JP2022529662A - 二重グリカン結合ａａｖ２．５ベクターのための方法および組成物 - Google Patents

Abstract

１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、前記置換が新たなグリカン結合部位をＡＶＶカプシドタンパク質に導入する、アデノ随伴ウイルス２．５（ＡＡＶ２．５）カプシドタンパク質を含む方法および組成物が本明細書中で開示される。

Description

［優先権の申立］
本出願は、米国特許法第１１９（ｅ）の下で、その全内容が参照により本明細書の一部をなす２０１９年４月２６日出願の米国仮特許出願第６２／８３９，１９６号の利益を主張する。

［政府支援の明示］
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金第ＨＬ０８５７９４号およびＯＤ０１１１０７号の下で、政府の支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。

［配列表の電子ファイリングに関する記載］
ＡＳＣＩＩテキスト形式での配列表は、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１のもとで提出され、５４７０－８５６ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと表題付きの、１３，０５８バイトのサイズで、２０２０年２月２７日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂ経由で提出され、ハードコピーの代わりに提供される。本配列表は、これによって参照により本明細書のその開示用の特許明細書の一部をなすものとする。

［発明の分野］
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の改変カプシドタンパク質、それを含むウイルスカプシドおよびウイルスベクター、ならびにそれらの使用法に関する。

代謝の先天的なエラーは、単一遺伝子が神経機能の発達および維持ならびに神経生存に必要な機能不全酵素を産生する一群の多様な先天的疾患の原因となる。不幸なことに、これらの多くは、１０歳以前または１０歳代に早期死亡をもたらす急速に進行する神経変性障害である。これらの酵素遺伝子での機能喪失型突然変異は典型的には、常染色体劣性またはＸ染色体連鎖型の遺伝に続いて起こり、そのためにこうした遺伝子は単一遺伝子置換戦略にとり魅力的である。こうした群の疾患のための遺伝子治療の開発にとっての大きな難問は、損傷が潜在的に不可逆的であるために、治療介入が成功するには、成長の極めて早期に行われなければならない点である。ここ２０年にわたる研究により、成功の最大の機会は、神経変性過程の開始に先立って介入する場合に存在することが一貫して実証されてきた。例えば、ムコ多糖蓄積症（ＭＰＳ）および白質ジストロフィーは、炭水化物分子または脂肪酸の障害性代謝から生じる稀な小児科神経変性障害であるが、細胞療法および酵素置換戦略により治療可能である。いくつかの研究では、介入は、行動または身体症状が顕在化した後では疾患進行を遅くするまたは逆転させることはできないことが実証されている。しかし、治療の時期に無症状であった子供は介入からもっとも利益を受けており、生存の確率が最大であった。

臨床的には、ＭＰＳおよび白質ジストロフィーの発病は典型的には、幼児期および小児期早期に観察され、進行性の中枢および末梢神経系が関与している。主要症状は、細かい運動および粗大運動の喪失、感覚障害、遠位筋力低下、ならびに腱痙縮を含む。罹患患者は多くの場合、車椅子依存的、聴力および視力障害性になり、こうした疾患は２～８歳までに致命的になることが多い。白質ジストロフィーに関与していることが公知の遺伝子は、異染性白質ジストロフィーの原因となるアリルスルファターゼＡ（ＡＳＡ）における突然変異；クラッベ病の原因となるガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）における突然変異；カナバン病の原因となるアスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）における突然変異；およびＸ連鎖副腎白質ジストロフィーの原因となるペルオキシソームＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣＤ１）における突然変異を含有する。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、ヒトでは非病原性であり強力な安全性プロファイルを有するので、効率的で標的化された遺伝子治療に魅力的な選択肢を提供する。天然に存在するＡＡＶ血清型は、複数の組織に対してトロピズムを示しており、従って、ＡＡＶベクターを特に所望の標的組織に向け、オフターゲット発現を最小限にする方法の開発の必要性が当該分野には存在する。

ウイルス－グリカン相互作用は、宿主細胞侵入の重大な決定因子である。シアル酸、ガングリオシドまたはヘパラン硫酸などの細胞表面炭水化物は、インフルエンザ、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０、ポリオーマウイルス、パピローマウイルスおよび他の病原体などの膨大な数のウイルスに利用されている。大半の場合では、単一クラスのグリカンがウイルスにとって細胞表面結合因子として主に役立っており、細胞侵入のための他の受容体／共受容体の逐次または平行結合をもたらす。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヘパラン硫酸（ＨＳ）、ガラクトース（Ｇａｌ）またはシアル酸（Ｓｉａ）を細胞表面結合のための主要受容体として利用するヘルパー依存パルボウイルスである。例えば、ＡＡＶ血清型２および３ｂはＨＳを利用し；ＡＡＶ１、４および５は異なる連鎖特異性でＳｉａに結合し、ＡＡＶ９は宿主細胞結合にＧａｌを利用する。異なるＡＡＶ株は、細胞内取込みのためには、インテグリンαＶβ５またはα５β１、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、またはラミニン受容体などの共受容体とのその後の相互作用も必要とする。

特定のＡＡＶ株と単一クラスの炭水化物の間の１対１の関係に対する顕著な例外は、ＡＡＶ血清型６であり、これはＳｉａとＨＳの両方を認識する。しかし、ウイルス形質導入に不可欠であることが明らかにされたのはＳｉａのみであった。ＡＡＶ１、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５およびＡＡＶ６に対するＳｉａ結合フットプリントはまだ決定されてはいない。つい最近、ＡＡＶ９カプシドによるＧａｌ認識に関与している肝要なアミノ酸残基が、分子ドッキングと部位特異的変異誘発の組合せを使用することにより特定された。必要なのは、細胞侵入および形質導入のために代わりの経路を利用する複数のグリカン結合能力を有するウイルスベクターである。

本発明は、複数のグリカン結合部位を有する改変カプシドタンパク質、これらのカプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターならびに神経変性白質ジストロフィーおよびＭＰＳなどの障害において治療ベクターとしてのそのベクターの使用のための方法を提供することにより当技術分野における以前の欠点を克服する。

本発明の態様は、新たなグリカン結合部位を導入する1つまたは複数のアミノ酸置換を含むＡＡＶ２．５カプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質に関する。

本明細書中に記載されるカプシドタンパク質、カプシド、ウイルスベクターおよび方法の実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸置換は、Ａ２６７Ｓ、ＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲ４６４～４７６ＳＸ_１ＡＧＸ_２ＳＸ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＱＸ_７Ｒ（Ｘ_１～７は任意のアミノ酸であってよい）、およびＥＹＳＷ５００～５０３ＥＸ_８Ｘ_９Ｗ（Ｘ_８～９は任意のアミノ酸であってよい）を含む。

本明細書中に記載されるカプシドタンパク質、カプシド、ウイルスベクターおよび方法の実施形態では、Ｘ_１はＶもしくはその保存的置換であり；Ｘ_２はＰもしくはその保存的置換であり；Ｘ_３はＮもしくはその保存的置換であり；Ｘ_４はＭもしくはその保存的置換であり；Ｘ_５はＡもしくはその保存的置換であり；Ｘ_６はＶもしくはその保存的置換であり；Ｘ_７はＧもしくはその保存的置換であり；Ｘ_８はＦもしくはその保存的置換であり；および／またはＸ_９はＡもしくはその保存的置換である。

本明細書中に記載されるカプシドタンパク質、カプシド、ウイルスベクターおよび方法の実施形態では、Ｘ_１はＶであり、Ｘ_２はＰであり、Ｘ_３はＮであり、Ｘ_４はＭであり、Ｘ_５はＡであり、Ｘ_６はＶであり、Ｘ_７はＧであり、Ｘ_８はＦであり、およびＸ_９はＡであり、新しいグリカン結合部位はガラクトース結合部位である。

本明細書中に記載されるカプシドタンパク質、カプシド、ウイルスベクターおよび方法の実施形態では、ＡＡＶ２．５カプシドタンパク質のアミノ酸配列は配列番号１またはその機能的誘導体である。

本明細書中に記載されるカプシドタンパク質、カプシド、ウイルスベクターおよび方法の実施形態では、アミノ酸配列は配列番号２またはその機能的誘導体である。

本発明の態様は、上記のＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドに関する。

本発明の態様は、上記のウイルスカプシドおよび少なくとも１つの末端反復配列を含む核酸を含むウイルスベクターに関し、核酸はウイルスカプシドによりカプシド封入されている。

本発明の態様は、薬学的に許容される担体中に、上記のＡＡＶカプシドタンパク質、上記のウイルスカプシド、および／または上記のウイルスベクターを含む組成物に関する。

本発明の態様は、細胞を上記ウイルスベクターと接触させることを含む、核酸を細胞内に導入する方法に関する。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、細胞は神経系組織中に存在する。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、細胞はニューロンまたはグリア細胞である。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、グリア細胞は星状細胞である。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２．５ウイルスベクターと比べた場合、神経系組織の増強された形質導入を有する。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、細胞は対象中に存在する。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、対象はヒト対象である。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、対象は子供である。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、子供は乳児である。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、対象は子宮内にいる。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、対象は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２．５ウイルスベクターに接触させた場合と比べてウイルスベクターに接触させた場合、低下した免疫性プロファイルを有する。

本発明の態様は、本明細書中に記載されるウイルスベクターおよび／または本明細書中に記載される組成物を、治療核酸が対象の細胞において発現される条件下で対象に投与することにより、治療核酸を対象の細胞中に導入することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を治療する方法に関する。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、対象はヒトである。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、対象は子宮内にいる。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、対象はＣＮＳ疾患もしくは障害を有するまたはこれらのリスクがある。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、対象は先天性神経変性障害を有するまたはこれのリスクがある。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、対象は、成人発症型常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、アイカルディ・グティエール症候群、アレキサンダー病、ＣＡＤＡＳＩＬ、カナバン病、ＣＡＲＡＳＩＬ、脳腱黄色腫症小児運動失調症および脳ミエリン形成不全症（ＣＡＣＨ）／白質消失病（ＶＷＭＤ）、ファブリー病、フコシドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、クラッベ病、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸尿症、皮質下嚢胞をもつ大頭型白質脳症、異染性白質ジストロフィー、多種スルファターゼ欠損症、ペリツェウス・メルツバッヘル病、Ｐｏｌ ＩＩＩ関連白質ジストロフィー、レフサム病、サラ病（遊離シアル酸蓄積症）、シェーグレン・ラルソン症候群、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、ツェルウェガー症候群スペクトル障害、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ムコ多糖症ＩＩＩ型、ムコ多糖症ＩＶ型、ムコ多糖症Ｖ型、ムコ多糖症ＶＩ型、ムコ多糖症ＶＩＩ型、ムコ多糖症ＩＸ型およびそれらの任意の組合せを有するまたはこれらのリスクがある。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、対象は、疾患または障害に伴う疼痛を有するまたはそれを有するリスクがある。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターまたは組成物は、経腸、非経口、くも膜下腔内、嚢内、脳内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼内、眼周囲、直腸内、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、舌下、皮下および／または経皮経路を経て送達される。本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、ウイルスベクターまたは組成物は、頭蓋内におよび／または脊髄内に送達される。

本発明のこれらのおよび他の態様は、下記の本発明の説明においてさらに詳細に扱われる。

［定義］
単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数形も同様に含むことが意図される。

さらに、用語「約」は、本明細書中で使用する場合、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さ、用量、時間、温度などの量などの測定可能な値をいう場合、特定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％またはさらには±０．１％の変動を包含することを意味する。

また、本明細書中で使用する場合、「および／または」は、関連する列挙された項目のうち１つまたは複数の、任意のおよび全ての可能な組み合わせ、ならびに代替として解釈される場合（「または」）には組み合わせの欠如をいい、かつこれらを包含する。

文脈が他を示さない限り、本明細書中に記載される本発明の種々の特徴が任意の組み合わせで使用され得ることが、具体的に意図される。

さらに、本発明は、本明細書中に示される本発明のいくつかの実施形態、任意の特徴または特徴の組み合わせが排除または割愛できることも企図している。

さらに説明すると、例えば、特定のアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択できることを本明細書が示す場合、この表現は、例えばＡ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみなどの、これらのアミノ酸（複数でもよい）の任意のサブセットからアミノ酸を選択できることも、各かかる下位の組み合わせが本明細書中に明示的に示されるかのように示す。さらに、かかる言葉は、１つまたは複数の特定されたアミノ酸が除外され得ることもまた示す。例えば、特定の実施形態では、各かかる可能な除外が明示的に示されるかのように、アミノ酸は、Ａ、ＧまたはＩではなく；Ａではなく；ＧまたはＶではない、など。

用語「トロピズム」とは、本明細書中で使用する場合、ある特定の細胞もしくは組織型へのウイルスもしくはウイルスベクターの優先的侵入またはある特定の細胞もしくは組織型への侵入を促進する細胞表面との優先的相互作用のことをいい、任意選択的におよび好ましくは、それに続いて細胞においてウイルスゲノムが保有する配列が発現される（例えば、転写および、任意選択的に、翻訳）。

用語「標的細胞」は、本明細書中に記載されるウイルスベクターが感染する細胞をいうために使用される。いくつかの実施形態では、「標的細胞」は、ウイルス／ウイルスベクターが感染し、内部の異種核酸上の調節エレメントが発現を促進する細胞型をいうのでもよい。

用語「保存的置換」または「保存的置換突然変異」とは、本明細書中で使用する場合、アミノ酸が類似する特性を有する別のアミノ酸の代わりに使われ、ペプチド化学の分野の当業者であれば、ポリペプチドの二次構造、化学的特性および／またはヒドロパシーの性質が実質的に変化しないと予測できる突然変異をいう。アミノ酸の以下の群は、保存的変化として歴史的に互いに置換されてきた：（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｒｙ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓ。他の一般的に受け入れられる保存的置換は下に列挙されている：

本明細書中で使用する場合、用語「低下する（ｒｅｄｕｃｅ／ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「低下」および類似の用語は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、１００％またはそれ以上の減少を意味する。

本明細書中で使用する場合、用語「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ／ｅｎｈａｎｃｅｓ）」「増強」および類似の用語は、少なくとも約１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれ以上の増加を示す。

本明細書中で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、特に示さない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。

「ポリヌクレオチド」、「核酸」または「核酸分子」は、本明細書中で使用する場合、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するヌクレオチドおよび天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）であり得るが、代表的実施形態では、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡ配列である。

本明細書中で使用する場合、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然に存在する生物またはウイルスの他の成分、例えば、そのポリヌクレオチドと一般的には関連して見出される細胞もしくはウイルスの構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。代表的実施形態では、「単離された」ヌクレオチドは、出発材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれ以上富化されている。

同様に、「単離された」ポリペプチドとは、天然に存在する生物またはウイルスの他の成分、例えば、そのポリペプチドと一般的には関連して見出される細胞もしくはウイルスの構造成分または他のポリペプチドもしくは核酸の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。代表的実施形態では、「単離された」ポリペプチドは、出発材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれ以上富化されている。

本明細書中で使用する場合、ウイルスベクターを「単離する」もしくは「精製する」（または文法的等価物）とは、そのウイルスベクターが、出発材料中の他の成分の少なくともいくつかから少なくとも部分的に分離されることを意味する。代表的実施形態では、「単離された」または「精製された」ウイルスベクターは、出発材料と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれ以上富化されている。

「治療的分子」（例えば、核酸またはポリペプチド）は、細胞もしくは対象中のタンパク質の非存在もしくは欠損から生じる症状を緩和、低下、予防、遅延および／もしくは安定化できる分子ならびに／または利益を他の方法で対象に付与する分子である。かかる治療的分子は、本明細書中に記載されるウイルスベクターに存在し、核酸の発現を促進する調節配列下にある異種核酸によりコードされ得る。

用語「治療する（ｔｒｅａｔ／ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「～の治療」（およびその文法的な変形）は、対象の状態の重症度が低下され、少なくとも部分的に改善または安定化されること、および／あるいは少なくとも１つの臨床症状における幾分かの緩和、軽減、減少または安定化が達成されること、および／あるいは疾患または障害の進行の遅延が存在することを意味する。

用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ／ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防」（およびその文法的な変形）とは、対象における疾患、障害および／または臨床症状（複数可）の発症の予防および／または遅延、ならびに／あるいは本発明の方法の非存在下で生じるものと比較した、疾患、障害および／または臨床症状（複数可）の発症の重症度における低下をいう。予防は、疾患、障害および／または臨床症状（複数可）の完全な非存在のように、完全であり得る。予防は部分的でもあり得、その結果、対象における疾患、障害および／または臨床症状（複数可）の出現ならびに／あるいは発症の重症度は、本発明の非存在下で生じるものよりも低くなる。

「治療有効」、「治療的」または「有効」量は、本明細書中で使用する場合、いくらかの改善または利益を対象に提供するのに充分な量である。代替的に述べると、「治療有効」、「治療的」または「有効」量は、対象における少なくとも１つの臨床症状におけるある程度の緩和、軽減、減少または安定化を提供する量である。いくらかの利益が対象に提供される限り、治療効果は完全である必要も治癒的である必要もないことを、当業者であれば理解するであろう。

「予防有効」量は、本明細書中で使用する場合、対象における疾患、障害および／または臨床症状の発症を予防および／または遅延するのに充分な量、ならびに／あるいは本発明の方法の非存在下で生じるものと比較して、対象における疾患、障害および／または臨床症状の発症の重症度を低下および／または遅延させるのに充分な量である。いくらかの利益が対象に提供される限り、予防のレベルが完全である必要がないことを、当業者は理解するであろう。

用語「異種ヌクレオチド配列」、「異種核酸」、または「異種核酸分子」は、本明細書中では互換的に使用され、ウイルス中に天然に存在しない配列をいう。一般に、異種核酸は、治療分子または診断分子などの目的（例えば、細胞または対象への送達のため）のポリペプチドまたは非翻訳ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームを含む。

本明細書中で使用する場合、用語「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」とは、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン内にパッケージングされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含む、ウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子をいう。あるいは、いくつかの文脈では、用語「ベクター」は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡ単独をいうために使用され得る。

本明細書中で使用する場合、ウイルスに言及するとき、用語「ベクター」、「粒子」、および「ビリオン」は互換的に使用され得る。

本発明のウイルスベクターは、例えば、国際特許公開公報ＷＯ ００／２８００４に記載されるように、「標的化された」ウイルスベクター（例えば、指向性トロピズムを有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（即ち、ウイルスＴＲおよびウイルスカプシドが異なるパルボウイルスに由来するもの）がさらに可能であり、前記特許文献の開示は、その全内容が参照により本明細書の一部をなす。

本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公開公報ＷＯ ０１／９２５５１（その開示は、その全内容が参照により本明細書の一部をなす）に記載される二重鎖パルボウイルス粒子がさらに可能である。従って、いくつかの実施形態では、二本鎖（二重鎖）ゲノムは、本発明のウイルスカプシド中にパッケージングされ得る。

体重に対するＡＡＶ投与の効果を示している。ＡＡＶ治療を受けた（組み合わせたＡＡＶ９、ＡＡＶ２－Ｇ９、およびＡＡＶ２．５－Ｇ９；Ｎ＝９）および対照胎児（Ｎ＝３６）の胎児脳および体重が比較された。群間で有意差は観察されなかった（ｐ＜０．０５）。データは平均値±平均値の標準誤差として示される。有意性は、スチューデントｔ検定解析によりｐ≦０．０５で決定された。 生物発光によるＡＡＶ媒介ホタルルシフェラーゼ形質導入および発現の検出を示している。ＡＡＶ９、ＡＡＶ２－Ｇ９、およびＡＡＶ２．５－Ｇ９を投与された胎児由来の右および左半球（前頭葉、頭頂葉、側頭葉、後頭葉）の個々の切片が生物発光を撮像された。それぞれの画像は、表３に記述される動物番号に対応する。全生物発光はそれぞれの画像の下にフォトン／秒（ｐ／ｓ）で記述されている。データは平均値±平均値の標準誤差として示される。有意性は、スチューデントｔ検定解析によりｐ≦０．０５で決定された。

本発明は、本発明の代表的実施形態が示された添付の図面を参照してここに記載される。しかし本発明は、異なる形態で具体化してもよく、本明細書中に示される実施形態に限定されると解釈すべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が徹底的かつ完全となり、本発明の範囲を当業者に完全に伝達するように提供されるものである。

特に規定しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中で発明の説明において使用される術語は、特定の実施形態だけを記載することを目的としており、本発明を限定することを意図しない。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる。

本発明の態様は、グリカン認識フットプリントを規定するＡＡＶカプシドタンパク質上の「ポケット」の発見およびかかる認識フットプリントの異種カプシドタンパク質上への移植とそれによる新規ＡＡＶカプシドタンパク質を産生することに関する。このポケットを規定する特定のアミノ酸は同定されており、例えば、ＡＡＶ９のガラクトース結合部位について本明細書中に記載されている。従って、本発明は、カプシドタンパク質上への新たなグリカン認識フットプリントの分子移植（例えば、ドナーＡＡＶ株カプシドの分子移植）とそれによりカプシドタンパク質を改変することを対象とする。かかる移植は構造モデル研究により導かれ、部位特異的変異誘発により達成される。導入遺伝子（例えば、レポーターカセット）を保有する組換えベクター（かかる移植に由来するカプシドを有する）は細胞培養および動物モデルにおいて急速な作用発現および増強された導入遺伝子発現を示す。この戦略から生み出されるウイルスベクターは、ヒト遺伝子療法臨床試験において観察される用量依存的免疫毒性などの難問に取り組むことができる。

いくつかの実施形態では、置換は、第１のＡＡＶ血清型（「ドナー」）のカプシドタンパク質由来のグリカン結合部位を前記第１のＡＡＶ血清型とは異なる第２のＡＡＶ血清型（「鋳型」）中に導入する。従って、一態様では、本発明は、置換がグリカン結合部位をＡＡＶカプシドタンパク質中に導入しそれによって「改変されたカプシドタンパク質」または「改変されたＡＡＶ２．５カプシドタンパク質」を産生する、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＡＡＶ２．５カプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質に関する。

いくつかの実施形態では、グリカン結合部位はヘキソース結合部位が可能であり、ヘキソースはガラクトース（Ｇａｌ）、マンノース（Ｍａｎ）、グルコース（Ｇｌｕ）またはフコース（Ｆｕｃ）である。いくつかの実施形態では、グリカン結合部位はシアル酸（Ｓｉａ）結合部位が可能であり、Ｓｉａ残基はＮ－アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）またはＮ－グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）である。いくつかの実施形態では、グリカン結合部位は二糖結合部位が可能であり、二糖は、Ｓｉａ（アルファ２，３）ＧａｌまたはＳｉａ（アルファ２，６）Ｇａｌの形態でガラクトースに連結しているシアル酸である。

いくつかの実施形態では、グリカン結合部位はガラクトース結合部位である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９ガラクトース結合部位（ドナー）はＡＡＶ２．５カプシドタンパク質鋳型中に移植され、移植された（改変された）ＡＡＶ２．５カプシドタンパク質鋳型に新たなグリカン結合部位を導入する。新たなグリカン結合部位は、１つまたは複数のアミノ酸置換をＡＡＶ２．５カプシド鋳型中に導入することにより生成される。

いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、
ａ）Ａ２６７Ｓ、ｂ）ＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲ４６４～４７６ＳＸ_１ＡＧＸ_２ＳＸ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＱＸ_７Ｒ（Ｘ_１～７は任意のアミノ酸であってよい）およびｃ）ＥＹＳＷ５００～５０３ＥＸ_８Ｘ_９Ｗ（Ｘ_８～９は任意のアミノ酸であってよい）を含む。

いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＡＡＶ２．５（配列番号１；ＶＰ１番号付け）中のアミノ酸２６７、アミノ酸４６４～４７６、および／またはアミノ酸５００～５０３にある。

いくつかの実施形態では、Ｘ_１はＶもしくはその保存的置換であり、Ｘ_２はＰもしくはその保存的置換であり、Ｘ_３はＮもしくはその保存的置換であり、Ｘ_４はＭもしくはその保存的置換であり、Ｘ_５はＡもしくはその保存的置換であり、Ｘ_６はＶもしくはその保存的置換であり、Ｘ_７はＧもしくはその保存的置換であり、Ｘ_８はＦもしくはその保存的置換であり、および／またはＸ_９はＡもしくはその保存的置換である。

いくつかの実施形態では、Ｘ_１はＶであり、Ｘ_２はＰであり、Ｘ_３はＮであり、Ｘ_４はＭであり、Ｘ_５はＡであり、Ｘ_６はＶであり、Ｘ_７はＧであり、Ｘ_８はＦであり、およびＸ_９はＡであり、それによってガラクトース結合部位である新しいグリカン結合部位が生じる。

ＡＡＶ２．５カプシド鋳型は、配列番号１のアミノ酸配列、またはその機能的誘導体を有し得る。アミノ酸配列の機能的誘導体は、アミノ酸置換、挿入または欠失を有してもよく、この誘導体では最初の配列の１つまたは複数の特性または機能を実質的に保持している。

機能的誘導体は、タンパク質機能に実質的な影響を及ぼさないアミノ酸置換、挿入および／または欠失を有し、例えば、誘導体は、最初のタンパク質の活性と比べた場合、１つまたは複数の活性（特性または機能）を保持する。かかる誘導体は、最初のタンパク質の１つまたは複数の活性に関して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を保持するまたは区別がつかない（有意差がない）。かかる活性は、限定なしに、１つまたは複数の細胞型トロピズムおよび／または組織トロピズムを含む。

いくつかの実施形態では、機能的誘導体は、配列番号１の１つまたは複数の保存的アミノ酸置換から生じる。保存的アミノ酸置換の例は本明細書中に提供されている。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質鋳型／骨格は、ＡＡＶ２．５（配列番号１；ＶＰ１番号付け）由来であり、アミノ酸置換は、任意の組合せでの、Ａ２６７Ｓ置換、Ｑ４６５Ｖ置換、Ａ４６８Ｐ置換、Ｄ４７０Ｎ置換、Ｉ４７１Ｍ置換、Ｒ４７２Ａ置換、Ｄ４７３Ｖ置換、Ｓ４７５Ｇ置換、Ｙ５０１Ｆ置換および／またはＳ５０２Ａ置換である。従って、いくつかの実施形態では、本発明は、置換がＡＡＶ２．５カプシドタンパク質中にグリカン結合部位を導入する、Ａ２６７Ｓ置換、Ｑ４６５Ｖ置換、Ａ４６８Ｐ置換、Ｄ４７０Ｎ置換、Ｉ４７１Ｍ置換、Ｒ４７２Ａ置換、Ｄ４７３Ｖ置換、Ｓ４７５Ｇ置換、Ｙ５０１Ｆ置換およびＳ５０２Ａ置換を含むＡＡＶ２．５（配列番号１；ＶＰ１番号付け）由来のＡＡＶカプシドタンパク質骨格を含むＡＡＶ２．５カプシドタンパク質を提供する。

鋳型としての役割を果たすＡＡＶ２．５カプシドタンパク質は、米国特許第９，０１２，２２４号に記載されるＡＡＶ２カプシド配列への特定の突然変異に起源を持っており、前記特許文献の内容は参照により本明細書の一部をなすものとする。これは、それらの特定の位置（Ｑ２６３Ａ；２６５ｉｎｓＴ；Ｎ７０５Ａ；Ｖ７０８Ａ；Ｔ７１６Ｎ）でＡＡＶ１に似ているＡＡＶ２中の５つのアミノ酸を変えることにより生成された。こうして得られたアミノ酸改変は下の配列（配列番号１）に大文字で示されている。こうして得られたＡＡＶ２．５カプシドタンパク質からウイルス粒子に与えられた特性はよく特徴付けられている（米国特許第９，０１２，２２４号）。以下に限定されないが、ＡＡＶ２．５カプシドがウイルス粒子に与える特性は、ＡＡＶ２と比べて、増強された骨格筋トロピズム、低下した肝臓－肝細胞トロピズム、神経トロピズム、およびグリアトロピズム（例えば、星状細胞）、ならびに、既存のＡＡＶ２およびＡＡＶ１中和抗体からの中和を回避する能力を含む。本明細書中に記載される本発明のいくつかの実施形態では、ＡＡＶ２．５カプシドタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１に示される配列であり、これはＶＰ１番号付けを利用している。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２．５カプシドタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するカプシドタンパク質の機能的誘導体である。

＜配列番号１ ＡＡＶ２．５カプシドタンパク質＞
1 maadgylpdw ledtlsegir qwwklkpgpp ppkpaerhkd dsrglvlpgy kylgpfngld
61 kgepvneada aalehdkayd rqldsgdnpy lkynhadaef qerlkedtsf ggnlgravfq
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241 ttstrtwalp tynnhlykqi ssAsTgasnd nhyfgystpw gyfdfnrfhc hfsprdwqrl
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361 gclppfpadv fmvpqygylt lnngsqavgr ssfycleyfp sqmlrtgnnf tfsytfedvp
421 fhssyahsqs ldrlmnplid qylyylsrtn tpsgtttqsr lqfsqagasd irdqsrnwlp
481 gpcyrqqrvs ktsadnnnse yswtgatkyh lngrdslvnp gpamashkdd eekffpqsgv
541 lifgkqgsek tnvdiekvmi tdeeeirttn pvateqygsv stnlqrgnrq aatadvntqg
601 vlpgmvwqdr dvylqgpiwa kiphtdghfh psplmggfgl khpppqilik ntpvpanpst
661 tfsaakfasf itqystgqvs veiewelqke nskrwnpeiq ytsnyAksAn vdftvdNngv
721 eprpigtr yltrnl (AAV2.5)

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２．５カプシドは、配列番号１に示される配列に少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％類似するまたは同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、特定の実施形態では、「ＡＡＶ２．５」カプシドタンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列、ならびに配列番号１のアミノ酸配列に少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％類似するまたは同一である配列を包含する。

２つ以上のアミノ酸配列間の配列類似性または同一性を決定する方法は、当該分野で公知である。配列類似性または同一性は、当該分野で公知の標準的な技術を使用して決定され得、この技術には、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁（１９７０）の配列同一性アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４頁（１９８８）の類似性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７～３９５頁（１９８４）に記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、または検査が含まれるがこれらに限定されない。

別の適切なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３～４１０頁（１９９０）およびＫａｒｌｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３～５７８７頁（１９９３）に記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、２６６：４６０～４８０頁（１９９６）；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得られるＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、任意選択的にデフォルト値に設定されるいくつかの検索パラメータを使用する。これらのパラメータは、ダイナミックな値であり、特定の配列の組成および対象の配列がそれに対して検索されている特定のデータベースの構成に依存して、プログラム自体によって設定されるが、これらの値は、感度を増加させるために調整されてよい。

さらに、追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９～３４０２頁（１９９７）により報告されているギャップドＢＬＡＳＴである。

いくつかの実施形態では、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、またはその機能的誘導体を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、配列番号２のヌクレオチド配列またはそれに少なくとも約７０％同一である、例えば、それに少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなる。

＜配列番号２ ＡＡＶ２．５Ｇ９カプシドタンパク質＞
1 maadgylpdw ledtlsegir qwwklkpgpp ppkpaerhkd dsrglvlpgy kylgpfngld
61 kgepvneada aalehdkayd rqldsgdnpy lkynhadaef qerlkedtsf ggnlgravfq
121 akkrvleplg lveepvktap gkkrpvehsp vepdsssgtg kagqqparkr lnfgqtgdad
181 svpdpqplgq ppaapsglgt ntmatgsgap madnnegadg vgnssgnwhc dstwmgdrvi
241 ttstrtwalp tynnhlykqi ssAsTgSsnd nhyfgystpw gyfdfnrfhc hfsprdwqrl
301 innnwgfrpk rlnfklfniq vkevtqndgt ttiannltst vqvftdseyq lpyvlgsahq
361 gclppfpadv fmvpqygylt lnngsqavgr ssfycleyfp sqmlrtgnnf tfsytfedvp
421 fhssyahsqs ldrlmnplid qylyylsrtn tpsgtttqsr lqfSVAGPSN MAVQGRnwlp
481 gpcyrqqrvs ktsadnnnsE FAWtgatkyh lngrdslvnp gpamashkdd eekffpqsgv
541 lifgkqgsek tnvdiekvmi tdeeeirttn pvateqygsv stnlqrgnrq aatadvntqg
601 vlpgmvwqdr dvylqgpiwa kiphtdghfh psplmggfgl khpppqilik ntpvpanpst
661 tfsaakfasf itqystgqvs veiewelqke nskrwnpeiq ytsnyAksAn vdftvdNngv
721 yseprpigtr yltrnl (AAV2.5G9)

本明細書中で提供される例は、ＡＡＶ９ドナーからのガラクトース結合部位の導入のためのＡＡＶ２．５鋳型での可能なアミノ酸置換を示している。これらの例は、限定的であることが意図されておらず、ドナーＡＡＶ血清型由来のグリカン結合部位は、本明細書中に記載される「ポケット」を規定する残基を改変することにより、異なるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質鋳型中に導入することができるという原理を実証している。

新たなグリカン結合部位を含むかかる改変されたまたはキメラカプシドタンパク質は、増加した細胞表面結合およびインビボでのさらに迅速で増強された導入遺伝子発現という有益な表現型を有するウイルスベクターとして使用可能であるウイルス粒子を作り上げるカプシドに組み立てることが可能である。

表２は、本発明が包含し得る非限定的な例となるＡＡＶの血清型ならびにゲノムおよびカプシド配列の受託番号を列挙している。ドナーおよび鋳型のＡＡＶ血清型はヒトＡＡＶに限定されず、非ヒトＡＡＶ、例えば、トリまたはウシＡＡＶ、ならびに非ヒト霊長類ＡＡＶを含んでいてもよく、その例は表１に示されている。本明細書中で使用する場合、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）には、１型ＡＡＶ、２型ＡＡＶ、２．５型ＡＡＶ、３型ＡＡＶ（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、４型ＡＡＶ、５型ＡＡＶ、６型ＡＡＶ、７型ＡＡＶ、８型ＡＡＶ、９型ＡＡＶ、１０型ＡＡＶ、１１型ＡＡＶ、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、クレードＦ ＡＡＶおよび現在公知のまたは後に発見される任意の他のＡＡＶが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照のこと。多数の比較的新しいＡＡＶ血清型およびクレードが同定されている（表１参照のこと）。

ＡＡＶの種々の血清型のゲノム配列、ならびにネイティブ末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質およびカプシドサブユニットの配列が、当該分野で公知である。かかる配列の例示的であるが非限定的な例は、文献中またはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースなどの公的データベース中で見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース受託番号ＮＣ＿００２０７７．１、ＮＣ＿００１４０１．２、ＮＣ＿００１７２９．１、ＮＣ＿００１８６３．１、ＮＣ＿００１８２９．１、ＮＣ＿００６１５２．１、ＮＣ＿００１８６２．１、ＡＦ５１３８５１．１、ＡＦ５１３８５２．１を参照でき、その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために、参照により本明細書の一部をなすものとする。例えば以下もまた参照のこと：Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａら（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５頁；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３頁；Ｃｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９頁；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９頁；Ｘｉａｏら（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４頁；Ｍｕｒａｍａｔｓｕら（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８頁；Ｓｈａｄｅら（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１頁；Ｇａｏら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４頁；国際特許公開公報ＷＯ ００／２８０６１、ＷＯ ９９／６１６０、ＷＯ ９８／１１２４４；および米国特許第６，１５６，３０３号；これらの開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶの核酸配列およびアミノ酸配列を教示するために、参照により本明細書の一部をなすものとする。

自律的パルボウイルスおよびＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳら、ＶＩＲＯＬＯＧＹ、第２巻、第６９章および第７０章（第４版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）中により詳細に記載されている。ＡＡＶ２（Ｘｉｅら（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５～１０頁）、ＡＡＶ４（Ｐａｄｒｏｎら（２００５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７～５８頁）、ＡＡＶ５（Ｗａｌｔｅｒｓら（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：３３６１～７１頁）およびＣＰＶ（Ｘｉｅら（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７～５２０頁およびＴｓａｏら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１４５６～６４頁）の結晶構造の説明もまた参照のこと。

本発明の他の態様は、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質を含むカプシドに関する。

本発明の他の態様は、（ａ）本発明のＡＡＶカプシド、および（ｂ）少なくとも１つの末端反復配列を含む核酸を含むウイルスベクターまたは粒子に関し、核酸はカプシドによりカプシド封入されている。

本発明の他の態様は、薬学的に許容される担体中に、改変ＡＡＶカプシドタンパク質、ならびに／または改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドおよび／もしくはウイルスベクターを含む組成物に関する。

本発明は、改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスベクターと細胞を接触させることを含む、核酸を細胞中に導入する方法をさらに提供する。細胞は対象中に存在し得、いくつかの実施形態では、対象はヒト対象が可能である。いくつかの実施形態では、対象は子宮内にあってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は神経系細胞（例えば、ニューロンまたはグリア細胞、例えば、神経組織の細胞）でもよい。いくつかの実施形態では、結果としてのウイルスベクターは、細胞に接触させた場合のドナーおよび鋳型血清型のウイルスベクターの形質導入レベルと比べて、細胞に接触させた場合に増強された形質導入（例えば、細胞（例えば、神経系細胞、例えば、ニューロン）での核酸発現の増強されたレベル）を有する。例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質ドナーがＡＡＶ血清型９であり、ＡＡＶカプシドタンパク質鋳型がＡＡＶ血清型２．５（ＡＡＶ２．５）である場合、得られたウイルスベクターはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２．５と比較される。

［ウイルスベクターを生成する方法］
本発明は、本発明の改変されたカプシドタンパク質およびカプシドを含むウイルスベクターもまた包含する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター（例えば、パルボウイルスカプシドおよび／またはベクターゲノムを含んでいる）、例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶカプシドおよび／またはベクターゲノムを含んでいる）である。代表的実施形態では、ウイルスベクターは、本発明の改変されたカプシドサブユニットを含む改変されたＡＡＶカプシドとベクターゲノムとを含む。

例えば、代表的実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）本発明の改変されたカプシドタンパク質を含む改変されたウイルスカプシド（例えば、改変されたＡＡＶカプシド）と、（ｂ）末端反復配列（例えば、ＡＡＶ－ＴＲ）を含む核酸とを含み、この末端反復配列を含む核酸は、改変されたウイルスカプシドによってカプシド封入されている。核酸は、２つの末端反復（例えば、２つのＡＡＶ－ＴＲ）を任意選択的に含み得る。

代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、ウイルスのゲノムが目的の異種核酸を含む組換えウイルスベクターである。異種核酸は、目的のポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードし得る。組換えウイルスベクターは下にさらに詳細に記載されている。異種核酸は、標的細胞での発現を促進する適切な制御配列に作動可能に連結されることが可能である。例えば、異種核酸は、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、および／またはエンハンサー、および同類のものなどの発現制御エレメントに作動可能に結合することができる。

特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターは、改変されたカプシドタンパク質なしのウイルスベクターによる形質導入のレベルと比べた場合（例えば、ＡＡＶ２．５カプシドタンパク質を有するウイルスベクターと比べた場合）、肝臓の変更された（例えば、低下した）形質導入を有する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、筋肉に対して全身的形質導入を有し、例えば、ベクターは体全体を通じて複数の骨格筋群を形質導入し、任意選択的に心筋および／または横隔膜筋を形質導入する。いくつかの実施形態では、本発明のウイルスベクターは、適切な対照と比べた場合（例えば、他の組織と比べた場合、および／または、他のウイルスベクター、例えば、改変されたカプシドタンパク質のないベクター、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２．５、もしくは表１に列挙されている任意のＡＡＶ血清型、を用いた形質導入のレベルと比べた場合）、神経系（例えば、ニューロン、星状細胞などのグリアまたはオリゴデンドロサイト）組織において増強された形質導入（例えば、増強されたレベルの核酸発現）を有する。適切な対照は、移植されたグリカン結合部位を組み入れられていないことを除き他の点では同一のウイルスベクターでもよい。

本発明の改変されたカプシドタンパク質、ウイルスカプシドおよびウイルスベクターは、その天然の（すなわち、グリカン結合部位を導入する本明細書中に記載される置換で「改変されて」いない）状態で特定された位置に指示されたアミノ酸を有するカプシドタンパク質、カプシドおよびウイルスベクターを除外することは当業者であれば理解する。

本発明は、本発明のウイルスベクターを生成する方法をさらに提供する。１つの代表的実施形態では、本発明は、ウイルスベクターを生成する方法を提供し、この方法は、（ａ）少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ－ＴＲ配列）を含む核酸鋳型と、（ｂ）核酸鋳型の複製およびＡＡＶカプシド中へのカプシド封入に充分なＡＡＶ配列（例えば、本発明のＡＡＶカプシドをコードするＡＡＶのｒｅｐ配列およびＡＡＶのｃａｐ配列）とを、細胞に提供するステップを含む。任意選択的に、核酸鋳型は、少なくとも１つの異種核酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、核酸鋳型は２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、これらは、（存在する場合）異種核酸配列に対して５’側および３’側に位置するが、異種核酸配列と直接隣接している必要はない。

核酸鋳型ならびにＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ配列は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた核酸鋳型を含むウイルスベクターが細胞中で生成されるような条件下で提供される。この方法は、細胞からウイルスベクターを回収するステップをさらに含み得る。ウイルスベクターは、培地からおよび／または細胞を溶解することによって回収され得る。

細胞は、ＡＡＶウイルスの複製を許容する細胞であり得る。当該分野で公知の任意の適切な細胞が使用され得る。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失した機能を提供するトランス補完性（ｔｒａｎｓ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス補完性細胞であり得る。

ＡＡＶ複製およびカプシド配列は、当該分野で公知の任意の方法によって提供され得る。現在のプロトコールは典型的に、単一のプラスミド上のＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現する。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列は、一緒に提供される必要はないが、一緒に提供するのが簡便であり得る。ＡＡＶのｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供され得る（例えば、欠失型アデノウイルスベクターのＥ１ａ領域またはＥ３領域中に挿入される）。ＥＢＶベクターもまた、ＡＡＶのｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現するために使用され得る。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソームであるが、連続する細胞分裂を通じてずっと高コピー数を維持する（すなわち、染色体外エレメントとして細胞中に安定的に組み込まれ、「ＥＢＶベースの核エピソーム」と呼ばれる）ことである。

さらなる代替として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞中に安定に取り込まれ得る。

典型的には、ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを防止するために、ＴＲと隣接していない。

核酸鋳型は、当該分野で公知の任意の方法を使用して細胞に提供され得る。例えば、鋳型は、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施形態では、核酸鋳型は、ヘルペスウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠失型アデノウイルスのＥ１ａ領域またはＥ３領域中に挿入される）。別の例として、ＡＡＶ ＴＲが隣接するレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルスベクターを使用可能である。ＥＢＶベクターもまた、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上記したように、鋳型を送達するために使用され得る。

別の代表的実施形態では、核酸鋳型は、複製するｒＡＡＶウイルスによって提供される。なお他の実施形態では、核酸鋳型を含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体中に安定に組み込まれる。

ウイルス力価を増強するために、増殖性ＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が、細胞に提供され得る。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当該分野で公知である。典型的には、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスベクターまたはヘルペスウイルスベクターによって提供される。あるいは、アデノウイルス配列またはヘルペスウイルス配列は、例えば、効率的なＡＡＶ生成を促進するヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして、別の非ウイルスベクターまたはウイルスベクターによって提供され得る。

さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体中に埋め込まれたまたは安定な染色体外エレメントとして維持されるヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン中にパッケージングすることはできない、例えば、ヘルパーウイルス配列にＴＲは隣接していない。

単一のヘルパー構築物上のＡＡＶ複製およびカプシド配列ならびにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を提供することが有利であり得ることを、当業者は理解するであろう。このヘルパー構築物は、非ウイルス構築物でもウイルス構築物でもよい。１つの非限定的説明として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであり得る。

１つの特定の実施形態では、ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは、核酸鋳型をさらに含み得る。ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはｒＡＡＶ鋳型は、アデノウイルスの欠失した領域（例えば、Ｅ１ａ領域またはＥ３領域）中に挿入され得る。

さらなる実施形態では、ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施形態によれば、ｒＡＡＶ鋳型は、プラスミド鋳型として提供され得る。

別の例示的実施形態では、ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供され、ｒＡＡＶ鋳型は、プロウイルスとして細胞中に取り込まれる。あるいは、ｒＡＡＶ鋳型は、染色体外エレメント（例えば、ＥＢＶベースの核エピソーム）として細胞内で維持されるＥＢＶベクターによって提供される。

さらなる例示的な実施形態では、ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。ｒＡＡＶ鋳型は、別個の複製するウイルスベクターとして提供され得る。例えば、ｒＡＡＶ鋳型は、ｒＡＡＶ粒子または第２の組換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。

上述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは典型的に、アデノウイルスの複製およびパッケージングに充分なアデノウイルスの５’および３’のシス配列（即ち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列および存在する場合にはｒＡＡＶ鋳型は、アデノウイルス骨格中に埋め込まれ、５’および３’のシス配列がそれに隣接しており、その結果これらの配列は、アデノウイルスカプシド中にパッケージングされ得る。上記のように、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶのｒｅｐ／ｃａｐ配列には一般に、これらの配列がＡＡＶビリオン中にパッケージングされないように、ＴＲとは隣接していない。

Ｚｈａｎｇら（Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４～１２頁（２００１））は、アデノウイルスならびにＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方を含むキメラヘルパーを記載している。

ヘルペスウイルスもまた、ＡＡＶパッケージング法においてヘルパーウイルスとして使用され得る。ＡＡＶのｒｅｐタンパク質（複数可）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、拡大縮小可能なＡＡＶベクター生成スキームを有利に促進し得る。ＡＡＶ－２ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ－Ｉ）ベクターが記載されており、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ００／１７３７７があり、前記特許文献は参照により本明細書の一部をなす。

さらなる代替案として、本発明のウイルスベクターは、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶ鋳型を送達するバキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞において生成することができる。

混入するヘルパーウイルスを含まないＡＡＶベクターストックは、当該分野で公知の任意の方法によって得られ得る。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に識別され得る。ＡＡＶはまた、ヘパリン基質に対する親和性に基づいて、ヘルパーウイルスから分離され得る。任意の混入するヘルパーウイルスが複製コンピテントにならないように、欠失型複製欠損ヘルパーウイルスが使用され得る。アデノウイルス初期遺伝子発現のみがＡＡＶウイルスのパッケージングを媒介するために必要なので、さらなる代替として、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーが使用され得る。後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルス変異体は当該分野で公知である（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。

［組換えウイルスベクター］
本発明のウイルスベクターは、インビトロ、エクスビボおよびインビボで細胞に核酸を送達するために有用である。特に、ウイルスベクターは、例えば、哺乳動物細胞を含む動物細胞に核酸を送達または移入するために有利に使用され得る。

目的の任意の異種核酸配列（複数可）は、本発明のウイルスベクター中で送達され得る。目的の核酸には、治療的（例えば、医療用途または獣医学用途のため）および／または免疫原性（例えば、ワクチンのため）ポリペプチドを含む、ポリペプチドをコードする核酸が含まれる。

治療的ポリペプチドには、嚢胞性線維症膜貫通制御タンパク質（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＦＴＲ））、ジストロフィン（ミニジストロフィンおよびマイクロジストロフィン）が含まれる、例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０頁；米国特許公開公報２００３０１７１３１号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００８／０８８８９５号、Ｗａｎｇら Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３７１４～１３７１９頁（２０００）；およびＧｒｅｇｏｒｅｖｉｃら Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：６５７～６４頁（２００８）を参照のこと）、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３４９頁）、ミニユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子など）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α_１－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分岐鎖ケト酸脱水素酵素、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド増殖因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経増殖因子、神経栄養因子－３および－４、脳由来神経栄養因子、骨形態形成（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ）タンパク質［ＲＡＮＫＬおよびＶＥＧＦが含まれる］、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子－αおよび－βなど）、リソソーム酸α－グルコシダーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死増殖因子α可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、カルシウムハンドリングをモジュレートする分子（例えば、ＳＥＲＣＡ_２Ａ、ＰＰ１のインヒビター１およびそれらの断片［例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ２００６／０２９３１９およびＷＯ ２００７／１００４６５］）、短縮型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔなどのＧタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子、ＩＲＡＰなどの抗炎症性因子、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、モノクローナル抗体（単鎖モノクローナル抗体が含まれ；例示的なＭａｂは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｍａｂである）、ニューロペプチドおよびその断片（例えば、ガラニン、ニューロペプチドＹ（米国特許第７，０７１，１７２号を参照のこと）、バソヒビンなどの血管新生インヒビターならびに他のＶＥＧＦインヒビター（例えば、バソヒビン２［ＰＣＴ公開番号ＷＯ ＪＰ２００６／０７３０５２を参照のこと］）が含まれるが、これらに限定されない。他の例示的な異種核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、および腫瘍壊死因子）、がん療法において使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンド、およびそれを必要とする対象において治療効果を有する任意の他のポリペプチドをコードする。ＡＡＶベクターは、モノクローナル抗体および抗体断片、例えば、ミオスタチンに対する抗体または抗体断片を送達するためにも使用され得る（例えば、Ｆａｎｇら Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：５８４～５９０頁（２００５）を参照のこと）。

ポリペプチドをコードする異種核酸配列には、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をコードする異種核酸配列が含まれる。レポーターポリペプチドは当該分野で公知であり、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼおよびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。

任意選択的に、異種核酸は、分泌型ポリペプチド（例えば、そのネイティブ状態で分泌型ポリペプチドであるポリペプチド、または例えば当該分野で公知の分泌シグナル配列との作動可能な関連によって分泌されるように操作されたポリペプチド）をコードする。

あるいは、本発明の特定の実施形態では、異種核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載される）、スプライソソーム媒介性のトランススプライシングをもたらすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６頁（１９９９）；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照のこと）、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１頁（２０００）を参照のこと）および「ガイド」ＲＮＡなどの他の非翻訳ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９頁（１９９８）；Ｙｕａｎらに対する米国特許第５，８６９，２４８号）などをコードし得る。例示的な非翻訳ＲＮＡには、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療および／もしくは予防するため、ならびに／または化学療法による損傷を予防するために心臓に投与するため）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのため）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療および／または予防するため）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管疾患を治療するため、例えば、Ａｎｄｉｎｏら Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１３２～１４２頁（２００８）およびＬｉら Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．２６：５１～５５頁（２００５）を参照のこと）；ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン阻害分子またはドミナントネガティブ分子（例えば、心血管疾患を治療するため、例えば、Ｈｏｓｈｉｊｉｍａら Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８６４～８７１頁（２００２）を参照のこと）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、癲癇のため）、ならびに病原性生物およびウイルス（例えば、Ｂ型および／またはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルスなど）に対するＲＮＡｉが含まれる。

さらに、選択的スプライシングを指示する核酸配列が送達され得る。説明するために、ストロフィンエクソン５１の５’および／または３’スプライス部位に相補的なアンチセンス配列（または他の阻害配列）が、このエクソンの読み飛ばしを誘導するためにＵ１またはＵ７低分子核内（ｓｎ）ＲＮＡプロモーターと合わせて送達され得る。例えば、アンチセンス／阻害配列（複数可）に対して５’側に位置するＵ１またはＵ７ ｓｎＲＮＡプロモーターを含むＤＮＡ配列は、本発明の改変されたカプシド中にパッケージングされて送達され得る。

ウイルスベクターは、宿主染色体上の遺伝子座と相同性を共有し、宿主染色体上の遺伝子座と組み換わる異種核酸もまた含み得る。このアプローチは、例えば、宿主細胞中の遺伝的欠陥を修正するために利用され得る。

本発明は、例えばワクチン接種のための免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスベクターもまた提供する。核酸は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶまたはＳＩＶのｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、がん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原など由来の免疫原が含まれるがこれらに限定されない、当該分野で公知の対象の任意の免疫原をコードし得る。

ワクチンベクターとしてのパルボウイルスの使用は当該分野で公知である（例えば、Ｍｉｙａｍｕｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：８５０７頁（１９９４）；Ｙｏｕｎｇらに対する米国特許第５，９１６，５６３号、Ｍａｚｚａｒａらに対する米国特許第５，９０５，０４０号、米国特許第５，８８２，６５２号、Ｓａｍｕｌｓｋｉらに対する米国特許第５，８６３，５４１号を参照のこと）。抗原は、パルボウイルスカプシド中に存在し得る。あるいは、抗原は、組換えベクターゲノム中に導入された異種核酸から発現され得る。本明細書中に記載されるおよび／または当該分野で公知の対象の任意の免疫原は、本発明のウイルスベクターによって提供され得る。

免疫原性ポリペプチドは、免疫応答を惹起するのに適した、ならびに／または微生物、細菌、原生動物、寄生生物、真菌および／もしくはウイルスの感染および疾患が含まれるがこれらに限定されない感染および／もしくは疾患に対して対象を保護するのに適した任意のポリペプチドであり得る。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルソミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）表面タンパク質もしくはインフルエンザウイルス核タンパク質、またはウマインフルエンザウイルス免疫原などの、インフルエンザウイルス免疫原）もしくはレンチウイルス免疫原（例えば、ＨＩＶもしくはＳＩＶのエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶもしくはＳＩＶのマトリックス／カプシドタンパク質ならびにＨＩＶもしくはＳＩＶのｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物などの、ウマ感染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原）であり得る。免疫原性ポリペプチドは、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルス核カプシドタンパク質および／またはラッサ熱エンベロープ糖タンパク質などのラッサ熱ウイルス免疫原）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアＬ１またはＬ８遺伝子産物などのワクシニアウイルス免疫原）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、ＮＰおよびＧＰ遺伝子産物などの、エボラウイルス免疫原またはマールブルグウイルス免疫原）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦおよび／またはＳＦＳウイルス免疫原）、またはコロナウイルス免疫原（例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質などの感染性ヒトコロナウイルス免疫原、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原またはトリ感染性気管支炎ウイルス免疫原）でもあり得る。免疫原性ポリペプチドはさらに、ポリオ免疫原、ヘルペスウイルス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）、ムンプスウイルス免疫原、麻疹ウイルス免疫原、風疹ウイルス免疫原、ジフテリア毒素もしくは他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）免疫原、および／または当該分野で現在公知のまたは免疫原として後に同定される任意の他のワクチン免疫原であり得る。

あるいは、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍またはがん細胞の抗原であり得る。任意選択的に、腫瘍抗原またはがん抗原は、がん細胞の表面上に発現される。例示的ながんおよび腫瘍細胞の抗原は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１頁（１９９１））に記載されている。他の例示的ながん抗原および腫瘍抗原には、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ－１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＫ－４、β－カテニン、ＭＵＭ－１、カスパーゼ－８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ－１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５頁；Ｋａｗａｋａｍｉら（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７頁；Ｋａｗａｋａｍｉら（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４頁）、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００ ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＣＥＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、Ｐ－１５、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９頁）；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９、ＮＳＥ、ＤＵ－ＰＡＮ－２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ－１、ＣＡ７２－４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ－ｅｒｂＢ－２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ－ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制因子タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ、（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３頁）；ムチン抗原（ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９０／０５１４２）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；および／または現在公知のまたは以下のがんに関連することが後に発見される抗原：メラノーマ、腺癌腫、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がん、および現在公知のまたは後に同定される任意の他のがんまたは悪性状態（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１～９１頁を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。

さらなる代替として、異種核酸は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで細胞中において生成されることが望ましい任意のポリペプチドをコードし得る。例えば、ウイルスベクターは、培養細胞中に導入され得、発現された核酸産物がそこから単離される。

対象の異種核酸（複数可）が適切な制御配列と作動可能に関連し得ることが、当業者に理解されよう。例えば、異種核酸は、発現制御エレメント、例えば転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどと、作動可能に関連し得る。

さらに、目的の異種核酸（複数可）の調節された発現は、転写後レベルで、例えば、オリゴヌクレオチド、小分子および／または特定の部位におけるスプライシング活性を選択的に遮断する他の化合物（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ２００６／１１９１３７に記載される）の存在または非存在によって、異なるイントロンの選択的スプライシングを調節することによって、達成され得る。

種々のプロモーター／エンハンサーエレメントが、所望されるレベルおよび組織特異的発現に依存して使用され得ることを、当業者は理解するであろう。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに依存して、構成的または誘導性であり得る。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブまたは外来であり得、天然配列または合成配列であり得る。外来とは、転写開始領域が、その転写開始領域が導入される野生型宿主において見出されないものであることを意図する。

特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療される対象にとってネイティブであり得る。代表的実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列にとってネイティブであり得る。プロモーター／エンハンサーエレメントは一般に、対象の標的細胞（複数可）において機能するように選択される。さらに、特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳動物のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的でも誘導性でもよい。

誘導性発現制御エレメントは典型的に、異種核酸配列（複数可）の発現の調節を提供することが望ましい適用において有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的プロモーター／エンハンサーエレメントまたは好ましいプロモーター／エンハンサーエレメントであり得、筋特異的または好ましい（心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または好ましいものが含まれる）、神経組織特異的または好ましい（脳特異的または好ましいものが含まれる）、眼特異的または好ましい（網膜特異的および角膜特異的なものが含まれる）、肝臓特異的または好ましい、骨髄特異的または好ましい、膵臓特異的または好ましい、脾臓特異的または好ましい、および／または肺特異的または好ましいプロモーター／エンハンサーエレメントが含まれる。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、ホルモン誘導性エレメントおよび金属誘導性エレメントが含まれる。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントには、Ｔｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーターおよびメタロチオネインプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

異種核酸配列（複数可）が標的細胞において転写され、次いで翻訳される実施形態では、特異的開始シグナルが一般に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために含まれる。ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含み得るこれらの外因性翻訳制御配列は、天然および合成の両方の、種々の起源のものであり得る。

本発明に従うウイルスベクターは、分裂細胞および非分裂細胞を含む広範な細胞中に異種核酸を送達する手段を提供する。ウイルスベクターは、例えば、インビトロでポリペプチドを生成するために、またはエクスビボの遺伝子療法のために、対象の核酸をインビトロで細胞に送達するために使用され得る。ウイルスベクターは、例えば、免疫原性および／もしくは治療的ポリペプチドならびに／または機能的ＲＮＡを発現するために、それを必要とする対象に核酸を送達する方法において、さらに有用である。この様式で、ポリペプチドおよび／または機能的ＲＮＡは、対象中においてインビボで生成され得る。対象は、ポリペプチドの欠乏症を有するので、そのポリペプチドを必要とし得る。さらに、対象におけるポリペプチドおよび／または機能的ＲＮＡの生成は、いくらかの有益な効果を付与し得るので、この方法が実施され得る。

ウイルスベクターは、（例えば、スクリーニング方法と合わせて、例えばポリペプチドを生成するためおよび／または対象に対する機能的ＲＮＡの影響を観察するためのバイオリアクタとして対象を使用して）培養細胞または対象において対象のポリペプチドおよび／または機能的ＲＮＡを生成するためにも使用され得る。

一般に、本発明のウイルスベクターは、治療的ポリペプチドおよび／または機能的ＲＮＡを、例えば、それを必要とする対象、例えば、対象は疾患状態または障害を有するまたはそのリスクがある、に送達することが有利な任意の疾患状態または障害を治療および／または予防するために、ポリペプチドおよび／または機能的ＲＮＡ（例えば、治療的ポリペプチド、例えば、治療的核酸）をコードする異種核酸を送達するために使用され得る。いくつかの実施形態では、疾患状態はＣＮＳ疾患または障害である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患または障害に関連する疼痛を有するまたはこれを有するリスクがある。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は子宮内にいる。

例示的な疾患状態には、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通制御タンパク質）および他の肺の疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（β－グロビン）、貧血（エリスロポエチン）および他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β－インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞株由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（反復を除去するためのＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、癲癇（ガラニン、神経栄養因子）および他の神経学的障害、がん（エンドスタチン、アンジオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；ＶＥＧＦまたは多剤耐性遺伝子産物に対するＲＮＡｉを含むＲＮＡｉ、ｍｉｒ－２６ａ［例えば、肝細胞癌腫のため］）、真正糖尿病（インスリン）、デュシェンヌ型（ジストロフィン、ミニジストロフィン、インスリン様増殖因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、エクソン読み飛ばしを誘導するためのジストロフィン遺伝子中のスプライスジャンクションに対するアンチセンスまたはＲＮＡｉ［例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００３／０９５６４７を参照のこと］、エクソン読み飛ばしを誘導するためのＵ７ ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス［例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２００６／０２１７２４を参照のこと］、およびミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体断片）およびベッカー型を含む筋ジストロフィー、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（α－Ｌ－イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠乏症（アデノシンデアミナーゼ）、糖原貯蔵障害（例えば、ファブリー病［α－ガラクトシダーゼ］およびポンペ病［リソソーム酸α－グルコシダーゼ］）および他の代謝障害、先天性肺気腫（α１－アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ・サックス病（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸脱水素酵素）、網膜変性疾患（ならびに眼および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性症についてＰＤＧＦ、および／あるいは例えばＩ型糖尿病における網膜障害を治療／予防するためのバソヒビンもしくはＶＥＧＦの他のインヒビターまたは他の血管新生インヒビター）、固形臓器の疾患、例えば脳（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンジオスタチン、および／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、膠芽腫［エンドスタチン、アンジオスタチン、および／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］が含まれる）、肝臓、腎臓、うっ血性心不全または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を含む心臓（例えば、プロテインホスファターゼインヒビターＩ（Ｉ－１）およびその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、β２アドレナリン受容体、β２アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、短縮型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔなどのＧタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子；カルサルシン（ｃａｌｓａｒｃｉｎ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン阻害分子またはドミナントネガティブ分子などを送達することによる）、関節炎（インスリン様増殖因子）、関節障害（インスリン様増殖因子１および／または２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓを送達することによる）、心臓移植物の生存の改善（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様増殖因子Ｉ）、腎臓欠損症（ｋｉｄｎｅｙ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（ＩＲＡＰおよびＴＮＦα可溶性受容体などの抗炎症性因子）、肝炎（α－インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠乏症（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２およびＳＣＡ３を含む脊髄性大脳性運動失調症（ｓｐｉｎａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｔａｘｉａｓ）、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患、先天性神経変性障害（例えば、単一遺伝子神経変性障害）例えば、ムコ多糖症（ムコ多糖症Ｉ型（ハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群、またはシャイエ症候群としても公知である、ＩＤＵＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ）、ムコ多糖症ＩＩ型（ハンター症候群としても公知である、ＩＤＳ、Ｉ２Ｌ酵素）、ムコ多糖症ＩＩＩ型（サンフィリポ症候群としても公知である、ＧＮＳ［Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ］、ＨＧＳＮＡＴ［ヘパラン－アルファ－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ］、ＮＡＧＬＵ［アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ］、および／またはＳＧＳＨ［スルファミダーゼ］）、ムコ多糖症ＩＶ型（モルキオ症候群としても公知である、ＧＡＬＮＳ［ガラクトサミン（ｇａｌａｔｏｓａｍｉｎｅ）（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ］および／またはＧＬＢ１［ベータ－ガラクトシダーゼ］）、ムコ多糖症Ｖ型（シャイエ症候群としても公知である、現在ではＩ型のサブグループ、その上ＩＤＵＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ）、ムコ多糖症ＶＩ型（マロトー・ラミー症候群としても公知である、ＡＲＳＢ、アリルスルファターゼＢ）、ムコ多糖症ＶＩＩ型（スライ症候群としても公知である、ＧＵＳＢ、ベータ－グルクロニダーゼ）、ムコ多糖症ＩＸ型（Ｎａｔｏｗｉｃｚ症候群としても公知である、ＨＹＡＬ１、ヒアルロニダーゼ）を含むがこれらに限定されない）および／または白質ジストロフィー（成人発症型常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ；ＬＭＮＢ１、ラミンＢ１）、アイカルディ・グティエール症候群（ＴＲＥＸ１、ＲＮＡＳＥＨＳＢ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、および／またはＲＮＡＳＥＨ２Ａ）、アレキサンダー病（ＦＲＡＰ、グリア線維酸性タンパク質）、ＣＡＤＡＳＩＬ（Ｎｏｔｃｈ３）、カナバン病（ＡＳＰＡ、アスパルトアシラーゼ）、ＣＡＲＡＳＩＬ（ＨＴＲＡ１、セリンプロテアーゼＨＴＲＡ１）、脳腱黄色腫症（「ＣＴＸ」、ＣＹＰ２７Ａ１、ステロール２７－水酸化酵素）小児運動失調症および脳ミエリン形成不全症（ＣＡＣＨ）／白質消失病（ＶＷＭＤ）（ｅＩＦ２Ｂ、真核生物翻訳開始因子２Ｂ）、ファブリー病（ＧＬＡ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ）、フコシドーシス（ＦＵＣＡ１、アルファ－Ｌ－フコシダーゼ）、ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＬＢ１、ベータ－ガラクトシダーゼ）、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸尿症（Ｌ２ＨＤＧＨ、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ）、クラッベ病（ＧＡＬＣ、ガラクトセレブロシダーゼ）、皮質下嚢胞をもつ大脳型白質脳症（「ＭＬＣ」、ＭＬＣ１および／またはＨＥＰＡＣＡＭ）、異染性白質ジストロフィー（ＡＳＡ、アリルスルファターゼＡ）、多種スルファターゼ欠損症（「ＭＳＤ」、ＳＵＭＦ１、すべてのスルファターゼ酵素に影響を与えるスルファターゼ変更因子１）、ペリツェウス・メルツバッヘル病（「Ｘ連鎖痙性対麻痺」としても公知である、ＰＬＰ１［Ｘ連鎖プロテオリピドタンパク質１］および／またはＧＪＡ１２［ギャップ結合タンパク質１２］）、Ｐｏｌ ＩＩＩ関連白質ジストロフィー（ＰＯＬＲ３Ａおよび／またはＰＯＬＲ３Ｂ）、レフサム病（ＰＨＹＨ、［フィタノイル－ＣｏＡ水酸化酵素］および／またはＰｅｘ７［ペルオキシソーム中へのＰＨＹＨインポーター］）、サラ病（「遊離シアル酸蓄積症」としても公知である、ＳＬＣ１７Ａ５、シアル酸トランスポーター）、シェーグレン・ラルソン症候群（ＡＬＤＨ３Ａ２、アルデヒドデヒドロゲナーゼ）、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー（「ＡＬＤ」、ＡＢＣＤ１、ペルオキシソームＡＴＰアーゼ結合カセットタンパク質）、ツェルウェガー症候群スペクトル障害（ペルオキシソーム形成異常症としても公知である、ＰＥＸ１、ＰＥＸ２、ＰＥＸ３、ＰＥＸ４、ＰＥＸ５、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１１Ｂ、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ１４、ＰＥＸ１６、ＰＥＸ１９、ＰＥＸ２６））などが含まれるが、これらに限定されない。本発明はさらに、移植の成功率を増加させるためおよび／または臓器移植もしくは補助療法の負の副作用を低下させるために、臓器移植後に使用され得る（例えば、サイトカイン生成を遮断するために免疫抑制剤または阻害核酸を投与することによって）。別の例として、骨形態形成タンパク質（ＢＮＰ２、７など、ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦを含む）が、例えば、がん患者における破壊（ｂｒｅａｋ）または外科的除去後に、骨同種移植片と共に投与され得る。

従って、いくつかの実施形態では、本発明は、治療的核酸が対象において発現される条件下で、本発明のウイルスベクターおよび／または組成物を対象に投与することにより対象の細胞中に治療的核酸を導入することも含む、それを必要とする対象において疾患を治療する方法を提供する。

本発明は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）を生成するためにも使用され得る。例えば、本発明のウイルスベクターは、例えば成人線維芽細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、腎細胞、脂肪細胞、心臓細胞、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞などの非多能性細胞中に、幹細胞関連核酸（複数可）を送達するために使用され得る。幹細胞に関連する因子をコードする核酸は、当該分野で公知である。かかる幹細胞および多能性に関連する因子の非限定的な例には、Ｏｃｔ－３／４、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３および／またはＳＯＸ１５）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４および／またはＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃおよび／またはＮ－ｍｙｃ）、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８が含まれる。

本発明は、糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子）などの代謝障害、ムコ多糖障害（例えば、スライ症候群［β－グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハーラー・シャイエ症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリポ症候群Ａ［ヘパランスルファミダーゼ］、Ｂ［Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチル－ＣｏＡ：α－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ－アセチルグルコサミン ６－スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ］、Ｂ［β－ガラクトシダーゼ］、マロトー・ラミー症候群［Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ］、など）などのリソソーム蓄積症、ファブリー病（α－ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、または糖原貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸性α－グルコシダーゼ）を治療および／または予防するためにも実行され得る。

遺伝子導入は、疾患状態のための療法を理解および提供するためのかなり有望な用途を有する。欠損した遺伝子が既知でありクローニングされている多数の遺伝性疾患が存在する。一般に、上記疾患状態は２つのクラスに入る：（劣性様式で一般に遺伝する、多くは酵素の）欠乏状態、および（調節タンパク質または構造タンパク質が関与し得、典型的には優性様式で遺伝する）バランスを欠いた状態。欠乏状態の疾患について、遺伝子導入は、補充療法のために罹患組織中に正常な遺伝子をもたらすため、ならびにアンチセンス変異を使用して疾患の動物モデルを創出するために使用され得る。バランスを欠いた疾患状態について、遺伝子導入は、モデル系において疾患状態を創出するために使用され得、このモデル系は次いで疾患状態に対抗するための試みにおいて使用され得る。従って、本発明に従うウイルスベクターは、遺伝疾患の治療および／または予防を可能にする。

本発明に従うウイルスベクターは、機能的ＲＮＡをインビトロまたはインビボで細胞に提供するためにも使用され得る。細胞における機能的ＲＮＡの発現は、例えば、細胞による特定の標的タンパク質の発現を減殺し得る。従って、機能的ＲＮＡは、それを必要とする対象において特定のタンパク質の発現を減少させるために投与され得る。機能的ＲＮＡはまた、遺伝子発現および／または細胞生理学を調節するため、例えば、細胞もしくは組織培養系を最適化するために、またはスクリーニング方法において、インビトロで細胞に投与され得る。

さらに、本発明に従うウイルスベクターは、診断方法およびスクリーニング方法における用途が見出され、その結果、細胞培養系において、あるいはトランスジェニック動物モデルにおいて、対象の核酸が一過的にまたは安定に発現される。

本発明のウイルスベクターは、当業者に明らかなように、遺伝子の標的化、クリアランス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコールにおける使用が含まれるがこれらに限定されない種々の非治療的目的のためにも使用され得る。ウイルスベクターは、安全性（伝播、毒性、免疫原性など）を評価する目的のためにも使用され得る。かかるデータは、例えば、臨床的有効性の評価の前に、通常の承認プロセスの一部として、米国食品医薬品局によって検討される。

さらなる態様として、本発明のウイルスベクターは、対象において免疫応答を生成するために使用され得る。この実施形態によれば、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むウイルスベクターが対象に投与され得、その免疫原性ポリペプチドに対する能動免疫応答が、対象によって開始される。免疫原性ポリペプチドは、本明細書中で上記したとおりである。いくつかの実施形態では、防御免疫応答が惹起される。

あるいは、ウイルスベクターは、エクスビボで細胞に投与され得、変更された細胞が対象に投与される。異種核酸を含むウイルスベクターが細胞中に導入され、その細胞が対象に投与され、ここで、免疫原をコードする異種核酸が発現され得、対象においてその免疫原に対する免疫応答を誘導し得る。特定の実施形態では、細胞は抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。

「能動免疫応答」または「能動免疫」は、「免疫原との遭遇後の宿主組織および細胞の関与」を特徴とし、「これは、抗体の合成もしくは細胞媒介反応性の発生またはそれら両方を導く、リンパ細網組織における免疫担当細胞の分化および増殖に関与する。」Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ、Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ １１７（Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ編、１９８５）。言い換えれば、能動免疫応答は、感染またはワクチン接種による免疫原への曝露後に宿主によって開始される。能動免疫は受動免疫と対比され得、受動免疫は、「能動免疫された宿主から非免疫宿主への、予め形成された物質（抗体、トランスファー因子、胸腺移植片、インターロイキン－２）の移入」を介して達成される（同文献）。

「防御」免疫応答または「防御」免疫は、本明細書中で使用される場合、疾患の発生率を予防するまたは低下させるという点で、免疫応答が対象にいくらかの利益を付与することを示す。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、疾患、特にがんまたは腫瘍の治療および／または予防において有用であり得る（例えば、がんまたは腫瘍の形成を予防することによって、がんまたは腫瘍の退縮を引き起こすことによって、および／あるいは転移を予防することによって、および／あるいは転移性小結節の増殖を予防することによって）。防御効果は、治療の利益がその任意の不利益を上回る限り、完全でも部分的でもよい。

特定の実施形態では、異種核酸を含むウイルスベクターまたは細胞は、本明細書中に記載される免疫原的有効量で投与され得る。

本発明のウイルスベクターは、１つまたは複数のがん細胞抗原（または免疫学的に類似の分子）あるいはがん細胞に対する免疫応答を生成する任意の他の免疫原を発現するウイルスベクターの投与によるがん免疫療法のためにも投与され得る。説明するために、例えば、がんを有する患者を治療するために、および／または、対象においてがんの発生を予防するために、がん細胞抗原をコードする異種核酸を含むウイルスベクターを投与することによって、対象においてがん細胞抗原に対する免疫応答が生成され得る。ウイルスベクターは、本明細書中で記載されるように、インビボでまたはエクスビボ方法を使用することによって対象に投与され得る。あるいは、がん抗原は、ウイルスカプシドの一部として発現され得るか、またはウイルスカプシドと他の方法で関連し得る（例えば、上記されるように）。

別の代替方法として、当該分野で公知の任意の他の治療的核酸（例えば、ＲＮＡｉ）またはポリペプチド（例えば、サイトカイン）が、がんを治療および／または予防するために投与され得る。

本明細書中で使用する場合、用語「がん」は、腫瘍形成がんを包含する。同様に、用語「がん性組織」は腫瘍を包含する。「がん細胞抗原」は腫瘍抗原を包含する。

用語「がん」は、当該分野で理解される意味を有し、例えば、身体の離れた部位に伝播する能力を有する組織の制御されない増殖（即ち、転移）である。例示的ながんには、メラノーマ、腺癌腫、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんならびに現在公知のまたは後に同定される任意の他のがんまたは悪性状態が含まれるが、これらに限定されない。代表的実施形態では、本発明は、腫瘍形成がんを治療および／または予防する方法を提供する。

用語「腫瘍」もまた、例えば、多細胞生物内の未分化細胞の異常な塊として、当該分野で理解される。腫瘍は悪性または良性であり得る。代表的実施形態では、本明細書中に開示される方法は、悪性腫瘍を予防および治療するために使用される。

用語「がんを治療する」、「がんの治療」および等価な用語は、がんの重症度が低下されもしくは少なくとも部分的に排除されること、ならびに／または疾患の進行が減速されるおよび／もしくは制御されること、ならびに／または疾患が安定化されることを意図する。特定の実施形態では、これらの用語は、がんの転移が予防もしくは低下もしくは少なくとも部分的に排除されること、ならびに／または転移性小結節の増殖が予防もしくは低下もしくは少なくとも部分的に排除されることを示す。

用語「がんの予防」または「がんを予防する」および等価な用語は、その方法が、がんの発症の発生率および／または重症度を、少なくとも部分的に排除または低下および／または遅延させることを意図する。代替的に述べると、対象におけるがんの発症は、尤度もしくは確率において低下され得る、および／または遅延され得る。

特定の実施形態では、細胞は、がんを有する対象から取り出され得、本発明に従うがん細胞抗原を発現するウイルスベクターと接触され得る。次いで、改変された細胞が対象に投与され、それにより、がん細胞抗原に対する免疫応答が惹起される。この方法は、インビボで充分な免疫応答を開始できない（即ち、充分な量で促進抗体を生成できない）易感染性対象と共に有利に使用され得る。

免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン、ω－インターフェロン、τ－インターフェロン、インターロイキン－１α、インターロイキン－１β、インターロイキン－２、インターロイキン－３、インターロイキン－４、インターロイキン５、インターロイキン－６、インターロイキン－７、インターロイキン－８、インターロイキン－９、インターロイキン－１０、インターロイキン－１１、インターロイキン１２、インターロイキン－１３、インターロイキン－１４、インターロイキン－１８、Ｂ細胞増殖因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子－α、腫瘍壊死因子－β、単球走化性因子タンパク質－１、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子およびリンホトキシン）によって増強され得ることが、当該分野で公知である。従って、免疫調節性サイトカイン（好ましくは、ＣＴＬ誘導性サイトカイン）が、ウイルスベクターと合わせて対象に投与され得る。

サイトカインは、当該分野で公知の任意の方法によって投与され得る。外因性サイトカインが対象に投与され得るか、あるいはサイトカインをコードする核酸が適切なベクターを使用して対象に送達され得、サイトカインがインビボで生成され得る。

［対象、医薬製剤および投与様式］
本発明に従うウイルスベクターおよびカプシドは、獣医学適用および医療適用の両方において用途を見出す。適切な対象には、トリおよび哺乳動物の両方が含まれる。用語「トリ」には、本明細書中で使用する場合、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、オウム、インコなどが含まれるがこれらに限定されない。用語「哺乳動物」には、本明細書中で使用する場合、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどが含まれるがこれらに限定されない。対象は完全に成長した対象（例えば、成人）または発生過程を経験中の対象（例えば、子供、幼児または胎児）が可能である。ヒト対象には、子宮内（例えば、胎児）、新生児、幼児、青少年、成人および老人対象が含まれる。

代表的実施形態では、対象は、本発明の方法「を必要とする」、従っていくつかの実施形態では、「それを必要とする対象」が可能である。

特定の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体中に本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドを含み、任意選択的に、他の薬剤、医薬品、安定化剤、緩衝剤、担体、補助剤、希釈剤などを含む、医薬組成物を提供する。注射について、担体は典型的には液体である。他の投与方法について、担体は固体または液体のいずれかであり得る。吸入投与について、担体は呼吸用であり、任意選択的に、固体または液体の粒状形態であり得る。

「薬学的に許容される」とは、毒性でなくその他の点でも望ましくない材料、即ち、その材料が、望ましくない生物学的影響をいずれも引き起こすことなしに対象に投与され得ることを意味する。

本発明の一態様は、核酸をインビトロで細胞に移入する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適した標準的な形質導入法に従って、適切な感染多重度で細胞中に導入され得る。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞の型および数、ならびに特定のウイルスベクターに依存して変動し得、過度の実験なしに当業者によって決定され得る。代表的実施形態では、少なくとも約１０^３感染単位、任意選択的に少なくとも約１０^５感染単位が、細胞に導入される。

ウイルスベクターを中に導入する細胞（複数でもよい）は、神経系細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特に、ニューロンなどの脳細胞ならびに星状細胞およびオリゴデンドロサイトなどのグリア細胞を含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、および角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば、腸および呼吸器上皮細胞）、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞（ｃａｒｄｉａｃ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ）、平滑筋細胞および／または横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞（ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌｓ）、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞、などを含むが、これらに限定されない、いかなる型でも可能である。代表的実施形態では、細胞はいかなる前駆細胞でも可能である。さらなる実施形態として、細胞は幹細胞（例えば、神経系幹細胞、肝幹細胞）が可能である。さらなる実施形態として、細胞はがん細胞または腫瘍細胞が可能である。さらに、細胞は、上で示されるように、いかなる起源の種由来でも可能である。

ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的で、インビトロで細胞中に導入することができる。特定の実施形態では、細胞は対象から取り出されており、ウイルスベクターがその中に導入され、次に細胞は対象中に投与されて戻される。エクスビボでの操作のために対象から細胞を取り出し、続いて対象中に導入して戻す方法は当該分野では公知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照のこと）。あるいは、組換えウイルスベクターをドナー対象由来の細胞中に、培養細胞中に、または任意の他の適切な供給源由来の細胞中に導入することができ、細胞はそれを必要とする対象（すなわち、「レシピエント」対象）に投与される。

エクスビボ核酸送達に適した細胞は上記のとおりである。対象に投与する細胞の投薬量は、対象の年齢、状態および種、細胞の型、細胞が発現する核酸、投与様式などに応じて変動する。典型的には、少なくとも約１０^２～約１０^８細胞または少なくとも約１０^３～約１０^６細胞が、１投薬当たり薬学的に許容される担体中で投与される。特定の実施形態では、ウイルスベクターで形質導入された細胞は、医薬担体と組み合わせて、治療有効量または予防有効量で対象に投与される。

いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが細胞中に導入され、その細胞が、送達されたポリペプチド（例えば、導入遺伝子として発現されたまたはカプシド中の）に対する免疫原性応答を惹起するために、対象に投与され得る。典型的には、免疫原的有効量のポリペプチドを発現する細胞の量が、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される。「免疫原的有効量」は、医薬製剤が投与される対象において、そのポリペプチドに対する能動免疫応答を誘起するのに充分な、発現されたポリペプチドの量である。特定の実施形態では、投薬量は、（上で定義した）防御免疫応答を生成するのに充分である。免疫原性ポリペプチドを投与することの利益がその任意の不利益を上回る限り、付与される保護の程度は、完全または永続的である必要はない。

いくつかの実施形態では、対象は、対照と比べた場合、例えば、別のＡＡＶウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ２．５、または表１に列挙されている任意のＡＡＶ血清型）と接触させた場合、本発明のウイルスベクターと接触させた場合に低下した免疫原性プロファイル（例えば、免疫原性応答、例えば、抗原交差反応性）を有し得る。

本発明のさらなる態様は、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを対象に投与する方法である。本発明に従ったウイルスベクターおよび／またはカプシドを、それを必要とするヒト対象または動物に投与することは、当該技術分野で公知のいかなる手段によっても可能である。任意選択的に、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、薬学的に許容される担体中治療有効用量または予防有効用量で送達することができる。

本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、免疫原性応答（例えば、ワクチンとして）を誘発するためにさらに投与することができる。典型的には、本発明の免疫原性組成物は、免疫原的有効量のウイルスベクターおよび／またはカプシドを薬学的に許容される担体と組み合わせて含む。任意選択的に、投与量は防御免疫応答（上で定義される）を生み出すのに十分である。

対象に投与されるウイルスベクターおよび／またはカプシドの投薬量は、投与様式、治療および／または予防される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクターまたはカプシド、ならびに送達される核酸などに依存し、慣用的な様式で決定され得る。治療効果を達成するための例示的な用量は、少なくとも約１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^３、１０^１４、１０^１５形質導入単位、任意選択的に約１０^８～１０^１３形質導入単位の力価である。

特定の実施形態では、１回より多い投与（例えば、２回、３回、４回またはそれ以上の投与）が、例えば、毎日、週１回、月１回、年１回などの種々の間隔の期間にわたって、所望のレベルの遺伝子発現を達成するために使用され得る。

例示的な投与様式には、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介して）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内（または胚内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋内［骨格筋、横隔膜筋および／または心筋への投与が含まれる］、皮内、胸膜内、脳内および関節内）、外用（例えば、気道表面を含む皮膚表面および粘膜表面の両方への、ならびに経皮投与）、リンパ内など、ならびに直接的な組織または臓器への注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳への）が含まれる。投与は、腫瘍への投与であり得る（例えば、腫瘍またはリンパ節の中または近傍）。任意の所与の場合における最も適切な経路は、治療および／または予防される状態の性質および重症度、ならびに使用されている特定のベクターの性質に依存する。

本発明に従った骨格筋への投与には、これに限定されないが、手足（例えば、上腕、前腕、大腿部、および／または下腿）、背部、頚部、頭部（例えば、舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰部、および／または指での骨格筋への投与が含まれる。適切な骨格筋には、小指外転筋（手における）、小指外転筋（足における）、母趾外転筋、第五中足骨外転筋、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転筋、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、肘筋、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、鳥口腕筋、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、二腹筋、背側骨間筋（手における）、背側骨間筋（足における）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、総指伸筋、短指伸筋、長指伸筋、短母指伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、手の短母指伸筋、手の長母指伸筋、撓側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手における）、短小指屈筋（足における）、短指屈筋、長指屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母指屈筋（ｆｌｅｘｏｒ ｈａｌｌｕｃｉｓ ｂｒｅｖｉｓ）、長母指屈筋（ｆｌｅｘｏｒ ｈａｌｌｕｃｉｓ ｌｏｎｇｕｓ）、短母指屈筋（ｆｌｅｘｏｒ ｐｏｌｌｉｃｉｓ ｂｒｅｖｉｓ）、長母指屈筋（ｆｌｅｘｏｒ ｐｏｌｌｉｃｉｓ ｌｏｎｇｕｓ）、前頭筋、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、薄筋、頚腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋（ｉｌｌｉａｃｕｓ）、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋、横突間、外側翼突筋、外側直筋、広背筋、口角挙筋、眼窩下筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋（ｌｏｎｇ ｒｏｔａｔｏｒｓ）、頭最長筋、頚最長筋、胸最長筋、頭長筋、頚長筋、中様筋（手における）、中様筋（足における）、咬筋、内側翼突筋、内直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋（ｏｃｃｉｐｉｔａｌｉｓ）、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第三腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頚筋、膝窩筋、後斜角筋、方回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頚半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短回旋筋（ｓｈｏｒｔ ｒｏｔａｔｏｒｓ）、ヒラメ筋、頭棘筋、頚棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頚板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸郭、甲状舌骨、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋、および小頬骨筋、ならびに当該技術分野で公知の任意の他の適切な骨格筋が含まれるが、これらに限定されない。

ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流、（任意選択的に、脚および／または腕の分離式肢灌流；例えば、Ａｒｒｕｄａら、（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８～３４６４頁を参照のこと）および／または直接筋肉内注射により骨格筋に送達することができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、四肢灌流、任意選択的に、分離式肢灌流により（例えば、静脈内または動脈内投与により）、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを有する対象）の肢（腕および／または脚）に投与される。本発明の実施形態では、本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、「流体力学」技法を用いなくても有利に投与することができる。ベクターの組織送達（例えば、筋肉へ）は、流体力学技法（例えば、静脈内／大量の静脈内投与）により増強されることが多く、この技法は脈管構造において圧力を増加させ内皮細胞バリアーを通過するベクターの能力を促進する。特定の実施形態では、本発明のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、大量注入および／または上昇した血管内圧力（例えば、正常な収縮期血圧よりも高い、例えば、正常な収縮期血圧よりも血管内圧力の５％、１０％、１５％、２０％、２５％増加より低いまたはこれに等しい）などの流体力学技法の非存在下で投与することができる。かかる方法は、浮腫、神経損傷および／またはコンパートメント症候群などの流体力学技法に関連する副作用を低下または回避し得る。

心筋への投与には、左心房、右心房、左心室、右心室および／または隔膜への投与が含まれる。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、静脈内投与、大動脈投与などの動脈内投与、直接心臓注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室中に）、および／または冠動脈潅流により心筋に送達することができる。

横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の適切な方法によっても可能である。

標的組織への送達は、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むデポーを送達することによっても達成され得る。代表的実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むデポーは、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋組織中に移植され、あるいは組織が、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むフィルムまたは他のマトリックスと接触され得る。かかる移植可能なマトリックスまたは基材は、例えば、米国特許第７，２０１，８９８号中に記載されている。

特定の実施形態では、本発明に従うウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、（例えば、筋ジストロフィー、心臓疾患［例えば、ＰＡＤまたはうっ血性心不全］を治療および／または予防するために）骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与される。

代表的実施形態では、本発明は、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋の障害を治療するおよび／または予防するために使用される。

代表的実施形態では、本発明は、ジストロフィン、ミニジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチブンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、ＩカッパＢ優性突然変異体などの抗炎症性ポリペプチド、サルコスパン（ｓａｒｃｏｓｐａｎ）、ユートロフィン、マイクロジストロフィン、ラミニン－α２、α－サルコグリカン、β－サルコグリカン、γ－サルコグリカン、δ－サルコグリカン、ＩＧＦ－１、ミオスタチンもしくはミオスタチンプロペプチドに対する抗体もしくは抗体断片、および／またはミオスタチンに対するＲＮＡｉをコードする異種核酸を含む本発明のウイルスベクターの治療または予防有効量を哺乳動物対象に投与することを含む、それを必要とする対象において筋ジストロフィーを治療するおよび／または予防する方法を提供する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、本明細書中の他の所に記載されている骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与することができる。

あるいは、本発明は、骨格筋、心筋または横隔膜筋に核酸を送達するために実行することができ、これらの筋肉は、障害（例えば、糖尿病［例えば、インスリン］、血友病［例えば、第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子］などの代謝障害、ムコ多糖障害［例えば、スライ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群、など］またはゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］もしくはファブリー病［α－ガラクトシダーゼＡ］などのリソソーム蓄積症またはポンペ病［リソソーム酸性αグルコシダーゼ］などの糖原貯蔵障害）を治療するおよび／または予防するために、血液中を正常に循環するポリペプチド（例えば、酵素）もしくは機能的ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の生成のためのまたは他の組織への全身的送達のためのプラットホームとして使用される。代謝障害を治療するおよび／または予防するための他の適切なタンパク質は、本明細書中に記載されている。目的の核酸を発現するためのプラットホームとしての筋肉の使用は、米国特許出願公開第２００２０１９２１８９号に記載されている。

従って、一態様として、本発明は、ポリペプチドをコードする異種核酸を含む本発明のウイルスベクターの治療または予防有効量を対象の骨格筋に投与することを含む、それを必要とする対象において代謝障害を治療するおよび／または予防する方法をさらに包含し、代謝障害はポリペプチドの欠乏および／または欠損の結果である。実例となる代謝障害およびポリペプチドをコードする異種核酸は本明細書中に記載されている。任意選択的に、ポリペプチドは分泌される（例えば、その天然の状態での分泌されるポリペプチドであるポリペプチド、または、例えば、当該技術分野で公知である分泌シグナル配列と作動可能に会合することにより分泌されるように操作されているポリペプチド）。本発明のいかなる特定の理論にも限定されることなく、本実施形態に従えば、骨格筋への投与により、ポリペプチドは体循環中に分泌され標的組織（複数可）に送達され得る。ウイルスベクターを骨格筋に送達する方法は本明細書中にさらに詳細に記載されている。

本発明は、全身的送達用にアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉまたは他の機能的ＲＮＡ（例えば、リボザイム）を生成するためにも実行することができる。

本発明は、例えば、筋小胞体（ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｎｄｏｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）Ｃａ^２＋－ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、血管新生因子、ホスファターゼインヒビターＩ（Ｉ－１）およびその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン抑制またはドミナントネガティブ分子、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、β２－アドレナリン受容体、β２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ＰＩ３キナーゼ、カルサルカン、β－アドレナリン受容体キナーゼインヒビター（βＡＲＫｃｔ）、プロテインホスファターゼ１のインヒビター１およびその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、短縮型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔなどのＧタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子、Ｐｉｍ－１、ＰＧＣ－１α、ＳＯＤ－１、ＳＯＤ－２、ＥＣ－ＳＯＤ、カリクレイン、ＨＩＦ、サイモシン－β４、ｍｉｒ－１、ｍｉｒ－１３３、ｍｉｒ－２０６、ｍｉｒ－２０８および／またはｍｉｒ－２６ａをコードする異種核酸を含む本発明のウイルスベクターの治療または予防有効量を哺乳動物対象に投与することを含む、それを必要とする対象において先天性心臓麻痺またはＰＡＤを治療するおよび／または予防する方法も提供する。

いくつかの実施形態では、本発明は、ポリペプチドをコードする異種核酸を含む本発明のウイルスベクターの治療または予防有効量を対象の神経系組織（例えば、神経細胞）に投与することを含む、それを必要とする対象において先天性神経変性障害（例えば、単一遺伝子神経変性障害）を治療するおよび／または予防する方法をさらに包含し、先天性神経変性障害はポリペプチドの欠乏および／または欠損の結果である。実例となる先天性神経変性障害およびポリペプチドをコードする異種核酸は本明細書中に記載されている。任意選択的に、ポリペプチドは分泌される（例えば、その天然の状態での分泌されるポリペプチドであるポリペプチド、または、例えば、当該技術分野で公知である分泌シグナル配列と作動可能に会合することにより分泌されるように操作されているポリペプチド）。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は子宮内にいる。いくつかの実施形態では、対象は、先天性（例えば、単一遺伝子）神経変性障害を有するまたはこのリスクがある。いくつかの実施形態では、対象は、ムコ多糖蓄積症または白質ジストロフィーを有するまたはこのリスクがある。

注射剤は、液体溶液または懸濁液、注射に先立つ液体中での溶解もしくは懸濁に適した固体形態として、または乳濁液として従来の形態で調製することができる。あるいは、本発明のウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを全身的ではなく局所的方法で、例えば、デポーまたは徐放性製剤で投与してもよい。さらに、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、外科的に移植可能なマトリックスに付着させて送達することができる（例えば、米国特許出願公開第２００４００１３６４５号に記載されている）。

本明細書中に開示されるウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、いかなる適切な手段によっても、任意選択的に、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドで構成されている呼吸可能粒子のエアロゾル懸濁液を投与し、それを対象が吸引することにより、対象の肺に投与することができる。呼吸可能粒子は液体または固体が可能である。ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者には公知である圧力駆動エアロゾルネブライザーまたは超音波ネブライザーを用いてなどのいかなる適切な手段によっても生成することができる。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照のこと。ウイルスベクターおよび／またカプシドを含む固体粒子のエアロゾルは同様に、製薬分野で公知の技法により、任意の固体粒子薬剤エアロゾル発生装置を用いて生成し得る。

ウイルスベクターおよびウイルスカプシドは、中枢神経系（ＣＮＳ）（例えば、脳、眼）の組織に投与することができ、本発明がない場合に観察されるよりも広い分布のウイルスベクターまたはカプシドを有利にもたらし得る。

特定の実施形態では、本発明の送達ベクターは、遺伝性障害、神経変性障害、精神障害および腫瘍を含む、ＣＮＳの疾患を治療するために投与され得る。ＣＮＳの実例となる疾患には、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー症候群、レフサム病、トゥレット病、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊髄または脳損傷による精神的外傷、テイ・サックス病、レッシュ・ナイハン症候群（Ｌｅｓｃｈ－Ｎｙａｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、癲癇、脳梗塞、気分障害（例えば、うつ病、双極性感情障害、持続性情動障害、二次気分障害）を含む精神障害、統合失調症、薬物依存性（例えば、アルコール中毒症および他の物質依存症）、ノイローゼ（例えば、不安、強迫性障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、産後うつ病）、精神病（例えば、幻覚および妄想）、痴呆、妄想性障害、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛性障害、摂食または体重障害（例えば、肥満、悪液質、拒食症、および過食症）、ＣＮＳのがんおよび腫瘍（下垂体腫瘍）、ならびに先天性神経変性障害、例えば、ムコ多糖症（ムコ多糖症Ｉ型（ハーラー症候群、ハーラー・シャイエ症候群、またはシャイエ症候群としても公知である、ＩＤＵＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ）、ムコ多糖症ＩＩ型（ハンター症候群としても公知である、ＩＤＳ、Ｉ２Ｌ酵素）、ムコ多糖症ＩＩＩ型（サンフィリポ症候群としても公知である、ＧＮＳ［Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ］、ＨＧＳＮＡＴ［ヘパラン－アルファ－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ］、ＮＡＧＬＵ［アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ］、および／またはＳＧＳＨ［スルファミダーゼ］）、ムコ多糖症ＩＶ型（モルキオ症候群としても公知である、ＧＡＬＮＳ［ガラクトサミン（Ｎ－アセチル）－６－スルファターゼ］および／またはＧＬＢ１［ベータ－ガラクトシダーゼ］）、ムコ多糖症Ｖ型（シャイエ症候群としても公知である、現在ではＩ型のサブグループ、その上ＩＤＵＡ、アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ）、ムコ多糖症ＶＩ型（マロトー・ラミー症候群としても公知である、ＡＲＳＢ、アリルスルファターゼＢ）、ムコ多糖症ＶＩＩ型（スライ症候群としても公知である、ＧＵＳＢ、ベータ－グルクロニダーゼ）、ムコ多糖症ＩＸ型（Ｎａｔｏｗｉｃｚ症候群としても公知である、ＨＹＡＬ１、ヒアルロニダーゼ）を含むがこれらに限定されない）および／または白質ジストロフィー（成人発症型常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ；ＬＭＮＢ１、ラミンＢ１）、アイカルディ・グティエール症候群（ＴＲＥＸ１、ＲＮＡＳＥＨＳＢ、ＲＮＡＳＥＨ２Ｃ、および／またはＲＮＡＳＥＨ２Ａ）、アレキサンダー病（ＦＲＡＰ、グリア線維酸性タンパク質）、ＣＡＤＡＳＩＬ（Ｎｏｔｃｈ３）、カナバン病（ＡＳＰＡ、アスパルトアシラーゼ）、ＣＡＲＡＳＩＬ（ＨＴＲＡ１、セリンプロテアーゼＨＴＲＡ１）、脳腱黄色腫症（「ＣＴＸ」、ＣＹＰ２７Ａ１、ステロール２７－水酸化酵素）小児運動失調症および脳ミエリン形成不全症（ＣＡＣＨ）／白質消失病（ＶＷＭＤ）（ｅＩＦ２Ｂ、真核生物翻訳開始因子２Ｂ）、ファブリー病（ＧＬＡ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ）、フコシドーシス（ＦＵＣＡ１、アルファ－Ｌ－フコシダーゼ）、ＧＭ１ガングリオシドーシス（ＧＬＢ１、ベータ－ガラクトシダーゼ）、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸尿症（Ｌ２ＨＤＧＨ、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸デヒドロゲナーゼ）、クラッベ病（ＧＡＬＣ、ガラクトセレブロシダーゼ）、皮質下嚢胞をもつ大脳型白質脳症（「ＭＬＣ」、ＭＬＣ１および／またはＨＥＰＡＣＡＭ）、異染性白質ジストロフィー（ＡＳＡ、アリルスルファターゼＡ）、多種スルファターゼ欠損症（「ＭＳＤ」、ＳＵＭＦ１、すべてのスルファターゼ酵素に影響を与えるスルファターゼ変更因子１）、ペリツェウス・メルツバッヘル病（「Ｘ連鎖痙性対麻痺」としても公知である、ＰＬＰ１［Ｘ連鎖プロテオリピドタンパク質１］および／またはＧＪＡ１２［ギャップ結合タンパク質１２］）、Ｐｏｌ ＩＩＩ関連白質ジストロフィー（ＰＯＬＲ３Ａおよび／またはＰＯＬＲ３Ｂ）、レフサム病（ＰＨＹＨ、［フィタノイル－ＣｏＡ水酸化酵素］および／またはＰｅｘ７［ペルオキシソーム中へのＰＨＹＨインポーター］）、サラ病（「遊離シアル酸蓄積症」としても公知である、ＳＬＣ１７Ａ５、シアル酸トランスポーター）、シェーグレン・ラルソン症候群（ＡＬＤＨ３Ａ２、アルデヒドデヒドロゲナーゼ）、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー（「ＡＬＤ」、ＡＢＣＤ１、ペルオキシソームＡＴＰアーゼ結合カセットタンパク質）、ツェルウェガー症候群スペクトル障害（ペルオキシソーム形成異常症としても公知である、ＰＥＸ１、ＰＥＸ２、ＰＥＸ３、ＰＥＸ４、ＰＥＸ５、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１１Ｂ、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ１４、ＰＥＸ１６、ＰＥＸ１９、ＰＥＸ２６））などが含まれるが、これらに限定されない。

ＣＮＳの障害には、網膜、後方路（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｔｒａｃｔ）および視神経に関与する眼科障害（例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症および他の網膜変性疾患、ぶどう膜炎、加齢性黄斑変性症、緑内障）が含まれる。

全部ではないが殆どの眼科の疾患および障害は、３つの型の指標のうち１つまたは複数と関連する：（１）血管新生、（２）炎症および（３）変性。本発明の送達ベクターは、抗血管新生因子；抗炎症性因子；細胞変性を遅延させ、細胞温存（ｓｐａｒｉｎｇ）を促進し、または細胞増殖を促進する因子、および上述の組み合わせを送達するために使用され得る。

例えば、糖尿病性網膜症は、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、眼内（例えば、硝子体中）または眼窩周囲（例えば、テノン下領域中）のいずれかに、１つまたは複数の抗血管新生因子を送達することによって治療され得る。１つまたは複数の神経栄養因子もまた、眼内（例えば、硝子体内）または眼窩周囲のいずれかに同時送達され得る。

ぶどう膜炎は炎症に関与する。１つまたは複数の抗炎症因子が、本発明の送達ベクターの眼内（例えば、硝子体または前房）投与によって投与され得る。

比較として、網膜色素変性症は、網膜変性によって特徴付けられる。代表的実施形態では、網膜色素変性症は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼内（例えば、硝子体投与）によって治療され得る。

加齢性黄斑変性症は、血管新生および網膜変性の両方に関与する。この障害は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内（例えば、硝子体）に、および／あるいは１つまたは複数の抗血管新生因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内または眼窩周囲（例えば、テノン嚢下領域中）に投与することによって、治療され得る。

緑内障は、眼圧の増加および網膜神経節細胞の喪失によって特徴付けられる。緑内障の治療には、本発明の送達ベクターを使用して興奮毒性損傷から細胞を保護する１つまたは複数の神経保護剤の投与が含まれる。かかる薬剤には、眼内に、任意選択的に硝子体内に送達される、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカインおよび神経栄養因子が含まれる。

他の実施形態では、本発明は、発作を治療するため、例えば、発作の発症、発生率および／または重症度を低下させるために使用され得る。発作の治療的処置の効力は、行動的手段（例えば、眼または口の震え、チック（ｔｉｃｋ））および／または電気記録手段（殆どの発作は、顕著な電気記録の異常を有する）によって評価され得る。従って、本発明は、経時的な複数の発作を特徴とする癲癇を治療するためにも使用され得る。

一代表的実施形態では、ソマトスタチン（またはその活性断片）は、下垂体腫瘍を治療するため本発明の送達ベクターを使用して脳に投与される。この実施形態によれば、ソマトスタチン（またはその活性断片）をコードする送達ベクターは、下垂体中への微小注入法により投与される。同様に、かかる治療は、先端巨大症（下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を治療するために使用することができる。ソマトスタチンの核酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００３０６）およびアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１６６；処理された活性ペプチドソマトスタチン－２８およびソマトスタチン－１４を含有する）は当該技術分野で公知である。

特定の実施形態では、ベクターは、例えば、米国特許第７，０７１，１７２号に記載される分泌シグナルを含むことができる。

本発明の代表的実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、ＣＮＳに（例えば、脳にまたは眼に）投与される。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉皮質、側頭葉皮質、頭頂葉皮質および前頭葉皮質、基底核、海馬ならびに扁桃体（ｐｏｒｔａａｍｙｇｄａｌａ）を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳および／または下丘中に導入され得る。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、網膜、角膜および／または視神経などの眼の異なる領域にも投与され得る。

ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、送達ベクターのより分散した投与のために、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺によって）送達され得る。ウイルスベクターおよび／またはカプシドはさらに、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与され得る。

ウイルスベクターおよび／またカプシドは、くも膜下腔内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下で）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前眼房）、および眼窩周囲（例えば、テノン嚢下領域）送達、ならびに、運動ニューロンへの後退送達を伴う筋肉内送達が含まれるが、これらに限定されない当該技術分野で公知のいかなる経路によってもＣＮＳの所望の領域（複数でもよい）に投与され得る。

いくつかの実施形態では、本発明のウイルスベクターまたは組成物は、経腸、非経口、くも膜下腔内、嚢内、脳内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼内、眼窩周囲、直腸内、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、舌下、皮下および／または経皮経路を経て送達され得る。いくつかの実施形態では、本発明のウイルスベクターまたは組成物は、頭蓋内におよび／または脊髄内に送達され得る。

特定の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、ＣＮＳ中の所望の領域または区画への直接的注射（例えば、定位注射）によって、液体製剤で投与される。他の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、所望の領域への外用適用によって、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の外用適用によるものであり得る。さらなる代替として、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、固体の持続放出製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照のこと）。

なおさらなる実施形態では、ウイルスベクターは、運動ニューロンに関与する疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など）を治療および／または予防するための逆行性輸送に使用され得る。例えば、ウイルスベクターは、筋肉組織に送達され得、そこからニューロン中に移動し得る。

本発明は、以下の番号付けされたパラグラフのいずれか一つに定義され得る。
１．新たなグリカン結合部位を導入する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＡＡＶ２．５カプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質。
２．1つまたは複数のアミノ酸置換が、
ａ）Ａ２６７Ｓ；
ｂ）ＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲ４６４～４７６ＳＸ_１ＡＧＸ_２ＳＸ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＱＸ_７Ｒ（Ｘ_１～７は任意のアミノ酸であってよい）、および
ｃ）ＥＹＳＷ５００～５０３ＥＸ_８Ｘ_９Ｗ（Ｘ_８～９は任意のアミノ酸であってよい）
を含むパラグラフ１のＡＡＶカプシドタンパク質。
３．Ｘ_１はＶもしくはその保存的置換であり；
Ｘ_２はＰもしくはその保存的置換であり；
Ｘ_３はＮもしくはその保存的置換であり；
Ｘ_４はＭもしくはその保存的置換であり；
Ｘ_５はＡもしくはその保存的置換であり；
Ｘ_６はＶもしくはその保存的置換であり；
Ｘ_７はＧもしくはその保存的置換であり；
Ｘ_８はＦもしくはその保存的置換であり；および／または
Ｘ_９はＡもしくはその保存的置換である
パラグラフ２のＡＡＶカプシドタンパク質。
４．Ｘ_１はＶであり、Ｘ_２はＰであり、Ｘ_３はＮであり、Ｘ_４はＭであり、Ｘ_５はＡであり、Ｘ_６はＶであり、Ｘ_７はＧであり、Ｘ_８はＦであり、およびＸ_９はＡであり、新しいグリカン結合部位はガラクトース結合部位である、パラグラフ３のＡＡＶカプシドタンパク質。
５．ＡＡＶ２．５カプシドタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１またはその機能的誘導体である、パラグラフ１～４のいずれか１つのＡＡＶカプシドタンパク質。
６．アミノ酸配列が、配列番号２またはその機能的誘導体である、パラグラフ１～５のいずれか１つのＡＡＶカプシドタンパク質。
７．パラグラフ１～６のいずれか１つのＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシド。
８．（ａ）パラグラフ７のウイルスカプシド、および
（ｂ）少なくとも１つの末端反復配列を含み、ウイルスカプシドによりカプシド封入されている核酸
を含むウイルスベクター。
９．薬学的に許容される担体中に、パラグラフ１～６のいずれか１つのＡＡＶカプシドタンパク質、パラグラフ７のウイルスカプシドおよび／またはパラグラフ８のウイルスベクターを含む組成物。
１０．細胞をパラグラフ８のウイルスベクターと接触させることを含む、核酸を細胞内に導入する方法。
１１．細胞が神経系組織中に存在する、パラグラフ１０の方法。
１２．細胞がニューロンまたはグリア細胞である、パラグラフ１１の方法。
１３．グリア細胞が星状細胞である、パラグラフ１２の方法。
１４．ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２．５ウイルスベクターと比べて、神経系組織の増強された形質導入を有する、パラグラフ１１の方法。
１５．細胞が対象中に存在する、パラグラフ１０～１４のいずれか１つの方法。
１６．対象がヒト対象である、パラグラフ１５の方法。
１７．対象が子供である、パラグラフ１６の方法。
１８．子供が乳児である、パラグラフ１７の方法。
１９．対象が子宮内にいる、パラグラフ１５または１６の方法。
２０．対象が、パラグラフ８のウイルスベクターに接触させた場合に、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２．５ウイルスベクターに接触させた場合と比較して低下した免疫性プロファイルを有する、パラグラフ１５～１９のいずれか１つの方法。
２１．パラグラフ８のウイルスベクターおよび／またはパラグラフ９の組成物を、治療核酸が対象の細胞において発現される条件下で対象に投与することにより、治療核酸を対象の細胞中に導入することを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を治療する方法。
２２．対象がヒトである、パラグラフ２１の方法。
２３．対象が子宮内にいる、パラグラフ２１または２２の方法。
２４．対象が、ＣＮＳ疾患もしくは障害を有するまたはそれらのリスクがある、パラグラフ２１～２３のいずれか１つの方法。
２５．対象が、先天性神経変性障害を有するまたはそのリスクがある、パラグラフ２１～２３のいずれか１つの方法。
２６．対象が、成人発症型常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、アイカルディ・グティエール症候群、アレキサンダー病、ＣＡＤＡＳＩＬ、カナバン病、ＣＡＲＡＳＩＬ、脳腱黄色腫症小児運動失調症および脳ミエリン形成不全症（ＣＡＣＨ）／白質消失病（ＶＷＭＤ）、ファブリー病、フコシドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、クラッベ病、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸尿症、皮質下嚢胞をもつ大脳型白質脳症、異染性白質ジストロフィー、多種スルファターゼ欠損症、ペリツェウス・メルツバッヘル病、Ｐｏｌ ＩＩＩ関連白質ジストロフィー、レフサム病、サラ病（遊離シアル酸蓄積症）、シェーグレン・ラルソン症候群、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、ツェルウェガー症候群スペクトル障害、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ムコ多糖症ＩＩＩ型、ムコ多糖症ＩＶ型、ムコ多糖症Ｖ型、ムコ多糖症ＶＩ型、ムコ多糖症ＶＩＩ型、ムコ多糖症ＩＸ型およびそれらの任意の組合せを有するまたはこれらのリスクがある、パラグラフ２１～２３のいずれか１つの方法。
２７．対象が、疾患または障害に伴う疼痛を有するまたはそれを有するリスクがある、パラグラフ２１または２２の方法。
２８．ウイルスベクターまたは組成物が、経腸、非経口、くも膜下腔内、嚢内、脳内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼内、眼周囲、直腸内、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、舌下、皮下および／または経皮経路を経て送達される、パラグラフ２１～２７のいずれか１つの方法。
２９．ウイルスベクターまたは組成物が、頭蓋内におよび／または脊髄内に送達される、パラグラフ２１～２７のいずれか１つの方法。

本発明を記載してきたが、以下の実施例では本発明をさらに詳細に説明することになり、実施例は説明目的でのみ本明細書中に含まれ、本発明を限定することを意図されていない。

［実施例１］：ＡＡＶ２－Ｇ９およびＡＡＶ２．５－Ｇ９のアカゲザル子宮内治療
ムコ多糖症および白質ジストロフィーなどの先天性一遺伝子性神経変性障害は、標的化遺伝子療法の有力な候補であるが、疾患の身体的および行動的徴候に先立って首尾よい介入が行われなければならない。いくつかの場合、疾患開始は発生中の初期に起こり、したがって、治療は誕生よりも前に考慮されなければならない。本研究では、超音波誘導下で、初期の第２三半期における霊長類中への子宮内頭蓋内投与に続いて、天然に存在するＡＡＶ血清型（ＡＡＶ９）の安全性、効率、および細胞トロピズムを２つの新規のキメラＡＡＶベクター（ＡＡＶ２－Ｇ９およびＡＡＶ２．５－Ｇ９（カプシドのアミノ酸配列は配列番号２に示されている））と比較する。組織は出産近くで回収し、導入遺伝子発現はエクスビボ生物発光イメージング（ＢＬＩ）およびｑＰＣＲにより評価した。ＢＬＩは、試験したすべてのベクターを用いた大脳半球および脊髄において高レベルのホタルルシフェラーゼ発現を示した。ｑＰＣＲはＢＬＩ所見と高度に相関していた。胎仔発育または成長に対する有害作用は観察されなかった。組織は正常範囲内であり、ニューロン、星状細胞、およびオリゴデンドロサイトの予想される集団が免疫組織化学により確かめられた。これらの研究は、遺伝子置換戦略を受け入れることができる先天性神経変性障害に対する標的化遺伝子療法用のキメラＡＡＶベクターの安全性、効率、およびトロピズムを実証している。

超音波組織学的にも胎仔組織回収時にも有害作用は検出されなかった。組織回収時の胎仔の身体と器官重量は、歴史的対照と比べた場合、正常範囲内であった（Ｎ＝３６）（平均４６５．１±１６．８ 歴史的対照平均４８４．１±１４．２ｇ；図１）。脳重量（平均５３．８±１．７ｇ）も、同時対照（平均５５．５±１．９ｇ）および歴史的対照（平均５６．１±０．６ｇ）に匹敵していた。

生物発光イメージング（ＢＬＩ）結果。ＡＡＶベクターを投与されたすべての胎仔において大脳半球内での高レベルのホタルルシフェラーゼ発現が観察され、ベクター投与のそばにおいて主に相関していた（図２）。ＡＡＶ９を投与された胎仔は、すべての大脳葉において２．８×１０^８ｐ／ｓおよび６．６×１０^８ｐ／ｓの全生物発光を示し、ＡＡＶ２－Ｇ９を投与された胎仔では７．９×１０^８ｐ／ｓおよび８．６×１０^９ｐ／ｓが観察された。ＡＡＶ２．５－Ｇ９を投与された胎仔は、１．４×１０^７ｐ／ｓ～５．３×１０^９ｐ／ｓを示した。個々の大脳葉での生物発光は、ＡＡＶ９と比べた場合、キメラベクター（ＡＡＶ２－Ｇ９、ＡＡＶ２．５－Ｇ９）のほうが一般的に大きかった（表３）。ホタルルシフェラーゼ発現は脊髄でも顕著であった。中枢神経系以外の組織では検出された生物発光は極めて低いか全くなかった。

ベクター体内分布結果。ベクター体内分布は、組織回収時に胎仔脳（大脳半球、小脳のすべての葉）、脊髄および末梢組織におけるホタルルシフェラーゼコピー／５０，０００細胞のｑＰＣＲにより評価された（表４）。ベクターの存在は、すべてのＡＡＶ治療脳（９／９）においておよび脊髄のすべての領域において検出された。ベクターの存在は、すべての脳および脊髄領域においてＡＡＶ２－Ｇ９およびＡＡＡＶ９と比べてＡＡＶ２．５－Ｇ９のほうが大きかった。全体で、ルシフェラーゼコピー数は個々の動物間で変化した（表４）。生物発光と比べて、脊髄において高ベクターゲノムコピーが観察された。中枢神経系以外の組織ではｑＰＣＲにより増幅されたベクターゲノムは極めて低いか全くなかった。

本研究は、ＡＡＶ９ならびに２つの新規のキメラＡＡＶベクター、ＡＡＶ２－Ｇ９およびＡＡＶ２．５－Ｇ９の形質導入効率および生体分布について検討した。胎仔脳の発生は、頭蓋内投与後正常な発生パターンに従うことが明らかにされており、本アプローチおよび研究されたＡＡＶベクターの安全性を実証している。試験されたキメラベクターは、単一部位投与で、すべての大脳葉、小脳、および脊髄において左右されない形質導入効率を有することが明らかにされた。

子宮内へのＡＡＶ投与は、マウスの発生中の眼および耳において安全であることが実証されており、これら眼および耳は、有糸分裂後であり再生しない感覚光受容体および感覚有毛細胞を含有する。視覚機能および聴覚機能の出産後評価により、ＧＦＰレポーター遺伝子をコードするＡＡＶベクターの子宮内注入が感覚閾値に対して及ぼす影響は無きに等しいことが明らかにされた。これは重要である。なぜならば、これらの感覚細胞の小集団でも死亡または機能不全は機能分析により容易に検知可能であり、したがって、有利な安全性プロファイルを実証するからである。さらなる組織学的分析により、正常な感覚細胞密度および形態が明らかにされた。

アカゲザル。動物福祉法とプロトコールの要件に従ったすべての動物手順は、実行に先立って、Ｄａｖｉｓにあるカルフォルニア大学の施設内動物管理および使用委員会の承認を受けた。動物管理（食餌、収容）に関係する行動は、カルフォルニア国立霊長類研究センター標準操作手順により実施された。先の妊娠の履歴がある正常に循環している成獣雌アカゲザル（Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ）（Ｎ＝９ 遺伝子導入；３対照）を飼育し、確立した方法に従って妊娠中と確認された。アカゲザルの妊娠期間は５５日単位で三半期、第１の三半期（０～５５日妊娠）、第２の三半期（５６～１１０日妊娠）、および第３の三半期（１１１～１６５日妊娠）に分けられる。出産は典型的には、１６５±１０日妊娠期間で起こる。

ベクター投与および胎仔モニタリング。雌親は、研究課題として血清陰性の雌を選択するためにＡＡＶ抗体についてスクリーニングした。ＡＡＶベクターは第２三半期初期（６５±５日）に超音波誘導下、脳室内アプローチを使用して投与した。ベクター上澄み（０．１ｍｌ容積中１×１０^１２ゲノムコピー）は右または左側脳室中に頭蓋内投与を経て注入された（Ｎ＝９）。すべての妊娠は、確立した手順に従って、妊娠期間中１０～１４日ごとに超音波検査的にモニターした。

組織回収。子宮切開は確立されたプロトコールに従って出産近くで実施した。すべての組織を取り除き、ホタルルシフェラーゼ発現について撮像した。胎仔脳を秤量し、次に、右および左半球（前頭葉、頭頂葉、側頭葉、後頭葉）、小脳、および中脳を切開した。脊髄の領域（頚部、胸部、腰部）も、分子的および組織学的分析のためにＢＬＩ後に評価した。すべての組織の試料は、組織学的分析のためにホルマリンに固定するまたは分子的分析のために液体窒素に瞬間凍結した。凍結試料は分析まで≦－８０℃で保存した。

ＢＬＩ。ルシフェラーゼ発現についてのＢＬＩは、Ｄ－ルシフェリン（１００ｍｇ／ｋｇ）（Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア付きのＩＶＩＳ ２００（登録商標）イメージングシステム、Ｘｅｎｏｇｅｎ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ）の静脈内注射直後に実施した。生物発光は、目的の領域をポジティブ発光の切片の周辺に置くことにより半定量的方法（フォトン／ｃｍ^２；Ｐ／Ｓ）を使用して評価した。

ベクター体内分布。ベクター体内分布を数量化するため、ゲノムＤＮＡをＧｅｎｔｒａ Ｐｕｒｅｇｅｎｅ Ｔｉｓｓｕｅキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して瞬間凍結組織から単離した。ｑＰＣＲは、ベクター存在を数量化するためにホタルルシフェラーゼ用のプライマーを用いてならびにハウスキーピング遺伝子イプシロン－グロビン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をＤＮＡ単離およびＰＣＲ反応用の内部標準として用いて実行した。リアルタイムｑＰＣＲ分析は、７９００ ＡＢＩ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＳｙｓｔｅｍおよびＴａｑＭａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して９６ウェル光学プレートで実行した。ゲノムＤＮＡ発現は、試料ＤＮＡの量を正規化するためハウスキーピング遺伝子と比べて定量化された。

免疫組織化学。小脳、ならびに右および左前頭葉、頭頂葉、側頭葉および後頭葉のホルマリン固定パラフィン切片を、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により評価して組織形態を調べた。ＩＨＣは、確立されたプロトコールに従って、ニューロン（Ｎｅｕｒｏ－Ｃｈｒｏｍ（商標）汎ニューロンマーカー、ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、星状細胞（グリア線維酸性タンパク質、Ａｂｃａｍ）、またはオリゴデンドロサイト（環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼ、Ａｂｃａｍ）のマーカーを用いて実施した。簡潔に述べると、切片はキシレンで脱パラフィンし、次に、段階的エタノールで脱水した。熱媒介抗原検索は、４℃、一晩の一次抗体とのインキュベーションに先立ってクエン酸バッファーで実施した。可視化のために二次抗体（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を室温で１時間適用した。４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール，ジヒドロクロリドを有するＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ退色防止試薬（ＤＡＰＩ；Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をマウンティング用および核を特定するために使用した（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）。

ＲＮＡインサイツハイブリダイゼーション。ルシフェラーゼレポーターＲＮＡを、製造業者により記載されるプロトコールに従ってＲＮＡｓｃｏｐｅ（登録商標）２．５ Ａｓｓａｙシステム（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｈａｙｗａｒｄ、ＣＡ）を用いて可視化した。標的プローブには、ベクター存在を可視化するルシフェラーゼ（ｌｕｃ２）およびニューロンを可視化するＦＯＸ３が含まれていた。負の対照プローブは、標的として細菌遺伝子ｄａｐＢに向けられ、正の対照プローブはハウスキーピング遺伝子Ｐｏｌｒ２ａおよびＰＰＩＢを標的にした。切片は、ＶｅｃｔａＭｏｕｎｔ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を用いてマウントされ、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ６１顕微鏡を用いて可視化された。

［実施例２］：ＡＡＶ２．５Ｇ９キメラはＡＡＶ２．５の活性を保持する
予備的分析により、ＡＡＶ２．５Ｇ９キメラが、骨格筋の形質導入、ヘパリン結合、はっきり異なる免疫学的プロファイルの獲得、低下した肝臓トロピズム、および神経学的細胞トロピズム（星状細胞などのニューロンおよびグリア細胞）などのＡＡＶ２．５キメラの様々な活性を保持することが示された。この予備的な分析は、さらなる実験により確かめられることになり、その例が下に提供されている。

＜骨格筋を形質導入する＞
ＡＡＶ２．５Ｇ９変異体は、以下の実験により骨格筋を形質導入する能力について評価される。ウイルス粒子を含有する１×１０^１０ゲノムのＢＡＬＢ／ｃマウスの腓腹筋中への注入に続いて、対照ＡＡＶ血清型ＡＡＶ２．５およびＡＡＶ２と比較された。それぞれのマウスは注入後７、１４、２８、４２、および９５日目に撮像される。この実験で使用されるウイルスは、ヘパリンＨＰＬＣまたは塩化セシウム勾配を使用して精製される。それぞれの動物から発せられる光の量は、ＣＭＩＲイメージソフトウェアを使用して計算される。それぞれの脚由来の目的の領域（ＲＯＩ）が規定され、放たれる全フォトンを計算するのに使用される。データは、６つの肢すべての平均として表されることになる。ＡＡＶ２．５Ｇ９変異体は、ＡＡＶ２．５よりも大きな筋肉形質導入に匹敵することを示しており、ＡＡＶ２．５Ｇ９とＡＡＶ２．５の両方がＡＡＶ２よりもはるかに高い筋肉形質導入を示している。

＜ヘパリン結合＞
異なる変異体がヘパリンにより精製され得る能力も、以下の実験により調べることになる。ＡＡＶ２．５Ｇ９は、ＡＡＶ２．５およびＡＡＶ２血清型と比較される。それぞれのＡＡＶ変異体の同等の粒子をヘパリンアガロース１型にアプライして、結合させておく。カラムはＰＢＳで洗浄し、続いて塩化ナトリウムに溶出させる。次に、通過画分、洗浄液および溶出液に存在する粒子の数は、ドットブロットハイブリダイゼーションを経て決定される。データは、非結合粒子（洗浄および通過）および結合粒子（溶出）の百分率として描かれることになる。先の実験（米国特許第９，０１２，２２４号）と同じく、ＡＡＶ２．５変異体はＡＡＶ２に類似するヘパリン結合プロファイルを示す。ＡＡＶ２．５Ｇ９も、ＡＡＶ２およびＡＡＶ２．５に類似するヘパリン結合プロファイルを示し、これはＧａｌ結合ポケットをＡＡＶ２．５血清型上へ移植してもこの結合活性を保持し、細胞トロピズムに関与している受容体結合も保持することを示している。

＜免疫学的プロファイル＞
他の無エンベロープウイルスに類似して、高用量のＡＡＶは繰り返し投与を阻む中和抗体を産生する。新しい血清型の到来とともに、反復投与が可能になる。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２および／またはＡＡＶ９に対する元から存在する免疫応答を回避する能力を調査するため、以下の実験による異なるＡＡＶ血清型（それぞれ１、２、および２．５、９）に前もって曝露された動物由来の血清への曝露後、キメラ２．５Ｇ９ベクターをインビトロでの導入遺伝子発現について試験する。

ＡＡＶビリオンシェルに対する頑強な免疫応答を有する動物を作製するため、ＡＡＶ血清型１、２、２．５、２．５Ｇ９、および９ベクターの４×１０^１０粒子をＣ５７ｂｌｋ６マウスの筋肉内に独立して注射する。注射から４週間後、血液が単離され血清が収集される。次に、これらの動物由来の血清を、レポーター遺伝子としてＧＦＰを発現する２９３細胞およびＡＡＶ特異的血清型ベクターを使用して中和抗体アッセイにおいて使用する。このアッセイでは、血清は順次希釈され、次いで、４℃で２時間、血清型特異的ベクターの公知の量（１×１０^８粒子）と混合させる。次に、血清とベクターのこの混合物を、アデノウイルスヘルパーウイルスの存在下、感染多重度５で２４ウェルプレートの２９３細胞に添加する。これらの条件下では、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現が、中和抗体の存在下、細胞に感染する血清型特異的ベクター能力の尺度となる。次に、中和抗体力価を、ＧＦＰ発現が対照ベクターよりも５０％またはそれよりも少ない最も高い希釈度として計算する（血清型特異的血清との予めの混合なし）。

結果は、ＡＡＶ１に前もって曝露された動物がＡＡＶ１ＧＦＰ形質導入を中和できる（例えば、１対１０００もの希釈度で）ことを示す。しかし、この血清型１型特異的中和抗体のほうが、ＡＡＶキメラ２．５（例えば、１対１００希釈度）、およびＡＡＶキメラ２．５Ｇ９を中和するのに多くのマウス血清を必要とする。さらに重要なのは、この知見は、ＡＡＶ血清型２型ビリオンシェルに前もって曝露された動物から得られたマウス血清に当てはまる。このアッセイでは、血清が１対１０，０００で希釈された後でのみ、ＡＡＶ２対照と比べた場合、５０％ＧＦＰ形質導入が観察される。しかし、キメラ２．５および２．５Ｇ９では、５０％ＧＦＰ形質導入は、このマウス血清のはるかに低い希釈度（例えば、１対１００希釈度のみ）で観察される。このキメラベクターではアミノ酸変化の０．６％がＡＡＶ２とは異なるだけなので、これらの変更は、ＡＡＶ２．５およびＡＡＶ２．５Ｇ９カプシドシェルを認識する前から存在するＡＡＶ２中和抗体の能力に重大な効果を及ぼす。２．５およびＡＡＶ２．５Ｇ９に前もって曝露され、次にＡＡＶ１、２、および２．５、２．５Ｇ９、および９に対する中和活性についてアッセイされている動物は予想通りの結果をもたらし、それぞれ最も高い希釈度は２．５および２．５Ｇ９ベクターに必要であり（例えば、１対８０００）続いてＡＡＶ２にはより低い希釈度（例えば、１対１０００）、ＡＡＶ血清型１についてはさらに低い希釈度（例えば、１対１００）が必要であった。

同様に、ＡＡＶ９に前もって曝露された動物は、１対１０００もの希釈度でＡＡＶ９ＧＦＰ形質導入を中和することができる。しかし、この血清型９特異的中和抗体は、ＡＡＶキメラ２．５Ｇ９を中和するにはもっと多くのマウス血清を必要とする（例えば、１対１００希釈度）。さらに重要なことに、この知見は、ＡＡＶ血清型９ビリオンシェルに前もって曝露された動物から得られるマウス血清に当てはまる。このアッセイでは、血清がかなり希釈された後でのみ（例えば、１対１０，０００）、ＡＡＶ９対照と比べた場合、５０％ＧＦＰ形質導入が観察される。しかし、キメラ２．５および２．５Ｇ９では、５０％ＧＦＰ形質導入は、このマウス血清のはるかに低い希釈度（例えば、１対１００希釈度のみ）で観察される。２．５およびＡＡＶ２．５Ｇ９に前もって曝露され、次にＡＡＶ１、２、および２．５、２．５Ｇ９、および９に対する中和活性についてアッセイされている動物は予想通りの結果をもたらし、それぞれ最も高い希釈度は２．５および２．５Ｇ９ベクターに必要であり（例えば、１対８０００）続いてＡＡＶ２にはより低い希釈度（例えば、１対１０００）、ＡＡＶ血清型１およびＡＡＶ９についてはさらに低い希釈度（例えば、１対１００）が必要であった。

これらの研究から予想された結論は、キメラ２．５Ｇ９を生成するためにＡＡＶ２．５に加えたアミノ酸変更は、数は少ないが、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５、およびＡＡＶ９に対して特異的な中和抗体でチャレンジした場合、このビリオンについての免疫プロファイルに著しい影響を与えるのに十分であることである。

これらの研究により、２．５Ｇ９ベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ９、またはこれらの組合せに予め曝露された個体を形質導入するのに適しており、したがって、入手可能なベクターではるかに大きな多用途性を提供することが示される。例えば、このキメラベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９またはＡＡＶ２．５に予め曝露された動物および患者での再投与が可能になると考えられる。さらに、これにより、免疫応答を著しく変更する選択されたアミノ酸をＡＡＶ２．５アミノ酸カプシド配列において変えることができることを実証している。

＜脳および肝臓の形質導入はＡＡＶ２．５Ｇ９変異体でも保持される＞
細胞型および組織トロピズムも以下の実験により確かめられる。６～８週齢雄Ｃ５７ｂ１／６マウスは、肝臓でのＡＡＶ２および２．５ベクター形質導入の効率を決定するのに利用される。マウスは、３００μＬの２．５％アバチンを使用して麻酔をかけ、ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）導入遺伝子ウイルスを保有するＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２．５Ｇ９およびＡＡＶ９ベクターの１×１０^１１粒子を２５０μＬのＰＢＳに溶解し、門脈中にゆっくりと注入する。ベクターは国際特許公開ＷＯ ０１/９２５５１に記載される二重鎖ウイルス粒子である。１週間および６週間後、それぞれのマウス由来の１００μＬの血液を、ヘパリン被覆ガラス毛管を使用して尾静脈から収集する。血清は、血液試料を４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離することにより収集される。血清を試験するまで－８０℃で貯蔵した。血清中のｈＦＩＸの発現は、標準ＥＬＩＳＡ法により試験される。ｈＦＩＸレベルが５μｇ／ｍＬである正常なヒト血清の段階希釈を標準として使用する。このアッセイを使用すれば、２．５およびＡＡＶ２．５Ｇ９ベクターがそれぞれ、ＡＡＶ２ウイルスと比べた場合、肝臓を形質導入する能力が低下していることが見出される（図１３）。この実験により、ＡＡＶ２．５Ｇ９変異体が２．５ベクターの筋肉トロピズムを示しており、ＡＡＶ２に特徴的である肝臓特異的トロピズムと比べた場合に２．５ベクターがその結果失った肝臓特異的トロピズムの喪失も保持することが実証される。

別の実験では、二重鎖ＡＡＶ２．５ベクター、二重鎖ＡＡＶ２．５Ｇ９ベクター、二重鎖ＡＡＶ９ベクター、および二重鎖ＡＡＶ２ベクターは、それぞれ緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター導入遺伝子カセットを含有しており、ＡＡＶ２について以前確立された条件下でマウス脳の皮質領域中にそれぞれ注入される。次いで、ベクターは、ニューロン特異的形質導入についてアッセイされる。ＡＡＶ１およびＡＡＶ２はニューロン形質導入に特異的であり、ＡＡＶ２．５ベクターは、非ニューロン（星状細胞などのグリア細胞）と同様にニューロンに形質導入することは十分に確立されている。

インビボでの組織特異的形質導入についてＡＡＶ２．５Ｇ９ベクターを試験する場合のこれらの実験の概要は、ＡＡＶ２．５（ＡＡＶ血清型１親由来であるとして以前報告されている）の得られた組織特異的トロピズム（例えば、筋肉、骨格または心臓）を保持するおよびＡＡＶ２．５の失われた細胞型特異的形質導入（例えば、肝臓－肝細胞－特異的形質導入）を保持することに加えて、ＡＡＶ２．５Ｇ９ベクターは、ドナー親（ＡＡＶ１）にもレシピエント親カプシド（ＡＡＶ２）にも存在せずキメラ２．５ベクターに全く特有であるＡＡＶ２．５の新しいトロピズム（非ニューロン／星状細胞）も保持していることを同様に実証する。

ヘパリン結合実験。ヘパリンアガロースへのｒＡＡＶのバッチ結合は以前記載された通りに実施する（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ、（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８巻：４４２１～４４３２頁）。簡潔に述べると、ｒＡＡＶビリオンの同等の粒子を１×ＰＢＳ中のヘパリンアガロース１型（Ｈ－６５０８、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）にアプライし、室温で１時間結合させておき、低速で２分間遠心分離し、次に上清（通過画分）を取り除く。５総容積の１ｍＭのＭｇＣｌ_２／ＰＢＳで６回洗浄し、続いて０．５ＭのＮａＣｌ（ステップ１）、１．０ＭのＮａＣｌ（ステップ２）、または１．５ＭのＮａＣｌ（ステップ３）を含有する５総容積の１ｍＭのＭｇＣｌ_２／ＰＢＳの３ステップ溶出を行った。洗浄液および３ステップ溶出液中に存在するｒＡＡＶ粒子の数は、ドットブロットハイブリダイゼーションにより決定される。

動物イメージング。粒子（ｖｇ）を含有する１×１０^１０ウイルスゲノムを、６週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの腓腹筋中に注入する。合計６肢に、２５μｌのウイルスを使用してウイルス型ごとに注入する。動物は、Ｒｏｐｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｍａｇｉｎｇ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して注入後異なる日に撮像する。簡潔に述べると、動物を麻酔し、ルシフェリン基質をＩＰ注射する。注射１０分後、動物をチャンバーに置き、次に、光発光を判定する。目的の領域あたりの全画素の平均数をＣＭＩＲ＿Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍａｓｓ．Ｇｅｎｅｒａｌ）を使用して決定し、経時的にプロットする。

［実施例３］：ＡＡＶ２．５Ｇ９は二重グリカン結合を示す
＜ＡＡＶ２．５Ｇ９はＡＡＶ２Ｇ９に類似してＨＳとＧａｌ受容体をインビトロで互換的に利用する＞
競合的阻害アッセイは、以下の実験によりＡＡＶ２．５Ｇ９変異体による二重グリカン受容体の利用の証拠を提示する。これらのアッセイは、ウイルスが末端ガラクトシル化グリカンに選択的に結合する、可溶性ヘパリンおよびＥＣＬを含む細胞表面上のウイルス結合を利用する。突然変異ＣＨＯ細胞株である、ＣＨＯ－Ｌｅｃ２は、ＣＭＰシアル酸のゴルジ体領域から細胞表面への輸送が不十分である（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ Ｓ．Ｌ．ら、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：９６～１００頁（１９８６））。したがって、ＣＨＯ－Ｌｅｃ２表面上の末端グルカン部分の大多数がガラクトースである。ＣＨＯ－Ｌｅｃ２の表面上のこの独特のガラクトシル化パターンおよび野生型ＣＨＯ－Ｐｒｏ５細胞のシアリル化は、ＡＡＶ－ガラクトース／ＡＡＶ－シアル酸相互作用を研究するのに有用であり得る（Ｓｈｅｎら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６：１０４０８～１０４１７頁（２０１２）；Ｓｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：１３５３２～１３５４０頁（２０１１））。ＨＳはＣＨＯ－Ｌｅｃ２細胞におけるＡＡＶ２形質導入を著しく阻害するがＥＣＬは阻害せず（濃灰色バー）、ＥＣＬはほぼ２つのログユニットによりＡＡＶ９形質導入を選択的に遮断する（白色バー）。これらの結果は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ９について予想される形質導入プロファイルと一致している（Ｓｈｅｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８６：１３５３２～１３５４０頁（２０１１）； Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：１４３８～１４４５頁（１９９８）；Ｂｅｌｌら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２１：２４２７～２４３５頁（２０１１））。これとは対照的に、ＡＡＶ２Ｇ９およびＡＡＶ２．５Ｇ９は、ＥＣＬとＨＳの両方の組合せでの前処置によってのみ効果的に中和される。ＥＣＬでは小さいが著しい阻害効果が観察されることがある。

ＡＡＶ２、ＡＡｖ２．５Ｇ９、ＡＡＶ９、およびＡＡＶ２Ｇ９についての形質導入プロファイルは、ＥＣＬまたはＨＳを使用してそれぞれの株の細胞表面結合を阻害することによりさらに確証される。キメラＡＡＶ株の独特の細胞表面付着は、まったくＥＣＬとＨＳの組合せのみによりＡＡＶ２．５Ｇ９の細胞表面付着が競合的に阻害されるが、どちらの試薬も単独では阻害しないことによりさらに支持される。これはＡＡＶ２Ｇ９に類似しており、ＡＡＶ２Ｇ９に類似して２つの異なるグリカンに互換的に結合するＡＡＶ２．５Ｇ９の能力を示す。

二重グリカン結合ＡＡＶ２．５Ｇ９キメラのインビトロ特徴付け。ＦＩＴＣ－ＥＣＬおよび可溶性ヘパリンを用いたＣＨＯ Ｌｅｃ２細胞上でのＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５Ｇ９、ＡＡＶ２Ｇ９、およびＡＡＶ９形質導入の阻害についてのアッセイを実施する。ＣＨＯ Ｌｅｃ２細胞は４℃で前冷却し、ＣＢＡ－ルシフェラーゼレポーター導入遺伝子カセットをパッケージングしているＡＡＶ２、Ａｖ２．５Ｇ９、ＡＡＶ２Ｇ９、またはＡＡＶ９での感染に先立ってＦＩＴＣ－ＥＣＬ、可溶性ヘパリン、または両方と一緒にインキュベートする。形質導入効率は、相対的光ユニットでのルシフェラーゼ活性として感染２４時間後に測定される。導入遺伝子発現の百分率は、対照からの相対的光ユニットに形質導入効率を正規化することにより計算される。細胞表面結合の阻害についてのアッセイは、ＦＩＴＣ－ＥＣＬおよび可溶性ヘパリンを有するＣＨＯ Ｌｅｃ２細胞上でＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５Ｇ、ＡＡＶ２Ｇ９、およびＡＡＶ９を用いて実施される。異なるＡＡＶ粒子を４℃で前冷却していた細胞に結合させ、非結合ビリオンは冷ＰＢＳでの洗浄により取り除かれる。結合しているビリオンは、ウイルスゲノム抽出後ｑＰＣＲを使用して定量化される。結合ビリオンの百分率は、結合ビリオンの数を対応する対照の数に正規化することにより決定される。

インビトロ結合および形質導入アッセイ。ＣＨＯ－Ｐｒｏ５およびＣＨＯ－Ｌｅｃ２細胞は、１０％のＦＢＳ、１００ユニット／ｍｌのペニシリン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、および２．５μｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ（Ｓｉｇｍａ）を補充したα最小イーグル培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養される。細胞は２４ウェルプレートに１×１０^５細胞／ウェルの密度で播種される。

競合的阻害アッセイ。ＣＨＯ－Ｌｅｃ２細胞は４℃で３０分間前冷却し、α最小イーグル培地において４℃で１時間１００μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ標識アメリカデイゴ（Ｅｒｙｔｈｒｉｎａ ｃｒｉｓｔａ－ｇａｌｌｉ）レクチン（ＦＩＴＣ－ＥＣＬ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と一緒にインキュベートする。あるいは、異なるウイルスカプシドを、室温で１時間、１００μｇ／ｍｌの可溶性ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）または１×ＰＢＳ（対照）と一緒にインキュベートする。次に、模擬処置またはＦＩＴＣ－ＥＣＬ－処置された細胞に、１０００ｖｇコピー／細胞のＭＯＩでＣＢＡ－ＬｕｃｔｒａｎｓｇｅｎｅカセットをパッキングするＨＳ－結合または模擬処置ＡＡＶ２、ＡＡＶ２．５Ｇ９、ＡＡＶ２Ｇ９、またはＡＡＶ９カプシドを感染させる。低温室でも１時間のインキュベーションに続いて、非結合ビリオンは、氷冷１×ＰＢＳでの３回の洗浄により取り除かれる。細胞表面結合アッセイでは結合ビリオンの数は、定量的ＰＣＲを使用して、それぞれのウェルにおけるベクターゲノムコピー数／細胞を定量化することにより測定する。形質導入アッセイでは、感染したＬｅｃ２細胞は３７℃まで移し、細胞可溶化物からのルシフェラーゼ導入遺伝子発現の定量化に先立って２４時間インキュベートする。

前述のものは本発明を説明するものであって、これを限定するものと解釈するべきではない。

Claims (29)

1. 新たなグリカン結合部位を導入する１つまたは複数のアミノ酸置換を含むＡＡＶ２．５カプシドタンパク質を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質。
2. 前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、
   ａ）Ａ２６７Ｓ；
   ｂ）ＳＱＡＧＡＳＤＩＲＤＱＳＲ４６４～４７６ＳＸ_１ＡＧＸ_２ＳＸ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６ＱＸ_７Ｒ（Ｘ_１～７は任意のアミノ酸であってよい）、および
   ｃ）ＥＹＳＷ５００～５０３ＥＸ_８Ｘ_９Ｗ（Ｘ_８～９は任意のアミノ酸であってよい）
   を含む、請求項１に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
3. Ｘ_１がＶもしくはその保存的置換であり；
   Ｘ_２がＰもしくはその保存的置換であり；
   Ｘ_３がＮもしくはその保存的置換であり；
   Ｘ_４がＭもしくはその保存的置換であり；
   Ｘ_５がＡもしくはその保存的置換であり；
   Ｘ_６がＶもしくはその保存的置換であり；
   Ｘ_７がＧもしくはその保存的置換であり；
   Ｘ_８がＦもしくはその保存的置換であり；および／または
   Ｘ_９がＡもしくはその保存的置換である
   請求項２に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
4. Ｘ_１がＶであり、Ｘ_２がＰであり、Ｘ_３がＮであり、Ｘ_４がＭであり、Ｘ_５がＡであり、Ｘ_６がＶであり、Ｘ_７がＧであり、Ｘ_８がＦであり、およびＸ_９がＡであり、前記新たなグリカン結合部位がガラクトース結合部位である、請求項３に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
5. 前記ＡＡＶ２．５カプシドタンパク質のアミノ酸配列が、配列番号１またはその機能的誘導体である、請求項１～４のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
6. 前記アミノ酸配列が、配列番号２またはその機能的誘導体である、請求項１～５のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
7. 請求項１～６のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシド。
8. （ａ）請求項７のウイルスカプシド、および
   （ｂ）少なくとも１つの末端反復配列を含み、ウイルスカプシドによりカプシド封入されている核酸
   を含むウイルスベクター。
9. 薬学的に許容される担体中に、請求項１～６のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質、請求項７に記載のウイルスカプシドおよび／または請求項８に記載のウイルスベクターを含む組成物。
10. 請求項８に記載のウイルスベクターと細胞を接触させるステップを含む、細胞に核酸を導入する方法。
11. 前記細胞が神経系組織中に存在する、請求項１０に記載の方法。
12. 前記細胞がニューロンまたはグリア細胞である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記グリア細胞が星状細胞である、請求項１２に記載の方法。
14. 前記ウイルスベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２．５ウイルスベクターと比べて、神経系組織への増強された形質導入を有する、請求項１１に記載の方法。
15. 前記細胞が対象中に存在する、請求項１０～１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記対象がヒト対象である、請求項１５に記載の方法。
17. 前記対象が子供である、請求項１６に記載の方法。
18. 前記子供が乳児である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記対象が子宮内にいる、請求項１５または１６に記載の方法。
20. 前記対象が、請求項８に記載のウイルスベクターに接触させた場合に、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ２．５ウイルスベクターに接触させた場合と比較して低下した免疫性プロファイルを有する、請求項１５～１９のいずれか１項に記載の方法。
21. 請求項８に記載のウイルスベクターおよび／または請求項９に記載の組成物を、治療核酸が対象の細胞において発現される条件下で前記対象に投与することにより、治療核酸を前記対象の細胞中に導入するステップを含む、それを必要とする対象において疾患または障害を治療する方法。
22. 前記対象がヒトである、請求項２１に記載の方法。
23. 前記対象が子宮内にいる、請求項２１または２２に記載の方法。
24. 前記対象が、中枢神経系（ＣＮＳ）疾患もしくは障害を有するまたはそれらのリスクがある、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記対象が、先天性神経変性障害を有するまたはそのリスクがある、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
26. 前記対象が、成人発症型常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、アイカルディ・グティエール症候群、アレキサンダー病、ＣＡＤＡＳＩＬ、カナバン病、ＣＡＲＡＳＩＬ、脳腱黄色腫症小児運動失調症および脳ミエリン形成不全症（ＣＡＣＨ）／白質消失病（ＶＷＭＤ）、ファブリー病、フコシドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、クラッベ病、Ｌ－２－ヒドロキシグルタル酸尿症、皮質下嚢胞をもつ大脳型白質脳症、異染性白質ジストロフィー、多種スルファターゼ欠損症、ペリツェウス・メルツバッヘル病、Ｐｏｌ ＩＩＩ関連白質ジストロフィー、レフサム病、サラ病（遊離シアル酸蓄積症）、シェーグレン・ラルソン症候群、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、ツェルウェガー症候群スペクトル障害、ムコ多糖症Ｉ型、ムコ多糖症ＩＩ型、ムコ多糖症ＩＩＩ型、ムコ多糖症ＩＶ型、ムコ多糖症Ｖ型、ムコ多糖症ＶＩ型、ムコ多糖症ＶＩＩ型、ムコ多糖症ＩＸ型およびそれらの任意の組合せを有するまたはこれらのリスクがある、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。
27. 前記対象が、疾患または障害に伴う疼痛を有するまたはそれを有するリスクがある、請求項２１または２２に記載の方法。
28. 前記ウイルスベクターまたは組成物が、経腸、非経口、くも膜下腔内、嚢内、脳内、脳室内、鼻腔内、耳内、眼内、眼周囲、直腸内、筋肉内、腹腔内、静脈内、経口、舌下、皮下および／または経皮経路を経て送達される、請求項２１～２７のいずれか１項に記載の方法。
29. 前記ウイルスベクターまたは組成物が、頭蓋内におよび／または脊髄内に送達される、請求項２１～２７のいずれか１項に記載の方法。

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