KR20230135093A - T-세포를 표적화하는 aav 벡터 - Google Patents

T-세포를 표적화하는 aav 벡터 Download PDF

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KR20230135093A
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제임스 케넌 스미스
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징코 바이오웍스, 인크.
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Abstract

본 개시내용은 변이체 AAV 캡시드 단백질 및 AAV 캡시드 및 이를 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다. 본원에 기재된 바이러스 벡터는 고유 AAV 캡시드 서열과 비교하여, T-세포와 같은 관심 있는 표적 세포에서 증가된 형질도입을 가질 수 있다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 바이러스 벡터 및 바이러스 캡시드를 치료를 필요로 하는 세포 또는 환자에게 투여하는 방법을 제공한다.

Description

T-세포를 표적화하는 AAV 벡터
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 1월 14일자로 출원된 미국 가출원 제63/137,497호의 우선권의 이익을 주장하고, 이의 개시내용은 모든 목적을 위해 이의 전문이 참조로 포함된다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 아데노 관련 바이러스(AAV)로부터의 변이체 캡시드 단백질 및 바이러스 캡시드 및 이를 포함하는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 생체내 및/또는 생체외에서 T-세포의 증진된 세포 형질도입의 표현형을 부여하기 위해 바이러스 벡터에 혼입될 수 있는 변이체 AAV 캡시드 단백질 및 이를 포함하는 AAV 캡시드에 관한 것이다.
전자적으로 제출된 텍스트 파일의 기재
이와 함께 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 이들의 전문이 참조로 포함된다: 서열목록의 컴퓨터 판독 가능한 포맷 카피물(파일명: STRD_022_01WO_Sequence_Listing.txt, 2022년 1월 13일자로 기록된 날짜, 파일 크기 ~163.4 킬로바이트).
아데노 관련 바이러스(AAV)는 파르보비리대(Parvoviridae) 과의 데펜도바이러스(Dependovirus) 속에 속하는 작은 단일 가닥 DNA 바이러스이다. AAV는 수많은 세포 및 조직 유형을 감염시키는 이들의 능력, 이들의 병원성 결여, 이들의 낮은 면역원성 및 비분할 세포를 효과적으로 형질도입하는 이들의 능력으로 인해 유전자 치료요법을 위한 유망한 바이러스 벡터이다. 각각의 공지된 AAV 혈청형은 특정 세포 유형을 감염시키는 차등적인 능력을 갖고 있다.
AAV를 사용하여 T-세포를 표적화하는 것이 관심 대상이다. 예를 들어, T-세포를 표적화하는 AAV는 T-세포 고갈을 예방, 제한 및/또는 역전시키기 위한 유전자 치료요법 방법에 사용될 수 있다. T-세포 고갈은 많은 만성 감염 및 암 동안에 발생하는 T 세포 기능부전 상태이고, 또한 CAR-T 치료요법의 효과를 감소시키는 것으로 나타났다. 그러나 AAV는 일반적으로 T-세포를 높은 수준으로 형질도입하지 않는다.
따라서, 당업계에서는 증진된 형질도입 효율로 T-세포를 표적화할 수 있는 개선된 AAV 벡터가 필요하다.
개요
본 개시내용은 하나 이상의 형질도입 관련 펩타이드, 및 AAV 캡시드를 포함하는 아데노 관련 바이러스(AAV) 캡시드 단백질 및 이를 포함하는 바이러스 벡터에 관한 것이다. 본원에 기재된 형질도입 관련 펩타이드는 AAV 벡터의 T-세포와 같은 목적하는 세포 유형으로의 세포 형질도입을 증진시킬 수 있다.
본 개시내용은 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 제공하고, 여기서 캡시드 단백질은 서열번호 17 내지 23 중 어느 하나의 서열을 갖는 형질도입 관련 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 형질도입 관련 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 454-460에 상응하는 아미노산을 대체한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 및 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용은 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제공하고, 여기서, 캡시드 단백질은 서열번호 1의 서열을 포함하고, 여기서, 서열번호 1의 아미노산 454-460은 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(서열번호 24)을 포함하는 형질도입 관련 펩타이드에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, X1은 G가 아니고, X2는 S가 아니고, X3은 A가 아니고, X4는 Q가 아니고, X5는 N이 아니고, X6은 K가 아니고/아니거나 X7은 D가 아니다. 일부 구현예에서, X1은 H, M, A, Q, V, 또는 S이다. 일부 구현예에서, X2는 A 또는 T이다. 일부 구현예에서, X3은 P 또는 T이다. 일부 구현예에서, X4는 R 또는 D이다. 일부 구현예에서, X5는 V, Q, C, S, 또는 D이다. 일부 구현예에서, X6은 E, A 또는 P이다. 일부 구현예에서, X7은 E, G, N, T 또는 A이다. 일부 구현예에서, X1은 H이고, X2는 A이고, X3은 P이고, X4는 R이고, X5는 V이고, X6은 E이고, X7은 E이다. 일부 구현예에서, X1은 M이고, X2는 A이고, X3은 P이고, X4는 R이고, X5는 Q이고, X6은 E이고, X7은 G이다. 일부 구현예에서, X1은 H이고, X2는 T이고, X3은 T이고, X4는 D이고, X5는 C이고, X6은 A이고, X7은 N이다. 일부 구현예에서, X1은 A이고, X2는 A이고, X3은 P이고, X4는 R이고, X5는 S이고, X6은 E이고, X7은 T이다. 일부 구현예에서, X1은 Q이고, X2는 A이고, X3은 P이고, X4는 R이고, X5는 Q이고, X6은 E이고, X7은 G이다. 일부 구현예에서, X1은 V이고, X2는 A이고, X3은 P이고, X4는 R이고, X5는 D이고, X6은 P이고, X7은 A이다. 일부 구현예에서, X1은 S이고, X2는 A이고, X3은 P이고, X4는 R이고, X5는 S이고, X46은 E이고, X7은 N이다.
일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 1과 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 1과 약 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 및 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.
본 개시내용은 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV 벡터를 제공하고, 여기서 캡시드 단백질은 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 형질도입 관련 펩타이드를 포함하고, 여기서 형질도입 관련 펩타이드는 서열번호 1에 대해 아미노산 454-460을 대체한다. 일부 구현예에서, 형질도입 관련 펩타이드는 서열번호 17-23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다.
본 개시내용은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 어느 하나의 서열을 갖는 재조합 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 및 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산은 DNA 서열이다. 일부 구현예에서, 핵산은 RNA 서열이다. 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산 중 어느 하나를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 본 개시내용은 본원에 기재된 핵산 중 어느 하나 또는 본원에 기재된 발현 벡터 중 어느 하나를 포함하는 세포를 추가로 제공한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 AAV 벡터 중 어느 하나는 캡시드 단백질에 의해 캡슐화된 카고 핵산을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 핵산은 치료학적 단백질 또는 치료학적 RNA를 인코딩한다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터와 비교하여 세포로의 증가된 형질도입을 나타낸다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 T-세포이다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터와 비교하여 T-세포의 핵으로의 증가된 형질도입을 나타낸다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터와 비교하여 T-세포의 시토졸로의 증가된 형질도입을 나타낸다.
본 개시내용은 본원에 기재된 재조합 AAV 벡터 중 어느 하나, 본원에 기재된 핵산 중 어느 하나, 본원에 기재된 발현 벡터 중 어느 하나 또는 본원에 기재된 세포 중 어느 하나를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 본원에 기재된 세포 중 어느 하나 또는 본원에 기재된 재조합 AAV 벡터 중 어느 하나 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 추가로 제공한다.
본 개시내용은 본원에 기재된 AAV 벡터 중 어느 하나와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, AAV 벡터를 세포 내로 전달하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 세포를 접촉시키는 것은 시험관내, 생체외 또는 생체내 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 T-세포이다. 본 개시내용은 유효량의 본원에 기재된 AAV 벡터 중 어느 하나를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 본원에 기재된 AAV 벡터 중 어느 하나와 생체외 접촉된 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 대상체는 포유류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 사람이다. 본 개시내용은 약물로서 사용하기 위해 본원에 기재된 AAV 벡터 중 어느 하나를 제공한다. 본 개시내용은 또한 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법에 사용하기 위한 본원에 기재된 AAV 벡터 중 어느 하나를 제공한다.
이들 및 다른 구현예는 하기 제시된 발명의 상세한 설명에서 더 자세히 다룬다.
도 1은 야생형 AAV6와 비교하여 변이체 캡시드를 포함하는 다양한 AAV 벡터에 대해 실시예 2에 기재된 제조 방법을 사용하여 수득된 총 벡터 게놈(vg) 용적 측정 수율을 보여준다.
도 2는 야생형 AAV6 또는 표시된 AAV6 캡시드 변이체를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 T-세포의 현미경 분석으로부터의 이미지를 보여준다. 각각의 AAV 벡터는 GFP 전이유전자를 패키징하였다. 나타낸 바와 같이 상이한 감염 다중도(MOI)를 사용하여 AAV 벡터로 세포를 형질도입한 후 이미지를 수득하였다.
도 3a-3c는 야생형 AAV6, 또는 변이체 캡시드를 포함하는 표시된 AAV로 형질도입된 T-세포의 유세포 분석 결과를 보여주고, 각각은 GFP 전이유전자를 패키징한다. 도 3a는 시험된 세포 샘플의 크기 및 입상(granularity)(즉, 전방 산란 및 측면 산란)을 보여주고, 이로부터 관심 있는 세포 집단(다이어그램에서 원으로 나타낸)이 동정되었다. 도 3b는 분석을 위해 선택된, 단지 세포 집단에 대한 크기 및 입상을 보여준다. 도 3c는 관심 있는 세포 집단에 대해 측정된 형광 (FITC) 신호를 보여준다. 야생형 AAV6로 형질도입된 세포와 비교하여 STRD-207 캡시드를 포함하는 AAV 벡터로 형질도입된 세포에서 형광성이 증가되었다.
도 4는 야생형 AAV6 또는 나타낸 바와 같은 캡시드 변이체를 포함하는 각각의 AAV로 수행된 유세포분석 실험으로부터 수득된 GFP 양성 T-세포 퍼센트의 플롯을 보여준다. T-세포는 2개의 상이한 사람 공여자 (공여자 11 및 공여자 12)로부터 유래한다. 나타낸 바와 같이 상이한 MOI를 사용하였다(공여자 12 T-세포의 경우 10,000, 5,000 및 2,500 및 공여자 11 T-세포의 경우 15,000, 7,500 및 3,750).
도 5a 및 도 5b는 표 1에 기재된 바와 같이 T-세포 형질도입을 위한 3 라운드의 진화 및 선택 후 활성화된 T-세포의 핵 분획(도 5a) 및 시토졸 분획(도 5b)으로부터 수득된 변이체 캡시드를 포함하는 개별 AAV의 단리물을 나타내는 버블 플롯이다. 각각의 버블은 각각의 라이브러리에서 해당 변이체에 대한 판독 수에 비례하는 버블의 반경을 갖는 별개의 캡시드 단백질 아미노산 서열을 나타낸다. y-축은 절대 판독수를 나타낸다. 데이터는 용이한 가시화를 위해 x축을 따라 분산되어 있다. 서열 분석을 위해 우성 단리물을 선택하였다.
도 6은 T-세포의 핵 분획 또는 시토졸 분획이 풍부한 AAV 벡터에서 동정된 형질도입 관련 펩타이드의 서열을 보여준다. 이들 형질도입 관련 펩타이드는 캡시드 단백질의 아미노산 464-456에 위치하였고, 여기서 아미노산 번호는 야생형 AAV6(서열번호 1)에 상응한다. 도 6에 나타낸 서열은 상부에서 하부 순으로 서열번호 17-23에 상응한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어들은 본 출원이 속한 분야의 숙련가가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원의 발명의 상세한 설명에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 기재하기 위한 것이고 한정하려는 의도는 아니다.
본원에 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 논문, GenBank 또는 기타 승인 번호 및 기타 참조자료는 이들의 전문이 참조로 포함된다.
본 개시내용 및 첨부된 청구범위에서 AAV 캡시드 단백질 내의 모든 아미노산 위치의 지정은 VP1 캡시드 서브유닛 넘버링에 관한 것이다. AAV cap 유전자에 삽입되는 경우 본원에 기재된 변형이 VP1, VP2 및/또는 VP3 캡시드 서브유닛에서 변형을 초래할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 대안적으로, 캡시드 서브유닛은 캡시드 서브유닛(VP1, VP2, VP3, VP1 + VP2, VP1 + VP3, 또는 VP2 +VP3) 중 1개 또는 2개에서만 변형을 달성하기 위해 독립적으로 발현될 수 있다.
정의
다음 용어는 본원의 설명 및 첨부된 청구범위에서 사용된다.
단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수형도 포함하도록 의도된다.
추가로, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 양 또는 길이, 투여량, 시간, 온도 등과 같은 측정가능한 값을 언급할 때 본원에서 사용되는 용어 "약"은 지정된 양의 ±20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5% 또는 심지어 ± 0.1%를 포함하는 것으로 의미된다.
또한 본원에 사용되는 바와 같이, "및/또는"은 연관된 나열된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합뿐만 아니라 대안적("또는")으로 해석될 때 조합의 결여를 지칭하고 포함한다.
문맥상 달리 나타내지 않는 한, 본원에 기재된 다양한 특징이 임의의 조합으로 사용될 수 있음을 구체적으로 의도한다.
더욱이, 본 개시내용은 또한 일부 구현예에서 본원에 기재된 임의의 특성 또는 특성의 조합이 제외되거나 생략될 수 있음을 고려한다. 추가 설명을 위해, 예를 들어 본원 명세서가 특정 아미노산이 A, G, I, L 및/또는 V로부터 선택될 수 있는 것으로 나타내면, 상기 용어는 또한 아미노산이 이들 아미노산의 임의의 서브세트, 예를 들어 A, G, I 또는 L; A, G, I 또는 V; A 또는 G; 단지 L; 등으로부터 선택될 수 있고, 이는 그러한 각각의 하위 조합이 본원에 명시적으로 제시된 바와 같와 같다. 더욱이, 그러한 용어는 또한 하나 이상의 특정된 아미노산이 배제될 수 있음을 나타낸다. 예를 들어, 일부 구현예에서 아미노산은 A, G 또는 I가 아니고; A가 아니고; G 또는 V 가 아닌 것 등과 같이, 이는 가능한 배제 조항 각각이 여기에 명시적으로 제시된 것과 같다.
본원에서 사용되는 용어 "감소시킨다(reduce)", "감소시킨다(reduces)", "감소" 및 유사한 용어는 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 35%, 약 50%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 97% 이상의 감소를 의미한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "증진시킨다(enhance)", "증진시킨다(enhances)", "증진" 및 유사한 용어는 적어도 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 35%, 약 50%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 150%, 약 200%, 약 300%, 약 400%, 약 500% 이상의 증가를 지적한다.
본원에서 사용되는 용어 "파보바이러스"는 자율적으로 복제하는 파보바이러스 및 데펜도바이러스를 포함하는 파보비리대 과를 포함한다. 자율 파보바이러스는 프로토파보바이러스(Protoparvovirus), 에리트로파보바이러스(Erythroparvovirus), 보카파바이러스(Bocaparvirus) 및 덴소바이러스 속 아과의 구성원을 포함한다. 예시적인 자율 파보바이러스는 마우스의 미누트(minute) 바이러스, 소 파보바이러스, 개 파보바이러스, 닭 파보바이러스, 고양이 범백혈구감소증 바이러스, 고양이 파보바이러스, 거위 파보바이러스, H1 파보바이러스, 사향 오리 파보바이러스, B19 바이러스, 및 현재 알려져 있거나 이후에 발견되는 임의의 다른 자율 파보바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 다른 자율 파보바이러스는 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어 문헌(BERNARD N. FIELDS 등, VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers; Cotmore 등 Archives of Virology DOI 10.1007/s00705-013-1914-I))을 참조한다. 용어 "대상체", "개체" 및 "환자"는 본원에서 포유류와 같은 척추동물을 지칭하기 위해 상호 교환적으로 사용된다. 상기 포유류는 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 돼지, 양, 말, 비-사람 영장류(예를 들어, 시노몰구스 몽키, 침팬지) 또는 사람일 수 있다. 생체 내에서 수득되거나 시험관 내에서 배양된 대상체의 조직, 세포 또는 이의 유도체도 포함된다. 사람 대상체는 성인, 십대, 어린이(2세 내지 14세), 유아(1개월 내지 24개월) 또는 신생아(1개월 이하)일 수 있다. 일부 구현예에서, 성인은 약 65세 이상 또는 약 60세 이상의 노인이다. 일부 구현예에서, 대상체는 임신한 여성 또는 임신을 하고자 하는 여성이다. 일부 구현예에서, 대상체는 본원에 기재된 방법을 "필요로 한다".
본원에서 사용되는 용어 "아데노 관련 바이러스"(AAV)는 지금 알려져 있거나 이후 발견된 AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3(유형 3A 및 3B 포함), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, AAV 유형 12, AAV 유형 13, AAV 유형 rh32.33, AAV 유형 rh8, AAV 유형 rh10, AAV 유형 rh74, AAV 유형 hu.68, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 뱀 AAV, 비어디드 드래곤(bearded dragon) AAV, AAV2i8, AAV2g9, AAV-LK03, AAV7m8, AAV Anc80, AAV PHP.B 및 임의의 기타 AAV를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 문헌(BERNARD N. FIELDS 등, VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers))을 포함한다. 다수의 AAV 혈청형 및 클레이드가 동정되었다(참조: 예를 들어, Gao 등, (2004) J. Virology 78:6381-6388; Moris 등, (2004) Virology 33-:375-383; 및 표 2).
본원에서 사용되는 용어 "키메라 AAV"는 AAV의 2개 이상의 상이한 혈청형으로부터 유래된 영역, 도메인 및/또는 개별 아미노산을 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 AAV를 지칭한다. 일부 구현예에서, 키메라 AAV는 제1 AAV 혈청형으로부터 유래된 제1 영역 및 제2 AAV 혈청형으로부터 유래된 제2 영역으로 구성된 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 AAV는 제1 AAV 혈청형으로부터 유래된 제1 영역, 제2 AAV 혈청형으로부터 유래된 제2 영역, 및 제3 AAV 혈청형으로부터 유래된 제3 영역으로 구성된 캡시드 단백질을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메라 AAV는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, 및/또는 AAV12 중 2개 이상으로부터 유래된 영역, 도메인, 개별 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 키메라 AAV는 하기 나타낸 바와 같은 제1 및 제2 AAV 혈청형으로부터의 영역, 도메인 및/또는 개별 아미노산을 포함할 수 있고(표 1), 여기서 AAVX+Y는 AAVX 및 AAVY로부터 유래된 서열을 포함하는 키메라 AAV를 나타낸다.
표 1: 키메라 AAV
하나의 캡시드 단백질에 다수의 AAV 혈청형으로부터의 개별 아미노산 또는 영역을 포함함으로써, 다수의 AAV 혈청형으로부터 개별적으로 유래된 다수의 목적하는 성질을 갖는 캡시드 단백질이 수득될 수 있다.
AAV 및 자율 파보바이러스의 다양한 혈청형의 게놈 서열 뿐만 아니라 고유 말단 반복체(TR), Rep 단백질 및 캡시드 서브유닛의 서열은 당업계에 공지되어 있다. 상기 서열은 문헌 또는 GenBank와 같은 공개된 데이터베이스에서 발견될 수 있다. 예를 들어, GenBank 승인 번호 NC_002077, NC_001401, NC_001729, NC_001863, NC_001829, NC_001 862, AAB95450.1, NC_000883, NC_001701, NC_001510, NC_006152, NC_006261, AF063497, U89790, AF043303, AF028705, AF028704, J02275, J01901, J02275, X01457, AF288061, AH009962, AY028226, AY028223, NC_001358, NC_001540, AF513851, AF513852, AY530579를 참조하고; 이의 개시내용은 파보바이러스 및 AAV 핵산 및 아미노산 서열을 교시하기 위해 본원에 참조로 포함된다. 또한 예를 들어, 문헌(Srivistava 등, (1983) J. Virology 45:555; Chiorini 등, (1998) J Virology 71:6823; Chiorini 등, (1999) J. Virology 73: 1309; Bantel-Schaal 등, (1999) J Virology 73:939; Xiao 등, (1999) J Virology 73:3994; Muramatsu 등, (1996) Virology 221:208; Shade 등, (1986) J. Virol. 58:921; Gao 등, (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854; Moris 등, (2004) Virology 33:375-383; 국제 특허 공개 WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; 및 미국 특허 번호 6,156,303; 이의 개시내용은 파보바이러스 및 AAV 핵산 및 아미노산 서열을 교시하기 위해 본원에 참조로 인용됨)을 참조한다. 또한 표 2를 참조한다. 자율 파보바이러스 및 AAV의 캡시드 구조는 문헌(참조: BERNARD N. FIELDS 등, VIROLOGY, volume 2, chapters 69 & 70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers))에서 보다 상세히 기재된다. 또한 AAV2(Xie 등, (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99: 10405-10), AAV9 (DiMattia 등, (2012) J. Virol. 86:6947-6958), AAV8 (Nam 등, (2007) J. Virol. 81: 12260-12271), AAV6 (Ng 등, (2010) J. Virol. 84:12945-12957), AAV5 (Govindasamy 등 (2013) J. Virol. 87, 11187-11199), AAV4 (Govindasamy 등 (2006) J. Virol. 80:11556-11570), AAV3B (Lerch 등, (2010) Virology 403:26-36), BPV(Kailasan 등, (2015) J. Virol. 89:2603-2614) 및 CPV (Xie 등, (1996) J. Mol. Biol. 6:497-520 및 Tsao 등, (1991) Science 251:1456-64)의 결정 구조의 기재를 참조한다.
표 2:
재조합 AAV(rAAV) 벡터는 바이러스 생산 세포주를 사용하여 배양물에서 생산될 수 있다. 용어 "바이러스 생산 세포", "바이러스 생산 세포주" 또는 "바이러스 생산자 세포"는 바이러스 벡터를 생산하는 데 사용되는 세포를 지칭한다. HEK293 및 239T 세포는 일반적인 바이러스 생산 세포주이다. 하기 표 8은 다양한 바이러스 벡터에 대한 예시적인 바이러스 생산 세포주를 열거한다. rAAV를 생산하려면 전형적으로 세포에 3가지 요소가 있어야 한다: 1) AAV 역위 말단 반복체(ITR) 서열, 2) AAV rep 및 cap 유전자, 및 3) 헬퍼 바이러스 단백질 서열로 플랭킹된 전이유전자. 이들 3개의 요소는 하나 이상의 플라스미드에 제공될 수 있고, 세포 내로 형질감염 또는 형질도입될 수 있다.
표 8: 예시적인 바이러스 생산 세포주
본원에서 사용되는 용어 "다중 감염도" 또는 "MOI"는 세포와 접촉하는 비리온의 수를 지칭한다. 예를 들어, 배양된 세포는 세포 당 약 1 x 102 내지 약 1 x 105 비리온 범위의 MOI로 AAV와 접촉될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "형질도입"은 바이러스 벡터에 의해 핵산(예를 들어, 전이유전자)이 세포 내로 도입되는 과정을 지칭한다. 생체내 또는 생체외에서 증진된 세포 형질도입의 표현형을 부여하기 위해 바이러스 벡터에 혼입될 수 있는 변형된 AAV 캡시드 단백질(예를 들어, 변이체 캡시드 단백질) 및 이를 포함하는 캡시드가 본원에 기재된다. 본원에서 사용되는 "증진된 형질도입", "증진된 세포 형질도입" 및 유사한 용어는 형질도입이 약 1.5배에서 약 100배 또는 그 이상으로 증가하는 것을 지칭할 수 있다. 예를 들어, 형질도입은 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배 이상까지 증가될 수 있다. 변형된 AAV(예를 들어, 캡시드 변이체를 포함하는 AAV)의 형질도입은 야생형 또는 고유 AAV 벡터에 비해 증진될 수 있다. 일부 구현예에서, 형질도입 관련 펩타이드를 포함하는 AAV 벡터의 형질도입은 그 외에는 동일하지만 형질도입 관련 펩타이드가 결여된 AAV 벡터에 비해 증진될 수 있다.
용어 "전이유전자"는 세포의 형질도입에 사용되는 임의의 핵산 서열을 지칭하고, 이는 생체외에서 유지되는 세포 또는 유기체 내의 세포일 수 있다. 전이유전자는 코딩 서열, 비코딩 서열, cDNA, 유전자 또는 이의 단편 또는 일부, 게놈 서열, 조절 요소 등일 수 있다. 유전자전이 식물 또는 유전자전이 동물과 같은 "유전자전이" 유기체는 전이유전자가 전달 또는 도입되고 전이유전자가 유전자전이 유기체에서 발현되어 생성물을 생산할 수 있는 유기체이고, 이의 존재는 유기체에서 효과(예를 들어, 치료학적 또는 유익한 효과) 및/또는 표현형(예를 들어, 목적하는 또는 변경된 표현형)을 부여할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "향성"은 특정 세포 또는 조직으로의 바이러스의 우선적 진입, 임의로 세포에서 바이러스 게놈에 의해 운반되는 서열(들)의 발현(예를 들어, 전사 및 임의로 번역), 예를 들어, 관심 있는 이종성 핵산(들)의 발현이 이어진다.
당업자는 바이러스 게놈으로부터의 이종 핵산 서열의 전사가 예를 들어 유도성 프로모터 또는 그렇지 않으면 조절된 핵산 서열에 대한 트랜스-작용 인자의 부재 하에 개시되지 않을 수 있음을 인지할 것이다. rAAV 게놈의 경우, 바이러스 게놈으로부터의 유전자 발현은 안정하게 통합된 프로바이러스, 통합되지 않은 에피좀, 및 바이러스가 세포 내에서 취할 수 있는 임의의 다른 형태로부터 유래될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "전신성 향성" 및 "전신성 형질도입"(및 등가 용어)은 본 개시내용의 바이러스 캡시드 또는 바이러스 벡터가 신체 전체의 조직(예를 들어, 뇌, 폐, 골격근, 심장, 간, 콩팥 및/또는 췌장))에 대해 각각 향성을 나타내거나 이들을 형질도입함을 나타낸다. 일부 구현예에서, 근육 조직(예를 들어, 골격근, 횡경막 및 심장근)의 전신 형질도입이 관찰된다. 일부 구현예에서, 골격근 조직의 전신 형질도입이 달성된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본질적으로 신체 전체의 모든 골격근이 형질도입된다(형질도입의 효율은 근육 유형에 따라 다양할 수 있음). 일부 구현예에서, 사지 근육, 심장 근육 및 횡경막 근육의 전신 형질도입이 달성된다. 임의로, 바이러스 캡시드 또는 바이러스 벡터는 전신 경로(예를 들어, 정맥내, 관절내 또는 림프내와 같은 전신 경로)를 통해 투여된다.
대안적으로, 일부 구현예에서, 캡시드 또는 바이러스 벡터는 국소적으로(예를 들어, 발바닥으로, 근육내로, 피내로, 피하로, 국소적으로) 전달된다.
달리 나타내지 않는 한, "효율적인 형질도입" 또는 "효율적인 향성" 또는 유사한 용어는 적합한 대조군(예를 들어, 각각 대조군의 형질도입 또는 향성의 적어도 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 이상)을 참조로 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 T-세포, 골격근, 심근, 횡격막 근육, 췌장(β-섬 세포 포함), 비장, 위장관(예를 들어, 상피 및/또는 평활근), 중추 신경계, 폐, 관절 세포 및/또는 콩팥의 세포에 대해 효율적으로 형질도입하거나 효율적인 향성을 갖는다. 적합한 대조군은 목적하는 향성 프로필을 포함한 다양한 인자에 따라 달라진다. 일부 구현예에서, 적합한 대조군은 야생형 또는 고유 바이러스이다.
유사하게 바이러스가 표적 조직 또는 유사한 용어에 대해 "효율적으로 형질도입하지 않는지" 또는 "효율적인 향성이 없는지" 여부는 적합한 대조군을 참조하여 결정할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 간, 콩팥, 생식선 및/또는 생식 세포에 대해 효율적으로 형질도입하지 않는다(즉, 효율적인 향성을 갖지 않는다). 일부 구현예에서, 조직(들)(예를 들어, 간)의 바람직하지 않은 형질도입은 목적하는 표적 조직(들)(예를 들어, 골격근, 횡격막근, 심근 및/또는 중추신경계 세포)의 형질도입 수준의 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 1% 이하, 0.1% 이하이다.
본원에서 사용되는 용어 "폴리펩타이드"는 달리 나타내지 않는 한 펩타이드 및 단백질 둘다를 포함한다.
"폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드 염기의 서열이고, RNA, DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드 서열(천연적으로 존재하는 및 천연적으로 존재하지 않는 뉴클레오타이드 둘다 포함)일 수 있지만, 대표적인 구현예에서는 단일 또는 이중 가닥 DNA 서열이다.
본원에 사용된 "단리된" 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, "단리된 DNA" 또는 "단리된 RNA")는 천연적으로 발생한 유기체 또는 바이러스의 다른 성분, 예를 들어, 세포 또는 바이러스 구조 성분 또는 다른 폴리펩타이드 또는 통상적으로 폴리뉴클레오타이드와 회합된 것으로 발견되는 핵산 중 적어도 일부로부터 적어도 부분적으로 분리된 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 대표적인 구현예에서 "단리된" 뉴클레오타이드는 출발 물질과 비교하여 적어도 약 10배, 약 100배, 약 1000배, 약 10,000배 이상 풍부하다.
또한, "단리된" 폴리펩타이드는 천연적으로 발생한 유기체 또는 바이러스의 다른 성분, 예를 들어, 세포 또는 바이러스 구조 성분 또는 다른 폴리펩타이드 또는 통상적으로 폴리펩타이드와 회합된 것으로 발견되는 핵산 중 적어도 일부로부터 적어도 부분적으로 분리된 폴리펩타이드를 의미한다. 일부 구현예에서 "단리된" 폴리펩타이드는 출발 물질과 비교하여 적어도 약 10배, 약 100배, 약 1000배, 약 10,000배 이상 풍부하다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 바이러스 벡터를 "단리하다" 또는 "정제하다"(또는 문법적으로 등가물)는 바이러스 벡터가 출발 물질의 다른 성분 중 적어도 일부로부터 적어도 부분적으로 분리된다는 것을 의미한다. 일부 구현예에서 "단리된" 또는 "정제된" 바이러스 벡터는 출발 물질과 비교하여 적어도 약 10배, 약 100배, 약 1000배, 약 10,000배 이상 풍부하다.
본원에서 사용되는 용어 "형질도입-관련 펩타이드"는 AAV 벡터의 임의의 세포로의 형질도입을 변경하기 위해 AAV 벡터에 통합될 수 있는 짧은 아미노산 서열을 지칭한다. 형질도입 관련 펩타이드는 AAV 벡터의 형질도입에 임의의 효과를 미칠 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 형질도입 관련 펩타이드는 AAV 벡터의 관심 있는 표적 세포로의 형질도입을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 형질도입 관련 펩타이드는 표적화되지 않은 세포로의 AAV 벡터의 형질도입을 감소시킨다. 형질도입 관련 펩타이드는 기존의 AAV 캡시드 서열에 삽입될 수 있거나(즉, 서열에 아미노산의 순 첨가를 생성하기 위해), 또는 AAV 캡시드 서열의 기존 부분을 대체할 수 있다(즉, 순 변화를 생성하지 않음, 또는 서열 내의 아미노산 수의 감소).
"치료학적 폴리펩타이드" 또는 "치료학적 단백질"은 세포 또는 대상체에서 단백질의 부재 또는 결함으로 인한 증상을 완화, 감소, 예방, 지연 및/또는 안정화할 수 있는 폴리펩타이드 및/또는 다르게는 개체에 이득, 예를 들어 항암 효과 또는 이식체 생존 가능성의 개선을 부여하는 폴리펩타이드이다.
용어 "치료한다", "치료하는" 또는 "의 치료"(및 이의 문법적 변형)는 대상체 병태의 중증도가 감소되고, 적어도 부분적으로 개선되거나 안정화되고/되거나 적어도 하나의 임상적 증상에서 일부 경감, 완화, 감소 또는 안정화가 달성되고/되거나 질환 또는 장애의 진행이 지연됨을 의미한다. 용어 "대상체" 및 용어 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 "예방한다", "예방하는" 및 "예방"(및 이의 문법적 변형)은 대상체에서 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 발병의 예방 및/또는 지연 및/또는 본 개시내용의 방법이 부재인 것과 비교하여 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 발병 중증도 감소를 지칭한다. 예를 들어, 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 완전한 부재와 같이 예방이 완료될 수 있다. 예방은 또한 부분적일 수 있어서, 대상체에서의 질환, 장애 및/또는 임상 증상(들)의 발생 및/또는 발병 개시의 중증도는 본 개시내용의 부재에서 발생하는 것보다 적다.
본원에 사용된 "치료학적 유효량"은 질환, 또는 질환 또는 장애의 임상적 증상 중 적어도 하나를 치료하기 위해 대상체에게 투여되는 경우 질환 또는 이의 증상에 대한 상기 치료에 영향을 미치기에 충분한 양을 지칭한다. "치료학적 유효량"은 예를 들어 질환 및/또는 질환의 증상, 질환의 중증도 및/또는 질환 또는 장애의 증상, 환자의 연령, 체중 및/또는 건강 및 처방 의사의 판단에 따라 다양할 수 있다. 임의의 소정의 경우에 적당한 양은 당업자에게 자명할 수 있거나 통상적인 실험에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "바이러스 벡터", "벡터" 또는 "유전자 전달 벡터"는 핵산 전달 비히클로서 기능하고 비리온 내 패키징된 벡터 게놈(예를 들어, 바이러스 DNA[vDNA])을 포함하는 바이러스(예를 들어, AAV) 입자를 지칭한다. 대안적으로, 일부 상황에서 "벡터"라는 용어는 벡터 게놈/vDNA만을 지칭하는 데 사용될 수 있다.
"아데노 관련 바이러스 벡터" 또는 "AAV 벡터"는 전형적으로 AAV 캡시드, 및 AAV 캡시드에 의해 캡슐화된 핵산(예를 들어, 전이유전자를 포함하는 핵산)을 포함한다. "AAV 캡시드"는 T=1 20면체 대칭으로 회합되고 배열된 약 60개의 "AAV 캡시드 단백질"(본원에서" AAV 캡시드 단백질 서브유닛" 또는 "캡시드 단백질"로 상호교환적으로 지칭됨)을 포함하는 구형에 가까운 단백질 쉘이다. 본원에 기재된 AAV 벡터의 AAV 캡시드는 다수의 AAV 캡시드 단백질을 포함한다. AAV 벡터가 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 것으로 기재된 경우, AAV 벡터는 AAV 캡시드를 포함하고, 여기서 AAV 캡시드는 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 용어 "바이러스성-유사 입자" 또는 "바이러스-유사 입자"는 전달 카세트 또는 전이유전자를 포함하는 임의의 벡터 게놈 또는 핵산을 포함하지 않는 단백질 캡시드를 지칭한다. 용어 "AAV 벡터", "AAV 캡시드" 및 "AAV 캡시드 단백질"은 때때로 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 문맥에 기초하여, 당업자는 사용된 특정 용어의 의미를 쉽게 추론할 수 있을 것이다.
일부 구현예에서, AAV 벡터는 "전달 카세트"를 포함하는 핵산, 즉 AAV 벡터에 의해 세포로 전달될 수 있는 하나 이상의 서열을 포함하는 핵산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 자기-상보적(즉, 이중 가닥)이다. 일부 구현예에서, 핵산은 자기-상보적(즉, 단일 가닥)이지 않다.
"rAAV 벡터 게놈" 또는 "rAAV 게놈"은 하나 이상의 이종 핵산 서열을 포함하는 AAV 게놈(즉, vDNA)이다. rAAV 벡터는 일반적으로 바이러스를 생성하기 위해 시스의 말단 반복체(들)(TR(들))만을 필요로 한다. 다른 모든 바이러스 서열은 불필요하고 트랜스로 공급될 수 있다(참조: Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97). 전형적으로, rAAV 벡터 게놈은 벡터에 의해 효율적으로 패키징될 수 있는 전이유전자의 크기를 최대화하기 위해 하나 이상의 TR 서열만을 보유할 것이다. 구조적 및 비구조적 단백질 코딩 서열은 트랜스로(예를 들어, 플라스미드와 같은 벡터로부터, 또는 패키징 세포 내로 서열을 안정적으로 통합함으로써) 제공될 수 있다. 구현예에서, rAAV 벡터 게놈은 적어도 하나의 TR 서열(예를 들어, AAV TR 서열), 임의로 2개의 TR(예를 들어, 2개의 AAV TR)을 포함하고, 이는 전형적으로 벡터 게놈의 5' 및 3' 말단에 있고 이종 핵산을 플랭킹하지만 이에 인접할 필요는 없다. TR은 서로 동일하거나 상이할 수 있다.
"말단 반복체" 또는 "TR"이라는 용어는 헤어핀 구조를 형성하고 역위 말단 반복체으로서 기능하는(즉, 복제, 바이러스 패키징, 통합 및/또는 프로바이러스 구제 등과 같은 목적하는 기능을 매개하는) 임의의 바이러스 말단 반복체 또는 합성 서열을 포함한다. TR은 AAV TR 또는 비-AAV TR일 수 있다. 예를 들어, 비-AAV TR 서열, 예컨대 다른 파보바이러스(예를 들어, 개 파보바이러스(CPV), 마우스 파보바이러스(MVM), 사람 파보바이러스 B-19) 또는 임의의 다른 적합한 바이러스 서열(예를 들어, SV40 복제의 오리진으로서 작용하는 SV40 헤어핀)은 절단, 치환, 삭제, 삽입 및/또는 첨가에 의해 추가로 변형될 수 있는 TR로서 사용될 수 있다. 또한, TR은 사물스키(Samulski) 등의 미국 특허 제5,478,745호에 기재된 바와 같은 "이중-D 서열"과 같이 부분적으로 또는 완전히 합성될 수 있다.
"AAV 말단 반복체" 또는 "AAV TR"은 현재 알려져 있거나 이후 발견된 혈청형 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 또는 임의의 다른 AAV를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 AAV로부터 유래될 수 있다(예를 들어, 표 2 참조). AAV 말단 반복체는 말단 반복체가 목적하는 기능, 예를 들어 복제, 바이러스 패키징, 통합 및/또는 프로바이러스 구제 등을 매개하는 한, 고유 말단 반복체 서열(예를 들어, 고유 AAV TR 서열은 삽입, 결실, 절단 및/또는 미스센스 돌연변이에 의해 변경될 수 있음)을 가질 필요는 없다.
본 개시내용의 바이러스 벡터는 추가로 "표적화된" 바이러스 벡터(예를 들어, 지향성을 가짐) 및/또는 "하이브리드" 파보바이러스(즉, 바이러스 TR 및 바이러스 캡시드가 상이한 파보바이러스로부터 유래함)일 수 있고, 이는 국제 특허 공개 공보 WO00/28004 및 Chao 등, (2000) Molecular Therapy 2:619에 기재된 바와 같다.
본 개시내용의 바이러스 벡터는 추가로 국제 특허 공개 공보 WO 01/92551(이의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 인용됨)에 기재된 바와 같이 듀플렉스 파보바이러스 입자일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 이중 가닥(듀플렉스) 게놈은 본 개시내용의 바이러스 캡시드 내로 패키징될 수 있다.
추가로, 바이러스 캡시드 또는 게놈 요소는 삽입, 결실 및/또는 치환을 포함하는 다른 변형을 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 임의의 천연적으로 존재하는 아미노산, 이의 변형된 형태 및 합성 아미노산을 포함한다.
천연적으로 존재하는 좌선성(L-) 아미노산은 표 3에 나타낸다.
표 3: 아미노산 잔기 및 약어.
대안적으로, 아미노산은 변형된 아미노산 잔기(비제한적인 예는 표 4에 나타냄)일 수 있고/있거나 번역 후 변형(예를 들어, 아세틸화, 아미드화, 포밀화, 하이드록실화, 메틸화, 인산화 또는 황산화)에 의해 변형되는 아미노산일 수 있다.
표 4: 변형된 아미노산 잔기
추가로, 비-천연적으로 존재하는 아미노산은 "비천연" 아미노산일 수 있다(Wang 등, Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)에 기재된 바와 같음). 이들 비천연 아미노산은 관심 있는 분자를 AAV 캡시드 단백질에 화학적으로 연결하는 데 유리하게 사용될 수 있다.
"능동 면역 반응" 또는 "능동 면역력"은 "면역원과의 접촉 후 숙주 조직 및 세포의 참여"를 특징으로 한다. 이는 림프세망 조직에서 면역적격 세포의 분화 및 증식을 수반하며, 이는 항체 합성 또는 세포 매개 반응성의 발달 또는 둘 다로 이어진다." Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, in IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 1 17 (Joseph A. Bellanti ed., 1985). 달리 말하면, 능동 면역 반응은 감염 또는 백신접종에 의해 면역원에 노출된 후 숙주에 의해 개시된다. 능동 면역력은 능동적으로 면역화된 숙주에서 비면역 숙주로 형성된 물질(항체, 전이 인자, 흉선 이식편, 인터류킨-2)의 전이를 통해 수득되는 수동 면역력과 대조될 수 있다.
본원에서 사용되는 "보호" 면역 반응 또는 "보호" 면역력은 면역 반응이 질환의 발병을 예방하거나 감소시킨다는 점에서 대상체에게 일부 이득을 부여한다는 것을 나타낸다. 대안적으로, 보호 면역 반응 또는 보호 면역력은 질환, 특히 암 또는 종양의 치료 및/또는 예방에 유용할 수 있다(예를 들어, 암 또는 종양 형성을 예방함으로써, 암 또는 종양의 퇴행을 유발함으로써 및/또는 전이를 예방하고/하거나 전이성 결절의 성장을 예방함으로써). 보호 효과는 치료의 이득이 이의 단점을 능가하는 한 완전하거나 부분적일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "암"은 종양 형성 암을 포함한다. 또한, 용어 "암성 조직"은 종양을 포함한다. "암 세포 항원"은 종양 항원을 포함한다.
용어 "암"은, 예를 들어 신체의 원위 부위로 확산(즉, 전이)할 가능성을 갖는 조직의 제어되지 않은 성장과 같이 당업계에서 이해되는 의미를 갖는다. 예시적인 암은 흑색종, 선암종, 흉선종, 림프종(예를 들어, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종), 육종, 폐암, 간암, 결장암, 백혈병, 자궁암, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 콩팥암, 췌장암, 뇌암 및 현재 알려졌거나 나중에 동정된 임의의 기타 암 또는 악성 병태를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 대표적인 구현예에서, 본 개시내용은 종양 형성 암을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
용어 "종양"은 또한 당업계에서 예를 들어 다세포 유기체 내의 미분화 세포의 비정상적인 덩어리(mass)로 이해된다. 종양은 악성 또는 양성일 수 있다. 대표적인 구현예에서, 본원에 개시된 방법은 악성 종양을 예방하고 치료하는 데 사용된다.
용어 "암을 치료하는", "암의 치료" 및 등가 용어에 의해 암의 중증도가 감소되거나 적어도 부분적으로 제거되고/되거나 질환의 진행이 느려지고/거나 제어되고/되거나 질환이 안정화되는 것으로 의도된다. 일부 구현예에서, 이들 용어는 암의 전이가 예방되거나 감소되거나 적어도 부분적으로 제거되고/되거나 전이성 결절의 성장이 예방되거나 감소되거나 적어도 부분적으로 제거됨을 나타낸다.
용어 "암의 예방" 또는 "암을 예방하는" 및 등가 용어는 방법이 암의 발생률 및/또는 중증도를 적어도 부분적으로 제거 또는 감소 및/또는 지연시키는 것으로 의도된다. 대안적으로 말하면, 대상체에서 암의 개시는 가능성 또는 개연성이 감소되고/되거나 지연될 수 있다.
변형된 AAV 캡시드 단백질 및 이를 포함하는 캡시드
본 개시내용은 AAV 캡시드 단백질(VP1, VP2 및/또는 VP3) 변이체, 및 바이러스 캡시드 및 이를 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다. 각각의 캡시드 변이체는 하나 이상의 형질도입 관련 펩타이드를 포함한다. 형질도입 관련 펩타이드는 천연적으로 존재하는 AAV 캡시드 단백질에 존재하지 않고, 일부 구현예에서 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터에 대한 증진된 형질도입을 관심 있는 표적 세포(예를 들어, T-세포)에 부여할 수 있다. 본원에 기재된 AAV 캡시드 단백질 변이체는 현재 알려지거나 나중에 발견되는 임의의 AAV 혈청형의 캡시드 단백질에 대한 변이체일 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질 변이체는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh32.33, AAVrh74, 소 AAV 및 조류 AAV로부터 선택되는 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질의 변이체이다.
a. AAV 캡시드 단백질의 변형
일부 구현예에서, 본원에 기재된 형질도입 관련 펩타이드는 다양한 세포 유형(예를 들어, T-세포)에서의 증진된 세포성 형질도입을 제한 없이 포함하는 변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 벡터에 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 하나 이상의 바람직한 성질을 부여할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 캡시드 단백질은 AAV 벡터에 혼입될 수 있다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터는 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 야생형 AAV 또는 AAV 바이러스 입자 또는 AAV 바이러스 벡터와 비교하여 증진된 세포성 형질도입(예를 들어, 증진된 T 세포 형질도입)을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 AAV 바이러스 입자 또는 벡터는 또한 중화 항체를 회피할 수 있다.
본 개시내용의 형질도입 관련 펩타이드는 야생형 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 대체할 수 있어, AAV 캡시드 단백질 서열에서 아미노산 수의 순 증가 또는 감소를 초래하지 않는다. 일부 구현예에서, 야생형 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열을 본 개시내용의 형질도입 관련 펩타이드로 교체하면 야생형 AAV 캡시드 단백질 서열과 비교하여 아미노산의 순 손실(예를 들어, 결실)을 초래할 수 있다. 예를 들어, 형질도입 관련 펩타이드는 다음 혈청형 중 어느 하나로부터의 AAV 캡시드 단백질에서 하나 이상의 아미노산을 대체할 수 있다: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh32.33, AAVrh74, 소 AAV 및 조류 AAV. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 형질도입 관련 펩타이드는 야생형 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열에 삽입될 수 있어, AAV 캡시드 단백질 서열에서 아미노산 수의 증가를 초래한다.
일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질의 변형은 고유 AAV 캡시드 단백질의 하나 이상의 아미노산 잔기를 고유 캡시드 서열에 존재하지 않는 아미노산으로 대체하는 결과를 초래한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질의 변형은 하기의 아미노산 잔기: 454, 455, 456, 457, 458, 459, 및 460이 고유 캡시드 단백질 서열에 존재하지 않는 아미노산으로 대체되도록 하고, 여기서 아미노산 넘버링은 야생형 AAV6 캡시드 단백질의 VP1 서열, 또는 임의의 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질에서 상응하는 잔기에 상대적이다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질의 변형은 하기의 아미노산 잔기: 454, 455, 456, 457, 458, 459, 및 460 중 하나 이상의 결실을 초래하고, 여기서 아미노산 넘버링은 야생형 AAV6 캡시드 단백질의 VP1 서열, 또는 임의의 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질에서 상응하는 잔기에 상대적이다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질의 변형은 고유 AAV6 캡시드 단백질 서열의 아미노산 서열(서열번호 1)에 상대적으로 아미노산 454, 455, 456, 457, 458, 459, 및/또는 460의 대체를 초래한다.
일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(서열번호 24)의 형질도입 관련 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(서열번호 24)의 형질도입 관련 펩타이드를 포함하고, 여기서 캡시드 단백질은 하기의 혈청형의 어느 하나를 갖는다: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh32.33, AAVrh74, 소 AAV 또는 조류 AAV. 일부 구현예에서, 서열번호 1 또는 25-34 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질은 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(서열번호 24)의 형질도입 관련 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 고유 AAV6 캡시드 단백질 서열(예를 들어, 서열번호 1)의 서열을 포함하고, 추가로 서열번호 24의 형질도입 관련 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 예를 들어, 서열번호 1 또는 25-34와 같은 야생형 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열과 적어도 약 80% 동일성, 예를 들어, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96% 동일성, 적어도 약 97% 동일성, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.5% 또는 약 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 AAV 캡시드 단백질은 서열번호 1과 약 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
서열번호 24의 형질도입 관련 펩타이드는 기재된 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열 중 어느 곳에서 하나 이상의 아미노산 잔기를 대체하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호 24의 형질도입 관련 펩타이드는 캡시드 단백질에서 서열을 대체하기 위해 사용될 수 있고, 여기서 캡시드 단백질은 서열번호 1 및 25-34 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 서열번호 24의 형질도입 관련 펩타이드는 본원에 기재된 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 서열에 삽입될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 하나 이상의 AAV 캡시드 단백질의 고유 서열을 서열번호 24의 서열의 형질도입 관련 펩타이드로 대체하면 AAV 캡시드 단백질의 서열로부터 하나 이상의 아미노산이 결실될 수 있다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 서열번호 1의 아미노산 454-460이 서열번호 24의 서열을 포함하는 형질도입 관련 펩타이드로 대체된 것을 제외하고 서열번호 1의 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 서열번호 24는 야생형 AAV 캡시드 단백질의 서열을 대체하기 위해 사용되어, 수득한 서열은 야생형 서열에 존재하지 않는 적어도 1개, 2개, 3개 등의 개별 아미노산을 포함한다.
일부 구현예에서, 서열번호 24는 X1이 G가 아니고, X2가 S가 아니고, X3이 A가 아니고, X4가 Q가 아니고, X5가 N이 아니고, X6이 K가 아니고/아니거나 X7이 D가 아닌 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, X1은 H, M, A, Q, V, 또는 S이다. 일부 구현예에서, X2는 A 또는 T이다. 일부 구현예에서, X3은 P 또는 T이다. 일부 구현예에서, X4는 R 또는 D이다. 일부 구현예에서, X5는 V, Q, C, S, 또는 D이다. 일부 구현예에서, X6은 E, A 또는 P이다. 일부 구현예에서, X7은 E, G, N, T 또는 A이다. 일부 구현예에서, X1은 H이고, X2는 A이고, X3은 P이고, X4는 R이고, X5는 V이고, X6은 E이고, X7은 E이다. 일부 구현예에서, X1은 M이고, X2는 A이고, X3은 P이고, X4는 R이고, X5는 Q이고, X6은 E이고, X7은 G이다. 일부 구현예에서, X1은 H이고, X2는 T이고, X3은 T이고, X4는 D이고, X5는 C이고, X6은 A이고, X7은 N이다. 일부 구현예에서, X1은 A이고, X2는 A이고, X3은 P이고, X4는 R이고, X5는 S이고, X6은 E이고, X7은 T이다. 일부 구현예에서, X1은 Q이고, X2는 A이고, X3은 P이고, X4는 R이고, X5는 Q이고, X6은 E이고, X7은 G이다. 일부 구현예에서, X1은 V이고, X2는 A이고, X3은 P이고, X4는 R이고, X5는 D이고, X6은 P이고, X7은 A이다. 일부 구현예에서, X1은 S이고, X2는 A이고, X3은 P이고, X4는 R이고, X5는 S이고, X46은 E이고, X7은 N이다.
일부 구현예에서, 형질도입 관련 펩타이드는 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7의 아미노산 서열을 갖고, 여기서 X1= H, M, Q, V 또는 S이고; X2 = A 또는 T이고; X3 = P 또는 T이고; X4 = R 또는 D이고; X5 = V, Q, C, S, 또는 D이고, X6 = E, A 또는 P이고; X7 = E, G, N, T 또는 A이다(서열번호 16). 일부 구현예에서, 형질도입 관련 펩타이드는 서열번호 17-23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 17-23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 형질도입 관련 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 서열번호 17-23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 형질도입 관련 펩타이드는 AAV 캡시드 단백질의 하나 이상의 아미노산을 대체한다. 본 개시내용은 하기의 혈청형: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh32.33, AAVrh74, 소 AAV 및 조류 AAV 중 어느 하나의 AAV 캡시드 단백질의 변이체를 제공하고, 여기서 AAV 캡시드 단백질 변이체는 서열번호 17-23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 형질도입 관련 펩타이드를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 서열번호 1 및 25-34 중 어느 하나로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하지만, 여기서 하나 이상의 아미노산은 서열번호 17-23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 형질도입 관련 펩타이드로 대체된다.
일부 구현예에서, 서열번호 17-23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 형질도입 관련 펩타이드는 하기의 혈청형 중 어느 하나의 AAV 캡시드 단백질의 하나 이상의 아미노산을 대체한다: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh32.33, AAVrh74, 소 AAV 및 조류 AAV. 일부 구현예에서, 서열번호 17-23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 형질도입 관련 펩타이드는 서열번호 1 및 25-34 중 어느 하나로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 AAV 캡시드 단백질의 하나 이상의 아미노산을 대체한다.
일부 구현예에서, 고유 AAV6 캡시드 단백질(예를 들어, 서열번호 1)의 아미노산 454-460은 서열번호 17-23 중 어느 하나의 서열을 포함하는 형질도입 관련 펩타이드에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, 고유 AAV6 캡시드 단백질(예를 들어, 서열번호 1)의 아미노산 454-460은 서열번호 17의 서열의 형질도입 관련 펩타이드에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, 고유 AAV6 캡시드 단백질(예를 들어, 서열번호 1)의 아미노산 454-460은 서열번호 18의 서열의 형질도입 관련 펩타이드에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, 고유 AAV6 캡시드 단백질(예를 들어, 서열번호 1)의 아미노산 454-460은 서열번호 19의 서열의 형질도입 관련 펩타이드에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, 고유 AAV6 캡시드 단백질(예를 들어, 서열번호 1)의 아미노산 454-460은 서열번호 20의 서열의 형질도입 관련 펩타이드에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, 고유 AAV6 캡시드 단백질(예를 들어, 서열번호 1)의 아미노산 454-460은 서열번호 21의 서열의 형질도입 관련 펩타이드에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, 고유 AAV6 캡시드 단백질(예를 들어, 서열번호 1)의 아미노산 454-460은 서열번호 22의 서열의 형질도입 관련 펩타이드에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, 고유 AAV6 캡시드 단백질(예를 들어, 서열번호 1)의 아미노산 454-460은 서열번호 23의 서열의 형질도입 관련 펩타이드에 의해 대체된다.
일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 및 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열 또는 이와 적어도 약 80% 동일한 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 또는 14 중 어느 하나와 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 동일성, 적어도 약 99.5% 또는 약 100% 동일한 아미노산 서열을 포함한다.
b. AAV 캡시드 단백질의 기타 변형
본 개시내용은 변형될 AAV 캡시드 단백질이 천연적으로 존재하는 AAV 캡시드 단백질(예를 들어, AAV2, AAV3a 또는 3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 캡시드 단백질 또는 표 2에 제시된 AAV 중 임의의 것)일 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 당업자는 AAV 캡시드 단백질에 대한 다양한 조작이 당업계에 공지되어 있고 본 개시내용이 천연적으로 존재하는 AAV 캡시드 단백질의 변형에 제한되지 않음을 이해할 것이다. 예를 들어, 변형될 캡시드 단백질은 천연적으로 존재하는 AAV(예를 들어, 천연적으로 존재하는 AAV 캡시드 단백질, 예를 들어 AAV2, AAV3a, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12 또는 현재 알려져 있거나 나중에 발견되는 임의의 다른 AAV)와 비교하여 변경을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 가공된 AAV, 예를 들어, AAV2i8, AAV2g9, AAV-LK03, AAV7m8, AAV Anc80, AAV PHP.B일 수 있다. 상기 AAV 캡시드 단백질은 또한 본 개시내용의 범위내에 있다.
일부 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 키메라이다. 예를 들어, 키메라 AAV 캡시드 단백질은 2개 이상의 AAV 혈청형 또는 3개 이상의 AAV 혈청형으로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다. 키메라 AAV 캡시드 단백질은 하기의 AAV 혈청형 중 2개 이상으로부터 유래된 서열을 포함할 수 있다: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh32.33, AAVrh74, 소 AAV 및 조류 AAV.
따라서, 일부 구현예에서, 변형될 AAV 캡시드 단백질은 천연적으로 존재하는 AAV로부터 유래될 수 있지만 캡시드 단백질내로 삽입 및/또는 치환되고/되거나 하나 이상의 아미노산의 결실에 의해 변경된 하나 이상의 외래 서열(예를 들어, 고유 바이러스에 대해 외인성임)을 추가로 포함한다. 따라서, 본원에서 특정 AAV 캡시드 단백질(예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 또는 AAV11 캡시드 단백질 또는 표 2에 제시된 임의의 AAV로부터의 캡시드 단백질)을 언급할 때, 고유 캡시드 단백질 및 본 개시내용의 변형 이외의 변경을 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 변경은 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 고유 AAV 캡시드 단백질 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개, 20개 미만, 30개 미만, 40개 미만, 50개 미만, 60개 미만 또는 70개 미만의 아미노산이 삽입된 것(본 개시내용의 아미노산 서열 치환 제외)을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 고유 AAV 캡시드 단백질 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개, 20개 미만, 30개 미만, 40개 미만, 50개 미만, 60개 미만 또는 70개 미만의 아미노산이 치환된 것(본 개시내용에 따른 형질도입 관련 펩타이드 제외)을 포함한다. 일부 구현예에서, 캡시드 단백질은 고유 AAV 캡시드 단백질 서열과 비교하여 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개, 20개 미만, 30개 미만, 40개 미만, 50개 미만, 60개 미만 또는 70개 미만의 아미노산이 결실된 것(본 개시내용의 형질도입 관련 펩타이드 제외)을 포함한다.
본 개시내용에 따른 AAV 캡시드 단백질에 대한 변형은 "선택적" 변형이다. 이러한 접근법은 AAV 혈청형 간의 전체 서브유닛 또는 대형 도메인 스왑을 사용한 이전 작업과 대조된다(참조: 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 00/28004 및 Hauck 등, (2003) J. Virology 77:2768-2774). 일부 구현예에서, "선택적" 변형은 약 20, 18, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3개 미만 또는 이하의 인접한 아미노산의 삽입 및/또는 치환 및/또는 결실을 초래한다. 본 개시내용의 변형된 캡시드 단백질 및 캡시드는 현재 알려지거나 나중에 동정되는 임의의 다른 변형을 추가로 포함할 수 있다. 아미노산 잔기가 야생형 또는 고유 아미노산 서열에 존재하는 아미노산 잔기 이외의 임의의 아미노산 잔기에 의해 치환되는 본원에 기재된 구현예에서, 상기 임의의 다른 아미노산 잔기는 당업계에 공지된 임의의 천연 또는 비-천연 아미노산일 수 있다(예를 들어, 표 3 및 4 참조). 일부 구현예에서, 치환은 보존적 치환일 수 있고, 일부 구현예에서, 치환은 비-보존적 치환일 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이, 다수의 AAV로부터의 캡시드 단백질의 아미노산 서열 및 핵산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 따라서, 고유 AAV 캡시드 단백질의 아미노산 위치에 "상응하는" 아미노산은 임의의 다른 AAV에 대해 용이하게 결정될 수 있다(예를 들어, 서열 정렬을 사용함으로써). 2개 이상의 아미노산 서열 간의 서열 유사성 또는 동일성을 결정하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 서열 유사성 또는 동일성은 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 결정할 수 있고, 이는 문헌(참조: Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981))의 국소 서열 동일성 알고리즘, 문헌(참조: Needleman & Wunsch, J Mol. Biol. 48,443 (1970))의 서열 동일성 정렬 알고리즘, 문헌(참조: Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85,2444 (1988))의 유사성 방법에 대한 검색, 이들 알고리즘 (Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wi에서 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 문헌(참조: the Best Fit sequence program described by Devereux 등, Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984))에 의해 기재된 최상의 피트 서열 프로그램, 또는 주사에 의한 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 적합한 알고리즘은 BLAST 알고리즘이고, 이는 문헌(참조: Altschul 등, J Mol. Biol. 215, 403-410, (1990) 및 Karlin 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993))에 기재된다. 특히 유용한 BLAST 프로그램은 WU-BLAST-2 프로그램이고, 이는 문헌(참조: Altschul 등, Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996); blast.wustl/edu/blast/ README.html)으로부터 수득하였다. WU-BLAST-2는 여러 검색 파라미터를 사용하고, 이는 임의로 디폴트 값으로 설정된다. 파라미터는 역학적 값이고 특정 서열의 조성 및 관심 있는 서열이 검색되는 특정 데이터베이스의 구성에 따라 프로그램 자체에 의해 확립되지만; 감도를 높이기 위해 값을 조정할 수 있다.
추가로 유용한 알고리즘은 문헌(참조: Altschul 등, (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402)에 의해 보고된 바와 같이 갭(gapped) BLAST이다.
달리 나타내지 않은 경우, 퍼센트 동일성의 계산은 월드 와이드 웹 주소: blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi에서 가용한 BLAST 알고리즘을 사용하여 본원에서 수행된다.
c. 변형된 바이러스 캡시드
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 변이체 캡시드 단백질 중 적어도 하나를 포함하는 바이러스 캡시드를 제공한다. 일부 구현예에서, 바이러스 캡시드는 파보바이러스 캡시드이고, 이는 추가로 자율 파보바이러스 캡시드 또는 데펜도바이러스 캡시드일 수 있다. 임의로, 바이러스 캡시드는 AAV 캡시드이다. 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 AAV1, AAV2, AAV3a, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, 소 AAV 캡시드, 조류 AAV 캡시드 또는 현재 알려져 있거나 이후 동정된 임의의 다른 AAV이다. AAV 혈청형의 비제한 목록은 표 2에 나타낸다. 본 개시내용의 AAV 캡시드는 표 2에 열거되거나 하나 이상의 삽입, 치환 및/또는 결실에 의해 이전에 기재된 것으로부터 유래된 임의의 AAV 혈청형일 수 있다. 변형된 바이러스 캡시드는 예를 들어 미국 특허 제5,863,541호에 기재된 바와 같이 "캡시드 비히클"로서 사용될 수 있다. 본 개시내용에 따른 바이러스 캡시드는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여, 예를 들어, 바쿨로바이러스로부터의 발현에 의해 생성될 수 있다(참조: Brown 등, (1994) Virology 198:477-488). 일부 구현예에서, AAV 캡시드는 본원에 기재된 약 60개 변이체 캡시드 단백질을 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 캡시드는 목적하는 표적 조직(들) 상에 존재하는 세포-표면 분자와 상호작용하도록 바이러스 캡시드를 지시하는 표적화 서열(예를 들어, 바이러스 캡시드에 치환되거나 삽입됨)을 포함하는 표적화된 바이러스 캡시드일 수 있다(참조: 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 00/28004 및 Hauck 등, (2003) J. Virology 77:2768-2774); Shi 등, Human Gene Therapy 17:353-361 (2006) [AAV 캡시드 서브유닛의 위치 520 및/또는 584에서 인테그린 수용체 결합 모티프 RGD의 삽입을 기재하는]; 및 미국 특허 제7,314,912호 [AAV2 캡시드 서브유닛의 아미노산 위치 447, 534, 573 및 587 후 RGD 모티프를 함유하는 PI 펩타이드의 삽입을 기재하는]). 삽입을 허용하는 AAV 캡시드 서브유닛 내 다른 위치는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌(참조: Grifman 등, Molecular Therapy 3:964-975 (2001))에 의해 기재된 위치 449 및 588).
예를 들어, 본 개시내용의 바이러스 캡시드는 관심 있는 특정 표적 조직(예를 들어, 간, 골격근, 심장, 횡경막 근육, 콩팥, 뇌, 위, 창자, 피부, 내피 세포 및/또는 폐)에 대해 상대적으로 비효율적인 향성을 가질 수 있다. 표적화 서열은 유리하게 이들 낮은-형질도입 벡터에 혼입되어 바이러스 캡시드에 목적하는 향성 및 임의로 특정 조직 또는 세포, 예를 들어, T-세포에 대한 선택적 향성을 부여할 수 있다. AAV 캡시드 단백질, 캡시드 및 표적화 서열을 포함하는 벡터는 예를 들어 국제 특허 공개 공보 WO 00/28004에 기재되어 있다. 또 다른 예로서, 문헌(참조: Wang 등, Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006))에 기재된 바와 같이 하나 이상의 천연적으로 존재하지 않는 아미노산은 낮은 형질도입 벡터를 목적하는 표적 조직(들)로 재지시하는 수단으로서 직교 부위에서 본 개시내용의 AAV 캡시드 서브유닛에 통합될 수 있다. 이들 비천연 아미노산은 글리칸(만노스 - 수지상 세포 표적화); 특정 암 세포 유형으로의 표적화된 전달을 위한 RGD, 봄베신 또는 신경펩타이드; 성장 인자 수용체, 인테그린 등과 같은 특정 세포 표면 수용체에 표적화된 파아지 디스플레이로부터 선택된 RNA 압타머 또는 펩타이드를 제한없이 포함하는 AAV 캡시드 단백질에 관심 있는 분자에 화학적으로 연결하기 위해 사용될 수 있다. 아미노산을 화학적으로 변형시키기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다(참조: 예를 들어, Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 1st　edition, Academic Press, 1996). 일부 구현예에서, 표적화 서열은 특정 세포 유형(들)에 대한 감염을 지시하는 바이러스 캡시드 서열(예를 들어, 자율 파보바이러스 캡시드 서열, AAV 캡시드 서열, 또는 임의의 다른 바이러스 캡시드 서열)일 수 있다.
또 다른 비제한적 예로서, 헤파린 또는 헤파란 설페이트(HS) 결합 도메인(예를 들어, 호흡기 신시티알 바이러스 헤파린 결합 도메인)은 전형적으로 HS 수용체(예를 들어, AAV4, AAV5)에 결합하지 않는 캡시드 서브유닛에 삽입되거나 치환되어 수득한 변이체에 대한 헤파린 및/또는 헤파란 설페이트 결합을 부여한다. HS/헤파린 결합이 아르기닌 및/또는 리신이 풍부한 "기본 패치"에 의해 매개된다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 예시적인 구현예에서, "B"가 염기성 잔기이고 X가 중성 및/또는 소수성인 모티프 BXXB(서열번호 105) 이후 서열이 사용될 수 있다. 비제한적인 예로서, BXXB는RGNR(서열번호 106)일 수 있다. 또 다른 비제한적 예로서, BXXB는 고유 AAV2 캡시드 단백질에서 아미노산 위치 262 내지 265 또는 또 다른 AAV 혈청형의 캡시드 단백질의 상응하는 위치(들)에서 치환된다.
파보바이러스 B19는 글로보사이드를 이의 수용체로 사용하여 1차 적혈구 전구체 세포를 감염시킨다(Brown 등, (1993) Science 262: 114). B19의 구조는 8 Å 분리능으로 결정되었다(Agbandje-McKenna 등, (1994) Virology 203: 106). 글로보사이드에 결합하는 B19 캡시드의 영역은 아미노산 399 내지 406(참조: Chapman 등, (1993) Virology 194:419)에서 맵핑되었고, 루프 제거된 영역은 β-배럴 구조 E와 F 사이에 있다(참조: Chipman 등, (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:7502). 따라서, B19 캡시드의 글로보사이드 수용체 결합 도메인은 바이러스 캡시드 또는 이를 포함하는 바이러스 벡터를 적혈구계 세포에 표적화하기 위해 본 개시내용의 AAV 캡시드 단백질로 치환될 수 있다.
일부 구현예에서, 외인성 표적화 서열은 변형된 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 캡시드 또는 바이러스 벡터의 향성을 변경하는 펩타이드를 인코딩하는 임의의 아미노산 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 표적화 펩타이드 또는 단백질은 천연적으로 존재하거나 대안적으로 완전히 또는 부분적으로 합성일 수 있다. 예시적인 표적화 서열은 ROD 펩타이드 서열, 브래디키닌, 호르몬, 펩타이드 성장 인자(예를 들어, 표피 성장 인자, 신경 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 혈소판 유래 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자 I 및 II 등), 사이토킨, 멜라닌 세포 자극 호르몬(예를 들어, a, β 또는 γ), 신경펩타이드 및 엔도르핀 등, 및 세포를 이의 동족 수용체로 표적화하는 능력을 보유하는 이들의 단편과 같이 세포 표면 수용체 및 당단백질에 결합하는 리간드 및 다른 펩타이드를 포함한다. 다른 예시적인 펩타이드 및 단백질은 상기에 기재된 바와 같이, 물질 P, 케라틴 세포 성장 인자, 신경펩타이드 Y, 가스트린 방출 펩타이드, 인터류킨 2, 계란 흰자 리소자임, 에리트로포이에틴, 고나돌리베린, 코르티코스타틴, β-엔돌핀, leu-엔케팔린, 리모르핀, 알파-네오-엔케팔린, 안지오텐신, 뉴마딘, 혈관활성 장 펩타이드, 뉴로텐신, 모틸린 및 이들의 단편을 포함한다. 또 다른 대안으로서, 독소(예를 들어, 알파-붕가로톡신 등과 같은 파상풍 독소 또는 뱀 독소 등)로부터의 결합 도메인은 표적화 서열로서 캡시드 단백질로 치환될 수 있다. 추가의 대표적인 구현예에서, AAV 캡시드 단백질은 문헌(참조: Cleves(Current Biology 7:R318 (1997))에 기재된 바와 같이 "비고전적" 입수/방출 신호 펩타이드(예를 들어, 섬유아세포 성장 인자-1 및 -2, 인터류킨 1, HIV-1 Tat 단백질, 헤르페스 바이러스 VP22 단백질 등)의 치환에 의해 AAV 캡시드 단백질로 변형될 수 있다. 또한 특정 세포에 의한 흡수를 지시하는 펩타이드 모티프, 예를 들어 간 세포에 의한 흡수를 유발하는 FVFLP(서열번호 104) 펩타이드 모티프가 포함된다.
당업계에 공지된 다른 기술뿐만 아니라 파아지 디스플레이 기술을 사용하여 임의의 관심 있는 세포 유형을 인지하는 펩타이드를 동정할 수 있다. 표적화 서열은 수용체(예를 들어, 단백질, 탄수화물, 당단백질 또는 프로테오글리칸)를 포함하는 세포 표면 결합 부위에 표적화하는 임의의 펩타이드를 인코딩할 수 있다. 세포 표면 결합 부위의 예는 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트 및 기타 글리코사미노글리칸, 뮤신상에서 발견되는 시알산 모이어티, 당단백질 및 강글리오사이드, MHC 1 당단백질, 만노스, N-아세틸-갈락토사민, N-아세틸-글루코사민, 푸코스, 갈락토스 등을 포함하는 막 당단백질 상에 발견되는 탄수화물 성분을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 표 7은 적합한 표적화 서열의 다른 비제한적인 예를 보여준다.
표 7: 예시적인 표적화 서열
Y*는 포스포-Tyr이다
일부 구현예에서, 표적화 서열은 세포로의 진입을 표적화하는 또 다른 분자에 대한 화학적 커플링을 위해 사용될 수 있는(예를 들어, 이들의 R 기를 통해 화학적으로 커플링될 수 있는 아르기닌 및/또는 라이신 잔기를 포함할 수 있음) 펩타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 AAV 캡시드 단백질 또는 바이러스 캡시드는 WO 2006/066066에 기재된 바와 같은 돌연변이를 포함할 수 있다. 예를 들어, 캡시드 단백질은 고유 AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 위치 263, 705, 708 및/또는 716에서의 선택적 아미노산 치환 또는 다른 AAV 혈청형으로부터의 캡시드 단백질에서 상응하는 변화(들)를 포함할 수 있다.
추가로 또는 대안적으로, 일부 구현예에서, 캡시드 단백질, 바이러스 캡시드 또는 벡터는 AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 위치 264 바로 이후에 선택적인 아미노산 삽입 또는 다른 AAV로부터의 캡시드 단백질에서 상응하는 변화를 포함한다. "아미노산 위치 X 직후"는 삽입이 표시된 아미노산 위치 바로 이후에 있는 것으로 의도된다(예를 들어, "아미노산 위치 264 후"는 위치 265에서 포인트 삽입 또는 예를 들어 위치 265에서 268 등까지의 큰 포인트 삽입을 나타낸다). 또한, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 캡시드 단백질, 바이러스 캡시드 또는 벡터는 PCT 공개 공보 WO 2010/093784(예를 들어, 2i8) 및/또는 PCT 공개 공보 WO 2014/144229(예를 들어, 이중 글리칸)에 기재된 바와 같은 아미노산 변형을 포함할 수 있다.
이종성 분자는 AAV 감염에서 천연적으로 발견되지 않는 분자, 예를 들어 야생형 AAV 게놈에 의해 인코딩되지 않은 분자로 정의된다. 또한, 치료학적으로 유용한 분자는 분자를 숙주 표적 세포로 전달하기 위해 키메라 바이러스 캡시드의 외부와 회합될 수 있다. 이러한 회합된 분자는 DNA, RNA, 작은 유기 분자, 금속, 탄수화물, 지질 및/또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 하나의 구현예에서 치료학적으로 유용한 분자는 캡시드 단백질에 공유 결합(즉, 접합 또는 화학적 커플링)된다. 분자를 공유 결합시키는 방법은 당업자에 의해 공지되어 있다.
d. 변형된 바이러스 벡터
본 개시내용은 본 개시내용의 캡시드 단백질 변이체 및 캡시드를 포함하는 바이러스 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 파보바이러스 벡터(예를 들어, 파보바이러스 캡시드 및/또는 벡터 게놈을 포함함), 예를 들어 AAV 벡터(예를 들어, AAV 캡시드 및/또는 벡터 게놈을 포함함)이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 본 개시내용의 변형된 캡시드 단백질 및 벡터 게놈을 포함하는 변형된 AAV 캡시드를 포함한다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는: (a) 본 개시내용의 캡시드 단백질 변이체를 포함하는 바이러스 캡시드 (예를 들어, AAV 캡시드); 및 (b) 말단 반복체 서열(예를 들어, AAV Tr)을 포함하고, 여기서 말단 반복체 서열을 포함하는 핵산은 바이러스 캡시드에 의해 캡시드화된다. 핵산은 임의로 2개의 말단 반복체(예를 들어, 2개의 AAV TR)를 포함할 수 있다. 대표적인 구현예에서, 바이러스 벡터는 관심 있는 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA를 인코딩하는 이종성 핵산을 포함하는 재조합 바이러스 벡터이다.
AAV는 전형적으로 T-세포를 높은 수준으로 형질도입하지 않는다. 대조적으로, 일부 구현예에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 야생형 바이러스 벡터 또는 캡시드 단백질 변이체가 없는 바이러스 벡터에 의한 형질도입 수준과 비교하여 하나 이상의 세포 유형(예를 들어, T-세포) 및/또는 조직의 증진된 형질도입을 나타낸다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 야생형 또는 고유 AAV 바이러스 벡터와 비교하여 증가된 세포 형질도입을 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 야생형 또는 고유 AAV 바이러스 벡터, 또는 본원에 기재된 캡시드 단백질 변이체 중 어느 하나를 포함하지 않는 AAV 바이러스 벡터와 비교하여 하나 이상의 세포 유형(예를 들어, T-세포)에서 증가된 형질도입을 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 조혈 줄기 세포로의 증가된 형질도입을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 단핵구, 호염기구, 호산구, 호중구, 수지상 세포, 대식세포, B-세포, T-세포 및/또는 천연 킬러 세포에서 증가된 형질도입을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 위성 세포, 중간엽 줄기 세포 및/또는 기저 세포에서 증가된 형질도입을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 폐 상피 세포, 간세포 및/또는 골격근 세포에서 증가된 형질도입을 가질 수 있다.
AAV에 대한 알려진 수용체 및 보조 수용체는 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 인테그린, O-연결된 시알산, N-연결된 시알산, AAV 수용체(AAVR, KIAA0319L), 간세포 성장 인자 수용체(c-Met), CD9, FGFR-1, 37/67-kDa 라미닌 수용체 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체를 포함한다. 구현예에서, 본 개시내용의 AAV 바이러스 벡터는 이들 수용체 및/또는 공동-수용체 중 하나 이상에 대해 증가된 친화성을 갖는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 야생형 또는 고유 AAV 바이러스 벡터에 비해 증가된 헤파린 및/또는 헤파란 설페이트 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 야생형 또는 고유 AAV 바이러스 벡터에 비해 증가된 시알산 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 야생형 또는 고유 AAV 바이러스 벡터에 비해 증가된 인테그린 결합을 갖는다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스 벡터는 야생형 또는 고유 AAV 바이러스 벡터에 비해 α 서브유닛 및 β 서브유닛을 포함하는 인테그린에 대해 증가된 결합을 갖는다. 인테그린은 예를 들어, α4β7, α4β1, α1β1, α2β1, αEβ7, αLβ2, α5β1, α5β6, α5β5, α5β8, α5β8, α3β1, α5β1, α11β1, α5β3, α11β3, αVβ3, αVβ5, αVβ6, αVβ8일 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 하나 이상의 캡시드 단백질 변이체(예를 들어, AAV 캡시드 단백질 변이체) 또는 캡시드 단백질 변이체를 포함하는 하나 이상의 캡시드(예를 들어, AAV 캡시드)를 인코딩하는, 뉴클레오타이드 서열, 또는 이를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 어느 하나의 서열을 갖는 재조합 AAV 캡시드 단백질을 인코딩한다. 일부 구현예에서, 핵산은 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 및 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함한다. 뉴클레오타이드 서열은 DNA 서열 또는 RNA 서열일 수 있다. 발현 벡터는 제한되지 않고, 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스, AAV, 헤르페스바이러스, 백시니아, 폭스바이러스, 바쿨로바이러스 등), 또는 비-바이러스 벡터, 예를 들어, 플라스미드, 파아지, YAC, BAC 등일 수 있다. 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 또는 발현 벡터를 포함하는 세포를 제공한다. 세포는 시험관내, 생체외 또는 생체내일 수 있다.
바이러스 벡터를 제조하기 위한 방법
본 개시내용은 추가로 본원에 기재된 바이러스 벡터를 생성하는 방법을 제공한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용은 a) AAV 캡시드 단백질 상의 표면-노출된 잔기를 동정하는 단계; b) (a)에서 동정된 표면 노출된 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 AAV 캡시드 단백질의 라이브러리를 생성하는 단계; c) (b)의 AAV 캡시드 단백질 라이브러리로부터 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자를 생성하는 단계; d) 감염 및 복제가 발생할 수 있는 조건 하에서 (c)의 AAV 입자를 세포와 접촉시키는 단계; e) 적어도 하나의 감염 주기를 완료하고 대조군 AAV 입자와 유사하거나 더 큰 역가로 복제할 수 있는 AAV 입자를 선택하는 단계를 포함하는, 증가된 세포성 형질도입(예를 들어, T-세포로의 증가된 형질도입)을 갖는 AAV 벡터를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 단계 (d) 및 (e)는 1회 초과, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10회 반복된다. 표면 노출된 잔기를 동정하기 위한 방법의 비제한적인 예는 극저온 전자 현미경을 포함한다. 또한 AAV2(Xie 등, (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99: 10405-10), AAV9(DiMattia 등, (2012) J. Virol. 86:6947-6958), AAV8(Nam 등, (2007) J. Virol. 81: 12260-12271), AAV6(Ng 등, (2010) J. Virol. 84:12945-12957), AAV5(Govindasamy 등 (2013) J. Virol. 87, 11187-11199), AAV4(Govindasamy 등 (2006) J. Virol. 80:11556-11570), AAV3B(Lerch 등, (2010) Virology 403:26-36), BPV(Kailasan 등, (2015) J. Virol. 89:2603-2614) 및 CPV(Xie 등, (1996) J. Mol. Biol. 6:497-520 및 Tsao 등, (1991) Science 251:1456-64)의 결정 구조의 기재를 참조한다.
표면 노출된 잔기의 분리능 및 동정은 추가 선택 및/또는 스크리닝을 통해 동정될 수 있는 AAV 캡시드를 생성하기 위해 무작위, 합리적 및/또는 축퇴성 돌연변이 유발을 통한 후속 변형을 허용한다. 따라서, 추가의 구현예에서, 본 개시내용은 a) AAV 캡시드 단백질 상의 표면-노출된 아미노산 잔기를 동정하는 단계; b) (a)에서 동정된 표면 노출된 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 무작위, 합리적 및/또는 축퇴성 돌연변이 유발에 의해 생성하는 단계; c) (b)의 AAV 캡시드 단백질로부터의 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 입자를 생성하는 단계; d) 감염 및 복제가 발생할 수 있는 조건 하에서 (c)의 AAV 입자를 세포와 접촉시키는 단계; 및 e) 적어도 하나의 감염 주기를 완료하고 대조군 AAV 입자와 유사하거나 더 큰 역가로 복제할 수 있는 AAV 입자를 선택하는 단계를 포함하는, 증가된 세포성 형질도입(예를 들어, T 세포로의 증가된 형질도입)을 갖는 AAV 벡터를 생성하는 방법을 제공한다.
무작위, 합리적 및/또는 축퇴성 돌연변이유발에 의한 표면 노출된 아미노산 잔기의 아미노산 치환을 포함하는 AAV 캡시드 단백질을 생성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 이러한 포괄적인 접근법은 임의의 AAV 캡시드를 변형시키는 데 적용할 수 있는 플랫폼 기술을 제공한다. 이러한 플랫폼 기술을 적용하면 증진된 형질도입 효율을 갖는 본래의 AAV 캡시드 주형으로부터 유래된 AAV 변이체를 생성한다. 1개의 이점과 이득으로 상기 기술을 적용하면 AAV 벡터로 유전자 치료요법을 받을 수 있는 환자 코호트가 확대될 것이다.
일부 구현예에서, 본 개시내용은 바이러스 벡터를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포에 다음을 제공하는 것을 포함한다: (a) 적어도 하나의 TR 서열(예를 들어, AAV TR 서열)을 포함하는 핵산 주형, 및 (b) 핵산 주형의 복제를 위해서 및 AAV 캡시드로의 캡슐화를 위해 충분한 AAV 서열(예를 들어, AAV rep 서열 및 본 개시내용의 AAV 캡시드를 인코딩하는 AAV cap 서열). 임의로 핵산 주형은 적어도 하나의 이종 핵산 서열을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 주형은 2개의 AAV ITR 서열을 포함하고, 이는 이종 핵산 서열(존재하는 경우)의 5' 및 3'에 위치하지만, 이들은 직접 인접할 필요는 없다.
핵산 주형 및 AAV rep 및 cap 서열은 AAV 캡시드 내에 패키징된 핵산 주형을 포함하는 바이러스 벡터가 세포에서 생성되도록 하는 조건 하에 제공된다. 방법은 세포로부터 바이러스 벡터를 수거하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 바이러스 벡터는 배지로부터 및/또는 세포를 용해시킴에 의해 수거될 수 있다. 세포는 AAV 바이러스 복제를 허용하는 세포일 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 적합한 세포가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 포물 세포이다. 일부 구현예에서, 세포는 복제 결함 헬퍼 바이러스, 예를 들어 293 세포 또는 다른 E1a 트랜스-세포성 세포로부터 결실된 기능을 제공하는 트랜스-상보성 패키징 세포주일 수 있다.
AAV 복제 및 캡시드 서열은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 제공될 수 있다. 현재 프로토콜은 전형적으로 단일 플라스미드 상에 AAV rep/cap 유전자를 발현한다. AAV 복제 및 패키징 서열은 함께 제공될 필요는 없지만 그렇게 하는 것이 단편할 수 있다. AAV rep 및/또는 cap 서열은 임의의 바이러스 또는 비-바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, rep/cap 서열은 하이브리드 아데노바이러스 또는 헤르페스 벡터에 의해 제공될 수 있다(예를 들어, 결실된 아데노바이러스 벡터의 E1a 또는 E3 영역에 삽입됨). EBV 벡터는 또한 AAV cap 및 rep 유전자를 발현하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법의 하나의 이점은 EBV 벡터는 에포좀성이지만 연속적인 세포 분열에 걸쳐 높은 카피수를 유지한다(즉, "EBV 기반 핵 에피좀"으로서 지정된 염색체외 요소로서 세포에 안정적으로 통합된다, 문헌(Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67)을 참조한다). 추가의 대안으로서, rep/cap 서열은 세포에 안정적으로 혼입될 수 있다. 전형적으로 AAV rep/cap 서열은 이들 서열의 구조 및/또는 패키징을 방지하기 위해 TR에 의해 플랭킹된다.
핵산 주형은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 세포에 제공될 수 있다. 예를 들어, 주형은 비-바이러스(예를 들어, 플라스미드) 또는 바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산 주형은 헤르페스바이러스 또는 아데노바이러스 벡터에 의해 공급된다(예를 들어, 결실된 아데노바이러스의 E1a 또는 E3 영역에 삽입된다). 또 다른 예로서, 문헌(참조: Palombo 등, (1998) J. Virology 72:5025)은 AAV TR에 의해 플랭킹된 리포터 유전자를 갖는 바쿨로바이러스 벡터를 기재한다. EBV 벡터는 또한 rep/cap 유전자와 관련하여 상기에 기재된 바와 같은 주형을 전달하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 핵산 주형은 복제하는 rAAV 바이러스에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, 핵산 주형을 포함하는 AAV 프로바이러스는 세포의 염색체에 안정적으로 통합된다. 바이러스 역가를 증진시키기 위해 생산적인 AAV 감염을 촉진하는 헬퍼 바이러스 기능(예를 들어, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스)을 세포에 제공할 수 있다. AAV 복제를 위한 헬퍼 바이러스 서열은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 이들 서열은 헬퍼 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 벡터에 의해 제공된다. 대안적으로, 아데노바이러스 또는 헤르페스바이러스 서열은, 예를 들어, 문헌(Ferrari 등, (1997) Nature Med. 3: 1295, 및 미국 특허 번호 6,040,183 및 6,093,570)에 기재된 바와 같이 효율적인 AAV 생성을 촉진시키는 모든 헬퍼 유전자를 갖는 비감염성 아데노바이러스 미니플라스미드로서 또 다른 비-바이러스 또는 바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다.
또한, 헬퍼 바이러스 기능은 염색체에 포매되거나 안정한 염색체외 요소로서 유지되는 헬퍼 서열을 갖는 패키징 세포에 의해 제공될 수 있다. 일반적으로, 헬퍼 바이러스 서열은 AAV 비리온에 패키징될 수 없고, 예를 들어, TR에 의해 플랭킹되지 않는다. 당업자는 단일 헬퍼 작제물 상에 AAV 복제 및 캡시드 서열 및 헬퍼 바이러스 서열(예를 들어, 아데노바이러스 서열)을 제공하는 것이 유리할 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 헬퍼 작제물은 비바이러스 또는 바이러스 작제물일 수 있다. 하나의 비제한적 예시로서, 헬퍼 작제물은 AAV rep/cap 유전자를 포함하는 하이브리드 아데노바이러스 또는 하이브리드 헤르페스바이러스일 수 있다. 일부 구현예에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 공급된다. 이러한 벡터는 추가로 핵산 주형을 포함할 수 있다. AAV rep/cap 서열 및/또는 rAAV 주형은 아데노바이러스의 결실된 영역 (예를 들어, E1a 또는 E3 영역)으로 삽입될 수 있다.
일부 구현예에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 공급된다. rAAV 주형은 예를 들어, 플라스미드 주형으로서 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼 벡터에 의해 제공되고, rAAV 주형은 프로바이러스로서 세포에 통합된다. 대안적으로, rAAV 주형은 염색체외 요소로서(예를 들어, EBV 기반 핵 에피좀으로서) 세포 내에서 유지되는 EBV 벡터에 의해 제공된다.
일부 구현예에서, AAV rep/cap 서열 및 아데노바이러스 헬퍼 서열은 단일 아데노바이러스 헬퍼에 의해 제공된다. rAAV 주형은 별도의 복제 바이러스 벡터로서 제공될 수 있다. 예를 들어, rAAV 주형은 rAAV 입자 또는 두 번째 재조합 아데노바이러스 입자에 의해 제공될 수 있다. 상기한 방법에 따르면, 하이브리드 아데노바이러스 벡터는 전형적으로 아데노바이러스 복제 및 패키징에 충분한 아데노바이러스 5' 및 3' 시스 서열(즉, 아데노바이러스 말단 반복체 및 PAC 서열)을 포함한다. AAV rep/cap 서열 및 존재하는 경우, rAAV 주형은 아데노바이러스 백본에 삽입되고 5' 및 3' 시스 서열에 의해 플랭킹되어 이들 서열은 아데노바이러스 캡시드로 패키징될 수 있다. 상기한 바와 같이, 아데노바이러스 헬퍼 서열 및 AAV rep/cap 서열은 일반적으로 TR에 의해 플랭킹되지 않아 이들 서열은 AAV 비리온으로 패키징되지 않는다. 문헌(Zhang 등, ((2001) Gene Ther. 18:704-12)은 아데노바이러스 및 AAV rep 및 cap 유전자 둘 다를 포함하는 키메라 헬퍼를 기재한다.
헤르페스바이러스는 또한 AAV 패키징 방법에서 헬퍼 바이러스로 사용될 수 있다. AAV Rep 단백질(들)을 인코딩하는 하이브리드 헤르페스바이러스는 유리하게 확장 가능한 AAV 벡터 생산 방식을 촉진할 수 있다. AAV-2 rep 및 cap 유전자를 발현하는 하이브리드 헤르페스 심플렉스 바이러스 유형 I (HSV-1) 벡터는 문헌(참조: Conway 등, (1999) Gene Therapy 6:986 및 WO 00/17377)에 기재되었다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 예를 들어 문헌[Urabe 등, (2002) Human Gene Therapy 13: 1935-43]에 기재된 바와 같이 rep/cap 유전자 및 rAAV 주형을 전달하기 위해 바쿨로바이러스 벡터를 사용하여 곤충 세포에서 생산될 수 있다.
오염 헬퍼 바이러스가 없는 AAV 벡터 스톡은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, AAV 및 헬퍼 바이러스는 크기별로 용이하게 구분될 수 있다. AAV는 또한 헤파란 기질에 대한 친화도를 기반으로 헬퍼 바이러스로부터 분리될 수 있다(Zolotukhin 등 (1999) Gene Therapy 6:973). 결실된 복제 결함 헬퍼 바이러스는 임의의 오염 헬퍼 바이러스가 복제 능력이 없도록 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 바이러스의 패키징을 매개하기 위해 아데노바이러스 초기 유전자 발현만이 요구되기 때문에, 후기 유전자 발현이 결여된 아데노바이러스 헬퍼가 사용될 수 있다. 후기 유전자 발현에 결함이 있는 아데노바이러스 돌연변이체(예를 들어, ts100K 및 ts149 아데노바이러스 돌연변이체)는 당업계에 공지되어 있다.
재조합 바이러스 벡터
본 개시내용은 본원에 기재된 캡시드 단백질(예를 들어, AAV 캡시드 단백질) 중 적어도 하나 또는 캡시드(예를 들어, AAV 캡시드) 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, 재조합 AAV 벡터)를 제공하고, 여기서 캡시드 단백질은 본원에 기재된 하나 이상의 형질도입 관련 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 야생형 AAV 벡터 또는 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터와 비교하여 T 세포와 같은 세포로의 증가된 형질도입을 나타낸다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 야생형 AAV 벡터 또는 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터와 비교하여 T-세포의 핵으로의 증가된 형질도입을 나타낸다. 일부 구현예에서, AAV 벡터는 야생형 AAV 벡터 또는 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터와 비교하여 T-세포의 시토졸로의 증가된 형질도입을 나타낸다.
본 개시내용의 재조합 바이러스 벡터는 시험관내, 생체외 및 생체내에서 핵산을 세포로 전달하는데 유용하다. 변형된 바이러스 캡시드에 의해 패키징되고 세포 내로 전달될 수 있는 분자는 이종 DNA, RNA, 폴리펩타이드, 작은 유기 분자, 금속 또는 이들의 조합을 포함한다. 특히, 바이러스 벡터는 포물 세포를 포함하는 동물 세포에 핵산을 전달 또는 이동시키는데 유리하게 사용될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 핵산("카고 핵산")은 본 개시내용의 캡시드 단백질에 의해 캡슐화될 수 있다. 본 개시내용의 바이러스 벡터에 전달되는 카고 핵산 서열은 임의의 관심 있는 이종 핵산 서열(들)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 AAV 벡터에 의해 전달되는 이종 핵산의 발현은 야생형 AAV 벡터(예를 들어, AAV6 벡터) 또는 본원에 기재된 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터에 의해 전달되는 이종 핵산의 발현과 비교하여 증가된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 AAV 벡터에 의해 전달되는 이종 핵산의 발현은 야생형 AAV 벡터(예를 들어, AAV6 벡터) 또는 본원에 기재된 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터에 의해 전달되는 이종 핵산의 발현과 비교하여, 그 사이에 있는 모든 값 및 하위 범위를 포함하여, 적어도 약 1.5배, 예를 들어 약 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배 증가된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 AAV 벡터에 의해 전달되는 이종 핵산의 발현은 야생형 AAV 벡터(예를 들어, AAV6 벡터) 또는 본원에 기재된 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터에 의해 전달되는 이종 핵산의 발현과 비교하여, 그 사이에 있는 모든 값 및 하위 범위를 포함하여, 적어도 약 10%, 예를 들어 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90% 또는 약 100% 증가된다.
관심 있는 핵산은 치료학적(예를 들어, 의료용 또는 수의학용) 또는 면역원성(예를 들어, 백신용) 폴리펩타이드 또는 RNA를 포함하는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 카고 핵산은 치료학적 단백질 또는 치료학적 RNA를 인코딩한다.
치료학적 폴리펩타이드는 키메라 항원 수용체(CAR), ABCD1, 베타 글로빈(HBB), 헤모글로빈 A, 헤모글로빈 F, 낭포성 섬유증 막횡단 조절 단백질(CFTR), 디스트로핀(미니- 및 마이크로- 디스트로핀을 포함하는, 예를 들어, Vincent 등, (1993) Nature Genetics 5: 130; 미국 특허 공개 번호 2003/017131; 국제 공개 WO/2008/088895, Wang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 참조 97: 1 3714-13719 (2000); 및 Gregorevic 등, Mol. Ther. 16:657-64 (2008) 참조), 미오스타틴 프로펩타이드, 폴리스타틴, 액티빈 유형 11 가용성 수용체, IGF-1, 항염증 폴리펩타이드, 예를 들어, Ikappa B 우성 돌연변이체, 사르코스판, 유트로핀(Tinsley 등, (1996) Nature 384:349), 미니-유트로핀, 응고 인자(예를 들어, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X 등), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 카탈라제, 티로신 하이드록실라제, 슈퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, LDL 수용체, 지질단백질 리파제, 오르니틴 트랜스카바밀라제, β-글로빈, a-글로빈, 스펙트린, 알파-1-안티트립신, 아데노신 데아미나제, 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, β-글루코세레브로시다제, 스핑고미엘리나제, 리소좀 헥소사미니다제 A, 분지쇄 케토산 데하이드로게나제, RP65 단백질, 사이토킨(예를 들어, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 감마-인터페론, 인터류킨-2, 인터류킨-4, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 림프독소, 및 등), 펩타이드 성장 인자, 신경영양 인자 및 호르몬(예를 들어, 소마토트로핀, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자 1 및 2, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 신경영양 인자 -3 및 -4, 뇌유래 신경영양 인자, 뼈 형성 단백질[RANKL 및 VEGF 포함], 아교세포 유래 성장 인자, 형질전환 성장 인자 -α 및 -β 등), 리소좀산 알파-글루코시다제, 알파-갈락토시다제 A, 수용체 (예를 들어, 종양 괴사 성장 인자 가용성 수용체), S100A1, 파르발부민, 아데닐릴 사이클라제 유형 6, 칼슘 처리를 조절하는 분자(예를 들어, SERCA2A, PP1의 억제제 1 및 이의 단편[예를 들어, WO 2006/029319 및 WO 2007/100465]), 절단된 항시성 활성 bARKct와 같은 G-단백질 커플링된 수용체 키나제 유형 2 녹다운, IRAP와 같은 항염증 인자, 항미오스타틴 단백질, 아스파르토아실라제, 모노클로날 항체(단일쇄 모노클로날 항체 포함; Mab의 예는 Herceptin® Mab임), 신경펩타이드 및 이의 단편(예를 들어, 갈라닌, 신경펩타이드 Y(U.S. 7,071,172 참조), 바소히빈 및 기타 VEGF 억제제와 같은 혈관신생 억제제(예를 들어, 바소히빈 2[WO JP2006/073052 참조])를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 다른 예시적인 이종 핵산 서열은 자살 유전자 생성물(예를 들어, 티미딘 키나제, 시토신 데아미나제, 디프테리아 독소 및 종양 괴사 인자), 숙주 인자의 전사를 증진시키거나 억제하는 단백질(예를 들어, 전사 인핸서 또는 억제제 요소에 연결된 뉴클레아제-데드 Cas9, 전사 인핸서 또는 억제제 요소에 연결된 아연-핑거 단백질, 전사 인핸서 또는 억제제 요소에 연결된 전사 활성화인자 유사(TAL) 이펙터), 암 치료에 사용되는 약물에 대한 내성을 부여하는 단백질, 종양 서프레서 유전자 생성물(예를 들어, p53, Rb, Wt-1), TRAIL, FAS-리간드, 및 치료를 필요로 하는 개체에서 치료학적 효과를 갖는 임의의 다른 폴리펩타이드를 인코딩한다. AAV 벡터는 또한 모노클로날 항체 및 항체 단편, 예를 들어 미오스타틴에 대해 지시된 항체 또는 항체 단편을 전달하는데 사용될 수 있다(참조: 예를 들어, Fang 등, Nature Biotechnology 23:584-590 (2005)). 폴리펩타이드를 인코딩하는 이종 핵산 서열은 리포터 폴리펩타이드(예를 들어, 효소)를 인코딩하는 것을 포함한다. 리포터 폴리펩타이드는 당업계에 공지되어 있고, 녹색 형광 단백질, β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, 루시퍼라제 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 임의로, 이종 핵산은 분비된 폴리펩타이드(예를 들어, 천연 상태의 분비된 폴리펩타이드이거나, 예를 들어 당업계에 공지된 바와 같이 분비 신호 서열과의 작동가능한 회합에 의해 분비되도록 조작된 폴리펩타이드)를 인코딩한다.
대안적으로, 본 개시내용의 일부 구현예에서, 이종 핵산은 안티센스 핵산, 리보자임(예를 들어, 미국 특허 제5,877,022호에 기재된 바와 같음), 스플라이스좀-매개/램-스플라이싱에 영향을 미치는 RNA(참조: Puttaraju 등, (1999) Nature Biotech. 17:246; 미국 특허 제6,013,487호; 미국 특허 제6,083,702호), 유전자 사일런싱을 매개하는 siRNA, shRNA 또는 miRNA를 포함하는 간섭 RNA(RNAi)(참조: Sharp 등, (2000) Science 287:2431), 및 "가이드" RNA와 같은 기타 번역되지 않은 RNA(Gorman 등, (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95:4929; 미국 특허 번호 5,869,248 내지 Yuan 등) 등을 인코딩할 수 있다. 번역되지 않은 예시적인 RNA는 다중 약물 내성(MDR) 유전자 산물(예를 들어, 종양을 치료 및/또는 예방하고/하거나 화학치료요법에 의한 손상을 방지하기 위해 심장에 투여하기 위해)에 대한 RNAi, 미오스타틴에 대한 RNAi(예를 들어, 뒤센 근이영양증에 대해), VEGF에 대한 RNAi(예를 들어, 종양을 치료 및/또는 예방하기 위해), 포스포람반에 대한 RNAi(예를 들어, 심혈관 질환을 치료하기 위해, 예를 들어, Andino 등, J. Gene Med. 10: 132-142 (2008) 및 Li 등, Acta Pharmacol Sin. 26:51-55 (2005) 참조); 포스포람반 억제 또는 우성-네거티브 분자, 예를 들어, 포스포람반 S 16E(예를 들어, 심혈관 질환을 치료하기 위해, 예를 들어, Hoshijima 등 Nat. Med. 8:864-871 (2002) 참조), 아데노신 키나제에 대해 지시된 RNAi(예를 들어, 간질) 및 병원성 유기체 및 바이러스(예를 들어, B형 및/또는 C형 간염 바이러스, 사람 면역결핍 바이러스, CMV, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 사람 유두종 바이러스 등)에 대해 지시된 RNAi를 포함한다.
또한, 대안적 스플라이싱을 지시하는 핵산 서열이 전달될 수 있다. 설명을 위해, 디스트로핀 엑손 51의 5' 및/또는 3' 스플라이스 부위에 상보적인 안티센스 서열(또는 다른 억제 서열)은 U1 또는 U7 소핵(sn) RNA 프로모터와 함께 전달되어 엑손의 스키핑을 유도할 수 있다. 예를 들어, 안티센스/억제 서열(들)에 대해 5'에 위치한 U1 또는 U7 snRNA 프로모터를 포함하는 DNA 서열은 본 개시내용의 변형된 캡시드에 패키징 및 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 편집을 지시하는 핵산 서열이 전달될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 가이드 RNA 또는 뉴클레아제와 같은 유전자 편집 분자를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵산은 아연 핑거 뉴클레아제, 호밍 엔도뉴클레아제, TALEN(전사 활성화인자-유사 이펙터 뉴클레아제), NgAgo(아그로노트 엔도뉴클레아제), SGN(구조 유도된 엔도뉴클레아제) 또는 Cas9 뉴클레아제 또는 Cpf1 뉴클레아제와 같은 RGN(RNA-유도 뉴클레아제)을 인코딩할 수 있다.
바이러스 벡터는 또한 숙주 염색체 상의 유전자좌와 상동성을 공유하고 재조합하는 이종 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 접근법은 예를 들어 숙주 세포의 유전학적 결함을 보정하기 위해 활용될 수 있다.
본 개시내용은 또한 예를 들어 백신접종을 위한 면역원성 폴리펩타이드를 발현하는 바이러스 벡터를 제공한다. 핵산은 사람 면역결핍 바이러스(HIV), 시미안 면역결핍 바이러스(SIV), 인플루엔자 바이러스, HIV 또는 SIV gag 단백질, 종양 항원, 암 항원, 세균 항원, 바이러스 항원 등으로부터의 면역원을 포함하지만 이에 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 관심 있는 면역원을 인코딩할 수 있다.
백신 벡터로서 파르보바이러스의 사용은 당업계에 공지되어 있다(참조: 예를 들어, Miyamura 등, (1994) Proc. Nat. Acad. Sci USA 91:8507; 미국 특허 번호 5,916,563 내지 Young 등, 미국 특허 번호 5,905,040 내지 Mazzara 등, 미국 특허 번호 5,882,652, 미국 특허 번호 5,863,541 내지 Samulski 등). 항원은 파르보바이러스 캡시드에 제공될 수 있다. 대안적으로, 항원은 재조합 벡터 게놈으로 도입된 이종 핵산으로부터 발현될 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 및/또는 당업계에 공지된 임의의 관심 있는 면역원은 본 개시내용의 바이러스 벡터에 의해 제공될 수 있다.
면역원성 폴리펩타이드는 미생물, 세균, 원생동물, 기생충, 진균류 및/또는 바이러스 감염 및 질병을 포함하지만 이에 제한되지 않는 감염 및/또는 질환에 대해 면역반응을 유발하고/하거나 대상체를 보호하기에 적합한 임의의 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어, 면역원성 폴리펩타이드는 오르토믹소바이러스 면역원(예를 들어, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(HA) 표면 단백질 또는 인플루엔자 바이러스 핵단백질과 같은 인플루엔자 바이러스 면역원, 또는 말 인플루엔자 바이러스 면역원) 또는 렌티바이러스 면역원(예를 들어, 말 전염성 빈혈 바이러스 면역원, 시미안 면역결핍 바이러스(SIV) 면역원 또는 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 면역원, 예를 들어 HIV 또는 SIV 외피 GP 160 단백질, HIV 또는 SIV 매트릭스/캡시드 단백질 및 HIV 또는 SIV gag, pol 및 env 유전자 생성물)일 수 있다. 면역원성 폴리펩타이드는 또한 아레나바이러스 면역원(예를 들어, 라사 열 바이러스 뉴클레오캡시드 단백질 및 라사 열 외피 당단백질과 같은 라사 열 바이러스 면역원), 폭스바이러스 면역원(예를 들어 백시니아 LI 또는 L8 유전자 생성물과 같은 백시니아 바이러스 면역원), 플라비바이러스 면역원(예를 들어. 황열병 바이러스 면역원 또는 일본 뇌염 바이러스 면역원), 필로바이러스 면역원(예를 들어, 에볼라 바이러스 면역원 또는 NP 및 GP 유전자 생성물과 같은 마르부르크 바이러스 면역원), 분야바이러스 면역원(예를 들어, RVFV, CCHF 및/또는 SFS 바이러스 면역원) 또는 코로나바이러스 면역원(예를 들어, 사람 코로나바이러스 외피 당단백질과 같은 감염성 사람 코로나바이러스 면역원, 또는 돼지 전염성 위장염 바이러스 면역원, 또는 조류 전염성 기관지염 바이러스 면역원)일 수 있다. 면역원성 폴리펩타이드는 추가로 폴리오 면역원, 헤르페스 면역원(예를 들어, CMV, EBV, HSV 면역원), 볼거리 면역원, 홍역 면역원, 루벨라 면역원, 디프테리아 독소 또는 다른 디프테리아 면역원, 백일해 항원, 간염(예를 들어, A형 간염, B형 간염, C형 간염 등) 면역원, 및/또는 현재 당업계에 알려져 있거나 나중에 면역원으로 동정된 임의의 다른 백신 면역원일 수 있다.
대안적으로, 면역원성 폴리펩타이드는 임의의 종양 또는 암 세포 항원일 수 있다. 임의로 종양 또는 암 항원은 암 세포의 표면상에서 발현된다.
예시적인 암 및 종양 세포 항원은 S.A. Rosenberg (Immunity 10:281 (1991)에 기재되어 있다. 다른 예시적 암 및 종양 항원은 하기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: BRCA1 유전자 생성물, BRCA2 유전자 생성물, gp100, 티로시나제, GAGE- 1/2, BAGE, RAGE, LAGE, NY-ESO-1, CDK-4, β-카테닌, MUM-1, 카스파제-8, KIAA0205, HPVE, SART-1, FRAME, p15, 흑색종 종양 항원 (참조: Kawakami 등, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515; Kawakami 등, (1994) J. Exp. Med., 180:347; Kawakami 등, (1994) Cancer Res. 54:3124), MART-1, gp100, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, CEA, TRP-1, TRP-2, P-15, 티로시나제 (Brichard 등, (1993) J Exp. Med. 178:489); HER-2/neu 유전자 생성물 (미국 특허 번호 4.968.603), CA 125, LK26, FB5(엔도시알린), TAG 72, AFP, CA 19-9, NSE, DU-PAN-2, CA50, SPan-1, CA72-4, HCG, STN(시알릴 Tn 항원), c-erbB-2 단백질, PSA, L-CanAg, 에스트로겐 수용체, 우유 지방 글로불린, p53 종양 억제 단백질(참조: Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623); 뮤신 항원 (국제 특허 공개 번호 WO 90/05142); 텔로머라제; 핵 매트릭스 단백질; 프로스타트산 포스파타제; 파필로마 바이러스 항원; 및/또는 하기의 암과 관련된 것으로 지금 공지되거나 이후 발견된 항원: 흑색종, 선암종, 흉선종, 림프종(예를 들어, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종), 육종, 폐암, 간암, 결장암, 백혈병, 자궁암, 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 방광암, 콩팥암, 췌장암, 뇌암 및 임의의 기타 암 또는 악성 병태 또는 지금 공지되거나 이후 동정된 전이(참조: 예를 들어, Rosenberg, (1996) Ann. Rev. Med. 47:481-91).
관심 있는 이종 핵산(들)이 적절한 제어 서열과 작동가능하게 연관될 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 예를 들어, 이종 핵산은 전사/번역 제어 신호, 복제 오리진, 폴리아데닐화 신호, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 프로모터 및/또는 인핸서 등과 같은 발현 제어 요소와 작동 가능하게 연관될 수 있다.
추가로, 관심 있는 이종 핵산(들)의 조절된 발현은 예를 들어 올리고뉴클레오타이드, 소분자 및/또는 특정 부위에서 스플라이싱 활성을 선택적으로 차단하는 다른 화합물의 존재 또는 부재에 의해 상이한 인트론의 선택적 스플라이싱을 조절함으로써 전사 후 수준에서 달성될 수 있다(예를 들어, WO 2006/119137에 기재된 바와 같이).
당업자는 목적하는 수준 및 조직 특이적 발현에 따라 다양한 프로모터/인핸서 요소가 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 프로모터/인핸서는 목적하는 발현 패턴에 따라 항시성이거나 유도성일 수 있다. 프로모터/인핸서는 고유 또는 외래일 수 있고 천연 또는 합성 서열일 수 있다. 외래란 전사 개시 영역이, 전사 개시 영역이 도입된 야생형 숙주에서 발견되지 않은 것으로 의도된다.
일부 구현예에서, 프로모터/인핸서 요소는 치료될 표적 세포 또는 대상체에 고유할 수 있다. 대표적인 구현예에서, 프로모터/인핸서 요소는 이종 핵산 서열에 고유할 수 있다. 프로모터/인핸서 요소는 일반적으로 관심 대상 세포(들)에서 기능하도록 선택된다. 추가로, 일부 구현예에서 프로모터/인핸서 요소는 포유동물 프로모터/인핸서 요소이다. 프로모터/인핸서 요소는 항시성 또는 유도성일 수 있다.
유도성 발현 제어 요소는 일반적으로 이종 핵산 서열(들)의 발현에 대한 조절을 제공하는 것이 바람직한 적용에서 유리하다. 유전자 전달을 위한 유도성 프로모터/인핸서 요소는 조직 특이적 또는 바람직한 프로모터/인핸서 요소일 수 있고, 근육 특이적 또는 바람직한(심장, 골격 및/또는 평활근 특이적 또는 바람직한을 포함), 신경 조직 특이적 또는 바람직한(뇌-특이적 또는 바람직한을 포함), 눈 특이적 또는 바람직한(망막 특이적 및 각막 특이적 포함), 간 특이적 또는 바람직한, 골수 특이적 또는 바람직한, 췌장 특이적 또는 바람직한, 비장 특이적 또는 바람직한, 및 폐 특이적 또는 바람직한 프로모터/인핸서 요소를 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터 및/또는 인핸서와 같은 유도성 발현 제어 요소는 T-세포에서 선택적 발현을 촉진한다. 다른 유도성 프로모터/인핸서 요소는 호르몬 유도성 및 금속 유도성 요소를 포함한다. 예시적인 유도성 프로모터/인핸서 요소는 Tet 온/오프 요소, RU486-유도성 프로모터, 엑디손-유도성 프로모터, 라파마이신-유도성 프로모터 및 메탈로티오네인 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
이종 핵산 서열(들)이 전사된 후 표적 세포에서 번역되는 구현예에서, 일반적으로 삽입된 단백질 인코딩 서열의 효율적인 번역을 위해 특정 개시 신호가 포함된다. ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함할 수 있는 이들 외인성 번역 제어 서열은 천연 및 합성 모두에서 다양한 기원을 가질 수 있다.
약제학적 조성물 및 사용 방법
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 AAV 캡시드 단백질, AAV 캡시드, 바이러스 벡터, 핵산, 발현 벡터 및/또는 세포 중 적어도 하나를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 추가로 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 일부 구현예에서, 약제학적으로 허용되는 담체 및 임의로 다른 의약 제제, 약제학적 제제, 안정화제, 완충제, 담체, 보조제, 희석제 등 중에 본 개시내용의 바이러스 벡터 및/또는 캡시드 및/또는 캡시드 단백질 및/또는 바이러스 입자를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 주사를 위해, 담체는 전형적으로 액체이다. 다른 투여 방식의 경우 담체는 고체 또는 액체일 수 있다. 흡입 투여의 경우, 담체는 흡입가능할 것이고 선택적으로 고체 또는 액체 미립자 형태일 수 있다. "약제학적으로 허용되는"은 독성이 없거나 바람직하지 않은 물질을 의미하고, 즉 물질은 임의의 바람직하지 않은 생물학적 효과를 일으키지 않고 대상체에게 투여될 수 있다.
본 개시내용에 따른 바이러스 벡터는 분열 및 비분열 세포를 포함하는 광범위한 세포로 이종 핵산을 전달하기 위한 수단을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 T-세포이다. 바이러스 벡터는 예를 들어 시험관내에서 또는 생체외 유전자 치료요법을 위해 폴리펩타이드를 생산하기 위해 시험관내 세포에 관심 있는 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 추가로, 면역원성 또는 치료학적 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA를 발현하기 위해 핵산을 치료를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 방법에 유용하다. 이러한 방식으로, 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA는 대상체에서 생체내에서 생성될 수 있다. 대상체는 폴리펩타이드가 결핍되어 있기 때문에 대상체는 폴리펩타이드를 필요로 할 수 있다. 또한, 대상체에서 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA의 생산이 일부 유익한 효과를 부여할 수 있기 때문에 방법이 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내 세포에서 폴리펩타이드 또는 RNA를 발현시키는 단계, 및 임의로 세포로부터 폴리펩타이드 또는 RNA를 단리하는 단계를 포함한다. 바이러스 벡터는 또한 배양된 세포 또는 대상체에서 관심 있는 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA를 생성하기 위해 사용될 수 있다(예를 들어, 대상체를 생물반응기로 사용하여 폴리펩타이드를 생성하거나 대상체에 대한 기능적 RNA의 효과를 관찰하기 위해, 예를 들어 스크리닝 방법과 관련하여).
본 개시내용은 대상체에게 본 개시내용의 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및/또는 조성물 중 어느 하나를 투여하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 개시내용은 유효량의 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터) 중 어느 하나, 바이러스 입자(예를 들어, AAV 입자) 중 어느 하나, 및/또는 본원에 기재된 조성물 중 어느 하나를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 따라서, 본 개시내용은 의약으로서 사용하기 위한, 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법에 사용하기 위한, 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터) 중 어느 하나, 바이러스 입자(예를 들어, AAV 입자) 중 어느 하나, 및/또는 본원에 기재된 조성물 중 어느 하나를 제공한다.
일부 구현예에서, 본원 개시내용의 바이러스 벡터는 치료학적 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA를 전달하는 것이 이로운 임의의 질환 상태를 치료 및/또는 예방하기 위해 폴리펩타이드 또는 기능성 RNA를 인코딩하는 이종 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 질환 상태는 T-세포의 기능부전 또는 증가와 연관되거나, 상호관련되거나, 이에 의해 야기된다. 일부 구현예에서, 질환 상태는 낭포성 섬유증(낭포성 섬유증 막관통 조절 단백질) 및 폐의 다른 질환, 혈우병 A(인자 VIII), 혈우병 B(인자 IX), 지중해빈혈(β-글로빈), 빈혈(에리트로포이에틴) 및 기타 혈액 장애를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 알츠하이머 질환(GDF; 네프릴리신), 다발성 경화증(β-인터페론), 파킨슨 질환(신경교 세포주 유래 신경영양 인자[GDNF]), 헌팅턴 질환(반복체를 제거하는 RNAi), 근위축성 측삭 경화증, 간질(갈라닌, 신경영양 인자), 및 기타 신경학적 장애, 암(엔도스타틴, 안지오스타틴, TRAIL, FAS-리간드, 인터페론을 포함하는 사이토킨; VEGF 또는 다중 약물 내성 유전자 생성물인 mir-26a[예를 들어, 간세포 암종에 대한]에 대한 RNAi를 포함하는 RNAi), 진성 당뇨병(인슐린), 뒤센 (디스트로핀, 미니-디스트로핀, 인슐린 유사 성장 인자 I, 사르코글리칸[예를 들어, a, β, γ], 미오스타틱 미오스타틴 프로펩타이드에 대한 RNAi, 폴리스타틴, 액티빈 유형 II 가용성 수용체, Ikappa B 우성 돌연변이체, 사코스판, 우트로핀, 미니-우트로핀, 안티센스 또는 엑손 스키핑을 유도하기 위한 디스트로핀 유전자의 스플라이스 접합부에 대한 RNAi와 같은 염증성 폴리펩타이드[예를 들어, WO/2003/095647 참조], 엑손 스키핑을 유도하기 위한 U7 snRNA에 대한 안티센스[예를 들어, WO/2006/021724 참조], 및 미오스타틴 또는 미오스타틴 프로펩타이드에 대한 항체 또는 항체 단편) 및 베커, 고셔 질환(글루코세레브로시다제), 헐러 질환(a-L-이두로니다제), 아데노신 데아미나제 결핍(아데노신 데아미나제), 글리코겐 저장 질환(예를 들어, 파브리 질환[α-갈락토시다제] 및 폼페 질환[리소좀산 알파-글루코시다제]) 및 기타 대사 장애, 선천성 폐기종(알파-1-항트립신), 레슈니한 증후군(하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제), 니만-픽 질환(스핑고미엘리나제), 테이-삭스(Tay-Sachs) 질환(리소좀 헥소사미니다제 A), 메이플 시럽뇨 질환(분지쇄 케토산 데하이드로게나제), 망막 퇴행성 질환(및 기타 눈 및 망막 질환; 예를 들어, 황반 변성을 위한 PDGF 및/또는 바소히빈 또는 VEGF의 다른 억제제 또는 예를 들어 제I형 당뇨병에서 망막 장애를 치료/예방하기 위한 다른 혈관신생 억제제, 뇌와 같은 고형 기관의 질병(파킨슨병[GDNF], 성상세포종 포함[VEGF에 대한 엔도스타틴, 안지오스타틴 및/또는 RNAi], 교모세포종[VEGF에 대한 엔도스타틴, 안지오스타틴 및/또는 RNAi]), 간, 콩팥, 울혈성 심부전 또는 말초 동맥 질환(PAD)을 포함한 심장(예를 들어, 단백질 포스파타제 억제제 I(I-1) 및 이의 단편(예를 들어, IlC), serca2a, 포스포람반 유전자를 조절하는 아연 핑거 단백질, Barkct, [32-아드레날린 수용체, 2-아드레날린 수용체 키나아제(BARK), 포스포이노시타이드-3 키나제(PI3 키나제)), S100A1, 파르발부민, 아데닐릴 시클라제 유형 6, 절단된 구성적 활성 bARKct와 같은 G-단백질 커플링된 수용체 키나제 유형 2 녹다운에 영향을 미치는 분자, 칼사르신, 포스포람반에 대한 RNAi, 포스포람반 억제 또는 포스포람반 S16E와 같은 우성 음성 분자, 등), 관절염(인슐린 유사 성장 인자), 관절 장애(인슐린 유사 성장 인자 1 및/또는 2), 내막 증식(예를 들어, enos, inos 전달에 의한), 심장 이식의 생존율 향상(슈퍼옥사이드 디스뮤타제), AIDS(가용성 CD4), 근육 소모(인슐린 유사 성장 인자 I), 신장 결핍(에리스로포이에틴), 빈혈(에리스로포이에틴), 관절염(I RAP 및 TNFa 수용성 수용체와 같은 항염증 인자), 간염(a-인터페론) , LDL 수용체 결핍증(LDL 수용체), 고암모니아혈증(오르니틴 트랜스카르바밀라제), 크라베병(갈락토세레브로시다제), 바텐 질환, SCA1, SCA2 및 SCA3을 포함하는 척수 뇌 운동실조, 페닐케톤뇨증(페닐알라닌 하이드록실라제), 자가면역 질환 등. 본 개시내용은 이식체의 성공을 증가시키기 위해 및/또는 장기 이식 또는 보조 치료요법의 부정적인 부작용을 감소시키기 위해(예를 들어, 면역억제제 또는 사이토킨 생성을 차단하기 위한 억제 핵산을 투여함으로써) 장기 이식 후에 추가로 사용될 수 있다. 또 다른 예로서, 뼈 형태 형성 단백질(BNP 2, 7 등, RANKL 및/또는 VEGF 포함)은 예를 들어 암 환자의 골절 또는 외과적 제거 후 뼈 동종이식편과 함께 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 간 질환 또는 장애를 치료 및/또는 예방하기 위해 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA를 인코딩하는 이종 핵산을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 간 질환 또는 장애는 예를 들어 원발성 담즙성 간경변증, 비알코올성 지방간 질환(NAFLD), 비알코올성 지방간염(NASH), 자가면역 간염, B형 간염, C형 간염, 알코올성 간질환, 섬유증, 황달, 원발성 경화증 담관염(PSC), 버드 키아리(Budd-Chiari) 증후군, 혈색소침착증, 윌슨 질환, 알코올성 섬유증, 비알코올성 섬유증, 간 지방증, 길버트 증후군, 담도 폐쇄증, 알파-1-항트립신 결핍증, 알라길 증후군, 진행성 가족성 간내 담즙정체, 혈우병 B, 유전성 혈관부종(HAE), 동형접합 가족성 고콜레스테롤혈증(HoFH), 이형접합 가족성 고콜레스테롤혈증(HeFH), 폰 기르케 질환(GSD I), A형 혈우병, 메틸말론산혈증, 프로피온산혈증, 호모시스틴뇨증, 페닐케톤뇨증(PKU), 티로신혈증 1형, 아르기나아제 1 결핍, 아르기니노숙시네이트 리아제 결핍, 카바모일-포스페이트 신테타제 1 결핍, 시트룰린혈증 1형, 시트린 결핍증, 크리글러-나자르 증후군 1형, 시스틴증, 파브리 질환, 글리코겐 저장 질환 1b, LPL 결핍, N-아세틸글루타메이트 신테타제 결핍, 오르니틴 트랜스카바밀라제 결핍, 오르니틴 트랜스로카제 결핍, 원발성 고옥살뇨증(Hyperoxaluria) 1형 또는 ADA SCID일 수 있다.
본원에 기재된 바이러스 벡터는 또한 유도 만능 줄기 세포(iPS)를 생산하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 줄기 세포 관련된 핵산(들)을 성체 섬유아세포, 피부 세포, 간 세포, 신장 세포, 지방 세포, 심장 세포, 신경 세포, 상피 세포, 내피 세포 등과 같은 비-만능 세포로 전달하기 위해 사용될 수 있다.
줄기 세포와 연관된 인자를 인코딩하는 핵산은 당업계에 공지되어 있다. 줄기 세포 및 만능과 관련된 상기 인자들의 비제한적인 예는 Oct-3/4, SOX 계열(예를 들어, SOX 1, SOX2, SOX3 및/또는 SOX 15), Klf 계열(예를 들어, Klfl, KHZ Klf4 및/또는 Klf5), Myc 계열(예를 들어, C-myc, L-myc 및/또는 N-myc), NANOG 및/또는 LIN28을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 벡터는 본원에 기재된 바와 같은 점액다당류증 장애(예를 들어, 슬라이 증후군[β-글루쿠로니다제], 헐러 증후군[알파-L-이두로니다제], 샤이에 증후군[알파-L-이두로니다제], 헐러-샤이에 증후군[알파-L-이두로니다제], 헌터 증후군[이두로네이트 설파타제], 산필립포 증후군 A[헤파란 설파미다제], B[N-아세틸글루코사미니다제], C[아세틸-CoA:알파-글루코사미니드 아세틸트랜스퍼라제], D[N-아세틸글루코사민 6-설파타제], 모르퀴오 증후군 A[갈락토스-6-설페이트 설파타제], B[β-갈락토시다제], 마로토-라미 증후군[N-아세틸갈락토사민-4-설파타제] 등), 파브리 질환(a-갈락토시다제), 고셔 질환(글루코세레브로시다제), 또는 글리코겐 축적 장애(예를 들어, 폼페 질환; 리소좀산 알파-글루코시다제)와 같은 리소좀 저장 장애를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 당뇨 (예를 들어, 인슐린), 혈우병 (예를 들어, 인자 IX 또는 인자 VIII), 리소좀 저장 장애, 예컨대 점액다당류증 장애(예를 들어, 슬라이 증후군[β-글루쿠로니다제], 헐러 증후군[알파-L-이두로니다제], 샤이에 증후군[알파-L -이두로니다제], 헐러- 샤이에 증후군[알파-L-이두로니다제], 헌터 증후군[이두로네이트 설파타제], 산필립포 증후군 A[헤파란 설파미다제], B[N-아세틸글루코사미니다제], C[아세틸-CoA:알파-글루코사미니드 아세틸트랜스퍼라제], D[N-아세틸글루코사민 6-설파타제], 모르퀴오 증후군 A[갈락토스-설페이트 설파타제], B[β-갈락토시다제], 마로토-라미 증후군[N-아세틸갈락토사민-4-설파타제] 등), 파브리 질환(α-갈락토시다제), 고셔 질환(글루코세레브로시다제), 또는 글리코겐 저장 장애(예를 들어, 폼페 질환; 리소좀산 알파-글루코시다제)와 같은 대사 장애를 치료하고/하거나 예방하기 위해 수행될 수 있다.
유전자 전달은 질환 상태에 대한 치료요법을 이해하고 제공하기 위해 실질적으로 사용된다. 결함 유전자가 공지되고 클로닝된 많은 유전 질환이 있다. 일반적으로, 상기 질환 병태는 일반적으로 열성 방식으로 유전되는 효소의 결핍 상태와 조절 또는 구조 단백질을 포함할 수 있고 일반적으로 우성 방식으로 유전되는 불균형 상태의 두 부류로 나뉜다. 결핍 상태 질환의 경우 유전자 전달을 사용하여 대체 치료요법을 위해 정상 유전자를 영향을 받은 조직으로 가져오고 안티센스 돌연변이를 사용하여 질환에 대한 동물 모델을 생성할 수 있다. 불균형 질환 상태의 경우, 유전자 전달을 사용하여 질환 상태에 대응하기 위한 노력에 사용될 수 있는 모델 시스템에서 질환 상태를 생성할 수 있다. 따라서, 본 개시내용에 따른 바이러스 벡터는 유전적 질환의 치료 및/또는 예방을 가능하게 한다.
본 개시내용에 따른 바이러스 벡터는 또한 기능적 RNA를 시험관내 또는 생체내에서 세포에 제공하기 위해 사용될 수 있다. 기능성 RNA는 예를 들어 비인코딩 RNA일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포에서 기능적 RNA의 발현은 세포에 의한 특정 표적 단백질의 발현을 감소시킬 수 있다. 따라서, 기능적 RNA는 치료를 필요로 하는 대상체에서 특정 단백질의 발현을 감소시키기 위해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포에서 기능적 RNA의 발현은 세포에 의한 특정 표적 단백질의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 기능적 RNA는 치료를 필요로 하는 대상체에서 특정 단백질의 발현을 증가시키기 위해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 기능적 RNA의 발현은 세포에서 특정 표적 RNA의 스플라이싱을 조절할 수 있다. 따라서, 기능적 RNA는 치료를 필요로 하는 대상체에서 특정 RNA의 스플라이싱을 조절하기 위해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포에서 기능적 RNA의 발현은 세포에 의한 특정 표적 단백질의 기능을 조절할 수 있다. 따라서, 기능적 RNA는 치료를 필요로 하는 대상체에서 특정 단백질의 기능을 조절하기 위해 투여될 수 있다. 기능적 RNA는 또한 유전자 발현 및/또는 세포 생리학을 조절하기 위해, 예를 들어 세포 또는 조직 배양 시스템을 최적화하기 위해 또는 스크리닝 방법에서 시험관 내에서 세포에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바이러스 벡터는 생체외에서 세포와 접촉될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 T-세포, 예를 들어 활성화된 T-세포이다. 일부 구현예에서, 세포(예를 들어, 활성화된 T-세포)는 사람 환자와 같은 대상체로부터 수득된다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터와 접촉한 세포는 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 키메라 항원 수용체(CAR)를 인코딩하는 이종 핵산을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 바이러스 벡터와 T-세포를 접촉시키는 것은 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현을 초래하여 CAR T-세포를 생성한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바이러스 벡터 중 임의의 하나를 생체외에서 T-세포와 접촉시키는 것을 포함하는 CAR T-세포를 제조하는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 본원에 기재된 방법 중 임의의 하나를 사용하여 생성된 CAR T-세포, 및 대상체에게 본원에 기재된 CAR T-세포를 투여하는 것을 포함하는 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법을 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, CAR T-세포는 동일한 대상체로부터 수득된 T 세포(자가 T 세포)를 사용하여 생성되는 반면, 다른 구현예에서 CAR T-세포는 건강한 공여자 대상체로부터 수득된 T-세포(동종이계 T 세포)를 사용하여 생성된다. CAR T-세포 투여를 필요로 하는 대상체는 의사 또는 숙련된 개업의에 의해 동정될 수 있고 암, 예를 들어 급성 림프구성 백혈병(ALL), 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), 호지킨 림프종, 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 다발성 골수종과 같은 임의의 질환을 가질 수 있다.
T 세포 고갈은 많은 만성 감염 및 암 동안에 발생하는 T 세포 기능부전 상태이고, 또한 CAR-T 치료요법의 효과를 감소시키는 것으로 나타났다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 재조합 바이러스 벡터는 T-세포 고갈을 예방, 제한 및/또는 역전시키기 위한 유전자 치료요법 방법(예를 들어, CAR-T 치료요법 방법)에 사용된다. 따라서, 본 개시내용은 유효량의 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터) 중 어느 하나, 바이러스 입자(예를 들어, AAV 입자) 중 어느 하나, 및/또는 본원에 기재된 조성물 중 임의의 하나를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 T-세포 고갈을 완화, 예방, 제한 및/또는 역전시키는 방법을 제공한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 면역원성 폴리펩타이드와 같은 면역원을 인코딩하는 이종 핵산을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 바이러스 벡터와 세포를 접촉시키는 것은 면역원의 발현을 초래한다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체에게 투여될 수 있고, 따라서 대상체에서 면역원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 보호 면역 반응이 유발된다. 일부 구현예에서, 세포는 항원 제시 세포(예를 들어, 수지상 세포)이다. 일부 구현예에서, 세포는 대상체로부터 제거되었고, 바이러스 벡터가 그 안에 도입된 다음, 세포가 대상체 내로 다시 투여된다. 생체외 조작을 위해 대상체로부터 세포를 제거한 후 대상체에 다시 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,399,346호 참조). 대안적으로, 재조합 바이러스 벡터는 공여자 대상체로부터의 세포, 배양된 세포 또는 임의의 다른 적합한 공급원으로부터의 세포로 도입될 수 있고, 세포는 치료를 필요로 하는 대상체(즉, "수용자" 대상체)에게 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 암에 걸린 대상체로부터 제거되고 본 개시내용에 따라 암 세포 항원을 발현하는 바이러스 벡터와 접촉될 수 있다. 이후 변형된 세포를 대상체에게 투여하여 암 세포 항원에 대한 면역 반응을 유발한다. 이러한 방법은 생체 내에서 충분한 면역 반응을 일으킬 수 없는(즉, 충분한 양으로 증진된 항체를 생성할 수 없는) 면역손상된 대상체에 유리하게 사용될 수 있다. 대안적으로, 암 항원은 바이러스 캡시드의 일부로서 발현되거나 그렇지 않으면 바이러스 캡시드와 회합될 수 있다(예를 들어, 상기에 기재된 바와 같이). 또 다른 대안으로서, 당업계에 공지된 임의의 다른 치료학적 핵산(예를 들어, RNAi) 또는 폴리펩타이드(예를 들어, 사이토킨)가 암을 치료 및/또는 예방하기 위해 투여될 수 있다.
면역 반응이 면역조절 사이토킨(예를 들어, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 감마-인터페론, 오메가-인터페론, 타우-인터페론, 인터류킨-1-알파, 인터류킨-1β, 인터류킨-2, 인터류킨-3, 인터류킨-4, 인터류킨 5, 인터류킨-6, 인터류킨-7, 인터류킨-8, 인터류킨-9, 인터류킨-10, 인터류킨-11, 인터류킨-12, 인터류킨-13, 인터류킨-14, 인터류킨-18, B 세포 성장 인자, CD40 리간드, 종양 괴사 인자-알파, 종양 괴사 인자-β, 단핵구 화학유인 단백질-1, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 및 림프독소)에 의해 증진될 수 있다. 따라서 면역 조절 사이토킨(바람직하게는 CTL 유도 사이토킨)은 바이러스 벡터와 함께 대상체에게 투여될 수 있다. 사이토킨은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 투여될 수 있다. 외인성 사이토킨은 대상체에게 투여될 수 있거나, 대안적으로 사이토킨을 인코딩하는 핵산은 적합한 벡터를 사용하여 대상체에게 전달될 수 있으며, 사이토킨은 생체 내에서 생성된다.
또한, 본 개시내용에 따른 바이러스 벡터는 진단 및 스크리닝 방법에 사용되고, 관심 있는 핵산은 세포 배양 시스템 또는 대안적으로 유전자전이 동물 모델에서 일시적으로 또는 안정적으로 발현된다.
본 개시내용의 바이러스 벡터는 또한 당업자에게 명백한 바와 같이 유전자 표적화, 청소율, 전사, 번역 등을 평가하기 위한 프로토콜에서의 사용을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 비치료학적 목적을 위해 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 안전성 평가(전파, 독성, 면역원성 등)의 목적으로도 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 데이터는 미국 식품의약국에서 임상 효능 평가 전에 규제 승인 프로세스의 일부로 간주된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 변형된 바이러스 캡시드는 신규한 캡시드 구조에 대한 항체를 생성하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 외인성 아미노산 서열은 세포로의 항원 제공을 위해, 예를 들어 외인성 아미노산 서열에 대한 면역 반응을 생성하기 위해 대상체에게 투여하기 위해 변형된 바이러스 캡시드 내로 삽입될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 캡시드는 관심 있는 폴리펩타이드 또는 기능적 RNA를 인코딩하는 핵산을 전달하는 바이러스 벡터의 투여 전 및/또는 동시에(예를 들어, 서로 몇 분 또는 몇 시간 내에) 특정 세포 부위를 차단하기 위해 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 캡시드는 간 세포 상의 세포 수용체를 차단하기 위해 전달될 수 있고 전달 벡터는 후속적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 이는 간 세포의 형질도입을 감소시키고 다른 표적(예를 들어, 골격, 심장 및/또는 횡경막 근육)의 형질도입을 증진시킬 수 있다.
투여 용량 및 방식
바이러스 벡터는 특정 표적 세포에 적합한 표준 형질도입 방법에 따라 적절한 감염 다중도로 세포 내로 도입될 수 있다. 투여할 바이러스 벡터의 역가는 표적 세포 유형 및 수, 특정 바이러스 벡터에 따라 다양할 수 있고, 과도한 실험 없이 당업자에 의해 결정될 수 있다. 대표적인 구현예에서, 적어도 약 103개의 감염성 단위, 임의로 적어도 약 105개의 감염성 단위가 세포에 도입된다.
바이러스 벡터가 도입되는 세포(들)는 T-세포, 신경 세포(말초 및 중추 신경계의 세포, 특히 뉴런 및 희소돌기아교세포와 같은 뇌 세포 포함), 폐 세포, 안구 세포(망막 세포, 망막 색소 상피 및 각막 세포 포함), 상피 세포(예를 들어, 소화관 및 호흡기 상피 세포), 근육 세포(예를 들어, 골격근 세포, 심근 세포, 평활근 세포 및/또는 횡격막 근육 세포), 수지상 세포, 췌장 세포(섬 세포 포함), 간 세포, 심근 세포, 골 세포(예를 들어, 골수 줄기 세포), 조혈 줄기 세포, 비장 세포, 각질 세포, 섬유아세포, 내피 세포 , 전립선 세포, 생식 세포 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 유형일 수 있다. 대표적인 구현예에서, 세포는 임의의 전구체 세포일 수 있다. 추가 가능성으로서, 세포는 줄기 세포(예를 들어, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포)일 수 있다. 또 다른 추가의 대안으로서, 세포는 암 또는 종양 세포일 수 있다. 더욱이, 세포는 상기에 나타낸 바와 같이 임의의 종의 기원일 수 있다.
생체외 핵산 전달을 위해 적합한 세포는 상기에 기재된 바와 같다. 대상체에게 투여하기 위한 세포의 용량은 대상체의 연령, 상태 및 종, 세포 유형, 세포에 의해 발현되는 핵산, 투여 방식 등에 따라 다양할 것이다. 전형적으로, 약제학적으로 허용되는 담체 내의 적어도 약 102 내지 약 108개의 세포 또는 적어도 약 103 내지 약 106개의 세포가 투여 당 투여될 것이다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터로 형질도입된 세포는 약제학적 담체와 함께 치료학적 유효량으로 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 세포에 도입되고 세포는 전달된 폴리펩타이드에 대한 면역원성 반응을 유도하기 위해 대상체에게 투여될 수 있다(예를 들어, 전이유전자로서 또는 캡시드에서 발현됨). 전형적으로, 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 면역학적 유효량의 폴리펩타이드를 발현하는 세포의 양이 투여된다. "면역학적 유효량"은 약제학적 제형이 투여되는 대상체에서 폴리펩타이드에 대한 능동 면역 반응을 유발하기에 충분한 발현된 폴리펩타이드의 양이다. 일부 구현예에서, 용량은 보호 면역 반응을 생성하기에 충분하다. 부여된 보호 정도는 면역원성 폴리펩타이드 투여의 이득이 임의의 단점을 능가하는 한 완전하거나 영구적일 필요는 없다. 따라서, 본 개시내용은 핵산을 세포에 투여하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 세포를 본 개시내용의 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및/또는 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다.
대상체에게 투여되는 바이러스 벡터 및/또는 캡시드의 용량은 투여 방식, 치료 및/또는 예방할 질환 또는 병태, 개별 대상체의 병태, 특정 바이러스 벡터 또는 캡시드 및 전달될 핵산에 따라 다양하다. 치료학적 효과를 달성하기 위한 예시적인 용량은 적어도 약 105, 약 106, 약 107, 약 108, 약 109, 약 1010, 약 1011, 약 1012, 약 1013, 약 1014, 약 1015 형질도입 단위, 임의로 약 108 - 1013 형질도입 단위의 역가이다. 일부 구현예에서, 다양한 간격, 예를 들어 매일, 매주, 매월, 매년 등의 기간에 걸쳐 목적하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해 1회 초과의 투여(예를 들어, 2회, 3회, 4회 이상의 투여)가 사용될 수 있다.
본 개시내용에 따른 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및/또는 캡시드를 치료를 필요로 하는 사람 대상체 또는 동물에게 투여하는 것은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의한 것일 수 있다. 임의로, 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및/또는 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체에 치료학적 유효량으로 전달된다. 일부 구현예에서, 치료학적 유효량의 바이러스 벡터, 바이러스 입자 및/또는 캡시드가 전달된다.
예시적인 투여 방식은 경구, 직장, 경점막, 비강내, 흡입(예를 들어, 에어로졸을 통해), 협측(예를 들어, 설하), 질, 척수강내, 안구내, 경피, 자궁내(또는 난내), 비경구(예를 들어, 정맥내), 피하, 피내, 근육내[골격, 횡격막 및/또는 심근으로의 투여를 포함], 피내, 흉막내, 뇌내 및 관절내), 국소(예를 들어, 기도 표면을 포함하는 피부 및 점막 표면 모두에 대한 투여 및 경피 투여), 림프내 등뿐만 아니라 직접 조직 또는 기관 주사(예를 들어, 간, 골격근, 심근, 횡격막 근육 또는 뇌에 대한)를 포함한다. 투여는 또한 종양(예를 들어, 종양 또는 림프절 내 또는 근처)에 대한 것일 수 있다. 주어진 경우에 가장 적합한 경로는 치료 및/또는 예방되는 병태의 특성 및 중증도와 사용 중인 특정 벡터의 특성에 따라 달라진다. 본 개시내용은 또한 전신 전달을 위한 안티센스 RNA, RNAi 또는 다른 기능적 RNA(예를 들어, 리보자임)와 같은 비인코딩 RNA를 생성하기 위해 수행될 수 있다.
주사제는 액체 용액 또는 현탁액, 주사 전에 액체중에 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로서 또는 에멀젼으로서 통상적인 형태로 제조될 수 있다. 대안적으로, 본 개시내용의 바이러스 벡터 및/또는 바이러스 캡시드를 전신 방식보다는 국소 방식으로, 예를 들어 데포(depot) 또는 서방성 제제로 투여할 수 있다. 추가로, 바이러스 벡터 및/또는 바이러스 캡시드는 수술적으로 이식가능한 매트릭스에 부착하여 전달될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 공개 공보 US-2004-0013645-A1에 기재된 바와 같이).
실시예
단지 예시 목적으로 본원에 포함된 하기 실시예는 제한하려는 의도가 아니다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 STRD.201, STRD.202, STRD.203, STRD.204, STRD.205, STRD.206 및 STRD. 207는 캡시드 단백질 서열을 기재하기 위해 사용되고, 용어 AAV-STRD. 201, AAV-STRD. 202, AAV-STRD.203¸ AAV-STRD.204¸ AAV-STRD.205, AAV-STRD.206, 및 AAV-STRD.207은 캡시드 단백질을 포함하는 AAV 벡터를 기재하기 위해 사용된다. 그러나 용어 STRD.201, STRD.202, STRD.203, STRD.204, STRD.205, STRD.206 및 STRD. 207은 일부 맥락에서 당업자에게 자명한 바와 같이 지명된 캡시드를 포함하는 AAV 벡터를 기재하기 위해 사용될 수 있다.
실시예 1: 형질도입 관련 펩타이드를 포함하는 AAV 캡시드 단백질 변이체의 전개
시험관내 전개 과정을 사용하여 AAV 벡터에 혼입될 때 벡터의 T-세포로의 증진된 형질도입을 제공하는 AAV 캡시드 단백질 변이체를 제조하였다. 이러한 공정의 제1 단계는 극저온 전자 현미경을 사용하여 AAV 캡시드 표면상의 표면 노출 영역의 동정을 포함한다. 이어서, AAV 캡시드의 표면 노출 영역 내의 선택된 잔기를 뉴클레오타이드 NNK로 치환된 각 코돈 및 Gibson 어셈블리 및/또는 다단계 PCR에 의해 함께 조합된 유전자 단편을 갖는 축퇴성 프라이머를 사용하여 돌연변이유발에 적용하였다. 여기서, 서열번호 1의 아미노산 잔기 454-460은 재조합 캡시드 유전자 서열의 라이브러리를 생성하기 위해 무작위 돌연변이유발에 적용되었다. 상기 축퇴성 라이브러리 내의 각각의 유전자는 플라스미드 라이브러리를 생성하는 본래의 Cap 인코딩 DNA 서열을 대체하기 위해 야생형 AAV 게놈으로 클로닝하였다. 이어서 플라스미드 라이브러리는 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드를 사용하여 293 생산자 세포주로 형질감염시켜 AAV 캡시드 라이브러리를 생성하였다. AAV 라이브러리의 성공적인 생성은 DNA 서열 분석을 통해 확인되었다.
T-세포를 표적화하고 효과적으로 형질도입할 수 있는 AAV 벡터를 동정하기 위해, AAV 라이브러리를 여러 라운드의 시험관 내 선택에 적용하였다. 구체적으로, 세포의 혼합 집단으로의 1차 형질도입을 수행한 후, 활성화된 공여자 T-세포로의 2차 형질도입을 수행하였다. 각 단계에서 바이러스 DNA를 정제하고, PCR 증폭하고, AAV 벡터 내로 역클로닝하고, 선택의 다음 라운드에 사용하였다. AAV 벡터의 조합 가공 및 선택에 사용되는 일반적인 방법의 추가 세부 사항은 WO 2019/195449, WO 2019/195423, 및 WO 2019/195444에 제공되고, 이들 각각의 내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다. 3차 감염 후, AAV 입자는 배양된 T 세포로부터 단리하였다. 구체적으로, 세포를 용해시키고, 바이러스 DNA를 T-세포의 핵 및 세포질 분획으로부터 정제하고, PCR 증폭하고, 상기에 기재된 바와 같이 AAV 벡터로 역클로닝하였다.
실시예 1에 기재된 3차의 선택 및 전개 후에 T-세포의 핵 및 시토졸 분획에서 풍부해진 AAV 변이체를 서열분석하여 단일 AAV 단리물을 동정하였다. 도 5에 나타낸 버블 플롯에서, 버블 크기는 판독 수에 비례한다. 핵 분획(AAV.STRD-203, 205), 세포질 분획(AAV.STRD-206, 207) 또는 핵 및 시토졸 분획(AAV.STRD-201, 202 및 204)에서 가장 풍부한 AAV 변이체는 서열분석하여 아미노산 위치 454-460에 존재하는 아미노산 잔기를 동정하였다. 도 6 및 표 5를 참조한다. 이들 결과는 표 5의 형질도입 관련 펩타이드를 포함하는 변이체 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV 비리온이 T-세포를 효과적으로 형질도입할 수 있음을 입증하였다.
표 5. 시험관내 전개 과정을 사용하여 동정된 형질도입 관련 펩타이드
실시예 2: 형질도입 관련 펩타이드를 포함하는 AAV 벡터의 제조능
실시예 1에서 동정된 다양한 AAV 벡터가 대규모 시스템에서 제조될 수 있는지 여부를 결정하기 위해 표준 방법에 따라 AAV를 생성하고 수율을 야생형 AAV6 벡터의 수율과 비교하였다.
AAV는 표준 3중 형질감염 프로토콜에 따라 HEK293 세포에서 생성하였다. 간략하게, 세포를 (i) 표 5에 나열된 야생형 AAV9 캡시드 서열 또는 변이체 캡시드 서열을 포함하는 플라스미드; (ii) 5'ITR, 전이유전자 및 3' ITR 서열을 포함하는 플라스미드; 및 (iii) AAV 생성에 필요한 헬퍼 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질감염시켰다. AAV는 세포 배양물의 상등액으로부터 정제하였다. 그 후, PCR 기반 정량화 접근법을 사용하여 각 AAV의 수율을 측정하였다.
도 1 및 표 6에 나타낸 바와 같이, STRD-201의 캡시드 서열을 포함하는 재조합 AAV 벡터(여기서는 "AAV.STRD-201"로 지칭함)가 야생형 AAV6의 수율보다 더 높은 수율을 가졌다. 추가로, AAV.STRD-204, AAV.STRD-205, AAV.STRD-206 및 AAV.STRD-207의 수율은 야생형 AAV6의 수율에 상응하였다.
이들 데이터는 캡시드 변이체 단백질을 포함하는 AAV 벡터가 상업적 제조를 위해 적합함을 확인시켜 준다.
표 6:
실시예 3: T-세포에서 AAV 변이체에 의한 GFP 전이유전자의 발현을 특징 분석
GFP 전이유전자를 운반하는, 재조합 AAV 변이체, AAV.STRD-201, AAV.STRD-202, AAV.STRD-204, AAV.STRD-205, AAV.STRD-206 및 AAV.STRD-207 또는 야생형 AAV6 벡터를 활성화된 T-세포에 형질도입하였다. 팽창하는 동안 T 세포가 뭉치기 때문에 세포를 이미지화하기 전에 위아래로 피펫팅하거나 혼합하였다. GFP의 발현을 현미경으로 관찰하였고 실험으로부터의 이미지를 도 2에 나타내었다. 보다 높은 GFP 발현은 T-세포로의 바이러스 벡터의 보다 효율적인 형질도입을 나타낸다. 도 2의 이미지에 나타낸 바와 같이, 모든 AAV 변이체는 보다 밝은 녹색 형광 신호를 나타내므로 야생형 AAV6 바이러스 벡터와 비교하여 활성화된 T-세포에서 GFP의 보다 높은 발현을 나타낸다. 재조합 AAV 변이체 중에서 AAV.STRD-201 및 AAV.STRD-207은 특히 증진된 GFP 발현을 보여 T-세포로의 보다 증진된 형질도입을 나타낸다. 야생형 AAV6 바이러스 벡터와 비교하여 AAV 변이체로부터의 GFP 발현 수준을 추가로 분석하기 위해, AAV6 벡터 또는 AAV.STRD-207 변이체 둘 중 하나로 형질도입된 T-세포를, 음성 대조군으로 사용된 단독 T 세포와 유세포분석하였다. 도 3c에 나타낸 바와 같이, AAV.STRD-207 변이체로 형질도입된 세포의 증가된 비율은 AAV6 모체 벡터에 의해 형질도입된 집단과 비교하여 더 높은 GFP 신호(파란색 선 위의 FITC 신호로 표시됨)를 나타낸다. AAV 변이체(AAV.STRD-201, AAV.STRD-202, AAV.STRD-204, AAV.STRD-205, AAV.STRD-206 및 AAV.STRD-207)로 형질도입된 세포에서의 GFP 발현은 도 4에서 추가로 정량하고 이는 주어진 집단(막대로 표시됨)에서 GFP-양성 세포의 %와 해당 모집단에서 GFP의 평균 강도(선 그래프로 지적됨)를 보여준다. 결과는 GFP 양성 세포 수의 증가가 야생형 AAV6에 비해 AAV 변이체에 의해 형질도입된 세포에서 GFP 신호의 평균 강도 증가와 잘 일치함을 보여주고, 이는 T 세포로의 AAV 변이체의 증진된 형질도입이 T 세포에서 증가된 GFP 발현을 초래함을 지적한다.
이전의 기재 내용은 본 발명을 예시하고 이를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 한다. 본 발명은 하기의 청구항에 의해 정의되고 청구항의 등가물이 본원에 포함된다.
번호가 매겨진 구현예
하기의 구현예 목록은 단지 설명을 목적으로 포함되고 포괄적이거나 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 청구된 주요 요지는 명백하게 하기의 구현예로 제한되지 않는다.
구현예 1. 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터로서, 상기 캡시드 단백질이 서열번호 17 내지 23 중 어느 하나의 서열을 갖는 형질도입 관련 펩타이드를 포함하는, 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터.
구현예 2. 구현예 1에 있어서, 상기 캡시드 단백질이 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
구현예 3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 형질도입 관련 펩타이드가 서열번호 1의 아미노산 454-460에 상응하는 아미노산을 대체하는, 재조합 AAV 벡터.
구현예 4. 구현예 1에 있어서, 상기 캡시드 단백질이 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 및 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
구현예 5. 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV 벡터로서, 상기 캡시드 단백질이 서열번호 1의 서열을 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 454-460이 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(서열번호 24)을 포함하는 형질도입 관련 펩타이드에 의해 대체된, 재조합 AAV 벡터.
구현예 6. 구현예 5에 있어서, X1이 G가 아니고, X2가 S가 아니고, X3이 A가 아니고, X4가 Q가 아니고, X5가 N이 아니고, X6이 K가 아니고/아니거나 X7이 D가 아닌, 재조합 AAV 벡터.
구현예 7. 구현예 5 내지 6 중 어느 하나에 있어서, X1가 H, M, A, Q, V, 또는 S인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 8. 구현예 5 내지 7 중 어느 하나에 있어서, X2가 A 또는 T인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 9. 구현예 5 내지 8 중 어느 하나에 있어서, X3이 P 또는 T인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 10. 구현예 5 내지 9 중 어느 하나에 있어서, X4가 R 또는 D인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 11. 구현예 5 내지 10 중 어느 하나에 있어서, X5가 V, Q, C, S 또는 D인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 12. 구현예 5 내지 11 중 어느 하나에 있어서, X6가 E, A 또는 P인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 13. 구현예 5 내지 12 중 어느 하나에 있어서, X7이 E, G, N, T, 또는 A인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 14. 구현예 5에 있어서, X1이 H이고, X2가 A이고, X3이 P이고, X4가 R이고, X5가 V이고, X6이 E이고, X7이 E인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 15. 구현예 5에 있어서, X1이 M이고, X2가 A이고, X3이 P이고, X4가 R이고, X5가 Q이고, X6가 E이고, X7이 G인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 16. 구현예 5에 있어서, X1이 H이고, X2가 T이고, X3이 T이고, X4가 D이고, X5가 C이고, X6이 A이고, X7이 N인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 17. 구현예 5에 있어서, X1이 A이고, X2가 A이고, X3이 P이고, X4가 R이고, X5가 S이고, X6가 E이고, X7이 T인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 18. 구현예 5에 있어서, X1이 Q이고, X2가 A이고, X3이 P이고, X4가 R이고, X5가 Q이고, X6가 E이고, X7이 G인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 19. 구현예 5에 있어서, X1이 V이고, X2가 A이고, X3이 P이고, X4가 R이고, X5가 D이고, X6이 P이고, X7이 A인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 20. 구현예 5에 있어서, X1이 S이고, X2가 A이고, X3이 P이고, X4가 R이고, X5가 S이고, X46이 E이고, X7이 N인, 재조합 AAV 벡터.
구현예 21. 구현에 5에 있어서, 상기 캡시드 단백질이 서열번호 1과 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
구현예 22. 구현예 21에 있어서, 상기 캡시드 단백질이 서열번호 1과 약 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
구현예 23. 구현예 5에 있어서, 상기 캡시드 단백질이 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 및 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
구현예 24. 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV 벡터로서, 상기 캡시드 단백질이 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 형질도입 관련 펩타이드를 포함하고, 여기서 형질도입 관련 펩타이드가 서열번호 1에 대해 아미노산 454-460을 대체하는, 재조합 AAV 벡터.
구현예 25. 구현예 24에 있어서, 형질도입 관련 펩타이드가 서열번호 17-23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는, 재조합 AAV 벡터.
구현예 26. 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 어느 하나의 서열을 갖는 재조합 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산.
구현예 27. 구현예 26에 있어서, 상기 핵산이 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 및 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 핵산.
구현예 28. 구현예 26 또는 구현예 27에 있어서, 상기 핵산이 DNA 서열인, 핵산.
구현예 29. 구현예 26 또는 구현예 27에 있어서, 상기 핵산이 RNA 서열인, 핵산.
구현예 30. 구현예 26 내지 29 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
구현예 31. 구현예 26 내지 29 중 어느 하나의 핵산 또는 구현예 30의 발현 벡터를 포함하는 세포.
구현예 32. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 캡시드 단백질에 의해 캡슐화된 카고 핵산을 추가로 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
구현예 33. 구현예 32에 있어서, 상기 카고 핵산이 치료학적 단백질 또는 치료학적 RNA를 인코딩하는, 재조합 AAV 벡터.
구현예 34. 구현예 32 또는 33에 있어서, 상기 AAV 벡터가 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터와 비교하여 세포로의 증가된 형질도입을 나타내는, 재조합 AAV 벡터.
구현예 35. 구현예 34에 있어서, 상기 세포가 T-세포인, AAV 벡터.
구현예 36. 구현예 35에 있어서, 상기 AAV 벡터가 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터와 비교하여 T-세포의 핵으로의 증가된 형질도입을 나타내는, AAV 벡터.
구현예 37. 구현예 35에 있어서, 상기 AAV 벡터가 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터와 비교하여 T-세포의 시토졸로의 증가된 형질도입을 나타내는, AAV 벡터.
구현예 38. 구현예 1 내지 25 또는 32 내지 37 중 어느 하나의 재조합 AAV 벡터, 구현예 26 내지 29 중 어느 하나의 핵산, 구현예 30의 발현 벡터 또는 구현예 31의 세포를 포함하는 조성물.
구현예 39. 구현예 31의 세포 또는 구현예 1 내지 25 또는 32 내지 37 중 어느 하나의 재조합 AAV 벡터; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
구현예 40. AAV 벡터를 세포 내로 전달하는 방법으로서, 세포를 구현예 1-25 또는 32-37 중 어느 하나의 AAV 벡터와 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
구현예 41. 구현예 40에 있어서, 상기 세포의 접촉이 시험관내, 생체외 또는 생체내 수행되는, 방법.
구현예 42. 구현예 40 또는 구현예 41에 있어서, 상기 세포가 T-세포인, 방법.
구현예 43. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 25 또는 32 내지 37 중 어느 하나의 유효량의 AAV 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
구현예 44. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 구현예 1 내지 25 또는 32 내지 37 중 어느 하나의 AAV 벡터와 생체외 접촉된 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
구현예 45. 구현예 43 또는 구현예 44에 있어서, 상기 대상체가 포유류인, 방법.
구현예 46. 구현예 45에 있어서, 상기 대상체가 사람인, 방법.
구현예 47. 구현예 1 내지 25 또는 32 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 약물로서 사용하기 위한, AAV 벡터.
구현예 48. 구현예 1 내지 25 또는 32 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법에 사용하기 위한, AAV 벡터.

Claims (48)

  1. 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터로서, 상기 캡시드 단백질이 서열번호 17 내지 23 중 어느 하나의 서열을 갖는 형질도입 관련 펩타이드를 포함하는, 재조합 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 캡시드 단백질이 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 형질도입 관련 펩타이드가 서열번호 1의 아미노산 454-460에 상응하는 아미노산을 대체하는, 재조합 AAV 벡터.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 캡시드 단백질이 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 및 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
  5. 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV 벡터로서, 상기 캡시드 단백질이 서열번호 1의 서열을 포함하고, 서열번호 1의 아미노산 454-460이 서열 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(서열번호 24)을 포함하는 형질도입 관련 펩타이드에 의해 대체된, 재조합 AAV 벡터.
  6. 제 5 항에 있어서,
    X1이 G가 아니고, X2가 S가 아니고, X3이 A가 아니고, X4가 Q가 아니고, X5가 N이 아니고, X6이 K가 아니고/아니거나 X7이 D가 아닌, 재조합 AAV 벡터.
  7. 제 5 항 또는 제 6 항에 있어서,
    X1이 H, M, A, Q, V, 또는 S인, 재조합 AAV 벡터.
  8. 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X2가 A 또는 T인, 재조합 AAV 벡터.
  9. 제 5 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X3이 P 또는 T인, 재조합 AAV 벡터.
  10. 제 5 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X4가 R 또는 D인, 재조합 AAV 벡터.
  11. 제 5 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X5가 V, Q, C, S 또는 D인, 재조합 AAV 벡터.
  12. 제 5 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X6이 E, A 또는 P인, 재조합 AAV 벡터.
  13. 제 5 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서,
    X7이 E, G, N, T 또는 A인, 재조합 AAV 벡터.
  14. 제 5 항에 있어서,
    X1이 H이고, X2가 A이고, X3이 P이고, X4가 R이고, X5가 V이고, X6이 E이고, X7이 E인, 재조합 AAV 벡터.
  15. 제 5 항에 있어서,
    X1이 M이고, X2가 A이고, X3이 P이고, X4가 R이고, X5가 Q이고, X6이 E이고, X7이 G인, 재조합 AAV 벡터.
  16. 제 5 항에 있어서,
    X1이 H이고, X2가 T이고, X3이 T이고, X4가 D이고, X5가 C이고, X6이 A이고, X7이 N인, 재조합 AAV 벡터.
  17. 제 5 항에 있어서,
    X1이 A이고, X2가 A이고, X3이 P이고, X4가 R이고, X5가 S이고, X6이 E이고, X7이 T인, 재조합 AAV 벡터.
  18. 제 5 항에 있어서,
    X1이 Q이고, X2가 A이고, X3이 P이고, X4가 R이고, X5가 Q이고, X6이 E이고, X7이 G인, 재조합 AAV 벡터.
  19. 제 5 항에 있어서,
    X1이 V이고, X2가 A이고, X3이 P이고, X4가 R이고, X5가 D이고, X6이 P이고, X7이 A인, 재조합 AAV 벡터.
  20. 제 5 항에 있어서,
    X1이 S이고, X2가 A이고, X3이 P이고, X4가 R이고, X5가 S이고, X46이 E이고, X7이 N인, 재조합 AAV 벡터.
  21. 제 5 항에 있어서,
    상기 캡시드 단백질이 서열번호 1과 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 캡시드 단백질이 서열번호 1과 약 99% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
  23. 제 5 항에 있어서,
    상기 캡시드 단백질이 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 및 14로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
  24. 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV 벡터로서, 상기 캡시드 단백질이 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 형질도입 관련 펩타이드를 포함하고, 여기서 형질도입 관련 펩타이드가 서열번호 1에 대해 아미노산 454-460을 대체하는, 재조합 AAV 벡터.
  25. 제 24 항에 있어서,
    상기 형질도입 관련 펩타이드가 서열번호 17-23 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는, 재조합 AAV 벡터.
  26. 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 어느 하나의 서열을 갖는 재조합 AAV 캡시드 단백질을 인코딩하는 핵산.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 핵산이 서열번호 3, 5, 7, 9, 11, 13, 및 15로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는, 핵산.
  28. 제 26 항 또는 제 27 항에 있어서,
    상기 핵산이 DNA 서열인, 핵산.
  29. 제 26 항 또는 제 27 항에 있어서,
    상기 핵산이 RNA 서열인, 핵산.
  30. 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  31. 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제 30 항의 발현 벡터를 포함하는 세포.
  32. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 캡시드 단백질에 의해 캡슐화된 카고 핵산을 추가로 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 카고 핵산이 치료학적 단백질 또는 치료학적 RNA를 인코딩하는, 재조합 AAV 벡터.
  34. 제 32 항 또는 제 33 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터가 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터와 비교하여 세포로의 증가된 형질도입을 나타내는, 재조합 AAV 벡터.
  35. 제 34 항에 있어서,
    상기 세포가 T-세포인, AAV 벡터.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터가 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터와 비교하여 T-세포의 핵으로의 증가된 형질도입을 나타내는, AAV 벡터.
  37. 제 35 항에 있어서,
    상기 AAV 벡터가 형질도입 관련 펩타이드를 포함하지 않는 AAV 벡터와 비교하여 T-세포의 시토졸로의 증가된 형질도입을 나타내는, AAV 벡터.
  38. 제 1 항 내지 제 25 항 또는 제 32 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터, 제 26 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항의 핵산, 제 30 항의 발현 벡터 또는 제 31 항의 세포를 포함하는 조성물.
  39. 제 31 항의 세포 또는 제 1 항 내지 제 25 항 또는 제 32 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터; 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  40. AAV 벡터를 세포 내로 전달하는 방법으로서, 제 1 항 내지 제 25 항 또는 제 32 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 AAV 벡터와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  41. 제 40 항에 있어서,
    상기 세포를 접촉시키는 것이 시험관내, 생체외 또는 생체내 수행되는, 방법.
  42. 제 40 항 또는 제 41 항에 있어서,
    상기 세포가 T-세포인, 방법.
  43. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제 1 항 내지 제 25 항 또는 제 32 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 유효량의 AAV 벡터를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  44. 치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서, 제 1 항 내지 제 25 항 또는 제 32 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 AAV 벡터와 생체외 접촉된 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  45. 제 43 항 또는 제 44 항에 있어서,
    상기 대상체가 포유류인, 방법.
  46. 제 45 항에 있어서,
    상기 대상체가 사람인, 방법.
  47. 약물로서 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 25 항 또는 제 32 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 AAV 벡터.
  48. 치료를 필요로 하는 대상체의 치료 방법에 사용하기 위한 제 1 항 내지 제 25 항 또는 제 32 항 내지 제 37 항 중 어느 한 항의 AAV 벡터.
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