JP2021502086A - 環状ｒｎａ分子のための方法及び組成物 - Google Patents

環状ｒｎａ分子のための方法及び組成物 Download PDF

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Abstract

本発明は、環状ＲＮＡ発現用のＡＡＶ組成物及び共有結合的に閉環した環状ＲＮＡを発現させる方法に関する。

Description

［優先権の記載］
本出願は、３５ Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき、２０１７年１１月７日出願の米国仮特許出願第６２／５８２，７９６号の利益を主張し、その全内容が参照されて本明細書の一部をなすものとする。
［政府支援の記載］
本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号ＨＬ０８９２２１、ＨＬ１１２７６１、ＮＳ０９９３７１の下、政府の支援を得てなされた。政府は本発明において所定の権利を有する。
［配列リストの電子ファイリングに関する記載］
５４７０−８２９ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと題する、サイズが１８，１１０バイトである、２０１８年１１月７日に生成され、及びＥＦＳ−Ｗｅｂ経由でファイルされた、３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１に基づき提出されたＡＳＣＩＩテキストフォーマットでの配列リストが、ペーパーコピーに代えて提出される。この配列リストは、それを開示する目的で、参照されて本明細書の一部をなすものとする。
本発明は、環状ＲＮＡ発現用の組成物に関する。
環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）は、ＲＮＡが共有結合的に閉環して環を形成する非コーディングＲＮＡの１クラスである。環状ＲＮＡは、古細菌からヒトに至るまで、種々の生物において見出されている。後生動物では、環状ＲＮＡは、ダイレクトバックスプライシングとして知られているプロセスを通じて主に形成され、そのプロセスではドナー部位が、（正常なスプライシング方向とは逆に）上流アクセプター部位に対してスプライシングされる。多くの場合、ｃｉｒｃＲＮＡは、環状化されたエクソンから構成される。このように、ｃｉｒｃＲＮＡ産物と直鎖状ｍＲＮＡ産物とは互いに競合するものであると理解することができる。環状産物と直鎖状産物との比は遺伝子によって変化するが、いくつかの遺伝子の場合、ｃｉｒｃＲＮＡが主要なＲＮＡ産物である。所与のエクソンの環状化に影響を及ぼすシグナルは、周辺のイントロン配列内にコードされていると思われる。ヒトでは、逆方向反復（例えばＡｌｕエレメント等）の存在が環状化と関連することが明らかにされている；更に、ＲＮＡ結合タンパク質、例えばＱｕａｋｉｎｇ（ＱＫＩ）等は、環状化の制御に関与していることが公知である。
最近の研究では、ｃｉｒｃＲＮＡは、複数の細胞型及び組織型内で高度に発現していることが明らかにされている。しかし、大部分のｃｉｒｃＲＮＡの機能は不明である。いくつかの例外、例えばｍｉＲＮＡ−７及びＭＢＬタンパク質スポンジとしてそれぞれ十分に特徴付けられているｃｉＲＳ−７／Ｃｄｒ１ａｓ及びｃｉｒｃＭｂｌ等も存在する。いくつかの最近の研究では、内因性ｃｉｒｃＲＮＡはコーディング能力を有し得ることが示唆されたが、翻訳効率は最良でも極めて低く、その他の研究はｃｉｒｃＲＮＡとリボソームとの会合を明確なレベルで認めることができなかった。いずれにせよ、ｃｉｒｃＲＮＡは、ｃｉｒｃＲＮＡに含まれるオープンリーディングフレームの翻訳を推進するＩＲＥＳ（配列内リボソーム進入部位）配列を含有するように工学的に操作可能である。ｃｉｒｃＲＮＡの興味深い特性として、遊離末端を欠くことから、直鎖状のアイソフォームと比較してその安定性が強化されていることが挙げられる。いくつかの研究では、ｃｉｒｃＲＮＡは、直鎖状のカウンターパートよりも少なくとも２．５倍長い半減期を有することを明らかにした。本発明は、安定で持続的なＲＮＡ分子からのタンパク質の発現を可能にするｃｉｒｃＲＮＡを提供する。このような特性から、ｃｉｒｃＲＮＡは、例えば、長期遺伝子発現が重要な関心事項である遺伝子送達用途において有用となる。
本概要は、本明細書で開示される主題のいくつかの実施形態をリスト化し、また多くの場合、これらの実施形態の変形形態及び置換形態をリスト化する。本概要は、非常に多くの異なる実施形態の例示にすぎない。所与の実施形態において１つ又は複数の代表的な特性が記載されるが、それも同様に例示的である。そのような実施形態は、記載された特性（複数でもよい）を含め、又は含めずに一般的に存在し得るが、同様に、そのような特性は、本概要にリスト化されている又はされていないに関わらず、本明細書に開示される主題のその他の実施形態に適用され得る。過剰の反復を回避するため、本概要は、そのような特性のすべての可能な組み合わせをリスト化する又は示唆するわけではない。
１つの態様では、本発明は、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子であって、ａ）非コーディングＲＮＡ又は翻訳可能なｍＲＮＡに転写され得る目的遺伝子と、ｂ）前記目的遺伝子に付随するイントロンエレメントであって、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡをもたらすために細胞スプライシング機構によりバックスプライスされるイントロンエレメントと、ｃ）前記目的遺伝子から転写された翻訳可能なｍＲＮＡの翻訳を推進する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、ｄ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の内部且つ前記目的遺伝子に付随するイントロンエレメントの外部に位置するプロモーター領域と、ｅ）３’ＵＴＲの内部且つ前記目的遺伝子に付随するイントロンエレメントの外部に位置する翻訳制御領域とを含む核酸分子を提供する。
本発明は、細胞内で、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、前記共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子が転写される条件下で、前記細胞中に本発明の核酸分子、本発明のＡＡＶゲノム、本発明のＡＡＶカプシド又は粒子、及び／又は本発明の組成物を導入することを含む方法を更に提供する。
別の実施形態では、本発明は、組織特異的及び／又は細胞特異的な様式で、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、前記共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子が発現する条件下で、組織及び／又は細胞を、本発明の核酸分子、本発明のＡＡＶゲノム、本発明のＡＡＶカプシド若しくは粒子、及び／又は本発明の組成物と接触させることを含む方法を提供する。
スプライシングパターン及びレポーターアウトプットを示す概略図である。ＩＲＥＳ−ＧＦＰコンストラクトに由来するＲＮＡがＣＭＶプロモーターから発現しており、かつ、その直鎖状アイソフォームではキャップ化及びポリアデニル化されている。コントロールＩＲＥＳ−ＧＦＰ転写物は、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳを含有し、ＧＦＰがそれに後続する。 スプライシングパターン及びレポーターアウトプットを示す概略図である。ＺＫＳＣＡＮ１スプリットＧＦＰ又はＨＩＰＫ３スプリットＧＦＰコンストラクトに由来するＲＮＡがＣＭＶプロモーターから発現しており、かつ、その直鎖状アイソフォームにおいてキャップ化及びポリアデニル化されている。前駆体スプリットＧＦＰ転写物は、ヒトＺＫＳＣＡＮ１又はＨＩＰＫ３遺伝子に由来するイントロン配列により挟まれた（ｆｌａｎｋｅｄ）スプリットＧＦＰカセットを含有する。ドナー及びアクセプタースプライス部位はグレーの三角形により表されており、また点線はバックスプライスパターンを示す。ＧＦＰ断片は、ＲＮＡが環状化した際に完全長ＧＦＰが発現するように、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳにより分離されている。 神経膠芽腫の組織培養モデルにおいて、ｃｉｒｃＲＮＡが発現していることを示す図である。（２Ａ）細胞１個当たりベクターゲノム１００，０００個を用いて組換えＡＡＶ２ベクターを形質導入した後４日経過したときのＩＲＥＳ−ＧＦＰ（左側）、ＺＫＳＣＡＮ１スプリットＧＦＰ（中央）、又はＨＩＰＫ３スプリットＧＦＰ（右側）を発現するＵ８７細胞から発せられるＧＦＰ蛍光の代表的な画像。（２Ｂ）上記のように形質導入されたＵ８７細胞のライセートにおけるＧＦＰ又はローディングコントロールのアクチンを検出するウェスタンブロットであり、（２Ｃ）で定量化されている。 神経膠芽腫の組織培養モデルにおいて、ｃｉｒｃＲＮＡが発現していることを示す図である。（２Ｂ）上記のように形質導入されたＵ８７細胞のライセートにおけるＧＦＰ又はローディングコントロールのアクチンを検出するウェスタンブロットであり、（２Ｃ）で定量化されている。 神経膠芽腫の組織培養モデルにおいて、ｃｉｒｃＲＮＡが発現していることを示す図である。（２Ｄ）ＩＲＥＳ−ＧＦＰ、ＺＫＳＣＡＮ１スプリットＧＦＰ、又はＨＩＰＫ３スプリットＧＦＰコンストラクトから発現した様々なＲＮＡ種を特徴付けるためにＧＦＰに対してプローブされた全細胞ＲＮＡのノーザンブロッティング。１８Ｓ ｒＲＮＡの位置がサイズマーカーとして示されている。予想されるＲＮＡ種の模式図が表示されている。 神経膠芽腫の組織培養モデルにおいて、ｃｉｒｃＲＮＡが発現していることを示す図である。ｃｉｒｃＲＮＡバンドは、ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＲＮＡのレベルに対して相対的な数値として定量化されて示されている。 マウス心臓組織において、ｃｉｒｃＲＮＡが発現していることを示す図である。表示のコンストラクトを組換えＡＡＶ９ベクター中にパッケージングし、動物１匹当たり５．５ｅ１１個のベクターゲノムの用量でＣ５７／ＢＬ６マウスの静脈内注射し、注射４週間後に採取した。（３Ａ）心臓組織を切片化し、その後に免疫組織化学染色してＧＦＰ発現を視覚化した。 マウス心臓組織において、ｃｉｒｃＲＮＡが発現していることを示す図である。表示のコンストラクトを組換えＡＡＶ９ベクター中にパッケージングし、動物１匹当たり５．５ｅ１１個のベクターゲノムの用量でＣ５７／ＢＬ６マウスの静脈内注射し、注射４週間後に採取した。（３Ｂ）染色した心臓切片中のＧＦＰ発現レベルを平均ピクセル強度により定量化した。（３Ｃ）ＣＭＶプロモーターに特異的なプライマーを用いたｑＰＣＲによる、各コホート内のウイルスゲノムコピー数の定量化。マウスラミンＢ２遺伝子座に対して正規化されている。 マウス心臓組織において、ｃｉｒｃＲＮＡが発現していることを示す図である。表示のコンストラクトを組換えＡＡＶ９ベクター中にパッケージングし、動物１匹当たり５．５ｅ１１個のベクターゲノムの用量でＣ５７／ＢＬ６マウスの静脈内注射し、注射４週間後に採取した。（３Ｄ）ＲＮＡを心臓組織から抽出し、バックスプライス接合部をまたいで増幅するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した（概略図を参照）。これらのプライマーはＩＲＥＳ−ＧＦＰ内で生成された完全長ＧＦＰも増幅する。（３Ｅ）定量的ＲＴ−ＰＣＲを、（３Ｄ）で規定するサンプル及びプライマーと同一のサンプル及びプライマーを用いて実施した。（３Ｆ）ＲＮＡを、ＲＮＡｓｅ Ｒで処理し、次にＲＴ−ＰＣＲを（３Ｄ）と同様に実施した。 中枢神経系の組織において、ｃｉｒｃＲＮＡが発現していることを示す図である。（４Ａ）表示のコンストラクトを組換えＡＡＶ９ベクター中にパッケージングし、動物１匹当たり３．９８９ｅ１０個のベクターゲノムの用量で、Ｃ５７／ＢＬ６マウスの左脳室内に注射し、注射６週間後に採取した。ＧＦＰ発現は、脳切片を免疫組織化学的に染色することにより可視化した。皮質の代表的な画像を示す。 中枢神経系の組織において、ｃｉｒｃＲＮＡが発現していることを示す図である。（４Ｂ）（４Ａ）で示したサンプル中のＧＦＰ陽性細胞の定量。（４Ｃ）表示のコンストラクトを組換えＡＡＶ９ベクター中にパッケージングし、動物１匹当たり１ｅ１０個のベクターゲノムの用量でＣ５７／ＢＬ６マウスに硝子体内注射し、注射４週間後に採取した。切片化された網膜の代表的な画像を示す。グリーン：ＧＦＰの免疫蛍光染色。ブルー：細胞核のＤＡＰＩ染色。 中枢神経系の組織において、ｃｉｒｃＲＮＡが発現していることを示す図である。（４Ｄ）補正後の平均蛍光によるＧＦＰ発現の定量化。（４Ｅ）ＲＮＡを注射した網膜から抽出し、バックスプライス接合部をまたいで増幅するプライマーセットを用いて定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。 組織培養モデルにおけるｃｉｒｃＲＮＡ発現。組換えＡＡＶ２ベクターを、細胞１個当たり１００，０００個のベクターゲノムで形質導入した後に、ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（上部）、ＺＫＳＣＡＮ１スプリットＧＦＰ（中央）、又はＨＩＰＫ３スプリットＧＦＰ（下部）を発現するＨＥＫ２９３（左端）、Ｈｕｈ７（中央左側）、Ｕ８７（中央右側）、又はＮｅｕｒｏ２Ａ（左端）細胞からのＧＦＰ蛍光の代表的な画像。 マウス肝臓におけるｃｉｒｃＲＮＡ発現。表示のコンストラクトを組換えＡＡＶ９ベクター中にパッケージングし、動物１匹当たり５．５ｅ１１個のベクターゲノムの用量でＣ５７／ＢＬ６マウスに静脈内注射し、注射４週間後に採取した。肝組織を切片化し、その後免疫組織化学染色してＧＦＰ発現を視覚化した。 スプリット及び非スプリットｃｉｒｃＲＮＡ発現ベクターの比較。（７Ａ）前駆体スプリットＧＦＰ転写物は、ヒトＺＫＳＣＡＮ１又はＨＩＰＫ３遺伝子に由来するイントロン配列により挟まれたスプリットＧＦＰカセットを含有する。ドナー及びアクセプタースプライス部位は、グレーの三角形により表し、点線はバックスプライスパターンを示す。 スプリット及び非スプリットｃｉｒｃＲＮＡ発現ベクターの比較。（７Ｂ）組換えＡＡＶ２ベクターを、細胞１個当たり１００，０００個のベクターゲノムで形質導入した後４日経過したときのＺＫＳＣＡＮ１ ＧＦＰ（上部）、又はＺＫＳＣＡＮ１スプリットＧＦＰ（下部）を発現するＵ８７細胞からのＧＦＰ蛍光の代表的な画像。（７Ｃ）上記のように形質導入されたＵ８７細胞のライセートにおけるＧＦＰ又はローディングコントロールのアクチンを検出するウェスタンブロットであり、（７Ｄ）で定量化されている。 スプリット及び非スプリットｃｉｒｃＲＮＡ発現ベクターの比較。（７Ｃ）上記で示すように形質導入されたＵ８７細胞のライセートにおけるＧＦＰ又はローディングコントロールのアクチンを検出するウェスタンブロットであり、（７Ｄ）で定量化されている。（７Ｅ）ＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを、バックスプライス接合部をまたいで増幅するプライマーを用いて実施した。 スプリット及び非スプリットｃｉｒｃＲＮＡ発現ベクターの比較。（７Ｆ）表示のコンストラクトを組換えＡＡＶ９ベクター中にパッケージングし、動物１匹当たり５．５ｅ１１個のベクターゲノムの用量でＣ５７／ＢＬ６マウスに静脈内注射し、注射４週間後に採取した。心臓組織を切片化し、その後免疫組織化学染色してＧＦＰ発現を視覚化した。 環状ＲＮＡの形成及び翻訳をサポートする、異なるイントロンエレメントの能力を一覧表示するデータを示す図である。これらのデータは、環状ＲＮＡコーディングコンストラクトのモジュラーデザインを可能にし、補強する。ＺＫＳＣＡＮ１、ＨＩＰＫ３、ラッカーゼ２、及びＥＰＨＢ４遺伝子に由来するイントロンを用いて、ＣｉｒｃＲＮＡ生成カセットを創出した。これらのコンストラクトをｒＡＡＶ２にパッケージングし、１００，０００ｖｇ／細胞のＭＯＩでＵ８７細胞に形質導入するのに使用した。画像を４日目に取得した。 ３’（右側）イントロン配列は挿入を許容することを示す図である。ｃｉｒｃＲＮＡ生成カセットの右側イントロンに配列を挿入しても、産生されるｃｉｒｃＲＮＡの量を低下させない。（９Ａ）代表的な蛍光画像。 ３’（右側）イントロン配列は挿入を許容することを示す図である。ｃｉｒｃＲＮＡ生成カセットの右側イントロンに配列を挿入しても、産生されるｃｉｒｃＲＮＡの量を低下させない。（９Ｂ）環状ＲＮＡから翻訳されたＧＦＰ及びコントロールのアクチンに対するウェスタンブロット、データは正規化されており、また（９Ｃ）で定量化されている。 ３’（右側）イントロン配列は挿入を許容することを示す図である。ｃｉｒｃＲＮＡ生成カセットの右側イントロンに配列を挿入しても、産生されるｃｉｒｃＲＮＡの量を低下させない。（９Ｄ）ＧＦＰに対してプローブされたノーザンブロット。ｃｉｒｃＲＮＡバンドについて示す。 ３’（右側）イントロン配列は挿入を許容することを示す図である。ｃｉｒｃＲＮＡ生成カセットの右側イントロンに配列を挿入しても、産生されるｃｉｒｃＲＮＡの量を低下させない。（９Ｅ）ノーザン／環状ＲＮＡ発現の定量化。（９Ｆ）右側（３’）イントロン内に挿入を有するＡＡＶベクターゲノムによりコードされるＲＮＡ前駆体の概略図。長さ１００〜１０００塩基の挿入は、環状ＲＮＡレベル又は環状ＲＮＡからＧＦＰへの翻訳に影響を及ぼさない。１５００塩基の挿入は環状ＲＮＡの翻訳を改善するが、但し環状ＲＮＡの発現を２倍までは改善しない。 ５’（左側）イントロン配列は挿入を許容しないことを示す図である。ｃｉｒｃＲＮＡ生成カセットの左側イントロンに配列を挿入すると、生成されるｃｉｒｃＲＮＡの量は低下する。（１０Ａ）代表的な蛍光画像。 ５’（左側）イントロン配列は挿入を許容しないことを示す図である。ｃｉｒｃＲＮＡ生成カセットの左側イントロンに配列を挿入すると、生成されるｃｉｒｃＲＮＡの量は低下する。（１０Ｂ）ＧＦＰ及びアクチンに対するウェスタンブロット。（１０Ｃ）で定量化されている。 ５’（左側）イントロン配列は挿入を許容しないことを示す図である。ｃｉｒｃＲＮＡ生成カセットの左側イントロンに配列を挿入すると、生成されるｃｉｒｃＲＮＡの量は低下する。（１０Ｄ）ＧＦＰに対してプローブされたノーザンブロット。ｃｉｒｃＲＮＡバンドについて示す。 ５’（左側）イントロン配列は挿入を許容しないことを示す図である。ｃｉｒｃＲＮＡ生成カセットの左側イントロンに配列を挿入すると、生成されるｃｉｒｃＲＮＡの量は低下する。（１０Ｅ）ノーザンブロットの定量化。（１０Ｆ）左側（５’）イントロン内に挿入を有するＡＡＶベクターゲノムによりコードされるＲＮＡ前駆体の概略図。長さ１００〜１５００塩基の挿入は、環状ＲＮＡレベル又は環状ＲＮＡからＧＦＰへの翻訳を顕著に低下させる。 （Ａｌｕ反復エレメント及びスプライスアクセプター／ドナー部位は保存した状態で）左側イントロンにおいてイントロン配列を欠損させると、ｃｉｒｃＲＮＡ生成量の増加を引き起こすことを示す図である。右側イントロン内のこれらの配列が完全に欠損すると、ｃｉｒｃＲＮＡ形成不能となるが、より小さな欠損は許容される。（１１Ａ）代表的な蛍光画像。 （Ａｌｕ反復エレメント及びスプライスアクセプター／ドナー部位は保存した状態で）左側イントロンにおいてイントロン配列を欠損させると、ｃｉｒｃＲＮＡ生成量の増加を引き起こすことを示す図である。右側イントロン内のこれらの配列が完全に欠損すると、ｃｉｒｃＲＮＡ形成不能となるが、より小さな欠損は許容される。（１１Ｂ）ＧＦＰ及びアクチンに対するウェスタンブロットであり、（１１Ｃ）で定量化されている。 （Ａｌｕ反復エレメント及びスプライスアクセプター／ドナー部位は保存した状態で）左側イントロンにおいてイントロン配列を欠損させると、ｃｉｒｃＲＮＡ生成量の増加を引き起こすことを示す図である。右側イントロン内のこれらの配列が完全に欠損すると、ｃｉｒｃＲＮＡ形成不能となるが、より小さな欠損は許容される。（１１Ｄ）ＧＦＰに対してプローブされたノーザンブロット。ｃｉｒｃＲＮＡバンドについて示す。 （Ａｌｕ反復エレメント及びスプライスアクセプター／ドナー部位は保存した状態で）左側イントロンにおいてイントロン配列を欠損させると、ｃｉｒｃＲＮＡ生成量の増加を引き起こすことを示す図である。右側イントロン内のこれらの配列が完全に欠損すると、ｃｉｒｃＲＮＡ形成不能となるが、より小さな欠損は許容される。（１１Ｅ）ノーザンブロットの定量化。（１１Ｆ）概略図。 左側及び右側イントロンにおいて欠損を組み合わせると、コンストラクトのｃｉｒｃＲＮＡ生成量が＞５倍増加することを示す図である。（１２Ａ）代表的な蛍光画像。 左側及び右側イントロンにおいて欠損を組み合わせると、コンストラクトのｃｉｒｃＲＮＡ生成量が＞５倍増加することを示す図である。（１２Ｂ）ＧＦＰ及びアクチンに対するウェスタンブロットであり、（１２Ｃ）で定量化されている。 左側及び右側イントロンにおいて欠損を組み合わせると、コンストラクトのｃｉｒｃＲＮＡ産生量が＞５倍増加することを示す図である。（１２Ｄ）ＧＦＰに対してプローブされたノーザンブロット。ｃｉｒｃＲＮＡバンドについて示す。 左側及び右側イントロンにおいて欠損を組み合わせると、コンストラクトのｃｉｒｃＲＮＡ産生量が＞５倍増加することを示す図である。（１２Ｅ）ノーザンブロットの定量化。（１２Ｆ）概略図。 ＲΔフル及びＲΔミニマルの間の差異は配列固有ではないことを示す図である。全長が同一であるが、異なる配列が残存する欠損（ＲΔ１５０）も許容される。（１３Ａ）代表的な蛍光画像。 ＲΔフル及びＲΔミニマルの間の差異は配列固有ではないことを示す図である。全長が同一であるが、異なる配列が残存する欠損（ＲΔ１５０）も許容される。（１３Ｂ）ＧＦＰ及びアクチンに対するウェスタンブロットであり、（１３Ｃ）で定量化されている。（１３Ｄ）概略図。 （１４Ａ）ＨＩＰＫ３について左側及び右側イントロン配列の配列を示す図である（左側：配列番号１５；右側：配列番号１６）。太字の領域は、識別された相補性を含む反復配列を示し、また下線付きの領域は、合成イントロンエレメントをもたらす許容可能な欠損を示す。ＨＩＰＫ３：（ホメオドメイン相互作用プロテインキナーゼ３）はタンパク質コーディング遺伝子である。その関連する経路として、とりわけ細胞性老化（ＫＥＧＧ）が挙げられる。この遺伝子と関連する遺伝子オントロジー（ＧＯ）アノテーションには、含リン基を移転させるトランスフェラーゼ活性及びタンパク質チロシンキナーゼ活性が含まれる。 （１４Ｂ）ＺＫＳＣＡＮ１について左側及び右側イントロン配列の配列を示す図である（左側：配列番号１３；右側：配列番号１４）。太字の領域は、識別された相補性を含む反復配列を示し、また下線付きの領域は、合成イントロンエレメントをもたらす許容可能な欠損を示す。ＺＫＳＣＡＮ１：この遺伝子は、クルッペルＣ２Ｈ２型ジンクフィンガーファミリータンパク質のメンバーをコードする。これがコードするタンパク質は、脳内でＧＡＢＡ Ａ型受容体の発現を制御する転写因子として機能し得る。この遺伝子からの転写物は、安定且つ豊富な環状ＲＮＡを形成することが明らかにされている。この遺伝子の発現増加が胃がんで認められており、またコードされたタンパク質は、ヒト胃がん細胞の移動及び浸潤を刺激し得る。 （１４Ｃ）ＥＰＨＢ４について左側及び右側イントロン配列の配列を示す図である（左側：配列番号２９；右側：配列番号３０）。太字の領域は、識別された相補性を含む反復配列を示し、また下線付きの領域は、合成イントロンエレメントをもたらす許容可能な欠損を示す。ＥＰＨＢ４：（ＥＰＨ受容体Ｂ４）は、タンパク質コーディング遺伝子である。ＥＰＨＢ４と関連する疾患として、胎児水腫、非免疫、及び／又は心房中隔欠損症、及び胎児水腫が挙げられる。その関連する経路として、とりわけＥＲＫシグナリング及びＡｋｔシグナリングが挙げられる。この遺伝子と関連する遺伝子オントロジー（ＧＯ）アノテーションには、含リン基を移転させるトランスフェラーゼ活性、及びタンパク質チロシンキナーゼ活性が含まれる。 （１４Ｄ）ラッカーゼ２について左側及び右側イントロン配列の配列を示す図である（左側：配列番号３１；右側：配列番号３２）。太字の領域は、識別された相補性を含む反復配列を示し、また下線付きの領域は、合成イントロンエレメントをもたらす許容可能な欠損を示す。ラッカーゼ２：タンパク質コーディング遺伝子。その機能として、とりわけ銅イオン結合、フェロキシダーゼ活性、ショウジョウバエ（ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）におけるクチクラ発現及びイオン輸送が挙げられる。
ここで、本発明は、本発明の代表的な実施形態を示す添付図面を参照しながら記載される。但し、本発明は異なる形態で具体化される場合もあり、本明細書に記載する実施形態に限定されるものと解釈すべきでない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が網羅的且つ完全であり、本発明の範囲を当業者に完全に伝達するように提供される。
別途定義されなければ、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する当業者により一般的に理解される意味と同一の意味を有する。本明細書において本発明の説明で使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的に限定され、本発明を制限するようには意図されない。本明細書に記載されるすべての公開資料、特許出願、特許、及びその他の参考資料は、参考としてそのまま本明細書の一部をなすものとする。
［定義］
下記の用語は、本明細書における説明及び添付の特許請求の範囲において使用可能である：単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明示しない限り、複数形も含まれるように意図され得る。
更に、用語「約」は、本明細書で使用する場合、測定可能な数値、例えばポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の長さ、用量、時間、温度等の量等を表すとき、所定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％の変動、又は±０．１％の変動さえも含むことを意味し得る。
また本明細書で使用する場合、「及び／又は」とは、関連するリスト化されている事項のうちの１つ又は複数からなるあらゆるすべての可能な組み合わせ、並びに代替的に（「又は」）解釈されるときには組み合わせを欠くことを意味し、それらを包含する。
文脈が別途示唆しない限り、本明細書に記載する本発明の様々な特性は任意の組み合わせで使用可能であることが特に意図されている。
更に、本発明は、本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載する任意の特性又は特性の組み合わせが除外又は省略可能であることについても検討する。
更に例証するために、例えば、特定のアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及び／又はＶから選択され得ることを本明細書が示唆する場合、この表現は、アミノ酸はこれらのアミノ酸（複数でもよい）の任意のサブセット、例えば、Ａ、Ｇ、Ｉ、又はＬ；Ａ、Ｇ、Ｉ、又はＶ；Ａ又はＧ；Ｌのみ等から、あたかもそのような部分的組み合わせのそれぞれが本明細書に明示的に記載されるかのように選択され得ることも示唆する。更に、そのような表現は、特定されたアミノ酸のうちの１つ又は複数が否定され得ることも示唆する。例えば、特定の実施形態では、アミノ酸は、Ａ、Ｇ、又はＩではない；Ａではない；Ｇ又はＶではない等、あたかもそのような可能な否定のそれぞれが本明細書に明示的に記載されるかのように否定される。
本明細書で使用する場合、用語「〜を低下させる（ｒｅｄｕｃｅ）」、「〜を低下させる（ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「低下（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」、及び類似した用語は、少なくとも約２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、又はそれを超えての減少を意味し得る。
本明細書で使用する場合、用語「〜を増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、「〜を増強する（ｅｎｈａｎｃｅｓ）」、「増強（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」、及び類似した用語は、少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％、又はそれを超えての増加を示唆し得る。
用語「パルボウイルス」は、本明細書で使用する場合、自立増殖パルボウイルス及びディペンドウイルスを含むパルボウイルス科（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）を包含し得る。自立性のパルボウイルスは、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属、エリスロウイルス（Ｅｒｙｔｈｒｏｖｉｒｕｓ）属、デンソウイルス（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）属、イテラウイルス（Ｉｔｅｒａｖｉｒｕｓ）属、及びコントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）属のメンバーを含み得る。代表的な自立性のパルボウイルスとして、これらに限定されないが、マウスのマイニュートウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、ＨＩパルボウイルス、ノバリケンパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス、及び現在知られている、又は後に発見された任意のその他の自立性のパルボウイルスが挙げられる。その他の自立性のパルボウイルスは当業者にとって公知である。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。
本明細書で使用する場合、用語「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）として、これらに限定されないが、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、及び現在知られている又は後に発見された任意のその他のＡＡＶが挙げられる。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。いくつかの比較的新しいＡＡＶ血清型及びクレードが識別されている（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：６３８１−６３８８；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３−：３７５−３８３；及び表１を参照）。
ＡＡＶ及び自立性のパルボウイルスの様々な血清型のゲノム配列、並びに天然の末端反復配列（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びカプシドサブユニットの配列は、当技術分野において公知である。そのような配列は、文献又は公開データベース、例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース等に見出され得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿０４４９２７、ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、ＪＯ１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を参照；その開示は、パルボウイルス及びＡＡＶの核酸及びアミノ酸配列について教示するために、本明細書において参考として組み込まれている。例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ（１９９９）Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１ １８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３：３７５−３８３；国際公開第００／２８０６１号、同第９９／６１６０１号、同第９８／１１２４４号；及び米国特許第６，１５６，３０３号も参照；その開示は、パルボウイルス及びＡＡＶの核酸及びアミノ酸配列について教示するために、本明細書において参考として組み込まれている。表１も参照。
自立性のパルボウイルス及びＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ６９ ＆ ７０（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）により詳細に記載されている。ＡＡＶ２の結晶構造の記載についても参照されたい（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５−１０），ＡＡＶ４（Ｐａｄｒｏｎ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７−５８），ＡＡＶ５（Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ Ｖｉｒｏｌ．７８：３３６１−７１）、及びＣＰＶ（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７−５２０、及びＴｓａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１４５６−６４）。
用語「トロピズム」とは、本明細書で使用する場合、ウイルスが特定の細胞又は組織中に選好的に進入し、任意選択的に、細胞内でウイルスゲノムが有する配列（複数でもよい）の発現（例えば、転写、及び任意選択的に翻訳）、例えば組換えウイルスの場合、目的とする異種核酸（複数でもよい）の発現が後続することを意味し得る。当業者は、ウイルスゲノムに由来する異種核酸配列の転写は、例えば誘導性プロモーター、さもなければ被制御性の核酸配列に対するトランス作用因子が存在しない場合には開始されない可能性があることを認識する。ｒＡＡＶゲノムの場合、ウイルスゲノムからの遺伝子発現は、安定的に組み込まれたプロウイルスから、非組み込み型のエピソームから、並びにウイルスが細胞内で採り得る任意のその他の形態から生じ得る。
本明細書で使用する場合、「全身的なトロピズム」及び「全身的な形質導入」（及び同等の用語）は、本発明のウイルスカプシド又はウイルスベクターが、身体全体にわたる組織（例えば、脳、眼、肺、骨格筋、心臓、肝臓、腎臓、及び／又は膵臓）に対して、それぞれトロピズムを示す、又は形質導入を引き起こすことを示唆し得る。本発明の複数の実施形態では、筋肉組織（例えば、骨格筋、横隔膜筋、及び心筋）への全身的な形質導入が認められる。その他の実施形態では、骨格筋組織への全身的な形質導入が達成される。例えば、特定の実施形態では、身体全体にわたり、実質的にすべての骨格筋が形質導入される（但し、形質導入効率は筋肉型毎に変化し得る）。特別な実施形態では、四肢の筋肉、心筋、及び横隔膜筋への全身性的な形質導入が達成される。任意選択的に、ウイルスカプシド又はウイルスベクターが全身的経路（例えば、静脈内、関節内、又はリンパ内等の全身的経路）により投与され得る。
或いは、その他の実施形態では、カプシド又はウイルスベクターは、局所的に送達される（例えば、足蹠、筋肉内、皮膚内、皮下、局部的）。更なる実施形態では、カプシド又はウイルスベクターは、眼に送達される。複数の実施形態では、カプシド又はウイルスベクターは、硝子体中、網膜下、結膜下、眼球後、前房内、及び／又は上脈絡膜の経路により投与される。
別途明記しない限り、「有効な形質導入」又は「有効なトロピズム」、又は類似した用語は、好適なコントロールを参照することにより決定可能である（例えば、コントロールの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれを超えてが、それぞれ形質導入される又はトロピズムを有する）。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、骨格筋、心筋、横隔膜筋、膵臓（β−小島細胞を含む）、脾臓、胃腸管（例えば、上皮及び／又は平滑筋）、中枢神経系の細胞、肺、関節細胞、腎臓、及び／又は眼の細胞若しくは細胞層に有効に形質導入される、又はそれに対して有効なトロピズムを有する。好適なコントロールは、所望のトロピズムプロファイルを含む様々な因子に依存する。
同様に、ウイルスが「有効に形質導入を引き起こさない」又は標的組織に対して「有効なトロピズムを有さない」場合、又は類似した用語についても、好適なコントロールを参照することにより決定可能である。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、肝臓、腎臓、生殖腺、及び／又は生殖細胞に対して有効に形質導入を引き起こさない（すなわち、有効なトロピズムを有さない）。特定の実施形態では、望ましくない組織（複数でもよい）（例えば、肝臓）への形質導入は、望ましい標的組織（複数でもよい）（例えば、骨格筋、横隔膜筋、心筋、及び／又は中枢神経系の細胞）への形質導入のレベルと比較して、２０％以下、１０％以下、５％以下、１％以下、０．１％以下である。
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、別途明記しない限りペプチド及びタンパク質の両方を包含し得る。
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり得、またＲＮＡ、ＤＮＡ又はＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在する及び天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）であり得るが、代表的な実施形態では、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ配列である。
本明細書で使用する場合、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」又は「単離されたＲＮＡ」）は、天然に存在する生物又はウイルスの少なくともいくつかのその他のコンポーネント、例えば、細胞若しくはウイルスの構造的コンポーネント、又はその他のポリペプチド、又はポリヌクレオチドと付随して一般的に見出される核酸から少なくとも部分的に分離したポリヌクレオチドを意味し得る。代表的な実施形態では、「単離された」ヌクレオチドは、出発物質と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、又はそれを超えて濃縮されている。
同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然に存在する生物又はウイルスの少なくともいくつかのその他のコンポーネント、例えば、細胞若しくはウイルスの構造的コンポーネント、又はその他のポリペプチド、又はポリペプチドと付随して一般的に見出される核酸から少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味し得る。代表的な実施形態では、「単離された」ポリペプチドは、出発物質と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、又はそれを超えて濃縮されている。
本明細書で使用する場合、ウイルスベクター「を単離する」又は「を精製する」（又は文法的に同等の用語）とは、ウイルスベクターが、出発物質内の少なくともいくつかのその他のコンポーネントから少なくとも部分的に分離されることを意味し得る。代表的な実施形態では、「単離された」又は「精製された」ウイルスベクターは、出発物質と比較して、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍、又はそれを超えて濃縮されている。
「治療用タンパク質」は、細胞又は対象においてタンパク質が存在しないこと、又はその欠陥に起因する症状を、緩和、低下、予防、遅延、及び／又は安定化させることができるタンパク質であり得るが、並びに／或いはさもなければ対象に利益を付与するタンパク質である。
「治療用ＲＮＡ分子」又は「機能的ＲＮＡ分子」は、本明細書で使用する場合、当技術分野において公知であるように、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載されるような）、スプライソソーム媒介式のトランススプライシングを有効にするＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６；米国特許第６，０１３，４８７号；同第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子発現の停止に関係するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１を参照）、及び任意のその他の非翻訳ＲＮＡ、例えば「ガイド」ＲＮＡ等（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５：４９２９；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，８６９，２４８号）等であり得る。
用語「治療」、「〜を治療すること」、又は「〜の治療」（及びその文法的変形形態）とは、対象の状態の重症度が軽減され、少なくとも部分的に改善し、若しくは安定化すること、並びに／或いは少なくとも１つの臨床症状における何らかの軽減、緩和、減少、若しくは安定化が達成され、及び／又は疾患若しくは障害の進行遅延が認められることを意味し得る。
用語「〜を予防する」、「〜を予防すること」、及び「予防」（及びその文法的変形形態）は、対象における疾患、障害、及び／又は臨床症状（複数でもよい）の発現の予防及び／又は遅延、並びに／或いは本発明の方法が存在しない場合に生ずるものと比較して、疾患、障害、及び／又は臨床症状（複数でもよい）の発現の重症度の軽減を意味し得る。予防は完全であり得、例えば、疾患、障害、及び／又は臨床症状（複数でもよい）が完全に存在しない。予防は、対象における疾患、障害、及び／又は臨床症状（複数でもよい）の発生及び／又は発現の重症度が、本発明が存在しない場合に生ずるものよりも低くなるように部分的であってもよい。
「治療上有効な」量は、本明細書で使用する場合、対象に何らかの改善又は利益を提供するのに十分な量であり得る。換言すれば、「治療上有効な」量は、対象内の少なくとも１つの臨床症状において、何らかの軽減、緩和、減少、又は安定化を提供する量であり得る。当業者は、対象に何らかの利益が提供される限り、治療効果は完全である必要も治癒的である必要もないことを認識する。
「予防上有効な」量は、本明細書で使用する場合、対象における疾患、障害、及び／又は臨床症状の発現を予防し、及び／又は遅延させる、並びに／或いは対象における疾患、障害、及び／又は臨床症状の発現の重症度を、本発明の方法が存在しない場合に生ずるものと比較して低下及び／又は遅延させるのに十分な量であり得る。当業者は、予防のレベルは、何らかの利益が対象に提供される限り、完全である必要はないことを認識する。
用語「異種ヌクレオチド配列」と「異種核酸分子」とは、本明細書では交換可能に使用され、またウイルス内に天然には存在しない核酸配列を意味し得る。一般的に、異種核酸は、タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム又は目的とする非翻訳ＲＮＡ（例えば、細胞又は対象への送達用）を含む。
本明細書で使用する場合、用語「ウイルスベクター（ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」、「ウイルスベクター（ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ）」、「ベクター」、「ウイルス粒子」、「粒子」、「組換えウイルスベクター（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ）」、又は「遺伝子送達ベクター」とは、核酸送達媒体として機能することができ、ビリオン内にパッケージングされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含むウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を意味する。
或いは、いくつかの文脈では、用語「ベクター」は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡ単独を意味するのに使用され得る。
本明細書で使用する場合、用語「カプシド」又は「ウイルスカプシド」とは、カプシドタンパク質からなるカプシド構造を意味し、その場合、該カプシドは、ウイルスゲノム（例えば、ＡＡＶカプシド内のＡＡＶゲノム）等のゲノムであり得る核酸分子を含む。
「ｒＡＡＶベクターゲノム」又は「ｒＡＡＶゲノム」は、１つ又は複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）であり得る。ｒＡＡＶベクターは、ウイルスを生成するために、シスにおける末端反復（ＴＲ）（複数でもよい）のみを一般的に必要とする。その他のすべてのウイルス配列は必ずしも必要でなく、またトランスで供給され得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。一般的に、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターにより有効にパッケージングされ得る導入遺伝子のサイズを最大化させるために１つ又は複数のＴＲ配列を保持するにすぎない。構造的及び非構造的タンパク質コーディング配列はトランスで提供され得る（例えば、プラスミド等のベクターから、又は配列をパッケージング細胞に安定的に組み込むことにより）。本発明の複数の実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つの末端反復（ＴＲ）配列（例えば、ＡＡＶ−ＴＲ配列）、任意選択的に２つのＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ−ＴＲ）を含み、それらは、一般的にベクターゲノムの５’及び３’末端に位置し、且つ異種核酸配列に隣接しているが、それと連続している必要はない。ＴＲは、同一であり得る、又は相互に相違し得る。
用語「末端反復」又は「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成し、末端逆位反復配列として機能する（すなわち、所望の機能、例えば複製、ウイルスのパッケージング、組み込み、及び／又はプロウイルスレスキュー（ｐｒｏ ｖｉｒｕｓ ｒｅｓｃｕｅ）等に関与する）任意のウイルス末端反復配列又は合成配列を含み得る。ＴＲは、ＡＡＶのＴＲ又は非ＡＡＶのＴＲであり得る。例えば、非ＡＡＶのＴＲ配列、例えばその他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ−１９）の配列等、又は任意のその他の適するウイルス配列（例えば、ＳＶ４０複製の起点として機能するＳＶ４０ヘアピン）は、ＴＲとして使用可能であり、該ＴＲはトランケーション、置換、欠損、挿入、及び／又は付加により更に改変可能である。更に、ＴＲは、部分的又は完全に合成的であり得、例えばＳａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載されるような「ダブルＤ配列」等であり得る。
「ＡＡＶ末端反復配列」又は「ＡＡＶ−ＴＲ」は、これらに限定されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは１１を含む任意のＡＡＶ、又は現在知られている、又は後に発見された任意のその他のＡＡＶ（例えば、表１を参照）に由来し得る。ＡＡＶ末端反復配列は、末端反復配列が所望の機能、例えば複製、ウイルスのパッケージング、組み込み、及び／又はプロウイルスレスキュー等に関与する限り、天然の末端反復配列を有する必要はない（例えば、天然のＡＡＶ−ＴＲ配列は、挿入、欠損、トランケーション、及び／又はミスセンス突然変異により変化し得る）。
本発明のウイルスベクターは、更に、国際特許公開番号国際公開第００／２８００４号及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載されるように、「標的化された」ウイルスベクター（例えば、狙いを定めたトロピズムを有する）、及び／又は「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＴＲ及びウイルスカプシドが異なるパルボウイルスに由来する）であり得る。
本発明のウイルスベクターは、更に、国際特許公開番号国際公開第０１／９２５５１号（その開示は参考としてそのまま本明細書の一部をなすものとする）に記載されるように二連のパルボウイルス粒子であり得る。従って、いくつかの実施形態では、二本鎖（二重鎖（ｄｕｐｌｅｘ））ゲノムは、本発明のウイルスカプシド中にパッケージングされ得る。
更に、ウイルスカプシド又はゲノムエレメントは、挿入、欠損、及び／又は置換を含むその他の改変を含有し得る。
本明細書で使用する場合、用語「アミノ酸」は、任意の天然に存在するアミノ酸、その修飾された形態、及び合成アミノ酸を包含し得る。天然に存在する左旋性（Ｌ−）アミノ酸を表２に示す。
或いは、アミノ酸は、修飾されたアミノ酸残基（非限定的な例を表３に示す）であり得、及び／又は翻訳後修飾により改変された（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化、又はスルホン化（ｓｕｌｆａｔａｔｉｏｎ））アミノ酸であり得る。
更に、天然に存在しないアミノ酸は、Ｗａｎｇら（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５−４９（２００６））により記載されるように、「非天然」アミノ酸であり得る。これらの非天然アミノ酸は、目的とする分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的にリンクさせるのに有利に使用可能である。
［核酸分子並びにそれを含むウイルスカプシド及びウイルスベクター］
１つの実施形態では、本発明は、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子を提供し、該核酸分子は、ａ）非コーディングＲＮＡ又は翻訳可能なｍＲＮＡに転写され得る目的遺伝子；ｂ）前記目的遺伝子に付随する（ｆｌａｎｋ）イントロンエレメントであって、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡをもたらすために細胞スプライシング機構によりバックスプライシングされるイントロンエレメント；ｃ）前記目的遺伝子から転写された翻訳可能なｍＲＮＡの翻訳を推進する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）；ｄ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の内部且つ前記目的遺伝子に付随するイントロンエレメントの外部に位置する、プロモーター領域；及びｅ）３’ＵＴＲの内部且つ前記目的遺伝子に付随するイントロンエレメントの外部に位置する、翻訳制御領域を含む。
いくつかの実施形態では、（ｂ）のイントロンエレメントは、任意の重複数及び／又は比の任意の組み合わせの、任意の公知のイントロンエレメント（複数でもよい）からなる群より選択される。イントロンエレメントの例として、Ｒｙｂａｋ−Ｗｏｌｆ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ５８（５）：８７０−８８５（２０１５）に記載されているもの、及びｃｉｒｃＢａｓｅ環状ＲＮＡデータベース（Ｇｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ ２０：１６６６−１６７０（２０１４）；及びｗｗｗ．ｃｉｒｃｂａｓｅ．ｏｒｇ）に記載されているものが挙げられ、すべて本明細書において参考としてそのまま組み込まれている。
いくつかの実施形態では、（ｂ）のイントロンエレメントは、配列番号１３〜２４又は２９〜３２のいずれかのヌクレオチド配列を、任意の重複数及び／又は比の任意の組み合わせで含み得る、それから実質的に構成され得る、又はそれから構成され得る。
いくつかの実施形態では、（ｃ）のＩＲＥＳは、単独又は任意のこれらの組み合わせで、及び／又は任意の重複数及び／又は比の、表５に記載されているウイルスＩＲＥＳ、表６に記載されている細胞ＩＲＥＳであり得る。
いくつかの実施形態では、（ｅ）の翻訳制御領域は、当技術分野において周知のように、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）配列及び／又はｃｉｒｃＲＮＡを安定化させる構造エレメントを含み得る、それから実質的に構成され得る、及び／又はそれから構成され得る。
１つの実施形態では、本発明は、ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）がいずれか片方の側又は両方の側と隣接する、本発明の核酸分子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムを提供する。
１つの実施形態では、本発明は、本発明のＡＡＶゲノム及び／又は核酸分子を含むＡＡＶカプシド又は粒子を提供する。ＡＡＶカプシド又は粒子は、ＡＡＶベクターであり得る。
本発明は、薬学的に許容される担体中に、本発明の核酸分子、本発明のＡＡＶゲノム、及び／又は本発明のＡＡＶカプシド若しくは粒子若しくはベクターを含む組成物を更に提供する。本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される」とは、有毒でない、さもなければ忌避されない担体材料を意味し、すなわち、材料は、何らかの忌避される生物学的効果を引き起こすことなく対象に投与され得る。
本発明は、細胞内で、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、前記共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子が転写される条件下で、前記細胞中に本発明の核酸分子、本発明のＡＡＶゲノム、本発明のＡＡＶカプシド若しくは粒子、及び／又は本発明の組成物を導入するステップを含む方法を更に提供する。
別の実施形態では、本発明は、組織特異的及び／又は細胞特異的な様式で、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、前記共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子が発現する条件下で、組織及び／又は細胞を、本発明の核酸分子、本発明のＡＡＶゲノム、本発明のＡＡＶカプシド若しくは粒子、及び／又は本発明の組成物と接触させるステップを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、治療用ｍＲＮＡ分子（例えば、タンパク質をコードする治療用ＲＮＡ分子）、ＲＮＡ発現停止分子、ゲノムエレメントを標的とすることができるガイドＲＮＡ分子、ＲＮＡ転写物を標的とすることができるガイドＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、長鎖非コーディングＲＮＡ分子、アンチセンスＲＮＡ分子、又は任意のこれらの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、細胞及び／又は組織は本発明の対象由来であり、該対象は哺乳動物であり得る、またいくつかの実施形態ではヒトである。
本発明のいくつかの実施形態では、本発明の核酸分子は、直鎖状核酸分子又は環状核酸分子であり得る。核酸分子は、一本鎖又は二本鎖であり得るＲＮＡ分子又はＤＮＡ分子であり得る。核酸分子は、対象の細胞若しくは組織中、及び／又は対象中にネイキッド核酸分子として導入され得る、或いは核酸分子は、核酸コンストラクト、プラスミド、ベクター、ウイルスベクター、カプシド、又は粒子の一部分であり得る。
いくつかの実施形態では、本発明のｃｉｒｃＲＮＡ分子は、治療用ＲＮＡをコードすることができ、核酸配列からアミノ酸配列への翻訳を推進するためにＩＲＥＳエレメントは必要とされない。
いくつかの実施形態では、本発明のｃｉｒｃＲＮＡ分子は、タンパク質をコードすることができ、ＩＲＥＳエレメントは、ｃｉｒｃＲＮＡ分子中に存在し、核酸配列からアミノ酸配列への翻訳を推進することができる。
本発明の１つの態様は、例えば、療法又は有用なタンパク質のバイオ製造を目的として、哺乳動物細胞又は動物中に、本発明のｃｉｒｃＲＮＡ分子をコードするＡＡＶベクターを投与するステップを含む。本方法は、真核細胞の内部でポリペプチドをコードする所望のｃｉｒｃＲＮＡ（リボヌクレアーゼ及び塩基に対する抵抗性に起因して直鎖状ＲＮＡよりも長い半減期を有する）の産生を実現する際に有利である。
本発明の別の態様は、例えば、療法又はタンパク質若しくは非コーディングＲＮＡの製造を目的として、哺乳動物細胞又は動物中に本発明のｃｉｒｃＲＮＡ分子を投与するステップを含む。環状ＲＮＡは、そのままトランスフェクトされ得、又はＤＮＡベクターの形態でトランスフェクトされ、望み通りに細胞内で転写され得る。細胞の転写は、添加されたポリメラーゼ若しくはそれをコードする核酸を使用することができ、又は好ましくは内因性ポリメラーゼを使用することができる。真核細胞中の環状ＲＮＡの好ましい半減期は、ハイブリダイゼーション又は定量的ＲＴ−ＰＣＲ実験で測定するとき、少なくとも２０時間、３０時間であり、又は少なくとも４０時間でさえでもある。いくつかの実施形態では、本発明は、真核細胞内で少なくとも２０時間の半減期を有する、又は真核細胞の内部において直鎖状である同一のｍＲＮＡの少なくとも２倍の半減期を有する環状ＲＮＡを提供する。
１つの実施形態では、本発明は、ＩＲＥＳ、５’ＵＴＲ、目的とするコーディング配列、３’ＵＴＲ、及びポリアデニル化配列をその順序で有する、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子を提供する。翻訳増強特性及び相乗効果を有するこれらのＲＮＡエレメントの多くの異なる組み合わせが創出され得る。そのような組み合わせには、これらに限定されないが、ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ−ｐｏｌｙＡ、ＩＲＥＳ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ、ＩＲＥＳ−５’ＵＴＲ−ＯＲＦ−３’ＵＴＲ等が含まれる。
いくつかの実施形態では、本発明の環状ＲＮＡ分子は、修飾されたＲＮＡヌクレオチドを含み得る。修飾されたリボヌクレオチド塩基の非限定的な例として、５−メチルシチジン及びプソイドウリジンが挙げられる。これらのヌクレオチドは、追加の安定性及び免疫活性化に対する抵抗性を提供する。
本発明の別の実施形態は、本発明の環状ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡテンプレートをインビトロで転写することを含む。ＲＮＡ分子の両端部に位置する逆イントロン自己スプライシング配列は、追加の酵素を一切必要とせずに環状ＲＮＡの形成を促進する。
本発明の追加の実施形態は、細胞内部での環状ＲＮＡの産生を含み、該環状ＲＮＡは、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼにより細胞質内で、又は宿主ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより核内で、ＤＮＡテンプレートとは独立に転写され得る。
本発明の１つの実施形態は、環状ＲＮＡ分子によりコードされるポリペプチドが生物内で発現するように、本発明の環状ＲＮＡを、ヒト又は動物等の生物に投与することから構成される。ポリペプチドは、細胞内に存在することができ、又は分泌され得る。
本発明の別の実施形態では、環状ＲＮＡは、目的とする所望のポリペプチドを発現させるために、組織培養物中の細胞の内部にトランスフェクトされ得る。特に、環状ＲＮＡは、目的とする細胞内で細胞内タンパク質及び膜タンパク質を発現させることができる。
本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター及びターミネーターは、Ｔ７ウイルス、Ｔ６ウイルス、ＳＰ６ウイルス、Ｔ３ウイルス、又はＴ４ウイルスに由来し得る。
いくつかの実施形態では、本発明の３’ＵＴＲは、ヒトβグロビン、ヒトαグロビン、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）βグロビン、アフリカツメガエルαグロビン、ヒトプロラクチン、ヒトＧＡＰ−４３、ヒトｅＥＦ１ａ１、ヒトＴａｕ、ヒトＴＮＦα、デング熱ウイルス、ハンタウイルス小分子ｍＲＮＡ、ブニヤウイルス小分子ｍＲＮＡ、カブ黄斑モザイクウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、風疹ウイルス、タバコモザイクウイルス、ヒトＩＬ−８、ヒトアクチン、ヒトＧＡＰＤＨ、ヒトチューブリン、ハイビスカス退緑斑ウイルス、ウッドチャック肝炎ウイルスの翻訳後に制御されるエレメント、シンドビスウイルス、カブクリンクルウイルス、タバコエッチ病ウイルス、又はベネズエラウマ脳炎ウイルスに由来し得る。
いくつかの実施形態では、本発明の５’ＵＴＲは、ヒトβグロビン、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）βグロビン、ヒトαグロビン、アフリカツメガエルαグロビン、風疹ウイルス、タバコモザイクウイルス、マウスＧｔｘ、デング熱ウイルス、ヒートショックタンパク質７０ｋＤａタンパク質１Ａ、タバコアルコールデヒドロゲナーゼ、タバコエッチ病ウイルス、カブクリンクルウイルス、又はアデノウイルス三分割リーダー（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ）に由来し得る。
いくつかの実施形態では、本発明のｐｏｌｙＡ配列は、少なくとも３０ヌクレオチドの長さ又は少なくとも６０ヌクレオチドの長さである。
本発明のＩＲＥＳの非限定的な例として、本明細書の表５〜表６に記載されているもの、並びにタウラ症候群原因ウイルス（Ｔａｕｒａ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｖｉｒｕｓ）、トリアトーマウイルス、タイラー脳脊髄炎ウイルス（Ｔｈｅｉｌｅｒ’ｓ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）、シミアンウイルス４０、ヒアリ（Ｓｏｌｅｎｏｐｓｉｓ ｉｎｖｉｃｔａ）病原ウイルス１、ムギクビレアブラムシ腸管ウイルス（Ｒｈｏｐａｌｏｓｉｐｈｕｍ ｐａｄｉ ｖｉｒｕｓ）、細網内皮症ウイルス、ヒトポリオウイルス１、チャバネアオカメムシ腸管ウイルス（Ｐｌａｕｔｉａ ｓｔａｌｉ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ ｖｉｒｕｓ）、カシミール蜂ウイルス、ヒトライノウイルス２、ホマロジスカコアグラタ（Ｈｏｍａｌｏｄｉｓｃａ ｃｏａｇｕｌａｔａ）ウイルス−１、ヒト免疫不全ウイルス１型、ホマロジスカコアグラタウイルス−１、ヒメトビＰウイルス（Ｈｉｍｅｔｏｂｉ Ｐ ｖｉｒｕｓ）、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、肝炎ＧＢウイルス、口蹄疫ウイルス、ヒトエンテロウイルス７１、ウマ鼻炎ウイルス、エクトロピス・オブリクア・ピコルナ様ウイルス（Ｅｃｔｒｏｐｉｓ ｏｂｌｉｑｕａ ｐｉｃｏｒｎａ−ｌｉｋｅ ｖｉｒｕｓ）、脳心筋炎ウイルス、ドロソフィラＣウイルス、ヒトコクサッキーウイルスＢ３、クルシファー・トバモウイルス（Ｃｒｕｃｉｆｅｒ ｔｏｂａｍｏ ｖｉｒｕｓ）、クリケット麻痺ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス１、黒色女王蜂児病ウイルス（Ｂｌａｃｋ ｑｕｅｅｎ ｃｅｌｌ ｖｉｒｕｓ）、アブラムシ致死麻痺ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、急性蜂麻痺ウイルス、ハイビスカス退緑斑ウイルス、古典的ブタ熱ウイルス、ヒトＦＧＦ２、ヒトＳＦＴＰＡ１、ヒトＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１、ドロソフィラ・アンテナペディア（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ）、ヒトＡＱＰ４、ヒトＡＴ１Ｒ、ヒトＢＡＧ−１、ヒトＢＣＬ２、ヒトＢｉＰ、ヒトｃ−ＩＡＰ１、ヒトｃ−ｍｙｃ、ヒトｅＩＦ４Ｇ、マウスＮＤＳＴ４Ｌ、ヒトＬＥＦ１、マウスＨＩＦ１α、ヒトｎ．ｍｙｃ、マウスＧｔｘ、ヒトｐ２７ｋｉｐ１、ヒトＰＤＧＦ２／ｃ−ｓｉｓ、ヒトｐ５３、ヒトＰｉｍ−１、マウスＲｂｍ３、ドロソフィラ・リーパー（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｒｅａｐｅｒ）、イヌ・スキャンパー、ドロソフィラＵｂｘ、ヒトＵＮＲ、マウスＵｔｒＡ、ヒトＶＥＧＦ−Ａ、ヒトＸＩＡＰ、ドロソフィラ・ヘアレス（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｈａｉｒｌｅｓｓ）、Ｓ．セレビシエ（Ｓ． ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＦＩＩＤ、Ｓ．セレビシエＹＡＰ１、ＷＯ０１５５３６９、タバコエッチ病ウイルス、カブクリンクルウイルスに由来するＩＲＥＳ、又はｅＩＦ４Ｇに対するアプタマーが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明のＩＲＥＳは、第２のＩＲＥＳ又は第３のＩＲＥＳと組み合わせることができ、追加の開始因子の導入、リボソームサブユニット結合、リボソームシャンティング、リボソームベースペアリング、又はリボソームトランスロケーションを促進する。
いくつかの実施形態では、本発明は、環状ＲＮＡを作成する方法であって、リボヌクレオチドトリホスフェート、無機ピロホスファターゼ、ＲＮａｓｅ阻害剤、及びＲＮＡポリメラーゼを、しかるべき反応バッファー中の本発明のベクターに添加するステップと、前記ベクターからＲＮＡを転写するステップと、環状ｍＲＮＡを生成するために前記転写されたＲＮＡの自己環化を可能にするステップとを含む方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明のリボヌクレオチドは、修飾されたリボヌクレオチドｍ５Ｃ、ｍ５Ｕ、ｍ６Ａ、ｓ２Ｕ、．ＰＳＩ．、又は２’−Ｏ−メチル−Ｕを含み得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の環状ＲＮＡ及び／又はベクターを、それを必要としている対象に導入することを含む遺伝子療法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によりコードされるタンパク質を製造するために、本発明の環状ＲＮＡ及び／又はベクターを真核細胞又は哺乳動物に導入することを含む、タンパク質をバイオ製造する方法を提供する。
特別な実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、天然のＡＡＶカプシドタンパク質配列を有する、或いは天然のＡＡＶカプシドタンパク質配列と少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％、若しくは９９％類似した、又はそれと同一であるアミノ酸配列を有する。
２つ又はそれを超えてのアミノ酸配列の間の配列類似性又は同一性を決定する方法は、当技術分野において公知である。配列類似性又は同一性は、これらに限定されないが、Ｓｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２，４８２（１９８１）の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ Ｊ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５，２４４４（１９８８）の相同性探索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実施（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩのＷｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２，３８７−３９５（１９８４）により記載されるベストフィット配列プログラムを含む、当技術分野において公知の標準的な技術を使用して、又は検査により決定され得る。
別の好適なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０，（１９９０）、及びＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０，５８７３−５７８７（１９９３）に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６，４６０−４８０（１９９６）；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、任意選択的にデフォルト値に設定されるいくつかのサーチパラメーターを使用する。パラメーターは、動的な数値であり、また具体的な配列の組成、及び具体的なデータベースの組成に依存して、プログラムそのものにより規定され、その組成に対して目的とする配列が調査される；但し、数値は、感度が増加するように調整され得る。更に、追加の有用なアルゴリズムとして、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９−３４０２により報告されているように、ギャップ導入ＢＬＡＳＴが挙げられる。
本発明は、本発明のＡＡＶゲノムを含む、それから実質的になる、又はそれからなるウイルスカプシドも提供する。特定の実施形態では、ウイルスカプシドは、パルボウイルスカプシドであり、それは更に自立性のパルボウイルスカプシド又はディペンドウイルスカプシドであり得る。任意選択的に、ウイルスカプシドはＡＡＶカプシドである。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、若しくは表１に示す任意のその他のＡＡＶである、或いは１つ若しくは複数の挿入、置換、及び／又は欠損による上記カプシドのいずれかに由来する。
ウイルスカプシドは、例えば、米国特許第５，８６３，５４１号に記載されているように、「カプシド媒体」として使用可能である。改変されたウイルスカプシドによりパッケージングされ、細胞内に移入され得る分子として、異種のＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、小有機分子、金属、又はその組み合わせが挙げられる。
異種分子は、ＡＡＶ感染において天然に見出されない分子、例えば、野生型ＡＡＶゲノムによりコードされない分子として定義され得る。更に、治療上有用な分子は、分子を宿主標的細胞内に移入するために、キメラウイルスカプシドの外部と会合し得る。そのような会合分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小有機分子、金属、炭水化物、脂質、及び／又はポリペプチドを含み得る。本発明の１つの実施形態では、治療上有用な分子は、カプシドタンパク質に共有結合している（すなわち、コンジュゲートしている又は化学的にカップリングしている）。分子を共有結合的にリンクさせる方法は当業者にとって公知である。
本発明のウイルスカプシドは、新規のカプシド構造に対する抗体の増加においても、その使用を見出すことができる。更なる代替案として、外因性のアミノ酸配列が、細胞に抗原提示させるために、例えば、対象に投与して外因性のアミノ酸配列に対する免疫応答を生成するために、ウイルスカプシド内に挿入され得る。
その他の実施形態では、ウイルスカプシドは、ポリペプチドをコードする核酸又は目的とする機能的ＲＮＡを送達するウイルスベクターを投与する前に、及び／又はそれと同時に（例えば、相互に数分間又は時間以内に）、特定の細胞の部位をブロックするために投与され得る。例えば、本発明のカプシドは、特定の細胞上の細胞受容体をブロックするために送達可能であり、送達ベクターがその後又は同時に投与可能であるが、その場合ブロックされた細胞の形質導入を低下させ、その他の標的（例えば、ＣＮＳ前駆細胞及び／又は神経芽細胞）の形質導入を強化することができる。
代表的な実施形態によれば、ウイルスカプシドは、本発明によるウイルスベクターの前、及び／又はそれと同時に対象に投与され得る。更に、本発明は、本発明のウイルスカプシドを含む組成物及び医薬製剤を提供する；任意選択的に、該組成物は本発明のウイルスベクターも含む。
本発明は、本発明のウイルスカプシド及びカプシドタンパク質をコードする核酸分子（任意選択的に、単離された核酸分子）も提供する。核酸分子を含むベクター、並びに本発明の核酸分子及び／又はベクターを含む（インビボ又は培養中の）細胞が更に提供される。好適なベクターとして、非限定的にウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、ワクシニア、ポックスウイルス、バキュロウイルス等）、プラスミド、ファージ、ＹＡＣ、ＢＡＣ等が挙げられる。そのような核酸分子、ベクター、及び細胞は、本明細書に記載されるようなウイルスカプシド又はウイルスベクターを製造するために、例えば試薬（例えば、ヘルパーパッケージングコンストラクト又はパッケージング細胞）として使用可能である。
本発明によるウイルスカプシドは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して、例えばバキュロウイルスからの発現により（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８：４７７−４８８）製造可能である。
本発明のカプシドタンパク質及びカプシドは、現在知られている又は後に識別された任意の改変を含み得る。
例えば、本発明のＡＡＶカプシドタンパク質及びウイルスカプシドは、別のウイルス、任意選択的に、例えば国際特許公開番号国際公開第００／２８００４号に記載されるような別のパルボウイルス又はＡＡＶに由来するカプシドサブユニットの全部又は一部を含み得るという点においてキメラであり得る。
ウイルスカプシドは、所望の標的組織（複数でもよい）上に存在する細胞表面分子と相互作用するようにウイルスカプシドを誘導する標的配列（例えば、置換された又はウイルスカプシドに挿入された配列）を含む、標的化されたウイルスカプシドであり得る（例えば、国際特許公開番号国際公開第００／２８００４号及びＨａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：２７６８−２７７４）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：３５３−３６１（２００６）［ＡＡＶカプシドサブユニットの位置５２０及び／又は５８４におけるインテグリン受容体結合モチーフＲＧＤの挿入について記載する］；及び米国特許第７，３１４，９１２号［ＡＡＶ２カプシドサブユニットの位置４４７、５３４、５７３、及び５８７のアミノ酸の後にＲＧＤモチーフを含有するＰＩペプチドの挿入について記載する］を参照）。挿入を許容するＡＡＶカプシドサブユニット内のその他の位置は、当技術分野において公知である（例えば、Ｇｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：９６４−９７５（２００１）に記載されている位置４４９及び５８８）。
例えば、本発明のウイルスカプシドのいくつかは、目的とするほとんどの標的組織（例えば、肝臓、骨格筋、心臓、横隔膜筋、腎臓、脳、胃、腸、皮膚、内皮細胞、及び／又は肺）に対して比較的非効率的なトロピズムを有する。標的配列は、このような低形質導入ベクターに有利に組み込み可能であり、これによりウイルスカプシドに所望のトロピズム、また任意選択的に、特定の組織（複数でもよい）に対して選択的トロピズムを付与する。標的配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質、カプシド、及びベクターは、例えば、国際特許公開番号国際公開第００／２８００４号に記載されている。別の可能性として、１つ又は複数の天然に存在しないアミノ酸が、Ｗａｎｇら（Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５−４９（２００６））に記載されるように、低形質導入ベクターを所望の標的組織（複数でもよい）に再誘導する手段として、直交部位においてＡＡＶカプシドサブユニットに組み込み可能である。これらの非天然アミノ酸は、目的とする分子を、ＡＡＶカプシドタンパク質（グリカン（マンノース−樹状細胞の標的化）；特定のがん細胞型に標的を定めて送達するためのＲＧＤ、ボンベシン、又は神経ペプチド；特定の細胞表面受容体、例えば増殖因子受容体、インテグリン等に標的を定めたファージディスプレーから選択されるＲＮＡアプタマー又はペプチドを非限定的に含む）に化学的にリンクさせるのに有利に使用可能である。アミノ酸を化学的に修飾する方法は当技術分野において公知である（例えば、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１ｓｔｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６を参照）。
代表的な実施形態では、標的配列は、特定の細胞型（複数でもよい）に対して感染を生じさせるウイルスカプシド配列（例えば、自立性のなパルボウイルスカプシド配列、ＡＡＶカプシド配列、又は任意のその他のウイルスカプシド配列）であり得る。
別の非限定的な例として、得られた突然変異体に対してヘパリン結合部を付与するために、ヘパリン結合ドメイン（例えば、呼吸系発疹ウイルスヘパリン結合ドメイン）が、ＨＳ受容体（例えば、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５）とは一般的に結合しないカプシドサブユニット中に挿入又は置換され得る。
Ｂ１９は、グロボシドをその受容体として使用して一次赤血球前駆細胞に感染する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１１４）。Ｂ１９の構造は、８オングストロームの分解能で決定されている（Ａｇｂａｎｄｊｅ−ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ２０３：１０６）。グロボシドと結合するＢ１９カプシドの領域は、アミノ酸３９９〜４０６の間でマッピングされており（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４：４１９）、βバレル構造Ｅ及びＦの間でループアウトした領域である（Ｃｈｉｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：７５０２）。従って、Ｂ１９カプシドのグロボシド受容体結合ドメインは、それを含むウイルスカプシド又はウイルスベクターが赤血球細胞を標的とするように、ＡＡＶカプシドタンパク質中に置換され得る。
代表的実施形態では、外因性標的配列は、改変されたＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシド又はウイルスベクターのトロピズムを変化させるペプチドをコードする任意のアミノ酸配列であり得る。特定の実施形態では、標的ペプチド又はタンパク質は、天然に存在するものであり得る、或いは完全に又は部分的に合成的であり得る。例示的な標的化配列として、細胞表面受容体及び糖タンパク質に結合するリガンド及びその他のペプチド、例えば、ＲＧＤペプチド配列、ブラジキニン、ホルモン、ペプチド増殖因子（例えば、上皮増殖因子、神経増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子Ｉ及びＩＩ等）、サイトカイン、メラニン細胞刺激ホルモン（例えば、α、β、又はγ）、ニューロペプチド、及びエンドルフィン等、並びに細胞にその同族受容体を標的化せしめる能力を保持するその断片が挙げられる。その他の例証的なペプチド及びタンパク質として、サブスタンスＰ、ケラチノサイト増殖因子、ニューロペプチドＹ、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン２、ニワトリ卵白リゾチーム、エリスロポエチン、ゴナドリベリン、コルチコスタチン、β−エンドルフィン、ロイシンエンケファリン、リモルフィン、α−ネオエンケファリン、アンジオテンシン、ニューマジン（ｐｎｅｕｍａｄｉｎ）、血管作用性腸ペプチド、ニューロテンシン、モチリン、及びこれまでに記載されたそれらの断片が挙げられる。なおも更なる代替案として、毒素（例えば、破傷風毒素又は蛇毒、例えば、α−ブンガロトキシン等）由来の結合ドメインが、標的配列としてカプシドタンパク質中に置換され得る。なおも更なる代表的実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｃｌｅｖｅｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：Ｒ３１８（１９９７））により記載される「非古典的」インポート／エクスポートシグナルペプチド（例えば、線維芽細胞増殖因子−１及び−２、インターロイキン１、ＨＩＶ−１ Ｔａｔタンパク質、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質等）のＡＡＶカプシドタンパク質中への置換によって改変され得る。特定の細胞による取り込みを指図するペプチドモチーフも包含され、例えば、ＦＶＦＬＰペプチドモチーフは肝細胞による取り込みを惹起する。
ファージディスプレー技術、並びに当分野において公知のその他の技術が、任意の目的とする細胞型を認識するペプチドを同定するのに使用され得る。
標的配列は、受容体（例えば、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質、又はプロテオグリカン）を含む、細胞表面結合部位を標的とする任意のペプチドをコードし得る。細胞表面結合部位の例として、これらに限定されないが、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、及びその他のグリコサミノグリカン、シアル酸部分、ポリシアル酸部分、糖タンパク質、及びガングリオシド、ＭＨＣＩ糖タンパク質、膜糖タンパク質上に見出される炭水化物成分（マンノース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、フコース、ガラクトースを含む）等が挙げられる。
なおも更なる代替案として、標的配列は、細胞中への進入を標的とする別の分子と化学的にカップリングさせるために使用され得る（例えば、そのＲ基を介して化学的にカップリングされ得るアルギニン及び／又はリジン残基を含み得る）ペプチドであり得る。
本発明の上記実施形態は、本明細書に記載されるように、異種核酸を細胞又は対象に送達するために使用可能である。従って、１つの実施形態では、本発明は、核酸分子を細胞中に導入する方法であって、細胞を本発明のウイルスベクター及び／又は組成物と接触させるステップを含む方法を提供する。
核酸分子を対象に送達する方法であって、対象に本発明のウイルスベクター及び／又は本発明の組成物を投与するステップを含む方法が、本明細書に更に提示される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクター又は組成物は、対象の眼に投与される。いくつかの実施形態では、投与は、硝子体中、網膜下、結膜下、眼球後、前房内、及び／又は上脈絡膜の各経路による。
表面にポリシアル酸を有する細胞に対して選択的に形質導入を引き起こす方法であって、細胞を本発明のウイルスベクター及び／又は本発明の組成物と接触させるステップを含む方法が、本明細書において追加的に提示される。
本発明は、目的とする核酸分子を眼細胞に送達する方法であって、眼細胞又は層を本発明のウイルスベクターと接触させることを含み、該ウイルスベクターが目的とする核酸分子を含む方法を更に提供する。この方法のいくつかの実施形態では、目的とする核酸分子は、治療用タンパク質又は治療用ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、モノクロナール抗体又は融合タンパク質である。
上記方法のいくつかの実施形態では、眼細胞又は層は対象内にあり得、いくつかの実施形態では、対象はヒト対象であり得る。
本発明は、対象における眼科障害又は欠陥を治療する方法であって、対象に本発明のウイルスベクターを投与するステップを含み、該ウイルスベクターが眼科障害又は欠陥を治療するのに有効な治療用タンパク質又は治療用ＲＮＡをコードする核酸分子を含む方法を更に提供する。この方法のいくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、硝子体中、網膜下、結膜下、眼球後、前房内、及び／又は上脈絡膜の各経路により投与される。いくつかの実施形態では、眼科障害又は欠陥は、網膜色素変性、黄斑変性、又はレーバー先天性黒内障、色覚障害、Ｘ連鎖性網膜分離症、視神経炎、コロイデレミア、視神経萎縮症、網膜錐状体ジストロフィー、網膜症、網膜芽細胞腫、緑内障、バルデ・ビードル症候群、又は色盲である。
目的とする核酸分子（ＮＯＩ）を中枢神経系前駆細胞及び／又は神経芽細胞に送達する方法であって、前駆細胞及び／又は神経芽細胞をアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型４（ＡＡＶ４）カプシドタンパク質を含むウイルスベクターと接触させることを含み、該カプシドタンパク質がＫ４９２、Ｋ５０３、及びＮ５８５において突然変異を含み、並びに該ウイルスベクターが目的とする核酸分子を含む方法も本明細書において提示される。この方法のいくつかの実施形態では、目的とする核酸分子は、治療用タンパク質又は治療用ＲＮＡをコードすることができ、またいくつかの実施形態では、中枢神経系前駆細胞及び／又は神経芽細胞は、対象内にあり得る。
本発明の更なる実施形態では、対象における神経障害又は欠陥を治療する方法であって、本発明のウイルスベクター及び／又は本発明の組成物を対象に投与することを含み、該ウイルスベクターが神経障害又は欠陥の治療において有効な治療用タンパク質又は治療用ＲＮＡをコードする核酸分子を含む方法が提供される。この方法のいくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃａｌ）、大槽内、実質内、頭蓋骨内、及び／又は髄腔内の各経路により投与される。この方法のいくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。
本発明は、本発明の核酸分子を含むウイルスベクターも包含する。特別な実施形態では、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター（例えば、パルボウイルスカプシド及び／又はベクターゲノムを含む）、例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶカプシド及び／又はベクターゲノムを含む）である。
例えば、代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、（ａ）ウイルスカプシド（例えば、ＡＡＶカプシド）；及び（ｂ）末端反復配列（例えば、ＡＡＶ−ＴＲ）を含む核酸を含み、その場合、該末端反復配列を含む核酸は、改変されたウイルスカプシドによりカプシド封入されている。核酸は、２つの末端反復配列（例えば、２つのＡＡＶ−ＴＲ）を任意選択的に含むことができる。
代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、目的とするタンパク質又は機能的ＲＮＡをコードする異種核酸分子を含む組換えウイルスベクターである。組換えウイルスベクターは、以下においてより詳細に記載されている。
［ウイルスベクターを生成する方法］
本発明は、本発明のウイルスベクターを生成する方法を更に提供する。１つの代表的実施形態では、本発明は、ウイルスベクターを生成する方法を提供し、この方法は、細胞に対して、（ａ）少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ−ＴＲ配列）を含む核酸テンプレート、並びに（ｂ）核酸テンプレートの複製及びＡＡＶカプシド中への封入（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）に十分なＡＡＶ配列（例えば、本発明のＡＡＶカプシドをコードするＡＡＶｒｅｐ配列及びＡＡＶｃａｐ配列）を提供するステップを含む。任意選択的に、核酸テンプレートは、少なくとも１つの異種核酸配列を更に含む。特定の実施形態では、核酸テンプレートは２つのＡＡＶ−ＩＴＲ配列を含み、これらは、（存在する場合）異種核酸配列に対して５’側及び３’側に位置するが、異種核酸配列と直接隣接している必要はない。
核酸テンプレート並びにＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ配列は、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた核酸テンプレートを含むウイルスベクターが細胞中で生成されるような条件下で提供される。本方法は、細胞からウイルスベクターを収集するステップを更に含み得る。ウイルスベクターは、培地から及び／又は細胞を溶解することによって収集され得る。
細胞は、ＡＡＶウイルス複製を許容する細胞であり得る。当該技術分野で公知の任意の好適な細胞が採用され得る。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損性ヘルパーウイルスから取り除かれた機能を提供するトランス補完性（ｔｒａｎｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞又はその他のＥ１ａトランス補完性細胞であり得る。
ＡＡＶ複製及びカプシド配列は、当技術分野で公知の任意の方法によって提供され得る。現行のプロトコールは、単一のプラスミド上のＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現させるのが一般的である。ＡＡＶ複製及びパッケージング配列は一緒に提供される必要はないが、そうすることが好都合であり得る。ＡＡＶｒｅｐ及び／又はｃａｐ配列は、任意のウイルスベクター又は非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルス又はヘルペスウイルスベクターによって提供され得る（例えば、欠損型アデノウイルスベクターのＥ１ａ領域又はＥ３領域中に挿入される）。ＥＢＶベクターもまた、ＡＡＶｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子を発現させるために採用され得る。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターはエピソーマルであるが、連続する細胞分裂全体を通じて、高コピー数をなおも維持することである（すなわち、「ＥＢＶベースの核エピソーム（ＥＢＶ ｂａｓｅｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｅｐｉｓｏｍｅ）」と称される染色体外エレメントとして細胞中に安定に組み込まれる、Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７を参照）。
更なる代替案として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は細胞中に安定に組み込まれ得る。一般的には、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列には、これらの配列のレスキュー及び／又はパッケージングを阻止するために、ＴＲを隣接させない。
核酸テンプレートは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して細胞に提供され得る。例えば、テンプレートは、非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）又はウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施形態では、核酸テンプレートは、ヘルペスウイルスベクター又はアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠損型アデノウイルスのＥ１ａ領域又はＥ３領域中に挿入される）。別の例証として、Ｐａｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５０２５は、ＡＡＶ−ＴＲにより挟まれたレポーター遺伝子を有するバキュロウイルスベクターについて記載する。ＥＢＶベクターもまた、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上記したように、テンプレートを送達するために採用され得る。
別の代表的実施形態では、核酸テンプレートは、複製性のｒＡＡＶウイルスによって提供される。なおもその他の実施形態では、核酸テンプレートを含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体中に安定に組み込まれる。
ウイルス力価を増強するために、増殖性ＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルス又はヘルペスウイルス）が細胞に提供され得る。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野で公知である。一般的には、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスベクター又はヘルペスウイルスベクターによって提供される。或いは、アデノウイルス配列又はヘルペスウイルス配列は、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５；並びに米国特許第６，０４０，１８３号及び同第６，０９３，５７０号によって記載されるように、効率的なＡＡＶ生成を促進するヘルパー遺伝子のすべてを有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして、別の非ウイルスベクター又はウイルスベクターによって提供され得る。
更に、ヘルパーウイルス機能は、染色体中に埋め込まれ、又は安定な染色体外エレメントとして維持されているヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る。概して、ヘルパーウイルス配列はＡＡＶビリオン中にパッケージングされ得ない、例えば、ＴＲにより挟まれていない。
単一のヘルパーコンストラクト上に、ＡＡＶ複製及びカプシド配列、並びにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を提供することが有利であり得ることを、当業者は理解するであろう。このヘルパーコンストラクトは、非ウイルスコンストラクトであっても、またウイルスコンストラクトであってもよい。１つの非限定的例証として、ヘルパーコンストラクトは、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルス又はハイブリッドヘルペスウイルスであり得る。
１つの特定の実施形態では、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは、核酸テンプレートを更に含み得る。ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列及び／又はｒＡＡＶテンプレートは、アデノウイルスの欠損した領域（例えば、Ｅ１ａ領域又はＥ３領域）中に挿入され得る。
更なる実施形態では、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施形態によれば、ｒＡＡＶテンプレートは、プラスミドテンプレートとして提供され得る。
別の例証的実施形態では、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供され、ｒＡＡＶテンプレートがプロウイルスとして細胞中に組み込まれる。或いは、ｒＡＡＶテンプレートは、染色体外エレメント（例えば、ＥＢＶベースの核エピソーム）として細胞内で維持されるＥＢＶベクターによって提供される。
更なる例示的な実施形態では、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。ｒＡＡＶテンプレートは、別個の複製性のウイルスベクターとして提供され得る。例えば、ｒＡＡＶテンプレートは、ｒＡＡＶ粒子又は第２の組換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。
上記方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、アデノウイルスの複製及びパッケージングに十分なアデノウイルス５’及び３’シス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復及びＰＡＣ配列）を一般的に含む。ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列及び存在する場合にはｒＡＡＶテンプレートは、アデノウイルスバックボーン中に埋め込まれ、５’及び３’シス配列によって挟まれており、その結果これらの配列は、アデノウイルスカプシド中にパッケージングされ得る。
上記のように、アデノウイルスヘルパー配列及びＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列がＡＡＶビリオン中にパッケージングされないように、概してＴＲにより挟まれていない。
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４−１２）は、アデノウイルス、並びにＡＡＶｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の両方を含むキメラヘルパーについて記載する。
ヘルペスウイルスもまた、ＡＡＶパッケージング法においてヘルパーウイルスとして使用され得る。ＡＡＶ−Ｒｅｐタンパク質（複数でもよい）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、拡大縮小可能なＡＡＶベクター生成スキームを有利に促進し得る。ＡＡＶ−２ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ−１）ベクターが、Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９８６及び国際公開第００／１７３７７号に記載されている。
更なる代替案として、本発明のウイルスベクターは、例えばＵｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５−４３に記載されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子及びｒＡＡＶテンプレートを送達するためのバキュロウイルスベクターを使用して、昆虫細胞中で生成され得る。
夾雑性のヘルパーウイルスを含まないＡＡＶベクターストックが、当技術分野で公知の任意の方法によって取得されてよい。例えば、ＡＡＶ及びヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に識別され得る。ＡＡＶはまた、ヘパリン基材に対する親和性に基づいてヘルパーウイルスからも分離され得る（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９７３）。いかなる夾雑性のヘルパーウイルスも複製コンピテントとならないように、欠失型の複製欠損性ヘルパーウイルスが使用され得る。ＡＡＶウイルスのパッケージングを媒介するためにアデノウイルスの初期遺伝子発現のみが必要とされるので、更なる代替案として、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーが採用され得る。後期遺伝子発現が欠損しているアデノウイルス変異体は当技術分野で公知である（例えば、ｔｓ１００Ｋ及びｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。
［組換えウイルスベクター］
本発明のウイルスベクター、カプシド、及び粒子は、インビトロ、エクスビボ、及びインビボで核酸を細胞に送達するために有用である。特に、ウイルスベクターは、哺乳動物、細胞を含む動物に核酸を送達又は移入するために有利に採用され得る。
目的とする任意の異種核酸配列（複数でもよい）は、本発明のウイルスベクター、カプシド、及び／又は粒子中に送達され得る。目的とする核酸として、治療的（例えば、医療用又は獣医学用）若しくは免疫原性（例えば、ワクチン用）タンパク質を含むポリペプチドをコードする核酸、及び／又は機能的若しくは治療的ＲＮＡ分子が挙げられる。
治療的ポリペプチドとして、これらに限定されないが、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ミニジストロフィン及びマイクロジストロフィンを含む、例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０；米国特許公開第２００３／０１７１３１号；国際公開番号国際公開第２００８／０８８８９５号、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３７１４−１３７１９（２０００）；及びＧｒｅｇｏｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：６５７−６４（２００８）を参照）、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ−１、抗炎症性ポリペプチド、例えばＩκＢ優性変異体、サルコスパン、ユートロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３４９）、ミニユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子等）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β−グロビン、α−グロビン、スペクトリン、α１−アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β−グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン等）、ペプチド増殖因子、神経栄養因子及びホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１及び２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経増殖因子、神経栄養因子−３及び−４、脳由来神経栄養因子、骨形態形成タンパク質（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）［ＲＡＮＫＬ及びＶＥＧＦを含む］、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子−α及び−β等）、リソソーム酸α−グルコシダーゼ、α−ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死増殖因子α可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、カルシウムハンドリングを調節する分子（例えば、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＰＰ１の阻害剤１及びその断片［例えば、国際公開第２００６／０２９３１９号及び同第２００７／１００４６５号］）、短縮型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔ等の、Ｇタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウンを有効にする分子、ＩＲＡＰ等の抗炎症性因子、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、モノクロナール抗体（単鎖モノクロナール抗体を含む；例示的なＭａｂは、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｍａｂである）、ニューロペプチド及びその断片（例えば、ガラニン、ニューロペプチドＹ（米国特許第７，０７１，１７２号を参照）、バソヒビン等の血管新生阻害剤及びその他のＶＥＧＦ阻害剤（例えば、バソヒビン２［国際公開第ＪＰ２００６／０７３０５２号を参照］）が挙げられる。その他の例証的な異種核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、及び腫瘍壊死因子）、がん療法で使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ−１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ−リガンド、及びそれを必要とする対象において治療効果を有する任意のその他のポリペプチドをコードする。ＡＡＶベクターは、モノクロナール抗体及び抗体断片、例えば、ミオスタチンを標的とする抗体又は抗体断片を送達するためにも使用され得る（例えば、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：５８４−５９０（２００５）を参照）。ＡＡＶベクターは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体の１つ若しくは複数のコンポーネント、又はその他の遺伝子編集システムで使用されるコンポーネントを提供するためにも使用され得る。更に、ＡＡＶベクターは、分泌型治療薬、例えば融合タンパク質（エタネルセプト）を提供するためにも使用され得る。分泌型治療薬を提供するために使用される場合、分泌型治療薬が目的とする標的組織に到達可能な限り、ウイルスの広範囲に及ぶ発現は必要とされない。
ポリペプチドをコードする異種核酸配列として、レポーターポリペプチド（例えば酵素）をコードするものが挙げられる。レポーターポリペプチドは当技術分野で公知であり、これらに限定されないが、緑色蛍光タンパク質、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が含まれる。
任意選択的に、異種核酸は、分泌型ポリペプチド（例えば、その天然の状態において分泌型ポリペプチドであるポリペプチド、又は例えば当技術分野で公知の分泌シグナル配列を作動可能に付随させることによって、分泌されるように遺伝子工学的に改変されたポリペプチド）をコードする。
或いは、本発明の特定の実施形態では、異種核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載されている）、スプライソソーム媒介性のトランススプライシングを有効にするＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６；米国特許第６，０１３，４８７号；同第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子発現抑制に関与するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１を参照）、及び「ガイド」ＲＮＡ等のその他の非翻訳ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，８６９，２４８号）等をコードし得る。例示的な非翻訳ＲＮＡとして、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療及び／又は予防するため、並びに／或いは化学療法による障害を予防するための心臓への投与用）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー用）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療及び／又は予防するため）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管疾患を治療するため、例えば、Ａｎｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１３２−１４２（２００８）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．２６：５１−５５（２００５）を参照）；ホスホランバンＳ１６Ｅ等のホスホランバン阻害分子又はドミナントネガティブ分子（例えば、心血管疾患を治療するため、例えば、Ｈｏｓｈｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８６４−８７１（２００２）を参照）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、癲癇用）、並びに病原性生物及びウイルス（例えば、Ｂ型及び／又はＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス等）を標的とするＲＮＡｉが挙げられる。
更に、選択的スプライシングを指令する核酸配列が送達され得る。例証するために、ジストロフィンエクソン５１の５’及び／又は３’スプライス部位に対して相補的なアンチセンス配列（又はその他の阻害配列）が、このエクソンのスキッピングを誘導するために、Ｕ１又はＵ７低分子核内（ｓｎ）ＲＮＡプロモーターと連携して送達され得る。例えば、アンチセンス／阻害配列（複数でもよい）に対して５’側に位置するＵ１又はＵ７ ｓｎＲＮＡプロモーターを含むＤＮＡ配列が、本発明の改変されたカプシド中にパッケージング及び送達され得る。
ウイルスベクターは、宿主染色体上の遺伝子座と相同性を共有し、それと組み替わる異種核酸も含み得る。このアプローチは、例えば、宿主細胞中の遺伝的欠陥を修正するために利用され得る。
本発明は、例えばワクチン接種のための免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスベクターも提供する。核酸は、これらに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ又はＳＩＶのｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、がん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原等に由来する免疫原を含む、当技術分野で公知の任意の目的とする免疫原をコードし得る。
ワクチンベクターとしてのパルボウイルスの使用は当技術分野で公知である（例えば、Ｍｉｙａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：８５０７；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，９１６，５６３号、Ｍａｚｚａｒａ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，９０５，０４０号、米国特許第５，８８２，６５２号、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．の米国特許第５，８６３，５４１号を参照）。抗原は、パルボウイルスカプシド中に存在し得る。或いは、抗原は、組換えベクターゲノム中に導入された異種核酸から発現され得る。本明細書に記載され及び／又は当技術分野で公知の目的とする任意の免疫原は、本発明のウイルスベクターによって提供され得る。
免疫原性ポリペプチドは、免疫応答を惹起するのに好適な、並びに／或いはこれらに限定されないが、微生物、細菌、原生動物、寄生生物、真菌及び／又はウイルスの感染及び疾患を含む、感染及び／又は疾患から対象を防御するのに好適な任意のポリペプチドであり得る。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルソミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルス免疫原、例えばインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）表面タンパク質若しくはインフルエンザウイルス核タンパク質、又はウマインフルエンザウイルス免疫原等）、又はレンチウイルス免疫原（例えば、ウマ感染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原、又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原、例えばＨＩＶ若しくはＳＩＶのエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶ若しくはＳＩＶのマトリックス／カプシドタンパク質、並びにＨＩＶ若しくはＳＩＶのｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子産物等）であり得る。免疫原性ポリペプチドは、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルス免疫原、例えばラッサ熱ウイルス核カプシドタンパク質及びラッサ熱エンベロープ糖タンパク質等）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアウイルス免疫原、例えばワクシニアＬ１又はＬ８遺伝子産物等）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルス免疫原又は日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、エボラウイルス免疫原又はマールブルグウイルス免疫原、ＮＰ及びＧＰ遺伝子産物等）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦ及び／又はＳＦＳウイルス免疫原）、又はコロナウイルス免疫原（例えば、感染性ヒトコロナウイルス免疫原、例えばヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質等、又はブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原、又はトリ感染性気管支炎ウイルス免疫原等）でもあり得る。免疫原性ポリペプチドは更に、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）、流行性耳下腺炎免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素若しくはその他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎等）免疫原、及び／又は当技術分野で現在知られている若しくは免疫原として後に同定された任意のその他のワクチン免疫原であり得る。
或いは、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍細胞又はがん細胞の抗原であり得る。任意選択的に、腫瘍抗原又はがん抗原は、がん細胞の表面上に発現される。
例示的ながん及び腫瘍細胞の抗原は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１（１９９１））に記載されている。その他の例証的ながん抗原及び腫瘍抗原として、これらに限定されないが、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ−１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＣＤＫ−４、β−カテニン、ＭＵＭ−１、カスパーゼ−８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ−１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８０：３４７；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４）、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００ ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ＣＥＡ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、Ｐ−１５、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９）；ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９−９、ＮＳＥ、ＤＵ−ＰＡＮ−２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ−１、ＣＡ７２−４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ−ｅｒｂＢ−２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ−ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制因子タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ、（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３）；ムチン抗原（国際特許公開番号国際公開第９０／０５１４２号）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；及び／又は現在知られている抗原、若しくは以下のがん、すなわちメラノーマ、腺がん、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんに関連することが後に発見された抗原、及び現在知られている、若しくは後に同定された任意のその他のがん若しくは悪性状態（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ、（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１〜９１頁を参照）が挙げられる。
更なる代替案として、異種核酸は、インビトロ、エクスビボ又はインビボにおいて、細胞中で産生されることが望ましい任意のポリペプチドをコードし得る。例えば、ウイルスベクターは、培養細胞中に導入され得、発現した遺伝子産物がそこから単離され得る。
目的とする異種核酸（複数でもよい）には適切な制御配列が作動可能に付随し得ることが、当業者に理解されよう。例えば、異種核酸には、発現制御エレメント、例えば転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、及び／又はエンハンサー等と作動可能に付随し得る。
更に、目的とする異種核酸（複数でもよい）の調節された発現が、例えば、オリゴヌクレオチド、小分子、及び／又は特定の部位におけるスプライシング活性を選択的にブロックするその他の化合物（例えば、国際公開第２００６／１１９１３７号に記載される）の存在又は非存在により、異なるイントロンの選択的スプライシングを調節することによって、転写後レベルで達成され得る。
種々のプロモーター／エンハンサーエレメントが、望まれるレベル及び組織特異的発現に応じて使用され得ることを、当業者は理解するであろう。プロモーター／エンハンサーは、望まれる発現パターンに応じて構成的又は誘導性であり得る。プロモーター／エンハンサーは、先天的又は外来性であり得、天然配列又は合成配列であり得る。外来とは、転写開始領域が導入される野生型宿主において、転写開始領域が見出されないことが意図されている。
特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞又は治療される対象にとって先天的であり得る。代表的実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列にとって先天的であり得る。プロモーター／エンハンサーエレメントは、それが目的とする標的細胞（複数でもよい）において機能するように一般に選択される。更に、特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳動物のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的であっても誘導性であってもよい。
誘導性発現制御エレメントは、異種核酸配列（複数でもよい）の発現に対して調節を提供することが望ましい用途において一般的に有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的又は選好的プロモーター／エンハンサーエレメントであり得、筋特異的若しくは選好的（心筋、骨格筋、及び／又は平滑筋特異的若しくは選好的を含む）、神経組織特異的若しくは選好的（脳特異的又は選好的を含む）、眼特異的若しくは選好的（網膜特異的及び角膜特異的を含む）、肝臓特異的若しくは選好的、骨髄特異的若しくは選好的、膵臓特異的若しくは選好的、脾臓特異的若しくは選好的、及び肺特異的若しくは選好的プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。その他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとして、ホルモン誘導性エレメント及び金属誘導性エレメントが挙げられる。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとして、これらに限定されないがＴｅｔオン／オフエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、及びメタロチオネインプロモーターが挙げられる。
異種核酸配列（複数でもよい）が標的細胞内で転写され、次いで翻訳される実施形態では、特異的開始シグナルが、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために一般に含まれる。このような外因性の翻訳制御配列は、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む場合もあり、天然及び合成のいずれでもあり得る様々な起源の配列であり得る。
本発明によるウイルスベクター、カプシド、及び粒子は、分裂細胞及び非分裂細胞を含む広範囲にわたる細胞中に異種核酸を送達する手段を提供する。いくつかの実施形態では、例えば、インビトロでポリペプチドを製造するため、又はエクスビボでの遺伝子療法を目的として、ウイルスベクターは、インビトロで目的とする核酸を細胞に送達するために採用され得る。ウイルスベクターは、例えば、免疫原性若しくは治療用ポリペプチド又は機能的ＲＮＡを発現させるために、それを必要とする対象に核酸を送達する方法において更に有用である。このように、ポリペプチド又は機能的ＲＮＡは、対象においてインビボで産生され得る。対象ではポリペプチドが欠損しているので、そのポリペプチドを必要とし得るが、ポリペプチドは遺伝子療法プロトコールにより対象に投与され得る。更に、対象におけるポリペプチド又は機能的ＲＮＡの生成は何らかの有益な効果を付与し得るので、この方法が実践され得る。
本発明のウイルスベクター、カプシド、及び粒子は、培養細胞又は対象において、目的とするポリペプチド又は機能的ＲＮＡを生成させるためにも使用され得る（例えば、スクリーニング法と連携しながら、例えばポリペプチドを生成させるため又は対象に対する機能的ＲＮＡの影響を観察するためのバイオリアクターとして対象を使用して）。
一般的に、本発明のウイルスベクター、カプシド、及び粒子は、ポリペプチド又は機能的ＲＮＡをコードする異種核酸を送達して、治療用ポリペプチド又は機能的ＲＮＡを送達することが有利なあらゆる疾患状態を治療及び／又は予防するために採用され得る。例証的な疾患状態として、これらに限定されないが、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）及びその他の肺の疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（β−グロビン）、貧血（エリスロポエチン）、及びその他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β−インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞株由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（反復を除去するためのＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、癲癇（ガラニン、神経栄養因子）、及びその他の神経学的障害、がん（エンドスタチン、アンジオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ−リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；ＶＥＧＦ又は多剤耐性遺伝子産物に対するＲＮＡｉを含むＲＮＡｉ、ｍｉｒ−２６ａ［例えば、肝細胞がんに関する］）、真正糖尿病（インスリン）、デュシェンヌ型（ジストロフィン、ミニジストロフィン、インスリン様増殖因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗炎症性ポリペプチド、例えばＩκＢ優性変異体等、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、エクソンスキッピングを誘発するためのジストロフィン遺伝子中のスプライスジャンクションに対するアンチセンス又はＲＮＡｉ［例えば、国際公開第２００３／０９５６４７号を参照］、エクソンスキッピングを誘発するためのＵ７ ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス［例えば、国際公開第２００６／０２１７２４号を参照］、及びミオスタチン又はミオスタチンプロペプチドに対する抗体又は抗体断片）及びベッカー型を含む筋ジストロフィー、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（α−Ｌ−イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠乏症（アデノシンデアミナーゼ）、グリコーゲン貯蔵疾患（例えば、ファブリー病［α−ガラクトシダーゼ］及びポンペ病［リソソーム酸α−グルコシダーゼ］）、及びその他の代謝障害、先天性肺気腫（α１−アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ・サックス病（Ｔａｙｓ Ｓａｃｈｓ ｄｉｓｅａｓｅ）（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ）、網膜変性疾患（及び眼と網膜のその他の疾患；例えば、黄斑変性症におけるＰＤＧＦ、及び／又は例えばＩ型糖尿病における網膜障害を治療／予防するためのバソヒビン若しくはＶＥＧＦのその他の阻害剤、若しくはその他の血管新生阻害剤）、固形臓器の疾患、例えば脳（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンジオスタチン、及び／又はＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、膠芽腫［エンドスタチン、アンジオスタチン、及び／又はＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］を含む）、肝臓、腎臓、うっ血性心不全又は末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を含む心臓（例えば、プロテインホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ−１）及びその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、Ｐ２アドレナリン受容体、ｐ２アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド−３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、短縮型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔ等のＧタンパク質共役型受容体キナーゼ２型ノックダウンを有効にする分子；カルサルシン（ｃａｌｓａｒｃｉｎ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅ等のホスホランバン阻害分子又はドミナントネガティブ分子等を送達することによる）、関節炎（インスリン様増殖因子）、関節障害（インスリン様増殖因子１及び／又は２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓを送達することによる）、心臓移植物の生存の改善（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様増殖因子Ｉ）、腎臓欠乏症（ｋｉｄｎｅｙ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（ＩＲＡＰ及びＴＮＦα可溶性受容体等の抗炎症因子）、肝炎（α−インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠乏症（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２、及びＳＣＡ３を含む脊髄性大脳性運動失調症（ｓｐｉｎａｌ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｔａｘｉａｓ）、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患等が挙げられる。本発明は、移植の奏功率を高めるため、及び／又は臓器移植若しくは補助療法の有害な副作用を低減させるために、臓器移植後に更に使用され得る（例えば、サイトカイン生成を遮断するために免疫抑制剤又は阻害性核酸を投与することによって）。別の例として、骨形態形成タンパク質（ＢＮＰ２、７等、ＲＡＮＫＬ及び／又はＶＥＧＦを含む）が、例えば、がん患者における破壊（ｂｒｅａｋ）又は外科的除去後に、骨同種移植片と共に投与され得る。
本発明は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）を生成するためにも使用され得る。例えば、本発明のウイルスベクターは、非多能性細胞、例えば成人線維芽細胞、皮膚細胞、肝細胞、腎細胞、脂肪細胞、心臓細胞、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞等に、幹細胞関連核酸（複数でもよい）を送達するために使用され得る。
幹細胞に関連する因子をコードする核酸は当技術分野で公知である。幹細胞及び多能性に関連するかかる因子の非限定的な例として、Ｏｃｔ−３／４、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３、及び／又はＳＯＸ１５）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４、及び／又はＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（例えば、Ｃ−ｍｙｃ、Ｌ−ｍｙｃ、及び／又はＮ−ｍｙｃ）、ＮＡＮＯＧ、及び／又はＬＩＮ２８が挙げられる。
本発明は、癲癇、脳卒中、外傷性脳損傷、認知障害、行動障害、精神障害、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、並びに軸索／ニューロンの再生若しくは修復から利益を得る、又はそれを必要とするその他のあらゆる神経変性状態を治療及び／又は予防するためにも実践され得る。
特定の実施形態では、本発明は、例えば幹細胞の分化及びリプログラミング因子、例えばＦｏｘＪｌ、Ｆｏｘ２、ＮｅｕｒｏＤ２、ＮＧ２、若しくはＯｌｉｇ２等、及び／又はマイクロＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１３７、ＭｉＲ１２４等、並びに任意のその他の因子、又はニューロンの発達及び分化に関わるｍｉＲＮＡの標的化された制御又は過剰発現により、軸索再生及びニューロン修復を促進し、回路を復元し、及び／又は失われたニューロンを補充するために、矯正療法として実践され得る。
遺伝子移入は、疾患状態に対する療法を理解し提供するための実質的潜在的用途を有する。欠損した遺伝子が既知であり、クローニングされているいくつかの遺伝性疾患が存在する。一般的に、上記疾患状態は２つのクラスに該当する：劣性様式で一般に遺伝する、通常は酵素の欠乏状態、及び、調節タンパク質又は構造タンパク質が関与し得る、一般的には優性様式で遺伝するバランスを欠いた状態。欠乏状態の疾患の場合、補充療法を目的として罹患組織中に正常な遺伝子をもたらすため、並びにアンチセンス突然変異を使用して疾患に対する動物モデルを創出するために、遺伝子移入が使用され得る。バランスを欠いた疾患状態の場合、遺伝子移入は、モデル系内で疾患状態を創出するために使用され得るが、このモデル系は次に疾患状態に対抗する努力において使用され得る。従って、本発明によるウイルスベクターは、遺伝疾患の治療及び／又は予防を可能にする。
本発明によるウイルスベクター、カプシド、及び粒子は、インビトロ又はインビボで機能的ＲＮＡを細胞に提供するためにも採用され得る。細胞内で機能的ＲＮＡを発現させると、例えば、細胞による特定の標的タンパク質の発現を低下させることができる。従って、機能的ＲＮＡは、それを必要とする対象において特定のタンパク質の発現を減少させるために投与され得る。機能的ＲＮＡはまた、遺伝子発現及び／又は細胞の生理学を調節して、例えば、細胞若しくは組織培養系を最適化するために、又はスクリーニング法において、インビトロで細胞に投与され得る。
更に、本発明によるウイルスベクター、カプシド、及び粒子は、診断法及びスクリーニング法においてその用途を見出し、それにより、目的とする核酸が、細胞培養系において、或いはトランスジェニック動物モデルにおいて、一過的に又は安定に発現される。
本発明のウイルスベクター、カプシド、及び粒子は、当業者にとって明らかなように、これらに限定されないが、遺伝子の標的化、クリアランス、転写、翻訳等を評価するためのプロトコールにおける使用を含む、様々な非治療目的で使用され得る。ウイルスベクター、カプシド、及び粒子は、安全性（伝播、毒性、免疫原性など）を評価する目的でも使用され得る。かかるデータは、例えば、臨床的有効性の評価を行う前に、規制承認プロセスの一環として、米国食品医薬品局によって検討される。
更なる態様として、本発明のウイルスベクター、カプシド、及び粒子は、対象において免疫応答を生み出すために使用され得る。この実施形態によれば、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むウイルスベクター、カプシド、及び粒子が対象に投与され得、能動免疫応答が、対象によって該免疫原性ポリペプチドに対して開始される。免疫原性ポリペプチドは、本明細書において上記した通りである。いくつかの実施形態では、防御的免疫応答が惹起される。
或いは、ウイルスベクター、カプシド、及び粒子は、エクスビボで細胞に投与され得、その変更された細胞が対象に投与される。異種核酸を含むウイルスベクター、カプシド、及び粒子が細胞中に導入され、該細胞が対象に投与され、そこで免疫原をコードする異種核酸が発現され、対象において該免疫原に対して免疫応答を誘発し得る。特定の実施形態では、細胞は抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。
「能動免疫応答」又は「能動免疫」は、「免疫原と遭遇した後の宿主組織及び細胞の関与」により特徴付けられる。これは、抗体の合成又は細胞媒介型の反応性の発現、又はその両方を引き起こす、リンパ細網組織における免疫担当細胞の分化及び増殖に関係する。Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ、Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ、ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ １１７（Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ ｅｄ．，１９８５）。換言すれば、能動免疫応答は、感染又はワクチン接種により免疫原に曝露した後に宿主によって開始される。能動免疫は受動免疫と対比され得るが、受動免疫は、「能動的に免疫化された宿主から非免疫宿主への、事前形成された物質（抗体、トランスファー因子、胸腺移植片、インターロイキン−２）の移入」を介して獲得される（同文献）。
「防御的」免疫応答又は「防御的」免疫とは、本明細書中で使用される場合、疾患を予防する又はその発生率を低下させるという点で、免疫応答が対象に対して何らかの利益を付与することを表す。或いは、防御的免疫応答又は防御的免疫は、疾患、特にがん又は腫瘍の治療及び／又は予防において有用であり得る（例えば、がん若しくは腫瘍の形成を予防することによって、がん若しくは腫瘍の退縮を引き起こすことによって、及び／又は転移を予防することによって、及び／又は転移性小結節の増殖を予防することによって）。防御的効果は、治療の利益がそのあらゆる不利益を凌駕する限り、完全であってもまた部分的であってもよい。
特定の実施形態では、異種核酸を含むウイルスベクター、カプシド、粒子、又は細胞は、本明細書中に記載される免疫原的に有効な量で投与され得る。
本発明のウイルスベクター、カプシド、及び粒子は、１つ若しくは複数のがん細胞抗原（又は免疫学的に類似の分子）、又はがん細胞に対する免疫応答を生成する任意のその他の免疫原を発現するウイルスベクターの投与によるがん免疫療法を目的として投与される場合もある。例証として、例えばがんを有する患者を治療するため及び／又は対象においてがんの発症を予防するために、がん細胞抗原をコードする異種核酸を含むウイルスベクターを投与することによって、対象においてがん細胞抗原に対して免疫応答が生成され得る。ウイルスベクターは、本明細書中で記載されるように、インビボで又はエクスビボ法を使用することによって、対象に投与され得る。
或いは、がん抗原は、ウイルスカプシドの一部として発現され得るか、さもなければウイルスカプシドと会合し得る（例えば、上記されるように）。
別の代替案として、当技術分野で公知の任意のその他の治療用核酸（例えば、ＲＮＡｉ）又はポリペプチド（例えば、サイトカイン）が、がんを治療及び／又は予防するために投与され得る。
本明細書中で使用する場合、用語「がん」は、腫瘍形成がんを包含し得る。同様に、用語「がん性組織」は腫瘍を包含する。「がん細胞抗原」は腫瘍抗原を包含する。
用語「がん」は、当技術分野で理解される意味、例えば、身体の離れた部位に伝播する能力を有する（すなわち、転移する）組織の非制御増殖という意味を有する。例示的ながんとして、これらに限定されないが、メラノーマ、腺がん、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頚がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がん、及び現在知られている又は後に同定された任意のその他のがん又は悪性状態が挙げられる。代表的実施形態では、本発明は、腫瘍形成がんを治療及び／又は予防する方法を提供する。
用語「腫瘍」も、例えば、多細胞生物内の未分化細胞の異常な塊として、当技術分野で理解されている。腫瘍は悪性又は良性であり得る。代表的実施形態では、本明細書において開示される方法は、悪性腫瘍を予防及び治療するために使用される。
用語「がんを治療すること」、「がんの治療」、及び同等の用語では、がんの重症度が抑えられる、又は少なくとも部分的に排除されること、並びに／或いは疾患の進行が減速及び／又は制御されること、並びに／或いは疾患が安定化することが意図されている。特定の実施形態では、これらの用語は、がんの転移が予防され、又は抑えられ、又は少なくとも部分的に排除されること、並びに／或いは転移性小結節の増殖が予防され、又は抑えられ、又は少なくとも部分的に排除されることを表す。
用語「がんの予防」又は「がんを予防すること」及び同等の用語では、方法が、がん発症の発生率及び／又は重症度を少なくとも部分的に排除し、又は低下させ、及び／又は遅延させることが意図されている。換言すれば、対象におけるがんの発症は、尤度若しくは確率において低減され得る、及び／又は遅延され得る。
特定の実施形態では、細胞は、がんを有する対象から取り出され、本発明によるがん細胞抗原を発現するウイルスベクターと接触され得る。次いで、改変された細胞が対象に投与され、それにより、がん細胞抗原に対する免疫応答が惹起される。この方法は、インビボで十分な免疫応答を開始できない（すなわち、十分な量で促進抗体を産生できない）免疫不全状態の対象で有利に使用され得る。
免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、α−インターフェロン、β−インターフェロン、γ−インターフェロン、ω−インターフェロン、τ−インターフェロン、インターロイキン−１α、インターロイキン−１β、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−８、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン１２、インターロイキン−１３、インターロイキン−１４、インターロイキン−１８、Ｂ細胞増殖因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子−α、腫瘍壊死因子−β、単球走化性因子タンパク質−１、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、及びリンホトキシン）によって増強され得ることが、当技術分野で公知である。従って、免疫調節性サイトカイン（好ましくは、ＣＴＬ誘導性サイトカイン）が、ウイルスベクターと連携して対象に投与され得る。
サイトカインは、当技術分野で公知の任意の方法によって投与され得る。外因性サイトカインが対象に投与され得る、或いはサイトカインをコードする核酸が好適なベクターを使用して対象に送達され、サイトカインがインビボで生成され得る。
［対象、医薬製剤、及び投与様式］
本発明によるウイルスベクター、カプシド、及び粒子は、獣医学的用途及び医学的用途の両方においてその使用を見出す。好適な対象としてトリ及び哺乳動物の両方が挙げられる。用語「トリ」として、本明細書中で使用する場合、これらに限定されないがニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、オウム、インコ等が挙げられる。用語「哺乳動物」として、本明細書中で使用する場合、これらに限定されないがヒト、ヒト以外の霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ等が挙げられる。ヒト対象として、新生児、乳幼児、未成年、成人、及び老人の対象が挙げられる。
代表的実施形態では、対象は、本発明の方法「を必要としている」。
特定の実施形態では、本発明は、薬学的に許容される担体中に本発明のウイルスベクター及び／又はカプシド及び／又は粒子、並びに任意選択的に、その他の薬剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、補助剤、希釈剤等を含む医薬組成物を提供する。注射剤の場合、担体は一般的には液体である。その他の投与方法では、担体は固体又は液体のいずれかであり得る。吸入式投与の場合、担体は呼吸可能であり、任意選択的に、固体又は液体の粒状形態であり得る。
「薬学的に許容される」とは、毒性でない、さもなければ忌避されない材料であること、すなわち該材料は、忌避される生物学的効果を一切引き起こすことなく対象に投与され得ることを意味する。
本発明の１つの態様は、インビトロで核酸を細胞に移入する方法である。ウイルスベクター、カプシド、又は粒子は、特定の標的細胞に適した標準的形質導入法に従って、しかるべき感染多重度で細胞中に導入され得る。投与するためのウイルスベクターの力価は、標的細胞の型及び数、並びに具体的なウイルスベクターに依存して変動し得、過度の実験を実施することなしに当業者によって決定され得る。代表的実施形態では、少なくとも約１０感染単位、任意選択的に、少なくとも約１０５感染単位が、細胞に導入される。
ウイルスベクター、カプシド、及び粒子が導入される細胞（複数でもよい）は、任意の型の細胞であり得、これらに限定されないが、神経細胞（末梢神経系及び中枢神経系の細胞、特に、ニューロン及びオリゴデンドロサイト等の脳細胞を含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、及び角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば、腸及び呼吸器の上皮細胞）、筋細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、及び／又は横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞等が挙げられる。代表的実施形態では、細胞は任意の前駆細胞であり得る。更なる可能性として、細胞は幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）であり得る。なお更なる代替案として、細胞はがん細胞又は腫瘍細胞であり得る。更に、細胞は、上記したように、あらゆる種に由来し得る。
ウイルスベクター、カプシド、及び粒子は、改変された細胞を対象に投与する目的で、インビトロで細胞中に導入され得る。特定の実施形態では、細胞は、対象からすでに取り出されており、ウイルスベクター、カプシド、及び粒子がその細胞に導入され、次いで該細胞が対象中に再び投与される。エクスビボで操作するために対象から細胞を取り出し、その後該対象中に再び導入する方法は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照）。或いは、ウイルスベクター、カプシド、及び粒子は、ドナー対象由来の細胞中に、培養細胞中に、又は任意のその他の好適な供給源に由来する細胞中に導入され得、該細胞は、それを必要とする対象（すなわち、「レシピエント」対象）に投与される。
エクスビボで核酸送達するための好適な細胞は上記した通りである。対象に投与する細胞の投薬量は、対象の年齢、状態及び種、細胞の型、細胞により発現される核酸、投与様式等に応じて変動する。一般的には、薬学的に許容される担体中、１用量当たり、少なくとも約１０２〜約１０８個の細胞、又は少なくとも約１０３〜約１０６個の細胞が投与される。特定の実施形態では、ウイルスベクターで形質導入された細胞は、薬学的担体と組み合わせて、治療有効量又は予防有効量で対象に投与される。
いくつかの実施形態では、ウイルスベクターが細胞中に導入され、送達されたポリペプチドに対する免疫原性応答が惹起されるように、該細胞が対象に投与され得る（例えば、導入遺伝子として、又はカプシド中で発現される）。一般的には、免疫原的に有効な量のポリペプチドを発現する細胞の量が、薬学的に許容される担体と組み合わせて投与される。「免疫原的に有効な量」は、医薬製剤が投与される対象において、ポリペプチドに対する能動免疫応答を誘発するのに十分な発現後ポリペプチドの量である。特定の実施形態では、投薬量は、防御的免疫応答（上記定義の通り）を生成するのに十分である。免疫原性ポリペプチドを投与することの利益がそのあらゆる不利益を凌駕する限り、付与される防御の程度は、完全である必要も永続的である必要もない。
本発明の更なる態様は、ウイルスベクター及び／又はウイルスカプシドを対象に投与する方法である。本発明によるウイルスベクター及び／又はカプシドを、それを必要とするヒト対象又は動物に投与することは、当技術分野で公知の任意の手段によって可能である。任意選択的に、ウイルスベクター及び／又はカプシドは、薬学的に許容される担体において治療有効用量又は予防有効用量で送達され得る。
本発明のウイルスベクター及び／又はカプシドは、免疫原性応答を惹起するために（例えば、ワクチンとして）、更に投与され得る。一般的には、本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、免疫原的に有効な量のウイルスベクター及び／又はカプシドを含む。任意選択的に、投薬量は、防御的免疫応答（上記定義の通り）を生成するのに十分である。免疫原性ポリペプチドを投与することの利益がそのあらゆる不利益を凌駕する限り、付与される防御の程度は、完全又は永続的である必要はない。対象及び免疫原性は上記した通りである。
対象に投与されるウイルスベクター及び／又はカプシドの投薬量は、投与様式、治療及び／又は予防される疾患又は状態、個々の対象の状態、具体的なウイルスベクター又はカプシド、送達される核酸等に依存し、慣用的な様式で決定され得る。治療効果を実現するための例示的な用量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０３、１０１４、１０１５形質導入単位（すなわち、ベクターゲノムコピー数）、任意選択的に約１０８〜１０１３形質導入単位の力価である。
特定の実施形態では、２回以上の投与（例えば、２回、３回、４回、又はそれ以上の投与回数）が、例えば、１日に１回、１週間に１回、１ヶ月に１回、１年に１回等の様々な間隔の期間にわたり、所望の遺伝子発現レベルを実現するために使用され得る。
例示的な投与様式として、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介して）、口腔（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内（又は胚内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋内［骨格筋、横隔膜筋、及び／又は心筋への投与を含む］、皮内、胸膜内、脳内、経心室、及び関節内）、局部的（例えば、皮膚及び気道表面を含む粘膜表面の両方に対して、並びに経皮投与）、リンパ内等、並びに直接的な組織又は臓器への注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋、又は脳に対する）が挙げられる。投与は、眼に対してもなされ得る（例えば、硝子体中、網膜下、結膜下、眼球後、前房内、及び／又は上脈絡膜の各経路による投与）。また、投与は腫瘍への投与でもあり得る（例えば、腫瘍又はリンパ節の中又は近傍）。任意の所与のケースにおける最も好適な経路は、治療及び／又は予防される状態の性質及び重症度、並びに使用されている具体的なベクターの性質に依存する。
標的組織への送達は、ウイルスベクター及び／又はカプシドを含むデポを送達することによっても実現され得る。代表的実施形態では、ウイルスベクター及び／又はカプシドを含むデポは、骨格筋、心筋、及び／又は横隔膜筋の組織中に移植され、或いは組織が、ウイルスベクター及び／又はカプシドを含むフィルム又はその他のマトリックスと接触され得る。かかる移植可能なマトリックス又は基材は、米国特許第７，２０１，８９８号に記載されている。
特定の実施形態では、本発明によるウイルスベクター及び／又はウイルスカプシドは、骨格筋、横隔膜筋、及び／又は心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィー、心疾患［例えば、ＰＡＤ又はうっ血性心不全］を治療及び／又は予防するために）。
本発明は、全身送達用のアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、又はその他の機能的ＲＮＡ（例えば、リボザイム）を生成するためにも実践され得る。
注射剤は、液体溶液若しくは懸濁液、注射前に液体中で溶液若しくは懸濁液にするのに好適な固体形態、又はエマルジョンとして、従来の形態で調製され得る。或いは、本発明のウイルスベクター及び／又はウイルスカプシドを、全身方式ではなく局所的に、例えば、デポ又は徐放性製剤として投与し得る。更に、ウイルスベクター及び／又はウイルスカプシドは、外科的に移植可能なマトリックスに付着した状態で送達され得る（例えば、米国特許公開第２００４−００１３６４５−Ａ１号に記載される）。
ウイルスベクター及びウイルスカプシドは、ＣＮＳの組織（例えば、脳、眼）に投与され得、本発明の非存在下で観察されるであろうものよりも広い分布のウイルスベクター又はカプシドを有利にもたらし得る。
特定の実施形態では、本発明の送達ベクターは、遺伝的障害、神経変性疾患、精神障害、及び腫瘍を含む、ＣＮＳの疾患を治療するために投与され得る。
ＣＮＳの例証的疾患として、これらに限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥレット症候群、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊髄及び／又は頭部の損傷に起因する外傷（例えば外傷性脳損傷）、テイ・サックス病、レッシュ・ナイハン病、癲癇、脳卒中、脳梗塞、気分障害を含む精神障害（例えば、うつ病、双極性情動障害、遷延性情動障害、二次的気分障害）、統合失調症、薬物依存症（例えば、アルコール依存症及びその他の物質依存症）、神経症（例えば、不安症、強迫障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、産後うつ病）、精神病（例えば、幻覚及び妄想）、認知症、パラノイア、注意欠陥障害、精神性的障害、軸索／ニューロンの再生及び／又は修復から利益を得る、又はそれを必要とし得るあらゆる神経変性状態、認知障害、行動障害、睡眠障害、疼痛性障害、摂食若しくは体重障害（例えば、肥満症、悪液質、神経性食欲不振症、及び過食症）、並びにＣＮＳのがん及び腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）が挙げられる。
ＣＮＳの障害として、網膜、後方路、及び視神経に関わる眼科障害（例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症、及びその他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性症、緑内障）が挙げられる。
すべてではなくとも、ほとんどの眼科の疾患及び障害は、３種類の兆候、すなわち（１）血管新生、（２）炎症、及び（３）変性のうち１つ又は複数と関連する。本発明の送達ベクターは、抗血管新生因子；抗炎症性因子；細胞変性を遅延させ、細胞節約（ｃｅｌｌ ｓｐａｒｉｎｇ）を促進し、又は細胞増殖を促進する因子、及び上記の組み合わせを送達するために採用され得る。
例えば、糖尿病性網膜症は血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、眼内（例えば、硝子体中）又は眼窩周囲（例えば、テノン下領域中）に、１つ又は複数の抗血管新生因子を送達することによって治療され得る。１つ又は複数の神経栄養因子も、眼内（例えば、硝子体内）又は眼窩周囲に同時送達され得る。
ブドウ膜炎は炎症に関係する。１つ又は複数の抗炎症因子が、本発明の送達ベクターの眼内（例えば、硝子体又は前房）投与によって投与され得る。
比較として、網膜色素変性症は、網膜変性によって特徴付けられる。代表的実施形態では、網膜色素変性症は、１つ又は複数の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼内投与（例えば、硝子体投与）によって治療され得る。
加齢性黄斑変性症は、血管新生及び網膜変性の両方に関与する。この障害は、１つ若しくは複数の神経栄養因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内（例えば、硝子体内）に、及び／又は１つ若しくは複数の抗血管新生因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内若しくは眼窩周囲（例えば、テノン下領域中）に投与することによって治療され得る。
緑内障は、眼圧の増加及び網膜神経節細胞の喪失によって特徴付けられる。緑内障の治療には、本発明の送達ベクターを使用して、興奮毒性障害から細胞を保護する１つ又は複数の神経保護剤の投与が含まれる。かかる薬剤として、眼内に、任意選択的に硝子体内に送達されるＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカイン、及び神経栄養因子が挙げられる。
その他の実施形態では、本発明は、発作を治療するため、例えば、発作の発現、発生率、又は重症度を低下させるために使用され得る。発作の治療的処置の有効性は、行動的手段（例えば、眼又は口の震え、ティック（ｔｉｃｋ））及び／又は電気記録手段（ほとんどの発作は、特有の電気記録上の異常を有する）によって評価され得る。従って、本発明は、長期にわたる複数の発作を特徴とする癲癇を治療するためにも使用され得る。
１つの代表的実施形態では、ソマトスタチン（又はその活性断片）が、下垂体腫瘍を治療するために、本発明の送達ベクターを使用して脳に投与される。この実施形態によれば、ソマトスタチン（又はその活性断片）をコードする送達ベクターは、微量注入によって下垂体中に投与される。同様に、かかる治療は、先端巨大症（下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を治療するために使用され得る。ソマトスタチンの核酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００３０６）及びアミノ酸配列（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１６６；プロセシングされた活性ペプチドのソマトスタチン−２８及びソマトスタチン−１４を含む）は、当技術分野で公知である。
特定の実施形態では、ベクターは、米国特許第７，０７１，１７２号に記載されている分泌シグナルを含み得る。
本発明の代表的実施形態では、ウイルスベクター及び／又はウイルスカプシドは、ＣＮＳに（例えば、脳又は眼に対して）投与される。ウイルスベクター及び／又はカプシドは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、及び前頭葉、皮質、基底核、海馬、並びに扁桃体（ｐｏｒｔａａｍｙｇｄａｌａ）を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、及び下丘中に導入され得る。ウイルスベクター及び／又はカプシドは、網膜、角膜、及び／又は視神経等の眼の異なる領域にも投与され得る。ウイルス及び／又はカプシドは、硝子体中、網膜下、結膜下、眼球後、前房内、又は上脈絡膜の各経路により投与され得る。
ウイルスベクター及び／又はカプシドは、送達ベクターをより分散させて投与するために、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺によって）送達され得る。ウイルスベクター及び／又はカプシドは、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍又は脳梗塞）では、更にＣＮＳに対して血管内投与され得る。
ウイルスベクター及び／又はカプシドは、これらに限定されないが、側脳室内、大槽内、実質内、頭蓋骨内、髄腔内、眼球内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、糖、例えばマンニトール等の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）、及び眼窩周囲（例えば、テノン下領域）送達、並びに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋内送達を含む、当技術分野で公知の任意の経路によって、ＣＮＳの所望の領域（複数でもよい）に投与され得る。
特定の実施形態では、ウイルスベクター及び／又はカプシドは、ＣＮＳ内の所望の領域又はコンパートメントへの直接注射（例えば、定位注射）によって、液体製剤の状態で投与される。その他の実施形態では、ウイルスベクター及び／又はカプシドは、所望の領域への局部的適用によって、又はエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局部的適用によるものであり得る。更なる代替案として、ウイルスベクター及び／又はカプシドは、固体の持続放出製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照）。
なおも更なる実施形態では、ウイルスベクターは、運動ニューロンに関わる疾患及び障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）等）を治療及び／又は予防するための逆行性輸送に使用され得る。例えば、ウイルスベクターは筋肉組織に送達可能であり、そこからニューロン中に移動し得る。
本発明を説明してきたが、同発明は以下の実施例においてより詳細に説明され、該実施例は例証目的に限定して本明細書中に含まれるものであり、本発明に対して制限を設けるようには意図されない。
ここで、本発明の主題は、添付の実施例を参照しながら以後より完全に記載されるが、該実施例では、今ここに開示される主題の代表的な実施形態が示される。しかし、今ここに開示される主題は異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載される実施形態に限定されるものと解釈すべきでない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が網羅的且つ完全であり、また今ここに開示される主題の範囲を当業者に十分に伝達するように提供される。
下記の実施例は、例証的実施形態を提供する。下記の実施例の特定の態様は、実施形態の実践において十分に機能するように、本発明者らにより見出された又は検討された技術及び手順について開示されている。本開示及び当業者の一般的レベルに照らし、当業者は、下記の実施例は、例示目的に限定されるように意図されていること、及び今ここに主張される主題の範囲から逸脱せずに非常に多くの変更、修正、及び改変が採用され得ることを認識する。
［実施例１］
プラスミド。ヒトＺＫＳＣＡＮ１及びＨＩＰＫ３遺伝子の一部分を含有するプラスミドを、本明細書に記載される実験で使用した。イントロン配列を増幅し、マルチクローニングサイトにより隔てられたプラスミドバックボーン中にクローニングすることによりクローニングベクターを構築した。ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ及びＧＦＰ（直鎖状又はスプリット）を含有するカセットを、これらのイントロン配列の間にクローン化した。使用したスプリットＧＦＰカセットは、ｃｉｒｃＧＦＰプラスミドに由来した。更に、ＩＲＥＳ−直鎖状ＧＦＰカセットも、コントロールとしてプラスミドバックボーン中にクローン化した。すべてのプラスミドを、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、及びＡＡＶ２ゲノムに由来する末端逆位反復配列を含有するバックボーン中で構築した。
組換えＡＡＶベクターの生成。最新のトリプルプラスミドトランスフェクションプロトコールを組換えＡＡＶベクターを生成するのに使用した。手短に述べると、トランスフェクション混合物は、（ｉ）ｐＸＲヘルパープラスミド；（ｉｉ）アデノウイルスヘルパープラスミドｐＸＸ６−８０；及び（ｉｉｉ）ＡＡＶ２ゲノムに由来する末端逆位反復配列に挟まれた、ＣＭＶプロモーターにより駆動される表示の導入遺伝子を含有した。ベクターの精製は、イオジキサノールグラジエント超遠心分離プロトコールを使用して実施し、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎ Ｅｓａｌｔｉｎｇカラム（４０Ｋ ＭＷＣＯ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用して脱塩した。ＡＡＶ２末端逆位反復配列と選択的に結合するように設計されたプライマー（フォアワード、５’−ＡＡＣ ＡＴＧ ＣＴＡ ＣＧＣ ＡＧＡ ＧＡＧ ＧＧＡ ＧＴＧ Ｇ−３’、配列番号１；リバース、５’−ＣＡＴ ＧＡＧ ＡＣＡ ＡＧＧ ＡＡＣ ＣＣＣ ＴＡＧ ＴＧＡ ＴＧＧ ＡＧ−３’、配列番号２）を使用する定量的ＰＣＲ（Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０、Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、ＣＡ）により、Ｖｇ力価を取得した。
細胞培養。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｓｉｇｍａ社）及び１％ゲンタマイシン／カナマイシンが補充されたダルベッコ変法イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ社／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）内で培養した。Ｈｕｈ７及びＵ８７細胞を５％ＦＢＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｓｉｇｍａ社）及び１％ゲンタマイシン／カナマイシンが補充されたダルベッコ変法イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ社／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）内で培養した。Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｓｉｇｍａ社）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ社／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）内で培養した。すべての細胞を３７℃及び５％ＣＯ２において維持した。
蛍光顕微鏡検査。細胞を約７０％の集密度において播種し、その後に表示のｒＡＡＶベクターを用いて形質導入を行った。細胞を形質導入後の６、４、４、又は１３日目において画像化した（ＨＥＫ２９３、Ｈｕｈ７、Ｕ８７、及びＮｅｕｒｏ２Ａ細胞のそれぞれについて）。ＧＦＰライトキューブ（励起４７０ｎｍ、発光５１０ｎｍ）を備えたＥＶＯＳ ＦＬ落射蛍光細胞画像化システム（ＡＭＣ社／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して細胞を画像化した。
ＲＮＡ抽出。Ｔｒｉｚｏｌ試薬を使用し、製造業者のプロトコールに従って、ＲＮＡＬａｔｅｒに保管された凍結組織又は接着細胞からＲＮＡを抽出した。組織サンプルの場合、Ｔｉｓｓｕｅ Ｌｙｓｅｒ ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用してＴｒｉｚｏｌ内で組織を最初にホモジナイズした。
ウェスタンブロッティング。ライセートを、１×Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して回収し、−８０℃で保管した。サンプルを１００℃まで加熱した後、１０％トリス−グリシンゲル上で分離し、ニトロセルロース膜に転写した。５％脱脂乳を含むＴＢＳＴ中、４℃、オーバーナイトで膜をブロックした。ＧＦＰ（１：１０００ Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社、ＳＣ９９９６）又はアクチン（１：１００００、ＧｅｎｅＴｅｘ社、ＧＴ５５１２）に対する一次抗体を用いて膜をブロットした。安定化ペルオキシダーゼコンジュゲートヒツジ抗マウス抗体を、二次抗体として使用した（１：３０００、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ＮＡ９３１Ｖ）。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｆｅｍｔｏ基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用してブロットを現像し、定量化するために、オートラジオグラフィーにより、又はＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋（ＢｉｏＲａｄ社）上での化学発光高感度プロトコールにより可視化した。
ノーザンブロッティング。１０μｇのＲＮＡを変性バッファー（６７％脱イオン化ホルムアミド、６．７％ホルムアルデヒド、１×ＭＯＰＳ泳動バッファー）中に再懸濁し、６０℃で１０分間インキュベートし、氷上で冷却した。サンプルを１．２％変性アガロースゲル上で分離し、その後Ｈｙｂｏｎｄ Ｎ＋膜に転写した（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）。放射標識されたプローブを、製造業者の指示に基づき、Ｐｒｉｍｅ−Ｉｔ ＩＩランダムプライマーラベリングキット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用して生成した。下記のＧＦＰ増幅プライマー（５’−ＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＴＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＣＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＡＣＧＧ−３’、配列番号３、５’−ＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＡＣＣＴＧＧＡＣＧＴＡＧＣＣＴＴＣＧＧＧＣＡＴＧＧＣ−３’、配列番号４）を用いたＰＣＲにより、プローブラベリング用のＤＮＡテンプレートを生成した。放射標識されたプローブは、製造業者のプロトコールに基づき、ｉｌｌｕｓｔｒａ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−５０カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を使用して精製した。次に、プローブを、Ｒａｐｉｄ−Ｈｙｂバッファー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）中で膜にハイブリダイズさせた。ブロットをフィルムへの曝露により可視化し、放射標識シグナルを、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒスクリーンへの曝露により数値化した。
静脈内投与。この試験において報告された動物実験を、ＵＮＣ施設内実験動物飼育使用委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認されたＮＩＨガイドラインに基づき、繁殖及び維持したＣ５７／Ｂｌ６マウスを用いて実施した。尾静脈を通じて、５．５×１０１１ｖｇ／動物で動物に静脈内注射した。注射後４週間目に、トリブロモエタノール（アバチン）（１．２５％溶液１０ｇ当たり０．２ｍｌ）を、腹腔内経路によりマウスに過量投与した。この後、リン酸緩衝化生理食塩水の経心潅流が続いた。採取した臓器の一部を裁断してＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）中で保管し、残りは４％パラホルムアルデヒド中で事後固定化した。
ＩＣＶ投与。この試験で報告された動物実験を、ＵＮＣ施設内実験動物飼育使用委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認されたＮＩＨガイドラインに基づき繁殖及び維持したＣ５７／Ｂｌ６マウスを用いて実施した。出生後第１〜２日目の仔を氷上で２分間速やかに麻酔し、定位固定のＩＣＶ注射が後続した。特に、異なる導入遺伝子をパッケージングするベクターを、左側脳室（総容積＜３μｌ）内に、ＫＯＰＦ−９００小動物定位固定装置（ＫＯＰＦ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、Ｔｕｊｕｎｇａ、ＣＡ）に連結した、２６ｓゲージ針を備えたＨａｍｉｌｔｏｎ７００シリーズシリンジ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を使用して注射した。すべての新生児注射を矢状静脈洞に対して０．５ｍｍ、横静脈洞に対して２ｍｍ頭側、及び深さ１．５ｍｍにおいて実施した。ベクターの投与後、マウスを加熱ランプ下で回復させ、床敷き内で摩擦した後、母親の下に再配置した。注射後６週間目に、トリブロモエタノール（アバチン）（１．２５％溶液１０ｇ当たり０．２ｍｌ）を、腹腔内経路によりマウスに過量投与した。この後、リン酸緩衝化生理食塩水中、４％パラホルムアルデヒドの経心潅流が続いた。脳を採取し、４％パラホルムアルデヒド中で２４時間、事後固定化した。
組織の処理及び免疫組織化学。固定された組織を用い、Ｌｅｉｃａ ＶＴ １，２００Ｓ振動翼ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）を使用して、厚さ５０μｍの切片を取得した。ＧＦＰ発現の免疫組織化学分析を、製造業者のプロトコールに基づき、Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ ＡＢＣ−ＨＲＰキット（ウサギＩｇＧ ＰＫ−４００１キット、Ｖｅｃｔｏｒ ｂｉｏｌａｂｓ社、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を使用して実施した。Ｚｅｉｓｓ ＣＬＳＭ ７００共焦点レーザー走査型顕微鏡を、免疫染色後の異なる臓器の切片を画像化するのに使用した（Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社、ＵＮＣ）。ＩｍａｇｅＪにおいて定量化を実施した。切片を１６ビット画像に変換し、反転させ、その後にローリングボール法によるバックグラウンド除去が続いた。各セクション、並びに無染色コントロール切片についても、積分された密度及び面積を測定した。密度を面積に対して正規化し、バックグラウンド値（無染色コントロールに由来）を差し引いた。
ベクターゲノムの定量化。ゲノムＤＮＡを、ＱｉａＡｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ組織キット（Ｑｉａｇｅｎ社）を使用して固定された組織の切片から抽出した。ウイルスゲノムコピー数を計算するために、ＣＭＶプロモーターに対して特異的なプライマー（５’−ＣＡＡＧＴＡＣＧＣＣＣＣＣＴＡＴＴＧＡＣ−３’、配列番号５、及び５’−ＡＡＧＴＣＣＣＧＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧ−３’、配列番号６）を用いて定量的ＰＣＲを実施した。ベクターゲノムコピー数を、ハウスキーピング遺伝子（プライマー５’−ＧＧＡＣＣＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＣＴＣＡＡＧＧＧ−３’、配列番号７、及び５’−ＡＧＧＧＣＡＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＧＧＡＡＡＣ−３’、配列番号８）としてのマウスラミンＢ２遺伝子座に対して正規化した。
硝子体内投与。この試験で報告された動物実験を、ＵＮＣ施設内実験動物飼育使用委員会（ＩＡＣＵＣ）により承認されたＮＩＨガイドラインに基づき繁殖及び維持したＣ５７／Ｂｌ６マウスを用いて実施した。注射前に、１％アトロピン及び２．５％フェニレフリンＨＣｌ（Ａｋｏｒｎ Ｉｎｃ社、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）眼科用溶液を用いて眼を拡張させた。マウスを２００ｍｇ／ｋｇのトリブロモエタノール（アベルチン）を使用して麻酔した。３０Ｇ針を用いて眼の角膜輪部に小さな穴を設け、次に１μＬのウイルスを、Ｈａｍｉｌｔｏｎガスタイトシリンジ上の３４Ｇ針を用いてゆっくりと送達した。注射後４週間目に、ＣＯ２吸入によりマウスを屠殺した。位置決めを容易にするために、各眼の最上部において角膜輪部にマーキングした。この後、４％パラホルムアルデヒド中に眼球を摘出し、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。角膜を眼杯から切り離し、次に眼杯を３０％スクロース中で３時間浸漬し、最適な切断温度化合物（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｕｔｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ社、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）中で凍害を防止し、２０℃で保管した。明記する場合、眼杯は、後のＲＮＡ抽出用としてＲＮＡｌａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に保管した。
組織免疫蛍光検査法。１２μＭ網膜切片を、Ｌｅｉｃａ ＣＭ３０５０クリオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．社、Ｂｕｆｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ、ＩＬ）上で切断した。スライドを、次に１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で３回リンスした。スライド上の網膜切片を、０．５％トリトンＸ−１００及び１％ＢＳＡ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｗａｌｔｈａｍ社、ＭＡ）で、各１時間カバーした。ウサギ抗ＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｇ１０３６２）を、１％ＢＳＡ＋０．３％トリトンＸ−１００中で１：７５０に希釈し、切片と共に、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。スライドを１×ＰＢＳを用いてリンスし、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒヤギ抗ウサギ４８８（１：５００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ−１１００８）と共に室温でインキュベートした。水洗後、封入剤を含有するＰｒｏＬｏｎｇ Ｇｏｌｄ ＤＡＰＩ（Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を適用し、スライドをカバーガラスで覆った。蛍光を、補正式総蛍光法（ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ ｔｏｔａｌ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｍｅｔｈｏｄ）によりＩｍａｇｅＪにおいて数値化した。
ＲＴ−ＰＣＲ。５μｇのＲＮＡを、Ｔｕｒｂｏ ＤＮＡフリーキット（Ａｍｂｉｏｎ社／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用してＤＮａｓｅ処理した。ナノグラム量が等しい、ＤＮａｓｅ処理したＲＮＡを、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ−ｔｏ−ｃＤＮＡキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を使用してｃＤＮＡに変換した。この逆転写反応の生成物を、ＧＦＰ（５’−ｃｔｇｃｔｔｇｔｃｇｇｃｃａｔｇａｔａｔａｇａｃｇｔｔｇｔｇｇｃ−３’、配列番号９、５’−ｃａａｇｃｔｇａｃｃｃｔｇａａｇｔｔｃａｔｃｔｇｃａｃｃａｃｃ−３’、配列番号１０）及びグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）（５’−ＣＣＡＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＴＴＴＧＡＣ−３’、配列番号１１、５’−ＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣ−３’、配列番号１２）に対する遺伝子特異的プライマーを使用するＰＣＲ（又は定量的ＰＣＲ）用のテンプレートとして利用した。非定量的ＰＣＲ産物をアガロースゲル上で可視化した。ＲＮＡｓｅＲ実験の場合、５マイクログラムのＲＮＡを、５ユニットのＲＮａｓｅＲ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ社）を用いて、３７℃で１０分間処理した。酵素を９５℃で５分間不活性化した。上記のように、得られたＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲ用として使用した。
ここでは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が、環状ＲＮＡをインビボで発現する導入遺伝子カセットを送達するのに使用可能であることを示す。レポーターデザインは、ヒトＺＫＳＣＡＮ１及びＨＩＰＫ３遺伝子に由来するイントロン配列に基づいた。ＺＫＳＣＡＮ１のｍＲＮＡのエクソン２及び３、並びにＨＩＰＫ３のｍＲＮＡのエクソン２は、自然にバックスプライスされてｃｉｒｃＲＮＡを形成する。レポーターコンストラクトを創出するために、内因的環化エクソンに付随するイントロン配列の一部分をベクター中に配置した。イントロン配列の間に、スプリットＧＦＰオープンリーディングフレームを、環状ＲＮＡ内でのみ再構成されるように配置した。ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳも、環状の状況内での翻訳を推進するためにＧＦＰの前に配置した。これを両方のイントロン配列を用いて実施し、ＺＫＳＣＡＮ１スプリットＧＦＰ及びＨＩＰＫ３スプリットＧＦＰコンストラクトを創出した。ＩＲＥＳ依存性翻訳用のコントロールとして、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳ及びＧＦＰからなるカセットを、バックスプライシングを促進するためのイントロン配列を欠いているベクター中にクローン化した（図１Ａ〜１Ｂ）。
ｃｉｒｃＲＮＡ発現ベクターのインビトロでの特徴付け。異なるカセットを検証するために、コンストラクトを組換えＡＡＶ２ベクター中にパッケージングしたが、その血清型は培養中のほとんどの細胞に形質導入を引き起こす。様々な細胞型に形質導入を行うためにウイルスベクターを使用した（図５）。これらのうち、Ｕ８７ヒト神経膠芽腫細胞系が最も強固な発現を示し、それを更なる分析用として選択した。蛍光画像では、直鎖状のコントロールが最低の発現を示した一方、２つの環状カセットはほぼ等しい発現を示した（図２Ａ）。これをＧＦＰ発現のウェスタンブロット分析により検証した（図２Ｂ、図２Ｃで定量化されている）。コンストラクトを更に特徴付けるために、ＲＮＡを細胞から抽出し、ノーザンブロットを実施するのに使用した。ＧＦＰ含有配列についてプローブしたとき、ＩＲＥＳ−ＧＦＰコンストラクトは、このコンストラクトから転写されたｍＲＮＡについて期待されるサイズにおいて１つのバンドを示した。対照的に、以下の２つのスプリットＧＦＰベクターは２つのバンドを含有した：スプライシングされていないプレｍＲＮＡに対応するサイズにおいて１つのバンド、及びスプライシングされたｃｉｒｃＲＮＡに対応するサイズにおいて１つのバンド（図２Ｄ）。ブロットの定量化から、ＺＫＳＣＡＮ１スプリットＧＦＰ及びＨＩＰＫ３スプリットＧＦＰから生成したｃｉｒｃＲＮＡのレベルは有意に相違しないことが判明し、これはタンパク質レベルの結果を確認した（図２Ｅ）。興味深いことに、ｃｉｒｃＲＮＡのレベルは、ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＲＮＡと有意に異ならなかった。これは、直鎖状ＩＲＥＳ含有ＲＮＡは、おそらくｃａｐ依存性の翻訳とＩＲＥＳ媒介式の翻訳の間の干渉に起因して、環状ＲＮＡよりも低い効率で翻訳されたことを示唆している。これらの細胞培養実験から、本発明者らのベクターは、翻訳可能な環状ＲＮＡを送達及び発現するために、ＡＡＶ中に成功裏にパッケージングされ得ることの妥当性が確認された。
静脈内送達後のｃｉｒｃＲＮＡ発現。細胞培養物において認められる効果はインビボでの事象を必ずしも再現するものではないことが公知である。従って、次に本発明者らのコンストラクトをマウスにおいて試験した。コンストラクトを組換えＡＡＶ９ベクター中にパッケージングしたが、その血清型はインビボで十分に形質導入を引き起こすことが公知である。最初の試験として、マウスにウイルスベクターを静脈内注射し、心臓組織を分析用に採取した。相対的レベル及びＧＦＰ発現の局在化を確認するために、ＧＦＰに対する免疫組織化学染色を実施した。コントロールの直鎖状ＩＲＥＳ−ＧＦＰコンストラクトでは、心臓組織内でＧＦＰ陽性細胞が認められなかったが、それは驚くべき結果であった。しかし、２つのｃｉｒｃＲＮＡベクターは、心臓全体を通じて心筋細胞内での発現を示した。ＺＫＳＣＡＮ１スプリットＧＦＰは強固な発現を示し、多量のＧＦＰ陽性筋肉細胞が認められた。ＨＩＰＫ３スプリットＧＦＰ組織も、ＺＫＳＣＡＮ１イントロンを用いたときに認められた数よりは少ないものの、ＧＦＰ陽性細胞を有した（図３Ａ）。これは、染色切片の平均ピクセル強度分析により確認された（図３Ｂ）。すべての動物は等しい数のベクターゲノムの投与を受けたので、発現の差異は投薬量に起因しないことが更に確認された（図３Ｃ）。
ＲＮＡレベルで発現を評価するために、ｃｉｒｃＲＮＡスプライスジャンクションをまたいで増幅するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを実施した（このプライマーはＩＲＥＳ−ＧＦＰのＲＮＡも増幅することに留意すること）。この分析によりＩＲＥＳ−ＧＦＰのＲＮＡについてバンドが検出されなかったが、スプリットＧＦＰコンストラクトのいずれもｃｉｒｃＲＮＡの発現を示した（図３Ｄ）。より高感度で発現を調べるために、同一サンプルにおいて定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。この分析により、ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＲＮＡ発現は、極めて低レベルではあるものの検出可能であった。対照的に、ＺＫＳＣＡＮ１スプリットＧＦＰ及びＨＩＰＫ３スプリットＧＦＰは、心臓組織においてＧＡＰＤＨと同等又はそれ以上のレベルで強固な発現を示した。ＺＫＳＣＡＮ１駆動コンストラクトからは、ＨＩＰＫ３駆動コンストラクトよりも２７倍高い発現が認められた（図３Ｅ）。いずれのベクターも、等しい効率で転写及び翻訳されるはずなので、これは、ＺＫＳＣＡＮ１イントロン配列は、心臓組織内ではＨＩＰＫ３イントロンよりも高い効率で環状化を推進することを示唆する。最終的に、ＲＮＡｓｅ Ｒアッセイを実施し、スプリットＧＦＰベクターの両方に対応するＲＴ−ＰＣＲバンドは、その切断に対して抵抗性であり、その環状化の証拠となった（図３Ｆ）。
次に、これらのｃｉｒｃＲＮＡ発現ベクターが、その他の組織型において発現を示すか調べたいと考えた。上記と同様の注射から、肝組織を採取及び処理した。ＧＦＰに対する免疫組織化学染色を実施し、すべてのコンストラクトは肝臓内では極めて低い発現レベルしか示さないことを明らかにした。３つのうち、ＺＫＳＣＡＮ１スプリットＧＦＰが最も多くの発現を示し、次いでＨＩＰＫ３スプリットＧＦＰ、次にＩＲＥＳ−ＧＦＰであった。しかし、３つすべてはバックグラウンド近傍であったので、差異は大きくなかった（図６）。ＡＡＶ９は、肝臓において十分な形質導入を引き起こすことが公知のベクターであるので、この効果はベクターのトロピズムに起因するものではない。従って、これも本発明者らの細胞培養データと一致した（図５、Ｈｕｈ７細胞）。これまでの研究では、内因性のＺＫＳＣＡＮ１−ｃｉｒｃＲＮＡは肝臓内で発現していることを示しているので、これはいささか驚くべき結果である。可能な説明として２つ挙げられる。第１に、おそらくは環状化のために少量のイントロンしか使用できないことに起因して、ベクターは肝臓内では十分に環状化できない可能性がある。第２に、これまでの研究では、その他のＩＲＥＳと比較して、ＥＭＣＶ−ＩＲＥＳの肝臓内発現は低いことが明らかにされているので、このＩＲＥＳは高レベルで翻訳を推進しない可能性がある。
スプリットＧＦＰベクターは正確に代表的なものである。この発現ベクターは環状生成物を生み出すが、スプライシングされていないプレｍＲＮＡも、少なくとも細胞培養物中に明らかなレベルでなおも見出されている（図２Ｃ）。更に、環特異的タンパク質発現のみを示すために、これまでスプリットレポーターを使用してきたが、このシステムをその他の目的とするタンパク質にまで拡張するには、非スプリットＯＲＦを使用することが有利である。この場合、タンパク質が直鎖状のスプライシングされていないＲＮＡからも発現され得ることが可能となる。これを試験するために、ＧＦＰオープンリーディングフレームがスプリットされていない、ＺＫＳＣＡＮ１レポーターの別のバージョンを創出した。このレポーターは、イントロン配列により挟まれたＩＲＥＳ−ＧＦＰカセットを含有する（図７Ａ）。このベクターは、「ＺＫＳＣＡＮ１ ＧＦＰ」と名付けられ、初期細胞培養試験用としてｒＡＡＶ２ベクター中にパッケージングされた。Ｕ８７細胞では、ＺＫＳＣＡＮ１ ＧＦＰ及びＺＫＳＣＡＮ１スプリットＧＦＰに由来するＧＦＰ蛍光は、有意に相違するようには見えなかった（図７Ｂ）；これはウェスタンブロット分析により確認された（図７Ｃ、図７Ｄで定量化されている）。両方のベクターに由来するＲＮＡレベルが有意に相違しなかったことも確認した（図７Ｅ）。ｃｉｒｃＲＮＡ及びタンパク質のレベルは２ベクター間で等しいので、これはプレｍＲＮＡからの有意な翻訳上の寄付は存在しないことを示唆する。次に、ＨＩＰＫ３ ＧＦＰの非スプリットバージョンも創出した。組換えＡＡＶ９ベクターを創出するために両方のコンストラクトを使用し、心臓組織での発現を確認するために静脈内注射した。スプリットＧＦＰコンストラクトを用いたときの結果は、直鎖状ＧＦＰコンストラクトを用いたときの結果を再現した。ＺＫＳＣＡＮ１ ＧＦＰ及びＨＩＰＫ３ ＧＦＰは、いずれも心臓内での強固な発現を示したが、ＺＫＳＣＡＮ１ ＧＦＰの発現レベルの方がより高かった（図７Ｆ）。これらコンストラクト内の発現のレベル及び範囲は、スプリットバージョンとは目立つ程には相違せず、本発明者らのスプリットＧＦＰレポーターベクターは代表的な発現を示すことを示唆している。
神経系におけるｃｉｒｃＲＮＡ発現。本発明者らの細胞培養実験及びｃｉｒｃＲＮＡ発現に関する公表されたデータの両方から、神経系の組織では、ｃｉｒｃＲＮＡが多量に発現していると思われる。従って、仔マウスの左脳室中にウイルスベクターを注射した。脳を採取し、ＧＦＰ発現を視覚化するために、再度免疫組織化学染色を実施した。コントロールのＩＲＥＳ−ＧＦＰカセットは、脳内では発現を示さなかった（図４Ａ）。スプリットＧＦＰベクターのいずれも、大脳皮質に限定されたものの、脳内での発現を示した。ＡＡＶ９ベクターは脳内で汎領域的に発現することが公知であるので、この領域特異的発現は、ｃｉｒｃＲＮＡに固有のものである可能性がある（環状化又はＩＲＥＳ媒介型の翻訳に起因する）。更に、ＧＦＰ発現は主にアストロサイト内であり、ニューロンでの発現はほとんど検出されない。これまでの実験とは対照的に、ＨＩＰＫ３スプリットＧＦＰ発現組織は、脳内でＺＫＳＣＡＮ１スプリットＧＦＰ発現組織よりも多くのＧＦＰ陽性細胞を有した（図４Ｂ）。これは、環状化を推進するイントロン配列の能力に組織特異的な相違がある証拠である。
発現について試験した最後の組織は、眼の網膜であった。同一のｒＡＡＶ９ベクターをマウスの眼の硝子体に注射した。眼杯を除去し、網膜を切片化し、その後に発現を視覚化するために免疫蛍光検査法が続いた。やはり、試験したすべてのその他のマウス組織と整合して、ＩＲＥＳ−ＧＦＰコンストラクトは検出可能なＧＦＰ発現を示さなかった。しかし、ＺＫＳＣＡＮ１スプリットＧＦＰ及びＨＩＰＫ３スプリットＧＦＰのいずれも、網膜の長さ全体を通じて、広範囲にわたるＧＦＰシグナルを示した（図４Ｃ、図４Ｄで定量化されている）。この場合、ＨＩＰＫ３−スプリットＧＦＰ発現はより多くの広がりを示した。この文脈において、ＧＦＰ発現は、主として光受容体細胞及びレチノイド色素上皮（ｒｅｔｉｎｏｉｄ ｐｉｇｍｅｎｔ ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）内に見出され、その他の細胞型には存在しなかった（挿入図を参照）。ＲＮＡを、定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析用として第２の注射コホートから抽出した（図４Ｅ）。バックグラウンドより高いものの、ＩＲＥＳ−ＧＦＰのＲＮＡに対するシグナルは極めて低く、タンパク質レベルのデータを実証する。ＺＫＳＣＡＮ１スプリットＧＦＰ及びＨＩＰＫ３スプリットＧＦＰは、ＩＲＥＳ−ＧＦＰと比較して、いずれも発現が増加する傾向を示したが、但し各状態における潜在的外れ値に起因して有意ではなかった。
これらの試験から、ｃｉｒｃＲＮＡは様々な組織型において導入遺伝子を発現させるために使用可能であることが明らかにされた。ｃｉｒｃＲＮＡは主として神経系の組織において発現していることが明らかにされているが、本発明者らのカセットは心臓組織における発現も推進することができた。しかし、肝臓内では発現はほとんど認められなかった。ＡＡＶベクターは肝臓を標的とすることが公知であるので、これには注目すべきである。ｃｉｒｃＲＮＡ発現を示した組織内でさえも、細胞型特異性が認められた。例えば、脳内では、本発明者らのベクターは、ニューロン中ではなく、アストロサイト中においてのみ発現を示した。いくつもの研究が、ニューロンにおけるｃｉｒｃＲＮＡ発現を明らかにしており、また多くのｃｉｒｃＲＮＡはニューロンプロセスにおいて機能すると考えられているので、これは驚くべきことであった。従って、ｃｉｒｃＲＮＡが発現することができる細胞型は、これまでに知られているものよりも幅広い可能性がある。更に、特定の細胞型、具体的には光受容体及びレチノイド色素上皮も眼内での発現の標的となった。これらの試験で使用された組換えＡＡＶベクターは、動物のほとんどの組織全般において発現する血清型のベクターであるが、異なるトロピズムを有する多くのベクターが生成されている。従って、特異性に関する２因子システムとして、異なるベクター内でこれらのｃｉｒｃＲＮＡ発現コンストラクトを試験することは興味深い。この試験で使用されたコンストラクトは、相互に比較したとき、発現レベルにおいて組織特異的な相違を示したが、本研究では２つの異なるイントロンの対についてのみ試験した。多様な研究において同定された多数の公知ｃｉｒｃＲＮＡを踏まえ、その発現レベルや組織特異性について試験され得るより多くのイントロンの対が存在する。従って、所望の組織や細胞型に対する標的を定めた発現を用いたイントロンの対からなるツールキットを創出することが可能であり得る。
ｃｉｒｃＲＮＡの際立った特性の１つとして、ほとんどの直鎖状ｍＲＮＡと比較して、その安定性の向上が挙げられる。本試験では、発現用として一時点においてのみ組織を採取した。しかし、ＲＮＡの安定性が高まったことから、直鎖状のメッセージとの比較において、発現レベルを経時的に増加させることが可能である。従って、タイムコース試験が将来的な試験において興味深いものとなる。更に、ＲＮＡ安定性が向上すれば、強固な発現に必要とされる用量を減らすことができる。発現には、高用量ｒＡＡＶベクターが多くの場合必要とされ、導入遺伝子発現のアブレーションを引き起こす炎症性応答を誘発するおそれがあるので、これは特に重要である（ｒｅｆ）。従って、タイムコース試験に加えて、用量比較試験が、ｃｉｒｃＲＮＡ発現ベクターの有用性を特徴付けるのに必要である。
本試験のために、ｃｉｒｃＲＮＡ発現のプロキシとしてＧＦＰ発現を利用した。但し、使用されるウイルスＩＲＥＳも、特定の細胞型において発現を制限し得る。従って、ｃｉｒｃＲＮＡ発現の程度は、ここで認められたものより大きい可能性がある。タンパク質レベルの発現に対する異なるＩＲＥＳ配列の効果を更に試験することは興味深いものとなろう。タンパク質の発現は別として、機能的ＲＮＡを発現させるためにｃｉｒｃＲＮＡベクターを使用する余地が存在する。様々な公知の非コーディングＲＮＡが、ｌｎｃＲＮＡを含め、本発明者らのシステムによりおそらくは発現され得る。更に、ｃｉｒｃＲＮＡは、デザイナーＲＮＡを発現させるためのプラットフォームとしての潜在能力を有する。これには、デザイナーｍｉＲＮＡスポンジが含まれ得る（特に、内因性のｃｉｒｃＲＮＡがｍｉＲＮＡスポンジとして十分に特徴付けられているので）。更に、ＲＮＡは、様々な用途において、ＲＮＡ結合タンパク質に対する結合部位を有するように設計され得る。これらを総じて考慮すると、ｃｉｒｃＲＮＡは、様々な組織及び細胞型において、コーディングＲＮＡ及び非コーディングＲＮＡの両方を発現させるための新規方法を代表する。
［実施例２］
バックスプライシングに対するイントロン要件を調査するために、両方のイントロン（左側及び右側）上のＡｌｕエレメントとスプライス部位の間の距離が異なる一連のコンストラクトを創出した。最初に、配列を左側イントロンに挿入した；これは、塩基対形成する能力をほとんど有さない、ＧＣ含有量が内因性ＨＩＰＫ３イントロンのＧＣ含有量と一致するランダム化された配列から構成された。１００ｂｐ〜１．５ｋｂｐの一連のサイズを、スプライス部位から１００ｎｔ離れたポイントにおいて挿入した。これらの挿入は大きな効果を有した；１００ヌクレオチドの挿入さえも環形成及びＧＦＰ発現を劇的に低下させ、一方、長さがより長ければ発現は完全に消滅した（図８）。
次に、ポリピリミジントラクトから３２５ｎｔ離れて位置する、左側イントロン中への第２の一連の挿入を創出した。これらのコンストラクトも同一の効果を示し（図９Ａ〜９Ｆ）、左側イントロン内のＡｌｕエレメントとスプライス部位の間の距離が増すと、環状ＲＮＡ形成にとって有害となることを示唆する。重要なこととして、ＨＩＰＫ３コンストラクトの右側イントロンにランダム化した配列を挿入した（図１０Ａ〜１０Ｆ）。右側イントロンに対する効果は、左側イントロンにおける効果とは完全に異なった。最大１．５ｋｂまでのすべての挿入は、環状ＲＮＡレベル又はＧＦＰ発現に対して効果を有することなく許容された。従って、所望の配列が、ｃｉｒｃＲＮＡ形成に影響を及ぼすことなく右側イントロンに挿入可能であった。指摘すべき重要事項として、異なるエレメント、例えば環状ＲＮＡコンストラクトの右側イントロン内のその他の非コードＲＮＡであるマイクロＲＮＡ等の多重化を可能にすることが挙げられる。
次に、Ａｌｕエレメントとスプライス部位の間の距離を短縮する調査を行いたいと考えた。従って、Ａｌｕとスプライス部位の間の配列がすべて欠損した左側及び右側イントロン両方の欠損体を創出した。左側イントロンでは、すべてのポリピリミジントラクトを残した。右側イントロンでは、コンセンサススプライスドナー部位まですべてを欠損させた。別の約１００ｎｔを残して最低限度の欠損も設けた（左側イントロン内のポリピリミジントラクトについてほぼ同一の量を残した）。左側イントロンの欠損は十分に許容され、実際に、ｃｉｒｃＲＮＡレベル及びＧＦＰ発現の２〜３倍の増加が認められた。これは、距離の増加は有害であったという結果と一致する（図８、９Ａ〜９Ｆ）。しかし、右側イントロン内ですべて欠損するとｃｉｒｃＲＮＡ形成が不能となり、一方、右側イントロン内の欠損が最低限度であれば、欠損がない場合と等しいｃｉｒｃＲＮＡ及びＧＦＰレベルをもたらした。従って、右側イントロンの場合、ある最低限度の距離が必要とされる（図１１Ａ〜１１Ｆ）。
右側イントロン内の配列が重要であるか；すなわち、距離が増加したために、又は含まれている実際の配列が理由で、最低限度のコンストラクトが機能したのかについても試験した。従って、最低限度の欠損として、Ａｌｕとスプライス部位の間の距離を同一に保持するが、異なる配列（イントロンの異なる部分に由来）を含む、右側イントロン内の別の欠損を創出した。このコンストラクトは、オリジナルの最低限度の右側欠損と同様の挙動を示し、無欠損コンストラクトに等しいＧＦＰ及びｃｉｒｃＲＮＡレベルを有した（図１３Ａ〜１３Ｄ）。左側欠損及び最低限度の右側欠損はいずれも許容されるので、これら２つの欠損を合理的に組み合わせてダブル欠損コンストラクトを作成することを決定した。重要なこととして、このダブル欠損コンストラクトは、単一の欠損のいずれよりも良好であり、ｃｉｒｃＲＮＡ及びＧＦＰ発現量はオリジナルのコンストラクトよりも約５〜６倍高かった（図１２Ａ〜１２Ｆ）。これらの知見は、ｃｉｒｃＲＮＡ形成を支援することができる合成イントロンを設計するための根拠を提供する。
ダブル欠損コンストラクトを用いることで、ＨＩＰＫ３イントロンから、左側イントロン内の２２６ｎｔ及び右側イントロン内の４９７ｎｔに分割された合計７２３ヌクレオチドを欠損させることが可能であった。これらの結果に基づき、ｃｉｒｃＲＮＡ形成で使用されるその他のイントロンにおいて類似した欠損を設けることができると仮定した。ＥＰＨＢ４、ＺＫＳＣＡＮ１、及びラッカーゼ２イントロンの対内に欠損を含む合成イントロンの理論的デザインを示す（図１４Ａ〜Ｄ）。これらの合成イントロンは、ＡＡＶベクター内にその他のゲノムエレメントを組み込むためのより多くの空間を提供することに留意することもまた重要である。
まとめとして、これらの基礎的試験は、小型の合成バックスプライシングイントロンは、ｃｉｒｃＲＮＡを効率的に生み出すために生成可能であることを実証する。更に、挿入又は欠損を有する合成イントロンエレメントについて、その異なる順列の組み合わせが、ＡＡＶベクターを使用して異なるゲノムエレメントの多重化した発現を実現するために生成可能である。
これまでの記載は本発明の例証であり、その制限とは解釈されない。本発明は、下記の特許請求の範囲により定義され、特許請求の範囲の均等物も本明細書に含まれる。
＜代表的なイントロンのエレメント＞
配列１：ＺＫＳＣＡＮ１
左側
（配列番号１３）
右側
（配列番号１４）
配列２：ＨＩＰＫ３
左側
（配列番号１５）
右側
（配列番号１６）
＜欠損を含む合成イントロンの配列＞
＞ＨＩＰＫ３ΔＬ
（配列番号１７）
＞ＨＩＰＫ３ΔＲ
（配列番号１８）
＞ＺＫＳＣＡＮ１ΔＬ
（配列番号１９）
＞ＺＫＳＣＡＮ１ΔＲ
（配列番号２０）
＞ラッカーゼ２ΔＬ
（配列番号２１）
＞ラッカーゼ２ΔＲ
（配列番号２２）
＞ＥＰＨＢ４ΔＬ
（配列番号２３）
＞ＥＰＨＢ４ΔＲ
（配列番号２４）
＜代表的なＩＲＥＳエレメント＞
配列１：脳心筋炎ウイルスＩＲＥＳ
（配列番号２５）
配列２：ポリオウイルスＩＲＥＳ
（配列番号２６）
＜代表的なプロモーターエレメント＞
ＣＭＶプロモーター
（配列番号２７）
＜代表的なポリＡ配列エレメント＞
ＳＶ４０ ｐｏｌｙ−Ａ
（配列番号２８）
これまでの記載は本発明の例証であり、その制限とは解釈されない。本発明は、下記の特許請求の範囲により定義され、特許請求の範囲の均等物も本明細書に含まれる。

Claims (18)

  1. 共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）をコードする核酸分子であって、
    ａ）非コーディングＲＮＡ又は翻訳可能なｍＲＮＡに転写され得る、目的遺伝子と、
    ｂ）前記目的遺伝子に付随するイントロンエレメントであって、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡをもたらすために細胞スプライシング機構によりバックスプライスされる、イントロンエレメントと、
    ｃ）前記目的遺伝子から転写された翻訳可能なｍＲＮＡの翻訳を推進する配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）と、
    ｄ）５’非翻訳領域（ＵＴＲ）の内部且つ前記目的遺伝子に付随するイントロンエレメントの外部に位置するプロモーター領域と、
    ｅ）３’ＵＴＲの内部且つ前記目的遺伝子に付随するイントロンエレメントの外部に位置する翻訳制御領域と
    を含む核酸分子。
  2. （ｂ）のイントロンエレメントが、配列番号＿のうちのいずれかのヌクレオチド配列を、その任意の組み合わせ並びに任意の重複数及び／又は比で含む、請求項１に記載の核酸分子。
  3. （ｃ）のＩＲＥＳが、表５に記載されているウイルスＩＲＥＳ、表６に記載されている細胞ＩＲＥＳを、その任意の組み合わせ並びに任意の重複数及び／又は比で含む、請求項１に記載の核酸分子。
  4. （ｅ）の翻訳制御領域が、ポリアデニル化（ｐｏｌｙＡ）配列、及び／又はｃｉｒｃＲＮＡを安定化させる構造エレメントである、請求項１に記載の核酸分子。
  5. ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に挟まれた、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ゲノム。
  6. 請求項５に記載のＡＡＶゲノムを含むＡＡＶカプシド又は粒子。
  7. 請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子を含むＡＡＶカプシド又は粒子。
  8. 薬学的に許容される担体中に、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項５に記載のＡＡＶゲノム、及び／又は請求項６若しくは７に記載のＡＡＶカプシド若しくは粒子を含む組成物。
  9. 細胞内で、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、前記共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子が転写される条件下で、前記細胞中に請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子を導入することを含む方法。
  10. 細胞内で、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、前記共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子が転写される条件下で、前記細胞中に請求項５に記載のＡＡＶゲノムを導入することを含む方法。
  11. 細胞内で、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、前記共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子が転写される条件下で、前記細胞中に、請求項６又は７に記載のＡＡＶカプシド又は粒子を導入することを含む方法。
  12. 細胞内で、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、前記共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子が転写される条件下で、前記細胞中に、請求項８に記載の組成物を導入することを含む方法。
  13. 組織特異的及び／又は細胞特異的な方式で、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、前記共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子が発現する条件下で、組織及び／又は細胞を、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸分子と接触させることを含む方法。
  14. 組織特異的及び／又は細胞特異的な方式で、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、前記共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子が発現する条件下で、組織及び／又は細胞を、請求項５に記載のＡＡＶゲノムと接触させることを含む方法。
  15. 組織特異的及び／又は細胞特異的な方式で、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、前記共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子が発現する条件下で、組織及び／又は細胞を、請求項６又は７に記載のＡＡＶカプシド又は粒子と接触させることを含む方法。
  16. 組織特異的及び／又は細胞特異的な方式で、共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子を発現させる方法であって、前記共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子が発現する条件下で、組織及び／又は細胞を、請求項８に記載の組成物と接触させることを含む方法。
  17. 前記共有結合的に閉環した環状ＲＮＡ分子が、タンパク質をコードする治療用ｍＲＮＡ分子、ＲＮＡ発現停止分子、ゲノムエレメントを標的とすることができるガイドＲＮＡ分子、ＲＮＡ転写物を標的とすることができるガイドＲＮＡ分子、ｔＲＮＡ分子、長鎖非コーディングＲＮＡ分子、アンチセンスＲＮＡ分子、又は任意のこれらの組み合わせである、請求項９〜１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記細胞及び／又は組織が哺乳動物に由来するものである、請求項９〜１７のいずれか１項に記載の方法。
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