使用されてもよい。
【００６７】
上記組み換えベクターは、公表された方法にしたがって宿主細胞へ送達されてもよい。選ばれた導入遺伝子を担持しているＡＡＶウイルスベクターは、好ましくは生物学的に適合しうる溶液もしくは製薬的に許容しうる送達媒質中に懸濁されて、患者に投与されてもよい。適当な媒質は、無菌生理食塩水を含む。製薬的に許容しうるキャリヤーであることが既知で、そして当業者には周知の他の水性および非水性等張無菌注射液ならびに水性および非水性無菌懸濁液が、この目的のために使用されてもよい。
【００６８】
ウイルスベクターは、細胞をトランスフェクションし、そして十分なレベルの遺伝子伝達と発現を提供するのに十分な量において投与されて、当該医学分野における熟達者によって決定できる過度の副作用なしに、または薬物学的に許容しうる生理的効果をもつ、治療利益を提供する。慣用の製薬的に許容しうる投与経路は、限定されるものではないが、肝臓への直接送達、経口、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および他の非経口投与経路を含む。投与経路は、所望であれば、組み合わされてもよい。
【００６９】
ウイルスベクターの用量は、第１には、治療されている症状、患者の年令、体重および健康のようなファクターに依存し、したがって患者によって変わるであろう。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効なヒト用量は、一般に、濃度約１ｘ１０9〜１ｘ１０16ゲノムウイルスベクターを含有する溶液約１ｍｌ〜約１００ｍｌの範囲内である。好適なヒト用量は、約１ｘ１０13〜１ｘ１０16ＡＡＶゲノムであってもよい。用量は、あらゆる副作用に対して治療利益をバランスさせるように調整でき、そしてそのような用量は、組み換えベクターが使用される治療適用に応じて変わるであろう。導入遺伝子の発現レベルが、ウイルスベクター、好ましくはミニジーンを含有しているＡＡＶベクターをもたらす用量の頻度を決定するためにモニターすることができる。場合によっては、治療目的のために記述された処方に類似する用量処方が、本発明の組成物を用いる免疫化のために利用されてもよい。イン・ビトロの生産では、所望のタンパク質は、所望のタンパク質をコードしている遺伝子を含有するｒＡＡＶにより宿主細胞をトランスフェクションし、そして発現を可能にする条件下で細胞培養液を培養した後、所望の培養液から得ることができる。次いで、発現されたタンパク質は、所望のように精製され、単離することができる。トランスフェクション、細胞培養、精製および単離のための適当な技術は、当業者には既知である。
【００７０】
次の実施例は、本発明のいくつかの態様および実施態様を具体的に説明するものである。
【００７１】
実施例１−ＡＡＶ−１の感染性クローンの作成
ＡＡＶ−１の複製型ＤＮＡは、ＡＡＶ−１および野生型アデノウイルス５型によって感染された２９３細胞から抽出された。
【００７２】
Ａ．細胞培養およびウイルス
ＡＡＶ−１不含２９３細胞および８４−３１細胞は、ペンシルバニア大学のヒト応用研究室によって提供された。これらの細胞は、１０％胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシンを補足されたＤｕｌｂｅｃｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍｕにおいて、５％ＣＯ2を供給された湿潤環境中３７℃で培養された。８４−３１細胞系は、アデノウイルス遺伝子Ｅ１ａ，Ｅ１ｂ，Ｅ４／ＯＲＦ６を構成的に発現し、そして既に記述されている［Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２（１９９６）］。ＡＡＶ−１（ＡＴＣＣ ＶＲ−６４５）種保存株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入された。ＡＡＶウイルスは、ヘルパーウイルスとしての野生型Ａｄ５とともに２９３細胞において増殖された。
【００７３】
Ｂ．組み換えＡＡＶ作成
組み換えＡＡＶウイルスは、アデノウイルス不含の方法を用いるトランスフェクションによって作成された。簡単には、ｃｉｓプラスミド（ＡＡＶ ＩＴＲをもつ）、ｔｒａｎｓプラスミド（ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をもつ）およびヘルパープラスミド（ｐＦ△１３、アデノウイルスゲノム由来の必須領域をもつ）が、同時に、１：１：２の比でリン酸カルシウム沈殿によって２９３細胞中にコ・トランスフェクションされた。ｐＦ△１３ヘルパープラスミドは、アデノウイルスＥ２Ｂ領域に８ｋｂ欠失をもち、そしてほとんどの後期遺伝子における欠失を有する。このヘルパープラスミドは、ｐＦＧ１４０（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ，Ｃａｎａｄａ）からＲｓｒＩＩフラグメントを欠失させることによって作成された。典型的には、ＤＮＡ（ｃｉｓ：ｔｒａｎｓ：ｐＦ△１３、それぞれ１：１：２比で）５０μｇが、１５ｃｍ組織培養皿上にトランスフェクションされた。細胞は、感染９６時間後に収穫され、音波処理され、そして０．５％デオキシコール酸ナトリウムにより処理された。細胞溶解液は、次に、２ラウンドのＣｓＣｌ濃度勾配にかけられた。ＡＡＶベクターを含有するピーク画分が回収され、プールされ、そして動物への注射前にＰＢＳに対して透析された。ＡＡＶ−１ビリオンをもつｒＡＡＶウイルスを作成するために、ｐＡＶ１Ｈもしくはｐ５Ｅ１８（２／１）が、ｔｒａｎｓプラスミドとして使用されてｒｅｐおよびｃａｐ機能を与えた。
【００７４】
ＡＡＶ−２に基づくｒＡＡＶの作成のためには、ｐ５Ｅ１８が、一般に、ｒＡＡＶ収率を改善するので、それがｔｒａｎｓプラスミドとして使用された。このプラスミド、ｐ５Ｅ１８（２／２）は、ＡＡＶ−２ＲｅｐおよびＣａｐを発現し、そしてＣａｐ遺伝子に対して位置３’に再び置かれたＰ５プロモーターを含有し、それによってＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８の発現を最小化する。その戦略は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５２３６−５２４３（１９９７）によって最初に記述された。ｐ５Ｅ１８（２／２）は、次の方法において構築された。既に記述されたｐＭＭＴＶ−ｔｒａｎｓベクター（すなわち、ＡＡＶ−２に基づくベクターにおいてＰ５プロモーターについて置換されたマウス乳癌ウイルスプロモーター）が、ＳｍａＩおよびＣｌａＩにより消化され、クレノウ酵素により充填され、次いでＤＮＡリガーゼにより再環化された。得られる構築物は、ＸｂａＩで消化され、充填され、そして次の方法で構築されたｐＣＲ−ｐ５からの平滑末端ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントに連結された。ＡＡＶのＰ５プロモーターが、ＰＣＲによって増幅され、そして増幅されたフラグメントが、続いて、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化されてｐＣＲ−Ｐ５を得た、ヘルパープラスミドｐＡＶ１Ｈは、ｐＡＡＶ−２のＢｆａＩフラグメントを、ＢｃｏｒＶおよびＳｍａＩ部位においてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ−ＳＫ（＋）中にクローニングすることによって構築された。ｐ５Ｅ１８（２／２）からの３．０−ｋｂＸｂａＩ−ＫｐｎＩフラグメント、ｐＡＶ１Ｈからの２．３−ｋｂＸｂａＩ−ＫｐｎＩフラグメント、およびｐ５Ｅ１８（２／２）からの１．７−ｋｂＫｐｎＩフラグメントは、ＡＡＶ−２Ｒｅｐ、ＡＡＶ−１Ｃａｐ、およびＣａｐ遺伝子に対して３’に位置するＡＡＶ−２Ｐ５プロモーターを含有する別々のプラスミドｐ５Ｅ１８（２／１）中に組み入れられた。プラスミドｐ５Ｅ１８（２／１）は、ｐＡＶ１Ｈよりも１０〜２０倍高い量のベクターを生じた（すなわち、１０12ゲノム／５０ １５−ｃｍ2プレート）。
【００７５】
Ｃ．ＤＮＡ技術
ＨｉｒｔＤＮＡ抽出は、少し改変されて当該技術分野に記述されているように実施された［Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１３５−１４３（１９８３）］。より特別には、ＳＤＳ不含のＨｉｒｔ液が、ＳＤＳを含有する元のＨｉｒｔ液を使用する代わりに使用された。元のＨｉｒｔ液に存在するＳＤＳ量は、細胞が完全に懸濁された後添加された。ＡＡＶ−１感染性クローンを構築するために、ＡＡＶ−１感染２９３細胞からのＨｉｒｔＤＮＡが、クレノウ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて修復されて、末端が平滑であることを確定した。次いで、処理されたＡＡＶ−１ＨｉｒｔＤＮＡは、ＢａｍＨＩにより消化され、そしてそれぞれ３ベクター中にクローン化された。内部ＢａｍＨＩが、ＢａｍＨＩにより切断されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ−ＳＫ＋中にクローン化されてｐＡＶ１−ＢＭを得た。左右のフラグメントが、ＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＶにより切断されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ−ＳＫ＋中にクローン化されてそれぞれｐＡＶ１−ＢＬおよびｐＡＶ１−ＢＲを得た。これらの３種のプラスミドにおけるＡＡＶ配列が、続いて、同じベクター中に組み立てられて、ＡＡＶ−１感染性クローンｐＡＡＶ−１を得た。組み換えＡＡＶ−１ウイルス作成のためのヘルパープラスミドは、ＥｃｏＲＶ部位においてｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ−ＳＫ＋中に、ｐＡＡＶ−１のＢｆａＩフラグメントをクローニングすることによって構築された。
【００７６】
ＨｉｒｔＤＮＡの分析は、３種のバンド、９．４ｋｂにおけるダイマー、４．７ｋｂにおけるモノマーおよび１．７ｋｂにおける一本鎖ＤＮＡを現し、ＡＡＶ−１の異なる複製形態に相関していた。モノマーバンドが、ゲルから切り出され、次いでＢａｍＨＩにより消化された。これは、３個のフラグメント、１．１ｋｂ，０．８ｋｂおよび２．８ｋｂをもたらした。このパターンは、Ｂａｎｔｅｌ−ｓｃｈａａｌおよびｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ，Ｖｉｒｏｌ．，１３４（１）：５２−６３（１９８４）による記述と一致している。１．１ｋｂおよび２．８ｋｂＢａｍＨＩフラグメントは、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶ部位においてｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋）中にクローン化された。中間の０．８ｋｂフラグメントは、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋）のＢａｍＨＩ部位中にクローン化された。
【００７７】
これら３種のフラグメントは、次いで、同じ構築物中にサブクローン化されて、ＡＡＶ−１の全配列を含有するプラスミド（ｐＡＡＶ−１）を得た。次いで、ｐＡＡＶ−１が、プラスミドバックボーンおよびパッケージから感染性ウイルスをレスキューするその能力について試験された。次いで、ｐＡＡＶ−１は、２９３細胞にトランスフェクションされ、そしてＭＯＩ １０においてヘルパーとしてのアデノウイルスを供給された。ウイルス上澄液が２９３細胞を再感染するために使用された。
【００７８】
サザンブロット解析では、ＨｉｒｔＤＮＡが、ＤｐｎＩにより消化されて細菌生まれのプラスミドが除去され、ＡＡＶ−１の内部ＢａｍＨＩフラグメントとプローブされた。メンブランは、次いで、高いストリンジェント条件で洗浄されたが、この条件は、６５℃で２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにより３０分２回および６５℃で０．１ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにより３０分２回：を含む。次いで、メンブランは、両リン光体画像およびＸ線オートラジオグラフィーによって解析された。結果は、ｐＡＡＶ−１が、実際に、ＡＡＶ血清型１の感染性クローンであることを確認した。
【００７９】
実施例２−ＡＡＶ−１の配列解析
次いで、完全ＡＡＶ−１ゲノムが、自動配列決定によって決定され、そして長さ４７１８ヌクレオチドであることがわかった（図１Ａ〜１Ｃ）。配列決定では、ＡＢＩ３７３自動シーケンサーが、ＦＳ染料化学を用いてこの研究に関連するすべてのプラスミドおよびＰＣＲフラグメントの配列決定するために使用された。すべての配列が、両プラスおよびマイナス鎖を配列決定することによって確認された。また、これらの配列は、ｐＡＶ−ＢＭの２つの独立したクローン、ｐＡＶ−ＢＬおよびｐＡＶ−ＢＲを配列決定することによって確認された。ＡＡＶ−１ＤＮＡの複製形態が、配列決定のための鋳型として使用されたので、また、これらの配列は、鋳型として元のＡＡＶ−１種保存株を用いる一連のＰＣＲ産物を配列決定することによって確認された。
【００８０】
ＡＡＶ−１の長さは、他の血清型：ＡＡＶ−３（４７２６ヌクレオチド）、ＡＡＶ−４（４７７４ヌクレオチド）、ＡＡＶ−２（４６８１ヌクレオチド）、およびＡＡＶ−６（４６８３ヌクレオチド）の範囲内であることが見い出された。
【００８１】
ＡＡＶ−１ゲノムは、アデノ随伴ウイルスの他の血清型との類似性を示した。全般に、それは、デフォルトセッティング（ｄｅｆａｕｌｔ ｓｅｔｔｉｎｇ）を用いるコンピュータープログラムＭｅｇａｌｉｇｎ［ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ］によって決定されるように、他の既知ＡＡＶウイルスと８０％以上の同一性を共有している。また、ＡＡＶ−２における重要な特徴は、ＡＡＶ−１においても見い出すことができる。第１に、ＡＡＶ−１は、ヌクレオチドレベルにおける違いにもかかわらず、Ｔ型ヘアピン構造を形成できる同型の逆方向末端反復を有する（図２および３）。ＡＡＶ−１の右ＩＴＲと左ＩＴＲの配列は同一である。ＡＡＶ ＴＲ配列は、Ａ，Ａ’，Ｂ，Ｂ’，Ｃ，Ｃ’，ＤおよびＤ’に細分される［Ｂｅｒｎ，前出］。
【００８２】
これらのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、また、事実、ＡＡＶ−６右ＩＴＲに見いだされる配列と同じであり、ＡおよびＡ’配列の各々、およびＤ配列の最後のヌクレオチドにおいて１つのヌクレオチド差異が存在する。第２に、ＡＡＶ−２ｒｅｐ結合モティーフ［ＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＧ（配列番号：２０）］は、良好に保存されている。また、そのようなモティーフは、ヒト染色体１９ＡＡＶ−２プレ・インテグレーション領域において見い出すことができる。最後に、非構造および構造コーディング領域、および他のＡＡＶ血清型のものと類似の調節要素が、またＡＡＶ−１ゲノムにおいて存在する。
【００８３】
ＡＡＶ末端反復の全般的特徴は、非常によく保存されているけれども、ＡＡＶ末端反復の全長は相違を示す。ＡＡＶ−１の末端反復は、１４３ヌクレオチドからなり、一方、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３およびＡＡＶ−４のそれは約１４５もしくは１４６ヌクレオチドである。ＡＡＶ−１ ＩＴＲのループ領域は、それが、また、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−３において見い出されるＴＴＴの代わりにＴＣＴを使用するという点で、ＡＡＶ−４のそれと非常に密接に類似している。配列決定の誤りの可能性は、これらの３ヌクレオチドが、ＳａｃＩ部位の一部である（ｇａｇｃｔｃ；配列番号：１のｎｔ６９−７４）ので、制限酵素消化を用いて除去される。ＡＡＶ−１のｐ５プロモーター領域は、他のＡＡＶ血清型とヌクレオチド配列において一層の変化を示す。しかしながら、それは、決定的な調節要素をなお維持している。ＹＹ１［図１Ａ〜１Ｃ、参照］部位の２コピーは、すべてのＡＡＶ血清型において保存されているようであり、これらは、ＡＡＶ遺伝子発現を調節することに関与していることが分かっている。ＡＡＶ−４には、ＹＹ１とＥ−ｂｏｘ／ＵＳＦ部位間に挿入された５６個のさらなるヌクレオチドが存在するが、一方、ＡＡＶ−１では、Ｅ−ｂｏｘ／ＵＳＦ部位前に挿入された２６個のさらなるヌクレオチドが存在する。また、ｐ１９プロモーター、ｐ４０プロモーターおよびポリＡは、高度にまた保存されている既知のＡＡＶ血清型に対する相似性によってＡＡＶ−１ゲノムから特定することができる。
【００８４】
かくして、種々の血清型のＡＡＶ末端反復の解析は、ＡおよびＡ’配列が非常によく保存されていることを示した。その理由の１つは、Ｒｅｐ結合モティーフ（ＧＣＴＣ）3ＧＣＴＧ［配列番号：２０］であるかもしれない。これらの配列は、ＡＡＶ ＤＮＡ複製および部位特異的組み込みには必須であるようである。また、同じ配列が、サルのゲノムにおいても保存されていることが分かっている［Ｓａｍｕｌｓｋｉ，私信］。また、Ｄ配列の最初の８ヌクレオチドは、すべての既知ＡＡＶ血清型において同一である。これは、最初の１０ヌクレオチドのみが、ＡＡＶパッケージングにとって必須であるというＳｒｉｖａｓｔａｖａグループの観察と一致している［Ｘ．Ｓ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：３０７７−３０８２（１９９７）；Ｘ．Ｓ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：１１４０−１１４６（１９９７）］。残りのＤ配列の機能は、まだ不明のままである。それらは、それらの組織特異性にいくらか関係しているかもしれない。また、ＢおよびＣ配列におけるヌクレオチドの違いは、ＩＴＲの２次構造が、その生物学的機能にとってより決定的であることを示唆しているかも知れず、このことは、多くの従来の出版物において例証されている。
【００８５】
実施例３−ＡＡＶ−１配列の比較
上記のように得られたＡＡＶ−１のヌクレオチド配列が、ＤＮＡ Ｓｔａｒ Ｍｅｇａｌｉｇｎを用いて、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−６を含む既知のＡＡＶ配列と比較された。この比較は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６によって共有される一続きの７１個の同一ヌクレオチドを明らかにした。図１Ａ〜１Ｃ、参照。
【００８６】
この比較は、ＡＡＶ−６が、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２の相同組み換えによって形成されたハイブリッドであることを、さらに示唆した。図３Ａおよび３Ｂ、参照。これらのヌクレオチドは、ＡＡＶ−６ゲノムを２つの領域に分ける。５２２ヌクレオチドをもつＡＡＶ−６の５’側半分は、２位置における以外はＡＡＶ−２のそれと同一である。多くのｒｅｐ遺伝子、完全ｃａｐ遺伝子および３’ＩＴＲを含むＡＡＶ−６の３’側半分は、ＡＡＶ−１に９８％同一である。
【００８７】
生物学的に、そのような組み換えは、ヒト集団をとおして伝達する能力をＡＡＶ−１に獲得させるであろう。また、ＡＡＶ−６のＩＴＲが、１つのＡＡＶ−１ＩＴＲおよび１つのＡＡＶ−２ＩＴＲを含有することに注目することは興味ある。欠陥パルボウイルスの複製モデルは、この特定の配置を維持することができる。ＡＡＶ組み込みに関する研究は、多数のＡＡＶ組み込み体が、末端反復の少なくとも１つにおける欠失を担持していることを示した。これらの欠失は、鋳型として他のインタクト末端反復を用いて、遺伝子保存をとおして修復することができることが示された。したがって、ＡＡＶ−６の組み込まれたコピーがヘルパーウイルス感染により宿主細胞からレスキューされる場合には、同種集団としてＡＡＶ−６を維持することは、非常に困難であろう。２つの同一ＡＡＶ−２ＩＴＲもしくは２つの同一ＡＡＶ−１ＩＴＲをもつＡＡＶ−６は、有力な変異体であろう。２つのＡＡＶ−１ＩＴＲをもつＡＡＶ−６は、Ｒｕｓｓｅｌｌグループによって観察された［Ｒｕｔｌｅｄｇｅ、前出（１９９８）］。今まででは、２つのＡＡＶ−２ＩＴＲをもつＡＡＶ−６に関する報告は存在しない。ＡＡＶ−６によるＡＡＶ−２Ｐ５プロモーターの獲得は、ＡＡＶ−６が、ヒト起源から単離されたのに対して同じビリオンをもつＡＡＶ−１は単離されなかったということを説明できる。ＡＡＶの異なる種の間のＰ５プロモーターの調節は、イン・ビボでは異なるであろう。この観察は、ＡＡＶのキャプシドタンパク質が、組織特異性についての唯一の決定要素ではないことを示唆する。
【００８８】
ＡＡＶ−６が、ＡＡＶ−１とＡＡＶ−２のハイブリッドであることは明らかであるけれども、ＡＡＶ−６は、既に、ＡＡＶ−１もしくはＡＡＶ−２いずれとも違うことを表した。ＡＡＶ−６とＡＡＶ−２の間ではそれらの最初の４５０ヌクレオチドにおいて２ヌクレオチドの差異が存在する。ヌクレオチド５２２から３’末端までにヌクレオチドレベルにおいてＡＡＶ−６とＡＡＶ−１間に約１％の差異が存在する。また、ＡＡＶ−６とＡＡＶ−１間には全く違う領域（ヌクレオチド４４８６−４５９３）が存在する（図１Ａ−１Ｃ）。この領域は、ＡＡＶに関するいかなる既知タンパク質もコードしていない。これらのヌクレオチド配列における差異は、ＡＡＶ−６およびＡＡＶ−１が、ある進化をとおして、組み換えが起きた結果生じたことを示唆するであろう。その他の可能な説明は、まだ同定されていないＡＡＶ−１のその他の変異体が存在するということである。今まででは、いずれの可能性も除外する証拠はない。他のハイブリッド（ＡＡＶ−２対ＡＡＶ−４など）が天然に存在するかどうかは、まだ未知である。
【００８９】
ＡＡＶ−１のコーディング領域は、他の既知ＡＡＶ血清型との比較によって推定された。表１は、ＡＡＶ−１とＡＡＶ−６間のコーディング領域差異を具体的に説明している。アミノ酸残基は、ＡＡＶ−２にしたがって推定される。
【００９０】
ＡＡＶ−１のアミノ酸位置に関して、表１は、ＡＡＶ−６の対応するアミノ酸に変換されたＡＡＶ−１のアミノ酸を挙げる。ＡＡＶ−１のアミノ酸は、矢印の左に示される。照合は、ＡＡＶ−１Ｒｅｐ７８のアミノ酸配列の配列番号：５に対して、そしてＡＡＶ−１ＶＰ１のアミノ酸配列についての配列番号：１３に対して行うことができる。
【００９１】
【表１】
【００９２】
ＡＡＶ−１コーディング領域の配列が、位置４５２からコーディング領域の末端までのＡＡＶ−６のそれとほとんど同一（９９％）であることが分かったのは驚くべきことであった。ＡＡＶ−６の最初の５０８ヌクレオチドは、ＡＡＶ−２のそれらと同一であることが示されている［Ｒｕｔｌｅｄｇｅ、前出（１９９８）］。ＡＡＶ−６ゲノムの成分が、ＡＡＶ−２左ＩＴＲ−ＡＡＶ−２ｐ５プロモーター−ＡＡＶ−１コーディング領域−ＡＡＶ−１右ＩＴＲであると思われるので、ＡＡＶ−６は、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２間に天然に生じたハイブリッドであると結論された。
【００９３】
実施例４−ＡＡＶ−１に基づく遺伝子治療ベクター
ＡＡＶ−１ウイルスに基づく組み換え遺伝子伝達ベクターは、実施例１に記載の方法によって構築された。ＡＡＶ−１ビリオンおよびＡＡＶ−２ＩＴＲをもつハイブリッド組み換えウイルスを作成するために、ＡＡＶ−１ｔｒａｎｓプラスミド（ｐＡＶ１Ｈ）およびＡＡＶ−２ｃｉｓ−ｌａｃＺプラスミド（ＡＡＶ−２ＩＴＲをもつ）が使用された。ＡＡＶ−２ＩＴＲは、部位特異的組み込みを指図するその既知の能力にかんがみて、このベクターにおいて使用された。また、ｔｒａｎｓプラスミドとしてｐＡＶ１Ｈを用いて、ＣＭＶの即時型プロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子を担持するＡＡＶ−１ベクターが、この実験における使用のために構築された。
【００９４】
Ａ．イン・ビトロでのｒＡＡＶ−１ウイルスによる宿主細胞のトランスフェクション
８４−３１細胞、安定にＥ４／ＯＲＦ５を発現する２９３細胞（アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂを発現する）のサブクローンが、ｒＡＡＶ−１ＧＦＰもしくはｒＡＡＶ−ｌａｃＺにより感染された。ＧＦＰおよびｌａｃＺの高レベルの発現は、培養８４−３１細胞において検出された。これは、ｒＡＡＶ−１に基づくベクターが、感染能と発現レベルにおいてＡＡＶ−２に基づくベクターに非常に類似していることを示唆する。
【００９５】
Ｂ．イン・ビボでのｒＡＡＶ−１ウイルスによる細胞のトランスフェクション また、ＡＡＶ−１に基づくベクターの性能が、イン・ビボにおいて試験された。ｒＡＡＶ−１ＣＭＶ−α１ＡＴウイルスが、次のように構築された。ヒトα１−抗トリプシン（α１ＡＴ）ｃＤＮＡフラグメントを含有しているｐＡＴ８５（ＡＴＣＣ）のＥｃｏＲＩフラグメントが末端を平滑にされ、そしてＳｍａＩ部位においてＰＣＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローン化されてＰＣＲ−α１ＡＴを得た。ＣＭＶプロモーターは、ＸｂａＩ部位においてＰＣＲ−α１ＡＴ中にクローン化された。Ａｌｂ−α１ＡＴ発現カセットは、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩによって切り取られ、そしてＸｂａＩ部位においてｐＡＶ１Ｈ中にクローン化された。このベクタープラスミドが、下記の実験において使用されるＡＡＶ−１−ＣＭＶ−α１ＡＴウイルスを作成するために使用された。
【００９６】
ＡＡＶに対するヒト抗体をスクリーニングするために、精製ＡＡＶウイルスが、Ｒｉｐａバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．２、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ＳＤＳ、０．１５ＭＮａＣｌ）により溶解され、そして１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分離された。熱不活性化されたヒト血清が、このアッセイにおいて１〜１０００倍希釈において使用された。ｒＡＡＶ−１ＣＭＶ−α１ＡＴウイルスは、種々の用量において尾静脈注射によってＲａｇ−１マウス中に注射された。マウス血清中のヒトα１−抗トリプシンの濃度がＥＬＩＳＡを用いて測定された。コーティング抗体は、ウサギ抗ヒト・ヒトα１−抗トリプシン（Ｓｉｇｍａ）である。ヒツジ抗ヒトα１−抗トリプシン（Ｓｉｇｍａ）が、最初の検出抗体として使用された。このアッセイの感度は約０．３ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌである。マウス血液中のヒトα−抗トリプシンの発現は、非常に励みになるレベルにおいて検出することができる。この結果は表２に示される。
【００９７】
【表２】
【００９８】
ｒＡＡＶ−１ＣＭＶ−ｌａｃＺウイルスが、また、Ｃ５７ＢＬ６マウスの筋肉内に注射され、そして類似の結果が得られた。まとめれば、これらの結果は、ＡＡＶ−１に基づくベクターは、肝および筋両方の遺伝子送達のために適当であろうことを示唆した。
【００９９】
実施例５−ＡＡＶ−１に対する中和抗体
ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２に対する中和抗体（ＮＡＢ）の単純な定量的アッセイが、組み換えベクターを用いて開発された。総数３３の赤毛サルおよび７７の正常ヒト被験者がスクリーニングされた。
【０１００】
Ａ．非ヒト霊長類
野生で捕獲された幼少サルは、Ｃｏｎｖａｎｃｅ（Ａｌｉｃｅ，Ｔｅｘ．）およびＬＡＢＳ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ（Ｙｅｍａｓｓｅｅ，ＳＣ）から購入され、そして完全検疫下に維持された。サルは、体重約３〜４ｋｇであった。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙの研究プログラムにおいて使用された非ヒト霊長類は、米国において特定病原体フリーの閉鎖コロニーにおいて意図的に飼育される。すべての販売者は、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ａ級ディーラーである。したがって、赤毛サルは、結核因子、多数のサル・レンチウイルス（サル・免疫不全ウイルスおよびサル・レトロウイルス）およびサル科のヘルペスウイルスを含む、重要なサルの病原体で感染されていない。また、動物は、内部および外部寄生虫をもっていない。これらのプレミアム動物の優れた健康状態は、外部の変数についての可能性を最小にした。この研究では、血清が、すべてのプロトコールの開始前にサルから得られた。
【０１０１】
ＮＡＢタイターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するレポーターウイルス（ＡＡＶ１−ＧＦＰもしくはＡＡＶ２−ＧＦＰ）の８４−３１細胞への導入を阻害する血清抗体の能力を調査することによって分析された。３７℃で１時間レポーターウイルスとともにプレインキュベートされた種々の希釈の抗体が、９０％集密細胞培養物に添加された。細胞は、４８時間インキュベートされ、そして緑色血清タンパク質の発現が、ＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｉｎｇ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって測定された。ＮＡＢタイターは、５０％の細胞が緑色に染色されたもっとも高い希釈として計算された。
【０１０２】
赤毛サルにおけるＮＡＢの分析は、試験された動物の６１％がＡＡＶ−１についてポジティブであり；少数（２４％）がＡＡＶ−２に対するＮＡＢを有した。３分の１以上の動物が、ＡＡＶ−１に対する抗体を有したが、ＡＡＶ−２に対してはもたなかった（すなわち、ＡＡＶ−１に対して単一特異的であった）が、一方、動物は、ＡＡＶ−１に反応することなくＡＡＶ−２についてもポジティブではなかった。これらのデータは、ＡＡＶ−１が赤毛サルにおいて地方流行であるという仮説を支持する。ＡＡＶ−２に対するＡＡＶ−１応答の交差中和活性が除外できないので、この群の非ヒト霊長類における真のＡＡＶ−２感染の存在は、ほとんど明らかではない。両方をもつ動物におけるＡＡＶ−２ＮＡＢとＡＡＶ−１ＮＡＢ間に直線的関係が存在することは興味深い。
【０１０３】
Ｂ．ヒト
これらの中和抗体アッセイでは、ヒト血清サンプルが、補体を不活性化するために５６℃で３０分間インキュベートされ、次いで、ＤＭＥＭにおいて希釈された。ウイルス（ｌａｃＺもしくはＧＦＰいずれかをもつｒＡＡＶもしくはｒＡｄ）が、次に、各血清希釈液（２０Ｘ，４００Ｘ，２０００Ｘ，４０００Ｘなど）と混合され、そして３７℃で１時間インキュベートされ、その後９６穴プレートにおいて８４−３１細胞（ＡＡＶのために）もしくはＨｅｌａ細胞（アデノウイルスのために）の９０％集密培養に適用された。培養条件下でインキュベーション６０分後、２０％ＦＣＳを含有するさらなる培地１００μｌが添加されて、１０％ＦＣＳを含有する最終培養培地を作成した。
【０１０４】
結果は、表３において総括される。
【０１０５】
【表３】
【０１０６】
ＡＡＶに対する中和抗体の存在が、アデノウイルスに対する抗体についての指示にならないので、これらの３種のウイルスに対するヒト中和抗体は、無関係であるように見える。しかしながら、ＡＡＶは、ヘルパーウイルスとしてアデノウイルスを必要とし、ほとんどの場合において、ＡＡＶに対する中和抗体は、アデノウイルスに対する中和抗体の存在とは相関しなかった。スクリーニングされた７７ヒト血清サンプル中、４１％のサンプルは、Ａｄ５に基づく組み換えアデノウイルスの感染力を中和できる。血清サンプルの１５／７７（１９％）は、ｒＡＡＶ−１の導入を中和できるが、一方、サンプルの２０／７７（２０％）は、１対８０希釈以上においてｒＡＡＶ−２導入を阻害する。ＡＡＶ−１に対する中和抗体においてポジティブであるすべての血清サンプルは、また、ＡＡＶ−２についてもポジティブである。しかしながら、ｒＡＡＶ−１を中和することができない５つ（６％）のｒＡＡＶ−２ポジティブサンプルが存在する。また、中和抗体についてポジティブであるサンプルにおいて、抗体のタイターは、ポジティブなものの中で変化した。ＡＡＶに対する抗体についてヒト血清をスクリーニングすることから得た結果は、ＡＡＶ−１中和性ヒト血清が、ＡＡＶ−２の感染力もまた低下できるので、ＡＡＶ−１は、ＡＡＶ−２のそれと同じ抗原決定基を提示して細胞レポーターと相互作用するという結論を支持した。しかしながら、これらのＡＡＶについての中和抗体のプロフィルは同一ではなく、各ＡＡＶ血清型に対するさらなる特異的受容体が存在する。
【０１０７】
実施例６−組み換えＡＡＶウイルスは組織屈性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を示す
本発明の組み換えＡＡＶ−１ベクターおよび組み換えＡＡＶ−２ベクター［ヒトα１−抗トリプシン（ａ１ＡＴ）またはサイトメガロウイルスで増強されたβ−アクチンプロモーター（ＣＢ）からのマウス・エリトロポイエチン（Ｅｐｏ）］が、同じベクター遺伝子を含有しているＡＡＶ−２ベクターの当量コピーとの直接比較において評価された。
【０１０８】
ＡＡＶ−１キャプシドをもつ組み換えウイルスが、実施例１における技術を用いて構築された。ＡＡＶ−１ビリオンをもつｒＡＡＶを作成するためには、ｐＡＶ１Ｈもしくはｐ５Ｅ１８（２／１）が、ｔｒａｎｓプラスミドとして使用されて、ＲｅｐおよびＣａｐ機能が提供された。ＡＡＶ−２に基づくｒＡＡＶの作成では、ｐ５Ｅ１８（２／２）が、ｒＡＡＶ収量を大きく改善するので、それがｔｒａｎｓプラスミドとして使用された。［早期実験は、ｐＡＶ１Ｈおよびｐ５Ｅ１９（２／１）を用いて作成されたＡＡＶ−１ベクターの類似するイン・ビボ性能を示した。すべてのその後の研究は、収率を増大するので、ｐ５Ｅ１８（２／１）由来のＡＡＶ−１ベクターを使用した。］
当量のＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２ベクターの保存物が、免疫不全マウス中に、筋肉内（５ｘ１０10ゲノム）もしくは門脈循環を通して肝臓に（１ｘ１０11ゲノム）注射され、そして動物（４群）は、導入遺伝子の発現について３０日目に分析された。図４Ａおよび４Ｂ、参照。
【０１０９】
ＡＡＶ−２ベクターは、筋肉に較べて肝臓に注射された場合、１０〜５０倍以上の血清エリトロポイエチンもしくはα１−抗トリプシンを一貫して生産した。（しかしながら、ＡＡＶ−１で送達された遺伝子は、肝臓において許容しうる発現レベルを達成しなかった。）この結果は、ＡＡＶ−１ベクターについての結果とは非常に異なっていて、これによる筋肉発現は、肝臓発現と同等か、またはそれを超えていた。事実、ＡＡＶ−１は、ゲノムに基づいて当量タイターが投与された場合、筋肉においてＡＡＶ−２以上の働きをした。
【０１１０】
実施例７−ｒＡＡＶ−１を介する遺伝子送達
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週令オス、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が、ベクターの脾臓内注射後、肝臓へのＡＡＶに媒介される遺伝子伝達について解析された（すなわち、肝臓へのターゲティング）。ｒＡＡＶ−１もしくはｒＡＡＶ−２ベクターの全１０11ゲノム当量が、バッファー生理食塩水１００μｌにおいて循環中に注射された。最初のベクターは、いずれかＡＡＶ−１キャプシドもしくはＡＡＶ−２キャプシドを含有し、そしてニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーターの制御下でα１ＡＴを発現した。２８日目の血清が、ＡＡＶ−１もしくはＡＡＶ−２に対する抗体について分析され、そして血清α１ＡＴレベルがチェックされた。次いで、動物は、エリトロポイエチン（Ｅｐｏ、またＣＢプロモーターの制御下）を発現するＡＡＶ−１もしくはＡＡＶ−２構築物を注射された。１カ月後の血清が、Ｅｐｏの血清レベルについて分析された。次のグループが分析された（図５Ａ−５Ｄ）。
【０１１１】
グループ１では、ベクター１は、α１ＡＴを発現するＡＡＶ−２であり、そしてベクター２は、Ｅｐｏを発現するＡＡＶ−２であった。動物は、最初のベクター投与後にＡＡＶ−２に対する抗体を生成し、ＡＡＶ−２に基づくベクターの再投与を妨げた。ＡＡＶ−１に対する抗体を交差中和する証拠はなかった。
【０１１２】
グループ２では、ベクター１は、α１ＡＴを発現するＡＡＶ−１であり、一方、ベクター２は、Ｅｐｏを発現するＡＡＶ−１であった。最初のベクター投与は、１カ月目において、ＡＡＶ−１に対する中和抗体に対する抗体に関連する有意なα１ＡＴ発現をもたらさなかった。動物は、ＡＡＶ−１Ｅｐｏ発現性構築物により成功裏に再投与されなかった。
【０１１３】
グループ３では、ナイーブ動物に注射されたＥｐｏを発現するＡＡＶ−２ベクターの効力が測定された。動物は、ＰＢＳを注射され、そして２８日目にＡＡＶ−２Ｅｐｏベクターを注射され、そして１カ月後にＥｐｏ発現について分析された。中和抗体が２８日目に評価されたが、動物は、最初のベクター含むＰＢＳ注射を受けたので、期待したように何も見いだされなかった。このことは、ナイーブ動物では、ＡＡＶ−２は、１カ月後の高レベルの血清Ｅｐｏによって例証されるように、Ｅｐｏ遺伝子の伝達には非常に有効であることを示している。
【０１１４】
グループ４は、グループ３に類似する実験であって、ここでは、動物は、最初にベクター１についてのＰＢＳを受け、次いで、２８日後にＥｐｏを発現するＡＡＶ−１構築物を受けた。ベクター注射時点では、いずれかＡＡＶ−１もしくはＡＡＶ−２に対する抗体は、明らかに存在しなかった。ＡＡＶ−１に基づくベクターは、１カ月後に測定したときには、有意なＥｐｏの発現を生じることができた。
【０１１５】
グループ５は、最初のベクターが、α１ＡＴを発現するＡＡＶ−２であり、その後にＥｐｏを発現するＡＡＶ−１構築物が続く場合の交差実験である。期待されたように、動物は、２８日目における血液中の高レベルのタンパク質によって示されるように，α１ＡＴを発現するＡＡＶ−２ベクターにより有効に感染された。これは、ＡＡＶ−２に対する有意な中和抗体に関係している。重要なことは、第２のベクター投与に続く２８日目の血清中のＥｐｏの存在によって分かるように、動物は、ＡＡＶ−２ベクターに続いて成功裏にＡＡＶ−１を投与された。このベクター投与の時点では、高レベルＡＡＶ−２中和抗体が存在し、そしてＡＡＶ−１に対する交差反応は非常に低かった。Ｅｐｏのレベルは、少量の交差反応性のためにおそらく若干減少された。グループ６は、最初のベクターはＡＡＶ−１に基づき、一方、第２の実験は、ＡＡＶ−２に基づいた逆の交差実験であった。ＡＡＶ−１ベクターは、α１ＡＴの有意な遺伝子発現をもたらし、これがまた、高レベルＡＡＶ−１中和抗体をもたらした。動物は、高レベルＥｐｏによって証明されるように、最初のＡＡＶ−１ベクターに続いて、非常に効率的にＡＡＶ−２を投与された。
【０１１６】
実質的に同じ実験が、筋肉において実施され、５ｘ１０10ゲノムが、筋肉に対向される遺伝子治療のモデルとして、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの前脛骨筋中に注射された。結果は図６Ａ−６Ｄに示され、そして本質的に肝臓についてと同じである。
【０１１７】
総括すれば、この実験は、予め存在するＡＡＶ−２に対する抗体を有するか、または最初にＡＡＶ−２ベクターを受け、そして再投与を要する患者におけるＡＡＶ−１ベクターを使用することの効用を例証している。
【０１１８】
実施例８−ＡＡＶ−１ＩＴＲを含有する組み換えウイルスの構築
この実験は、本発明のＡＡＶ−１ＩＴＲを含有する組み換えＡＡＶベクターの構築を具体的に説明する。
【０１１９】
ＡＡＶ−１ｃｉｓプラスミドは、次のように構築される。ＡＡＶ−１５’ＩＴＲを含有する１６０ｂｐＸｈｏ−ＮｒｕＩＡＡＶ−１フラグメントが、ｐＡＶ１−ＢＬから得られた。ｐＡＶ１−ＢＬは、実施例１記載のように作成された。Ｘｈｏ−ＮｒｕＩフラグメントは、次に、ＸｂａＩ部位において第２のｐＡＶ１−ＢＬプラスミド中にクローン化されて、２つのＡＡＶ−１ＩＴＲをもつプラスミドが提供される。次いで、所望の導入遺伝子が、ＮｒｕＩとＢａｍＨＩ部位において改変ｐＡＶ１−ＢＬ中にクローン化され、ＡＡＶ−１ＩＴＲ配列の間に位置する。得られるＡＡＶ−１ｃｉｓプラスミドは、導入遺伝子に隣接するＡＡＶ−１ＩＴＲを含有し、そして機能性ＡＡＶ−１ｒｅｐおよびｃａｐを欠如する。
【０１２０】
組み換えＡＡＶは、２９３細胞中に３種のプラスミドを同時にトランスフェクションすることによって作成される。これらは、上記ＡＡＶ−１ｃｉｓプラスミド；ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ機能を与え、そしてＡＡＶＩＴＲを欠如するｔｒａｎｓプラスミド；およびアデノウイルスヘルパー機能を与えるプラスミドを含む。ｒｅｐおよび／またはｃａｐ機能は、意図されるレシピエントの免疫プロフィルに応じて、ＡＡＶ−１もしくはその他のＡＡＶ血清型によってｔｒａｎｓにおいて提供されてもよい。あるいはまた、ｒｅｐまたはｃａｐ機能は、再び患者の免疫プロフィルに応じて、ＡＡＶ−１もしくはその他の血清型によってｃｉｓにおいて提供されてもよい。
【０１２１】
典型的なコ・トランスフェクションでは、ＤＮＡ（１：１：２の比におけるｃｉｓ：ｔｒａｎｓ：ヘルパー）５０μｇが、１５ｃｍ組織培養皿上にトランスフェクションされる。細胞が、トランスフェクション後９６時間に収穫され、音波処理され、そして０．５％デオキシコール酸ナトリウムで処理（３７℃１０分間）される。次いで、細胞溶解液が、セシウム濃度勾配の２〜３回の超遠心にかけられる。ｒＡＡＶを含有するピーク画分が回収され、プールされ、そしてＰＢＳに対して透析される。典型的な収量は、１ｘ１０13ゲノム。／１０9細胞である。
【０１２２】
この方法を用いて、ＡＡＶ−１キャプシドをもつ、導入遺伝子に隣接するＡＡＶ−１ＩＴＲを含有する１種の組み換えウイルス構築物が調製される。そＡＡＶ−２キャプシドをもつ、導入遺伝子に隣接するＡＡＶ−１ＩＴＲを含有するその他の組み換えウイルス構築物が調製される。
【０１２３】
本明細書に引用されたすべての公表物は、引用によって本明細書に組み入れられている。本発明は、特に好適な実施態様に関して記述されたけれども、本発明の精神から逸脱することなく、改変が作成できることは理解されるであろう。そのような改変は、本特許請求の範囲内にはいることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ−１Ｃ】 ＡＡＶ−１［配列番号：１］、ＡＡＶ−２［配列番号：１８］およびＡＡＶ−６［配列番号：１９］のヌクレオチドの整列を示す。
【図２】 ＡＡＶ−１ ＩＴＲの予想される２次構造を示す。
【図３Ａ】 ＡＡＶ−６が、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２間の相同的組み換えからいかにして生じるの仮説を示す。
【図３Ｂ】 ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６中の７１ｂｐ相同領域の詳細な図示である。
【図４Ａ】 組み換えＡＡＶ−１および組み換えＡＡＶ−２ウイルスを介するｈＡＡＴの送達に続く、血清中のヒトα１抗トリプシン（α１ＡＴ）の発現レベルを示すバーチャートである。
【図４Ｂ】 組み換えＡＡＶ−１および組み換えＡＡＶ−２ウイルスを介するエリトロポイエチン（ｅｐｏ）遺伝子の送達に続く、血清中のｅｐｏの発現レベルを示すバーチャートである。
【図５Ａ】 実施例７に記述されるようにα１ＡＴの送達に続く、肝臓中のα１ＡＴの発現レベルを示すバーチャートである。
【図５Ｂ】 実施例７に記述されるようにｅｐｏの送達に続く、肝臓中のｅｐｏの発現レベルを示すバーチャートである。
【図５Ｃ】 実施例７に記述されるように肝臓へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−１に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【図５Ｄ】 実施例７に記述されるように肝臓へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−２に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【図６Ａ】 実施例７に記述されるようにα１ＡＴの送達に続く、筋肉中のα１ＡＴの発現レベルを示すバーチャートである。
【図６Ｂ】 実施例７に記述されるようにｅｐｏの送達に続く、筋肉中のｅｐｏの発現レベルを示すバーチャートである。
【図６Ｃ】 実施例７に記述されるように筋肉へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−１に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【図６Ｄ】 実施例７に記述されるように筋肉へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−２に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【配列表】
本研究は、国立保健研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の補助金Ｎｏ．Ｐ３０ ＤＫ４７７５７−０６およびＰＯ１ ＨＤ３２６４９−０４によって援助された。米国政府は、本発明におけるある種の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に、ウイルスベクター、そしてより特別には、遺伝子送達のために有用な組み換えウイルスベクターに関する。
【０００３】
発明の背景
アデノ随伴ウイルスは、小さい一本鎖ＤＮＡウイルスであり、有効な複製を可能にするためにヘルパーウイルスを必要とする［Ｋ．Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，ｐ．１００７−１０４１，ｉｎ Ｆ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，ｖｏｌ．２，（Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）（１９９５）］。ＡＡＶの４．７ｋｂゲノムは、２つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）、およびそれぞれＲｅｐタンパク質およびＣａｐタンパク質をコードしている２つの読み枠を特徴とする。Ｒｅｐ読み枠は、分子量７８ｋＤ，６８ｋＤ，５２ｋＤおよび４０ｋＤの４種のタンパク質をコードしている。これらのタンパク質は、主として、ＡＡＶ複製および宿主細胞染色体へのＡＡＶの組み込みの調節において機能している。Ｃａｐ読み枠は、分子量８５ｋＤ（ＶＰ１），７２ｋＤ（ＶＰ２）および６１ｋＤ（ＶＰ３）の３種の構造タンパク質をコードしている［Ｂｅｒｎｓ、前出］。ＡＡＶビリオンにおける全タンパク質の８０％以上がＶＰ３である。２つのＩＴＲは、ＡＡＶ複製、パッケージングおよび組み込みのために必須のｃｉｓ要素のみである。ＡＡＶ ＩＴＲには「フリップ」および「フロップ」と呼ばれる２つのコンホメーションが存在する。コンホメーションにおけるこれらの違いは、ＩＴＲを使用して複製を開始および再開始するアデノ随伴ウイルスの複製モデルから生じる［Ｒ．Ｏ．Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：６０９６−６１０４（１９９３）；Ｋ．Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５４：３１６−３２９（１９９０）］。
【０００４】
ＡＡＶは、霊長類、イヌ、鳥類およびヒトを含む、多くの動物種において発見された［Ｆ．Ａ．Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｓｉｘｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ”，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｖｉｅｎｎａ（１９９５）］。５種の既知霊長類ＡＡＶ（ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−５）に加えて、また、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２に密接に関連するその他の血清型が単離された［Ｅ．Ａ．Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：３０９−３１９（１９９８）］。すべての既知ＡＡＶ血清型の中で、ＡＡＶ−２は、その感染性クローンが最初に作られたので、多分、最もよく特徴付けられた血清型である［Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９：２０７７−２０８１（１９８２）］。続いて、また、ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−６が決定された［Ｒｕｔｌｅｄｇｅ，前出；Ｊ．Ａ．Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：６８２３−６８３３（１９９７）；Ｓ．Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，２２１：２０８−２１７（１９９６）］。一般に、すべてのＡＡＶは、ヌクレオチド配列において８０％以上の相同性を共有している。
【０００５】
多数のユニークな性質が、ＡＡＶをしてヒト遺伝子治療のための有望なベクターにさせる［Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：９７−１２９（１９９２）］。他のウイルスベクターとは異なり、ＡＡＶは、いかなる既知のヒトの病気にも関連していないことが分かっており、そして一般に、病原性ではないと考えられる。野生型ＡＡＶは、部位特異的様式で宿主染色体中に組み込むことができる［Ｒ．Ｍ．Ｋｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２１１−２２１５（１９９０）−Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０（１２）：３９４１−３９５０（１９９１）］。ｒｅｐタンパク質がｔｒａｎｓにおいて供給される場合は、組み換えＡＡＶベクターは、染色体１９において組織培養細胞中に組み込むことができる［Ｃ．Ｂａｌａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：３２９９−３３０６（１９９７）；Ｒ．Ｔ．Ｓｕｒｏｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：７９５１−７９５９（１９９７）］。ＡＡＶの組み込まれたゲノムは、筋肉、肝臓および脳を含む多くの組織において長期の遺伝子発現を可能にすることが分かった［Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，３（３）：３０６−３１２（１９９７）；Ｒ．Ｏ．Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６：２７０−２７６（１９９７）；Ｘ．Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１４４：１１３−１２４（１９９７）；Ｘｉａｏ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０（１１）：８０９８−−８１０８（１９９６）］。
【０００６】
ＡＡＶ−２は、ヒト集団の約８０−９０％において存在することが分かっている。より早期の研究は、ＡＡＶ−２に対する中和抗体が伝播していることを示した［Ｗ．Ｐ．Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２：７１６−７２２（１９７０）］。そのような抗体の存在は、その他のメリットにもかかわらず、ＡＡＶ−２に基づくＡＡＶベクターの有用性を有意に減少するであろう。当該技術分野において必要とされるものは、中和抗体の存在を含む不利益なしに、上記のことを含むＡＡＶ−２の利点を特徴とするベクターである。
【０００７】
発明の概要
１つの態様では、本発明は、配列番号：１、配列番号：１に相補的な鎖、ならびに配列番号：１およびその相補鎖に相補的なｃＤＮＡおよびＲＮＡの中から選ばれる単離されたＡＡＶ−１核酸分子を提供する。
【０００８】
その他の態様では、本発明は、５’ＩＴＲ配列、配列番号：１のｎｔ１〜１４３；３’ＩＴＲ配列、配列番号：１のｎｔ４５７６〜４７１８、およびそれらのフラグメントを含む、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を提供する。
【０００９】
なおその他の態様では、本発明は、ＡＡＶ−１ＩＴＲおよび選ばれた導入遺伝子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を含んでなる組み換えベクターを提供する。好ましくは、ベクターは、両５’および３’ＡＡＶ−１ＩＴＲを含有し、これらの間に選ばれた導入遺伝子が位置する。
【００１０】
なおその他の態様では、本発明は、配列番号：１のｎｔ２３６〜２９９の配列もしくはその機能性フラグメントをもつＡＡＶ−１Ｐ５プロモーターを含んでなる組み換えベクターを提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、ＡＡＶ−１ｒｅｐコーディング領域およびＡＡＶ−１ｃａｐコーディング領域をコードしている核酸分子を提供する。
【００１２】
なおその他の態様では、本発明は、本発明の組み換えウイルスベクターにより形質導入された宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、本発明のＡＡＶ−１Ｐ５プロモーターにより安定に形質導入された宿主細胞を提供する。
【００１３】
なおさらなる態様では、本発明は、キャリヤーおよび本発明のベクターを含んでなる製薬組成物を提供する。
【００１４】
なおその他の態様では、本発明は、その発現を指図する配列の制御下に選ばれた導入遺伝子およびアデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ−１）ビリオンを含んでなる組み換えウイルスベクターを選ばれた宿主に送達する段階を伴う、宿主への導入遺伝子のＡＡＶに媒介される送達方法を提供する。
【００１５】
その他の態様では、本発明は、本発明のベクターを用いる選ばれた遺伝子産物のイン・ビトロでの生産方法を提供する。
【００１６】
本発明の他の態様および利点は、本発明の詳細な記述より当業者には容易に明らかになるであろう。
【００１７】
図面の簡単な説明
図１Ａ−１Ｃは、ＡＡＶ−１［配列番号：１］、ＡＡＶ−２［配列番号：１８］およびＡＡＶ−６［配列番号：１９］のヌクレオチドの整列を示す。整列は、Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒ６．０を用いて実施された。ＡＡＶ−１の完全配列は、上の列に示される。ＡＡＶ−１と同一なＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６におけるヌクレオチドは、「・」の記号で表され、そしてギャップは、「−」で表される。ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−６の３’ＩＴＲは、異なる方向で示されることに注目。
【００１８】
図２は、ＡＡＶ−１ ＩＴＲの予想される２次構造を示す。ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６におけるヌクレオチドは、それぞれイタリックおよび太字で示される。
【００１９】
図３Ａは、ＡＡＶ−６が、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２間の相同的組み換えからいかにして生じるの仮説を示す。ＡＡＶ−１の主要素は、グラフにおいて指示される。ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６の間で共有される領域は、波線による四角で示される。
【００２０】
図３Ｂは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６中の７１ｂｐ相同領域の詳細な図示である。これらの血清型において異なるヌクレオチドは矢印によって指示される。
【００２１】
図４Ａは、組み換えＡＡＶ−１および組み換えＡＡＶ−２ウイルスを介するｈＡＡＴの送達に続く、血清中のヒトα１抗トリプシン（α１ＡＴ）の発現レベルを示すバーチャートである。
【００２２】
図４Ｂは、組み換えＡＡＶ−１および組み換えＡＡＶ−２ウイルスを介するエリトロポイエチン（ｅｐｏ）遺伝子の送達に続く、血清中のｅｐｏの発現レベルを示すバーチャートである。
【００２３】
図５Ａは、実施例７に記述されるようにα１ＡＴの送達に続く、肝臓中のα１ＡＴの発現レベルを示すバーチャートである。
【００２４】
図５Ｂは、実施例７に記述されるようにｅｐｏの送達に続く、肝臓中のｅｐｏの発現レベルを示すバーチャートである。
【００２５】
図５Ｃは、実施例７に記述されるように肝臓へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−１に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【００２６】
図５Ｄは、実施例７に記述されるように肝臓へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−２に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【００２７】
図６Ａは、実施例７に記述されるようにα１ＡＴの送達に続く、筋肉中のα１ＡＴの発現レベルを示すバーチャートである。
【００２８】
図６Ｂは、実施例７に記述されるようにｅｐｏの送達に続く、筋肉中のｅｐｏの発現レベルを示すバーチャートである。
【００２９】
図６Ｃは、実施例７に記述されるように筋肉へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−１に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【００３０】
図６Ｄは、実施例７に記述されるように筋肉へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−２に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【００３１】
発明の詳細な記述
本発明は、血清型１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ−１）についての新規な核酸配列を提供する。また、これらのＡＡＶ−１配列のフラグメントが提供される。中でも特に望ましいＡＡＶ−１フラグメントは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、ｒｅｐおよびｃａｐである。これらのフラグメントの各々は、種々のベクター系および宿主細胞において、例えばカセットとして容易に利用することができる。そのようなフラグメントは、それのみで、他のＡＡＶ−１配列もしくはフラグメントと組み合わせて、または他のＡＡＶもしくは非ＡＡＶウイルス配列からの要素と組み合わせて使用することができる。１つの特定の望ましい実施態様では、カセットは、選ばれた導入遺伝子に隣接する本発明のＡＡＶ−１ ＩＴＲを含有してもよい。その他の望ましい実施態様では、カセットは、例えば、組み換え（ｒＡＡＶ）ウイルスの作成における使用のために、ＡＡＶ−１ｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質を含有してもよい。
【００３２】
かくして、ＡＡＶ−１配列およびそのフラグメントは、ｒＡＡＶの作成において有用であり、そしてまたアンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクターもしくはワクチンベクターとして有用である。さらに、本発明は、核酸分子、遺伝子送達ベクター、および本発明のＡＡＶ−１配列を含有する宿主細胞を提供する。また、ＡＡＶベクターを用いる遺伝子送達の新規方法が提供される。
【００３３】
本明細書に記述されるように、本発明のＡＡＶ−１キャプシドタンパク質を含有する本発明のベクターは、中和抗体が、他のＡＡＶ血清型に基づくベクター、ならびに他のウイルスベクターの有効性を減少させる場合の応用における使用のために、特に良好に適合される。本発明のｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ再投与および反復遺伝子治療において特に有利である。
【００３４】
本発明のこれらおよび他の実施態様および利点は、より詳細に以下に記述される。本明細書および請求項を通して使用されるように、用語「含有する」は、他の成分、要素、完全体、段階およびそれに類するものを含めている。
【００３５】
１．ＡＡＶ−１核酸およびタンパク質配列
本発明のＡＡＶ−１核酸配列は、配列番号：１のＤＮＡ配列（図１Ａ−１Ｃ）を含み、これは４７１８ヌクレオチドからなる。さらに、本発明のＡＡＶ−１核酸配列は、配列番号：１に相補的である鎖、ならびに配列番号：１およびその相補鎖に対応するＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列を包含する。また、本発明の核酸配列には、配列番号：１およびその相補鎖の天然の変異体および工学的改変体も含まれる。そのような改変は、例えば、当該技術分野において既知である標識、メチル化、および１個以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体による置換を含む。
【００３６】
さらに、本発明には、配列番号：１に８５％超、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、もっとも好ましくは少なくとも約９８−９９％同一性もしくは相同性である核酸配列が含まれる。核酸配列の文脈中、用語「パーセント配列同一性」もしくは［同一性の」は、最大の対応のために整列された場合に、同じである２配列における残基を指す。配列同一性比較の長さは、全長配列、または少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０−２４ヌクレオチド、少なくとも約２８−３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドにおけるフラグメントにわたっていてもよい。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用できる、当該技術分野において既知の多数の異なる計算法が存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Ｆａｓｔａ，ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａは、疑問および検索配列間において最良のオーバーラップ領域の整列およびパーセント配列同一性を提供する（本明細書に引用によって組み入れられている、Ｐｅｒｓｏｎ，１９９０）。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、Ｆａｓｔａを用いて、引用によって本明細書に組み入れられている、ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１において提供されるようなそのデフォルトパラメーター（ワードサイズ６およびスコアマトリックスのためのＮＯＰＡＭファクター）によって決定することができる。
【００３７】
核酸もしくはそのフラグメントに言及する場合、用語「実質的相同性」もしくは「実質的類似性」は、適当なヌクレオチド挿入もしくは欠失に関してその他の核酸（もしくはその相補鎖）と最適に整列された場合、配列の少なくとも約９５−９９％においてヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。
【００３８】
また、配列番号：１のフラグメント、その相補鎖、それに相補的なｃＤＮＡおよびＲＮＡが、本発明内に含まれる。適当なフラグメントは、長さ少なくとも１５ヌクレオチドであり、そして生物学的な興味のある機能性フラグメントを包含する。これらのフラグメントあるものは、図１Ａ−１Ｃを参照して同定することができる。特に望ましい機能性フラグメントの例は、本発明のＡＡＶ−１逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３およびＡＡＶ−４の１４５ｎｔＩＴＲに対して、ＡＡＶ−１ＩＴＲは、１４３ヌクレオチドのみからなることが分かっていて、なお有利には、ＡＡＶ−２ＩＴＲの、部位特異的組み込み指図する能力に関与すると考えられているＴ型ヘアピン構造を特徴とする。さらに、ＡＡＶ−１は、５’および３’ＩＴＲが同一であるという点で、他のＡＡＶ血清型の中でもユニークである。ＡＡＶ−１の全長５’ＩＴＲ配列は、配列番号：１のヌクレオチド１〜１４３（図１Ａ）において提供され、そしてＡＡＶ−１の全長３’ＩＴＲ配列は、配列番号：１のｎｔ４５７６〜４７１８（図１Ｃ）において提供される。当業者は、全長未満の５’および／または３’ＩＴＲ配列を種々の目的のために容易に利用することができ、そして例えばＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１３５−１４３（１９８３）においてＡＡＶ−２ＩＴＲについて記述されているように、慣用の技術を用いて改変ＩＴＲを構築することができる。
【００３９】
ＡＡＶ−１ゲノムのその他の望ましい機能性フラグメントは、決定的な調節要素および機能を維持しながら、ＡＡＶ Ｐ５プロモーター中にユニークな配列をもつＡＡＶ−１のＰ５プロモーターである。このプロモーターは、配列番号：１のｎｔ２３６〜２９９（図１Ａ）内に位置している。興味ある機能性フラグメントの他の例は、ｒｅｐ／ｃａｐの結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）における配列、例えば、ｎｔ２３０６−２２２３にわたる配列、ならびにこの結合のいずれかの側に５０ヌクレオチドを含有してもよいこの結合を包含するより大きいフラグメントを含む。なお他の機能性フラグメントの例は、ｒｅｐタンパク質をコードしている配列を含む。Ｒｅｐ７８は、配列番号：１のｎｔ３３４−２３０６の領域に位置し；Ｒｅｐ６８は、ｎｔ３３４−２２７２の領域に位置し、そして配列番号：１のｎｔ１９２４−２２２０にわたるイントロンを含有する。Ｒｅｐ５２は、配列番号：１のｎｔ１００７−２３０４の領域に位置し；ｒｅｐ４０は、ｎｔ１００７−２２７２の領域に位置し、そして配列番号：１のｎｔ１９２４−２２４６にわたるイントロンを含有する。また、キャプシドタンパク質、ＶＰ１［配列番号：１のｎｔ２２２３−４４３１］、ＶＰ２［配列番号：１のｎｔ２６３４−４４３２］およびＶＰ３［配列番号：１のｎｔ２８２９−４４３２］をコードしている配列も興味深い。興味ある他のフラグメントは、ＡＡＶ−１Ｐ１９配列、ＡＡＶ−１Ｐ４０配列、ｒｅｐ結合部位、および末端分離（ｒｅｓｏｌｕｔｅ）部位（ＴＲＳ）を含んでもよい。
【００４０】
さらに、本発明は、本発明のＡＡＶ−１核酸によってコードされているタンパク質およびそのフラグメントを提供する。特に望ましいタンパク質は、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質であって、これらは先に特定されたヌクレオチド配列によってコードされている。これらのタンパク質は、ｒｅｐ７８［配列番号：５］、ｒｅｐ６８［配列番号：７］、ｒｅｐ５２［配列番号：９］、ｒｅｐ４０［配列番号：１１］、ｖｐ１［配列番号：１３］、ｖｐ２［配列番号：１５］およびｖｐ３［配列番号：１７］、およびそれらの機能性フラグメントを含み、一方、ｒｅｐおよびｃａｐタンパク質の配列は、ＡＡＶ−６のそれらと密接に関係していることが分かっているが、アミノ酸配列における差異（下記表１参照）、ならびに免疫系によるこれらのタンパク質の認識における差異が存在する。しかしながら、当業者は、生物学的興味のある他の適当なタンパク質もしくはタンパク質フラグメントを容易に選択するであろう。適当には、そのようなフラグメントは、長さ少なくとも８アミノ酸である。しかしながら、他の所望の長さのフラグメントも、容易に利用できる。そのようなフラグメントは、組み換え的に、または他の適当な手段、例えば化学合成によって作成されてもよい。
【００４１】
本発明の配列、タンパク質およびフラグメントは、組み換え体作成、化学合成もしくは他の合成手段を含む、いかなる適当な手段によって作成されてもよい。そのような作成方法は、当業者の知識内に存在し、そして本発明を限定するものではない。
【００４２】
ＩＩ．ウイルスベクター
その他の態様では、本発明は、標的細胞への異種遺伝子もしくは他の核酸配列の送達のための、フラグメントを含む本発明のＡＡＶ−１配列を利用するベクターを提供する。適当には、これらの異種配列（すなわち導入遺伝子）は、標的細胞において発現されることが可能であるタンパク質もしくは遺伝子産物をコードしている。そのような導入遺伝子は、「ミニジーン（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）」の形態で構築されてもよい。そのような「ミニジーン」は、宿主細胞においてその遺伝子を転写し、そして遺伝子産物を発現するのに必要な選ばれた異種配列および他の調節要素を含む。かくして、遺伝子配列は、それらの転写を許す様式で調節成分に操作可能に結合される。そのような成分は、ウイルスベクターを含有する細胞において導入遺伝子の発現を推進するのに必要な通常の調節要素を含む。また、ミニジーンは、導入遺伝子に結合され、そして他の調節要素とともに、組み換えベクターの選ばれたウイルス配列内に位置する選ばれたプロモーターを含有してもよい。
【００４３】
プロモーターの選択は、日常的な問題であり、そして本発明を限定するものではない。有用なプロモーターは、構成的プロモーターもしくは調節される（誘導性）プロモーターであってもよく、これは、発現されるべき導入遺伝子の時期および量の制御を可能にする。例えば、望ましいプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時型プロモーター［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）参照］、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲプロモーター／エンハンサー、およびニワトリ細胞質β−アクチンプロモーター［Ｔ．Ａ．ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１（２３）：８２８７（１９８３）］を含む。なお他の望ましいプロモーターは、アルブミンプロモーターおよびＡＡＶ Ｐ５プロモーターである。場合によっては、選ばれたプロモーターは、異種のエンハンサーとの結合において使用される、例えば、β−アクチンプロモーターが、ＣＭＶエンハンサーと結合されて使用されてもよい。まだ他の適当なまたは望ましいプロモーターおよびエンハンサーは、当業者によって選択することができる。
【００４４】
また、ミニジーンは、好ましくは、転写物の有効なポリアデニル化（ポリＡもしくはｐＡ）のために要求されるシグナルならびに機能的スプライスドナーおよびアクセプター部位をもつイントロンを提供する配列を含む、ウイルスベクター配列に対して異種の核酸配列を含有してもよい。本発明の代表的なベクターにおいて使用される共通のポリＡ配列は、パポーバウイルスＳＶ−４０由来のものである。ポリＡ配列は、一般に、導入遺伝子配列の下流でウイルスベクター配列の上流のミニジーン中に挿入される。また、共通のイントロン配列は、ＳＶ−４０から得られ、そしてＳＶ４０Ｔイントロン配列として言及される。また、本発明のミニジーンは、望ましくは、プロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子間に位置するようなイントロンを含有してもよい。これらおよび他の共通のベクター要素の選択は慣例的であり［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ ｅｄｉｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）および本明細書に引用される文献、参照］、そして多くのそのような配列が、商業的および工業的起源ならびにＧｅｎｅｂａｎｋから得ることができる。
【００４５】
導入遺伝子の選択は、本発明を限定するものではない。適当な導入遺伝子は、望ましいリポーター遺伝子、治療遺伝子、および場合によっては、免疫原性ポリペプチドをコードしている遺伝子の中から容易に選ぶことができる。適当なリポーター遺伝子の例は、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、アルカリホスファターゼ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む。治療遺伝子の例は、なかんずくサイトカイン、成長因子、ホルモンおよび分化因子を含む。導入遺伝子は、当業者によって容易に選択することができる。例えば、他の適当な導入遺伝子を特定しているＷＯ９８／０９６５７を参照。
【００４６】
適当には、本発明のベクターは、最小でも、ＡＡＶ−１配列のフラグメントおよびタンパク質からなるカセットを含有する。１つの実施態様では、本発明のベクターは、少なくとも１つが本発明のＡＡＶ−１ＩＴＲである、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲによって隣接される選ばれた導入遺伝子を含有する。適当には、本発明のベクターは、本発明のＡＡＶ−１Ｐ５プロモーターを含有してもよい。なおその他の実施態様では、本発明のプラスミドもしくはベクターは、ＡＡＶ−１ｒｅｐ配列を含有する。なおその他の実施態様では、本発明のプラスミドもしくはベクターは、本発明の少なくとも１つのＡＡＶ−１ｃａｐタンパク質を含有する。もっとも適当には、これらのＡＡＶ−１由来のベクターは、本明細書に記述されるように、ウイルスベクター中に組み立てられる。
【００４７】
Ａ．ＡＡＶウイルスベクター
１つの態様では、本発明は、本発明のＡＡＶ−１キャプシドタンパク質を用いて作成される組み換えＡＡＶ−１ウイルスベクターを提供する。本発明のパッケージされたｒＡＡＶ−１ビリオンは、選ばれたミニジーンに加えて、他のＡＡＶ−１配列を含有してもよく、または他のＡＡＶ血清型からの配列を含有してもよい。
【００４８】
ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、そして適当な方法の選択は、本発明を限定するものではない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｏｌ．，７０：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，７４５号、参照。１つの適当な方法では、選ばれた宿主細胞は、ｒｅｐタンパク質をコードしているＡＡＶ配列、ＡＡＶｃａｐタンパク質をコードしている遺伝子、およびパッケージングとそれに続く送達のための配列を与えられる。望ましくは、その方法は、本発明のＡＡＶ−１ｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質をコードしている配列を利用する。
【００４９】
１つの実施態様では、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子および送達のための配列は、これらの遺伝子および配列を担持しているベクターのコ・トランスフェクションによって与えられる。１つの現在好適な実施態様では、ｃｉｓ（ベクター）プラスミド、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有しているｔｒａｎｓプラスミド、およびアデノウイルスヘルパー遺伝子を含有しているプラスミドが、適当な細胞系、例えば２９３中にコ・トランスフェクションされる。あるいはまた、これらの機能の１つ以上が、別々のベクターを介してｔｒａｎｓで供給されてもよく、または適当に工作されたパッケージング細胞系において見いだされてもよい。
【００５０】
代表的なｃｉｓプラスミドは、５’から３’の順で、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、選ばれた導入遺伝子およびＡＡＶ３’ＩＴＲを含有できる。１つの望ましい実施態様では、少なくとも１つのＡＡＶＩＴＲは１４３ｎｔＡＡＶ−１ＩＴＲである。しかしながら、他のＡＡＶ血清型ＩＴＲも容易に選択することができる。適当には、全長ＩＴＲが利用される。しかしながら、当業者は、慣用の技術を用いて改変されたＡＡＶＩＴＲを容易に作成することができる。同様に、そのようなプラスミドの構築方法も当業者には周知である。
【００５１】
ｒＡＡＶ−１ビリオン粒子の作成における使用のためのｔｒａｎｓプラスミドは、既知の技術にしたがって作成されてもよい。１つの望ましい実施態様では、このプラスミドは、ＡＡＶ−１のｒｅｐおよびｃａｐタンパク質、またはその機能性フラグメントを含有する。あるいはまた、ｒｅｐ配列は、その他の選ばれたＡＡＶ血清型由来であってもよい。
【００５２】
次に、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓプラスミドは、野生型ヘルパーウイルス（例えば、Ａｄ２，Ａｄ５もしくはヘルペスウイルス）か、またはより望ましくは、複製能欠損アデノウイルスとともに、選ばれた宿主細胞中にコ・トランスフェクションされてもよい。あるいはまた、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓプラスミドは、必要なヘルパー機能を備えているトランスフェクションされるプラスミドと一緒に、選ばれた宿主細胞中にコ・トランスフェクションされてもよい。適当な宿主細胞の選択は、当業者には周知であり、そしてなかんずく、２９３細胞、Ｈｅｌａ細胞のような哺乳類細胞を含む。
【００５３】
あるいはまた、ｃｉｓプラスミドおよび場合によってはｔｒａｎｓプラスミドは、本発明の所望のＡＡＶ−１配列を含有しているｒＡＡＶの産生に必要な残留ヘルパー機能を備えているパッケージング細胞系中にトランスフェクションされてもよい。適当なパッケージング細胞系の例は、ＡＡＶ−２キャプシドが所望される場合は、相同Ｐ５プロモーターの調節下でＡＡＶ−２ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を安定に発現するＢ−５０である。この細胞系は、コンカテマー（ｃｏｎｃａｔｏｍｅｒ）形態におけるＰ５−ｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子カセットの多数コピー（少なくとも５コピー）の細胞染色体中への組み込みを特徴とする。このＢ−５０細胞系は、ブダペスト条約の約定に従って、寄託番号ＣＲＬ−１２４０１の下、１９９７年９月１８日に、アメリカン タイプ カルチャー コレクション、１０８０１ ユニバーシティ ブールバード、マナサス、バージニア ２０１１０−２２０９（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９）に寄託された。しかしながら、本発明は、パッケージング細胞系の選択に関して限定されるものではない。
【００５４】
ＡＡＶ−１キャプシドタンパク質に基づく代表的な導入ベクターは、実施例４においてより詳細に記述されるように、両イン・ビボおよびイン・ビトロで試験された。これらの研究では、ＡＡＶ−１ビリオンをもつ組み換えＡＡＶベクターが、両マウス肝臓および筋肉に導入できることが例証された。多数のヒト集団において存在しているＡＡＶ−１の中和抗体は、他のＡＡＶ血清型とは異なるパターンを示し、したがってＡＡＶ−１ビリオンを中和しないので、当業者によって作成できるこれら、および他のＡＡＶ−１に基づく遺伝子治療ベクターは、選ばれた宿主細胞および遺伝子治療患者への遺伝子送達のために有益である。当業者は、当業者には既知の種々の技術を用いて、ここに提供されるＡＡＶ−１キャプシドタンパク質を含有している他のｒＡＡＶウイルスベクターを容易に作成することができる。なお、ＡＡＶ−１配列およびその他の血清型のＡＡＶキャプシドを含有する他のｒＡＡＶウイルスベクターも、同様に作成することができる。
【００５５】
Ｂ．他のウイルスベクター
当業者は、本発明のＡＡＶ−１配列が、イン・ビトロ、エクス・ビボもしくはイン・ビボ遺伝子送達のためのこれらおよび他のウイルスベクター系における使用のために容易に適用できることを、容易に理解できる。ＡＡＶ−１ＩＴＲ配列、ＡＡＶ−１ｒｅｐ、ＡＡＶ−１ｃａｐおよびＡＡＶ−１Ｐ５プロモーター配列は、そのようなウイルスベクター系における使用のために特によく適している。
【００５６】
例えば、１つの望ましい実施態様では、本発明のＡＡＶ−１ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ−１５’ＩＴＲ、興味ある非ＡＡＶＤＮＡ配列（例えばミニジーン）および３’ＩＴＲを含み、そして機能性ｒｅｐ／ｃａｐを欠いている発現カセットにおいて使用されてもよい。そのようなＡＡＶ−１ＩＴＲを含有するカセットは、所望の宿主細胞へのその後のトランスフェクションのためのプラスミド、例えば前記ｃｉｓプラスミド上に位置してもよい。さらに、この発現カセットは、細胞の感染を許すために選ばれた血清型のＡＡＶキャプシドを提供されてもよく、またはｒＡＡＶビリオンのパッケージングのために所望の宿主細胞中へ安定にトランスフェクションされてもよい。そのような発現カセットは、アデノウイルス系およびレンチウイルス系を含む他のウイルス系における使用のために容易に適合できる。Ａｄ／ＡＡＶベクターを作成する方法は当業者には周知である。１つの望ましい方法は、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４０１８に記述されている。しかしながら、本発明は、いかなる特定の方法にも限定されるものではない。
【００５７】
本発明のその他の態様は、配列番号：１のｎｔ２３６−２９９にわたる領域に位置する新規なＡＡＶ−１Ｐ５プロモーターである。このプロモーターは、所望の導入遺伝子の発現を推進するために種々のウイルスベクターにおいて有用である。
【００５８】
同様に、当業者は、種々のベクター系における使用のための本発明のＡＡＶ−１ゲノムの他のフラグメントを容易に選択することができる。そのようなベクター系は、例えば、なかんずくレンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルス系を含んでもよい。これらのベクター系の選択は、本発明の限定するものではない。
【００５９】
Ｃ．宿主細胞およびパッケージング細胞系
なおその他の態様では、本発明は、所望の導入遺伝子の発現またはｒＡＡＶ粒子の産生を可能にするために、本発明のＡＡＶ−１核酸配列により、一過性にトランスフェクションされてもよい宿主細胞を提供する。例えば、選ばれた宿主細胞は、慣用の技術を用いてＡＡＶ−１Ｐ５プロモーター配列および／またはＡＡＶ−１５’ＩＴＲ配列によりトランスフェクションされてもよい。本発明のトランスフェクションされた細胞系に対するＡＡＶヘルパー機能の供与は、感染性ｒＡＡＶ粒子としてのｒＡＡＶのパッケージングをもたらす。そのような細胞系は、本発明のＡＡＶ−１配列を使用して、既知技術［例えば米国特許第５，６５８，７８５号、参照］にしたがって作成することができる。
【００６０】
あるいはまた、本発明の宿主細胞は、本発明のｒＡＡＶ発現カセット、およびＡＡＶ−１ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子のコピーを用いて、安定にトランスフェクションされてもよい。適当な親細胞系は、哺乳類細胞系を含み、そして非サル哺乳類細胞由来の宿主細胞を選択することが望ましい。適当な親細胞系の例は、限定されるものではないが、Ｈｅｌａ［ＡＴＣＣ ＣＣＬ２］、Ａ５４９［ＡＴＣＣ寄託番号ＣＣＬ１８５］，ＫＢ［ＣＣＬ１７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えばＤｅｔｒｏｉｔ５１０，ＣＣＬ７２］およびＷＩ−３８［ＣＣＬ７５］細胞を含む。これらの細胞系は、アメリカン タイプ カルチャー コレクション、１０８０１ ユニバーシティ ブールバード、マナサス、バージニア ２０１１０−２２０９ ＵＳＡからすべて得ることができる。他の適当な親細胞系が、他の起源から得られてもよく、そして本発明のＰ５および／またはＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ配列を含有する安定な細胞系を構築するために使用されてもよい。
【００６１】
上記のように生成された組み換えベクターは、興味あるＤＮＡの細胞への送達のために有用である。
【００６２】
ＩＩＩ．ＡＡＶ−１由来のベクターを介して遺伝子を送達する方法
その他の態様では、本発明は、本発明のＡＡＶ−１配列（もしくはその機能性フラグメント）を用いて生成された組み換えウイルスベクターにより、選ばれた宿主細胞をトランスフェクションするか、または感染させることを伴う宿主への導入遺伝子の送達方法を提供する。送達方法は、当業者には周知であり、そして本発明を限定するものではない。
【００６３】
１つの望ましい実施態様では、本発明は、宿主への導入遺伝子のＡＡＶに媒介される送達方法を提供する。この方法は、導入遺伝子およびＡＡＶ−１キャプシドタンパク質の発現を指図する配列の制御下に選ばれた導入遺伝子を含有する組み換えウイルスベクターにより、選ばれた宿主細胞をトランスフェクションするか、または感染させることを必要とする。
【００６４】
場合によっては、宿主からのサンプルが、最初に、選ばれたＡＡＶ血清型に対する抗体の存在についてアッセイされる。中和抗体を検出するための種々のアッセイ型式が、当業者には周知である。そのようなアッセイの選択は、本発明を限定されるものではない。例えば、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，３（３）：３０６−３１２（Ｍａｒｃｈ １９９７）およびＷ．Ｃ．Ｍａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９：４７７−４８５（Ｍａｒｃｈ １，１９９８）、参照。このアッセイの結果は、例えばそのキャプシド血清型に特異的な中和抗体の不在によって、特定の血清型のキャプシドタンパク質を含有するＡＡＶベクターが、送達のために好適であるかを決定するするために使用できる。
【００６５】
この方法の１つの態様では、ＡＡＶ−１キャプシドタンパク質をもつベクターの送達は、異なる血清型ＡＡＶキャプシドタンパク質をもつベクターを介する遺伝子の送達に先行しても、または後に続いてもよい。かくして、ｒＡＡＶベクターを介する遺伝子送達は、選ばれた宿主細胞への反復遺伝子送達のために使用できる。望ましくは、後に投与されるｒＡＡＶベクターは、最初のｒＡＡＶベクターと同じ導入遺伝子を担持しているが、後に投与されるベクターは、最初のベクターとは異なる血清型のキャプシドタンパク質を含有している。例えば、最初のベクターがＡＡＶ−２キャプシドタンパク質をもつ場合は、後に投与されるベクターは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−６を含む、他の血清型の中から選ばれるキャプシドタンパク質を有してもよい。
【００６６】
かくして、本発明のｒＡＡＶ−１由来組み換えウイルスベクターは、生物が、１種以上のＡＡＶ血清型に対する中和抗体をもつ場合でさえも、イン・ビボもしくはエクス・ビボで選ばれた宿主細胞に選ばれた導入遺伝子を送達できる有効な遺伝子伝達を提供する。これらの組成物は、特に、治療目的のための遺伝子送達に良好に適合される。しかしながら、本発明の組成物は、また、免疫化において有用である。さらに、また、本発明の組成物は、イン・ビトロにおいて所望の遺伝子産物の生産のために使用されてもよい。
【００６７】
上記組み換えベクターは、公表された方法にしたがって宿主細胞へ送達されてもよい。選ばれた導入遺伝子を担持しているＡＡＶウイルスベクターは、好ましくは生物学的に適合しうる溶液もしくは製薬的に許容しうる送達媒質中に懸濁されて、患者に投与されてもよい。適当な媒質は、無菌生理食塩水を含む。製薬的に許容しうるキャリヤーであることが既知で、そして当業者には周知の他の水性および非水性等張無菌注射液ならびに水性および非水性無菌懸濁液が、この目的のために使用されてもよい。
【００６８】
ウイルスベクターは、細胞をトランスフェクションし、そして十分なレベルの遺伝子伝達と発現を提供するのに十分な量において投与されて、当該医学分野における熟達者によって決定できる過度の副作用なしに、または薬物学的に許容しうる生理的効果をもつ、治療利益を提供する。慣用の製薬的に許容しうる投与経路は、限定されるものではないが、肝臓への直接送達、経口、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および他の非経口投与経路を含む。投与経路は、所望であれば、組み合わされてもよい。
【００６９】
ウイルスベクターの用量は、第１には、治療されている症状、患者の年令、体重および健康のようなファクターに依存し、したがって患者によって変わるであろう。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効なヒト用量は、一般に、濃度約１ｘ１０9〜１ｘ１０16ゲノムウイルスベクターを含有する溶液約１ｍｌ〜約１００ｍｌの範囲内である。好適なヒト用量は、約１ｘ１０13〜１ｘ１０16ＡＡＶゲノムであってもよい。用量は、あらゆる副作用に対して治療利益をバランスさせるように調整でき、そしてそのような用量は、組み換えベクターが使用される治療適用に応じて変わるであろう。導入遺伝子の発現レベルが、ウイルスベクター、好ましくはミニジーンを含有しているＡＡＶベクターをもたらす用量の頻度を決定するためにモニターすることができる。場合によっては、治療目的のために記述された処方に類似する用量処方が、本発明の組成物を用いる免疫化のために利用されてもよい。イン・ビトロの生産では、所望のタンパク質は、所望のタンパク質をコードしている遺伝子を含有するｒＡＡＶにより宿主細胞をトランスフェクションし、そして発現を可能にする条件下で細胞培養液を培養した後、所望の培養液から得ることができる。次いで、発現されたタンパク質は、所望のように精製され、単離することができる。トランスフェクション、細胞培養、精製および単離のための適当な技術は、当業者には既知である。
【００７０】
次の実施例は、本発明のいくつかの態様および実施態様を具体的に説明するものである。
【００７１】
実施例１−ＡＡＶ−１の感染性クローンの作成
ＡＡＶ−１の複製型ＤＮＡは、ＡＡＶ−１および野生型アデノウイルス５型によって感染された２９３細胞から抽出された。
【００７２】
Ａ．細胞培養およびウイルス
ＡＡＶ−１不含２９３細胞および８４−３１細胞は、ペンシルバニア大学のヒト応用研究室によって提供された。これらの細胞は、１０％胎児ウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシンを補足されたＤｕｌｂｅｃｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍｕにおいて、５％ＣＯ2を供給された湿潤環境中３７℃で培養された。８４−３１細胞系は、アデノウイルス遺伝子Ｅ１ａ，Ｅ１ｂ，Ｅ４／ＯＲＦ６を構成的に発現し、そして既に記述されている［Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２（１９９６）］。ＡＡＶ−１（ＡＴＣＣ ＶＲ−６４５）種保存株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入された。ＡＡＶウイルスは、ヘルパーウイルスとしての野生型Ａｄ５とともに２９３細胞において増殖された。
【００７３】
Ｂ．組み換えＡＡＶ作成
組み換えＡＡＶウイルスは、アデノウイルス不含の方法を用いるトランスフェクションによって作成された。簡単には、ｃｉｓプラスミド（ＡＡＶ ＩＴＲをもつ）、ｔｒａｎｓプラスミド（ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をもつ）およびヘルパープラスミド（ｐＦ△１３、アデノウイルスゲノム由来の必須領域をもつ）が、同時に、１：１：２の比でリン酸カルシウム沈殿によって２９３細胞中にコ・トランスフェクションされた。ｐＦ△１３ヘルパープラスミドは、アデノウイルスＥ２Ｂ領域に８ｋｂ欠失をもち、そしてほとんどの後期遺伝子における欠失を有する。このヘルパープラスミドは、ｐＦＧ１４０（Ｍｉｃｒｏｂｉｘ，Ｃａｎａｄａ）からＲｓｒＩＩフラグメントを欠失させることによって作成された。典型的には、ＤＮＡ（ｃｉｓ：ｔｒａｎｓ：ｐＦ△１３、それぞれ１：１：２比で）５０μｇが、１５ｃｍ組織培養皿上にトランスフェクションされた。細胞は、感染９６時間後に収穫され、音波処理され、そして０．５％デオキシコール酸ナトリウムにより処理された。細胞溶解液は、次に、２ラウンドのＣｓＣｌ濃度勾配にかけられた。ＡＡＶベクターを含有するピーク画分が回収され、プールされ、そして動物への注射前にＰＢＳに対して透析された。ＡＡＶ−１ビリオンをもつｒＡＡＶウイルスを作成するために、ｐＡＶ１Ｈもしくはｐ５Ｅ１８（２／１）が、ｔｒａｎｓプラスミドとして使用されてｒｅｐおよびｃａｐ機能を与えた。
【００７４】
ＡＡＶ−２に基づくｒＡＡＶの作成のためには、ｐ５Ｅ１８が、一般に、ｒＡＡＶ収率を改善するので、それがｔｒａｎｓプラスミドとして使用された。このプラスミド、ｐ５Ｅ１８（２／２）は、ＡＡＶ−２ＲｅｐおよびＣａｐを発現し、そしてＣａｐ遺伝子に対して位置３’に再び置かれたＰ５プロモーターを含有し、それによってＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８の発現を最小化する。その戦略は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５２３６−５２４３（１９９７）によって最初に記述された。ｐ５Ｅ１８（２／２）は、次の方法において構築された。既に記述されたｐＭＭＴＶ−ｔｒａｎｓベクター（すなわち、ＡＡＶ−２に基づくベクターにおいてＰ５プロモーターについて置換されたマウス乳癌ウイルスプロモーター）が、ＳｍａＩおよびＣｌａＩにより消化され、クレノウ酵素により充填され、次いでＤＮＡリガーゼにより再環化された。得られる構築物は、ＸｂａＩで消化され、充填され、そして次の方法で構築されたｐＣＲ−ｐ５からの平滑末端ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントに連結された。ＡＡＶのＰ５プロモーターが、ＰＣＲによって増幅され、そして増幅されたフラグメントが、続いて、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化されてｐＣＲ−Ｐ５を得た、ヘルパープラスミドｐＡＶ１Ｈは、ｐＡＡＶ−２のＢｆａＩフラグメントを、ＢｃｏｒＶおよびＳｍａＩ部位においてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ−ＳＫ（＋）中にクローニングすることによって構築された。ｐ５Ｅ１８（２／２）からの３．０−ｋｂＸｂａＩ−ＫｐｎＩフラグメント、ｐＡＶ１Ｈからの２．３−ｋｂＸｂａＩ−ＫｐｎＩフラグメント、およびｐ５Ｅ１８（２／２）からの１．７−ｋｂＫｐｎＩフラグメントは、ＡＡＶ−２Ｒｅｐ、ＡＡＶ−１Ｃａｐ、およびＣａｐ遺伝子に対して３’に位置するＡＡＶ−２Ｐ５プロモーターを含有する別々のプラスミドｐ５Ｅ１８（２／１）中に組み入れられた。プラスミドｐ５Ｅ１８（２／１）は、ｐＡＶ１Ｈよりも１０〜２０倍高い量のベクターを生じた（すなわち、１０12ゲノム／５０ １５−ｃｍ2プレート）。
【００７５】
Ｃ．ＤＮＡ技術
ＨｉｒｔＤＮＡ抽出は、少し改変されて当該技術分野に記述されているように実施された［Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１３５−１４３（１９８３）］。より特別には、ＳＤＳ不含のＨｉｒｔ液が、ＳＤＳを含有する元のＨｉｒｔ液を使用する代わりに使用された。元のＨｉｒｔ液に存在するＳＤＳ量は、細胞が完全に懸濁された後添加された。ＡＡＶ−１感染性クローンを構築するために、ＡＡＶ−１感染２９３細胞からのＨｉｒｔＤＮＡが、クレノウ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて修復されて、末端が平滑であることを確定した。次いで、処理されたＡＡＶ−１ＨｉｒｔＤＮＡは、ＢａｍＨＩにより消化され、そしてそれぞれ３ベクター中にクローン化された。内部ＢａｍＨＩが、ＢａｍＨＩにより切断されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ−ＳＫ＋中にクローン化されてｐＡＶ１−ＢＭを得た。左右のフラグメントが、ＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＶにより切断されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ−ＳＫ＋中にクローン化されてそれぞれｐＡＶ１−ＢＬおよびｐＡＶ１−ＢＲを得た。これらの３種のプラスミドにおけるＡＡＶ配列が、続いて、同じベクター中に組み立てられて、ＡＡＶ−１感染性クローンｐＡＡＶ−１を得た。組み換えＡＡＶ−１ウイルス作成のためのヘルパープラスミドは、ＥｃｏＲＶ部位においてｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ−ＳＫ＋中に、ｐＡＡＶ−１のＢｆａＩフラグメントをクローニングすることによって構築された。
【００７６】
ＨｉｒｔＤＮＡの分析は、３種のバンド、９．４ｋｂにおけるダイマー、４．７ｋｂにおけるモノマーおよび１．７ｋｂにおける一本鎖ＤＮＡを現し、ＡＡＶ−１の異なる複製形態に相関していた。モノマーバンドが、ゲルから切り出され、次いでＢａｍＨＩにより消化された。これは、３個のフラグメント、１．１ｋｂ，０．８ｋｂおよび２．８ｋｂをもたらした。このパターンは、Ｂａｎｔｅｌ−ｓｃｈａａｌおよびｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ，Ｖｉｒｏｌ．，１３４（１）：５２−６３（１９８４）による記述と一致している。１．１ｋｂおよび２．８ｋｂＢａｍＨＩフラグメントは、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶ部位においてｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋）中にクローン化された。中間の０．８ｋｂフラグメントは、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋）のＢａｍＨＩ部位中にクローン化された。
【００７７】
これら３種のフラグメントは、次いで、同じ構築物中にサブクローン化されて、ＡＡＶ−１の全配列を含有するプラスミド（ｐＡＡＶ−１）を得た。次いで、ｐＡＡＶ−１が、プラスミドバックボーンおよびパッケージから感染性ウイルスをレスキューするその能力について試験された。次いで、ｐＡＡＶ−１は、２９３細胞にトランスフェクションされ、そしてＭＯＩ １０においてヘルパーとしてのアデノウイルスを供給された。ウイルス上澄液が２９３細胞を再感染するために使用された。
【００７８】
サザンブロット解析では、ＨｉｒｔＤＮＡが、ＤｐｎＩにより消化されて細菌生まれのプラスミドが除去され、ＡＡＶ−１の内部ＢａｍＨＩフラグメントとプローブされた。メンブランは、次いで、高いストリンジェント条件で洗浄されたが、この条件は、６５℃で２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにより３０分２回および６５℃で０．１ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにより３０分２回：を含む。次いで、メンブランは、両リン光体画像およびＸ線オートラジオグラフィーによって解析された。結果は、ｐＡＡＶ−１が、実際に、ＡＡＶ血清型１の感染性クローンであることを確認した。
【００７９】
実施例２−ＡＡＶ−１の配列解析
次いで、完全ＡＡＶ−１ゲノムが、自動配列決定によって決定され、そして長さ４７１８ヌクレオチドであることがわかった（図１Ａ〜１Ｃ）。配列決定では、ＡＢＩ３７３自動シーケンサーが、ＦＳ染料化学を用いてこの研究に関連するすべてのプラスミドおよびＰＣＲフラグメントの配列決定するために使用された。すべての配列が、両プラスおよびマイナス鎖を配列決定することによって確認された。また、これらの配列は、ｐＡＶ−ＢＭの２つの独立したクローン、ｐＡＶ−ＢＬおよびｐＡＶ−ＢＲを配列決定することによって確認された。ＡＡＶ−１ＤＮＡの複製形態が、配列決定のための鋳型として使用されたので、また、これらの配列は、鋳型として元のＡＡＶ−１種保存株を用いる一連のＰＣＲ産物を配列決定することによって確認された。
【００８０】
ＡＡＶ−１の長さは、他の血清型：ＡＡＶ−３（４７２６ヌクレオチド）、ＡＡＶ−４（４７７４ヌクレオチド）、ＡＡＶ−２（４６８１ヌクレオチド）、およびＡＡＶ−６（４６８３ヌクレオチド）の範囲内であることが見い出された。
【００８１】
ＡＡＶ−１ゲノムは、アデノ随伴ウイルスの他の血清型との類似性を示した。全般に、それは、デフォルトセッティング（ｄｅｆａｕｌｔ ｓｅｔｔｉｎｇ）を用いるコンピュータープログラムＭｅｇａｌｉｇｎ［ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ］によって決定されるように、他の既知ＡＡＶウイルスと８０％以上の同一性を共有している。また、ＡＡＶ−２における重要な特徴は、ＡＡＶ−１においても見い出すことができる。第１に、ＡＡＶ−１は、ヌクレオチドレベルにおける違いにもかかわらず、Ｔ型ヘアピン構造を形成できる同型の逆方向末端反復を有する（図２および３）。ＡＡＶ−１の右ＩＴＲと左ＩＴＲの配列は同一である。ＡＡＶ ＴＲ配列は、Ａ，Ａ’，Ｂ，Ｂ’，Ｃ，Ｃ’，ＤおよびＤ’に細分される［Ｂｅｒｎ，前出］。
【００８２】
これらのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、また、事実、ＡＡＶ−６右ＩＴＲに見いだされる配列と同じであり、ＡおよびＡ’配列の各々、およびＤ配列の最後のヌクレオチドにおいて１つのヌクレオチド差異が存在する。第２に、ＡＡＶ−２ｒｅｐ結合モティーフ［ＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＧ（配列番号：２０）］は、良好に保存されている。また、そのようなモティーフは、ヒト染色体１９ＡＡＶ−２プレ・インテグレーション領域において見い出すことができる。最後に、非構造および構造コーディング領域、および他のＡＡＶ血清型のものと類似の調節要素が、またＡＡＶ−１ゲノムにおいて存在する。
【００８３】
ＡＡＶ末端反復の全般的特徴は、非常によく保存されているけれども、ＡＡＶ末端反復の全長は相違を示す。ＡＡＶ−１の末端反復は、１４３ヌクレオチドからなり、一方、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３およびＡＡＶ−４のそれは約１４５もしくは１４６ヌクレオチドである。ＡＡＶ−１ ＩＴＲのループ領域は、それが、また、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−３において見い出されるＴＴＴの代わりにＴＣＴを使用するという点で、ＡＡＶ−４のそれと非常に密接に類似している。配列決定の誤りの可能性は、これらの３ヌクレオチドが、ＳａｃＩ部位の一部である（ｇａｇｃｔｃ；配列番号：１のｎｔ６９−７４）ので、制限酵素消化を用いて除去される。ＡＡＶ−１のｐ５プロモーター領域は、他のＡＡＶ血清型とヌクレオチド配列において一層の変化を示す。しかしながら、それは、決定的な調節要素をなお維持している。ＹＹ１［図１Ａ〜１Ｃ、参照］部位の２コピーは、すべてのＡＡＶ血清型において保存されているようであり、これらは、ＡＡＶ遺伝子発現を調節することに関与していることが分かっている。ＡＡＶ−４には、ＹＹ１とＥ−ｂｏｘ／ＵＳＦ部位間に挿入された５６個のさらなるヌクレオチドが存在するが、一方、ＡＡＶ−１では、Ｅ−ｂｏｘ／ＵＳＦ部位前に挿入された２６個のさらなるヌクレオチドが存在する。また、ｐ１９プロモーター、ｐ４０プロモーターおよびポリＡは、高度にまた保存されている既知のＡＡＶ血清型に対する相似性によってＡＡＶ−１ゲノムから特定することができる。
【００８４】
かくして、種々の血清型のＡＡＶ末端反復の解析は、ＡおよびＡ’配列が非常によく保存されていることを示した。その理由の１つは、Ｒｅｐ結合モティーフ（ＧＣＴＣ）3ＧＣＴＧ［配列番号：２０］であるかもしれない。これらの配列は、ＡＡＶ ＤＮＡ複製および部位特異的組み込みには必須であるようである。また、同じ配列が、サルのゲノムにおいても保存されていることが分かっている［Ｓａｍｕｌｓｋｉ，私信］。また、Ｄ配列の最初の８ヌクレオチドは、すべての既知ＡＡＶ血清型において同一である。これは、最初の１０ヌクレオチドのみが、ＡＡＶパッケージングにとって必須であるというＳｒｉｖａｓｔａｖａグループの観察と一致している［Ｘ．Ｓ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：３０７７−３０８２（１９９７）；Ｘ．Ｓ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：１１４０−１１４６（１９９７）］。残りのＤ配列の機能は、まだ不明のままである。それらは、それらの組織特異性にいくらか関係しているかもしれない。また、ＢおよびＣ配列におけるヌクレオチドの違いは、ＩＴＲの２次構造が、その生物学的機能にとってより決定的であることを示唆しているかも知れず、このことは、多くの従来の出版物において例証されている。
【００８５】
実施例３−ＡＡＶ−１配列の比較
上記のように得られたＡＡＶ−１のヌクレオチド配列が、ＤＮＡ Ｓｔａｒ Ｍｅｇａｌｉｇｎを用いて、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−６を含む既知のＡＡＶ配列と比較された。この比較は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６によって共有される一続きの７１個の同一ヌクレオチドを明らかにした。図１Ａ〜１Ｃ、参照。
【００８６】
この比較は、ＡＡＶ−６が、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２の相同組み換えによって形成されたハイブリッドであることを、さらに示唆した。図３Ａおよび３Ｂ、参照。これらのヌクレオチドは、ＡＡＶ−６ゲノムを２つの領域に分ける。５２２ヌクレオチドをもつＡＡＶ−６の５’側半分は、２位置における以外はＡＡＶ−２のそれと同一である。多くのｒｅｐ遺伝子、完全ｃａｐ遺伝子および３’ＩＴＲを含むＡＡＶ−６の３’側半分は、ＡＡＶ−１に９８％同一である。
【００８７】
生物学的に、そのような組み換えは、ヒト集団をとおして伝達する能力をＡＡＶ−１に獲得させるであろう。また、ＡＡＶ−６のＩＴＲが、１つのＡＡＶ−１ＩＴＲおよび１つのＡＡＶ−２ＩＴＲを含有することに注目することは興味ある。欠陥パルボウイルスの複製モデルは、この特定の配置を維持することができる。ＡＡＶ組み込みに関する研究は、多数のＡＡＶ組み込み体が、末端反復の少なくとも１つにおける欠失を担持していることを示した。これらの欠失は、鋳型として他のインタクト末端反復を用いて、遺伝子保存をとおして修復することができることが示された。したがって、ＡＡＶ−６の組み込まれたコピーがヘルパーウイルス感染により宿主細胞からレスキューされる場合には、同種集団としてＡＡＶ−６を維持することは、非常に困難であろう。２つの同一ＡＡＶ−２ＩＴＲもしくは２つの同一ＡＡＶ−１ＩＴＲをもつＡＡＶ−６は、有力な変異体であろう。２つのＡＡＶ−１ＩＴＲをもつＡＡＶ−６は、Ｒｕｓｓｅｌｌグループによって観察された［Ｒｕｔｌｅｄｇｅ、前出（１９９８）］。今まででは、２つのＡＡＶ−２ＩＴＲをもつＡＡＶ−６に関する報告は存在しない。ＡＡＶ−６によるＡＡＶ−２Ｐ５プロモーターの獲得は、ＡＡＶ−６が、ヒト起源から単離されたのに対して同じビリオンをもつＡＡＶ−１は単離されなかったということを説明できる。ＡＡＶの異なる種の間のＰ５プロモーターの調節は、イン・ビボでは異なるであろう。この観察は、ＡＡＶのキャプシドタンパク質が、組織特異性についての唯一の決定要素ではないことを示唆する。
【００８８】
ＡＡＶ−６が、ＡＡＶ−１とＡＡＶ−２のハイブリッドであることは明らかであるけれども、ＡＡＶ−６は、既に、ＡＡＶ−１もしくはＡＡＶ−２いずれとも違うことを表した。ＡＡＶ−６とＡＡＶ−２の間ではそれらの最初の４５０ヌクレオチドにおいて２ヌクレオチドの差異が存在する。ヌクレオチド５２２から３’末端までにヌクレオチドレベルにおいてＡＡＶ−６とＡＡＶ−１間に約１％の差異が存在する。また、ＡＡＶ−６とＡＡＶ−１間には全く違う領域（ヌクレオチド４４８６−４５９３）が存在する（図１Ａ−１Ｃ）。この領域は、ＡＡＶに関するいかなる既知タンパク質もコードしていない。これらのヌクレオチド配列における差異は、ＡＡＶ−６およびＡＡＶ−１が、ある進化をとおして、組み換えが起きた結果生じたことを示唆するであろう。その他の可能な説明は、まだ同定されていないＡＡＶ−１のその他の変異体が存在するということである。今まででは、いずれの可能性も除外する証拠はない。他のハイブリッド（ＡＡＶ−２対ＡＡＶ−４など）が天然に存在するかどうかは、まだ未知である。
【００８９】
ＡＡＶ−１のコーディング領域は、他の既知ＡＡＶ血清型との比較によって推定された。表１は、ＡＡＶ−１とＡＡＶ−６間のコーディング領域差異を具体的に説明している。アミノ酸残基は、ＡＡＶ−２にしたがって推定される。
【００９０】
ＡＡＶ−１のアミノ酸位置に関して、表１は、ＡＡＶ−６の対応するアミノ酸に変換されたＡＡＶ−１のアミノ酸を挙げる。ＡＡＶ−１のアミノ酸は、矢印の左に示される。照合は、ＡＡＶ−１Ｒｅｐ７８のアミノ酸配列の配列番号：５に対して、そしてＡＡＶ−１ＶＰ１のアミノ酸配列についての配列番号：１３に対して行うことができる。
【００９１】
【表１】
ＡＡＶ−１コーディング領域の配列が、位置４５２からコーディング領域の末端までのＡＡＶ−６のそれとほとんど同一（９９％）であることが分かったのは驚くべきことであった。ＡＡＶ−６の最初の５０８ヌクレオチドは、ＡＡＶ−２のそれらと同一であることが示されている［Ｒｕｔｌｅｄｇｅ、前出（１９９８）］。ＡＡＶ−６ゲノムの成分が、ＡＡＶ−２左ＩＴＲ−ＡＡＶ−２ｐ５プロモーター−ＡＡＶ−１コーディング領域−ＡＡＶ−１右ＩＴＲであると思われるので、ＡＡＶ−６は、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２間に天然に生じたハイブリッドであると結論された。
【００９３】
実施例４−ＡＡＶ−１に基づく遺伝子治療ベクター
ＡＡＶ−１ウイルスに基づく組み換え遺伝子伝達ベクターは、実施例１に記載の方法によって構築された。ＡＡＶ−１ビリオンおよびＡＡＶ−２ＩＴＲをもつハイブリッド組み換えウイルスを作成するために、ＡＡＶ−１ｔｒａｎｓプラスミド（ｐＡＶ１Ｈ）およびＡＡＶ−２ｃｉｓ−ｌａｃＺプラスミド（ＡＡＶ−２ＩＴＲをもつ）が使用された。ＡＡＶ−２ＩＴＲは、部位特異的組み込みを指図するその既知の能力にかんがみて、このベクターにおいて使用された。また、ｔｒａｎｓプラスミドとしてｐＡＶ１Ｈを用いて、ＣＭＶの即時型プロモーターの制御下に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子を担持するＡＡＶ−１ベクターが、この実験における使用のために構築された。
【００９４】
Ａ．イン・ビトロでのｒＡＡＶ−１ウイルスによる宿主細胞のトランスフェクション
８４−３１細胞、安定にＥ４／ＯＲＦ５を発現する２９３細胞（アデノウイルスＥ１ａ、Ｅ１ｂを発現する）のサブクローンが、ｒＡＡＶ−１ＧＦＰもしくはｒＡＡＶ−ｌａｃＺにより感染された。ＧＦＰおよびｌａｃＺの高レベルの発現は、培養８４−３１細胞において検出された。これは、ｒＡＡＶ−１に基づくベクターが、感染能と発現レベルにおいてＡＡＶ−２に基づくベクターに非常に類似していることを示唆する。
【００９５】
Ｂ．イン・ビボでのｒＡＡＶ−１ウイルスによる細胞のトランスフェクション また、ＡＡＶ−１に基づくベクターの性能が、イン・ビボにおいて試験された。ｒＡＡＶ−１ＣＭＶ−α１ＡＴウイルスが、次のように構築された。ヒトα１−抗トリプシン（α１ＡＴ）ｃＤＮＡフラグメントを含有しているｐＡＴ８５（ＡＴＣＣ）のＥｃｏＲＩフラグメントが末端を平滑にされ、そしてＳｍａＩ部位においてＰＣＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローン化されてＰＣＲ−α１ＡＴを得た。ＣＭＶプロモーターは、ＸｂａＩ部位においてＰＣＲ−α１ＡＴ中にクローン化された。Ａｌｂ−α１ＡＴ発現カセットは、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩによって切り取られ、そしてＸｂａＩ部位においてｐＡＶ１Ｈ中にクローン化された。このベクタープラスミドが、下記の実験において使用されるＡＡＶ−１−ＣＭＶ−α１ＡＴウイルスを作成するために使用された。
【００９６】
ＡＡＶに対するヒト抗体をスクリーニングするために、精製ＡＡＶウイルスが、Ｒｉｐａバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．２、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１％ＳＤＳ、０．１５ＭＮａＣｌ）により溶解され、そして１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分離された。熱不活性化されたヒト血清が、このアッセイにおいて１〜１０００倍希釈において使用された。ｒＡＡＶ−１ＣＭＶ−α１ＡＴウイルスは、種々の用量において尾静脈注射によってＲａｇ−１マウス中に注射された。マウス血清中のヒトα１−抗トリプシンの濃度がＥＬＩＳＡを用いて測定された。コーティング抗体は、ウサギ抗ヒト・ヒトα１−抗トリプシン（Ｓｉｇｍａ）である。ヒツジ抗ヒトα１−抗トリプシン（Ｓｉｇｍａ）が、最初の検出抗体として使用された。このアッセイの感度は約０．３ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌである。マウス血液中のヒトα−抗トリプシンの発現は、非常に励みになるレベルにおいて検出することができる。この結果は表２に示される。
【００９７】
【表２】
ｒＡＡＶ−１ＣＭＶ−ｌａｃＺウイルスが、また、Ｃ５７ＢＬ６マウスの筋肉内に注射され、そして類似の結果が得られた。まとめれば、これらの結果は、ＡＡＶ−１に基づくベクターは、肝および筋両方の遺伝子送達のために適当であろうことを示唆した。
【００９９】
実施例５−ＡＡＶ−１に対する中和抗体
ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２に対する中和抗体（ＮＡＢ）の単純な定量的アッセイが、組み換えベクターを用いて開発された。総数３３の赤毛サルおよび７７の正常ヒト被験者がスクリーニングされた。
【０１００】
Ａ．非ヒト霊長類
野生で捕獲された幼少サルは、Ｃｏｎｖａｎｃｅ（Ａｌｉｃｅ，Ｔｅｘ．）およびＬＡＢＳ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ（Ｙｅｍａｓｓｅｅ，ＳＣ）から購入され、そして完全検疫下に維持された。サルは、体重約３〜４ｋｇであった。Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙの研究プログラムにおいて使用された非ヒト霊長類は、米国において特定病原体フリーの閉鎖コロニーにおいて意図的に飼育される。すべての販売者は、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ａ級ディーラーである。したがって、赤毛サルは、結核因子、多数のサル・レンチウイルス（サル・免疫不全ウイルスおよびサル・レトロウイルス）およびサル科のヘルペスウイルスを含む、重要なサルの病原体で感染されていない。また、動物は、内部および外部寄生虫をもっていない。これらのプレミアム動物の優れた健康状態は、外部の変数についての可能性を最小にした。この研究では、血清が、すべてのプロトコールの開始前にサルから得られた。
【０１０１】
ＮＡＢタイターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するレポーターウイルス（ＡＡＶ１−ＧＦＰもしくはＡＡＶ２−ＧＦＰ）の８４−３１細胞への導入を阻害する血清抗体の能力を調査することによって分析された。３７℃で１時間レポーターウイルスとともにプレインキュベートされた種々の希釈の抗体が、９０％集密細胞培養物に添加された。細胞は、４８時間インキュベートされ、そして緑色血清タンパク質の発現が、ＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｉｎｇ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって測定された。ＮＡＢタイターは、５０％の細胞が緑色に染色されたもっとも高い希釈として計算された。
【０１０２】
赤毛サルにおけるＮＡＢの分析は、試験された動物の６１％がＡＡＶ−１についてポジティブであり；少数（２４％）がＡＡＶ−２に対するＮＡＢを有した。３分の１以上の動物が、ＡＡＶ−１に対する抗体を有したが、ＡＡＶ−２に対してはもたなかった（すなわち、ＡＡＶ−１に対して単一特異的であった）が、一方、動物は、ＡＡＶ−１に反応することなくＡＡＶ−２についてもポジティブではなかった。これらのデータは、ＡＡＶ−１が赤毛サルにおいて地方流行であるという仮説を支持する。ＡＡＶ−２に対するＡＡＶ−１応答の交差中和活性が除外できないので、この群の非ヒト霊長類における真のＡＡＶ−２感染の存在は、ほとんど明らかではない。両方をもつ動物におけるＡＡＶ−２ＮＡＢとＡＡＶ−１ＮＡＢ間に直線的関係が存在することは興味深い。
【０１０３】
Ｂ．ヒト
これらの中和抗体アッセイでは、ヒト血清サンプルが、補体を不活性化するために５６℃で３０分間インキュベートされ、次いで、ＤＭＥＭにおいて希釈された。ウイルス（ｌａｃＺもしくはＧＦＰいずれかをもつｒＡＡＶもしくはｒＡｄ）が、次に、各血清希釈液（２０Ｘ，４００Ｘ，２０００Ｘ，４０００Ｘなど）と混合され、そして３７℃で１時間インキュベートされ、その後９６穴プレートにおいて８４−３１細胞（ＡＡＶのために）もしくはＨｅｌａ細胞（アデノウイルスのために）の９０％集密培養に適用された。培養条件下でインキュベーション６０分後、２０％ＦＣＳを含有するさらなる培地１００μｌが添加されて、１０％ＦＣＳを含有する最終培養培地を作成した。
【０１０４】
結果は、表３において総括される。
【０１０５】
【表３】
ＡＡＶに対する中和抗体の存在が、アデノウイルスに対する抗体についての指示にならないので、これらの３種のウイルスに対するヒト中和抗体は、無関係であるように見える。しかしながら、ＡＡＶは、ヘルパーウイルスとしてアデノウイルスを必要とし、ほとんどの場合において、ＡＡＶに対する中和抗体は、アデノウイルスに対する中和抗体の存在とは相関しなかった。スクリーニングされた７７ヒト血清サンプル中、４１％のサンプルは、Ａｄ５に基づく組み換えアデノウイルスの感染力を中和できる。血清サンプルの１５／７７（１９％）は、ｒＡＡＶ−１の導入を中和できるが、一方、サンプルの２０／７７（２０％）は、１対８０希釈以上においてｒＡＡＶ−２導入を阻害する。ＡＡＶ−１に対する中和抗体においてポジティブであるすべての血清サンプルは、また、ＡＡＶ−２についてもポジティブである。しかしながら、ｒＡＡＶ−１を中和することができない５つ（６％）のｒＡＡＶ−２ポジティブサンプルが存在する。また、中和抗体についてポジティブであるサンプルにおいて、抗体のタイターは、ポジティブなものの中で変化した。ＡＡＶに対する抗体についてヒト血清をスクリーニングすることから得た結果は、ＡＡＶ−１中和性ヒト血清が、ＡＡＶ−２の感染力もまた低下できるので、ＡＡＶ−１は、ＡＡＶ−２のそれと同じ抗原決定基を提示して細胞レポーターと相互作用するという結論を支持した。しかしながら、これらのＡＡＶについての中和抗体のプロフィルは同一ではなく、各ＡＡＶ血清型に対するさらなる特異的受容体が存在する。
【０１０７】
実施例６−組み換えＡＡＶウイルスは組織屈性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を示す
本発明の組み換えＡＡＶ−１ベクターおよび組み換えＡＡＶ−２ベクター［ヒトα１−抗トリプシン（ａ１ＡＴ）またはサイトメガロウイルスで増強されたβ−アクチンプロモーター（ＣＢ）からのマウス・エリトロポイエチン（Ｅｐｏ）］が、同じベクター遺伝子を含有しているＡＡＶ−２ベクターの当量コピーとの直接比較において評価された。
【０１０８】
ＡＡＶ−１キャプシドをもつ組み換えウイルスが、実施例１における技術を用いて構築された。ＡＡＶ−１ビリオンをもつｒＡＡＶを作成するためには、ｐＡＶ１Ｈもしくはｐ５Ｅ１８（２／１）が、ｔｒａｎｓプラスミドとして使用されて、ＲｅｐおよびＣａｐ機能が提供された。ＡＡＶ−２に基づくｒＡＡＶの作成では、ｐ５Ｅ１８（２／２）が、ｒＡＡＶ収量を大きく改善するので、それがｔｒａｎｓプラスミドとして使用された。［早期実験は、ｐＡＶ１Ｈおよびｐ５Ｅ１９（２／１）を用いて作成されたＡＡＶ−１ベクターの類似するイン・ビボ性能を示した。すべてのその後の研究は、収率を増大するので、ｐ５Ｅ１８（２／１）由来のＡＡＶ−１ベクターを使用した。］
当量のＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２ベクターの保存物が、免疫不全マウス中に、筋肉内（５ｘ１０10ゲノム）もしくは門脈循環を通して肝臓に（１ｘ１０11ゲノム）注射され、そして動物（４群）は、導入遺伝子の発現について３０日目に分析された。図４Ａおよび４Ｂ、参照。
【０１０９】
ＡＡＶ−２ベクターは、筋肉に較べて肝臓に注射された場合、１０〜５０倍以上の血清エリトロポイエチンもしくはα１−抗トリプシンを一貫して生産した。（しかしながら、ＡＡＶ−１で送達された遺伝子は、肝臓において許容しうる発現レベルを達成しなかった。）この結果は、ＡＡＶ−１ベクターについての結果とは非常に異なっていて、これによる筋肉発現は、肝臓発現と同等か、またはそれを超えていた。事実、ＡＡＶ−１は、ゲノムに基づいて当量タイターが投与された場合、筋肉においてＡＡＶ−２以上の働きをした。
【０１１０】
実施例７−ｒＡＡＶ−１を介する遺伝子送達
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週令オス、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が、ベクターの脾臓内注射後、肝臓へのＡＡＶに媒介される遺伝子伝達について解析された（すなわち、肝臓へのターゲティング）。ｒＡＡＶ−１もしくはｒＡＡＶ−２ベクターの全１０11ゲノム当量が、バッファー生理食塩水１００μｌにおいて循環中に注射された。最初のベクターは、いずれかＡＡＶ−１キャプシドもしくはＡＡＶ−２キャプシドを含有し、そしてニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーターの制御下でα１ＡＴを発現した。２８日目の血清が、ＡＡＶ−１もしくはＡＡＶ−２に対する抗体について分析され、そして血清α１ＡＴレベルがチェックされた。次いで、動物は、エリトロポイエチン（Ｅｐｏ、またＣＢプロモーターの制御下）を発現するＡＡＶ−１もしくはＡＡＶ−２構築物を注射された。１カ月後の血清が、Ｅｐｏの血清レベルについて分析された。次のグループが分析された（図５Ａ−５Ｄ）。
【０１１１】
グループ１では、ベクター１は、α１ＡＴを発現するＡＡＶ−２であり、そしてベクター２は、Ｅｐｏを発現するＡＡＶ−２であった。動物は、最初のベクター投与後にＡＡＶ−２に対する抗体を生成し、ＡＡＶ−２に基づくベクターの再投与を妨げた。ＡＡＶ−１に対する抗体を交差中和する証拠はなかった。
【０１１２】
グループ２では、ベクター１は、α１ＡＴを発現するＡＡＶ−１であり、一方、ベクター２は、Ｅｐｏを発現するＡＡＶ−１であった。最初のベクター投与は、１カ月目において、ＡＡＶ−１に対する中和抗体に対する抗体に関連する有意なα１ＡＴ発現をもたらさなかった。動物は、ＡＡＶ−１Ｅｐｏ発現性構築物により成功裏に再投与されなかった。
【０１１３】
グループ３では、ナイーブ動物に注射されたＥｐｏを発現するＡＡＶ−２ベクターの効力が測定された。動物は、ＰＢＳを注射され、そして２８日目にＡＡＶ−２Ｅｐｏベクターを注射され、そして１カ月後にＥｐｏ発現について分析された。中和抗体が２８日目に評価されたが、動物は、最初のベクター含むＰＢＳ注射を受けたので、期待したように何も見いだされなかった。このことは、ナイーブ動物では、ＡＡＶ−２は、１カ月後の高レベルの血清Ｅｐｏによって例証されるように、Ｅｐｏ遺伝子の伝達には非常に有効であることを示している。
【０１１４】
グループ４は、グループ３に類似する実験であって、ここでは、動物は、最初にベクター１についてのＰＢＳを受け、次いで、２８日後にＥｐｏを発現するＡＡＶ−１構築物を受けた。ベクター注射時点では、いずれかＡＡＶ−１もしくはＡＡＶ−２に対する抗体は、明らかに存在しなかった。ＡＡＶ−１に基づくベクターは、１カ月後に測定したときには、有意なＥｐｏの発現を生じることができた。
【０１１５】
グループ５は、最初のベクターが、α１ＡＴを発現するＡＡＶ−２であり、その後にＥｐｏを発現するＡＡＶ−１構築物が続く場合の交差実験である。期待されたように、動物は、２８日目における血液中の高レベルのタンパク質によって示されるように，α１ＡＴを発現するＡＡＶ−２ベクターにより有効に感染された。これは、ＡＡＶ−２に対する有意な中和抗体に関係している。重要なことは、第２のベクター投与に続く２８日目の血清中のＥｐｏの存在によって分かるように、動物は、ＡＡＶ−２ベクターに続いて成功裏にＡＡＶ−１を投与された。このベクター投与の時点では、高レベルＡＡＶ−２中和抗体が存在し、そしてＡＡＶ−１に対する交差反応は非常に低かった。Ｅｐｏのレベルは、少量の交差反応性のためにおそらく若干減少された。グループ６は、最初のベクターはＡＡＶ−１に基づき、一方、第２の実験は、ＡＡＶ−２に基づいた逆の交差実験であった。ＡＡＶ−１ベクターは、α１ＡＴの有意な遺伝子発現をもたらし、これがまた、高レベルＡＡＶ−１中和抗体をもたらした。動物は、高レベルＥｐｏによって証明されるように、最初のＡＡＶ−１ベクターに続いて、非常に効率的にＡＡＶ−２を投与された。
【０１１６】
実質的に同じ実験が、筋肉において実施され、５ｘ１０10ゲノムが、筋肉に対向される遺伝子治療のモデルとして、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの前脛骨筋中に注射された。結果は図６Ａ−６Ｄに示され、そして本質的に肝臓についてと同じである。
【０１１７】
総括すれば、この実験は、予め存在するＡＡＶ−２に対する抗体を有するか、または最初にＡＡＶ−２ベクターを受け、そして再投与を要する患者におけるＡＡＶ−１ベクターを使用することの効用を例証している。
【０１１８】
実施例８−ＡＡＶ−１ＩＴＲを含有する組み換えウイルスの構築
この実験は、本発明のＡＡＶ−１ＩＴＲを含有する組み換えＡＡＶベクターの構築を具体的に説明する。
【０１１９】
ＡＡＶ−１ｃｉｓプラスミドは、次のように構築される。ＡＡＶ−１５’ＩＴＲを含有する１６０ｂｐＸｈｏ−ＮｒｕＩＡＡＶ−１フラグメントが、ｐＡＶ１−ＢＬから得られた。ｐＡＶ１−ＢＬは、実施例１記載のように作成された。Ｘｈｏ−ＮｒｕＩフラグメントは、次に、ＸｂａＩ部位において第２のｐＡＶ１−ＢＬプラスミド中にクローン化されて、２つのＡＡＶ−１ＩＴＲをもつプラスミドが提供される。次いで、所望の導入遺伝子が、ＮｒｕＩとＢａｍＨＩ部位において改変ｐＡＶ１−ＢＬ中にクローン化され、ＡＡＶ−１ＩＴＲ配列の間に位置する。得られるＡＡＶ−１ｃｉｓプラスミドは、導入遺伝子に隣接するＡＡＶ−１ＩＴＲを含有し、そして機能性ＡＡＶ−１ｒｅｐおよびｃａｐを欠如する。
【０１２０】
組み換えＡＡＶは、２９３細胞中に３種のプラスミドを同時にトランスフェクションすることによって作成される。これらは、上記ＡＡＶ−１ｃｉｓプラスミド；ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ機能を与え、そしてＡＡＶＩＴＲを欠如するｔｒａｎｓプラスミド；およびアデノウイルスヘルパー機能を与えるプラスミドを含む。ｒｅｐおよび／またはｃａｐ機能は、意図されるレシピエントの免疫プロフィルに応じて、ＡＡＶ−１もしくはその他のＡＡＶ血清型によってｔｒａｎｓにおいて提供されてもよい。あるいはまた、ｒｅｐまたはｃａｐ機能は、再び患者の免疫プロフィルに応じて、ＡＡＶ−１もしくはその他の血清型によってｃｉｓにおいて提供されてもよい。
【０１２１】
典型的なコ・トランスフェクションでは、ＤＮＡ（１：１：２の比におけるｃｉｓ：ｔｒａｎｓ：ヘルパー）５０μｇが、１５ｃｍ組織培養皿上にトランスフェクションされる。細胞が、トランスフェクション後９６時間に収穫され、音波処理され、そして０．５％デオキシコール酸ナトリウムで処理（３７℃１０分間）される。次いで、細胞溶解液が、セシウム濃度勾配の２〜３回の超遠心にかけられる。ｒＡＡＶを含有するピーク画分が回収され、プールされ、そしてＰＢＳに対して透析される。典型的な収量は、１ｘ１０13ゲノム。／１０9細胞である。
【０１２２】
この方法を用いて、ＡＡＶ−１キャプシドをもつ、導入遺伝子に隣接するＡＡＶ−１ＩＴＲを含有する１種の組み換えウイルス構築物が調製される。そＡＡＶ−２キャプシドをもつ、導入遺伝子に隣接するＡＡＶ−１ＩＴＲを含有するその他の組み換えウイルス構築物が調製される。
【０１２３】
本明細書に引用されたすべての公表物は、引用によって本明細書に組み入れられている。本発明は、特に好適な実施態様に関して記述されたけれども、本発明の精神から逸脱することなく、改変が作成できることは理解されるであろう。そのような改変は、本特許請求の範囲内にはいることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【図１Ａ−１Ｃ】 ＡＡＶ−１［配列番号：１］、ＡＡＶ−２［配列番号：１８］およびＡＡＶ−６［配列番号：１９］のヌクレオチドの整列を示す。
【図２】 ＡＡＶ−１ ＩＴＲの予想される２次構造を示す。
【図３Ａ】 ＡＡＶ−６が、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２間の相同的組み換えからいかにして生じるの仮説を示す。
【図３Ｂ】 ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６中の７１ｂｐ相同領域の詳細な図示である。
【図４Ａ】 組み換えＡＡＶ−１および組み換えＡＡＶ−２ウイルスを介するｈＡＡＴの送達に続く、血清中のヒトα１抗トリプシン（α１ＡＴ）の発現レベルを示すバーチャートである。
【図４Ｂ】 組み換えＡＡＶ−１および組み換えＡＡＶ−２ウイルスを介するエリトロポイエチン（ｅｐｏ）遺伝子の送達に続く、血清中のｅｐｏの発現レベルを示すバーチャートである。
【図５Ａ】 実施例７に記述されるようにα１ＡＴの送達に続く、肝臓中のα１ＡＴの発現レベルを示すバーチャートである。
【図５Ｂ】 実施例７に記述されるようにｅｐｏの送達に続く、肝臓中のｅｐｏの発現レベルを示すバーチャートである。
【図５Ｃ】 実施例７に記述されるように肝臓へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−１に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【図５Ｄ】 実施例７に記述されるように肝臓へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−２に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【図６Ａ】 実施例７に記述されるようにα１ＡＴの送達に続く、筋肉中のα１ＡＴの発現レベルを示すバーチャートである。
【図６Ｂ】 実施例７に記述されるようにｅｐｏの送達に続く、筋肉中のｅｐｏの発現レベルを示すバーチャートである。
【図６Ｃ】 実施例７に記述されるように筋肉へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−１に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【図６Ｄ】 実施例７に記述されるように筋肉へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、ＡＡＶ−２に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。
【配列表】
Claims (23)
- 組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であって、配列番号：１３のアミノ酸配列をもつＡＡＶ−１ ｖｐ１、配列番号：１５のアミノ酸配列をもつＡＡＶ−１ ｖｐ２および配列番号：１７のアミノ酸配列をもつＡＡＶ−１ ｖｐ３の中から選ばれるＡＡＶ−１タンパク質を含むＡＡＶ−１キャプシドと、ＡＡＶ５’逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）、導入遺伝子およびＡＡＶ３’ＩＴＲを含む核酸分子をもつ、上記組換えアデノ随伴ウイルス。
- ＡＡＶ−１タンパク質ｖｐ１が配列番号：１のヌクレオチド２２２３〜４４３１に少なくとも９９％の同一性をもつ核酸によりコードされている、請求項１記載の組換えアデノ随伴ウイルス。
- ＡＡＶ−１タンパク質ｖｐ２が配列番号：１のヌクレオチド２６３４〜４４３２に少なくとも９９％の同一性をもつ核酸によりコードされている、請求項１または２記載の組換えアデノ随伴ウイルス。
- ＡＡＶ−１タンパク質ｖｐ３が配列番号：１のヌクレオチド２８２９〜４４３１に少なくとも９９％の同一性をもつ核酸によりコードされている、請求項１〜３のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルス。
- ＡＡＶ５’ＩＴＲおよびＡＡＶ３’ＩＴＲがＡＡＶ血清型２のものである、請求項１〜４のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルス。
- 導入遺伝子の発現を指図する調節性プロモーターをさらに含んでなる請求項１〜４のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルス。
- 導入遺伝子がα1アンチトリプシンまたはエリトロポイエチンをコードする、請求項１〜４のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルス。
- 請求項１〜７のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルスおよび製薬学的に許容されるキャリヤーを含む製薬学的組成物。
- 有効成分として請求項１〜７のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルスを含む筋肉細胞に形質導入するための製剤。
- 筋肉内投与用として調製された請求項９記載の製剤。
- 有効成分として請求項１〜７のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルスを含む肝細胞に形質導入するための製剤。
- 筋肉内投与用として調製された請求項１１記載の製剤。
- 請求項１〜７のいずれかに記載の組換えアデノ随伴ウイルスを含む組換え宿主細胞。
- 配列番号：５のアミノ酸配列をもつｒｅｐ７８、配列番号：７のアミノ酸配列をもつｒｅｐ６８、配列番号：９のアミノ酸配列をもつｒｅｐ５２および配列番号：１１のアミノ酸配列をもつｒｅｐ４０の中から選ばれる１種以上のＡＡＶ−１ｒｅｐタンパク質を発現する核酸分子で形質転換された組換え宿主細胞。
- 配列番号：１３のアミノ酸配列をもつｖｐ１、配列番号：１５のアミノ酸配列をもつｖｐ２および配列番号：１７のアミノ酸配列をもつｖｐ３の中から選ばれる１種以上のＡＡＶ−１ｃａｐタンパク質を発現する核酸分子で形質転換された組換え宿主細胞。
- 請求項１３〜１５のいずれかに記載の組換え宿主細胞であって、
（ａ）配列番号：１のヌクレオチド１〜１４３の核酸配列をもつ５’ＩＴＲ、
（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド４５７６〜４７１８の核酸配列をもつ３’ＩＴＲおよび
（ｃ）（ａ）および（ｂ）に相補的核酸配列
からなる群より選ばれるＡＡＶ−１逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を含む、上記宿主細胞。 - ３’ＡＡＶ−１ ＩＴＲおよび５’ＡＡＶ−１ ＩＴＲをベクターに含む、請求項１６記載の組換え宿主細胞。
- アデノウイルスヘルパー配列をさらにベクターに含む、請求項１６または１７記載の組換え宿主細胞。
- ＡＡＶ ｒｅｐコード領域およびＡＡＶ ｃａｐコード領域を含んでなる、ＡＡＶ−１ヘルパー機能をコードするベクターであって、該ｃａｐコード領域が、
（ａ）配列番号：１のヌクレオチド２２２３〜４４３１の核酸配列をもつｖｐ１、
（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド２６３４〜４４３２の核酸配列をもつｖｐ２、および
（ｃ）配列番号：１のヌクレオチド２８２９〜４４３２の核酸配列をもつｖｐ３
からなる群より選ばれる少なくとも１つのメンバーを含む、上記ベクター。 - ＡＡＶ ｒｅｐコード領域およびＡＡＶ ｃａｐコード領域を含んでなる、ＡＡＶ−１ヘルパー機能をコードするベクターであって、該ｒｅｐコード領域が、
（ａ）配列番号：１のヌクレオチド３３５〜２３０４の核酸配列をもつｒｅｐ７８、
（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド３３５〜２２７２の核酸配列をもつｒｅｐ６８またはそれに対応するｃＤＮＡ、
（ｃ）配列番号：１のヌクレオチド１００７〜２３０４の核酸配列をもつｒｅｐ５２、および
（ｄ）配列番号：１のヌクレオチド１００７〜２２７２の核酸配列をもつｒｅｐ４０またはそれに対応するｃＤＮＡ
からなる群より選ばれる少なくとも１つのメンバーを含んでなるＡＡＶ ｒｅｐコード領域を含む、上記ベクター。 - 請求項１９または２０記載のベクターにより形質導入された宿主細胞。
- 配列番号：１のヌクレオチド２３６〜２９９の配列をもつＡＡＶ−１ Ｐ５プロモーターにより安定に形質導入された請求項１３〜１７または２１記載の宿主細胞。
- 宿主へ導入遺伝子を送達するための製剤であって、
（ａ）配列番号：１のヌクレオチド２２２３〜４４３１に少なくとも９９％同一性もつＡＡＶ−１ ｃａｐ遺伝子によりコードされた少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含むキャプシド、および
（ｂ）導入遺伝の発現を指図する調節配列の制御下に該導入遺伝子を含むＤＮＡ
を含むＡＡＶビリオンを有効成分として含んでなる、上記製剤。
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