JP2002529098A - アデノ随伴ウイルス血清型１核酸配列、ベクターおよび同一物を含有する宿主細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型１の核酸配列、同じくベクターならびにこれらの配列およびその機能性フラグメントを含有する宿主細胞が提供される。また、ＡＡＶ−１由来のベクターを介する遺伝子の送達方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本研究は、国立保健研究所（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）の補助金Ｎｏ．Ｐ３０ ＤＫ４７７５７−０６およびＰ
Ｏ１ ＨＤ３２６４９−０４によって援助された。米国政府は、本発明における
ある種の権利を有する。

【０００２】 発明の分野 本発明は、一般に、ウイルスベクター、そしてより特別には、遺伝子送達のた
めに有用な組み換えウイルスベクターに関する。

【０００３】 発明の背景 アデノ随伴ウイルスは、小さい一本鎖ＤＮＡウイルスであり、有効な複製を可
能にするためにヘルパーウイルスを必要とする［Ｋ．Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，Ｐａｒｖ ｏｖｉｒｉｄａｅ：ｔｈｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉ ｃａｔｉｏｎ ，ｐ．１００７−１０４１，ｉｎ Ｆ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ
ａｌ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３ｒｄ ｅｄ．，ｖｏｌ
．２，（Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｐｈｉｌ
ａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）（１９９５）］。ＡＡＶの４．７ｋｂゲノムは、２つ
の逆方向末端反復（ＩＴＲ）、およびそれぞれＲｅｐタンパク質およびＣａｐタ
ンパク質をコードしている２つの読み枠を特徴とする。Ｒｅｐ読み枠は、分子量
７８ｋＤ，６８ｋＤ，５２ｋＤおよび４０ｋＤの４種のタンパク質をコードして
いる。これらのタンパク質は、主として、ＡＡＶ複製および宿主細胞染色体への
ＡＡＶの組み込みの調節において機能している。Ｃａｐ読み枠は、分子量８５ｋ
Ｄ（ＶＰ１），７２ｋＤ（ＶＰ２）および６１ｋＤ（ＶＰ３）の３種の構造タン
パク質をコードしている［Ｂｅｒｎｓ、前出］。ＡＡＶビリオンにおける全タン
パク質の８０％以上がＶＰ３である。２つのＩＴＲは、ＡＡＶ複製、パッケージ
ングおよび組み込みのために必須のｃｉｓ要素のみである。ＡＡＶ ＩＴＲには
「フリップ」および「フロップ」と呼ばれる２つのコンホメーションが存在する
。コンホメーションにおけるこれらの違いは、ＩＴＲを使用して複製を開始およ
び再開始するアデノ随伴ウイルスの複製モデルから生じる［Ｒ．Ｏ．Ｓｎｙｄｅ
ｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６７：６０９６−６１０４（１９９３）
；Ｋ．Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，５ ４ ：３１６−３２９（１９９０）］。

【０００４】 ＡＡＶは、霊長類、イヌ、鳥類およびヒトを含む、多くの動物種において発見
された［Ｆ．Ａ．Ｍｕｒｐｈｙ ｅｔ ａｌ．，”Ｔｈｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃ
ａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｓｉ
ｘｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍ
ｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｔａｘｏｎｏｍｙ ｏｆ Ｖｉｒｕｓｅｓ”，Ａｒｃｈｉｖ ｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｖｉｅｎ
ｎａ（１９９５）］。５種の既知霊長類ＡＡＶ（ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−５）に加
えて、また、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２に密接に関連するその他
の血清型が単離された［Ｅ．Ａ．Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ ｏｌ．，７２ ：３０９−３１９（１９９８）］。すべての既知ＡＡＶ血清型の中
で、ＡＡＶ−２は、その感染性クローンが最初に作られたので、多分、最もよく
特徴付けられた血清型である［Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒ ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７９ ：２０７７−２０８１（１９
８２）］。続いて、また、ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４およびＡＡ
Ｖ−６が決定された［Ｒｕｔｌｅｄｇｅ，前出；Ｊ．Ａ．Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：６８２３−６８３３（１９９７）；Ｓ．
Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．，２２１：２０８−２１７（
１９９６）］。一般に、すべてのＡＡＶは、ヌクレオチド配列において８０％以
上の相同性を共有している。

【０００５】 多数のユニークな性質が、ＡＡＶをしてヒト遺伝子治療のための有望なベクタ
ーにさせる［Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃ ｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８ ：９７−１２９（
１９９２）］。他のウイルスベクターとは異なり、ＡＡＶは、いかなる既知のヒ
トの病気にも関連していないことが分かっており、そして一般に、病原性ではな
いと考えられる。野生型ＡＡＶは、部位特異的様式で宿主染色体中に組み込むこ
とができる［Ｒ．Ｍ．Ｋｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７ ：２２１１−２２１５（１９９０）−Ｒ．Ｊ．Ｓａｍ
ｕｌｓｋｉ，ＥＭＢＯ Ｊ．，１０（１２）：３９４１−３９５０（１９９１）
］。ｒｅｐタンパク質がｔｒａｎｓにおいて供給される場合は、組み換えＡＡＶ
ベクターは、染色体１９において組織培養細胞中に組み込むことができる［Ｃ．
Ｂａｌａｇｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：３２９９−３３０６
（１９９７）；Ｒ．Ｔ．Ｓｕｒｏｓｋｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７ １ ：７９５１−７９５９（１９９７）］。ＡＡＶの組み込まれたゲノムは、筋肉
、肝臓および脳を含む多くの組織において長期の遺伝子発現を可能にすることが
分かった［Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，３（３）：３０６
−３１２（１９９７）；Ｒ．Ｏ．Ｓｎｙｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６ ：２７０−２７６（１９９７）；Ｘ．Ｘｉａｏ ｅｔ
ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１４４：１１３−１
２４（１９９７）；Ｘｉａｏ、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０（１１）：８０９８−−
８１０８（１９９６）］。

【０００６】 ＡＡＶ−２は、ヒト集団の約８０−９０％において存在することが分かってい
る。より早期の研究は、ＡＡＶ−２に対する中和抗体が伝播していることを示し
た［Ｗ．Ｐ．Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２：７１６−７２
２（１９７０）］。そのような抗体の存在は、その他のメリットにもかかわらず
、ＡＡＶ−２に基づくＡＡＶベクターの有用性を有意に減少するであろう。当該
技術分野において必要とされるものは、中和抗体の存在を含む不利益なしに、上
記のことを含むＡＡＶ−２の利点を特徴とするベクターである。

【０００７】 発明の概要 １つの態様では、本発明は、配列番号：１、配列番号：１に相補的な鎖、なら
びに配列番号：１およびその相補鎖に相補的なｃＤＮＡおよびＲＮＡの中から選
ばれる単離されたＡＡＶ−１核酸分子を提供する。

【０００８】 その他の態様では、本発明は、５’ＩＴＲ配列、配列番号：１のｎｔ１〜１４
３；３’ＩＴＲ配列、配列番号：１のｎｔ４５７６〜４７１８、およびそれらの
フラグメントを含む、ＡＡＶ ＩＴＲ配列を提供する。

【０００９】 なおその他の態様では、本発明は、ＡＡＶ−１ＩＴＲおよび選ばれた導入遺伝
子（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）を含んでなる組み換えベクターを提供する。好ましく
は、ベクターは、両５’および３’ＡＡＶ−１ＩＴＲを含有し、これらの間に選
ばれた導入遺伝子が位置する。

【００１０】 なおその他の態様では、本発明は、配列番号：１のｎｔ２３６〜２９９の配列
もしくはその機能性フラグメントをもつＡＡＶ−１Ｐ５プロモーターを含んでな
る組み換えベクターを提供する。

【００１１】 さらなる態様では、本発明は、ＡＡＶ−１ｒｅｐコーディング領域およびＡＡ
Ｖ−１ｃａｐコーディング領域をコードしている核酸分子を提供する。

【００１２】 なおその他の態様では、本発明は、本発明の組み換えウイルスベクターにより
形質導入された宿主細胞を提供する。さらに、本発明は、本発明のＡＡＶ−１Ｐ
５プロモーターにより安定に形質導入された宿主細胞を提供する。

【００１３】 なおさらなる態様では、本発明は、キャリヤーおよび本発明のベクターを含ん
でなる製薬組成物を提供する。

【００１４】 なおその他の態様では、本発明は、その発現を指図する配列の制御下に選ばれ
た導入遺伝子およびアデノ随伴ウイルス１（ＡＡＶ−１）ビリオンを含んでなる
組み換えウイルスベクターを選ばれた宿主に送達する段階を伴う、宿主への導入
遺伝子のＡＡＶに媒介される送達方法を提供する。

【００１５】 その他の態様では、本発明は、本発明のベクターを用いる選ばれた遺伝子産物
のイン・ビトロでの生産方法を提供する。

【００１６】 本発明の他の態様および利点は、本発明の詳細な記述より当業者には容易に明
らかになるであろう。

【００１７】 図面の簡単な説明 図１Ａ−１Ｃは、ＡＡＶ−１［配列番号：１］、ＡＡＶ−２［配列番号：１８
］およびＡＡＶ−６［配列番号：１９］のヌクレオチドの整列を示す。整列は、
Ｍａｃ Ｖｅｃｔｏｒ６．０を用いて実施された。ＡＡＶ−１の完全配列は、上
の列に示される。ＡＡＶ−１と同一なＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６におけるヌク
レオチドは、「・」の記号で表され、そしてギャップは、「−」で表される。Ａ
ＡＶ−１およびＡＡＶ−６の３’ＩＴＲは、異なる方向で示されることに注目。

【００１８】 図２は、ＡＡＶ−１ ＩＴＲの予想される２次構造を示す。ＡＡＶ−２および
ＡＡＶ−６におけるヌクレオチドは、それぞれイタリックおよび太字で示される
。

【００１９】 図３Ａは、ＡＡＶ−６が、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２間の相同的組み換えか
らいかにして生じるの仮説を示す。ＡＡＶ−１の主要素は、グラフにおいて指示
される。ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６の間で共有される領域は、波
線による四角で示される。

【００２０】 図３Ｂは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６中の７１ｂｐ相同領域の
詳細な図示である。これらの血清型において異なるヌクレオチドは矢印によって
指示される。

【００２１】 図４Ａは、組み換えＡＡＶ−１および組み換えＡＡＶ−２ウイルスを介するｈ
ＡＡＴの送達に続く、血清中のヒトα１抗トリプシン（α１ＡＴ）の発現レベル
を示すバーチャートである。

【００２２】 図４Ｂは、組み換えＡＡＶ−１および組み換えＡＡＶ−２ウイルスを介するエ
リトロポイエチン（ｅｐｏ）遺伝子の送達に続く、血清中のｅｐｏの発現レベル
を示すバーチャートである。

【００２３】 図５Ａは、実施例７に記述されるようにα１ＡＴの送達に続く、肝臓中のα１
ＡＴの発現レベルを示すバーチャートである。

【００２４】 図５Ｂは、実施例７に記述されるようにｅｐｏの送達に続く、肝臓中のｅｐｏ
の発現レベルを示すバーチャートである。

【００２５】 図５Ｃは、実施例７に記述されるように肝臓へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送
達に続く、ＡＡＶ−１に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートであ
る。

【００２６】 図５Ｄは、実施例７に記述されるように肝臓へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送
達に続く、ＡＡＶ−２に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートであ
る。

【００２７】 図６Ａは、実施例７に記述されるようにα１ＡＴの送達に続く、筋肉中のα１
ＡＴの発現レベルを示すバーチャートである。

【００２８】 図６Ｂは、実施例７に記述されるようにｅｐｏの送達に続く、筋肉中のｅｐｏ
の発現レベルを示すバーチャートである。

【００２９】 図６Ｃは、実施例７に記述されるように筋肉へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送
達に続く、ＡＡＶ−１に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートであ
る。

【００３０】 図６Ｄは、実施例７に記述されるように筋肉へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送
達に続く、ＡＡＶ−２に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートであ
る。

【００３１】 発明の詳細な記述 本発明は、血清型１のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ−１）についての新規な核
酸配列を提供する。また、これらのＡＡＶ−１配列のフラグメントが提供される
。中でも特に望ましいＡＡＶ−１フラグメントは、逆方向末端反復配列（ＩＴＲ
）、ｒｅｐおよびｃａｐである。これらのフラグメントの各々は、種々のベクタ
ー系および宿主細胞において、例えばカセットとして容易に利用することができ
る。そのようなフラグメントは、それのみで、他のＡＡＶ−１配列もしくはフラ
グメントと組み合わせて、または他のＡＡＶもしくは非ＡＡＶウイルス配列から
の要素と組み合わせて使用することができる。１つの特定の望ましい実施態様で
は、カセットは、選ばれた導入遺伝子に隣接する本発明のＡＡＶ−１ ＩＴＲを
含有してもよい。その他の望ましい実施態様では、カセットは、例えば、組み換
え（ｒＡＡＶ）ウイルスの作成における使用のために、ＡＡＶ−１ｒｅｐおよび
／またはｃａｐタンパク質を含有してもよい。

【００３２】 かくして、ＡＡＶ−１配列およびそのフラグメントは、ｒＡＡＶの作成におい
て有用であり、そしてまたアンチセンス送達ベクター、遺伝子治療ベクターもし
くはワクチンベクターとして有用である。さらに、本発明は、核酸分子、遺伝子
送達ベクター、および本発明のＡＡＶ−１配列を含有する宿主細胞を提供する。
また、ＡＡＶベクターを用いる遺伝子送達の新規方法が提供される。

【００３３】 本明細書に記述されるように、本発明のＡＡＶ−１キャプシドタンパク質を含
有する本発明のベクターは、中和抗体が、他のＡＡＶ血清型に基づくベクター、
ならびに他のウイルスベクターの有効性を減少させる場合の応用における使用の
ために、特に良好に適合される。本発明のｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶ再投与
および反復遺伝子治療において特に有利である。

【００３４】 本発明のこれらおよび他の実施態様および利点は、より詳細に以下に記述され
る。本明細書および請求項を通して使用されるように、用語「含有する」は、他
の成分、要素、完全体、段階およびそれに類するものを含めている。

【００３５】 １．ＡＡＶ−１核酸およびタンパク質配列 本発明のＡＡＶ−１核酸配列は、配列番号：１のＤＮＡ配列（図１Ａ−１Ｃ）
を含み、これは４７１８ヌクレオチドからなる。さらに、本発明のＡＡＶ−１核
酸配列は、配列番号：１に相補的である鎖、ならびに配列番号：１およびその相
補鎖に対応するＲＮＡおよびｃＤＮＡ配列を包含する。また、本発明の核酸配列
には、配列番号：１およびその相補鎖の天然の変異体および工学的改変体も含ま
れる。そのような改変は、例えば、当該技術分野において既知である標識、メチ
ル化、および１個以上の天然に存在するヌクレオチドの類似体による置換を含む
。

【００３６】 さらに、本発明には、配列番号：１に８５％超、好ましくは少なくとも約９０
％、より好ましくは少なくとも約９５％、もっとも好ましくは少なくとも約９８
−９９％同一性もしくは相同性である核酸配列が含まれる。核酸配列の文脈中、
用語「パーセント配列同一性」もしくは［同一性の」は、最大の対応のために整
列された場合に、同じである２配列における残基を指す。配列同一性比較の長さ
は、全長配列、または少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０−
２４ヌクレオチド、少なくとも約２８−３２ヌクレオチド、好ましくは少なくと
も約３６以上のヌクレオチドにおけるフラグメントにわたっていてもよい。ヌク
レオチド配列同一性を測定するために使用できる、当該技術分野において既知の
多数の異なる計算法が存在する。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Ｆａｓｔａ
，ＧＣＧ Ｖｅｒｓｉｏｎ６．１を用いて比較することができる。Ｆａｓｔａは
、疑問および検索配列間において最良のオーバーラップ領域の整列およびパーセ
ント配列同一性を提供する（本明細書に引用によって組み入れられている、Ｐｅ
ｒｓｏｎ，１９９０）。例えば、核酸配列間のパーセント配列同一性は、Ｆａｓ
ｔａを用いて、引用によって本明細書に組み入れられている、ＧＣＧ Ｖｅｒｓ
ｉｏｎ６．１において提供されるようなそのデフォルトパラメーター（ワードサ
イズ６およびスコアマトリックスのためのＮＯＰＡＭファクター）によって決定
することができる。

【００３７】 核酸もしくはそのフラグメントに言及する場合、用語「実質的相同性」もしく
は「実質的類似性」は、適当なヌクレオチド挿入もしくは欠失に関してその他の
核酸（もしくはその相補鎖）と最適に整列された場合、配列の少なくとも約９５
−９９％においてヌクレオチド配列同一性が存在することを示す。

【００３８】 また、配列番号：１のフラグメント、その相補鎖、それに相補的なｃＤＮＡお
よびＲＮＡが、本発明内に含まれる。適当なフラグメントは、長さ少なくとも１
５ヌクレオチドであり、そして生物学的な興味のある機能性フラグメントを包含
する。これらのフラグメントあるものは、図１Ａ−１Ｃを参照して同定すること
ができる。特に望ましい機能性フラグメントの例は、本発明のＡＡＶ−１逆方向
末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３およびＡＡＶ−４の１
４５ｎｔＩＴＲに対して、ＡＡＶ−１ＩＴＲは、１４３ヌクレオチドのみからな
ることが分かっていて、なお有利には、ＡＡＶ−２ＩＴＲの、部位特異的組み込
み指図する能力に関与すると考えられているＴ型ヘアピン構造を特徴とする。さ
らに、ＡＡＶ−１は、５’および３’ＩＴＲが同一であるという点で、他のＡＡ
Ｖ血清型の中でもユニークである。ＡＡＶ−１の全長５’ＩＴＲ配列は、配列番
号：１のヌクレオチド１〜１４３（図１Ａ）において提供され、そしてＡＡＶ−
１の全長３’ＩＴＲ配列は、配列番号：１のｎｔ４５７６〜４７１８（図１Ｃ）
において提供される。当業者は、全長未満の５’および／または３’ＩＴＲ配列
を種々の目的のために容易に利用することができ、そして例えばＳａｍｕｌｓｋ
ｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１３５−１４３（１９８３）においてＡＡ
Ｖ−２ＩＴＲについて記述されているように、慣用の技術を用いて改変ＩＴＲを
構築することができる。

【００３９】 ＡＡＶ−１ゲノムのその他の望ましい機能性フラグメントは、決定的な調節要
素および機能を維持しながら、ＡＡＶ Ｐ５プロモーター中にユニークな配列を
もつＡＡＶ−１のＰ５プロモーターである。このプロモーターは、配列番号：１
のｎｔ２３６〜２９９（図１Ａ）内に位置している。興味ある機能性フラグメン
トの他の例は、ｒｅｐ／ｃａｐの結合（ｊｕｎｃｔｉｏｎ）における配列、例え
ば、ｎｔ２３０６−２２２３にわたる配列、ならびにこの結合のいずれかの側に
５０ヌクレオチドを含有してもよいこの結合を包含するより大きいフラグメント
を含む。なお他の機能性フラグメントの例は、ｒｅｐタンパク質をコードしてい
る配列を含む。Ｒｅｐ７８は、配列番号：１のｎｔ３３４−２３０６の領域に位
置し；Ｒｅｐ６８は、ｎｔ３３４−２２７２の領域に位置し、そして配列番号：
１のｎｔ１９２４−２２２０にわたるイントロンを含有する。Ｒｅｐ５２は、配
列番号：１のｎｔ１００７−２３０４の領域に位置し；ｒｅｐ４０は、ｎｔ１０
０７−２２７２の領域に位置し、そして配列番号：１のｎｔ１９２４−２２４６
にわたるイントロンを含有する。また、キャプシドタンパク質、ＶＰ１［配列番
号：１のｎｔ２２２３−４４３１］、ＶＰ２［配列番号：１のｎｔ２６３４−４
４３２］およびＶＰ３［配列番号：１のｎｔ２８２９−４４３２］をコードして
いる配列も興味深い。興味ある他のフラグメントは、ＡＡＶ−１Ｐ１９配列、Ａ
ＡＶ−１Ｐ４０配列、ｒｅｐ結合部位、および末端分離（ｒｅｓｏｌｕｔｅ）部
位（ＴＲＳ）を含んでもよい。

【００４０】 さらに、本発明は、本発明のＡＡＶ−１核酸によってコードされているタンパ
ク質およびそのフラグメントを提供する。特に望ましいタンパク質は、ｒｅｐお
よびｃａｐタンパク質であって、これらは先に特定されたヌクレオチド配列によ
ってコードされている。これらのタンパク質は、ｒｅｐ７８［配列番号：５］、
ｒｅｐ６８［配列番号：７］、ｒｅｐ５２［配列番号：９］、ｒｅｐ４０［配列
番号：１１］、ｖｐ１［配列番号：１３］、ｖｐ２［配列番号：１５］およびｖ
ｐ３［配列番号：１７］、およびそれらの機能性フラグメントを含み、一方、ｒ
ｅｐおよびｃａｐタンパク質の配列は、ＡＡＶ−６のそれらと密接に関係してい
ることが分かっているが、アミノ酸配列における差異（下記表１参照）、ならび
に免疫系によるこれらのタンパク質の認識における差異が存在する。しかしなが
ら、当業者は、生物学的興味のある他の適当なタンパク質もしくはタンパク質フ
ラグメントを容易に選択するであろう。適当には、そのようなフラグメントは、
長さ少なくとも８アミノ酸である。しかしながら、他の所望の長さのフラグメン
トも、容易に利用できる。そのようなフラグメントは、組み換え的に、または他
の適当な手段、例えば化学合成によって作成されてもよい。

【００４１】 本発明の配列、タンパク質およびフラグメントは、組み換え体作成、化学合成
もしくは他の合成手段を含む、いかなる適当な手段によって作成されてもよい。
そのような作成方法は、当業者の知識内に存在し、そして本発明を限定するもの
ではない。

【００４２】 ＩＩ．ウイルスベクター その他の態様では、本発明は、標的細胞への異種遺伝子もしくは他の核酸配列
の送達のための、フラグメントを含む本発明のＡＡＶ−１配列を利用するベクタ
ーを提供する。適当には、これらの異種配列（すなわち導入遺伝子）は、標的細
胞において発現されることが可能であるタンパク質もしくは遺伝子産物をコード
している。そのような導入遺伝子は、「ミニジーン（ｍｉｎｉｇｅｎｅ）」の形
態で構築されてもよい。そのような「ミニジーン」は、宿主細胞においてその遺
伝子を転写し、そして遺伝子産物を発現するのに必要な選ばれた異種配列および
他の調節要素を含む。かくして、遺伝子配列は、それらの転写を許す様式で調節
成分に操作可能に結合される。そのような成分は、ウイルスベクターを含有する
細胞において導入遺伝子の発現を推進するのに必要な通常の調節要素を含む。ま
た、ミニジーンは、導入遺伝子に結合され、そして他の調節要素とともに、組み
換えベクターの選ばれたウイルス配列内に位置する選ばれたプロモーターを含有
してもよい。

【００４３】 プロモーターの選択は、日常的な問題であり、そして本発明を限定するもので
はない。有用なプロモーターは、構成的プロモーターもしくは調節される（誘導
性）プロモーターであってもよく、これは、発現されるべき導入遺伝子の時期お
よび量の制御を可能にする。例えば、望ましいプロモーターは、サイトメガロウ
イルス（ＣＭＶ）即時型プロモーター［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ， Ｃｅｌｌ，４１ ：５２１−５３０（１９８５）参照］、ラウス肉腫ウイルスＬＴ
Ｒプロモーター／エンハンサー、およびニワトリ細胞質β−アクチンプロモータ
ー［Ｔ．Ａ．ｋｏｓｔ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１（
２３）：８２８７（１９８３）］を含む。なお他の望ましいプロモーターは、ア
ルブミンプロモーターおよびＡＡＶ Ｐ５プロモーターである。場合によっては
、選ばれたプロモーターは、異種のエンハンサーとの結合において使用される、
例えば、β−アクチンプロモーターが、ＣＭＶエンハンサーと結合されて使用さ
れてもよい。まだ他の適当なまたは望ましいプロモーターおよびエンハンサーは
、当業者によって選択することができる。

【００４４】 また、ミニジーンは、好ましくは、転写物の有効なポリアデニル化（ポリＡも
しくはｐＡ）のために要求されるシグナルならびに機能的スプライスドナーおよ
びアクセプター部位をもつイントロンを提供する配列を含む、ウイルスベクター
配列に対して異種の核酸配列を含有してもよい。本発明の代表的なベクターにお
いて使用される共通のポリＡ配列は、パポーバウイルスＳＶ−４０由来のもので
ある。ポリＡ配列は、一般に、導入遺伝子配列の下流でウイルスベクター配列の
上流のミニジーン中に挿入される。また、共通のイントロン配列は、ＳＶ−４０
から得られ、そしてＳＶ４０Ｔイントロン配列として言及される。また、本発明
のミニジーンは、望ましくは、プロモーター／エンハンサー配列と導入遺伝子間
に位置するようなイントロンを含有してもよい。これらおよび他の共通のベクタ
ー要素の選択は慣例的であり［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，”Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”
，２ｄ ｅｄｉｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）および本明細書に引用される文献、参照
］、そして多くのそのような配列が、商業的および工業的起源ならびにＧｅｎｅ
ｂａｎｋから得ることができる。

【００４５】 導入遺伝子の選択は、本発明を限定するものではない。適当な導入遺伝子は、
望ましいリポーター遺伝子、治療遺伝子、および場合によっては、免疫原性ポリ
ペプチドをコードしている遺伝子の中から容易に選ぶことができる。適当なリポ
ーター遺伝子の例は、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）、アルカリホスファ
ターゼ遺伝子、および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を含む。治療遺伝子の例は
、なかんずくサイトカイン、成長因子、ホルモンおよび分化因子を含む。導入遺
伝子は、当業者によって容易に選択することができる。例えば、他の適当な導入
遺伝子を特定しているＷＯ９８／０９６５７を参照。

【００４６】 適当には、本発明のベクターは、最小でも、ＡＡＶ−１配列のフラグメントお
よびタンパク質からなるカセットを含有する。１つの実施態様では、本発明のベ
クターは、少なくとも１つが本発明のＡＡＶ−１ＩＴＲである、５’ＩＴＲおよ
び３’ＩＴＲによって隣接される選ばれた導入遺伝子を含有する。適当には、本
発明のベクターは、本発明のＡＡＶ−１Ｐ５プロモーターを含有してもよい。な
おその他の実施態様では、本発明のプラスミドもしくはベクターは、ＡＡＶ−１
ｒｅｐ配列を含有する。なおその他の実施態様では、本発明のプラスミドもしく
はベクターは、本発明の少なくとも１つのＡＡＶ−１ｃａｐタンパク質を含有す
る。もっとも適当には、これらのＡＡＶ−１由来のベクターは、本明細書に記述
されるように、ウイルスベクター中に組み立てられる。

【００４７】 Ａ．ＡＡＶウイルスベクター １つの態様では、本発明は、本発明のＡＡＶ−１キャプシドタンパク質を用い
て作成される組み換えＡＡＶ−１ウイルスベクターを提供する。本発明のパッケ
ージされたｒＡＡＶ−１ビリオンは、選ばれたミニジーンに加えて、他のＡＡＶ
−１配列を含有してもよく、または他のＡＡＶ血清型からの配列を含有してもよ
い。

【００４８】 ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、そして適当な方法の選択は、
本発明を限定するものではない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｊ． Ｖｉｏｌ．，７０ ：５２０−５３２（１９９３）および米国特許第５，４７８，
７４５号、参照。１つの適当な方法では、選ばれた宿主細胞は、ｒｅｐタンパク
質をコードしているＡＡＶ配列、ＡＡＶｃａｐタンパク質をコードしている遺伝
子、およびパッケージングとそれに続く送達のための配列を与えられる。望まし
くは、その方法は、本発明のＡＡＶ−１ｒｅｐおよび／またはｃａｐタンパク質
をコードしている配列を利用する。

【００４９】 １つの実施態様では、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子および送達のための配列は、これ
らの遺伝子および配列を担持しているベクターのコ・トランスフェクションによ
って与えられる。１つの現在好適な実施態様では、ｃｉｓ（ベクター）プラスミ
ド、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含有しているｔｒａｎｓプラスミド、およびア
デノウイルスヘルパー遺伝子を含有しているプラスミドが、適当な細胞系、例え
ば２９３中にコ・トランスフェクションされる。あるいはまた、これらの機能の
１つ以上が、別々のベクターを介してｔｒａｎｓで供給されてもよく、または適
当に工作されたパッケージング細胞系において見いだされてもよい。

【００５０】 代表的なｃｉｓプラスミドは、５’から３’の順で、ＡＡＶ５’ＩＴＲ、選ば
れた導入遺伝子およびＡＡＶ３’ＩＴＲを含有できる。１つの望ましい実施態様
では、少なくとも１つのＡＡＶＩＴＲは１４３ｎｔＡＡＶ−１ＩＴＲである。し
かしながら、他のＡＡＶ血清型ＩＴＲも容易に選択することができる。適当には
、全長ＩＴＲが利用される。しかしながら、当業者は、慣用の技術を用いて改変
されたＡＡＶＩＴＲを容易に作成することができる。同様に、そのようなプラス
ミドの構築方法も当業者には周知である。

【００５１】 ｒＡＡＶ−１ビリオン粒子の作成における使用のためのｔｒａｎｓプラスミド
は、既知の技術にしたがって作成されてもよい。１つの望ましい実施態様では、
このプラスミドは、ＡＡＶ−１のｒｅｐおよびｃａｐタンパク質、またはその機
能性フラグメントを含有する。あるいはまた、ｒｅｐ配列は、その他の選ばれた
ＡＡＶ血清型由来であってもよい。

【００５２】 次に、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓプラスミドは、野生型ヘルパーウイルス（例え
ば、Ａｄ２，Ａｄ５もしくはヘルペスウイルス）か、またはより望ましくは、複
製能欠損アデノウイルスとともに、選ばれた宿主細胞中にコ・トランスフェクシ
ョンされてもよい。あるいはまた、ｃｉｓおよびｔｒａｎｓプラスミドは、必要
なヘルパー機能を備えているトランスフェクションされるプラスミドと一緒に、
選ばれた宿主細胞中にコ・トランスフェクションされてもよい。適当な宿主細胞
の選択は、当業者には周知であり、そしてなかんずく、２９３細胞、Ｈｅｌａ細
胞のような哺乳類細胞を含む。

【００５３】 あるいはまた、ｃｉｓプラスミドおよび場合によってはｔｒａｎｓプラスミド
は、本発明の所望のＡＡＶ−１配列を含有しているｒＡＡＶの産生に必要な残留
ヘルパー機能を備えているパッケージング細胞系中にトランスフェクションされ
てもよい。適当なパッケージング細胞系の例は、ＡＡＶ−２キャプシドが所望さ
れる場合は、相同Ｐ５プロモーターの調節下でＡＡＶ−２ｒｅｐおよびｃａｐ遺
伝子を安定に発現するＢ−５０である。この細胞系は、コンカテマー（ｃｏｎｃ
ａｔｏｍｅｒ）形態におけるＰ５−ｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子カセットの多数コピー
（少なくとも５コピー）の細胞染色体中への組み込みを特徴とする。このＢ−５
０細胞系は、ブダペスト条約の約定に従って、寄託番号ＣＲＬ−１２４０１の下
、１９９７年９月１８日に、アメリカン タイプ カルチャー コレクション、
１０８０１ ユニバーシティ ブールバード、マナサス、バージニア ２０１１
０−２２０９（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ，１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓ
ｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０−２２０９）に寄託された。しかしなが
ら、本発明は、パッケージング細胞系の選択に関して限定されるものではない。

【００５４】 ＡＡＶ−１キャプシドタンパク質に基づく代表的な導入ベクターは、実施例４
においてより詳細に記述されるように、両イン・ビボおよびイン・ビトロで試験
された。これらの研究では、ＡＡＶ−１ビリオンをもつ組み換えＡＡＶベクター
が、両マウス肝臓および筋肉に導入できることが例証された。多数のヒト集団に
おいて存在しているＡＡＶ−１の中和抗体は、他のＡＡＶ血清型とは異なるパタ
ーンを示し、したがってＡＡＶ−１ビリオンを中和しないので、当業者によって
作成できるこれら、および他のＡＡＶ−１に基づく遺伝子治療ベクターは、選ば
れた宿主細胞および遺伝子治療患者への遺伝子送達のために有益である。当業者
は、当業者には既知の種々の技術を用いて、ここに提供されるＡＡＶ−１キャプ
シドタンパク質を含有している他のｒＡＡＶウイルスベクターを容易に作成する
ことができる。なお、ＡＡＶ−１配列およびその他の血清型のＡＡＶキャプシド
を含有する他のｒＡＡＶウイルスベクターも、同様に作成することができる。

【００５５】 Ｂ．他のウイルスベクター 当業者は、本発明のＡＡＶ−１配列が、イン・ビトロ、エクス・ビボもしくは
イン・ビボ遺伝子送達のためのこれらおよび他のウイルスベクター系における使
用のために容易に適用できることを、容易に理解できる。ＡＡＶ−１ＩＴＲ配列
、ＡＡＶ−１ｒｅｐ、ＡＡＶ−１ｃａｐおよびＡＡＶ−１Ｐ５プロモーター配列
は、そのようなウイルスベクター系における使用のために特によく適している。

【００５６】 例えば、１つの望ましい実施態様では、本発明のＡＡＶ−１ＩＴＲ配列は、Ａ
ＡＶ−１５’ＩＴＲ、興味ある非ＡＡＶＤＮＡ配列（例えばミニジーン）および
３’ＩＴＲを含み、そして機能性ｒｅｐ／ｃａｐを欠いている発現カセットにお
いて使用されてもよい。そのようなＡＡＶ−１ＩＴＲを含有するカセットは、所
望の宿主細胞へのその後のトランスフェクションのためのプラスミド、例えば前
記ｃｉｓプラスミド上に位置してもよい。さらに、この発現カセットは、細胞の
感染を許すために選ばれた血清型のＡＡＶキャプシドを提供されてもよく、また
はｒＡＡＶビリオンのパッケージングのために所望の宿主細胞中へ安定にトラン
スフェクションされてもよい。そのような発現カセットは、アデノウイルス系お
よびレンチウイルス系を含む他のウイルス系における使用のために容易に適合で
きる。Ａｄ／ＡＡＶベクターを作成する方法は当業者には周知である。１つの望
ましい方法は、ＰＣＴ／ＵＳ９５／１４０１８に記述されている。しかしながら
、本発明は、いかなる特定の方法にも限定されるものではない。

【００５７】 本発明のその他の態様は、配列番号：１のｎｔ２３６−２９９にわたる領域に
位置する新規なＡＡＶ−１Ｐ５プロモーターである。このプロモーターは、所望
の導入遺伝子の発現を推進するために種々のウイルスベクターにおいて有用であ
る。

【００５８】 同様に、当業者は、種々のベクター系における使用のための本発明のＡＡＶ−
１ゲノムの他のフラグメントを容易に選択することができる。そのようなベクタ
ー系は、例えば、なかんずくレンチウイルス、レトロウイルス、ポックスウイル
ス、ワクシニアウイルスおよびアデノウイルス系を含んでもよい。これらのベク
ター系の選択は、本発明の限定するものではない。

【００５９】 Ｃ．宿主細胞およびパッケージング細胞系 なおその他の態様では、本発明は、所望の導入遺伝子の発現またはｒＡＡＶ粒
子の産生を可能にするために、本発明のＡＡＶ−１核酸配列により、一過性にト
ランスフェクションされてもよい宿主細胞を提供する。例えば、選ばれた宿主細
胞は、慣用の技術を用いてＡＡＶ−１Ｐ５プロモーター配列および／またはＡＡ
Ｖ−１５’ＩＴＲ配列によりトランスフェクションされてもよい。本発明のトラ
ンスフェクションされた細胞系に対するＡＡＶヘルパー機能の供与は、感染性ｒ
ＡＡＶ粒子としてのｒＡＡＶのパッケージングをもたらす。そのような細胞系は
、本発明のＡＡＶ−１配列を使用して、既知技術［例えば米国特許第５，６５８
，７８５号、参照］にしたがって作成することができる。

【００６０】 あるいはまた、本発明の宿主細胞は、本発明のｒＡＡＶ発現カセット、および
ＡＡＶ−１ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子のコピーを用いて、安定にトランスフェク
ションされてもよい。適当な親細胞系は、哺乳類細胞系を含み、そして非サル哺
乳類細胞由来の宿主細胞を選択することが望ましい。適当な親細胞系の例は、限
定されるものではないが、Ｈｅｌａ［ＡＴＣＣ ＣＣＬ２］、Ａ５４９［ＡＴＣ
Ｃ寄託番号ＣＣＬ１８５］，ＫＢ［ＣＣＬ１７］、Ｄｅｔｒｏｉｔ［例えばＤｅ
ｔｒｏｉｔ５１０，ＣＣＬ７２］およびＷＩ−３８［ＣＣＬ７５］細胞を含む。
これらの細胞系は、アメリカン タイプ カルチャー コレクション、１０８０
１ ユニバーシティ ブールバード、マナサス、バージニア ２０１１０−２２
０９ ＵＳＡからすべて得ることができる。他の適当な親細胞系が、他の起源か
ら得られてもよく、そして本発明のＰ５および／またはＡＡＶｒｅｐおよびｃａ
ｐ配列を含有する安定な細胞系を構築するために使用されてもよい。

【００６１】 上記のように生成された組み換えベクターは、興味あるＤＮＡの細胞への送達
のために有用である。

【００６２】 ＩＩＩ．ＡＡＶ−１由来のベクターを介して遺伝子を送達する方法 その他の態様では、本発明は、本発明のＡＡＶ−１配列（もしくはその機能性
フラグメント）を用いて生成された組み換えウイルスベクターにより、選ばれた
宿主細胞をトランスフェクションするか、または感染させることを伴う宿主への
導入遺伝子の送達方法を提供する。送達方法は、当業者には周知であり、そして
本発明を限定するものではない。

【００６３】 １つの望ましい実施態様では、本発明は、宿主への導入遺伝子のＡＡＶに媒介
される送達方法を提供する。この方法は、導入遺伝子およびＡＡＶ−１キャプシ
ドタンパク質の発現を指図する配列の制御下に選ばれた導入遺伝子を含有する組
み換えウイルスベクターにより、選ばれた宿主細胞をトランスフェクションする
か、または感染させることを必要とする。

【００６４】 場合によっては、宿主からのサンプルが、最初に、選ばれたＡＡＶ血清型に対
する抗体の存在についてアッセイされる。中和抗体を検出するための種々のアッ
セイ型式が、当業者には周知である。そのようなアッセイの選択は、本発明を限
定されるものではない。例えば、Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍ ｅｄ．，３ （３）：３０６−３１２（Ｍａｒｃｈ １９９７）およびＷ．Ｃ．Ｍ
ａｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，９：４７
７−４８５（Ｍａｒｃｈ １，１９９８）、参照。このアッセイの結果は、例え
ばそのキャプシド血清型に特異的な中和抗体の不在によって、特定の血清型のキ
ャプシドタンパク質を含有するＡＡＶベクターが、送達のために好適であるかを
決定するするために使用できる。

【００６５】 この方法の１つの態様では、ＡＡＶ−１キャプシドタンパク質をもつベクター
の送達は、異なる血清型ＡＡＶキャプシドタンパク質をもつベクターを介する遺
伝子の送達に先行しても、または後に続いてもよい。かくして、ｒＡＡＶベクタ
ーを介する遺伝子送達は、選ばれた宿主細胞への反復遺伝子送達のために使用で
きる。望ましくは、後に投与されるｒＡＡＶベクターは、最初のｒＡＡＶベクタ
ーと同じ導入遺伝子を担持しているが、後に投与されるベクターは、最初のベク
ターとは異なる血清型のキャプシドタンパク質を含有している。例えば、最初の
ベクターがＡＡＶ−２キャプシドタンパク質をもつ場合は、後に投与されるベク
ターは、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−３Ａ、ＡＡＶ−３Ｂ、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−
６を含む、他の血清型の中から選ばれるキャプシドタンパク質を有してもよい。

【００６６】 かくして、本発明のｒＡＡＶ−１由来組み換えウイルスベクターは、生物が、
１種以上のＡＡＶ血清型に対する中和抗体をもつ場合でさえも、イン・ビボもし
くはエクス・ビボで選ばれた宿主細胞に選ばれた導入遺伝子を送達できる有効な
遺伝子伝達を提供する。これらの組成物は、特に、治療目的のための遺伝子送達
に良好に適合される。しかしながら、本発明の組成物は、また、免疫化において
有用である。さらに、また、本発明の組成物は、イン・ビトロにおいて所望の遺
伝子産物の生産のために使用されてもよい。

【００６７】 上記組み換えベクターは、公表された方法にしたがって宿主細胞へ送達されて
もよい。選ばれた導入遺伝子を担持しているＡＡＶウイルスベクターは、好まし
くは生物学的に適合しうる溶液もしくは製薬的に許容しうる送達媒質中に懸濁さ
れて、患者に投与されてもよい。適当な媒質は、無菌生理食塩水を含む。製薬的
に許容しうるキャリヤーであることが既知で、そして当業者には周知の他の水性
および非水性等張無菌注射液ならびに水性および非水性無菌懸濁液が、この目的
のために使用されてもよい。

【００６８】 ウイルスベクターは、細胞をトランスフェクションし、そして十分なレベルの
遺伝子伝達と発現を提供するのに十分な量において投与されて、当該医学分野に
おける熟達者によって決定できる過度の副作用なしに、または薬物学的に許容し
うる生理的効果をもつ、治療利益を提供する。慣用の製薬的に許容しうる投与経
路は、限定されるものではないが、肝臓への直接送達、経口、静脈内、筋肉内、
皮下、皮内および他の非経口投与経路を含む。投与経路は、所望であれば、組み
合わされてもよい。

【００６９】 ウイルスベクターの用量は、第１には、治療されている症状、患者の年令、体
重および健康のようなファクターに依存し、したがって患者によって変わるであ
ろう。例えば、ウイルスベクターの治療的に有効なヒト用量は、一般に、濃度約
１ｘ１０⁹〜１ｘ１０¹⁶ゲノムウイルスベクターを含有する溶液約１ｍｌ〜約１
００ｍｌの範囲内である。好適なヒト用量は、約１ｘ１０¹³〜１ｘ１０¹⁶ＡＡＶ
ゲノムであってもよい。用量は、あらゆる副作用に対して治療利益をバランスさ
せるように調整でき、そしてそのような用量は、組み換えベクターが使用される
治療適用に応じて変わるであろう。導入遺伝子の発現レベルが、ウイルスベクタ
ー、好ましくはミニジーンを含有しているＡＡＶベクターをもたらす用量の頻度
を決定するためにモニターすることができる。場合によっては、治療目的のため
に記述された処方に類似する用量処方が、本発明の組成物を用いる免疫化のため
に利用されてもよい。イン・ビトロの生産では、所望のタンパク質は、所望のタ
ンパク質をコードしている遺伝子を含有するｒＡＡＶにより宿主細胞をトランス
フェクションし、そして発現を可能にする条件下で細胞培養液を培養した後、所
望の培養液から得ることができる。次いで、発現されたタンパク質は、所望のよ
うに精製され、単離することができる。トランスフェクション、細胞培養、精製
および単離のための適当な技術は、当業者には既知である。

【００７０】 次の実施例は、本発明のいくつかの態様および実施態様を具体的に説明するも
のである。

【００７１】 実施例１−ＡＡＶ−１の感染性クローンの作成 ＡＡＶ−１の複製型ＤＮＡは、ＡＡＶ−１および野生型アデノウイルス５型に
よって感染された２９３細胞から抽出された。

【００７２】 Ａ．細胞培養およびウイルス ＡＡＶ−１不含２９３細胞および８４−３１細胞は、ペンシルバニア大学のヒ
ト応用研究室によって提供された。これらの細胞は、１０％胎児ウシ血清（Ｈｙ
ｃｌｏｎｅ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシンを補足
されたＤｕｌｂｅｃｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ
ｕにおいて、５％ＣＯ₂を供給された湿潤環境中３７℃で培養された。８４−３
１細胞系は、アデノウイルス遺伝子Ｅ１ａ，Ｅ１ｂ，Ｅ４／ＯＲＦ６を構成的に
発現し、そして既に記述されている［Ｋ．Ｊ．Ｆｉｓｈｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ，７０：５２０−５３２（１９９６）］。ＡＡＶ−１（ＡＴＣＣ ＶＲ−６４５
）種保存株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ，Ｍ
ａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入された。ＡＡＶウイルスは、ヘルパーウイルス
としての野生型Ａｄ５とともに２９３細胞において増殖された。

【００７３】 Ｂ．組み換えＡＡＶ作成 組み換えＡＡＶウイルスは、アデノウイルス不含の方法を用いるトランスフェ
クションによって作成された。簡単には、ｃｉｓプラスミド（ＡＡＶ ＩＴＲを
もつ）、ｔｒａｎｓプラスミド（ＡＡＶｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子をもつ
）およびヘルパープラスミド（ｐＦ△１３、アデノウイルスゲノム由来の必須領
域をもつ）が、同時に、１：１：２の比でリン酸カルシウム沈殿によって２９３
細胞中にコ・トランスフェクションされた。ｐＦ△１３ヘルパープラスミドは、
アデノウイルスＥ２Ｂ領域に８ｋｂ欠失をもち、そしてほとんどの後期遺伝子に
おける欠失を有する。このヘルパープラスミドは、ｐＦＧ１４０（Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｘ，Ｃａｎａｄａ）からＲｓｒＩＩフラグメントを欠失させることによって作
成された。典型的には、ＤＮＡ（ｃｉｓ：ｔｒａｎｓ：ｐＦ△１３、それぞれ１
：１：２比で）５０μｇが、１５ｃｍ組織培養皿上にトランスフェクションされ
た。細胞は、感染９６時間後に収穫され、音波処理され、そして０．５％デオキ
シコール酸ナトリウムにより処理された。細胞溶解液は、次に、２ラウンドのＣ
ｓＣｌ濃度勾配にかけられた。ＡＡＶベクターを含有するピーク画分が回収され
、プールされ、そして動物への注射前にＰＢＳに対して透析された。ＡＡＶ−１
ビリオンをもつｒＡＡＶウイルスを作成するために、ｐＡＶ１Ｈもしくはｐ５Ｅ
１８（２／１）が、ｔｒａｎｓプラスミドとして使用されてｒｅｐおよびｃａｐ
機能を与えた。

【００７４】 ＡＡＶ−２に基づくｒＡＡＶの作成のためには、ｐ５Ｅ１８が、一般に、ｒＡ
ＡＶ収率を改善するので、それがｔｒａｎｓプラスミドとして使用された。この
プラスミド、ｐ５Ｅ１８（２／２）は、ＡＡＶ−２ＲｅｐおよびＣａｐを発現し
、そしてＣａｐ遺伝子に対して位置３’に再び置かれたＰ５プロモーターを含有
し、それによってＲｅｐ７８およびＲｅｐ６８の発現を最小化する。その戦略は
、Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：５２３６−５２４３（１９９７
）によって最初に記述された。ｐ５Ｅ１８（２／２）は、次の方法において構築
された。既に記述されたｐＭＭＴＶ−ｔｒａｎｓベクター（すなわち、ＡＡＶ−
２に基づくベクターにおいてＰ５プロモーターについて置換されたマウス乳癌ウ
イルスプロモーター）が、ＳｍａＩおよびＣｌａＩにより消化され、クレノウ酵
素により充填され、次いでＤＮＡリガーゼにより再環化された。得られる構築物
は、ＸｂａＩで消化され、充填され、そして次の方法で構築されたｐＣＲ−ｐ５
からの平滑末端ＢａｍＨＩ−ＸｂａＩフラグメントに連結された。ＡＡＶのＰ５
プロモーターが、ＰＣＲによって増幅され、そして増幅されたフラグメントが、
続いて、ｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローン化されてｐＣＲ−
Ｐ５を得た、ヘルパープラスミドｐＡＶ１Ｈは、ｐＡＡＶ−２のＢｆａＩフラグ
メントを、ＢｃｏｒＶおよびＳｍａＩ部位においてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ
−ＳＫ（＋）中にクローニングすることによって構築された。ｐ５Ｅ１８（２／
２）からの３．０−ｋｂＸｂａＩ−ＫｐｎＩフラグメント、ｐＡＶ１Ｈからの２
．３−ｋｂＸｂａＩ−ＫｐｎＩフラグメント、およびｐ５Ｅ１８（２／２）から
の１．７−ｋｂＫｐｎＩフラグメントは、ＡＡＶ−２Ｒｅｐ、ＡＡＶ−１Ｃａｐ
、およびＣａｐ遺伝子に対して３’に位置するＡＡＶ−２Ｐ５プロモーターを含
有する別々のプラスミドｐ５Ｅ１８（２／１）中に組み入れられた。プラスミド
ｐ５Ｅ１８（２／１）は、ｐＡＶ１Ｈよりも１０〜２０倍高い量のベクターを生
じた（すなわち、１０¹²ゲノム／５０ １５−ｃｍ²プレート）。

【００７５】 Ｃ．ＤＮＡ技術 ＨｉｒｔＤＮＡ抽出は、少し改変されて当該技術分野に記述されているように
実施された［Ｒ．Ｊ．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１３
５−１４３（１９８３）］。より特別には、ＳＤＳ不含のＨｉｒｔ液が、ＳＤＳ
を含有する元のＨｉｒｔ液を使用する代わりに使用された。元のＨｉｒｔ液に存
在するＳＤＳ量は、細胞が完全に懸濁された後添加された。ＡＡＶ−１感染性ク
ローンを構築するために、ＡＡＶ−１感染２９３細胞からのＨｉｒｔＤＮＡが、
クレノウ酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて修復されて
、末端が平滑であることを確定した。次いで、処理されたＡＡＶ−１ＨｉｒｔＤ
ＮＡは、ＢａｍＨＩにより消化され、そしてそれぞれ３ベクター中にクローン化
された。内部ＢａｍＨＩが、ＢａｍＨＩにより切断されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐ
ｔＩＩ−ＳＫ＋中にクローン化されてｐＡＶ１−ＢＭを得た。左右のフラグメン
トが、ＢａｍＨＩ＋ＥｃｏＲＶにより切断されたｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ−
ＳＫ＋中にクローン化されてそれぞれｐＡＶ１−ＢＬおよびｐＡＶ１−ＢＲを得
た。これらの３種のプラスミドにおけるＡＡＶ配列が、続いて、同じベクター中
に組み立てられて、ＡＡＶ−１感染性クローンｐＡＡＶ−１を得た。組み換えＡ
ＡＶ−１ウイルス作成のためのヘルパープラスミドは、ＥｃｏＲＶ部位において
ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔＩＩ−ＳＫ＋中に、ｐＡＡＶ−１のＢｆａＩフラグメン
トをクローニングすることによって構築された。

【００７６】 ＨｉｒｔＤＮＡの分析は、３種のバンド、９．４ｋｂにおけるダイマー、４．
７ｋｂにおけるモノマーおよび１．７ｋｂにおける一本鎖ＤＮＡを現し、ＡＡＶ
−１の異なる複製形態に相関していた。モノマーバンドが、ゲルから切り出され
、次いでＢａｍＨＩにより消化された。これは、３個のフラグメント、１．１ｋ
ｂ，０．８ｋｂおよび２．８ｋｂをもたらした。このパターンは、Ｂａｎｔｅｌ
−ｓｃｈａａｌおよびｚｕｒ Ｈａｕｓｅｎ，Ｖｉｒｏｌ．，１３４（１）：５
２−６３（１９８４）による記述と一致している。１．１ｋｂおよび２．８ｋｂ
ＢａｍＨＩフラグメントは、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＶ部位においてｐＢｌｕ
ｅＳｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋）中にクローン化された。中間の０．８ｋｂフラグメ
ントは、ｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋）のＢａｍＨＩ部位中にクローン化
された。

【００７７】 これら３種のフラグメントは、次いで、同じ構築物中にサブクローン化されて
、ＡＡＶ−１の全配列を含有するプラスミド（ｐＡＡＶ−１）を得た。次いで、
ｐＡＡＶ−１が、プラスミドバックボーンおよびパッケージから感染性ウイルス
をレスキューするその能力について試験された。次いで、ｐＡＡＶ−１は、２９
３細胞にトランスフェクションされ、そしてＭＯＩ １０においてヘルパーとし
てのアデノウイルスを供給された。ウイルス上澄液が２９３細胞を再感染するた
めに使用された。

【００７８】 サザンブロット解析では、ＨｉｒｔＤＮＡが、ＤｐｎＩにより消化されて細菌
生まれのプラスミドが除去され、ＡＡＶ−１の内部ＢａｍＨＩフラグメントとプ
ローブされた。メンブランは、次いで、高いストリンジェント条件で洗浄された
が、この条件は、６５℃で２ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにより３０分２回および
６５℃で０．１ＸＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにより３０分２回：を含む。次いで、
メンブランは、両リン光体画像およびＸ線オートラジオグラフィーによって解析
された。結果は、ｐＡＡＶ−１が、実際に、ＡＡＶ血清型１の感染性クローンで
あることを確認した。

【００７９】 実施例２−ＡＡＶ−１の配列解析 次いで、完全ＡＡＶ−１ゲノムが、自動配列決定によって決定され、そして長
さ４７１８ヌクレオチドであることがわかった（図１Ａ〜１Ｃ）。配列決定では
、ＡＢＩ３７３自動シーケンサーが、ＦＳ染料化学を用いてこの研究に関連する
すべてのプラスミドおよびＰＣＲフラグメントの配列決定するために使用された
。すべての配列が、両プラスおよびマイナス鎖を配列決定することによって確認
された。また、これらの配列は、ｐＡＶ−ＢＭの２つの独立したクローン、ｐＡ
Ｖ−ＢＬおよびｐＡＶ−ＢＲを配列決定することによって確認された。ＡＡＶ−
１ＤＮＡの複製形態が、配列決定のための鋳型として使用されたので、また、こ
れらの配列は、鋳型として元のＡＡＶ−１種保存株を用いる一連のＰＣＲ産物を
配列決定することによって確認された。

【００８０】 ＡＡＶ−１の長さは、他の血清型：ＡＡＶ−３（４７２６ヌクレオチド）、Ａ
ＡＶ−４（４７７４ヌクレオチド）、ＡＡＶ−２（４６８１ヌクレオチド）、お
よびＡＡＶ−６（４６８３ヌクレオチド）の範囲内であることが見い出された。

【００８１】 ＡＡＶ−１ゲノムは、アデノ随伴ウイルスの他の血清型との類似性を示した。
全般に、それは、デフォルトセッティング（ｄｅｆａｕｌｔ ｓｅｔｔｉｎｇ）
を用いるコンピュータープログラムＭｅｇａｌｉｇｎ［ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｍａｄ
ｉｓｏｎ，ＷＩ］によって決定されるように、他の既知ＡＡＶウイルスと８０％
以上の同一性を共有している。また、ＡＡＶ−２における重要な特徴は、ＡＡＶ
−１においても見い出すことができる。第１に、ＡＡＶ−１は、ヌクレオチドレ
ベルにおける違いにもかかわらず、Ｔ型ヘアピン構造を形成できる同型の逆方向
末端反復を有する（図２および３）。ＡＡＶ−１の右ＩＴＲと左ＩＴＲの配列は
同一である。ＡＡＶ ＴＲ配列は、Ａ，Ａ’，Ｂ，Ｂ’，Ｃ，Ｃ’，ＤおよびＤ
’に細分される［Ｂｅｒｎ，前出］。

【００８２】 これらのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、また、事実、ＡＡＶ−６右ＩＴＲに見いださ
れる配列と同じであり、ＡおよびＡ’配列の各々、およびＤ配列の最後のヌクレ
オチドにおいて１つのヌクレオチド差異が存在する。第２に、ＡＡＶ−２ｒｅｐ
結合モティーフ［ＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＧ（配列番号：２０）］は、
良好に保存されている。また、そのようなモティーフは、ヒト染色体１９ＡＡＶ
−２プレ・インテグレーション領域において見い出すことができる。最後に、非
構造および構造コーディング領域、および他のＡＡＶ血清型のものと類似の調節
要素が、またＡＡＶ−１ゲノムにおいて存在する。

【００８３】 ＡＡＶ末端反復の全般的特徴は、非常によく保存されているけれども、ＡＡＶ
末端反復の全長は相違を示す。ＡＡＶ−１の末端反復は、１４３ヌクレオチドか
らなり、一方、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３およびＡＡＶ−４のそれは約１４５もし
くは１４６ヌクレオチドである。ＡＡＶ−１ ＩＴＲのループ領域は、それが、
また、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−３において見い出されるＴＴＴの代わりにＴＣ
Ｔを使用するという点で、ＡＡＶ−４のそれと非常に密接に類似している。配列
決定の誤りの可能性は、これらの３ヌクレオチドが、ＳａｃＩ部位の一部である
（ｇａｇｃｔｃ；配列番号：１のｎｔ６９−７４）ので、制限酵素消化を用いて
除去される。ＡＡＶ−１のｐ５プロモーター領域は、他のＡＡＶ血清型とヌクレ
オチド配列において一層の変化を示す。しかしながら、それは、決定的な調節要
素をなお維持している。ＹＹ１［図１Ａ〜１Ｃ、参照］部位の２コピーは、すべ
てのＡＡＶ血清型において保存されているようであり、これらは、ＡＡＶ遺伝子
発現を調節することに関与していることが分かっている。ＡＡＶ−４には、ＹＹ
１とＥ−ｂｏｘ／ＵＳＦ部位間に挿入された５６個のさらなるヌクレオチドが存
在するが、一方、ＡＡＶ−１では、Ｅ−ｂｏｘ／ＵＳＦ部位前に挿入された２６
個のさらなるヌクレオチドが存在する。また、ｐ１９プロモーター、ｐ４０プロ
モーターおよびポリＡは、高度にまた保存されている既知のＡＡＶ血清型に対す
る相似性によってＡＡＶ−１ゲノムから特定することができる。

【００８４】 かくして、種々の血清型のＡＡＶ末端反復の解析は、ＡおよびＡ’配列が非常
によく保存されていることを示した。その理由の１つは、Ｒｅｐ結合モティーフ
（ＧＣＴＣ）₃ＧＣＴＧ［配列番号：２０］であるかもしれない。これらの配列
は、ＡＡＶ ＤＮＡ複製および部位特異的組み込みには必須であるようである。
また、同じ配列が、サルのゲノムにおいても保存されていることが分かっている
［Ｓａｍｕｌｓｋｉ，私信］。また、Ｄ配列の最初の８ヌクレオチドは、すべて
の既知ＡＡＶ血清型において同一である。これは、最初の１０ヌクレオチドのみ
が、ＡＡＶパッケージングにとって必須であるというＳｒｉｖａｓｔａｖａグル
ープの観察と一致している［Ｘ．Ｓ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ ．，７１ ：３０７７−３０８２（１９９７）；Ｘ．Ｓ．Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．
，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：１１４０−１１４６（１９９７）］。残りのＤ配列
の機能は、まだ不明のままである。それらは、それらの組織特異性にいくらか関
係しているかもしれない。また、ＢおよびＣ配列におけるヌクレオチドの違いは
、ＩＴＲの２次構造が、その生物学的機能にとってより決定的であることを示唆
しているかも知れず、このことは、多くの従来の出版物において例証されている
。

【００８５】 実施例３−ＡＡＶ−１配列の比較 上記のように得られたＡＡＶ−１のヌクレオチド配列が、ＤＮＡ Ｓｔａｒ
Ｍｅｇａｌｉｇｎを用いて、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−６を含む既
知のＡＡＶ配列と比較された。この比較は、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２およびＡＡ
Ｖ−６によって共有される一続きの７１個の同一ヌクレオチドを明らかにした。
図１Ａ〜１Ｃ、参照。

【００８６】 この比較は、ＡＡＶ−６が、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２の相同組み換えによ
って形成されたハイブリッドであることを、さらに示唆した。図３Ａおよび３Ｂ
、参照。これらのヌクレオチドは、ＡＡＶ−６ゲノムを２つの領域に分ける。５
２２ヌクレオチドをもつＡＡＶ−６の５’側半分は、２位置における以外はＡＡ
Ｖ−２のそれと同一である。多くのｒｅｐ遺伝子、完全ｃａｐ遺伝子および３’
ＩＴＲを含むＡＡＶ−６の３’側半分は、ＡＡＶ−１に９８％同一である。

【００８７】 生物学的に、そのような組み換えは、ヒト集団をとおして伝達する能力をＡＡ
Ｖ−１に獲得させるであろう。また、ＡＡＶ−６のＩＴＲが、１つのＡＡＶ−１
ＩＴＲおよび１つのＡＡＶ−２ＩＴＲを含有することに注目することは興味ある
。欠陥パルボウイルスの複製モデルは、この特定の配置を維持することができる
。ＡＡＶ組み込みに関する研究は、多数のＡＡＶ組み込み体が、末端反復の少な
くとも１つにおける欠失を担持していることを示した。これらの欠失は、鋳型と
して他のインタクト末端反復を用いて、遺伝子保存をとおして修復することがで
きることが示された。したがって、ＡＡＶ−６の組み込まれたコピーがヘルパー
ウイルス感染により宿主細胞からレスキューされる場合には、同種集団としてＡ
ＡＶ−６を維持することは、非常に困難であろう。２つの同一ＡＡＶ−２ＩＴＲ
もしくは２つの同一ＡＡＶ−１ＩＴＲをもつＡＡＶ−６は、有力な変異体であろ
う。２つのＡＡＶ−１ＩＴＲをもつＡＡＶ−６は、Ｒｕｓｓｅｌｌグループによ
って観察された［Ｒｕｔｌｅｄｇｅ、前出（１９９８）］。今まででは、２つの
ＡＡＶ−２ＩＴＲをもつＡＡＶ−６に関する報告は存在しない。ＡＡＶ−６によ
るＡＡＶ−２Ｐ５プロモーターの獲得は、ＡＡＶ−６が、ヒト起源から単離され
たのに対して同じビリオンをもつＡＡＶ−１は単離されなかったということを説
明できる。ＡＡＶの異なる種の間のＰ５プロモーターの調節は、イン・ビボでは
異なるであろう。この観察は、ＡＡＶのキャプシドタンパク質が、組織特異性に
ついての唯一の決定要素ではないことを示唆する。

【００８８】 ＡＡＶ−６が、ＡＡＶ−１とＡＡＶ−２のハイブリッドであることは明らかで
あるけれども、ＡＡＶ−６は、既に、ＡＡＶ−１もしくはＡＡＶ−２いずれとも
違うことを表した。ＡＡＶ−６とＡＡＶ−２の間ではそれらの最初の４５０ヌク
レオチドにおいて２ヌクレオチドの差異が存在する。ヌクレオチド５２２から３
’末端までにヌクレオチドレベルにおいてＡＡＶ−６とＡＡＶ−１間に約１％の
差異が存在する。また、ＡＡＶ−６とＡＡＶ−１間には全く違う領域（ヌクレオ
チド４４８６−４５９３）が存在する（図１Ａ−１Ｃ）。この領域は、ＡＡＶに
関するいかなる既知タンパク質もコードしていない。これらのヌクレオチド配列
における差異は、ＡＡＶ−６およびＡＡＶ−１が、ある進化をとおして、組み換
えが起きた結果生じたことを示唆するであろう。その他の可能な説明は、まだ同
定されていないＡＡＶ−１のその他の変異体が存在するということである。今ま
ででは、いずれの可能性も除外する証拠はない。他のハイブリッド（ＡＡＶ−２
対ＡＡＶ−４など）が天然に存在するかどうかは、まだ未知である。

【００８９】 ＡＡＶ−１のコーディング領域は、他の既知ＡＡＶ血清型との比較によって推
定された。表１は、ＡＡＶ−１とＡＡＶ−６間のコーディング領域差異を具体的
に説明している。アミノ酸残基は、ＡＡＶ−２にしたがって推定される。

【００９０】 ＡＡＶ−１のアミノ酸位置に関して、表１は、ＡＡＶ−６の対応するアミノ酸
に変換されたＡＡＶ−１のアミノ酸を挙げる。ＡＡＶ−１のアミノ酸は、矢印の
左に示される。照合は、ＡＡＶ−１Ｒｅｐ７８のアミノ酸配列の配列番号：５に
対して、そしてＡＡＶ−１ＶＰ１のアミノ酸配列についての配列番号：１３に対
して行うことができる。

【００９１】

【表１】

【００９２】 ＡＡＶ−１コーディング領域の配列が、位置４５２からコーディング領域の末
端までのＡＡＶ−６のそれとほとんど同一（９９％）であることが分かったのは
驚くべきことであった。ＡＡＶ−６の最初の５０８ヌクレオチドは、ＡＡＶ−２
のそれらと同一であることが示されている［Ｒｕｔｌｅｄｇｅ、前出（１９９８
）］。ＡＡＶ−６ゲノムの成分が、ＡＡＶ−２左ＩＴＲ−ＡＡＶ−２ｐ５プロモ ーター −ＡＡＶ−１コーディング領域−ＡＡＶ−１右ＩＴＲであると思われるの
で、ＡＡＶ−６は、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２間に天然に生じたハイブリッド
であると結論された。

【００９３】 実施例４−ＡＡＶ−１に基づく遺伝子治療ベクター ＡＡＶ−１ウイルスに基づく組み換え遺伝子伝達ベクターは、実施例１に記載
の方法によって構築された。ＡＡＶ−１ビリオンおよびＡＡＶ−２ＩＴＲをもつ
ハイブリッド組み換えウイルスを作成するために、ＡＡＶ−１ｔｒａｎｓプラス
ミド（ｐＡＶ１Ｈ）およびＡＡＶ−２ｃｉｓ−ｌａｃＺプラスミド（ＡＡＶ−２
ＩＴＲをもつ）が使用された。ＡＡＶ−２ＩＴＲは、部位特異的組み込みを指図
するその既知の能力にかんがみて、このベクターにおいて使用された。また、ｔ
ｒａｎｓプラスミドとしてｐＡＶ１Ｈを用いて、ＣＭＶの即時型プロモーターの
制御下に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー遺伝子を担持するＡＡＶ−１ベ
クターが、この実験における使用のために構築された。

【００９４】 Ａ．イン・ビトロでのｒＡＡＶ−１ウイルスによる宿主細胞のトランスフェク ション ８４−３１細胞、安定にＥ４／ＯＲＦ５を発現する２９３細胞（アデノウイル
スＥ１ａ、Ｅ１ｂを発現する）のサブクローンが、ｒＡＡＶ−１ＧＦＰもしくは
ｒＡＡＶ−ｌａｃＺにより感染された。ＧＦＰおよびｌａｃＺの高レベルの発現
は、培養８４−３１細胞において検出された。これは、ｒＡＡＶ−１に基づくベ
クターが、感染能と発現レベルにおいてＡＡＶ−２に基づくベクターに非常に類
似していることを示唆する。

【００９５】 Ｂ．イン・ビボでのｒＡＡＶ−１ウイルスによる細胞のトランスフェクション また、ＡＡＶ−１に基づくベクターの性能が、イン・ビボにおいて試験された
。ｒＡＡＶ−１ＣＭＶ−α１ＡＴウイルスが、次のように構築された。ヒトα１
−抗トリプシン（α１ＡＴ）ｃＤＮＡフラグメントを含有しているｐＡＴ８５（
ＡＴＣＣ）のＥｃｏＲＩフラグメントが末端を平滑にされ、そしてＳｍａＩ部位
においてＰＣＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にクローン化されてＰＣＲ−α１ＡＴを得
た。ＣＭＶプロモーターは、ＸｂａＩ部位においてＰＣＲ−α１ＡＴ中にクロー
ン化された。Ａｌｂ−α１ＡＴ発現カセットは、ＸｈｏＩおよびＣｌａＩによっ
て切り取られ、そしてＸｂａＩ部位においてｐＡＶ１Ｈ中にクローン化された。
このベクタープラスミドが、下記の実験において使用されるＡＡＶ−１−ＣＭＶ
−α１ＡＴウイルスを作成するために使用された。

【００９６】 ＡＡＶに対するヒト抗体をスクリーニングするために、精製ＡＡＶウイルスが
、Ｒｉｐａバッファー（１０ｍＭＴｒｉｓｐＨ８．２、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１
００、１％ＳＤＳ、０．１５ＭＮａＣｌ）により溶解され、そして１０％ＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲルにおいて分離された。熱不活性化されたヒト血清が、このアッセ
イにおいて１〜１０００倍希釈において使用された。ｒＡＡＶ−１ＣＭＶ−α１
ＡＴウイルスは、種々の用量において尾静脈注射によってＲａｇ−１マウス中に
注射された。マウス血清中のヒトα１−抗トリプシンの濃度がＥＬＩＳＡを用い
て測定された。コーティング抗体は、ウサギ抗ヒト・ヒトα１−抗トリプシン（
Ｓｉｇｍａ）である。ヒツジ抗ヒトα１−抗トリプシン（Ｓｉｇｍａ）が、最初
の検出抗体として使用された。このアッセイの感度は約０．３ｎｇ／ｍｌ〜３０
ｎｇ／ｍｌである。マウス血液中のヒトα−抗トリプシンの発現は、非常に励み
になるレベルにおいて検出することができる。この結果は表２に示される。

【００９７】

【表２】

【００９８】 ｒＡＡＶ−１ＣＭＶ−ｌａｃＺウイルスが、また、Ｃ５７ＢＬ６マウスの筋肉
内に注射され、そして類似の結果が得られた。まとめれば、これらの結果は、Ａ
ＡＶ−１に基づくベクターは、肝および筋両方の遺伝子送達のために適当であろ
うことを示唆した。

【００９９】 実施例５−ＡＡＶ−１に対する中和抗体 ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２に対する中和抗体（ＮＡＢ）の単純な定量的アッ
セイが、組み換えベクターを用いて開発された。総数３３の赤毛サルおよび７７
の正常ヒト被験者がスクリーニングされた。

【０１００】 Ａ．非ヒト霊長類 野生で捕獲された幼少サルは、Ｃｏｎｖａｎｃｅ（Ａｌｉｃｅ，Ｔｅｘ．）お
よびＬＡＢＳ ｏｆ Ｖｉｒｇｉｎｉａ（Ｙｅｍａｓｓｅｅ，ＳＣ）から購入さ
れ、そして完全検疫下に維持された。サルは、体重約３〜４ｋｇであった。Ｉｎ
ｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙの研究プログ
ラムにおいて使用された非ヒト霊長類は、米国において特定病原体フリーの閉鎖
コロニーにおいて意図的に飼育される。すべての販売者は、ＵＳ Ｄｅｐａｒｔ
ｍｅｎｔ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ａ級ディーラーである。したがって
、赤毛サルは、結核因子、多数のサル・レンチウイルス（サル・免疫不全ウイル
スおよびサル・レトロウイルス）およびサル科のヘルペスウイルスを含む、重要
なサルの病原体で感染されていない。また、動物は、内部および外部寄生虫をも
っていない。これらのプレミアム動物の優れた健康状態は、外部の変数について
の可能性を最小にした。この研究では、血清が、すべてのプロトコールの開始前
にサルから得られた。

【０１０１】 ＮＡＢタイターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するレポーターウイ
ルス（ＡＡＶ１−ＧＦＰもしくはＡＡＶ２−ＧＦＰ）の８４−３１細胞への導入
を阻害する血清抗体の能力を調査することによって分析された。３７℃で１時間
レポーターウイルスとともにプレインキュベートされた種々の希釈の抗体が、９
０％集密細胞培養物に添加された。細胞は、４８時間インキュベートされ、そし
て緑色血清タンパク質の発現が、ＦｌｕｏｒｏＩｍａｇｉｎｇ（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって測定された。ＮＡＢタイターは、５０％の細
胞が緑色に染色されたもっとも高い希釈として計算された。

【０１０２】 赤毛サルにおけるＮＡＢの分析は、試験された動物の６１％がＡＡＶ−１につ
いてポジティブであり；少数（２４％）がＡＡＶ−２に対するＮＡＢを有した。
３分の１以上の動物が、ＡＡＶ−１に対する抗体を有したが、ＡＡＶ−２に対し
てはもたなかった（すなわち、ＡＡＶ−１に対して単一特異的であった）が、一
方、動物は、ＡＡＶ−１に反応することなくＡＡＶ−２についてもポジティブで
はなかった。これらのデータは、ＡＡＶ−１が赤毛サルにおいて地方流行である
という仮説を支持する。ＡＡＶ−２に対するＡＡＶ−１応答の交差中和活性が除
外できないので、この群の非ヒト霊長類における真のＡＡＶ−２感染の存在は、
ほとんど明らかではない。両方をもつ動物におけるＡＡＶ−２ＮＡＢとＡＡＶ−
１ＮＡＢ間に直線的関係が存在することは興味深い。

【０１０３】 Ｂ．ヒト これらの中和抗体アッセイでは、ヒト血清サンプルが、補体を不活性化するた
めに５６℃で３０分間インキュベートされ、次いで、ＤＭＥＭにおいて希釈され
た。ウイルス（ｌａｃＺもしくはＧＦＰいずれかをもつｒＡＡＶもしくはｒＡｄ
）が、次に、各血清希釈液（２０Ｘ，４００Ｘ，２０００Ｘ，４０００Ｘなど）
と混合され、そして３７℃で１時間インキュベートされ、その後９６穴プレート
において８４−３１細胞（ＡＡＶのために）もしくはＨｅｌａ細胞（アデノウイ
ルスのために）の９０％集密培養に適用された。培養条件下でインキュベーショ
ン６０分後、２０％ＦＣＳを含有するさらなる培地１００μｌが添加されて、１
０％ＦＣＳを含有する最終培養培地を作成した。

【０１０４】 結果は、表３において総括される。

【０１０５】

【表３】

【０１０６】 ＡＡＶに対する中和抗体の存在が、アデノウイルスに対する抗体についての指
示にならないので、これらの３種のウイルスに対するヒト中和抗体は、無関係で
あるように見える。しかしながら、ＡＡＶは、ヘルパーウイルスとしてアデノウ
イルスを必要とし、ほとんどの場合において、ＡＡＶに対する中和抗体は、アデ
ノウイルスに対する中和抗体の存在とは相関しなかった。スクリーニングされた
７７ヒト血清サンプル中、４１％のサンプルは、Ａｄ５に基づく組み換えアデノ
ウイルスの感染力を中和できる。血清サンプルの１５／７７（１９％）は、ｒＡ
ＡＶ−１の導入を中和できるが、一方、サンプルの２０／７７（２０％）は、１
対８０希釈以上においてｒＡＡＶ−２導入を阻害する。ＡＡＶ−１に対する中和
抗体においてポジティブであるすべての血清サンプルは、また、ＡＡＶ−２につ
いてもポジティブである。しかしながら、ｒＡＡＶ−１を中和することができな
い５つ（６％）のｒＡＡＶ−２ポジティブサンプルが存在する。また、中和抗体
についてポジティブであるサンプルにおいて、抗体のタイターは、ポジティブな
ものの中で変化した。ＡＡＶに対する抗体についてヒト血清をスクリーニングす
ることから得た結果は、ＡＡＶ−１中和性ヒト血清が、ＡＡＶ−２の感染力もま
た低下できるので、ＡＡＶ−１は、ＡＡＶ−２のそれと同じ抗原決定基を提示し
て細胞レポーターと相互作用するという結論を支持した。しかしながら、これら
のＡＡＶについての中和抗体のプロフィルは同一ではなく、各ＡＡＶ血清型に対
するさらなる特異的受容体が存在する。

【０１０７】 実施例６−組み換えＡＡＶウイルスは組織屈性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を示す 本発明の組み換えＡＡＶ−１ベクターおよび組み換えＡＡＶ−２ベクター［ヒ
トα１−抗トリプシン（ａ１ＡＴ）またはサイトメガロウイルスで増強されたβ
−アクチンプロモーター（ＣＢ）からのマウス・エリトロポイエチン（Ｅｐｏ）
］が、同じベクター遺伝子を含有しているＡＡＶ−２ベクターの当量コピーとの
直接比較において評価された。

【０１０８】 ＡＡＶ−１キャプシドをもつ組み換えウイルスが、実施例１における技術を用
いて構築された。ＡＡＶ−１ビリオンをもつｒＡＡＶを作成するためには、ｐＡ
Ｖ１Ｈもしくはｐ５Ｅ１８（２／１）が、ｔｒａｎｓプラスミドとして使用され
て、ＲｅｐおよびＣａｐ機能が提供された。ＡＡＶ−２に基づくｒＡＡＶの作成
では、ｐ５Ｅ１８（２／２）が、ｒＡＡＶ収量を大きく改善するので、それがｔ
ｒａｎｓプラスミドとして使用された。［早期実験は、ｐＡＶ１Ｈおよびｐ５Ｅ
１９（２／１）を用いて作成されたＡＡＶ−１ベクターの類似するイン・ビボ性
能を示した。すべてのその後の研究は、収率を増大するので、ｐ５Ｅ１８（２／
１）由来のＡＡＶ−１ベクターを使用した。］ 当量のＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２ベクターの保存物が、免疫不全マウス中に
、筋肉内（５ｘ１０¹⁰ゲノム）もしくは門脈循環を通して肝臓に（１ｘ１０¹¹ゲ
ノム）注射され、そして動物（４群）は、導入遺伝子の発現について３０日目に
分析された。図４Ａおよび４Ｂ、参照。

【０１０９】 ＡＡＶ−２ベクターは、筋肉に較べて肝臓に注射された場合、１０〜５０倍以
上の血清エリトロポイエチンもしくはα１−抗トリプシンを一貫して生産した。
（しかしながら、ＡＡＶ−１で送達された遺伝子は、肝臓において許容しうる発
現レベルを達成しなかった。）この結果は、ＡＡＶ−１ベクターについての結果
とは非常に異なっていて、これによる筋肉発現は、肝臓発現と同等か、またはそ
れを超えていた。事実、ＡＡＶ−１は、ゲノムに基づいて当量タイターが投与さ
れた場合、筋肉においてＡＡＶ−２以上の働きをした。

【０１１０】 実施例７−ｒＡＡＶ−１を介する遺伝子送達 Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週令オス、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）が、ベクターの脾臓内注射後、肝臓へのＡＡＶに媒介される遺伝子伝
達について解析された（すなわち、肝臓へのターゲティング）。ｒＡＡＶ−１も
しくはｒＡＡＶ−２ベクターの全１０¹¹ゲノム当量が、バッファー生理食塩水１
００μｌにおいて循環中に注射された。最初のベクターは、いずれかＡＡＶ−１
キャプシドもしくはＡＡＶ−２キャプシドを含有し、そしてニワトリβ−アクチ
ン（ＣＢ）プロモーターの制御下でα１ＡＴを発現した。２８日目の血清が、Ａ
ＡＶ−１もしくはＡＡＶ−２に対する抗体について分析され、そして血清α１Ａ
Ｔレベルがチェックされた。次いで、動物は、エリトロポイエチン（Ｅｐｏ、ま
たＣＢプロモーターの制御下）を発現するＡＡＶ−１もしくはＡＡＶ−２構築物
を注射された。１カ月後の血清が、Ｅｐｏの血清レベルについて分析された。次
のグループが分析された（図５Ａ−５Ｄ）。

【０１１１】 グループ１では、ベクター１は、α１ＡＴを発現するＡＡＶ−２であり、そし
てベクター２は、Ｅｐｏを発現するＡＡＶ−２であった。動物は、最初のベクタ
ー投与後にＡＡＶ−２に対する抗体を生成し、ＡＡＶ−２に基づくベクターの再
投与を妨げた。ＡＡＶ−１に対する抗体を交差中和する証拠はなかった。

【０１１２】 グループ２では、ベクター１は、α１ＡＴを発現するＡＡＶ−１であり、一方
、ベクター２は、Ｅｐｏを発現するＡＡＶ−１であった。最初のベクター投与は
、１カ月目において、ＡＡＶ−１に対する中和抗体に対する抗体に関連する有意
なα１ＡＴ発現をもたらさなかった。動物は、ＡＡＶ−１Ｅｐｏ発現性構築物に
より成功裏に再投与されなかった。

【０１１３】 グループ３では、ナイーブ動物に注射されたＥｐｏを発現するＡＡＶ−２ベク
ターの効力が測定された。動物は、ＰＢＳを注射され、そして２８日目にＡＡＶ
−２Ｅｐｏベクターを注射され、そして１カ月後にＥｐｏ発現について分析され
た。中和抗体が２８日目に評価されたが、動物は、最初のベクター含むＰＢＳ注
射を受けたので、期待したように何も見いだされなかった。このことは、ナイー
ブ動物では、ＡＡＶ−２は、１カ月後の高レベルの血清Ｅｐｏによって例証され
るように、Ｅｐｏ遺伝子の伝達には非常に有効であることを示している。

【０１１４】 グループ４は、グループ３に類似する実験であって、ここでは、動物は、最初
にベクター１についてのＰＢＳを受け、次いで、２８日後にＥｐｏを発現するＡ
ＡＶ−１構築物を受けた。ベクター注射時点では、いずれかＡＡＶ−１もしくは
ＡＡＶ−２に対する抗体は、明らかに存在しなかった。ＡＡＶ−１に基づくベク
ターは、１カ月後に測定したときには、有意なＥｐｏの発現を生じることができ
た。

【０１１５】 グループ５は、最初のベクターが、α１ＡＴを発現するＡＡＶ−２であり、そ
の後にＥｐｏを発現するＡＡＶ−１構築物が続く場合の交差実験である。期待さ
れたように、動物は、２８日目における血液中の高レベルのタンパク質によって
示されるように，α１ＡＴを発現するＡＡＶ−２ベクターにより有効に感染され
た。これは、ＡＡＶ−２に対する有意な中和抗体に関係している。重要なことは
、第２のベクター投与に続く２８日目の血清中のＥｐｏの存在によって分かるよ
うに、動物は、ＡＡＶ−２ベクターに続いて成功裏にＡＡＶ−１を投与された。
このベクター投与の時点では、高レベルＡＡＶ−２中和抗体が存在し、そしてＡ
ＡＶ−１に対する交差反応は非常に低かった。Ｅｐｏのレベルは、少量の交差反
応性のためにおそらく若干減少された。グループ６は、最初のベクターはＡＡＶ
−１に基づき、一方、第２の実験は、ＡＡＶ−２に基づいた逆の交差実験であっ
た。ＡＡＶ−１ベクターは、α１ＡＴの有意な遺伝子発現をもたらし、これがま
た、高レベルＡＡＶ−１中和抗体をもたらした。動物は、高レベルＥｐｏによっ
て証明されるように、最初のＡＡＶ−１ベクターに続いて、非常に効率的にＡＡ
Ｖ−２を投与された。

【０１１６】 実質的に同じ実験が、筋肉において実施され、５ｘ１０¹⁰ゲノムが、筋肉に対
向される遺伝子治療のモデルとして、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの前脛骨筋中に注射
された。結果は図６Ａ−６Ｄに示され、そして本質的に肝臓についてと同じであ
る。

【０１１７】 総括すれば、この実験は、予め存在するＡＡＶ−２に対する抗体を有するか、
または最初にＡＡＶ−２ベクターを受け、そして再投与を要する患者におけるＡ
ＡＶ−１ベクターを使用することの効用を例証している。

【０１１８】 実施例８−ＡＡＶ−１ＩＴＲを含有する組み換えウイルスの構築 この実験は、本発明のＡＡＶ−１ＩＴＲを含有する組み換えＡＡＶベクターの
構築を具体的に説明する。

【０１１９】 ＡＡＶ−１ｃｉｓプラスミドは、次のように構築される。ＡＡＶ−１５’ＩＴ
Ｒを含有する１６０ｂｐＸｈｏ−ＮｒｕＩＡＡＶ−１フラグメントが、ｐＡＶ１
−ＢＬから得られた。ｐＡＶ１−ＢＬは、実施例１記載のように作成された。Ｘ
ｈｏ−ＮｒｕＩフラグメントは、次に、ＸｂａＩ部位において第２のｐＡＶ１−
ＢＬプラスミド中にクローン化されて、２つのＡＡＶ−１ＩＴＲをもつプラスミ
ドが提供される。次いで、所望の導入遺伝子が、ＮｒｕＩとＢａｍＨＩ部位にお
いて改変ｐＡＶ１−ＢＬ中にクローン化され、ＡＡＶ−１ＩＴＲ配列の間に位置
する。得られるＡＡＶ−１ｃｉｓプラスミドは、導入遺伝子に隣接するＡＡＶ−
１ＩＴＲを含有し、そして機能性ＡＡＶ−１ｒｅｐおよびｃａｐを欠如する。

【０１２０】 組み換えＡＡＶは、２９３細胞中に３種のプラスミドを同時にトランスフェク
ションすることによって作成される。これらは、上記ＡＡＶ−１ｃｉｓプラスミ
ド；ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ機能を与え、そしてＡＡＶＩＴＲを欠如するｔｒａｎ
ｓプラスミド；およびアデノウイルスヘルパー機能を与えるプラスミドを含む。
ｒｅｐおよび／またはｃａｐ機能は、意図されるレシピエントの免疫プロフィル
に応じて、ＡＡＶ−１もしくはその他のＡＡＶ血清型によってｔｒａｎｓにおい
て提供されてもよい。あるいはまた、ｒｅｐまたはｃａｐ機能は、再び患者の免
疫プロフィルに応じて、ＡＡＶ−１もしくはその他の血清型によってｃｉｓにお
いて提供されてもよい。

【０１２１】 典型的なコ・トランスフェクションでは、ＤＮＡ（１：１：２の比におけるｃ
ｉｓ：ｔｒａｎｓ：ヘルパー）５０μｇが、１５ｃｍ組織培養皿上にトランスフ
ェクションされる。細胞が、トランスフェクション後９６時間に収穫され、音波
処理され、そして０．５％デオキシコール酸ナトリウムで処理（３７℃１０分間
）される。次いで、細胞溶解液が、セシウム濃度勾配の２〜３回の超遠心にかけ
られる。ｒＡＡＶを含有するピーク画分が回収され、プールされ、そしてＰＢＳ
に対して透析される。典型的な収量は、１ｘ１０¹³ゲノム。／１０⁹細胞である
。

【０１２２】 この方法を用いて、ＡＡＶ−１キャプシドをもつ、導入遺伝子に隣接するＡＡ
Ｖ−１ＩＴＲを含有する１種の組み換えウイルス構築物が調製される。そＡＡＶ
−２キャプシドをもつ、導入遺伝子に隣接するＡＡＶ−１ＩＴＲを含有するその
他の組み換えウイルス構築物が調製される。

【０１２３】 本明細書に引用されたすべての公表物は、引用によって本明細書に組み入れら
れている。本発明は、特に好適な実施態様に関して記述されたけれども、本発明
の精神から逸脱することなく、改変が作成できることは理解されるであろう。そ
のような改変は、本特許請求の範囲内にはいることを意図する。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１Ａ−１Ｃ】 ＡＡＶ−１［配列番号：１］、ＡＡＶ−２［配列番号：１８］およびＡＡＶ−
６［配列番号：１９］のヌクレオチドの整列を示す。

【図２】 ＡＡＶ−１ ＩＴＲの予想される２次構造を示す。

【図３Ａ】 ＡＡＶ−６が、ＡＡＶ−１およびＡＡＶ−２間の相同的組み換えからいかにし
て生じるの仮説を示す。

【図３Ｂ】 ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−６中の７１ｂｐ相同領域の詳細な図示
である。

【図４Ａ】 組み換えＡＡＶ−１および組み換えＡＡＶ−２ウイルスを介するｈＡＡＴの送
達に続く、血清中のヒトα１抗トリプシン（α１ＡＴ）の発現レベルを示すバー
チャートである。

【図４Ｂ】 組み換えＡＡＶ−１および組み換えＡＡＶ−２ウイルスを介するエリトロポイ
エチン（ｅｐｏ）遺伝子の送達に続く、血清中のｅｐｏの発現レベルを示すバー
チャートである。

【図５Ａ】 実施例７に記述されるようにα１ＡＴの送達に続く、肝臓中のα１ＡＴの発現
レベルを示すバーチャートである。

【図５Ｂ】 実施例７に記述されるようにｅｐｏの送達に続く、肝臓中のｅｐｏの発現レベ
ルを示すバーチャートである。

【図５Ｃ】 実施例７に記述されるように肝臓へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、
ＡＡＶ−１に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。

【図５Ｄ】 実施例７に記述されるように肝臓へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、
ＡＡＶ−２に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。

【図６Ａ】 実施例７に記述されるようにα１ＡＴの送達に続く、筋肉中のα１ＡＴの発現
レベルを示すバーチャートである。

【図６Ｂ】 実施例７に記述されるようにｅｐｏの送達に続く、筋肉中のｅｐｏの発現レベ
ルを示すバーチャートである。

【図６Ｃ】 実施例７に記述されるように筋肉へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、
ＡＡＶ−１に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。

【図６Ｄ】 実施例７に記述されるように筋肉へのα１ＡＴもしくはｅｐｏの送達に続く、
ＡＡＶ−２に対向される中和抗体（ＮＡＢ）を示すバーチャートである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/21 ４Ｃ０８７ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ａ６１Ｋ 35/76 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 35/76 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ジアオ，ウエイドング アメリカ合衆国ペンシルベニア州19046ジ エンキンタウン・ワシントンレイン155・ アパートメントピー４ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 BA32 CA04 DA03 EA02 FA01 FA02 GA11 HA17 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA93X AA95Y AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 NA10 ZB211 ZC012 ZC412 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA10 ZB21 ZC01 ZC41 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA10 ZB21 ZC01 ZC41

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：１； （ｂ）配列番号：１に相補的なＤＮＡ配列； （ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に相補的なｃＤＮＡ；および （ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれかに相補的なＲＮＡ： からなる群から選ばれる配列を含んでなる単離されたＡＡＶ−１核酸分子。
2. 【請求項２】 （ａ）配列番号：１のｎｔ１〜１４３； （ｂ）配列番号：１のｎｔ４５７６〜４７１８； （ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）に相補的な核酸配列；および （ｄ）（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の機能性フラグメント： からなる群から選ばれるＡＡＶ−１逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含んでなる
   核酸分子。
3. 【請求項３】 ＩＴＲが、 （ａ）配列番号：１のｎｔ１〜１４３； （ｂ）（ａ）に相補的な核酸配列；および （ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の機能性フラグメント： からなる群から選ばれる配列をもつ、５’ＡＡＶ−１逆方向末端反復（ＩＴＲ）
   および選ばれた導入遺伝子を含んでなる組み換えベクター。
4. 【請求項４】 ベクターが、３’ＡＡＶ−１ＩＴＲをさらに含む、請求項３
   記載の組み換えベクター。
5. 【請求項５】 ＩＴＲが、 （ａ）配列番号：１のｎｔ４５７６〜４７１８； （ｂ）（ａ）に相補的な核酸配列；および （ｃ）（ａ）もしくは（ｂ）の機能性フラグメント： からなる群から選ばれる配列をもつ、３’ＡＡＶ−１逆方向末端反復（ＩＴＲ）
   および選ばれた導入遺伝子を含んでなる組み換えベクター。
6. 【請求項６】 ベクターが、５’ＡＡＶ−１ＩＴＲをさらに含む、請求項５
   記載の組み換えベクター。
7. 【請求項７】 ベクターが、配列番号：１３、１５もしくは１７の配列また
   はその機能性フラグメントをもつＡＡＶ−１キャプシドタンパク質をさらに含む
   、請求項３〜６のいずれかに記載の組み換えベクター。
8. 【請求項８】 ベクターがアデノウイルス配列をさらに含む、請求項３〜６
   のいずれかに記載の組み換えベクター。
9. 【請求項９】 配列番号：１のｎｔ２３６〜２９９の配列もしくはその機能
   性フラグメントをもつＡＡＶ−１Ｐ５プロモーターを含んでなる組み換えベクタ
   ー。
10. 【請求項１０】 ＡＡＶｒｅｐコーディング領域およびＡＡＶｃａｐコーデ
    ィング領域を含んでなる、ＡＡＶ−１ヘルパー機能をコードしている核酸分子で
    あって、該ｃａｐコーディング領域が、 （ａ）ｖｐ１、配列番号：１のｎｔ２２２３〜４４３１； （ｂ）ｖｐ２、配列番号：１のｎｔ２６３４〜４４３２；および （ｃ）ｖｐ３、配列番号：１のｎｔ２８２９〜４４３２： からなる群から選ばれる少なくとも１つのメンバーを含むものである核酸分子。
11. 【請求項１１】 ＡＡＶｒｅｐコーディング領域およびＡＡＶｃａｐコーデ
    ィング領域を含んでなる、ＡＡＶ−１ヘルパー機能をコードしている核酸分子で
    あって、該ｒｅｐコーディング領域が、 （ａ）ｒｅｐ７８、配列番号：１のｎｔ３３５〜２３０４； （ｂ）ｒｅｐ６８、配列番号：１のｎｔ３３５〜２２７２またはそれに対応する
    ｃＤＮＡ； （ｃ）ｒｅｐ５２、配列番号：１のｎｔ１００７〜２３０４；および （ｄ）ｒｅｐ４０、配列番号：１のｎｔ１００７〜２２７２またはそれに対応す
    るｃＤＮＡ： からなる群から選ばれる少なくとも１つのメンバーを含んでなるＡＡＶｒｅｐコ
    ーディング領域を含むものである核酸分子。
12. 【請求項１２】 請求項３〜６のいずれかに記載の組み換えウイルスベクタ
    ーにより形質導入された宿主細胞。
13. 【請求項１３】 請求項１、２、１０もしくは１１のいずれかに記載の核酸
    分子により形質導入された宿主細胞。
14. 【請求項１４】 配列番号：１のｎｔ２３６〜２９９の配列をもつＡＡＶ−
    １Ｐ５プロモーターにより安定に形質導入された宿主細胞。
15. 【請求項１５】 キャリヤーおよび請求項３〜６のいずれかに記載のベクタ
    ーを含むウイルスを含んでなる製薬組成物。
16. 【請求項１６】 キャリヤーおよび請求項７記載のベクターを含むウイルス
    を含んでなる製薬組成物。
17. 【請求項１７】 キャリヤーおよび請求項８記載のベクターを含むウイルス
    を含んでなる製薬組成物。
18. 【請求項１８】 （ａ）ＡＡＶ−１ｃａｐ遺伝子によってコードされている
    少なくとも１つのキャプシドタンパク質を含むキャプシド；および （ｂ）導入遺伝子を、その発現を指図する調節配列の制御下に含むＤＮＡ分子：
    を含有するＡＡＶビリオンを宿主細胞に送達する段階を含んでなる、導入遺伝子
    のＡＡＶ媒介性の送達方法。
19. 【請求項１９】 （ａ）宿主からのサンプルをアッセイして、いずれかのＡ
    ＡＶ血清型に対して特異的な中和抗体の存在を決定すること；および （ｂ）（ｉ）宿主が、段階（ａ）において決定されるようなそれに対する抗体を
    もたないＡＡＶ血清型のｃａｐ遺伝子によってコードされている少なくとも１つ
    のキャプシドタンパク質を含むキャプシド；および （ｉｉ）導入遺伝子を、その発現を指図する調節配列の制御下に含むＤＮＡ分子
    ： を含有するＡＡＶビリオンを宿主細胞に送達すること： の段階を含む、宿主への導入遺伝子のＡＡＶ媒介性の送達方法。
20. 【請求項２０】 段階（ａ）および（ｂ）を反復するさらなる段階を含む、
    請求項１９記載の方法。
21. 【請求項２１】 ｃａｐ遺伝子のＡＡＶ血清型に対して前もって存在する中
    和抗体をもたない宿主に、導入遺伝子を送達するための医薬の製造における、（
    ａ）宿主が、抗体をもつＡＡＶ血清型の該ｃａｐ遺伝子によってコードされてい
    る少なくとも１つのキャプシドタンパク質、および （ｂ）その発現を指図する調節配列に操作可能に結合された導入遺伝子を含むＤ
    ＮＡ分子、 を含むキャプシドを含んでなるＡＡＶビリオンの使用。
22. 【請求項２２】 請求項３〜８のいずれかに記載の組み換えベクターを含む
    組み換えウイルスを宿主に送達する段階を含む、導入遺伝子の送達方法。
23. 【請求項２３】 請求項１記載の分子もしくはその機能性フラグメントを哺
    乳動物細胞にトランスフェクションし、そして遺伝子産物を発現するのに適当な
    条件下で該細胞を培養する段階を含む、選ばれた遺伝子産物の生産方法。