JP2022551739A - ニーマン・ピック病ｃ型の治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents

ニーマン・ピック病ｃ型の治療のためのアデノ随伴ウイルスベクター Download PDF

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Abstract

ＮＰＣ１を治療、予防及び／又は治癒するための遺伝子療法組成物及び方法が本明細書で提供される。より具体的には、本開示は、ＮＰＣ１を治療、予防及び／又は治癒するための、核酸の送達のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及び核酸（ＡＡＶ導入カセットを含む）を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年９月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／０８２，８９９号、２０２０年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／０８２，４２５号、２０１９年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／９２３，２５３号及び２０１９年１０月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／９１６，７４９号に対する優先権を主張し、そのそれぞれは、参照により本明細書に全体として組み込まれる。
電子的に提出されたテキストファイルの説明
[0001] 本明細書とともに電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照により全体として組み込まれる：配列表のコンピュータ可読フォーマットコピー（ファイル名：STRD_021_02WO_SeqList_ST25.txt、データ記録日２０２０年１０月１４日、ファイルサイズ約４２５キロバイト）。
技術分野
[0002] 本出願は、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに関する。一部の実施形態において、組換えＡＡＶベクターは、形質導入効率の減少なしで中和抗体を回避する。
背景
[0003] ニーマン・ピック病Ｃ１型（ＮＰＣ１）は、エンドリソソームコンパートメント中のコレステロール蓄積により特徴付けられる神経変性障害である。これは、ＮＰＣ１、細胞内コレステロールトラフィッキングを媒介するエンドリソソームタンパク質をコードする遺伝子中の変異により引き起こされる。
[0004] ＮＰＣ１は、幼児、小児又は成人において見られ得る。新生児は、腹水及び肝臓の浸潤からの重度肝疾患及び／又は肺の浸潤からの呼吸器不全を呈し得る。肝疾患も肺疾患も有さない他の幼児は、低血圧症及び発育遅延を有する。典型的症状は、小児期中期から後期に生じ、遅発性運動失調、垂直性核上性注視麻痺（ＶＳＧＰ）及び認知症の潜行性の発症を伴う。ジストニア及び痙攣が一般的である。構音障害及び嚥下障害により最終的に日常生活に支障を来たし、経口摂取が不可能となり、通常、十代後半又は二十代で誤嚥性肺炎から死亡する。成人は、認知症又は精神科的症状を呈する可能性がより高い。
[0005] ２－ヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリン（ＨＰＢＣＤ）は、ＮＰＣ１動物モデルにおいてコレステロール及び脂質蓄積を低減させ、生存を延長することが示されている。しかしながら、Food and Drug Administration（ＦＤＡ）により承認されたＮＰＣ１の治療法は、存在しない。したがって、ＮＰＣ１を治療、治癒及び／又は予防する組成物及び方法が緊急に必要とされている。
簡単な概要
[0006] ＮＰＣ１を治療、予防及び／又は治癒するための遺伝子療法組成物及び方法が本明細書で提供される。より具体的には、本開示は、ＮＰＣ１を治療、予防及び／又は治癒するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター及び核酸（ＡＡＶ導入カセットを含む核酸を含む）を提供する。
[0007] 一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、（ｉ）配列番号１８０の配列を含むカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド；及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された核酸を含み；核酸は、導入カセットを含み；導入カセットは、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；プロモーター；ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含む。
[0008] 一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、（ｉ）配列番号１８０の配列又は配列番号１８０に対して約１～約２５個のアミノ酸変異を含む配列を含むカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド；及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された核酸を含み；核酸は、導入カセットを含み；導入カセットは、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；プロモーター；ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含む。
[0009] 一部の実施形態において、導入カセットは、イントロン配列を含む。一部の実施形態において、イントロン配列は、配列番号１０の配列を含む。一部の実施形態において、イントロン配列は、プロモーターと導入遺伝子との間に局在させることができる。
[0010] 一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号３００３の配列を含む。一部の実施形態において、３’ＩＴＲは、配列番号３００４の配列を含む。
[0011] 一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＢＡプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、配列番号３００５の配列を含む。
[0012] 一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質である。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号３００１の配列を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３００２の配列を含む。
[0013] 一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号３０１２の配列を含む。
[0014] 一部の実施形態において、導入カセットは、エンハンサーを含む。
[0015] 一部の実施形態において、導入カセットは、配列番号３０１４の配列を含む。一部の実施形態において、導入カセットは、配列番号３０１５～３０１９のいずれか１つの配列を含む。
[0016] 本開示のＡＡＶベクターを含む組成物も本明細書で提供される。本開示のＡＡＶベクターを含む細胞も本明細書で提供される。
[0017] 治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に、有効量の、本開示のＡＡＶベクター、核酸、組成物又は細胞を投与することを含む方法も本明細書で提供される。一部の実施形態において、対象は、ニーマン・ピック病Ｃ型を有する。一部の実施形態において、対象は、ヒト対象である。
[0018] これら及び他の実施形態は、以下でより詳細に記載される。
図面の簡単な説明
[0019]ライブラリー多様性、指向性進化及び新規抗原性フットプリントの濃縮の分析を示すバブルプロット。親ライブラリー（図１Ａ）を、Illumina MiSeqプラットフォームを使用する高スループットシーケンシングに供した。カスタムPerlスクリプトでの分析後、濃縮されたアミノ酸配列をプロットした。それぞれのバブルは、区別されるカプシドタンパク質サブユニットアミノ酸配列を表し、バブルの半径は、それぞれのライブラリーにおけるそのバリアントについてのリードの数に比例する。ｙ軸は、シーケンシングランからの総リードの割合を表す。可視化の容易性のためにデータがｘ軸に沿って拡散されている。 [0019]ライブラリー多様性、指向性進化及び新規抗原性フットプリントの濃縮の分析を示すバブルプロット。第１のラウンドの進化からの進化ライブラリー（図１Ｂ）を、Illumina MiSeqプラットフォームを使用する高スループットシーケンシングに供した。カスタムPerlスクリプトでの分析後、濃縮されたアミノ酸配列をプロットした。それぞれのバブルは、区別されるカプシドタンパク質サブユニットアミノ酸配列を表し、バブルの半径は、それぞれのライブラリーにおけるそのバリアントについてのリードの数に比例する。ｙ軸は、シーケンシングランからの総リードの割合を表す。可視化の容易性のためにデータがｘ軸に沿って拡散されている。 [0019]ライブラリー多様性、指向性進化及び新規抗原性フットプリントの濃縮の分析を示すバブルプロット。第２のラウンドの進化からの進化ライブラリー（図１Ｃ）を、Illumina MiSeqプラットフォームを使用する高スループットシーケンシングに供した。カスタムPerlスクリプトでの分析後、濃縮されたアミノ酸配列をプロットした。それぞれのバブルは、区別されるカプシドタンパク質サブユニットアミノ酸配列を表し、バブルの半径は、それぞれのライブラリーにおけるそのバリアントについてのリードの数に比例する。ｙ軸は、シーケンシングランからの総リードの割合を表す。可視化の容易性のためにデータがｘ軸に沿って拡散されている。ユニーククローンの低減パーセント（９６．５％）は、多数の「非フィット」配列が第１及び第２のラウンドの進化後に除去されたことを直接実証する。ドミナント単離体をさらなる分析のために選択した。 [0020]野生型ＡＡＶ９と比較した、カプシドタンパク質サブユニットバリアントＳＴＲＤ．１０１及びＳＴＲＤ．１０２を含むタンパク質カプシドを含むＡＡＶベクターの体積収量。バーは、平均＋／－９５％信頼区間を表す。 [0021]標準的なＴＣＩＤ５０アッセイを使用して決定されたＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１及び野生型ＡＡＶ９の感染力値。データを、感染単位（Ｐ：Ｉ比）を生成するために要求される粒子の数の自然対数としてグラフ化する。エラーバーは、標準偏差を表す。 [0022]同様にルシフェラーゼ配列をパッケージングする野生型ＡＡＶ９ベクターと比較した、ＳＴＲＤ．１０１カプシドタンパク質サブユニットを含み、ルシフェラーゼ導入遺伝子をパッケージングする組換えＡＡＶベクターによる、Ｕ８７細胞（図４Ａ）の形質導入。エラーバーは、標準誤差を表す。 [0022]同様にルシフェラーゼ配列をパッケージングする野生型ＡＡＶ９ベクターと比較した、ＳＴＲＤ．１０１カプシドタンパク質サブユニットを含み、ルシフェラーゼ導入遺伝子をパッケージングする組換えＡＡＶベクターによるＮ２Ａ細胞（図４Ｂ）の形質導入。エラーバーは、標準誤差を表す。 [0022]同様にルシフェラーゼ配列をパッケージングする野生型ＡＡＶ９ベクターと比較した、ＳＴＲＤ．１０１カプシドタンパク質サブユニットを含み、ルシフェラーゼ導入遺伝子をパッケージングする組換えＡＡＶベクターによるＳｙ５Ｙ細胞（図４Ｃ）の形質導入。エラーバーは、標準誤差を表す。 [0022]同様にルシフェラーゼ配列をパッケージングする野生型ＡＡＶ９ベクターと比較した、ＳＴＲＤ．１０１カプシドタンパク質サブユニットを含み、ルシフェラーゼ導入遺伝子をパッケージングする組換えＡＡＶベクターによるＵ２ＯＳ細胞（図４Ｄ）の形質導入。エラーバーは、標準誤差を表す。 [0023]４％ＰＦＡでの固定２４時間後の冠状ビブラトーム切片におけるtdTomato発現を示す代表的な蛍光顕微鏡法による画像。それぞれの切片は、２５μｍ厚である。上段パネルは、天然tdTomato蛍光について４倍対物レンズを使用して得られた画像を示す。下段パネルは、天然tdTomato蛍光について１０倍対物レンズを使用して得られた画像を示す。 [0024]４％ＰＦＡでの固定２４時間後の冠状ビブラトーム切片におけるtdTomato発現を示す代表的な免疫組織化学画像。それぞれの切片は、２５μｍ厚である。 [0025]４％ＰＦＡでの固定２４時間後のビブラトーム肝切片におけるtdTomato発現を示す代表的な蛍光顕微鏡法による画像。それぞれの切片は、２５μｍ厚である。パネルは、ＤＡＰＩ対比染色での天然tdTomato蛍光を示す。 [0026]４％ＰＦＡでの固定２４時間後のビブラトーム心臓切片におけるtdTomato発現を示す代表的な蛍光顕微鏡法による画像。それぞれの切片は、５０μｍ厚である。パネルは、ＤＡＰＩ対比染色での天然tdTomato蛍光を示す。 [0027]非ヒト霊長類における組換えＡＡＶの生体分布。水平線は検出限界を示す。 [0028]野生型Ｕ２ＯＳ細胞、ＮＰＣ１欠損（ＮＰＣ１－／－）Ｕ２ＯＳ細胞及び５×１０３又は１０×１０３のいずれかの感染多重度（ＭＯＩ）でＡＡＶ２－ｈＮＰＣを形質導入されたＮＰＣ１－／－細胞におけるLysoTracker（登録商標）蓄積を測定することにより決定されたリソソーム表現型を示すグラフである。統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡを使用して決定した。エラーバーは、標本平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。 [0029]野生型Ｕ２ＯＳ細胞、ＮＰＣ１欠損（ＮＰＣ１－／－）Ｕ２ＯＳ細胞及び５×１０３又は１０×１０３のいずれかの感染多重度（ＭＯＩ）でＡＡＶ２－ｈＮＰＣを形質導入されたＮＰＣ１－／－細胞における、フィリピン染色を使用して決定されたコレステロール蓄積を示すグラフである。統計的有意性は、一元ＡＮＯＶＡを使用して決定した。エラーバーは、ＳＥＭを表す。 [0030]生理食塩水又はＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１の眼窩静脈叢注射後のＮＰＣ１－／－マウスの生存率を示すカプラン・マイヤー生存曲線である。全てのＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１注射動物は、実験の継続期間にわたり生存し、組織学的分析のために約１００日齢で犠死させた。 [0031]野生型マウス、生理食塩水処理ＮＰＣ１－／－マウス又はＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１が注射されたＮＰＣ１－／－マウスの約１０週（７０日）齢における行動的表現型スコアを示す。統計的有意性は、対応のないＴ検定を使用して決定し、エラーバーは、ＳＥＭを表す。 [0032]野生型マウス、生理食塩水処理ＮＰＣ１－／－マウス又はＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１で処理されたＮＰＣ１－／－マウスの約８週（５６日）齢における平均台歩行テストにおける転倒の回数を示す。エラーバーは、標準偏差を表す。
詳細な説明
[0033] 抗体認識を回避し、及び／又はＣＮＳの組織を選択的に標的化する組換えＡＡＶベクターが本明細書で提供される。これらのＡＡＶベクターは、疾患、例えばＮＰＣ１の治療、予防及び／又は治癒に有用であり得る。
[0034] ＡＡＶは、遺伝子送達剤として有用であり、ヒト遺伝子療法のための強力なツールである。ＡＡＶを使用すると、高頻度ＤＮＡ送達及び安定的発現を種々の細胞においてインビボ及びインビトロの両方で達成することができる。一部の他のウイルスベクター系と異なり、ＡＡＶは、標的細胞中での安定的組込みのために活発な細胞分裂を要求しない。
[0035] 特に規定のない限り、本明細書において使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書の詳細な説明において使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のためのものにすぎず、限定的であることを意図しない。
[0036] 本明細書に挙げられる全ての刊行物、特許出願、特許、GenBank又は他のアクセッション番号及び他の参照文献は、参照により全体として全ての目的のために組み込まれる。
[0037] 本開示及び添付の特許請求の範囲におけるＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット中のアミノ酸位置の指定は、ＶＰ１番号付けに関する。ＡＡＶ ｃａｐ遺伝子中に挿入される場合の本明細書に記載の修飾がＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３領域中の修飾をもたらし得ることが当業者により理解される。代わりに、ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３を独立に発現させて、それらの領域の１つ又は２つのみ（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１＋ＶＰ２、ＶＰ１＋ＶＰ３又はＶＰ２＋ＶＰ３）の修飾を達成することができる。
定義
[0038] 以下の用語は、本明細書の説明及び添付の特許請求の範囲において使用される。
[0039] 単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」及び「その」は、文脈が特に明らかに示さない限り、複数形も含むことが意図される。
[0040] さらに、「約」という用語は、本明細書において使用されるとき、測定可能な値、例えばポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の長さ、用量、時間、温度などの量を指す場合、特定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％又はさらに±０．１％の変動を包含することを意味する。
[0041] また、本明細書において使用されるとき、「及び／又は」は、付随する列記項目の１つ以上の任意の及び全ての可能な組み合わせ並びに択一（「又は」）で解釈された場合の組み合わせの欠如を指し、包含する。
[0042] 文脈が特に示さない限り、本明細書に記載の種々の特徴部を任意の組み合わせで使用し得ることが具体的に意図される。さらに、一部の実施形態において、本明細書に記載の任意の特徴部又は特徴部の組み合わせを排除又は省略することができる。さらに説明すると、例えば、本明細書が、特定のアミノ酸をＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ及び／又はＶから選択できることを示す場合、その文言は、そのアミノ酸を、それらのアミノ酸の任意のサブセット、例えばＡ、Ｇ、Ｉ又はＬ；Ａ、Ｇ、Ｉ又はＶ；Ａ又はＧ；Ｌのみなどから、そのようなそれぞれのサブコンビネーションが本明細書に明示されているかのように選択し得ることも示す。さらに、このような文言は、特定のアミノ酸の１つ以上を排除できることも示す。例えば、一部の実施形態において、そのアミノ酸は、ＡでもＧでもＩでもなく；Ａでなく；ＧでもＶでもないなどであり、そのような考えられるそれぞれの排除項目は、本明細書に明示されているものとして扱われる。
[0043] 本明細書において使用されるとき、「低減させる（reduce）」、「低減させる（reduces）」、「低減」という用語及び類似の用語は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３５％、約５０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％又はそれより多い減少を意味する。
[0044] 本明細書において使用されるとき、「増加させる」、「改善する」、「向上させる（enhance）」、「向上させる（enhances）」、「向上」という用語及び類似の用語は、少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約５０％、約７５％、約１００％、約１５０％、約２００％、約３００％、約４００％、約５００％又はそれより多い増加を示す。
[0045] 「パルボウイルス」という用語は、本明細書において使用されるとき、パルボウイルス科（Parvoviridae）、例として自律複製パルボウイルス及びディペンドウイルスを包含する。自律性パルボウイルスとしては、プロトパルボウイルス（Protoparvovirus）、エリスロパルボウイルス（Erythroparvovirus）、ボカパルボウイルス（Bocaparvovirus）属及びデンソウイルス（Densovirus）亜科のメンバーが挙げられる。例示的な自律性パルボウイルスとしては、限定されるものではないが、マウス微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、マスコビーダックパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス及び現在公知の又は後に発見される任意の他の自律性パルボウイルスが挙げられる。他の自律性パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、BERNARD N.FIELDS et al, VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers；Cotmore et al. Archives of Virology DOI 10.1007/s00705-013-1914-I）を参照されたい。
[0046] 本明細書において使用されるとき、「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）という用語は、限定されるものではないが、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（例として３Ａ及び３Ｂ型）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ＡＡＶ ｒｈ３２．３３型、ＡＡＶ ｒｈ８型、ＡＡＶ ｒｈ１０型、ＡＡＶ ｒｈ７４型、ＡＡＶ ｈｕ．６８型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、フトアゴヒゲトカゲＡＡＶ、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂ及び現在公知の又は後に発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、BERNARD N. FIELDS et al, VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers）を参照されたい。多数のＡＡＶ血清型及びクレードが同定されている（例えば、Gao et al, (2004) J. Virology 78: 6381-6388；Moris et al, (2004) Virology 33-: 375-383；及び表２を参照されたい）。ＡＡＶ１－９、ＡＡＶｒｈ．１０及びＡＡＶ１１についての例示的なＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット配列は、配列番号１～１１に提供される。
[0047] 本明細書において使用されるとき、「キメラＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶの２つ以上の異なる血清型に由来する領域、ドメイン、個々のアミノ酸を有するカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシドを含むＡＡＶを指す。一部の実施形態において、キメラＡＡＶは、第１のＡＡＶ血清型に由来する第１の領域及び第２のＡＡＶ血清型に由来する第２の領域からなるカプシドタンパク質サブユニットを含む。一部の実施形態において、キメラＡＡＶは、第１のＡＡＶ血清型に由来する第１の領域、第２のＡＡＶ血清型に由来する第２の領域及び第３のＡＡＶ血清型に由来する第３の領域からなるカプシドタンパク質サブユニットを含む。一部の実施形態において、キメラＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１及び／又はＡＡＶ１２に由来する領域、ドメイン、個々のアミノ酸を含み得る。例えば、キメラＡＡＶは、以下（表１）に示される第１及び第２のＡＡＶ血清型からの領域、ドメイン及び／又は個々のアミノ酸を含み得、ＡＡＶＸ＋Ｙは、ＡＡＶＸ及びＡＡＶＹに由来する配列を含むキメラＡＡＶを示す。
Figure 2022551739000002
[0048] １つのカプシドタンパク質サブユニット中に複数のＡＡＶ血清型からの個々のアミノ酸又は領域を含めることにより、複数のＡＡＶ血清型に別個に由来する複数の所望の特性を有するカプシドタンパク質サブユニットを得ることができる。
[0049] ＡＡＶ及び自律性パルボウイルスの種々の血清型のゲノム配列並びに天然末端リピート（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質及びカプシドタンパク質サブユニットの配列は、当技術分野において公知である。このような配列は、文献又は公的なデータベース、例えばGenBankに見出すことができる。例えば、GenBankアクセッション番号NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852、AY530579を参照されたく；それらの開示は、パルボウイルス及びＡＡＶの核酸及びアミノ酸配列の教示のために参照により本明細書に組み込まれる。例えば、Srivistava et al., (1983) J. Virology 45: 555；Chiorini et al, (1998) J Virology 71: 6823；Chiorini et al., (1999) J. Virology 73: 1309；Bantel-Schaal et al., (1999) J Virology 73: 939；Xiao et al, (1999) J Virology 73: 3994；Muramatsu et al., (1996) Virology 221: 208；Shade et al, (1986) J. Virol. 58: 921；Gao et al, (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854；Moris et al, (2004) Virology 33: 375-383；国際公開第００／２８０６１号、国際公開第９９／６１６０１号、国際公開第９８／１１２４４号；及び米国特許第６，１５６，３０３号も参照されたく；それらの開示は、パルボウイルス及びＡＡＶの核酸及びアミノ酸配列の教示のために参照により本明細書に組み込まれる。表２も参照されたい。自律性パルボウイルス及びＡＡＶのタンパク質カプシド構造は、BERNARD N.FIELDS et al., VIROLOGY, volume 2, chapters 69&70 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers)により詳細に記載されている。ＡＡＶ２（Xie et al., (2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99: 10405-10）、ＡＡＶ９（DiMattia et al., (2012) J. Virol. 86: 6947-6958）、ＡＡＶ８（Nam et al, (2007) J. Virol. 81: 12260-12271）、ＡＡＶ６（Ng et al., (2010) J. Virol. 84: 12945-12957）、ＡＡＶ５（Govindasamy et al. (2013) J. Virol. 87, 11187-11199）、ＡＡＶ４（Govindasamy et al. (2006) J. Virol. 80: 11556-11570）、ＡＡＶ３Ｂ（Lerch et al., (2010) Virology 403: 26-36），ＢＰＶ（Kailasan et al., (2015) J. Virol. 89: 2603-2614）及びＣＰＶ（Xie et al, (1996) J. Mol. Biol. 6: 497-520及びTsao et al, (1991) Science 251: 1456-64）の結晶構造の記載も参照されたい。
Figure 2022551739000003
Figure 2022551739000004
Figure 2022551739000005
[0050] 組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは、ウイルス産生細胞系を使用して培養物中で産生することができる。「ウイルス産生細胞（viral production cell）」、「ウイルス産生細胞系」又は「ウイルス産生細胞（viral producer cell）」という用語は、ウイルスベクターを産生するために使用される細胞を指す。ＨＥＫ２９３及び２３９Ｔ細胞が一般的なウイルス産生細胞系である。以下の表３は、種々のウイルスベクターのための例示的なウイルス産生細胞系を列記する。ｒＡＡＶの産生は、典型的には、細胞において３つのエレメント：１）ＡＡＶ逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列によりフランキングされた導入遺伝子、２）ＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及び３）ヘルパーウイルスタンパク質配列の存在を要求する。これらの３つのエレメントは、１つ以上のプラスミド上で提供され、細胞中に形質移入又は形質導入されることができる。
Figure 2022551739000006
[0051] 「ＨＥＫ２９３」は、元々組織培養物中で増殖させたヒト胎児腎細胞に由来する細胞系を指す。ＨＥＫ２９３細胞系は、培養物中で容易に増殖し、ウイルス産生のために一般に使用される。本明細書において使用されるとき、「ＨＥＫ２９３」は、１つ以上のバリアントＨＥＫ２９３細胞系、すなわち１つ以上の遺伝子変化をさらに含む、元のＨＥＫ２９３細胞系に由来する細胞系も指し得る。多くのバリアントＨＥＫ２９３系は、１つ以上の特定の用途のために開発及び最適化されてきた。例えば、２９３Ｔ細胞系は、ＳＶ４０複製起点を含有する形質移入されたプラスミドのエピソーム複製を可能とするＳＶ４０ラージＴ抗原を含有し、所望の遺伝子産物の発現の増加を導く。
[0052] 「Ｓｆ９」は、親スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞系ＩＰＬＢ－Ｓｆ－２１－ＡＥに由来するクローン単離体である昆虫細胞系を指す。Ｓｆ９細胞は、血清の不存在下で増殖させることができ、接着培養するか又は懸濁液中で培養することができる。
[0053] 「形質移入試薬」は、細胞中への核酸の移行を向上させる組成物を意味する。当技術分野において一般に使用される一部の形質移入試薬としては、核酸に及び細胞表面に結合する１つ以上の脂質（例えば、Lipofectamine（商標））が挙げられる。
[0054] 本明細書において使用されるとき、「感染多重度」又は「ＭＯＩ」という用語は、細胞と接触するビリオンの数を指す。例えば、培養細胞は、１細胞当たり１×１０２～１×１０５個のビリオンの範囲のＭＯＩでＡＡＶと接触させることができる。
[0055] 「自己相補的ＡＡＶ」又は「ｓｃＡＡＶ」という用語は、自然にアニールし、二量体逆位リピート分子を形成し、慣用の一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶゲノムと比較して早期及びロバストな導入遺伝子発現をもたらす核酸（すなわちＤＮＡ）を含む組換えＡＡＶベクターを指す。例えば、McCarty, D. M., et al., Gene Therapy 8, 1248-1254 (2001)を参照されたい。慣用のｓｓＡＡＶと異なり、ｓｃＡＡＶは、遺伝子発現についての律速ステップである第２鎖合成を迂回し得る。さらに、二本鎖ｓｃＡＡＶは、ウイルス形質導入後のＤＮＡ分解の傾向が小さく、それにより安定的エピソームのコピーの数を増加させる。特に、ｓｃＡＡＶは、典型的には、慣用のＡＡＶベクターのサイズの半分である約２．４ｋｂのゲノムのみを保持し得る。一部の実施形態において、本明細書に記載のＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶである。
[0056] 本明細書において使用されるとき、「ペプチド」という用語は、短いアミノ酸配列を指す。ペプチドという用語は、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットアミノ酸配列の一部又は領域を指すために使用することができる。ペプチドは、天然ＡＡＶカプシドタンパク質中で天然に生じるペプチド又は天然ＡＡＶカプシドタンパク質中で天然に生じないペプチドであり得る。ＡＡＶカプシドタンパク質中で天然に生じるＡＡＶペプチドは、天然に生じないペプチドにより置換することができる。例えば、天然に生じるペプチドが、天然に生じないペプチドにより置き換えられるように、天然に生じないペプチドをＡＡＶカプシドタンパク質中に置換して修飾カプシドタンパク質を提供することができる。
[0057] 「トロピズム」という用語は、本明細書において使用されるとき、ある細胞又は組織中へのウイルスの優先的進入、任意選択でそれに続く、細胞中でのウイルスゲノムにより担持される配列の発現（例えば、転写及び任意選択で翻訳）、例えば組換えウイルスについて目的導入遺伝子の発現を指す。
[0058] 本明細書において使用されるとき、「全身性トロピズム」及び「全身性形質導入」（及び均等な用語）は、それぞれ本明細書に記載のウイルスベクター又はウイルス様粒子が全身の組織（例えば、脳、肺、骨格筋、心臓、肝臓、腎臓及び／又は膵臓）についてトロピズムを示すか、又はそれを形質導入することを示す。一部の実施形態において、筋肉組織（例えば、骨格筋、横隔膜筋及び心筋）の全身性形質導入が達成される。一部の実施形態において、骨格筋組織の全身性形質導入が達成される。例えば、一部の実施形態において、全身の本質的に全ての骨格筋が形質導入される（ただし、形質導入の効率は、筋肉タイプにより変動し得る）。一部の実施形態において、四肢筋、心筋及び横隔膜筋の全身性形質導入が達成される。任意選択で、ウイルスベクター又はウイルス様粒子は、全身経路（例えば、静脈内、関節内又はリンパ管内のような全身経路）を介して投与する。
[0059] 代わりに、一部の実施形態において、ウイルスベクター又はウイルス様粒子は、局部（例えば、足蹠、筋肉内、皮内、皮下、局所）送達する。一部の実施形態において、ウイルスベクター又はウイルス様粒子は、中枢神経系（ＣＮＳ）の組織、例えば脳又は脊髄に局部送達する。一部の実施形態において、ウイルスベクター又はウイルス様粒子は、髄腔内、脳内又は脳室内注射により投与する。
[0060] 特に示されない限り、「効率的な形質導入」若しくは「効率的なトロピズム」又は類似の用語は、好適な対照を参照することにより判断することができる（例えば、それぞれ対照の形質導入又はトロピズムの少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上）。一部の実施形態において、ウイルスベクター（例えば、ＡＶＶベクター）は、骨格筋、心筋、横隔膜筋、膵臓（膵島β細胞を含む）、脾臓、胃腸管（例えば、上皮及び／又は平滑筋）、中枢神経系の細胞、肺、関節細胞及び／又は腎臓について、効率的に形質導入するか又は効率的なトロピズムを有する。好適な対照は、種々の要因、例として所望のトロピズムプロファイルに依存する。例えば、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９は、骨格筋、心筋及び横隔膜筋の形質導入において高度に効率的であるが、高効率で肝臓も形質導入するという欠点を有する。したがって、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９の骨格筋、心筋及び／又は横隔膜筋の効率的な形質導入を実証するが、肝臓についてかなり低い形質導入効率を有するウイルスベクターを同定することができる。さらに、目的トロピズムプロファイルは、複数の標的組織へのトロピズムを反映し得るため、好適なウイルスベクターは、いくらかのトレードオフを表し得ることが認識される。説明すると、ウイルスベクターは、ＡＡＶ８又はＡＡＶ９よりも骨格筋、心筋及び／又は横隔膜筋の形質導入において効率が低くなり得るが、それにもかかわらず、低レベルの肝臓の形質導入のため極めて望ましいことがある。
[0061] 同様に、ウイルスが標的組織について「効率的に形質導入しない」か、「効率的なトロピズムを有さない」か、又はその類似の用語について、好適な対照を参照することにより判定することができる。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、肝臓、腎臓、性腺及び／又は生殖細胞について効率的に形質導入しない（すなわち効率的なトロピズムを有さない）。一部の実施形態において、組織（例えば、肝臓）の不所望な形質導入は、所望の標的組織（例えば、骨格筋、横隔膜筋、心筋及び／又は中枢神経系の細胞）の形質導入のレベルの約２０％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．１％以下である。
[0062] ＡＡＶベクター（又はタンパク質カプシド、カプシドタンパク質サブユニット若しくはそのペプチド）との関連で本明細書において使用されるとき、「選択的に結合する」、「選択的結合」という用語及び類似の用語は、特定の分子構造の存在に依存する様式での標的へのＡＡＶベクター（又はタンパク質カプシド、カプシドタンパク質サブユニット若しくはそのペプチド）の結合を指す。一部の実施形態において、選択的結合は、他の標的への実質的結合も顕著な結合もない主に特異的標的へのＡＡＶの結合を指す。一部の実施形態において、ＡＡＶベクター（又はタンパク質カプシド、カプシドタンパク質サブユニット若しくはそのペプチド）は、目的細胞又は組織中の受容体に特異的に結合するが、他の受容体への実質的結合も顕著な結合も示さない。
[0063] 「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（例として、天然に生じるヌクレオチド及び天然に生じないヌクレオチドの両方）であり得る。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、一本鎖ＤＮＡ配列又は二本鎖ＤＮＡ配列のいずれかである。
[0064] 本明細書において使用されるとき、「単離」ポリヌクレオチド（例えば、「単離ＤＮＡ」又は「単離ＲＮＡ」）は、天然に生じる生物若しくはウイルスの他の構成要素、例えば細胞若しくはウイルスの構造的な構成要素の少なくとも一部又は一般にポリヌクレオチドに付随して見出される他のポリペプチド若しくは核酸から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。一部の実施形態において、「単離」ヌクレオチドは、出発材料と比較して少なくとも約１０倍、約１００倍、約１０００倍、約１０，０００倍以上だけ濃縮されている。
[0065] 同様に、「単離」ポリペプチドは、天然に生じる生物若しくはウイルスの他の構成要素、例えば細胞若しくはウイルスの構造的な構成要素の少なくとも一部又は一般にポリペプチドに付随して見出される他のポリペプチド若しくは核酸から少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。一部の実施形態において、「単離」ポリペプチドは、出発材料と比較して少なくとも約１０倍、約１００倍、約１０００倍、約１０，０００倍以上だけ濃縮されている。
[0066] 本明細書において使用されるとき、ウイルスベクターを「単離する」又は「精製する」（又は文法的に均等な用語）は、出発物質中の他の構成要素の少なくとも一部からウイルスベクターを少なくとも部分的に分離することを意味する。一部の実施形態において、「単離」又は「精製」ウイルスベクターは、出発材料と比較して少なくとも約１０倍、約１００倍、約１０００倍、約１０，０００倍以上だけ濃縮されている。
[0067] 「治療」ポリペプチド又はタンパク質は、細胞若しくは対象のタンパク質の不存在若しくは欠損から生じる症状を緩和し、軽減し、予防し、遅延させ、及び／又は安定させ得るもの、及び／又はそうでなければ対象に利益、例えば抗癌効果若しくは移植生存率の改善を付与するポリペプチドである。
[0068] 「治療する」、「治療すること」又は「～の治療」という用語（及びその文法的変形表現）は、対象の病態の重症度を低減させるか、少なくとも部分的に改善するか若しくは安定させること、及び／又は少なくとも１つの臨床症状のいくらかの緩和、軽減、減少若しくは安定化が達成されること及び／又は疾患若しくは障害の進行の遅延が見られることを意味する。
[0069] 「予防する」、「予防すること」及び「予防」という用語（及びその文法的変形表現）は、対象における疾患、障害及び／又は臨床症状の発症の予防及び／又は遅延、及び／又は疾患、障害及び／又は臨床症状の発症の重症度を、本明細書に記載の組成物及び／又は方法の不存在下で生じるものに対して低減させることを指す。予防は、完全な予防、例えば疾患、障害及び／又は臨床症状の完全な不存在であり得る。予防は、対象における疾患、障害及び／又は臨床症状の発生及び／又は発症の重症度が本明細書に記載の組成物及び／又は方法の不存在下で生じるものよりも低いような部分的なものであり得る。
[0070] 本明細書において使用されるとき、「有効量」は、対象における疾患若しくは障害を治療若しくは予防するため又はその徴候若しくは症状を改善するために有効である、本明細書で提供されるＡＡＶベクター、核酸又は他の薬剤の量である。「有効量」は、例えば、疾患及び／又は疾患の症状、疾患の重症度及び／又は疾患若しくは障害の症状、年齢、体重及び／又は治療される患者の健康並びに処方医の判断に応じて変動し得る。任意の所与の例における適切な量は、当業者が確認することができるか、又は定型的な実験により決定することができる。
[0071] 本明細書において使用されるとき、「ウイルスベクター」、「ベクター」という用語は、核酸送達ビヒクルとして機能し、ビリオン又はウイルス様粒子内にパッケージングされたベクターゲノム（例えば、導入遺伝子を含む核酸）を含むウイルス（例えばＡＡＶ）粒子を指す。
[0072] 「アデノ随伴ウイルスベクター」又は「ＡＡＶベクター」は、典型的には、タンパク質カプシド及びタンパク質カプシドによってカプシド化された核酸（例えば、導入遺伝子を含む核酸）を含む。「タンパク質カプシド」は、Ｔ＝１の二十面体対称で会合及び配置された個々の「カプシドタンパク質サブユニット」（例えば、約６０個のカプシドタンパク質サブユニット）を含むほぼ球形のタンパク質シェルである。本明細書に記載のＡＡＶベクターのタンパク質カプシドは、複数のカプシドタンパク質サブユニットを含む。ＡＡＶベクターがＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを含むとして記載される場合、ＡＡＶベクターは、タンパク質カプシドを含み、タンパク質カプシドは、１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを含むことが理解される。本明細書において使用されるとき、「カプシドタンパク質」という用語は、カプシドタンパク質サブユニットを指すために使用されることがある。「ウイルス様粒子（viral-like particle）」又は「ウイルス様粒子（virus-like particle）」という用語は、導入カセット又は導入遺伝子を含むいかなるベクターゲノムや核酸を含まないタンパク質カプシドを指す。
[0073] 一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、「導入カセット」を含む核酸、すなわちＡＡＶにより細胞に送達され得る１つ以上の配列を含む核酸を含み得る。一部の実施形態において、核酸は、自己相補的である（すなわち二本鎖）。一部の実施形態において、核酸は、自己相補的でない（すなわち一本鎖）。
[0074] 「ｒＡＡＶベクターゲノム」又は「ｒＡＡＶゲノム」は、１つ以上の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわちｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般に、核酸複製を促進するためにシス位の逆位末端リピート（ＩＴＲ）のみを要求する。他の全てのウイルス配列は、必須ではなく、トランス位に供給することができる（Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158: 97）。典型的には、ＡＡＶベクターにより効率的にパッケージングすることができる導入遺伝子のサイズを最大化するために、ｒＡＡＶベクターゲノムは、１又は２つのＩＴＲ配列のみを保持する。構造及び非構造タンパク質コード配列は、（例えば、プラスミドから又はその配列をパッケージング細胞中に安定的に組み込むことにより）トランス位に供給することができる。一部の実施形態において、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ配列）、任意選択で２つのＩＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＩＴＲ）を含み、それらは、典型的には、ベクターゲノムの５’及び３’末端に存在し（すなわち５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ）、異種核酸をフランキングするが、それに連続する必要はない。
[0075] 本明細書に記載のウイルスベクターは、さらに、「標的化」ウイルスベクター（例えば、指向型トロピズムを有するベクター）及び／又は国際公開第００／２８００４号及びChao et al, (2000) Molecular Therapy 2: 619に記載の「ハイブリッド」ウイルスベクター（すなわちウイルスＩＴＲ及びウイルスタンパク質カプシドが異なるウイルスからのものである）であり得る。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ＣＮＳの細胞及び／又は組織に標的化される。
[0076] 本明細書に記載のウイルスベクターは、さらに、国際公開第０１／９２５５１号（その開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）に記載のデュプレックス化ウイルス粒子であり得る。したがって、一部の実施形態において、二本鎖（デュプレックス）ゲノムを、本明細書に記載のウイルスタンパク質カプシド中にパッケージングすることができる。さらに、タンパク質カプシド、タンパク質カプシドサブユニット又はゲノムエレメントは、他の修飾、例として挿入、欠失及び／又は置換を含有し得る。
[0077] 本明細書において使用されるとき、「アミノ酸」という用語は、任意の天然に生じるアミノ酸、その修飾形態及び合成アミノ酸を包含する。天然に生じる左旋性（Ｌ－）アミノ酸は、表４に示される。
Figure 2022551739000007
[0078] 代わりに、アミノ酸は、修飾アミノ酸残基（非限定的な例は、表５に示される）であり得、及び／又は翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化又は硫酸化）により修飾されているアミノ酸であり得る。アミノ酸を化学的に修飾する方法は、当技術分野において公知である（例えば、Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, 1st edition, Academic Press, 1996を参照されたい）。
Figure 2022551739000008
[0079] さらに、天然に生じないアミノ酸は、「非天然」アミノ酸（Wang et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35: 225-49 (2006)により記載）であり得る。これらの非天然アミノ酸を有利に使用して、目的分子をＡＡＶタンパク質カプシド又はカプシドタンパク質サブユニットに化学的に結合させることができる。
修飾ＡＡＶタンパク質カプシドサブユニット、タンパク質カプシド及びそれを含むＡＡＶベクター
ＡＡＶベクター
[0080] （ｉ）組換えカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド、及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された導入カセットを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが本明細書でさらに提供される。一部の実施形態において、組換えカプシドタンパク質サブユニット（ＶＰ１、ＶＰ２及び／又はＶＰ３領域を含む）は、いかなる天然ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット配列にも生じないそれらのアミノ酸配列中のペプチドを含み得る。本明細書に記載のペプチドを含むカプシドタンパク質サブユニットは、１つ以上の所望の特性、例として、限定されるものではないが、中和抗体を回避する能力をウイルスベクターに付与し得る。したがって、本明細書に記載のＡＡＶベクターは、慣用のＡＡＶベクターに伴う限界に対処する。
[0081] したがって、一部の実施形態において、本開示は、（ｉ）１つ以上の組換えカプシドタンパク質、及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された導入カセットを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、カプシドタンパク質は、配列番号１２～２０のいずれか１つの配列を有するペプチドを含む、ＡＡＶベクターを提供する。一部の実施形態において、導入カセットは、５’及び３’ＡＡＶ逆位末端リピートを含む。一部の実施形態において、導入カセットは、導入遺伝子（例えば、ＮＰＣ１導入遺伝子）を含む。一部の実施形態において、導入カセットは、二本鎖である。一部の実施形態において、導入カセットは、一本鎖である。一部の実施形態において、導入遺伝子は、治療タンパク質又はＲＮＡをコードする。一部の実施形態において、組換えカプシドタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ又はトリＡＡＶカプシドタンパク質の天然配列との少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、組換えカプシドタンパク質は、ＡＡＶ９カプシドタンパク質の天然配列との少なくとも９０％の配列同一性を有する。
[0082] 一部の実施形態において、ペプチドは、天然ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸４５１～４５８又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ若しくはトリＡＡＶ中の均等なアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置に局在し、ペプチドは、配列番号１２～１８のいずれか１つから選択される。一部の実施形態において、ペプチドは、天然ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸５８７～５９４又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ若しくはトリＡＡＶ中の均等なアミノ酸残基に対応するアミノ酸位置に局在し、ペプチドは、配列番号１９又は２０から選択される。
[0083] 一部の実施形態において、組換えカプシドタンパク質サブユニットは、ａ）配列番号１２～１８のいずれか１つの配列を有する第１のペプチド；及びｂ）配列番号１９～２０のいずれか１つの配列を有する第２のペプチドを含む。一部の実施形態において、第１のペプチドは、アミノ酸位置４５１～４５８に存在し、第２のペプチドは、アミノ酸５８７～５９４に存在し、アミノ酸番号付けは、天然ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニット又はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ若しくはトリＡＡＶ中の均等なアミノ酸残基に基づく。
[0084] 一部の実施形態において、ペプチドは、タンパク質カプシド又はそのカプシドタンパク質サブユニットへの少なくとも１つの抗体の結合を阻害する。一部の実施形態において、ペプチドは、抗体によるＡＡＶベクターの感染力の中和を阻害する。
[0085] 一部の実施形態において、ペプチドは、中枢神経系（ＣＮＳ）中の細胞の表面上で発現される受容体に選択的に結合する。一部の実施形態において、細胞は、運動前野、視床、小脳皮質、歯状核、脊髄又は後根神経節中に存在する。一部の実施形態において、ペプチドは、心臓中の細胞の表面で発現される受容体に選択的に結合する。
[0086] 一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、（ｉ）変異ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド、及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された導入カセットを含み、カプシドタンパク質サブユニットは、天然ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニット配列のアミノ酸４５１～４５８における配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（配列番号１５８）を有するペプチドを含み、ペプチドは、天然ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニット配列中に生じない。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｉでなく、Ｘ２は、Ｎでなく、Ｘ３は、Ｇでなく、Ｘ４は、Ｓでなく、Ｘ５は、Ｇでなく、Ｘ６は、Ｑでなく、Ｘ７は、Ｎでなく、及び／又はＸ８は、Ｑでない。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｓ、Ｆ、Ｑ、Ｇ、Ｋ又はＲである。一部の実施形態において、Ｘ２は、Ｃ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｔ又はＱである。一部の実施形態において、Ｘ３は、Ｑ、Ｖ、Ｇ、Ｙ、Ｒ、Ｆ又はＤである。一部の実施形態において、Ｘ４は、Ｐ、Ｑ、Ａ又はＲである。一部の実施形態において、Ｘ５は、Ｔ、Ｎ、Ａ、Ｐ又はＩである。一部の実施形態において、Ｘ６は、Ｖ、Ｑ、Ａ又はＩである。一部の実施形態において、Ｘ７は、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｑ又はＮである。一部の実施形態において、Ｘ８は、Ｎ、Ｌ、Ｆ、Ｅ、Ｈ又はＡである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｓであり、Ｘ２は、Ｃであり、Ｘ３は、Ｑであり、Ｘ４は、Ｐであり、Ｘ５は、Ｔであり、Ｘ６は、Ｖであり、Ｘ７は、Ｍであり、Ｘ８は、Ｎである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｆであり、Ｘ２は、Ｇであり、Ｘ３は、Ｖであり、Ｘ４は、Ｐであり、Ｘ５は、Ｎであり、Ｘ６は、Ｑであり、Ｘ７は、Ｐであり、Ｘ８は、Ｌである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｑであり、Ｘ２は、Ｒであり、Ｘ３は、Ｇであり、Ｘ４は、Ｑであり、Ｘ５は、Ａであり、Ｘ６は、Ａであり、Ｘ７は、Ｐであり、Ｘ８は、Ｆである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｇであり、Ｘ２は、Ｄであり、Ｘ３は、Ｙであり、Ｘ４は、Ａであり、Ｘ５は、Ｐであり、Ｘ６は、Ｉであり、Ｘ７は、Ｒであり、Ｘ８は、Ｅである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｋであり、Ｘ２は、Ｔであり、Ｘ３は、Ｒであり、Ｘ４は、Ｒであり、Ｘ５は、Ｉであり、Ｘ６は、Ｖであり、Ｘ７は、Ｑであり、Ｘ８は、Ｈである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｆであり、Ｘ２は、Ｇであり、Ｘ３は、Ｆであり、Ｘ４は、Ｐであり、Ｘ５は、Ｎであり、Ｘ６は、Ｑであり、Ｘ７は、Ｐであり、Ｘ８は、Ｌである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｒであり、Ｘ２は、Ｑであり、Ｘ３は、Ｄであり、Ｘ４は、Ｑであり、Ｘ５は、Ｐであり、Ｘ６は、Ｉであり、Ｘ７は、Ｎであり、Ｘ８は、Ａである。
[0087] 一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、（ｉ）変異ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド、及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された導入カセットを含み、カプシドタンパク質サブユニットは、天然ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニット配列のアミノ酸５８７～５９４における配列Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８（配列番号１５８）を有するペプチドを含み、ペプチドは、天然ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニット配列中に生じない。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ａでなく、Ｘ２は、Ｑでなく、Ｘ３は、Ａでなく、Ｘ４は、Ｑでなく、Ｘ５は、Ａでなく、Ｘ６は、Ｑでなく、Ｘ７は、Ｔでなく、及び／又はＸ８は、Ｇでない。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｓである。一部の実施形態において、Ｘ２は、Ｋ又はＴである。一部の実施形態において、Ｘ３は、Ｖである。一部の実施形態において、Ｘ４は、Ｅ又はＤである。一部の実施形態において、Ｘ５は、Ｓである。一部の実施形態において、Ｘ６は、Ｗ又はＩである。一部の実施形態において、Ｘ７は、Ｔ又はＡである。一部の実施形態において、Ｘ８は、Ｅ又はＩである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｓであり、Ｘ２は、Ｋであり、Ｘ３は、Ｖであり、Ｘ４は、Ｅであり、Ｘ５は、Ｓであり、Ｘ６は、Ｗであり、Ｘ７は、Ｔであり、Ｘ８は、Ｅである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｓであり、Ｘ２は、Ｔであり、Ｘ３は、Ｖであり、Ｘ４は、Ｄであり、Ｘ５は、Ｓであり、Ｘ６は、Ｉであり、Ｘ７は、Ａであり、Ｘ８は、Ｉである。
[0088] 一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、（ｉ）組換えカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド、及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された導入カセットを含み、カプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１６５～１８７のいずれか１つと少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１６５～１８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１７５のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１８０のアミノ酸配列を含む。
[0089] 一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、導入カセットを中枢神経系の細胞又は組織に選択的に送達する。一部の実施形態において、中枢神経系の組織は、運動前野、視床、小脳皮質、歯状核、脊髄又は後根神経節である。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、導入カセットを脳に送達するが、ＡＡＶベクターを心臓に送達しない。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、導入カセットを脳及び心臓に送達する。一部の実施形態において、導入カセットの送達は、心臓よりも脳が多い。一部の実施形態において、導入カセットの送達は、脳中及び心臓中でほぼ等しい。
ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット及びそれを含むタンパク質カプシド
[0090] 一部の実施形態において、本開示は、天然ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットと比較して１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換及び／又は欠失）を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質サブユニットであって、１つ以上の修飾は、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット上の１つ以上の抗原性部位を修飾する、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを提供する。１つ以上の抗原性部位の修飾は、１つ以上の抗原性部位の抗体による認識の低減及び／又はＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを含むウイルス粒子の感染力の中和の阻害をもたらす。１つ以上のアミノ酸修飾（例えば、置換及び／又は欠失）は、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを含有するＡＡＶ－抗体複合体のペプチドエピトープマッピング及び／又は低温電子顕微鏡法試験により同定される１つ以上の抗原性フットプリント中に存在し得る。一部の実施形態において、１つ以上の抗原性部位は、参照により全体として本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０５８８９２号に記載の共通の抗原性モチーフ又はＣＡＭである。一部の実施形態において、抗原性部位は、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットの可変領域（ＶＲ）、例えばＶＲ－Ｉ、ＶＲ－ＩＩ、ＶＲ－ＩＩＩ、ＶＲ－ＩＶ、ＶＲ－Ｖ、ＶＲ－ＶＩ、ＶＲ－ＶＩＩ、ＶＲ－ＶＩＩＩ、ＶＲ－ＩＸ中に存在する。一部の実施形態において、１つ以上の抗原性部位は、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットのＨＩループ中に存在する。
[0091] 一部の実施形態において、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ３２．２２、ウシＡＡＶ又はトリＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、以下の表６に同定される領域の１つ以上におけるアミノ酸修飾（例えば、置換又は欠失）を含む。
Figure 2022551739000009
Figure 2022551739000010
Figure 2022551739000011
Figure 2022551739000012
[0092] 一部の実施形態において、アミノ酸置換は、以下の血清型のいずれか１つからのＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット中の任意の８つのアミノ酸を置き換える：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ３２．２２、ウシＡＡＶ又はトリＡＡＶ。例えば、アミノ酸置換は、上記ＡＡＶ血清型のいずれかにおける以下のアミノ酸（ＶＰ１番号付け）を置き換え得る：３５５～３６２、３６３～３７０、３７１～３７８、３７９～３８６、３８７～３９４、３９５～４０２、４０３～４１０、４１１～４１８、４１９～４２６、４２７～４３４、４３５～４４２、４４３～４５０、４５１～４５８、４５９～４６６、４６７～４７４、４７５～４８２、４８３～４９０、４９１～４９８、４９９～５０６、５０７～５１４、５１５～５２２、５２３～５３０、５３１～５３８、５３９～５４６、５４７～５５４、５５５～５６２、５６３～５７０、５７１～５７８、５７９～５８６、５８７～５９４、５９５～６０２、６０３～６１０、６１１～６１８、６１９～６２６、６２７～６３４、６３５～６４２、６４３～６５０、６５１～６５８、６５９～６６６、６６７～６７４、６７５～６８２、６８３～６９０、６９１～６９８、６９９～７０６、７０７～７１４、７１５～７２２。
[0093] 一部の実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１９～２０のいずれか１つから選択される。一部の実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１２～１８のいずれか１つとの少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、置換は、野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸５８７～５９４に対応するアミノ酸におけるものである。一部の実施形態において、置換は、野生型ＡＡＶ１カプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸５８７～５９４に対応するアミノ酸におけるものである。一部の実施形態において、置換は、野生型ＡＡＶ６カプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸５８７～５９４に対応するアミノ酸におけるものである。一部の実施形態において、置換は、野生型ＡＡＶ８カプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸５８９～５９６に対応するアミノ酸におけるものである。一部の実施形態において、置換は、野生型ＡＡＶｒｈ８カプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸５８７～５９４に対応するアミノ酸におけるものである。一部の実施形態において、置換は、野生型ＡＡＶｒｈ１０カプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸５８９～５９６に対応するアミノ酸におけるものである。
[0094] 一部の実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１８～２０のいずれか１つから選択される。一部の実施形態において、アミノ酸置換は、配列番号１８～２０のいずれか１つとの少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、置換は、野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸４５１～４５８に対応するアミノ酸におけるものである。
[0095] 一部の実施形態において、アミノ酸欠失は、野生型カプシドタンパク質サブユニットと比較して少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ又は少なくとも１０個のアミノ酸の欠失を含む。
[0096] 一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、１つ以上のアミノ酸置換及び１つ以上のアミノ酸欠失を含む。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、少なくとも１つのアミノ酸置換及び少なくとも１つのアミノ酸欠失を含む。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、少なくとも１つのアミノ酸置換及び少なくとも１つのアミノ酸欠失を含み、少なくとも１つのアミノ酸置換及び少なくとも１つのアミノ酸欠失は、カプシドタンパク質サブユニットアミノ酸配列中で互いに直接隣接する。
[0097] 一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、ＡＡＶウイルス粒子又はＡＡＶウイルスベクター中に存在する場合にＣＮＳ（例えば、脳、脊髄）を選択的に標的化する表現型を有するＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを産生するように修飾される。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、ＡＡＶウイルス粒子又はＡＡＶウイルスベクター中に存在する場合に中和抗体を回避する表現型を有するＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを産生するように修飾される。ＡＡＶウイルス様粒子又はＡＡＶベクターは、中和抗体を回避し、及び／又はＣＮＳを標的化する表現型に加えて向上又は維持された形質導入効率の表現型も有し得る。
[0098] 一部の実施形態において、１つ以上の置換は、第１のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質サブユニットからの１つ以上の配列を、第１のＡＡＶ血清型と異なる第２のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質サブユニット中に導入し得る。
[0099] 修飾が付加されるベースＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、ウシＡＡＶ、トリＡＡＶ又は現在公知の若しくは後に同定される任意の他のＡＡＶから選択されるＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質サブユニットであり得る。一部の実施形態において、ベースＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、ＡＡＶ９血清型のものである。一部の実施形態において、ベースＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、キメラである。一部の実施形態において、ベースＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、ＡＡＶ８／９キメラである。
[0100] 修飾ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットのいくつかの例が本明細書で提供される。以下の実施例において、カプシドタンパク質サブユニットは、記載される特定の置換を含み得、一部の実施形態において、記載されるものよりも少ない又は多い置換を含み得る。本明細書において使用されるとき、「置換」は、単一のアミノ酸置換又は２つ以上の連続アミノ酸の置換を指し得る。例えば、一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個などの単一のアミノ酸置換を含み得る。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、複数の連続アミノ酸の１つ以上の置換、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２個の連続アミノ酸の１つ以上の置換を含み得る。
[0101] さらに、アミノ酸残基が、野生型又は天然アミノ酸配列中に存在するアミノ酸残基以外の任意のアミノ酸残基により置換される本明細書に記載の一部の実施形態において、任意の他のアミノ酸残基は、当技術分野において公知の任意の天然又は非天然アミノ酸残基であり得る（例えば、表２及び４を参照されたい）。一部の実施形態において、置換は、保存的置換であり得、一部の実施形態において、置換は、非保存的置換であり得る。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、１つ以上のアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、表７．１に示される配列番号１２～１８からそれぞれ個別に選択される。
Figure 2022551739000013
[0102] 一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、１つ以上のアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、表７．２に示される配列番号１９～２０からそれぞれ選択される。
Figure 2022551739000014
[0103] 一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、表７．１に列記される配列から選択される第１の置換及び表７．２に列記される配列から選択される第２の置換を含み得る。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、表７．３及び７．４に示される第１の置換、第２の置換を含み得る。
Figure 2022551739000015
Figure 2022551739000016
[0104] 一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、アミノ酸修飾（例えば、置換及び／又は欠失）を含み、アミノ酸修飾は、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット上の１つ以上の表面露出領域、例えば抗原性領域を修飾する。
[0105] 一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、１つ以上のアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換の少なくとも１つは、配列番号１９～２０の１つを含む。一部の実施形態において、置換は、野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸５８７～５９４に対応するアミノ酸を置き換える。
[0106] 一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、１つ以上のアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換の少なくとも１つは、配列番号１２～１８の１つを含む。一部の実施形態において、置換は、野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸４５１～４５８に対応するアミノ酸を置き換える。
[0107] 一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、天然カプシドタンパク質サブユニット配列中に生じない８つのアミノ酸の配列（Ｘ１－Ｘ２－Ｘ３－Ｘ４－Ｘ５－Ｘ６－Ｘ７－Ｘ８）（配列番号１５８）を含む置換を含む。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｉでなく、Ｘ２は、Ｎでなく、Ｘ３は、Ｇでなく、Ｘ４は、Ｓでなく、Ｘ５は、Ｇでなく、Ｘ６は、Ｑでなく、Ｘ７は、Ｎでなく、及び／又はＸ８は、Ｑでない。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｓ、Ｆ、Ｑ、Ｇ、Ｋ又はＲである。一部の実施形態において、Ｘ２は、Ｃ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｔ又はＱである。一部の実施形態において、Ｘ３は、Ｑ、Ｖ、Ｇ、Ｙ、Ｒ、Ｆ又はＤである。一部の実施形態において、Ｘ４は、Ｐ、Ｑ、Ａ又はＲである。一部の実施形態において、Ｘ５は、Ｔ、Ｎ、Ａ、Ｐ又はＩである。一部の実施形態において、Ｘ６は、Ｖ、Ｑ、Ａ又はＩである。一部の実施形態において、Ｘ７は、Ｍ、Ｐ、Ｒ、Ｑ又はＮである。一部の実施形態において、Ｘ８は、Ｎ、Ｌ、Ｆ、Ｅ、Ｈ又はＡである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｓであり、Ｘ２は、Ｃであり、Ｘ３は、Ｑであり、Ｘ４は、Ｐであり、Ｘ５は、Ｔであり、Ｘ６は、Ｖであり、Ｘ７は、Ｍであり、Ｘ８は、Ｎである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｆであり、Ｘ２は、Ｇであり、Ｘ３は、Ｖであり、Ｘ４は、Ｐであり、Ｘ５は、Ｎであり、Ｘ６は、Ｑであり、Ｘ７は、Ｐであり、Ｘ８は、Ｌである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｑであり、Ｘ２は、Ｒであり、Ｘ３は、Ｇであり、Ｘ４は、Ｑであり、Ｘ５は、Ａであり、Ｘ６は、Ａであり、Ｘ７は、Ｐであり、Ｘ８は、Ｆである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｇであり、Ｘ２は、Ｄであり、Ｘ３は、Ｙであり、Ｘ４は、Ａであり、Ｘ５は、Ｐであり、Ｘ６は、Ｉであり、Ｘ７は、Ｒであり、Ｘ８は、Ｅである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｋであり、Ｘ２は、Ｔであり、Ｘ３は、Ｒであり、Ｘ４は、Ｒであり、Ｘ５は、Ｉであり、Ｘ６は、Ｖであり、Ｘ７は、Ｑであり、Ｘ８は、Ｈである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｆであり、Ｘ２は、Ｇであり、Ｘ３は、Ｆであり、Ｘ４は、Ｐであり、Ｘ５は、Ｎであり、Ｘ６は、Ｑであり、Ｘ７は、Ｐであり、Ｘ８は、Ｌである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｒであり、Ｘ２は、Ｑであり、Ｘ３は、Ｄであり、Ｘ４は、Ｑであり、Ｘ５は、Ｐであり、Ｘ６は、Ｉであり、Ｘ７は、Ｎであり、Ｘ８は、Ａである。
[0108] 一部の実施形態において、Ｘ１は、Ａでなく、Ｘ２は、Ｑでなく、Ｘ３は、Ａでなく、Ｘ４は、Ｑでなく、Ｘ５は、Ａでなく、Ｘ６は、Ｑでなく、Ｘ７は、Ｔでなく、及び／又はＸ８は、Ｇでない。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｓである。一部の実施形態において、Ｘ２は、Ｋ又はＴである。一部の実施形態において、Ｘ３は、Ｖである。一部の実施形態において、Ｘ４は、Ｅ又はＤである。一部の実施形態において、Ｘ５は、Ｓである。一部の実施形態において、Ｘ６は、Ｗ又はＩである。一部の実施形態において、Ｘ７は、Ｔ又はＡである。一部の実施形態において、Ｘ８は、Ｅ又はＩである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｓであり、Ｘ２は、Ｋであり、Ｘ３は、Ｖであり、Ｘ４は、Ｅであり、Ｘ５は、Ｓであり、Ｘ６は、Ｗであり、Ｘ７は、Ｔであり、Ｘ８は、Ｅである。一部の実施形態において、Ｘ１は、Ｓであり、Ｘ２は、Ｔであり、Ｘ３は、Ｖであり、Ｘ４は、Ｄであり、Ｘ５は、Ｓであり、Ｘ６は、Ｉであり、Ｘ７は、Ａであり、Ｘ８は、Ｉである。
[0109] 一部の実施形態において、ＡＡＶサブユニットタンパク質は、１つ以上のアミノ酸欠失を含み、アミノ酸欠失は、野生型ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットと比較して少なくとも６つ又は少なくとも８つのアミノ酸の欠失を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、天然カプシドタンパク質サブユニット配列と比較して８つの連続アミノ酸の欠失を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、天然カプシドタンパク質サブユニット配列と比較して６つの連続アミノ酸の欠失を含む。
[0110] 一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、配列ＬＳＫＴＱＴＬＫ（配列番号１３７４）又は配列ＬＳＫＴＤＰＱＴＬＫ（配列番号１３７５）を含む。一部の実施形態において、配列番号１３７４又は１３７５を含むＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ及びウシＡＡＶから選択される血清型のものである。
[0111] 一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１２～１８から選択される配列を含む第１の置換；及び配列番号１９～２０から選択される配列を含む第２の置換を含む。
[0112] 一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、アミノ酸欠失及び置換を含み、置換は、配列番号１２～２０から選択される配列を含む。
[0113] 一部の実施形態において、組換えカプシドタンパク質サブユニットは、配列番号９（ＡＡＶ９）と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％同一の配列を有し、以下のアミノ酸置換の１つ以上を含む：Ｉ４５１Ｓ、Ｉ４５１Ｆ、Ｉ４５１Ｑ、Ｉ４５１Ｇ、Ｉ４５１Ｋ、Ｉ４５１Ｒ、Ｎ４５２Ｃ、Ｎ４５２Ｇ、Ｎ４５２Ｒ、Ｎ４５２Ｄ、Ｎ４５２Ｔ、Ｎ４５２Ｑ、Ｇ４５３Ｑ、Ｇ４５３Ｖ、Ｇ４５３Ｙ、Ｇ４５３Ｒ、Ｇ４５３Ｆ、Ｇ４５３Ｄ、Ｓ４５４Ｐ、Ｓ４５４Ｑ、Ｓ４５４Ａ、Ｓ４５４Ｒ、Ｇ４５５Ｔ、Ｇ４５５Ｎ、Ｇ４５５Ａ、Ｇ４５５Ｐ、Ｇ４５５Ｉ、Ｑ４５６Ｖ、Ｑ４５６Ａ、Ｑ４５６Ｉ、Ｎ４５７Ｍ、Ｎ４５７Ｐ、Ｎ４５７Ｒ、Ｎ４５７Ｑ、Ｑ４５８Ｎ、Ｑ４５８Ｌ、Ｑ４５８Ｆ、Ｑ４５８Ｅ、Ｑ４５８Ｈ、Ｑ４５８Ａ、Ａ５８７Ｓ、Ｑ５８８Ｋ、Ｑ５８８Ｔ、Ａ５８９Ｖ、Ｑ５９０Ｅ、Ｑ５９０Ｄ、Ａ５９１Ｓ、Ｑ５９２Ｗ、Ｑ５９２Ｉ、Ｔ５９３Ａ、Ｇ５９４Ｅ、Ｇ５９４Ｉ。
[0114] 本明細書に記載のＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットのいずれも、ＨＩループ中の修飾（例えば、置換又は欠失）をさらに含み得る。ＨＩループは、それぞれのウイルスタンパク質（ＶＰ）サブユニットから延び、隣接する５回軸ＶＰの一部を覆う、βストランドβＨ及びβＩ間のＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット表面上の突出ドメインである。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、ＨＩループ中の１、２、３、４、５、６、７又は８つのアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、ＨＩループ中の以下の置換の１つ以上：Ｐ６６１Ｒ、Ｔ６６２Ｓ、Ｑ６６６Ｇ、Ｓ６６７Ｄを含み、番号付けは、野生型ＡＡＶ８カプシドタンパク質サブユニット（配列番号８）に対応する。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、ＨＩループ中の以下の置換の１つ以上：Ｐ６５９Ｒ、Ｔ６６０Ｓ、Ａ６６１Ｔ、Ｋ６６４Ｇを含み、番号付けは、野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニット（配列番号９）に対応する。
[0115] 一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、１、２、３又は４つのアミノ酸置換を含み、それぞれの置換は、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット上の異なる抗原性部位を修飾し、アミノ酸置換の少なくとも１つは、カプシドタンパク質サブユニットのＨＩループを修飾する。
[0116] 一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、第１、第２、第３及び第４のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、置換の少なくとも１つは、カプシドタンパク質サブユニットのＨＩループを修飾する。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、ＨＩループ中の以下の置換の１つ以上：Ｐ６６１Ｒ、Ｔ６６２Ｓ、Ｑ６６６Ｇ、Ｓ６６７Ｄを含み、番号付けは、野生型ＡＡＶ８カプシドタンパク質サブユニット（配列番号８）に対応するか；又はＰ６５９Ｒ、Ｔ６６０Ｓ、Ａ６６１Ｔ、Ｋ６６４Ｇを含み、番号付けは、野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニット（配列番号９）に対応する。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１８５～１８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１６５～１８７のいずれか１つとの少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。
[0117] 本明細書に記載のＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットの１つ以上をコードする核酸又はそれを含むプラスミドも本明細書で提供される。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列又はＲＮＡ配列であり得る。一部の実施形態において、細胞は、１つ以上の本明細書に記載の核酸又はプラスミドを含む。
[0118] 一部の実施形態において、ＡＡＶタンパク質カプシドは、本明細書に記載のＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを含む。ＡＡＶタンパク質カプシドを含むウイルスベクター並びにＡＡＶタンパク質カプシド、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット及び／又はウイルスベクターを薬学的に許容可能な担体中で含む組成物が本明細書でさらに提供される。
[0119] 一部の実施形態において、１つ以上の抗原性部位の修飾は、１つ以上の抗原性部位への抗体による結合の低減をもたらす。一部の実施形態において、１つ以上の抗原性部位の修飾は、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを含むウイルス粒子の感染力の中和の阻害をもたらす。
[0120] 本明細書に記載のとおり、多数のＡＡＶからのカプシドタンパク質サブユニットの核酸及びアミノ酸配列が当技術分野において公知である。したがって、天然ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸位置に「対応する」アミノ酸は、任意の他のＡＡＶについて（例えば、配列アラインメントを使用することにより）容易に決定することができる。
[0121] 修飾カプシドタンパク質サブユニットは、現在公知の又は後に発見される任意のＡＡＶのカプシドタンパク質サブユニットを修飾することにより産生することができる。さらに、修飾されるベースＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、天然に生じるＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ又は３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０又はＡＡＶ１１カプシドタンパク質サブユニット又は表２に示されるＡＡＶのいずれか）であり得るが、それに限定されるものではない。当業者は、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットに対する種々の操作が当技術分野において公知であり、本開示が、天然に生じるＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットの修飾に限定されないことを理解する。例えば、修飾されるカプシドタンパク質は、天然に生じるＡＡＶ（例えば、天然に生じるＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット、例えばＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２又は現在公知の若しくは後に発見される任意の他のＡＡＶに由来する）と比較して改変を既に有し得る。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、キメラカプシドタンパク質サブユニットであり得る。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、エンジニアリングされたＡＡＶ、例えばＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶ Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＰＨＰ．Ｂであり得る。
[0122] したがって、一部の実施形態において、修飾されるＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、天然に生じるＡＡＶに由来し得るが、カプシドタンパク質サブユニット中に挿入及び／又は置換され、及び／又は１つ以上のアミノ酸の欠失により既に改変された１つ以上の外来配列（例えば、天然ウイルスに対して外因性である）をさらに含む。
[0123] したがって、本明細書において特定のＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０若しくはＡＡＶ１１カプシドタンパク質サブユニット又は表２に示されるＡＡＶのいずれかからのカプシドタンパク質サブユニットなど）に言及する場合、天然カプシドタンパク質サブユニット及び本明細書に記載の修飾以外の改変を有するカプシドタンパク質サブユニットを包含することが意図される。このような改変としては、置換、挿入及び／又は欠失が挙げられる。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、天然ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット配列と比較してその中に挿入された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満又は７０個未満のアミノ酸（本明細書に記載の挿入以外）を含む。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、天然ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満又は７０個未満のアミノ酸置換（本明細書に記載のアミノ酸置換以外）を含み、一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、天然ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット配列と比較して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０個、２０個未満、３０個未満、４０個未満、５０個未満、６０個未満又は７０個未満のアミノ酸の欠失を含む。
[0124] 一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、天然ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット配列と少なくとも約９０％、約９５％、約９７％、約９８％又は約９９％類似又は同一のアミノ酸配列を有する。
[0125] ２つ以上のアミノ酸配列間の配列類似性又は同一性を決定する方法は、当技術分野において公知である。配列類似性又は同一性は、核酸の全長又は核酸の示される一部について決定することができる。配列類似性又は同一性は、公知の標準的技術、例として、限定されるものではないが、Smith&Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)の局所配列同一性アルゴリズムを使用して、Needleman&Wunsch, J Mol. Biol. 48, 443 (1970)の配列同一性アラインメントアルゴリズムにより、Pearson&Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)の類似性検索方法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（Wisconsin Genetics Software PackageにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ、Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI）により、Devereux et al., Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984)により記載されたBest Fit配列プログラム又は目視により決定することができる。
[0126] 別の好適なアルゴリズムは、Altschul et al., J Mol. Biol. 215, 403-410, (1990)及びKarlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993)に記載のＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Altschul et al., Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996)；http://blast.wustl/edu/blast/README.htmlから得られたＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムである。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメータを使用し、それらは、任意選択で、デフォルト値に設定される。パラメータは、動的な値であり、特定の配列の組成及び目的配列が検索されている特定のデータベースの組成に応じてプログラム自体により構築されるが、それらの値を調整して感度を増加させることができる。
[0127] さらに、追加の有用なアルゴリズムは、Altschul et al, (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402に報告されているようなギャップＢＬＡＳＴである。
[0128] 本開示の目的のため、特に示されない限り、同一性パーセントは、blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiにおいてオンラインで利用可能なBasic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）を使用して計算される。当業者は、他のアルゴリズムに適宜置き換え得ることを理解する。
[0129] 一部の実施形態において、タンパク質カプシドは、本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを含む。一部の実施形態において、タンパク質カプシドは、パルボウイルスカプシドであり、それは、さらに、自律性パルボウイルスカプシド又はディペンドウイルスカプシドであり得る。任意選択で、タンパク質カプシドは、ＡＡＶタンパク質カプシドである。一部の実施形態において、ＡＡＶタンパク質カプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶタンパク質カプシド、トリＡＡＶタンパク質カプシド又は現在公知若しくは後に発見される任意の他のＡＡＶである。ＡＡＶ血清型の非限定的なリストは、表２に示される。ＡＡＶタンパク質カプシドは、表２に列記されるか、又は１つ以上の挿入、置換及び／又は欠失により上記のいずれかに由来する任意のＡＡＶ血清型であり得る。修飾ウイルスタンパク質カプシドによりパッケージングし、細胞中に移行させることができる分子としては、導入カセット（例えば、異種ＤＮＡ又はＲＮＡ）、ポリペプチド、有機小分子、金属又はそれらの組み合わせが挙げられる。
[0130] 異種分子は、ＡＡＶ感染において天然に見出されないもの、例えば野生型ＡＡＶゲノムによりコードされないものと定義される。さらに、治療有用分子は、宿主標的細胞中への分子の移行のためにキメラタンパク質カプシドの外側に会合させることができる。このような会合分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、有機小分子、金属、炭水化物、脂質及び／又はポリペプチドを挙げることができる。一部の実施形態において、治療有用分子は、タンパク質カプシド又はそのカプシドタンパク質に共有結合している（すなわちコンジュゲート又は化学結合している）。分子を共有結合させる方法は、当業者に公知である。
[0131] 修飾タンパク質カプシドは、新規タンパク質カプシド構造に対する抗体の発生においても使用される。さらなる代替形態として、細胞への抗原提示のために、例えば外因性アミノ酸配列に対する免疫応答を産生するための対象への投与のために外因性アミノ酸配列を修飾タンパク質カプシド又はそのカプシドタンパク質サブユニット中に挿入することができる。
[0132] 一部の実施形態において、目的ポリペプチド又は機能性ＲＮＡをコードする核酸を送達するウイルスベクターの投与前及び／又はその投与と同時に（例えば、互いに数分又は数時間以内に）、タンパク質カプシドを投与してある細胞部位を遮断することができる。例えば、本発明のタンパク質カプシドを送達して肝細胞上の細胞受容体を遮断することができ、その後又はそれと同時に送達ベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を投与することができ、それは、肝細胞の形質導入を低減させ、他の標的（例えば、骨格筋、心筋及び／又は横隔膜筋）の形質導入を向上させ得る。
[0133] 一部の実施形態によれば、修飾タンパク質カプシドは、本明細書に記載の修飾ウイルスベクターの前及び／又はそれと同時に対象に投与することができる。さらに、本開示は、本発明の修飾タンパク質カプシド又はそのカプシドタンパク質サブユニットを含む組成物及び医薬配合物を提供し；任意選択で、組成物は、本明細書に記載の修飾ウイルスベクターも含む。
[0134] 一部の実施形態において、核酸（任意選択で、単離核酸）は、本明細書に記載の修飾タンパク質カプシドサブユニットをコードする。本明細書に記載の核酸並びに核酸及び／又はウイルスベクターを含む細胞（インビボ又は培養物中）がさらに提供される。一例として、ウイルスベクターは、（ａ）本明細書に記載の修飾ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド；及び（ｂ）少なくとも１つの末端リピート配列を含む核酸を含み得、核酸は、ＡＡＶタンパク質カプシドによってカプシド化されている。
[0135] 好適なウイルスベクターとしては、例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、ワクシニア、ポックスウイルス、バキュロウイルス、レンチウイルス、コロナウイルスなどが挙げられる。好適な核酸としては、限定されるものではないが、プラスミド、ファージ、ＹＡＣ、ＢＡＣなどが挙げられる。このような核酸及び細胞は、例えば、本明細書に記載の修飾ウイルスタンパク質カプシド、タンパク質カプシドサブユニット又はウイルスベクターの産生のための試薬（例えば、ヘルパーパッケージング構築物又はパッケージング細胞）として使用することができる。
[0136] 本明細書に記載のタンパク質カプシド及びカプシドタンパク質サブユニットは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して、例えばバキュロウイルス系を使用することにより産生することができる（Brown et al., (1994) Virology 198: 477-488）。
[0137] 本明細書に記載のＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットに対する修飾は、「選択的」修飾である。このアプローチは、ＡＡＶ血清型間での全サブユニット又はラージドメインスワップを用いる従来の研究とは対照的である（例えば、国際公開第００／２８００４号及びHauck et al., (2003) J. Virology 77: 2768-2774を参照されたい）。一部の実施形態において、「選択的」修飾は、約２０、１８、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４又は３つ以下の連続アミノ酸の挿入及び／又は置換及び／又は欠失をもたらす。
[0138] 本明細書に記載の修飾カプシドタンパク質サブユニット及びタンパク質カプシドは、現在公知の又は後に同定される任意の他の修飾をさらに含み得る。例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット及びタンパク質カプシドは、それらが別のウイルス、任意選択で例えば国際公開第００／２８００４号に記載の別のパルボウイルス又はＡＡＶからのカプシドタンパク質サブユニットの全部又は一部を含み得る点でキメラであり得る。
[0139] 一部の実施形態において、タンパク質カプシド又はカプシドタンパク質サブユニットは、タンパク質カプシド又はカプシドタンパク質サブユニットに、所望の標的組織上に存在する細胞表面分子と相互作用させる標的化配列（例えば、タンパク質カプシド又はカプシドタンパク質サブユニット中で置換又は挿入された）を含む、標的化されるタンパク質カプシド又はカプシドタンパク質サブユニットであり得る（例えば、国際公開第００／２８００４号及びHauck et al., (2003) J. Virology 77: 2768-2774)；Shi et al., Human Gene Therapy 17: 353-361 (2006)［ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットの５２０及び／又は５８４位におけるインテグリン受容体結合モチーフＲＧＤの挿入を記載］；並びに米国特許第７，３１４，９１２号［ＡＡＶ２カプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸４４７、５３４、５７３及び５８７位後にＲＧＤモチーフを含有するＰＩペプチドの挿入を記載］を参照されたい）。挿入を許容するＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット内の他の位置は、当技術分野において公知である（例えば、Grifman et al., Molecular Therapy 3: 964-975 (2001)により記載される４４９及び５８８位）。
[0140] 例えば、本明細書に記載のタンパク質カプシド又はカプシドタンパク質サブユニットは、ある目的標的組織（例えば、肝臓、骨格筋、心臓、横隔膜筋、腎臓、脳、胃、腸、皮膚、内皮細胞及び／又は肺）への比較的非効率的なトロピズムを有し得る。有利には、標的化配列をそれらの低形質導入ベクター中に取り込んで、それによりタンパク質カプシド（又はそのカプシドタンパク質サブユニット）に所望のトロピズム及び任意選択で特定の組織についての選択的トロピズムを付与することができる。標的化配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド及びＡＡＶベクターは、例えば、国際公開第００／２８００４号に記載される。別の例として、低形質導入ベクターを所望の標的組織に再指向する手段として、Wang et al., Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35: 225-49 (2006)に記載される１つ以上の天然に生じないアミノ酸を本明細書に記載のＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット中にオルトゴナルな部位において取り込むことができる。有利には、これらの非天然アミノ酸を使用して目的分子をＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットに化学結合させることができ、その分子としては、限定されるものではないが、グリカン（マンノース－樹状細胞標的化）；特定の癌細胞タイプへの標的化送達のためのＲＧＤ、ボンベシン又は神経ペプチド；特定の細胞表面受容体、例えば成長因子受容体、インテグリンに標的化されるファージディスプレイから選択されるＲＮＡアプタマー又はペプチドなどが挙げられる。
[0141] 一部の実施形態において、標的化配列は、特定の細胞タイプへの感染を指向するカプシドタンパク質サブユニット配列（例えば、自律性パルボウイルスカプシド配列、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット配列又は任意の他のウイルスカプシド配列）であり得る。
[0142] 別の非限定的な例として、ヘパリン又はヘパラン硫酸結合ドメイン（例えば、呼吸器合胞体ウイルスヘパリン結合ドメイン）を、典型的にはＨＳ受容体に結合しないカプシドタンパク質サブユニット（例えば、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５）中に挿入又は置換して得られる変異体へのヘパリン及び／又はヘパラン硫酸結合を付与することができる。
[0143] Ｂ１９は、グロボシドをその受容体として使用して初代赤血球前駆細胞に感染する（Brown et al, (1993) Science 262: 114）。Ｂ１９の構造は、８Å分解能で求められている（Agbandje-McKenna et al, (1994) Virology 203: 106）。グロボシドに結合するＢ１９カプシドの領域は、アミノ酸３９９～４０６（Chapman et al, (1993) Virology 194: 419）、β－バレル構造Ｅ及びＦ間のループアウト領域（Chipman et al, (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93: 7502）にマッピングされている。したがって、Ｂ１９カプシドのグロボシド受容体結合ドメインをＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット中に置換してタンパク質カプシド又はそれを含むウイルスベクターを赤血球系細胞に標的化することができる。
[0144] 一部の実施形態において、外因性標的化配列は、修飾ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド又はウイルスベクターのトロピズムを改変するペプチドをコードする任意のアミノ酸配列であり得る。一部の実施形態において、標的化ペプチド又はタンパク質は、天然に生じるものであり得るか、又は代わりに完全若しくは部分的に合成によるものであり得る。例示的な標的化配列としては、細胞表面受容体及び糖タンパク質、例えばＲＯＤペプチド配列、ブラジキニン、ホルモン、ペプチド成長因子（例えば、上皮細胞成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子Ｉ及びＩＩなど）、サイトカイン、メラノサイト刺激ホルモン（例えば、ａ、β又はγ）、神経ペプチド及びエンドルフィンなど、並びに細胞をそれらのコグネイト受容体に標的化する能力を保持するそれらの断片に結合するリガンド及び他のペプチドが挙げられる。他の説明的なペプチド及びタンパク質としては、サブスタンスＰ、ケラチノサイト成長因子、神経ペプチドＹ、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン２、ニワトリ卵白リゾチーム、エリスロポエチン、ゴナドリブクリン、コルチコスタチン、β－エンドルフィン、ｌｅｕ－エンケファリン、リモルフィン、アルファ－ネオエンケファリン、アンギオテンシン、ニューマジン、血管作用性腸ペプチド、ニューロテンシン、モチリン及び上記のその断片が挙げられる。一層さらなる代替形態として、毒素（例えば、破傷風毒素又はヘビ毒素、例えばアルファ－ブンガロトキシンなど）からの結合ドメインをカプシドタンパク質サブユニット中に標的化配列として置換することができる。一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットは、Cleves (Current Biology 7: R318 (1997))により記載されるとおり「非古典的」インポート／エクスポートシグナルペプチド（例えば、線維芽細胞成長因子－１及び－２、インターロイキン１、ＨＩＶ－１ Ｔａｔタンパク質、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質など）をＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット中に置換することにより修飾することができる。特定の細胞による取り込みを指向するペプチドモチーフも包含され、例えば、ＦＶＦＬＰ（配列番号２２）ペプチドモチーフは、肝細胞による取り込みを誘発する。
[0145] ファージディスプレイ技術及び当技術分野において公知の他の技術を使用して任意の目的細胞タイプを認識するペプチドを同定することができる。
[0146] 標的化配列は、細胞表面結合部位、例として受容体（例えば、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質又はプロテオグリカン）に標的化する任意のペプチドをコードし得る。細胞表面結合部位の例としては、限定されるものではないが、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸及び他のグリコサミノグリカン、ムチン、糖タンパク質及びガングリオシド上に見出されるシアル酸部分、ＭＨＣ１糖タンパク質、膜糖タンパク質上に見出される炭水化物成分、例としてマンノース、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、ガラクトースなどが挙げられる。
[0147] 一部の実施形態において、ヘパラン硫酸（ＨＳ）又はヘパリン結合ドメインは、カプシドタンパク質サブユニット中に（例えば、他の点でＨＳにもヘパリンにも結合しないＡＡＶタンパク質カプシドサブユニット中で）置換されている。ＨＳ／ヘパリン結合がアルギニン及び／又はリジンに富む「塩基性パッチ」により媒介されることは、当技術分野において公知である。一部の実施形態において、モチーフＢＸＸＢ（配列番号２３）に従う配列を用いることができ、「Ｂ」は、塩基性残基であり、Ｘは、中性及び／又は疎水性残基である。非限定的な例として、ＢＸＸＢは、ＲＧＮＲ（配列番号２４）であり得る。別の非限定的な例として、ＢＸＸＢは、天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質サブユニット中のアミノ酸２６２から２６５位又は別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質サブユニット中の対応位置において置換されている。
[0148] 表８は、好適な標的化配列の他の非限定的な例を示す。
Figure 2022551739000017
Figure 2022551739000018
Figure 2022551739000019
Figure 2022551739000020
Figure 2022551739000021
Figure 2022551739000022
Figure 2022551739000023
[0149] 一部の実施形態において、標的化配列は、細胞中へのエントリーを標的化する別の分子への化学的カップリングに使用することができるペプチド（例えば、Ｒ基を介して化学的にカップリングさせることができるアルギニン及び／又はリジン残基を含み得る）であり得る。
[0150] 一部の実施形態において、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット又はタンパク質カプシドは、国際公開第２００６／０６６０６６号に記載の変異を含み得る。例えば、カプシドタンパク質サブユニットは、天然ＡＡＶ２カプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸２６３、７０５、７０８及び／又は７１６位における選択的アミノ酸置換又は別のＡＡＶ血清型からのカプシドタンパク質サブユニット中の対応する変化を含み得る。
[0151] 加えて又は代わりに、一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド又はウイルスベクターは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質サブユニットのアミノ酸２６４位の直後に選択的アミノ酸挿入を含むか、又は他のＡＡＶからのカプシドタンパク質サブユニット中の対応する変化を含む。「アミノ酸Ｘ位の直後に」は、その挿入が、示されるアミノ酸位置の直後にあることを意図する（例えば、「アミノ酸２６４位の後ろ」は、２６５位における点挿入又はさらに広範囲での挿入、例えば２６５～２６８位における挿入などを示す）。
[0152] さらに、一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド又はウイルスベクターは、アミノ酸修飾、例えばＰＣＴ公開国際公開第２０１０／０９３７８４号（例えば、２ｉ８）及び／又はＰＣＴ公開国際公開第２０１４／１４４２２９号（例えば、二重グリカン）に記載のアミノ酸修飾を含み得る。
[0153] 一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド又はウイルスベクターは、カプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド又はウイルスベクターが由来するＡＡＶ血清型の形質導入効率に対して均等な又は向上した形質導入効率を有し得る。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド又はウイルスベクターは、カプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド又はウイルスベクターが由来するＡＡＶ血清型の形質導入効率に対して低減した形質導入効率を有し得る。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド又はウイルスベクターは、カプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド又はウイルスベクターが由来するＡＡＶ血清型のトロピズムに対して均等な又は向上したトロピズムを有し得る。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド又はウイルスベクターは、カプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド又はウイルスベクターが由来するＡＡＶ血清型のトロピズムに対して改変された又は異なるトロピズムを有し得る。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド又はウイルスベクターは、脳組織についてのトロピズムを有し得るか、又はそれを有するようにエンジニアリングされ得る。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド又はウイルスベクターは、肝組織についてのトロピズムを有し得るか、又はそれを有するようにエンジニアリングされ得る。
[0154] 本明細書に記載のＡＡＶベクターを使用して異種核酸を細胞又は対象に送達することができる。例えば、修飾ベクターを使用してリソソーム蓄積症、例えばムコ多糖症（例えば、スライ症候群［β－グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハーラー・シャイエ症候群［アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリポ症候群（Ａ［ヘパランスルファミダーゼ］、Ｂ［Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチル－ＣｏＡ：アルファ－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ］、モルキオ症候群（Ａ［ガラクトース－６－硫酸スルファターゼ］、Ｂ［β－ガラクトシダーゼ］、マロトー・ラミー症候群［Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ］など）、ファブリー病（ａ－ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）又は糖原病（例えば、ポンペ病；リソソーム酸性アルファ－グルコシダーゼ）を本明細書に記載のとおり治療することができる。
[0155] 当業者は、一部のＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットについて、対応するアミノ酸位置がウイルス中に部分的若しくは完全に存在するか、又は代わりに完全に不存在であるかに応じて、対応する修飾が挿入及び／又は置換になることを認識する。
[0156] 一部の実施形態において、ウイルスベクターは、本明細書に記載の修飾カプシドタンパク質サブユニット及びタンパク質カプシドを含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、パルボウイルスベクター（例えば、パルボウイルスタンパク質カプシド及び／又はベクターゲノムを含む）、例えばＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶタンパク質カプシド及び／又はベクターゲノムを含む）である。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、本明細書に記載の修飾カプシドタンパク質サブユニットを含む修飾ＡＡＶタンパク質カプシド及びベクターゲノムを含む。
[0157] 例えば、一部の実施形態において、ウイルスベクターは、（ａ）本明細書に記載の修飾カプシドタンパク質サブユニットを含む修飾タンパク質カプシド（例えば、修飾ＡＡＶタンパク質カプシド）；及び（ｂ）末端リピート配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ）を含む核酸を含み、末端リピート配列を含む核酸は、修飾タンパク質カプシドによってカプシド化されている。核酸は、任意選択で、２つの末端リピート（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含み得る。
[0158] 一部の実施形態において、ウイルスベクターは、目的ポリペプチド又は機能性ＲＮＡをコードする異種核酸を含む組換えウイルスベクターである。組換えウイルスベクターは、以下でより詳細に説明される。
[0159] 一部の実施形態において、ウイルスベクターは、（ｉ）修飾カプシドタンパク質サブユニットを有さないウイルスベクターによる形質導入のレベルと比較して低減した肝臓の形質導入を有し；（ｉｉ）修飾カプシドタンパク質サブユニットを有さないウイルスベクターにより観察されるレベルと比較して向上した、動物対象におけるウイルスベクターによる全身性形質導入を示し；（ｉｉｉ）修飾カプシドタンパク質サブユニットを有さないウイルスベクターによる移動のレベルと比較して向上した、内皮細胞を越える移動を実証し、及び／又は（ｉｖ）修飾カプシドタンパク質サブユニットを有さないウイルスベクターによる形質導入のレベルと比較して筋肉組織（例えば、骨格筋、心筋及び／又は横隔膜筋）の形質導入の選択的な向上を示し、（ｖ）肝組織の形質導入の選択的な向上を示し、及び／又は（ｖｉ）脳組織（例えば、ニューロン）の低減した形質導入を示す。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、肝臓への全身性形質導入を有する。
[0160] 一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、（ｉ）配列番号１８０又は１７５の配列を含むカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド；及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された導入カセットを含み；導入カセットは、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；プロモーター；ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１８０の配列を含む。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１７５の配列を含む。
[0161] 一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは、（ｉ）配列番号１８０若しくは１７５の配列又は配列番号１８０若しくは１７５に対して約１～約２５個のアミノ酸変異を含む配列を含むカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド；及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された導入カセットを含み；導入カセットは、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；プロモーター；ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、カプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１８０又は１７５に対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個以上のアミノ酸変異を含む。
[0162] 一部の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、約１１０～約１６０ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲと同じ長さである。一部の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、異なる長さを有する。一部の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのゲノムから単離されるか又はそれに由来する。一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号３００３の配列を含む。一部の実施形態において、３’ＩＴＲは、配列番号３００４の配列を含む。
[0163] 一部の実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター、ＨＳＶＴＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター及びＨＳＶＴＫプロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態において、プロモーターは、配列番号３００５、配列番号３００６、配列番号３００７又は配列番号３００８のいずれか１つと少なくとも９５％又は１００％同一の配列を含む。
[0164] 一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質である。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９５％同一の配列を有する。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９８％同一の配列を有する。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号３００１の配列を含む。
[0165] 一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３００２の配列を含む。
[0166] 一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ｒＢＧ、α－グロビン、β－グロビン、ヒトコラーゲン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ポリオーマウイルス、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）から選択される。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ｒＢＧポリアデニル化シグナルである。
[0167] 一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号３０１２又は配列番号３０１３と少なくとも９５％又は１００％同一の配列を含む。
[0168] 一部の実施形態において、導入カセットは、エンハンサーをさらに含む。一部の実施形態において、エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサーである。一部の実施形態において、エンハンサーは、配列番号３００９の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む。
[0169] 一部の実施形態において、導入カセットは、イントロン配列をさらに含む。一部の実施形態において、イントロン配列は、キメラ配列である。
[0170] 一部の実施形態において、イントロン配列は、ハイブリッド配列である。一部の実施形態において、イントロン配列は、ＳＶ４０から単離されるか又はそれに由来する配列を含む。一部の実施形態において、イントロン配列は、配列番号３０１０～３０１１のいずれか１つの配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３０１４～３０１９のいずれか１つの配列を含む。
[0171] 本明細書に記載の修飾カプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド及びウイルスベクターは、天然状態で特定位置における示されるアミノ酸を有する（すなわち変異体でない）カプシドタンパク質サブユニット、タンパク質カプシド及びウイルスベクターを排除することが当業者により理解される。
ＡＡＶ導入カセット
[0172] 組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターの産生において使用されるＡＡＶ導入カセット、核酸及びプラスミドが本明細書に記載される。開示されるカセット、核酸及びプラスミドは、１つ以上の疾患又は障害の改善、治療及び／又は予防における治療有効性を有する１つ以上の導入遺伝子を発現させるために使用することができる配列を含む。
[0173] 一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；導入遺伝子；及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、プロモーター、導入遺伝子及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化配列及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化配列及び３’ＩＴＲを含み；導入カセットは、イントロン配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、プロモーター、イントロン配列、導入遺伝子、ポリアデニル化配列及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質又はその断片若しくはバリアントをコードする。
逆位末端リピート
[0174] 逆位末端リピート又はＩＴＲ配列は、ＡＡＶプロウイルス組込みを媒介する、ビリオン中へのＡＡＶ ＤＮＡのパッケージングのための配列である。ＩＴＲは、ＡＡＶ生活環における種々の活性に関与する。例えば、ＩＴＲ配列は、ヘアピン構造を形成し得、形質移入後のプラスミドからの切出し、ベクターゲノムの複製並びに組込み及び宿主細胞ゲノムからのレスキューにおける役割を果たす。
[0175] 本開示のＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含み得る。ＩＴＲ配列は、約１１０～約１６０ヌクレオチド長、例えば１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９又は１６０ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、ＩＴＲ配列は、約１４１ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲと同じ長さである。一部の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、異なる長さを有する。一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲよりも長く、他の実施形態において、３’ＩＴＲは、５’ＩＴＲよりも長い。
[0176] ＩＴＲは、任意のＡＡＶ、例えば表１に列記されるＡＡＶのゲノムから単離されるか又はそれに由来し得る。一部の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのゲノムから単離されるか又はそれに由来する。一部の実施形態において、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、ＡＡＶ以外の別のパルボウイルス種のメンバーから単離され、それに由来する野生型又は変異ＩＴＲであり得る。例えば、一部の実施形態において、ＩＴＲは、ボカウイルス又はパルボウイルスＢ１９から単離されるか又はそれに由来する野生型又は変異ＩＴＲであり得る。
[0177] 一部の実施形態において、ＩＴＲは、ｓｃＡＡＶの産生を促進するための修飾を含む。一部の実施形態において、ｓｃＡＡＶの産生を促進するための修飾は、ＩＴＲからの末端解離配列（ＴＲＳ）の欠失である。一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり、３’ＩＴＲは、末端解離配列を欠く変異ＩＴＲである。一部の実施形態において、３’ＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり、５’ＩＴＲは、末端解離配列を欠く変異ＩＴＲである。一部の実施形態において、末端解離配列は、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの両方で不存在である。他の実施形態において、ｓｃＡＡＶの産生を促進するための修飾は、異なるヘアピン形成配列、例えばｓｈＲＮＡ形成配列によるＩＴＲの置き換えである。
[0178] 一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号３００３の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含み得る。一部の実施形態において、３’ＩＴＲは、配列番号３００４の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含み得る。一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号３００３の配列を含み、３’ＩＴＲは、配列番号３００４の配列を含む。
[0179] 一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、１つ以上の「代理」ＩＴＲ、すなわちＩＴＲと同じ機能を提供する非ＩＴＲ配列を含む。例えば、Xie, J. et al., Mol. Ther., 25 (6): 1363-1374 (2017)を参照されたい。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセット中のＩＴＲは、代理ＩＴＲにより置き換えられる。一部の実施形態において、代理ＩＴＲは、ヘアピン形成配列を含む。一部の実施形態において、代理ＩＴＲは、ショートヘアピン（ｓｈ）ＲＮＡ形成配列である。
プロモーター、エンハンサー、リプレッサー及び他の調節配列
[0180] 遺伝子発現は、所与のタンパク質についてのコード領域をフランキングするプロモーター及びエンハンサーと呼ばれるヌクレオチド配列により制御することができる。
[0181] 本明細書において使用されるとき、「プロモーター」という用語は、作動可能に連結された核酸の転写を指令する１つ以上の核酸制御配列を指す。プロモーターは、転写の開始部位付近の核酸配列、例えばＴＡＴＡエレメントを含み得る。プロモーターは、転写因子により結合され得るシス作用ポリヌクレオチド配列も含み得る。
[0182] 「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境的及び発生的条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、環境的又は発生的調節下で活性なプロモーターである。「作動可能に連結された」という用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーター又は転写因子結合部位のアレイ）と第２の核酸配列との間の機能的な連結を指し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指令する。
[0183] 遺伝子発現は、転写の開始部位から数千塩基対ほどに局在し得る１つ以上の遠位「エンハンサー」又は「リプレッサー」エレメントによっても制御することができる。エンハンサー又はリプレッサーエレメントは、転写の開始部位から離れてエンハンサーエレメントが作用し得る例外を除き、転写の開始部位付近でシス作用エレメントに類似した方式で転写を調節する。
[0184] 一部の実施形態において、本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットは、プロモーターを含む。プロモーターは、例えば、構成的プロモーター又は誘導性プロモーターであり得る。一部の実施形態において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。
[0185] 本明細書に記載のＡＡＶ導入カセット中で使用することができる例示的なプロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターが挙げられる。一部の実施形態において、プロモーターは、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター及びＥＦ－１アルファショートプロモーターからなる群から選択される。一部の実施形態において、プロモーターは、配列番号３００５～３００８のいずれか１つから選択される配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む。
[0186] 一部の実施形態において、本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットは、エンハンサーを含む。エンハンサーは、例えば、ＣＭＶエンハンサーであり得る。一部の実施形態において、エンハンサーは、配列番号３００９の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む。
[0187] 本明細書に記載のＡＡＶ導入カセット中で使用することができる例示的な組織特異的プロモーター及びエンハンサーの非限定的なリストとしては、ＨＭＧ－ＣＯＡレダクターゼプロモーター、ステロール調節エレメント１（ＳＲＥ－１）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、ヒトＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）プロモーター、ヒトグルコキナーゼプロモーター、コレステロール７－アルファヒドロイラーゼ（ＣＹＰ－７）プロモーター、ベータ－ガラクトシダーゼアルファ－２，６シアリルトランスフェラーゼプロモーター、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ－１）プロモーター、アルドラーゼＢプロモーター、ヒトトランスフェリンプロモーター、コラーゲンＩ型プロモーター、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）プロモーター、９４の前立腺分泌タンパク質（ＰＳＰ９４）プロモーター、前立腺特異的抗原複合体プロモーター、ヒト腺性カリクレイン遺伝子プロモーター（ｈｇｔ－１）、筋細胞特異的エンハンサー結合因子ＭＥＦ－２、筋クレアチンキナーゼプロモーター、膵炎関連タンパク質プロモーター（ＰＡＰ）、エラスターゼ１転写エンハンサー、膵特異的アミラーゼ及びエラスターゼエンハンサープロモーター、膵コレステロールエラスターゼ遺伝子プロモーター、ウテログロビンプロモーター、コレステロール側鎖開裂（ＳＣＣ）プロモーター、ガンマ－ガンマエノラーゼ（ニューロン特異的エノラーゼ、ＮＳＥ）プロモーター、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦ－Ｈ）プロモーター、ヒトＣＧＬ－１／グランザイムＢプロモーター、末端デオキシトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、ラムダ５、ＶｐｒｅＢ及びｌｃｋ（リンパ球特異的チロシンタンパク質キナーゼｐ５６１ｃｋ）プロモーター、ヒトＣＤ２プロモーター及びその３’転写エンハンサー、ヒトＮＫ及びＴ細胞特異的活性化（ＮＫＧ５）プロモーター、ｐｐ６０ｃ－ｓｒｃチロシンキナーゼプロモーター、器官特異的ネオ抗原（ＯＳＮ）、分子量４０ｋＤａ（ｐ４０）プロモーター、結腸特異的抗原－Ｐプロモーター、ヒトアルファ－ラクトアルブミンプロモーター、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）プロモーター、ＨＥＲ２／ｎｅｕプロモーター、カゼインプロモーター、ＩｇＧプロモーター、絨毛性胎児性抗原プロモーター、エラスターゼプロモーター、ポルホビリノゲンデアミナーゼプロモーター、インスリンプロモーター、成長ホルモン因子プロモーター、チロシンヒドロキシラーゼプロモーター、アルブミンプロモーター、アルファフェトプロテインプロモーター、アセチルコリン受容体プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、アルファ又はベータグロビンプロモーター、Ｔ細胞受容体プロモーター、オステオカルシンプロモーター、ＩＬ－２プロモーター、ＩＬ－２受容体プロモーター、乳清（ｗａｐ）プロモーター並びにＭＨＣクラスＩＩプロモーターが挙げられる。
導入遺伝子
[0188] 本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットは、標的細胞中での発現のための導入遺伝子を含む。
[0189] 導入遺伝子は、（１つ以上の）任意の目的異種核酸配列であり得る。このような核酸としては、ポリペプチド、例として治療（例えば、医学的又は獣医学的使用のための）又は免疫原性（例えば、ワクチンのための）ポリペプチド又はＲＮＡをコードする核酸を挙げることができる。代わりに、核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム、スプライセオソーム媒介／ｒａｍスプライシングを付与するＲＮＡ、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、例として遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ及び他の非翻訳ＲＮＡをコードし得る。一部の実施形態において、核酸配列は、遺伝子編集を指令し得る。例えば、核酸は、遺伝子編集分子、例えばガイドＲＮＡ又はヌクレアーゼをコードし得る。一部の実施形態において、核酸は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、ＮｇＡｇｏ（アグロノート エンドヌクレアーゼ）、ＳＧＮ（構造ガイド型エンドヌクレアーゼ）又はＲＧＮ（ＲＮＡガイド型ヌクレアーゼ）、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼ又はＣｐｆ１ヌクレアーゼをコードし得る。一部の実施形態において、核酸は、宿主染色体上の遺伝子座と相同性を共有し、それと組換わり得る。このアプローチを利用して、例えば宿主細胞における遺伝子欠損を修正することができる。
[0190] 本開示によるウイルスベクターは、導入遺伝子を広範な細胞、例として分裂及び非分裂細胞中に送達する手段を提供する。ウイルスベクターを用いて、例えばインビトロでポリペプチドを産生するため又はエクスビボ遺伝子療法のため、インビトロで細胞に導入遺伝子を送達することができる。ウイルスベクターは、例えば、免疫原性若しくは治療ポリペプチド又は機能性ＲＮＡを発現させるため、導入遺伝子を、それを必要とする対象に送達する方法においてさらに有用である。この様式において、ポリペプチド又は機能性ＲＮＡは、対象においてインビボで産生され得る。対象は、ポリペプチドの欠損を有するため、対象は、ポリペプチドを必要とし得る。さらに、対象におけるポリペプチド又は機能性ＲＮＡの産生が一部の有益な効果を付与し得るため、その方法を実施することができる。本明細書において使用されるとき、「機能性ＲＮＡ」という用語は、細胞において１つ以上の機能を有する任意の非コードＲＮＡ配列、例えば上記段落に記載のものを指す。
[0191] ウイルスベクターを使用して、培養細胞における又は対象における目的ポリペプチド又は機能性ＲＮＡの産生のために核酸を送達することもできる（例えば、ポリペプチドを産生するため又は例えばスクリーニング方法と連動して、対象に対する機能性ＲＮＡの効果を観察するために対象をバイオリアクターとして使用する）。
[0192] 一般に、本開示のウイルスベクターを用いて、ポリペプチド又は機能性ＲＮＡをコードする導入遺伝子を送達して、治療ポリペプチド又は機能性ＲＮＡを送達することが有益である任意の疾患状態を治療及び／又は予防することができる。
[0193] 一部の実施形態において、導入遺伝子は、ＮＰＣ１の治療に有用である。一部の実施形態において、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする。ＮＰＣ１タンパク質は、例えば、ヒトＮＰＣ１タンパク質であり得る。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一又は少なくとも９８％同一の配列を有する。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、表９（番号付けは、配列番号３００１又は３０２０に基づく）に列記される単一のヌクレオチド変化の１つ以上を含む。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質のトランケート形態である。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号３００１の配列又はそれと少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号３０２０の配列又はそれと少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、表９に列記される単一のヌクレオチド変化の１つ以上を有する配列番号３００１又は３０２０の配列を含む。一部の実施形態において、ＮＰＣ１タンパク質は、参照により全体として本明細書に組み込まれるUniProtアクセッション番号O15118に示される配列を有する。
[0194] 一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３００２の配列又はそれと少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３００２の配列又はそれに対して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個以上の核酸変化を有する配列を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３００１のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３０２０のアミノ酸配列をコードする。
Figure 2022551739000024
Figure 2022551739000025
ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル
[0195] ポリアデニル化シグナルは、ほぼ全ての哺乳動物遺伝子中で見出されるヌクレオチド配列であり、遺伝子転写物の３’末端への一続きのおよそ２００個のアデノシン残基（ポリ（Ａ）テール）の付加を制御する。ポリ（Ａ）テールは、ｍＲＮＡの安定性に寄与し、ポリ（Ａ）テールを欠くｍＲＮＡは、急速に分解される。ポリ（Ａ）テールの存在が翻訳の開始に影響を与えることにより、ｍＲＮＡの翻訳可能性に正に寄与するという証拠もある。
[0196] 一部の実施形態において、本開示のＡＡＶ導入カセットは、ポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、α－グロビン、β－グロビン、ヒトコラーゲン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ポリオーマウイルス、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）のポリアデニル化シグナルから選択することができる。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、ｒＢＧポリアデニル化シグナルである。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号３０１２又は配列番号３０１３の配列を含む。一部の実施形態において、ポリアデニル化シグナルは、配列番号３０１２又は配列番号３０１３の配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％同一の配列を含む。
スタッファー配列
[0197] ＡＡＶベクターは、典型的には、一般に約４ｋｂ～約５．２ｋｂ又はそれよりわずかに大きい定義されたサイズ範囲を有するＤＮＡの挿入を許容する。したがって、より短い導入遺伝子配列について、挿入断片における追加の核酸を含めてＡＡＶベクターに許容可能な要求される長さを達成することが必要であり得る。したがって、一部の実施形態において、本開示のＡＡＶ導入カセットは、スファー（ｓｕｆｆｅｒ）配列を含み得る。スタッファー配列は、例えば、１～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７５、７５～１００、１００～１５０、１５０～２００、２００～２５０、２５０～３００、３００～４００、４００～５００、５００～７５０、７５０～１，０００、１，０００～１，５００、１，５００～２，０００、２，０００～２，５００、２，５００～３，０００、３，０００～３，５００、３，５００～４，０００、４，０００～４，５００から４，５００～５，０００ヌクレオチド長の配列であり得る。スタッファー配列は、それがベクターの機能や活性を妨げないように、カセット中に任意の所望位置で局在させることができる。
イントロン配列
[0198] 一部の実施形態において、本開示のＡＡＶ導入カセットは、イントロン配列を含み得る。イントロン配列の包含は、イントロン配列の不存在下での発現と比較して発現を向上させ得る。一部において、イントロン配列は、転写因子の結合部位として機能せずに遺伝子発現を増加させ得る。例えば、イントロン配列は、転写速度、核輸送及び転写物安定性に影響を与えることにより転写物レベルを増加させ得る。一部の実施形態において、イントロン配列は、ｍＲＮＡ翻訳の効率を増加させる。
[0199] 一部の実施形態において、イントロン配列は、ハイブリッド又はキメラ配列である。一部の実施形態において、イントロン配列は、ＳＶ４０、β－グロビン、ニワトリβ－アクチン、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、第ＩＸ因子及び／又はヒトＩｇＧ（重鎖又は軽鎖）の１つ以上のイントロン配列から単離されるか又はそれに由来する。一部の実施形態において、イントロン配列は、ＳＶ４０から単離されるか又はそれに由来する。一部の実施形態において、イントロン配列は、キメラである。一部の実施形態において、イントロン配列は、配列番号３０１０若しくは配列番号３０１１の配列又はそれと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％若しくは少なくとも９９％同一の配列を含む。
[0200] イントロン配列は、それがＡＡＶベクターの産生を妨害しない導入カセットのいずれの場所にも局在させることができる。例えば、一部の実施形態において、イントロン配列は、プロモーターと導入遺伝子との間に局在させることができる。
例示的なＡＡＶ導入カセット
[0201] 一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入カセットは、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入カセットは、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）、プロモーター、イントロン配列、導入遺伝子、ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、エンハンサーをさらに含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、イントロン配列をさらに含む。
[0202] 一部の実施形態において、５’ＩＴＲは、配列番号３００３の配列を含み、３’ＩＴＲは、配列番号３００４の配列を含む。一部の実施形態において、エンハンサーは、配列番号３００９の配列を含む。一部の実施形態において、プロモーターは、配列番号３００５～３００８のいずれか１つの配列を含む。一部の実施形態において、イントロン配列は、配列番号３０１０又は３０１１の配列を含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、配列番号３００２の配列を含む。一部の実施形態において、ポリＡシグナルは、配列番号３０１２又は３０１３の配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３０１４～３０１９のいずれか１つの配列を含む。
[0203] 一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、ＣＢＡプロモーター、ＳＶ４０イントロン、ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、キメライントロン、ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子、ｒＢＧポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、ＧＵＳＢ３７９プロモーター、ＳＶ４０イントロン、ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子、ｒＢＧポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、キメライントロン、ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＳＶ４０イントロン、ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、ＨＳＶＴＫプロモーター、ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子、ｒＢＧポリアデニル化シグナル及び３’ＩＴＲを含む。
[0204] 一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３００３の配列を含む５’ＩＴＲ、配列番号３００５の配列を含むＣＢＡプロモーター、配列番号３０１０の配列を含むＳＶ４０イントロン、ＮＰＣ１タンパク質（配列番号３００１）をコードする導入遺伝子、配列番号３０１２を含むＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び配列番号３００４の配列を含む３’ＩＴＲを含む。
[0205] 一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３００３の配列を含む５’ＩＴＲ、配列番号３００６の配列を含むＧＵＳＢ２４０プロモーター、配列番号３０１１を含むキメライントロン、ＮＰＣ１タンパク質（配列番号３００１）をコードする導入遺伝子、配列番号３０１３を含むｒＢＧポリアデニル化シグナル及び配列番号３００４の配列を含む３’ＩＴＲを含む。
[0206] 一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３００３の配列を含む５’ＩＴＲ、配列番号３００６を含むＧＵＳＢ３７９プロモーター、配列番号３０１０の配列を含むＳＶ４０イントロン、ＮＰＣ１タンパク質（配列番号３００１）をコードする導入遺伝子、配列番号３０１３を含むｒＢＧポリアデニル化シグナル及び配列番号３００４の配列を含む３’ＩＴＲを含む。
[0207] 一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３００３の配列を含む５’ＩＴＲ、配列番号３００７を含むＧＵＳＢ２４０プロモーター、配列番号３０１１の配列を含むキメライントロン、ＮＰＣ１タンパク質（配列番号３００１）をコードする導入遺伝子、配列番号３０１２を含むＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び配列番号３００４の配列を含む３’ＩＴＲを含む。
[0208] 一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３００３の配列を含む５’ＩＴＲ、配列番号３００６を含むＧＵＳＢ２４０プロモーター、配列番号３０１０の配列を含むＳＶ４０イントロン、ＮＰＣ１タンパク質（配列番号３００１）をコードする導入遺伝子、配列番号３０１２を含むＳＶ４０ポリアデニル化シグナル及び配列番号３００４の配列を含む３’ＩＴＲを含む。
[0209] 一部の実施形態において、ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３００３の配列を含む５’ＩＴＲ、ＣＭＶエンハンサー、配列番号３００８を含むＨＳＶＴＫプロモーター、ＮＰＣ１タンパク質（配列番号３００１）をコードする導入遺伝子、配列番号３０１３を含むｒＢＧポリアデニル化シグナル及び配列番号３００４の配列を含む３’ＩＴＲを含む。
[0210] 一部の実施形態において、核酸は、ＡＡＶ導入カセットを含む。一部の実施形態において、核酸は、導入遺伝子を含み、導入遺伝子は、配列番号３００１のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、核酸は、導入遺伝子を含み、導入遺伝子は、配列番号３０２０のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、核酸は、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；プロモーター；導入遺伝子；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含み、導入遺伝子は、配列番号３００１又は配列番号３０２０のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、核酸は、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；プロモーター；導入遺伝子；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含み；核酸は、イントロン配列を含み；導入遺伝子は、配列番号３００１又は配列番号３０２０のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、核酸は、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；ニワトリベータ－アクチンプロモーター；導入遺伝子；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含み；導入カセットは、イントロン配列を含み；導入遺伝子は、配列番号３００１又は配列番号３０２０のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、核酸は、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；プロモーター；イントロン配列；導入遺伝子；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含み；導入遺伝子は、配列番号３００１又は配列番号３０２０のアミノ酸配列をコードする。一部の実施形態において、核酸は、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；ニワトリベータ－アクチンプロモーター；イントロン配列；導入遺伝子；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含み；導入遺伝子は、配列番号３００１又は配列番号３０２０のアミノ酸配列をコードする。本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットは、標準的な分子生物学技術を使用してベクター（例えば、プラスミド又はバクミド）中に取り込むことができる。ベクター（例えば、プラスミド又はバクミド）は、ＡＡＶの産生中に使用される１つ以上の遺伝子エレメント、例として例えばＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子及びｃａｐ遺伝子並びにヘルパーウイルスタンパク質配列をさらに含み得る。
ウイルスベクターを産生する方法
[0211] ウイルスベクターを産生する方法も本明細書で提供される。一部の実施形態において、中和抗体を回避するＡＡＶベクターを産生する方法は、ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット又はタンパク質カプシド上の三次元抗原性フットプリントを形成する接触アミノ酸残基を同定すること；ｂ）（ａ）において同定された接触アミノ酸残基のアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットのライブラリーを生成すること；ｃ）（ｂ）のＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットのライブラリーからのカプシドタンパク質サブユニットを含むＡＡＶ粒子を産生すること；ｄ）（ｃ）のＡＡＶ粒子を、感染及び複製が生じ得る条件下で細胞と接触させること；ｅ）少なくとも１つの感染サイクルを完了し、対照ＡＡＶ粒子と類似の力価まで複製し得るＡＡＶ粒子を選択すること：１）（ｅ）において選択されたＡＡＶ粒子を、感染及び複製が生じ得る条件下で中和抗体及び細胞と接触させること；並びにｇ）（ｆ）の中和抗体により中和されないＡＡＶ粒子を選択することを含む。接触アミノ酸残基を同定する方法の非限定的な例としては、ペプチドエピトープマッピング及び／又は低温電子顕微鏡法が挙げられる。
[0212] 三次元抗原性フットプリント内の抗体接触残基の分解及び同定は、ランダム、合理的及び／又は縮重変異誘発を介するそれらの後続の修飾を可能として抗体回避ＡＡＶタンパク質カプシド及び／又はカプシドタンパク質サブユニットを生成し、それは、さらなる選択及び／又はスクリーニングを介して同定することができる。
[0213] したがって、一部の実施形態において、中和抗体を回避するＡＡＶベクターを産生する方法は、ａ）ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット及び／又はタンパク質カプシド上の三次元抗原性フットプリントを形成する接触アミノ酸残基を同定すること；ｂ）ランダム、合理的及び／又は縮重変異誘発による（ａ）において同定された接触アミノ酸残基のアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを生成すること；ｃ）（ｂ）のＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットからのカプシドタンパク質サブユニットを含むＡＡＶ粒子を産生すること；ｄ）（ｃ）のＡＡＶ粒子を、感染及び複製が生じ得る条件下で細胞と接触させること；ｅ）少なくとも１つの感染サイクルを完了し、対照ＡＡＶ粒子と類似の力価まで複製し得るＡＡＶ粒子を選択すること；ｆ）（ｅ）において選択されたＡＡＶ粒子を、感染及び複製が生じ得る条件下で中和抗体及び細胞と接触させること；並びにｇ）（ｆ）の中和抗体により中和されないＡＡＶ粒子を選択することを含む。
[0214] 接触アミノ酸残基を同定する方法の非限定的な例としては、ペプチドエピトープマッピング及び／又は低温電子顕微鏡法が挙げられる。ランダム、合理的及び／又は縮重変異誘発による接触アミノ酸残基のアミノ酸置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットを生成する方法は、当技術分野において公知である。
[0215] この包括的アプローチは、任意のＡＡＶタンパク質カプシド及び／又はカプシドタンパク質サブユニットの修飾に適用することができるプラットフォーム技術を表す。このプラットフォーム技術の適用は、元のＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットテンプレートに由来するＡＡＶ抗原性バリアントを形質導入効率の損失なしで生じさせる。１つの利点及び利益として、この技術の適用は、ＡＡＶベクターでの遺伝子療法の適格を有する患者のコホートを拡張する。
[0216] 一部の実施形態において、ウイルスベクターを産生する方法は、細胞に、（ａ）少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ配列）を含む核酸テンプレート、並びに（ｂ）核酸テンプレートの複製及びＡＡＶタンパク質カプシド中へのカプシド化に十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶカプシドサブユニットをコードするＡＡＶ ｒｅｐ配列及びＡＡＶ ｃａｐ配列）を提供することを含む。任意選択で、核酸テンプレートは、少なくとも１つの異種核酸配列をさらに含む。一部の実施形態において、核酸テンプレートは、２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、それらは、異種核酸配列（存在する場合）に対して５’及び３’に局在するが、それと直接連続する必要はない。
[0217] 核酸テンプレート並びにＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ配列は、ＡＡＶタンパク質カプシド内でパッケージングされた核酸テンプレートを含むウイルスベクターが細胞中で産生されるような条件下で提供する。方法は、ウイルスベクターを細胞から回収するステップをさらに含み得る。ウイルスベクターは、培地から及び／又は細胞を溶解させることにより回収することができる。
[0218] 細胞は、ＡＡＶウイルス複製について許容性の細胞であり得る。当技術分野において公知の任意の好適な細胞を用いることができる。一部の実施形態において、細胞は、哺乳類細胞である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失した機能を提供するトランス相補パッケージング細胞系、例えば２９３細胞又は他のＥ１ａトランス相補細胞であり得る。
[0219] ＡＡＶ複製及びカプシドタンパク質サブユニット配列は、当技術分野において公知の任意の方法により提供することができる。現在のプロトコルは、典型的には、単一のプラスミド上のＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現させる。ＡＡＶ複製及びパッケージング配列は一緒に提供する必要はないが、そうすることが簡便であり得る。ＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はｃａｐ配列は、任意のウイルス又は非ウイルスベクターにより提供することができる。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルス又はヘルペスウイルスベクターにより提供する（例えば、欠失アデノウイルスベクターのＥ１ａ又はＥ３領域中に挿入する）ことができる。ＥＢＶベクターを用いてＡＡＶ ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子を発現させることもできる。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソーム性であり、依然として連続的な細胞分裂全体にわたり高コピー数を維持することである（すなわち「ＥＢＶベース核エピソーム」と称される染色体外エレメントとして細胞中に安定的に組み込まれる、Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158: 67を参照されたい）。
[0220] さらなる代替形態として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列を細胞中に安定的に取り込むことができる。
[0221] 典型的には、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、それらの配列のレスキュー及び／又はパッケージングを防止するためにＴＲによりフランキングされない。
[0222] 核酸テンプレートは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して細胞に提供することができる。例えば、テンプレートは、プラスミド又はウイルスベクターにより供給することができる。一部の実施形態において、核酸テンプレートは、ヘルペスウイルス又はアデノウイルスベクターにより供給する（例えば、欠失アデノウイルスのＥ１ａ又はＥ３領域中に挿入する）。別の説明として、Palombo et al., (1998) J. Virology 72: 5025は、ＡＡＶ ＴＲによりフランキングされたレポーター遺伝子を担持するバキュロウイルスベクターを記載する。ＥＢＶベクターを用いてｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上記のとおりテンプレートを送達することもできる。
[0223] 一部の実施形態において、核酸テンプレートは、複製ｒＡＡＶウイルスにより提供する。一部の実施形態において、核酸テンプレートを含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の核中に安定的に組み込む。
[0224] ウイルス力価を向上させるため、増殖性ＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルス又はヘルペスウイルス）を細胞に提供することができる。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野において公知である。典型的には、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルス又はヘルペスウイルスベクターにより提供する。代わりに、アデノウイルス又はヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルス又はウイルスベクターにより、例えばFerrari et al., (1997) Nature Med. 3: 1295並びに米国特許第６，０４０，１８３号及び同第６，０９３，５７０号により記載される、効率的なＡＡＶ産生を促進するヘルパー遺伝子の全てを担持する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして提供することができる。
[0225] さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体中に埋め込まれるか、又は安定的染色体外エレメントとして維持されたヘルパー配列を有するパッケージング細胞により提供することができる。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン中にパッケージングすることができず、例えばＩＴＲによりフランキングされていない。
[0226] 当業者は、ＡＡＶ複製及びカプシドタンパク質サブユニット配列並びにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を単一のヘルパー構築物上で提供することが有利であり得ることを認識する。このヘルパー構築物は、非ウイルス又はウイルス構築物であり得る。１つの非限定的な説明として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルス又はハイブリッドヘルペスウイルスであり得る。
[0227] 一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより供給する。さらに、このベクターは、核酸テンプレートをさらに含み得る。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及び／又はｒＡＡＶテンプレートは、アデノウイルスの欠失領域（例えば、Ｅ１ａ又はＥ３領域）中に挿入することができる。
[0228] 一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより供給する。この実施形態によれば、ｒＡＡＶテンプレートは、プラスミドテンプレートとして提供することができる。
[0229] 一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより提供し、ｒＡＡＶテンプレートは、プロウイルスとして細胞中に組み込む。代わりに、ｒＡＡＶテンプレートは、細胞内に染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶベース核エピソームとして）維持されたＥＢＶベクターにより提供する。
[0230] 一部の実施形態において、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及びアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーにより提供する。ｒＡＡＶテンプレートは、別個の複製ウイルスベクターとして提供することができる。例えば、ｒＡＡＶテンプレートは、ｒＡＡＶ粒子又は第２の組換えアデノウイルス粒子により提供することができる。
[0231] 上記方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的には、アデノウイルス複製及びパッケージングに十分なアデノウイルス５’及び３’シス配列（すなわちアデノウイルス末端リピート及びＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列及び存在する場合にはｒＡＡＶテンプレートは、アデノウイルス骨格中で埋め込まれ、５’及び３’シス配列によりフランキングされ、その結果、それらの配列をアデノウイルスタンパク質カプシド中にパッケージングすることができる。上記のとおり、アデノウイルスヘルパー配列及びＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、一般に、ＩＴＲによりフランキングされておらず、その結果、それらの配列がＡＡＶビリオン中にパッケージングされない。Zhang et al.,((2001)Gene Ther.18:7041-12)は、アデノウイルス並びにＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の両方を含むキメラヘルパーを記載する。
[0232] ヘルペスウイルスも、ＡＡＶパッケージング方法においてヘルパーウイルスとして使用することができる。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、有利には、スケーラブルＡＡＶベクター産生スキームを容易にし得る。ＡＡＶ－２ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ－１）ベクターは、（Conway et al., (1999) Gene Therapy 6: 986及び国際公開第００／１７３７７号に記載される。
[0233] さらなる代替形態として、ウイルスベクターは、例えば、Urabe et al., (2002) Human Gene Therapy 13: 1935-43により記載されるとおり、バキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞中で産生してｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子及びｒＡＡＶテンプレートを送達することができる。
[0234] 混入ヘルパーウイルスを有さないＡＡＶベクターストックは、当技術分野において公知の任意の方法により得ることができる。例えば、ＡＡＶ及びヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別することができる。ＡＡＶは、ヘパリン基質についての親和性に基づいてヘルパーウイルスから分離することもできる（Zolotukhin et al. (1999) Gene Therapy 6: 973）。いかなる混入ヘルパーウイルスも複製可能でないように、欠失複製欠損ヘルパーウイルスを使用することができる。さらなる代替形態として、ＡＡＶウイルスのパッケージングを媒介するためにアデノウイルス初期遺伝子発現のみが要求されるため、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーを用いることができる。後期遺伝子発現を欠損するアデノウイルス変異体は、当技術分野において公知である（例えば、ｔｓ１００Ｋ及びｔｓ１４９アデノウイルス変異体）。
組換えウイルスベクター
[0235] 本明細書に記載のウイルスベクターは、インビトロ、エクスビボ及びインビボでの細胞への核酸の送達に有用である。特に、ウイルスベクターを有利に用いて核酸を動物、例として哺乳類細胞に送達するか又は移行させることができる。したがって、一部の実施形態において、核酸は、本明細書に記載のタンパク質カプシドによってカプシド化することができる。一部の実施形態において、核酸は、導入カセットである。一部の実施形態において、導入カセットは、ベクターゲノム（例えば、５’ＩＴＲ、導入遺伝子及び３’ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態において、核酸は、ＡＡＶ導入カセットである。
[0236] ウイルスベクターにより送達される導入カセット配列は、任意の目的異種核酸配列であり得る。目的核酸としては、ポリペプチド、例として治療（例えば、医薬又は獣医薬的使用のための）又は免疫原性（例えば、ワクチンのための）ポリペプチド又はＲＮＡをコードする核酸が挙げられる。一部の実施形態において、導入カセットは、５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、導入カセットは、５’ＩＴＲ、導入遺伝子及び３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態において、導入遺伝子は、治療タンパク質又はＲＮＡをコードする。
[0237] 治療ポリペプチドとしては、限定されるものではないが、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（例として、ミニ及びマイクロジストロフィン、例えばVincent et al, (1993) Nature Genetics 5: 130、米国特許出願公開第２００３／０１７１３１号；国際公開第２００８／０８８８９５号、Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 1 3714-13719 (2000)；及びGregorevic et al., Mol. Ther. 16: 657-64 (2008)を参照されたい）、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビン１１型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、アポリポタンパク質、例えばａｐｏＡ（ａｐｏＡ１、ａｐｏＡ２、ａｐｏＡ４、ａｐｏＡ－Ｖ）、ａｐｏＢ（ａｐｏＢ１００、ＡｐｏＢ４８）、ａｐｏＣ（ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＣＩＶ）、ａｐｏＤ、ａｐｏＥ、ａｐｏＨ、ａｐｏＬ、ａｐｏ（ａ）、抗炎症性ポリペプチド、例えばＩカッパＢドミナント変異体、アミロイドベータ、タウ、サルコスパン、ユートロフィン（Tinsley et al, (1996) Nature 384: 349）、ミニユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子など）、エリスロポエチン、アンギオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、プログラニュリン、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、アルファ－１－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、バッテニン、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、フラタキシン、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、アルファ－インターフェロン、ベータ－インターフェロン、ガンマ－インターフェロン、インターロイキン－２、インターロイキン－４、アルファシヌクレイン、パーキン、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド成長因子、神経栄養因子及びホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様成長因子１及び２、血小板由来成長因子、上皮細胞成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、神経栄養因子３及び４、脳由来神経栄養因子、骨形成タンパク質［例として、ＲＡＮＫＬ及びＶＥＧＦ］、グリア由来成長因子、トランスフォーミング成長因子－α及び－βなど）、ハンチンギン、リソソーム酸性アルファ－グルコシダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、アルファ－ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死成長因子可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、カルシウムハンドリングを調節する分子（例えば、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＰＰ１のインヒビター１及びその断片［例えば、国際公開第２００６／０２９３１９号及び国際公開第２００７／１００４６５号］）、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンを誘起する分子、例えばトランケートされた構成的に活性のｂＡＲＫｃｔ、抗炎症性因子、例えばＩＲＡＰ、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、モノクローナル抗体（例として、一本鎖モノクローナル抗体；例示的なＭａｂは、Herceptin（登録商標）Ｍａｂである）、神経ペプチド及びその断片（例えば、ガラニン、神経ペプチドＹ（米国特許第７，０７１，１７２号を参照されたい））、血管新生インヒビター、例えばバゾヒビン及び他のＶＥＧＦインヒビター（例えば、バゾヒビン２［国際公開第２００６／０７３０５２号を参照されたい］）が挙げられる。他の説明的な異種核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素及び腫瘍壊死因子）、宿主の因子の転写を向上させるか又は阻害するタンパク質（例えば、転写エンハンサー又は阻害エレメントに結合しているヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９、転写エンハンサー又は阻害エレメントに結合しているジンクフィンガータンパク質、転写エンハンサー又は阻害エレメントに結合している転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター）、癌療法において使用される薬剤に対する耐性を付与するタンパク質、腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳリガンド並びに治療を必要とする対象において治療効果を有する任意の他のポリペプチドをコードする。ＡＡＶベクターを使用して、モノクローナル抗体及び抗体断片、例えばミオスタチンに対して指向される抗体又は抗体断片を送達することもできる（例えば、Fang et al., Nature Biotechnology 23: 584-590 (2005)を参照されたい）。ポリペプチドをコードする異種核酸配列としては、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をコードする配列が含まれる。レポーターポリペプチドは、当技術分野において公知であり、それとしては、限定されるものではないが、緑色蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられる。
[0238] 任意選択で、異種核酸は、分泌ポリペプチド（例えば、天然状態で分泌ポリペプチドであるか、又は例えば当技術分野において公知の分泌シグナル配列との作動可能な会合により分泌されるようにエンジニアリングされたポリペプチド）をコードする。
[0239] 代わりに、一部の実施形態において、異種核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載）、スプライセオソーム媒介／ｒａｍ－スプライシングを誘起するＲＮＡ（Puttaraju et al., (1999) Nature Biotech. 17: 246；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照されたい）、遺伝子サイレンシングを媒介する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、例としてｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ（Sharp et al., (2000) Science 287: 2431を参照されたい）及び他の非翻訳ＲＮＡ、例えば「ガイド」ＲＮＡ（Gorman et al., (1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95: 4929；Yuanらの米国特許第５，８６９，２４８号）などをコードし得る。例示的な非翻訳ＲＮＡとしては、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療及び／又は予防するため、及び／又は化学療法による損傷を予防するために心臓に投与するため）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのため）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療及び／又は予防するため）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管疾患を治療するため、例えばAndino et al., J. Gene Med. 10: 132-142 (2008)及びLi et al., Acta Pharmacol Sin. 26: 51-55 (2005)を参照されたい）；ホスホランバン阻害又はドミナントネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ（例えば、心血管疾患を治療するため、例えばHoshijima et al., Nat. Med. 8: 864-871 (2002)を参照されたい）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、てんかんのため）並びに病原体及びウイルス（例えば、Ｂ型及び／又はＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルスなど）に対して指向されるＲＮＡｉが挙げられる。
[0240] さらに、代替的スプライシングを指向する核酸配列を送達することができる。説明すると、ジストロフィンエクソン５１の５’及び／又は３’スプライス部位に相補的なアンチセンス配列（又は他の阻害配列）をＵ１又はＵ７小核（ｓｎ）ＲＮＡプロモーターとともに送達してこのエクソンのスキッピングを誘導することができる。例えば、アンチセンス／阻害配列の５’に局在するＵ１又はＵ７ｓｎＲＮＡプロモーターを含むＤＮＡ配列を修飾タンパク質カプシド中にパッケージングし、送達することができる。
[0241] 一部の実施形態において、遺伝子編集を指向する核酸配列を送達することができる。例えば、核酸は、ガイドＲＮＡをコードし得る。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の実施形態において、核酸は、ヌクレアーゼをコードし得る。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ）、ＮｇＡｇｏ（アグロノート エンドヌクレアーゼ）、ＳＧＮ（構造ガイドエンドヌクレアーゼ）、ＲＧＮ（ＲＮＡガイドヌクレアーゼ）又はその修飾若しくはトランケートバリアントである。一部の実施形態において、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２（ａ）ヌクレアーゼ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＴｒｐＢ様ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼ又はそれらの修飾若しくはトランケートバリアントである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｓ．ピオゲネス（S. pyogenes）又はＳ．アウレウス（S. aureus）から単離されるか又はそれに由来する。
[0242] 一部の実施形態において、遺伝子ノックダウンを指向する核酸配列を送達することができる。例えば、核酸配列は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ又はアンチセンス核酸をコードし得る。ウイルスベクターは、宿主染色体上の遺伝子座と相同性を共有し、それと組換わる異種核酸も含み得る。このアプローチを利用して、例えば宿主細胞における遺伝子欠損を修正することができる。
[0243] 例えば、ワクチン接種のための免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスベクターも提供される。核酸は、当技術分野において公知の任意の目的免疫原、例として、限定されるものではないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ又はＳＩＶ ｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌性抗原、ウイルス抗原などからの免疫原をコードし得る。
[0244] ワクチンベクターとしてのパルボウイルスの使用は、当技術分野で公知である（例えば、Miyamura et al., (1994) Proc. Nat. Acad. Sci USA 91: 8507；Youngらの米国特許第５，９１６，５６３号、Mazzaraらの米国特許第５，９０５，０４０号、米国特許第５，８８２，６５２号、Samulskiらの米国特許第５，８６３，５４１号を参照されたい）。抗原は、パルボウイルスカプシド中で提示され得る。
[0245] 代わりに、抗原は、組換えベクターゲノム中に導入された異種核酸から発現させることができる。一部の実施形態において、本明細書に記載の及び／又は当技術分野において公知の任意の目的免疫原は、本明細書に記載のウイルスベクターにより提供することができる。
[0246] 免疫原性ポリペプチドは、免疫応答を誘発し、及び／又は感染及び／又は疾患、例として、限定されるものではないが、微生物、細菌、原生動物、寄生性、真菌及び／又はウイルス感染及び疾患から対象を保護するのに好適な任意のポリペプチドであり得る。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルトミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルス免疫原、例えばインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）表面タンパク質若しくはインフルエンザウイルス核タンパク質又はウマインフルエンザウイルス免疫原）又はレンチウイルス免疫原（例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原又はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原、例えばＨＩＶ又はＳＩＶエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶ又はＳＩＶマトリックス／カプシドタンパク質及びＨＩＶ又はＳＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子産物）であり得る。また、免疫原性ポリペプチドは、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルス免疫原、例えばラッサ熱ウイルスヌクレオカプシドタンパク質及びラッサ熱エンベロープ糖タンパク質）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアウイルス免疫原、例えばワクシニアＬ１又はＬ８遺伝子産物）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルス免疫原又は日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、エボラウイルス免疫原又はマールブルグウイルス免疫原、例えばＮＰ及びＧＰ遺伝子産物）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦ及び／又はＳＦＳウイルス免疫原）又はコロナウイルス免疫原（例えば、感染性ヒトコロナウイルス免疫原、例えばヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質、又はブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原、又はトリ感染性気管支炎ウイルス免疫原）であり得る。免疫原性ポリペプチドは、さらに、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）、ムンプス免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素又は他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）免疫原及び／又は当技術分野において現在公知の又は後に免疫原として同定される任意の他のワクチン免疫原であり得る。
[0247] 代わりに、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍又は癌細胞抗原であり得る。任意選択で、腫瘍又は癌抗原は、癌細胞の表面上で発現される。
[0248] 例示的な癌及び腫瘍細胞抗原は、S. A. Rosenberg (Immunity 10: 281 (1991))に記載される。他の説明的な癌及び腫瘍抗原としては、限定されるものではないが、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ－１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＫ－４、β－カテニン、ＭＵＭ－１、カスパーゼ－８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ－１、ＦＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原（Kawakami et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3515；Kawakami et al., (1994) J. Exp. Med., 180: 347；Kawakami et al., (1994) Cancer Res. 54: 3124）、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＣＥＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、Ｐ－１５、チロシナーゼ（Brichard et al., (1993) J. Exp. Med.1 78:489）；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９、ＮＳＥ、ＤＵ－ＰＡＮ－２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ－１、ＣＡ７２－４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ－ｅｒｂＢ－２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ－ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質（Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623）；ムチン抗原（国際公開第９０／０５１４２号）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；及び／又は以下の癌：メラノーマ、腺癌、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺癌、肝癌、結腸癌、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、膵癌、脳腫瘍及び現在公知の若しくは後に同定される任意の他の癌若しくは悪性腫瘍病態若しくはその転移物と関連することが現在公知の若しくは後に発見される抗原（例えば、Rosenberg, (1996) Ann. Rev. Med. 47: 481-91を参照されたい）が挙げられる。
[0249] さらなる代替形態として、異種核酸は、インビトロ、エクスビボ又はインビボで細胞中において産生されることが望ましい任意のポリペプチドをコードし得る。例えば、ウイルスベクターは、培養細胞及びそれから単離された発現された遺伝子産物中に導入することができる。
[0250] 目的異種核酸は、適切な制御配列と作動可能に会合され得ることが当業者により理解される。例えば、異種核酸は、発現制御エレメント、例えば転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター及び／又はエンハンサーなどと作動可能に会合させることができる。
[0251] さらに、目的異種核酸の発現の調節を、例えば特異的部位においてスプライシング活性を選択的に遮断するオリゴヌクレオチド、小分子及び／又は他の化合物の存在又は不存在により異なるイントロンの選択的スプライシングを調節することにより転写後レベルにおいて達成することができる（例えば、国際公開第２００６／１１９１３７号に記載）。
[0252] 当業者は、所望のレベル及び組織特異的発現に応じて種々のプロモーター／エンハンサーエレメントを使用し得ることを認識する。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて構成的又は誘導性であり得る。プロモーター／エンハンサーは、天然又は外来であり得、天然又は合成の配列であり得る。外来は、転写開始領域が導入される野生型宿主中で転写開始領域が見出されないことを意図する。
[0253] 一部の実施形態において、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞又は治療される対象に対して天然であり得る。一部の実施形態において、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列に対して天然であり得る。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般に、目的標的細胞中でそれが機能するように選択される。さらに、一部の実施形態において、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳類プロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的又は誘導性であり得る。
[0254] 誘導性発現制御エレメントは、典型的には、異種核酸配列の発現に対して調節を提供することが望ましい適用において有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的又は優先的プロモーター／エンハンサーエレメントであり得、それとしては、筋特異的又は優先的（例として、心筋、骨格筋及び／又は平滑筋特異的又は優先的）、神経組織特異的又は優先的（例として、脳特異的又は優先的）、眼特異的又は優先的（例として、網膜特異的及び角膜特異的）、肝特異的又は優先的、骨髄特異的又は優先的、膵特異的又は優先的、脾臓特異的又は優先的及び肺特異的又は優先的プロモーター／エンハンサーエレメントが挙げられる。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、ホルモン誘導性及び金属誘導性エレメントが挙げられる。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、限定されるものではないが、Tet on／offエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター及びメタロチオネインプロモーターが挙げられる。
[0255] 異種核酸配列を標的細胞中で転写させ、次いで翻訳させる一部の実施形態において、挿入タンパク質コード配列の効率的翻訳のために特定の開始シグナルを一般に含める。これらの外因性翻訳制御配列としては、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を挙げることができ、それは、種々の起源のもの、天然及び合成の両方であり得る。
[0256] 本明細書に記載のウイルスベクターは、異種核酸を広範な細胞、例として分裂及び非分裂細胞中に送達する手段を提供する。ウイルスベクターを用いて、例えばインビトロでポリペプチドを産生するため又はエクスビボ遺伝子療法のためにインビトロで細胞に目的核酸を送達することができる。ウイルスベクターは、例えば、免疫原性若しくは治療ポリペプチド又は機能性ＲＮＡを発現させるために、核酸を、それを必要とする対象に送達する方法においてさらに有用である。この様式において、ポリペプチド又は機能性ＲＮＡは、対象においてインビボで産生され得る。対象は、ポリペプチドの欠損を有するため、対象は、ポリペプチドを必要とし得る。さらに、対象におけるポリペプチド又は機能性ＲＮＡの産生がいくらかの有益な効果を付与し得るため、その方法を実施することができる。
[0257] ウイルスベクターを使用して、培養細胞又は対象において目的ポリペプチド又は機能性ＲＮＡを産生することもできる（例えば、ポリペプチドを産生するため又は例えばスクリーニング方法と連動して、対象に対する機能性ＲＮＡの効果を観察するために対象をバイオリアクターとして使用する）。
[0258] 一般に、本明細書に記載のウイルスベクターを用いて、ポリペプチド又は機能性ＲＮＡをコードする異種核酸を送達して治療ポリペプチド又は機能性ＲＮＡを送達することが有益である任意の病状を治療及び／又は予防することができる。説明的な病状としては、限定されるものではないが、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）及び肺の他の疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（β－グロビン）、貧血（エリスロポエチン）及び他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β－インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞系由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（リピートを除去するためのＲＮＡｉ）、カナバン病、筋萎縮性側索硬化症、てんかん（ガラニン、神経栄養因子）及び他の神経障害、癌（エンドスタチン、アンギオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンド、サイトカイン、例としてインターフェロン；ＲＮＡｉ、例としてＶＥＧＦ又は多剤耐性遺伝子産物に対するＲＮＡｉ、ｍｉｒ－２６ａ［例えば、肝細胞癌のため］）、糖尿病（インスリン）、筋ジストロフィー、例としてデュシェンヌ型（ジストロフィン、ミニジストロフィン、インスリン様成長因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、ａ、β、γ］、筋伸展ミオスタチンプロペプチドに対するＲＮＡｉ、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、抗炎症性ポリペプチド、例えばＩカッパＢドミナント変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、エクソンスキッピングを誘導するためのジストロフィン遺伝子中のスプライスジャンクションに対するアンチセンス又はＲＮＡｉ［例えば、国際公開第２００３／０９５６４７号を参照されたい］、エクソンスキッピングを誘導するためのＵ７ ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス［例えば、国際公開第２００６／０２１７２４号を参照されたい］及びミオスタチン又はミオスタチンプロペプチドに対する抗体又は抗体断片）及びベッカー型、筋強直性ジストロフィー１又は２、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＳＨＤ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（ａ－Ｌ－イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠損症（アデノシンデアミナーゼ）、糖原病（例えば、ファブリー病［ａ－ガラクトシダーゼ］及びポンペ病［リソソーム酸性アルファ－グルコシダーゼ］）及び他の代謝障害、先天性肺気腫（アルファ－１－アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ・サックス病（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、前頭側頭型認知症、メープルシロップ尿症（分枝鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ）、網膜変性疾患（並びに眼及び網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性症に関するＰＤＧＦ及び／又はバソヒビン又はＶＥＧＦの他のインヒビター又は例えば、Ｉ型糖尿病における網膜障害を治療／予防するための他の血管新生インヒビター）、固形臓器、例えば脳（例として、パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンギオスタチン及び／又はＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、膠芽腫［エンドスタチン、アンギオスタチン及び／又はＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］）、肝臓、腎臓、心臓、例として鬱血性心不全又は末梢動脈疾患（ＰＡＤ）（例えば、タンパク質ホスファターゼインヒビターＩ（Ｉ－１）及びその断片（例えば、ＩｌＣ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、［３２－アドレナリン受容体、２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンを誘起する分子、例えばトランケートされた構成的に活性のｂＡＲＫｃｔ；カルサルシン、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害又はドミナントネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅなどを送達することによる）の疾患、関節炎（インスリン様成長因子）、関節障害（インスリン様成長因子１及び／又は２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓを送達することによる）、心臓移植の生存率の改善（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様成長因子Ｉ）、腎臓欠損症（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（抗炎症性因子、例えばＩＲＡＰ及びＴＮＦａ可溶性受容体）、肝炎（ａ－インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠損症（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、脊髄小脳失調症、例としてＳＣＡ１、ＳＣＡ２及びＳＣＡ３、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患などが挙げられる。本明細書に開示される組成物及び方法を臓器移植後にさらに使用して移植の成功を増加させ、及び／又は臓器移植又は補助療法の有害な副作用を低減させることができる（例えば、サイトカイン産生を遮断するための免疫抑制剤又は阻害核酸の投与による）。別の例として、骨形態形成タンパク質（例として、ＢＮＰ２、７など、ＲＡＮＫＬ及び／又はＶＥＧＦ）は、例えば、癌患者における切断又は外科的除去の後に骨同種移植片とともに投与することができる。
[0259] 一部の実施形態において、本明細書に記載のウイルスベクターを用いて、ポリペプチド又は機能性ＲＮＡをコードする異種核酸を送達して肝疾患又は障害を治療及び／又は予防することができる。肝疾患又は障害は、例えば、原発性胆汁性肝硬変、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、自己免疫性肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、アルコール性肝疾患、線維症、黄疸、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、バッド・キアリ症候群、ヘモクロマトーシス、ウィルソン病、アルコール性線維症、非アルコール性線維症、肝脂肪変性、ジルベール症候群、胆道閉鎖症、アルファ－１－アンチトリプシン欠損症、アラジール症候群、進行性家族性肝内胆汁鬱滞症、血友病Ｂ、遺伝性血管浮腫（ＨＡＥ）、ホモ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｏＦＨ）、ヘテロ接合性家族性高コレステロール血症（ＨｅＦＨ）、フォン・ギールケ病（ＧＳＤ Ｉ）、血友病Ａ、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、ホモシスチン尿症、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、チロシン血症１型、アルギナーゼ１欠損症、アルギニノコハク酸リアーゼ欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素１欠損症、シトルリン血症１型、シトリン欠損症、クリグラー・ナジャール症候群１型、シスチン症、ファブリー病、糖原病１ｂ型、ＬＰＬ欠損症、Ｎ－アセチルグルタミン酸合成酵素欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、オルニチントランスロカーゼ欠損症、原発性高シュウ酸尿症１型又はＡＤＡ ＳＣＩＤであり得る。
[0260] 本明細書に記載の組成物及び方法を使用して誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）を産生することもできる。例えば、本明細書に記載のウイルスベクターを使用して幹細胞関連核酸を非多能性細胞、例えば成人線維芽細胞、皮膚細胞、肝細胞、腎細胞、脂肪細胞、心臓細胞、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞などの中に送達することができる。
[0261] 幹細胞と関連する因子をコードする核酸は、当技術分野において公知である。幹細胞及び全能性と関連するこのような因子の非限定的な例としては、Ｏｃｔ－３／４、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３及び／又はＳＯＸ１５）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆｌ、ＫＨＺ Ｋｌｆ４及び／又はＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ及び／又はＮ－ｍｙｃ）、ＮＡＮＯＧ及び／又はＬＩＮ２８が挙げられる。
[0262] 本明細書に記載の方法を実施して代謝障害、例えば糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、第ＩＸ因子又は第ＶＩＩＩ因子）、リソソーム蓄積症、例えばムコ多糖症（例えば、スライ症候群［β－グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハーラー・シャイエ症候群［アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリポ症候群Ａ［ヘパランスルファミダーゼ］、Ｂ［Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチル－ＣｏＡ：アルファ－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ－アセチルグルコサミン６－スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース－硫酸スルファターゼ］、Ｂ［β－ガラクトシダーゼ］、マロトー・ラミー症候群［Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ］など）、ファブリー病（アルファ－ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）又は糖原病（例えば、ポンペ病；リソソーム酸性アルファ－グルコシダーゼ）を治療及び／又は予防することもできる。
[0263] 遺伝子移行は、病状のための治療法を理解及び提供するための実質的な用途を有する。欠損遺伝子が公知であり、クローニングされている多数の遺伝性疾患が存在する。一般に、上記の病状は、２つのクラス：一般に劣性遺伝する、通常、酵素の欠損状態及び調節又は構造タンパク質が関与し得、典型的には優性遺伝する不均衡状態に分けられる。欠損状態の疾患について、遺伝子移行を使用して正常遺伝子を罹患組織中に補充療法のために運ぶために、及びアンチセンス変異を使用して疾患に関する動物モデルを作出することができる。不均衡病状について、遺伝子移行を使用して、モデル系における病状を作出することができ、次いでそれを病状に対抗する試行において使用することができる。したがって、本明細書に記載のウイルスベクターは、遺伝性疾患の治療及び／又は予防を可能とする。
[0264] 本明細書に記載のウイルスベクターを用いて機能性ＲＮＡを細胞にインビトロ又はインビボで提供することもできる。機能性ＲＮＡは、例えば、非コードＲＮＡであり得る。一部の実施形態において、細胞中での機能性ＲＮＡの発現は、その細胞による特定の標的タンパク質の発現を縮小させ得る。したがって、機能性ＲＮＡを投与して、特定のタンパク質の発現の減少を必要とする対象において特定のタンパク質の発現を減少させることができる。一部の実施形態において、細胞中での機能性ＲＮＡの発現は、その細胞による特定の標的タンパク質の発現を増加させ得る。したがって、機能性ＲＮＡを投与して、特定のタンパク質の発現の増加を必要とする対象において特定のタンパク質の発現を増加させることができる。一部の実施形態において、機能性ＲＮＡの発現は、細胞中での特定の標的ＲＮＡのスプライシングを調節し得る。したがって、機能性ＲＮＡを投与して、特定のＲＮＡのスプライシングの調節を必要とする対象において特定のＲＮＡのスプライシングを調節することができる。一部の実施形態において、細胞中での機能性ＲＮＡの発現は、その細胞による特定の標的タンパク質の機能を調節し得る。したがって、機能性ＲＮＡを投与して、特定のタンパク質の機能の調節を必要とする対象において特定のタンパク質の機能を調節することができる。機能性ＲＮＡは、遺伝子発現及び／又は細胞生理機能を調節し、例えば細胞若しくは組織培養系を最適化するために細胞にインビトロで又はスクリーニング方法において投与することもできる。
[0265] さらに、本明細書に記載のウイルスベクターは、診断及びスクリーニング方法において使用され、それにより目的核酸は細胞培養系中又は代わりにトランスジェニック動物モデル中で一過的又は安定的に発現される。
[0266] ウイルスベクターは、種々の非治療目的、例として、限定されるものではないが、当業者に明らかなとおり、遺伝子標的化、クリアランス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコルでの使用に使用することもできる。ウイルスベクターは、安全性（拡散、毒性、免疫原性など）を評価する目的に使用することもできる。このようなデータは、例えば、臨床有効性の評価前に規制当局承認プロセスの一部としてUnited States Food and Drug Administrationにより検討される。
[0267] 一部の実施形態において、ウイルスベクターを使用して対象において免疫応答を産生することができる。この実施形態によれば、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むウイルスベクターを対象に投与することができ、能動免疫応答が対象により免疫原性ポリペプチドに対して発揮される。免疫原性ポリペプチドは、上述のとおりである。一部の実施形態において、防御免疫応答が誘発される。
[0268] 代わりに、ウイルスベクターは、エクスビボで細胞に投与することができ、改変された細胞を対象に投与する。異種核酸を含むウイルスベクターを細胞中に導入し、細胞を対象に投与し、免疫原をコードする異種核酸が発現され得、免疫原に対する対象における免疫応答を誘導する。一部の実施形態において、細胞は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。
[0269] 「能動免疫応答」又は「能動免疫」は、「免疫原と遭遇した後の宿主組織及び細胞の関与を特徴とする。それは、リンパ細網組織中の免疫担当細胞の分化及び増殖を伴い、それらは、抗体の合成若しくは細胞媒介反応性の発達又はその両方をもたらす」。Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, in IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985)。換言すると、能動免疫応答は、感染又はワクチン接種による免疫原への曝露後に宿主により発揮される。能動免疫は、受動免疫と対比することができ、それは、能動免疫化宿主から非免疫宿主への、事前に形成された物質（抗体、移行因子、胸腺移植片、インターロイキン－２）の移行を介して獲得される。
[0270] 本明細書において使用される「防御」免疫応答又は「防御」免疫は、疾患の発生を予防するか又は低減させる点で免疫応答が対象に何らかの利益を付与することを示す。代わりに、防御免疫応答又は防御免疫は、疾患、特に癌又は腫瘍の治療及び／又は予防に有用であり得る（例えば、癌若しくは腫瘍形成を予防することにより、癌若しくは腫瘍の退縮を引き起こすことにより、及び／又は転移を予防することにより、及び／又は転移性結節の成長を予防することによる）。防御効果は、治療の利益がその任意の不利益を上回る限り、完全又は部分的であり得る。
[0271] 一部の実施形態において、異種核酸を含むウイルスベクター又は細胞は、以下に記載のとおり免疫原性有効量で投与することができる。
[0272] 一部の実施形態において、ウイルスベクターは、１つ以上の癌細胞抗原（又は免疫学的に類似する分子）又は癌細胞に対して免疫応答を産生する任意の他の免疫原を発現するウイルスベクターの投与により、癌免疫療法のために投与することができる。説明すると、癌細胞抗原をコードする異種核酸を含むウイルスベクターを投与することにより対象において癌細胞抗原に対して免疫応答を産生して、例えば癌を有する患者を治療し、及び／又は対象において癌の発生を予防することができる。ウイルスベクターは、本明細書に記載のとおり、インビボで又はエクスビボ方法を使用することにより対象に投与することができる。
[0273] 代わりに、癌抗原は、カプシドタンパク質サブユニットの一部として発現させるか、又はそうでなければタンパク質カプシドと会合させることができる（例えば、上記のとおり）。
[0274] 別の代替形態として、当技術分野において公知の任意の他の治療核酸（例えば、ＲＮＡｉ）又はポリペプチド（例えば、サイトカイン）を投与して癌を治療及び／又は予防することができる。
[0275] 本明細書において使用されるとき、「癌」という用語は、腫瘍を形成する癌を包含する。同様に、「癌性組織」という用語は、腫瘍を包含する。「癌細胞抗原」は、腫瘍抗原を包含する。
[0276] 「癌」という用語は、当技術分野において理解される意味、例えば身体の遠位部位に拡散する（すなわち転移する）潜在性を有する組織の無制御な成長の意味を有する。例示的な癌としては、限定されるものではないが、メラノーマ、腺癌、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺癌、肝癌、結腸癌、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、膵癌、脳腫瘍及び現在公知の又は後に同定される任意の他の癌又は悪性腫瘍病態が挙げられる。一部の実施形態において、腫瘍を形成する癌を治療及び／又は予防する方法が提供される。
[0277] また、「腫瘍」という用語は、例えば、多細胞生物内の未分化細胞の異常な腫瘤として当技術分野において理解される。腫瘍は、悪性又は良性であり得る。一部の実施形態において、本明細書に開示される方法を使用して悪性腫瘍を予防及び治療する。
[0278] 「癌を治療すること」、「癌の治療」という用語及び均等な用語により、癌の重症度を低減させるか若しくは少なくとも部分的に排除すること、及び／又は疾患の進行を遅延させ、及び／又は制御すること、及び／又は疾患を安定化することが意図される。一部の実施形態において、これらの用語は、癌の転移を予防するか、若しくは低減させるか、若しくは少なくとも部分的に排除すること及び／又は転移性結節の成長を予防するか、若しくは低減させるか、若しくは少なくとも部分的に排除することを示す。
[0279] 「癌の予防」又は「癌を予防すること」という用語及び均等な用語により、その方法が癌の発生及び／又は発症時の重症度を少なくとも部分的に排除するか若しくは低減させ、及び／又は遅延させることが意図される。換言すると、対象における癌の発症の可能性若しくは確率を低減させ、及び／又は発症を遅延させることができる。
[0280] 一部の実施形態において、癌を有する対象から細胞を取り出し、本明細書に記載の癌細胞抗原を発現するウイルスベクターと接触させることができる。次いで、修飾された細胞を対象に投与し、それにより癌細胞抗原に対する免疫応答が誘発される。この方法は、十分な免疫応答をインビボで発揮することができない（すなわち十分な量の促進抗体を産生することができない）免疫不全の対象について有利に用いることができる。
[0281] 免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、アルファ－インターフェロン、ベータ－インターフェロン、ガンマ－インターフェロン、オメガ－インターフェロン、タウ－インターフェロン、インターロイキン－１－アルファ、インターロイキン－１－β、インターロイキン－２、インターロイキン－３、インターロイキン－４、インターロイキン５、インターロイキン－６、インターロイキン－７、インターロイキン－８、インターロイキン－９、インターロイキン－１０、インターロイキン－１１、インターロイキン１２、インターロイキン－１３、インターロイキン－１４、インターロイキン－１８、Ｂ細胞成長因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子－アルファ、腫瘍壊死因子－β、単球走化性タンパク質－１、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子及びリンホトキシン）により向上され得ることが当技術分野において公知である。したがって、免疫調節性サイトカイン（好ましくはＣＴＬ誘導性サイトカイン）をウイルスベクターとともに対象に投与することができる。サイトカインは、当技術分野において公知の任意の方法により投与することができる。外因性サイトカインを対象に投与することができるか、又は代わりにサイトカインをコードする核酸を、好適なベクターを使用して対象に送達することができ、サイトカインをインビボで生産することができる。
対象、医薬配合物及び投与方式
[0282] 本明細書に記載のウイルスベクター及びウイルス様粒子は、獣医学的及び医学的用途の両方において使用される。好適な対象としては、トリ及び哺乳類の両方が挙げられる。本明細書において使用される「トリ」という用語には、限定されるものではないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、オウム、インコなどが含まれる。本明細書において使用される「哺乳類」という用語には、限定されるものではないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどが含まれる。ヒト対象としては、新生児、幼児、若年成人、成人及び高齢者対象が挙げられる。
[0283] 一部の実施形態において、対象は、本明細書に記載の方法が「必要」とされる。
[0284] 一部の実施形態において、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子を、薬学的に許容可能な担体及び任意選択で他の医療薬剤、医薬剤、安定化剤、緩衝剤、担体、アジュバント、希釈剤中に含む医薬組成物が提供される。注射について、担体は、典型的には、液体である。他の投与方法について、担体は、固体又は液体のいずれかであり得る。吸入投与について、担体は、吸入性であり、任意選択で固体又は液体粒子状形態であり得る。
[0285] 「薬学的に許容可能な」は、毒性でもなく、他の点で不所望でもない材料を意味し、すなわち、その材料は、いかなる不所望の生物学的効果も引き起こさずに対象に投与することができる。
[0286] 核酸を細胞にインビトロで移行させる方法も本明細書で提供される。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に好適な標準的な形質導入方法に従い、適切な感染多重度において細胞中に導入することができる。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞タイプ及び数並びに特定のウイルスベクターに応じて変動し得、過度の実験なしで当業者が決定することができる。一部の実施形態において、少なくとも約１０３感染単位、任意選択で少なくとも約１０５感染単位を細胞に導入する。
[0287] ウイルスベクターが導入される細胞は、任意のタイプのもの、例として、限定されるものではないが、神経細胞（例として、末梢及び中枢神経系の細胞、特に脳細胞、例えばニューロン及びオリゴデンドロサイト）、肺細胞、眼の細胞（例として、網膜細胞、網膜色素上皮及び角膜細胞）、上皮細胞（例えば、腸及び呼吸上皮細胞）、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞及び／又は横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（膵島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞などであり得る。一部の実施形態において、細胞は、任意の前駆細胞であり得る。さらなる可能性として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝幹細胞）であり得る。一層さらなる代替形態として、細胞は、癌又は腫瘍細胞であり得る。さらに、細胞は、上記の任意の種の起源からのものであり得る。
[0288] ウイルスベクターは、修飾された細胞を対象に投与する目的のために細胞中にインビトロで導入することができる。一部の実施形態において、細胞は、対象から取り出されており、ウイルスベクターをその中に導入し、次いで細胞を対象中に再び投与する。エクスビボでの操作のために対象から細胞を取り出し、その後に対象中に再び導入する方法は、当技術分野において公知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照されたい）。代わりに、組換えウイルスベクターは、ドナー対象からの細胞、培養細胞又は任意の他の好適な資源からの細胞中に導入することができ、細胞は、それを必要とする対象（すなわち「レシピエント」対象）に投与される。
[0289] エクスビボでの核酸送達に好適な細胞は、上記のとおりである。対象に投与する細胞の投与量は、対象の年齢、病態及び種、細胞のタイプ、細胞により発現される核酸、投与方式などにより変動する。典型的には、１用量当たり少なくとも約１０２～約１０８個の細胞又は少なくとも約１０３～約１０６個の細胞を薬学的に許容可能な担体中で投与する。一部の実施形態において、ウイルスベクターで形質導入された細胞は、医薬担体と組み合わせて有効量で対象に投与する。
[0290] 一部の実施形態において、ウイルスベクターを細胞中に導入し、細胞を対象に投与して送達されたポリペプチド（例えば、導入遺伝子として又はタンパク質カプシド中で発現される）に対する免疫原性応答を誘発することができる。典型的には、免疫原性的有効量のポリペプチドを発現する細胞の量を、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて投与する。「免疫原性的有効量」は、医薬配合物が投与される対象においてポリペプチドに対する能動免疫応答を引き起こすのに十分である、発現されるポリペプチドの量である。一部の実施形態において、投与量は、防御免疫応答（上記に定義）を産生するのに十分である。付与される防御の程度は、免疫原性ポリペプチドを投与する利益がその任意の不利益を上回る限り、完全である必要も又は恒久的である必要もない。
[0291] したがって、一部の実施形態において、核酸を細胞に投与する方法は、細胞を本明細書に記載のウイルスベクター、ウイルス粒子及び／又は組成物と接触させることを含む。
[0292] 本明細書に記載のウイルスベクター、ウイルス粒子及び／又はウイルス様粒子を対象にさらに投与する方法も本明細書で提供される。一部の実施形態において、核酸を対象に送達する方法は、対象に本明細書に記載のウイルス粒子、ウイルスベクター及び／又は組成物を投与することを含む。ウイルスベクター、ウイルス粒子及び／又はウイルス様粒子の、それを必要とするヒト対象又は動物への投与は、当技術分野において公知の任意の手段によるものであり得る。任意選択で、ウイルスベクター、ウイルス粒子及び／又はウイルス様粒子は、薬学的に許容可能な担体中において有効用量で送達する。一部の実施形態において、有効量のウイルスベクター、ウイルス粒子及び／又はウイルス様粒子を送達する。
[0293] 本明細書に記載のウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子を投与して免疫原性応答を誘発することができる（例えば、ワクチンとして）。典型的には、本発明の免疫原性組成物は、免疫原性的有効量のウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子を、薬学的に許容可能な担体と組み合わせて含む。任意選択で、投与量は、防御免疫応答（上記に定義）を産生するのに十分である。付与される防御の程度は、免疫原性ポリペプチドを投与する利益がその任意の不利益を上回る限り、完全又は永久である必要はない。対象及び免疫原は、上記のとおりである。
[0294] 対象に投与されるウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子の投与量は、投与方式、治療及び／又は予防される疾患又は病態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクター又はタンパク質カプシド並びに送達される核酸などに依存し、定型的な様式で決定することができる。一部の実施形態において、組換えＡＡＶの用量は、有効用量である。例示的な有効用量は、例えば、少なくとも約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１０１０、約１０１１、約１０１２、約１０１３、約１０１４、約１０１５形質導入単位、任意選択で約１０８～約１０１３形質導入単位の用量であり得る。一部の実施形態において、組換えＡＡＶの有効用量は、対象の体重１キログラム当たり約１×１０１１～約１×１０１５個のベクターゲノムの範囲の用量である。例えば、有効用量は、対象の体重１キログラム当たり約１×１０１１、約５×１０１１、約１×１０１２、約５×１０１２、約１×１０１３、約５×１０１３、約１×１０１４、約５×１０１４又は約１×１０１５個のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）であり得る。一部の実施形態において、投与されるＡＡＶの用量は、２．８×１０１３ｖｇ／ｋｇ又は２．９×１０１３ｖｇ／ｋｇであり得る。一部の実施形態において、用量は、２．１×１０１３ｖｇ又は３．０×１０１３ｖｇであり得る。
[0295] 一部の実施形態において、２回以上の投与（例えば、２、３、４回以上の投与）を用いて、種々の間隔の期間にわたり、例えば毎日、毎週、毎月、毎年などで所望レベルの遺伝子発現を達成することができる。
[0296] 例示的な投与方式としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介して）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、子宮内（又は卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［例として、骨格筋、横隔膜筋及び／又は心筋への投与］、皮内、胸腔内、脳内及び関節内）、局所（例えば、皮膚及び粘膜表面の両方への例として気道表面及び経皮投与）、リンパ管内など、並びに組織又は器官の直接的注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋又は脳への）が挙げられる。投与は、腫瘍へ（例えば、腫瘍又はリンパ節中で又はその付近）のものでもあり得る。任意の所与の例における最も好適な経路は、治療及び／又は予防されている病態の性質及び重症度並びに使用されている特定のベクターの性質に依存する。
[0297] 骨格筋への投与としては、限定されるものではないが、四肢（例えば、上腕、前腕、上肢及び／又は下肢）、背中、頸部、頭部（例えば、舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰及び／又は指における骨格筋への投与が挙げられる。好適な骨格筋としては、限定されるものではないが、小指外転筋（手）、小指外転筋（足）、母指外転筋、第五中足骨外転筋、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転筋、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、肘筋、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、烏口腕筋、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、二腹筋、背側骨間筋（手）、背側骨間筋（足）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、短趾伸筋、長趾伸筋、短母趾伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小趾屈筋（手）、短小趾屈筋（足）、短趾屈筋、長趾屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、大臀筋、中臀筋、小臀筋、薄筋、頸腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋、横突間筋、外側翼突筋、外側直筋、広背筋、口角挙筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋、頭最長筋、頸最長筋、胸最長筋、頭長筋、頸長筋、虫様筋（手）、虫様筋（足）、咬筋、内側翼突筋、内側直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第三腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頸筋、膝窩筋、後斜角筋、方形回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頸半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短回旋筋、ヒラメ筋、頭棘筋、頸棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頸板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸郭筋、甲状舌骨筋、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋及び小頬骨筋並びに当技術分野において公知の任意の他の好適な骨格筋が挙げられる。
[0298] ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流（任意選択で脚及び／又は腕の分離四肢灌流；例えばArruda et al., (2005) Blood 105: 3458-3464を参照されたい）及び／又は直接筋肉内注射により骨格筋に送達することができる。一部の実施形態において、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、四肢灌流、任意選択で分離四肢灌流により（例えば、静脈内又は関節内投与により）、対象（例えば、筋ジストロフィー、例えばデュシェンヌ型ジストロフィー（ＤＭＤ）又は肢帯型筋ジストロフィー（ＬＧＭＤ）を有する対象）の四肢（腕及び／又は脚）に投与する。一部の実施形態において、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、「ハイドロダイナミック」技術を用いずに有利に投与することができる。従来技術ベクターの組織送達（例えば、筋肉への）は、血管系中の圧力を増加させ、ベクターが内皮細胞バリアを通過する能力を促進するハイドロダイナミック技術（例えば、大容量の静脈内／静脈内投与）により向上されることが多い。一部の実施形態において、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、ハイドロダイナミック技術、例えば大容量の注入及び／又は上昇した血管内圧（例えば、正常の収縮期圧よりも高い、例えば正常の収縮期圧に対して血管内圧の増加が５％、１０％、１５％、２０％、２５％以下）の不存在下で投与することができる。このような方法は、ハイドロダイナミック技術に伴う副作用、例えば浮腫、神経損傷及び／又はコンパートメント症候群を低減させるか又は回避し得る。心筋への投与としては、左心房、右心房、左心室、右心室及び／又は中隔への投与が挙げられる。ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、静脈内投与、動脈内投与、例えば大動脈内投与、直接心臓注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室中に）及び／又は冠動脈灌流により心筋に送達することができる。
[0299] 横隔膜筋への投与は、任意の好適な方法、例として静脈内投与、動脈内投与及び／又は腹腔内投与によるものであり得る。
[0300] 標的組織への送達は、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子を含むデポ剤を送達することによっても達成することができる。本明細書に記載されるとき、「デポ剤」の送達は、ウイルスが標準的注射について考えられるよりも長い期間作用し得るようにウイルスの徐放及び／又は漸次的な広がりを可能とする持続作用配合物の投与を指す。一部の実施形態において、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子を含むデポ剤を骨格筋、心筋及び／又は横隔膜筋組織中に埋め込み又は組織を、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子を含むフィルム若しくは他のマトリックスと接触させることができる。このような移植可能なマトリックス又は基材は、米国特許第７，２０１，８９８号に記載される。
[0301] 一部の実施形態において、それによるウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、骨格筋、横隔膜筋及び／又は心筋に投与する（例えば、筋ジストロフィー、心疾患［例えば、ＰＡＤ又は鬱血性心不全］を治療及び／又は予防するため）。
[0302] 一部の実施形態において、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して骨格筋、心筋及び／又は横隔膜筋の疾患又は障害を治療及び／又は予防する。筋肉の疾患又は障害は、例えば、筋ジストロフィー、ミオパチー、運動ニューロン疾患及び心筋症であり得る。筋肉の疾患又は障害は、例えば、ジストロフィノパチー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー（例えば、筋強直性ジストロフィー１及び２型）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（ＦＤＨＤ）、エメリー・ドライフス型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、先天性筋ジストロフィー、若年性黄斑ジストロフィー、中心核ミオパチー、セントラルコアミオパチー及び封入体筋炎であり得る。
[0303] 一部の実施形態において、筋ジストロフィーの治療及び／又は予防を必要とする対象において筋ジストロフィーを治療及び／又は予防する方法であって、治療又は予防有効量のウイルスベクターを哺乳類対象に投与することを含み、ウイルスベクターは、ジストロフィン、ミニジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、抗炎症性ポリペプチド、例えばＩカッパＢドミナント変異体、サルコスパン、ユートロフィン、マイクロジストロフィン、ラミニン－ａ２、アルファ－サルコグリカン、ベータ－サルコグリカン、ガンマ－サルコグリカン、デルタ－サルコグリカン、ＩＧＦ－１、ミオスタチン若しくはミオスタチンプロペプチドに対する抗体若しくは抗体断片及び／又はミオスタチンに対するＲＮＡｉをコードする異種核酸を含む、方法が提供される。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、本明細書の他箇所に記載のとおり骨格筋、横隔膜筋及び／又は心筋に投与することができる。
[0304] 代わりに、本明細書に記載の方法を実施して核酸を骨格筋、心筋又は横隔膜筋に送達することができ、それは、血中を正常に循環するポリペプチド（例えば、酵素）若しくは機能性ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の産生又は他の組織への全身送達のためのプラットフォームとして使用して障害（例えば、代謝障害、例えば糖尿病［例えば、インスリン］、血友病［例えば、第ＩＸ因子又は第ＶＩＩＩ因子］、ムコ多糖症［例えば、スライ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群など］若しくはリソソーム蓄積症、例えばゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］若しくはファブリー病［ａ－ガラクトシダーゼＡ］若しくは糖原病、例えばポンペ病［リソソーム酸性アルファグルコシダーゼ］）を治療及び／又は予防する。代謝障害の治療及び／又は予防に好適な他のタンパク質は、本明細書に記載される。目的核酸を発現させるためのプラットフォームとしての筋肉の使用は、米国特許出願公開第２００２／０１９２１８９号に記載される。
[0305] 一部の実施形態において、代謝障害の治療及び／又は予防を必要とする対象において代謝障害を治療及び／又は予防する方法は、治療又は予防有効量のウイルスベクターを対象の骨格筋に投与することを含み、ウイルスベクターは、ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、代謝障害は、そのポリペプチドの欠損及び／又は欠乏の結果である。説明的な代謝障害及びポリペプチドをコードする異種核酸は、本明細書に記載される。任意選択で、ポリペプチドは、分泌される（例えば、天然状態で分泌ポリペプチドであるか、又は例えば当技術分野において公知の分泌シグナル配列との作動可能な会合により分泌されるようにエンジニアリングされたポリペプチド）。本発明のいかなる特定の理論にも制限されずに、この実施形態によれば、骨格筋への投与は、全身循環中へのポリペプチドの分泌及び標的組織への送達をもたらし得る。ウイルスベクターを骨格筋へ送達する方法は、本明細書により詳細に記載される。
[0306] 本明細書に記載の方法を実施して非コードＲＮＡ、例えばアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ又は他の機能性ＲＮＡ（例えば、リボザイム）を全身送達のために産生することもできる。
[0307] 一部の実施形態において、先天性心不全又はＰＡＤの治療及び／又は予防を必要とする対象において先天性心不全又はＰＡＤを治療及び／又は予防する方法は、治療又は予防有効量のウイルスベクターを哺乳類対象に投与することを含み、ウイルスベクターは、例えば、筋小胞体Ｃａ２＋－ＡＴＰアーゼ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、血管新生因子、ホスファターゼインヒビターＩ（Ｉ－１）及びその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害又はドミナントネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、ベータ－２－アドレナリン受容体、ベータ－２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ＰＩ３キナーゼ、カルサルカン、β－アドレナリン受容体キナーゼインヒビター（ＰＡＲＫｃｔ）、タンパク質ホスファターゼ１のインヒビター１及びその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンを誘起する分子、例えばトランケートされた構成的に活性のｂＡＲＫｃｔ、Ｐｉｍ－１、ＰＧＣ－Ｉα、ＳＯＤ－１、ＳＯＤ－２、ＥＣ－ＳＯＤ、カリクレイン、ＨＩＦ、チモシン－ｐ４、ｍｉｒ－１、ｍｉｒ－１３３、ｍｉｒ－２０６、ｍｉｒ－２０８及び／又はｍｉｒ－２６ａをコードする異種核酸を含む。
[0308] 注射剤は、慣用の形態において、液体の液剤又は懸濁液、注射前の液体中の液剤又は懸濁液に好適な固体形態又はエマルションのいずれかとして調製することができる。代わりに、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、全身的ではなく、局部的に例えばデポ剤又は徐放性配合物において投与することができる。さらに、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、外科的に移植可能なマトリックス（例えば、米国特許出願公開第２００４－００１３６４５－Ａ１号に記載）に付着させて送達することができる。
[0309] 本明細書に開示されるウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、任意の好適な手段により、任意選択で対象が吸入するウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子からなる吸入性粒子のエアロゾル懸濁液を投与することにより対象の肺に投与することができる。吸入性粒子は、液体又は固体であり得る。ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子を含む液体粒子のエアロゾルは、任意の好適な手段により、例えば当業者に公知の圧力駆動のエアロゾル噴霧器又は超音波噴霧器を用いて生産することができる。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子を含む固体粒子のエアロゾルは、薬学分野において公知の技術により、任意の固体粒子状医薬エアロゾル発生器を用いて同様に生産することができる。
[0310] ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子はＣＮＳの組織（例えば、脳、眼）に投与することができ、本明細書に記載の組成物及び方法の不存在下で観察されるよりも広範なウイルスベクター又はウイルス様粒子の分布を有利にもたらし得る。
[0311] 一部の実施形態において、本明細書に記載のウイルスベクターを投与してＣＮＳの疾患、例として遺伝性障害、神経変性障害、精神障害及び腫瘍を治療することができる。ＣＮＳの説明的な疾患としては、限定されるものではないが、副腎脊髄ニューロパチー（ＡＭＮ）、アルツハイマー病、アンジェルマン症候群、前頭側頭型認知症、パーキンソン病、ハンチントン病、脆弱Ｘ症候群、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥレット症候群、原発性側索硬化症、筋委縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊髄又は頭部損傷に起因する外傷、テイ・サックス病（ＧＭ２ガングリオシドーシス）、レッシュ・ナイハン病、ＭＣ４Ｒ肥満症、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ＭＰＳ Ｉ（ハーラー／シャイエ）、ＭＰＳ ＩＩＩＡ（サンフィリポＡ）、ニーマン・ピックＣ１、レット症候群、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ＡＡＤＣ欠損症、単一遺伝子性筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルファマンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、ドラベ症候群、巨大軸索ニューロパチー、球様細胞白質萎縮症（クラッベ）、Ｇｌｕｔ１欠損症、ＧＭ１ガングリオシドーシス、小児神経セロイドリポフスチン症（ＩＮＣＬ、バッテン）、若年性神経セロイドリポフスチン症（ＪＮＣＬ、バッテン）、遅発性乳児型神経セロイドリポフスチン症（ＬＩＮＣＬ、バッテン）、ＭＰＳ ＩＩ（ハンター）、ＭＰＳ ＩＩＩＢ（サンフィリポＢ）、ＭＰＳ ＩＩＩＣ（サンフィリポＣ）、ＭＰＳ ＩＶＡ（モルキオ症候群）、ＭＰＳ ＶＩ（マロトー・ラミー）、ペルオキシソーム形成異常症（ツェルウェガー症候群スペクトラム）、サンドホフ病（ＧＭ２ガングリオシドーシス）、てんかん、脳梗塞、精神障害、例として気分障害（例えば、鬱病、双極性感情障害、持続性感情障害、二次的気分障害）、統合失調症、薬物依存症（例えば、アルコール依存症及び他の物質依存症）、神経症（例えば、不安、強迫観念障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、産後鬱病）、精神病（例えば、幻覚及び妄想）、認知症、偏執症、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛性障害、摂食又は体重障害（例えば、肥満症、悪液質、神経性食欲不振及び過食症）並びにＣＮＳの癌及び腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）が挙げられる。
[0312] ＣＮＳの障害としては、網膜、後索路（posterior tract）及び視神経が関与する眼科障害（例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症及び他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢黄斑変性、緑内障）が挙げられる。
[0313] 眼科疾患及び障害は、全てでないにしてもほとんど、３つのタイプの適応症：（１）血管新生、（２）炎症、及び（３）変性の１つ以上と関連する。本明細書に記載のウイルスベクターを用いて抗血管新生因子；抗炎症性因子；細胞変性を遅らせるか、細胞温存を促進するか、又は細胞成長を促進する因子及び前述の組み合わせを送達することができる。
[0314] 糖尿病性網膜症は、例えば、血管新生を特徴とする。糖尿病性網膜症は、１つ以上の抗血管新生因子を眼内（例えば、硝子体中）又は眼周囲（例えば、テノン嚢下領域中）のいずれかに送達することにより治療することができる。１つ以上の神経栄養因子を眼内（例えば、硝子体内）又は眼周囲のいずれかに同時送達することもできる。
[0315] ブドウ膜炎は、炎症を伴う。１つ以上の抗炎症性因子は、ウイルスベクターの眼内（例えば、硝子体又は前眼房）投与により投与することができる。
[0316] 網膜色素変性症は、比較により網膜変性を特徴とする。一部の実施形態において、網膜色素変性症は、１つ以上の神経栄養因子をコードするウイルスベクターの眼内（例えば、硝子体投与）により治療することができる。
[0317] 加齢黄斑変性は、血管新生及び網膜変性の両方を伴う。この障害は、１つ以上の神経栄養因子をコードする本発明のウイルスベクターを眼内（例えば、硝子体）に投与すること及び／又は１つ以上の抗血管新生因子を眼内又は眼周囲（例えば、テノン嚢下領域内）に投与することにより治療することができる。
[0318] 緑内障は、眼圧の増加及び網膜神経節細胞の損失を特徴とする。緑内障の治療としては、本発明のウイルスベクターを使用する興奮毒性損傷から細胞を保護する１つ以上の神経保護剤の投与が挙げられる。このような薬剤としては、眼内、任意選択で硝子体内に送達されるＮ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカイン及び神経栄養因子が挙げられる。
[0319] 一部の実施形態において、本明細書に記載の組成物及び方法を使用して発作を治療し、例えば発作の発症、発生率又は重症度を低減させることができる。発作のための治療的治療の有効性は、行動的手段（例えば、振戦、眼又は口のチック）及び／又は脳波的手段（ほとんどの発作は、固有の脳波異常を有する）により評価することができる。したがって、経時的な複数の発作を特徴とするてんかんを治療することもできる。
[0320] 一部の実施形態において、治療を必要とする対象を治療する方法は、対象に、カプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシドを含むＡＡＶベクターを投与することを含み、カプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１６５～１８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、配列番号１７５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含むカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシドを含む。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、配列番号１７５のアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含むカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシドを含む。一部の実施形態において、対象は、ドラベ症候群を有する。一部の実施形態において、対象は、レット症候群を有する。一部の実施形態において、対象は、アンジェルマン症候群を有する。一部の実施形態において、対象は、ニーマン・ピック病を有する。一部の実施形態において、対象は、脆弱Ｘ症候群を有する。一部の実施形態において、対象は、アルツハイマー病を有する。一部の実施形態において、対象は、ゴーシェ病を有する。一部の実施形態において、対象は、ハンチントン病を有する。一部の実施形態において、対象は、パーキンソン病を有する。一部の実施形態において、対象は、フリードライヒ運動失調症を有する。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、対象に脳室内（ＩＣＶ）注射により投与する。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、対象に髄腔内（ＩＴ）注射により投与する。一部の実施形態において、ＡＡＶベクターは、対象に静脈内（ＩＶ）注射により投与する。
[0321] 一部の実施形態において、治療を必要とする対象を治療する方法は、対象に、カプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシドを含むＡＡＶベクターを投与することを含み、カプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１７５又は１８０のアミノ酸配列を含み、対象は、ドラベ症候群、レット症候群、アンジェルマン症候群、ニーマン・ピック病又は脆弱Ｘ症候群を有し、ＡＡＶベクターを対象にＩＣＶ又はＩＴ注射により投与する。
[0322] 一部の実施形態において、治療を必要とする対象を治療する方法は、対象に、カプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシドを含むＡＡＶベクターを投与することを含み、カプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１７５又は１８０のアミノ酸配列を含み、対象は、ゴーシェ病、ハンチントン病、パーキンソン病又はフリードライヒ運動失調症を有し、ＡＡＶベクターを対象にＩＣＶ又はＩＴ注射により投与する。
[0323] 一部の実施形態において、ウイルスベクターを使用してソマトスタチン（又はその活性断片）を脳に投与して下垂体腫瘍を治療する。この実施形態によれば、ソマトスタチン（又はその活性断片）をコードするウイルスベクターは、下垂体中にマイクロインフュージョンにより投与する。同様に、このような治療を使用して末端肥大症（下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を治療することができる。ソマトスタチンの核酸（例えば、GenBankアクセッション番号J00306）及びアミノ酸（例えば、GenBankアクセッション番号P01166；プロセッシングされた活性ペプチドソマトスタチン－２８及びソマトスタチン－１４を含有する）配列は、当技術分野において公知である。
[0324] 一部の実施形態において、ウイルスベクターは、米国特許第７，０７１，１７２号に記載の分泌シグナルを含み得る。
[0325] 一部の実施形態において、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、ＣＮＳに（例えば、脳又は眼に）投与する。ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、脊髄、脳幹（延髄、橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果腺）、小脳、終脳（線条体、大脳、例として後頭、側頭、頭頂及び前頭葉、皮質、基底核、海馬及び扁桃体門）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳及び下丘中に導入することができる。ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、眼の異なる領域、例えば網膜、角膜及び／又は視神経に投与することもできる。
[0326] ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、ベクターのより分散した投与のために、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺により）送達することができる。ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、血液脳関門が障害を受けた状況（例えば、脳腫瘍又は脳梗塞）において、ＣＮＳにさらに血管内投与することができる。
[0327] ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、当技術分野において公知の任意の経路、例として、限定されるものではないが、髄腔内、眼内、脳内、心室内、静脈内（例えば、糖、例えばマンニトールの存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）及び眼周囲（例えば、テノン嚢下領域）送達並びに運動ニューロンへの逆行送達を伴う筋肉内送達により、ＣＮＳの所望の領域に投与することができる。一部の実施形態において、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、液体配合物でＣＮＳ中の所望の領域又はコンパートメントに直接注射（例えば、定位的注射）により投与する。一部の実施形態において、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、所望の領域への局所適用又はエアロゾル配合物の鼻腔内投与により提供することができる。眼への投与は、液滴の局所適用によるものであり得る。さらなる代替形態として、ウイルスベクター及び／又はウイルス様粒子は、固体の徐放性配合物として投与することができる（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照されたい）。
[0328] 一部の実施形態において、ウイルスベクターを逆行輸送に使用して運動ニューロンが関与する疾患及び障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など）を治療及び／又は予防することができる。例えば、ウイルスベクターは筋組織に送達することができ、それはそこからニューロン中に移動し得る。
実施例
[0329] 以下の実施例は、説明目的のために本明細書に含まれるにすぎず、限定を意図しない。本明細書において使用されるとき、ＳＴＲＤ．１０１及びＳＴＲＤ．１０２という用語は、カプシドタンパク質サブユニット配列を記載するために使用し、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１及びＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０２は、組換え又は修飾カプシドタンパク質サブユニット配列を含むＡＡＶベクターを記載するために使用する。しかしながら、ＳＴＲＤ．１０１及びＳＴＲＤ．１０２という用語は、一部の文脈において当業者に明らかなとおり、名称カプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシドを含むＡＡＶベクターを記載するために使用することができる。
実施例１．抗体回避ＡＡＶベクターのコンビナトリアルエンジニアリング及び選択
[0330] 抗体回避ＡＡＶ変異体を以下の方法に従って調製する。第１のステップは、例えば、低温電子顕微鏡法を使用するＡＡＶカプシドタンパク質カプシド表面上の立体構造３Ｄ抗原性エピトープの同定を含む。次いで、抗原性モチーフ内の選択残基を、ヌクレオチドＮＮＫにより置換されたそれぞれのコドンを有する縮重プライマーを使用する変異誘発に供し、遺伝子断片をGibsonアセンブリ及び／又はマルチステップＰＣＲにより一緒に合わせる。変異抗原性モチーフの縮重ライブラリーを含有するカプシドタンパク質サブユニットコード遺伝子を野生型ＡＡＶゲノム中にクローニングして元のＣａｐコードＤＮＡ配列を置き換え、プラスミドライブラリーを生じさせる。次いで、プラスミドをアデノウイルスヘルパープラスミドとともに２９３産生細胞系中に形質移入してＡＡＶカプシドタンパク質サブユニットライブラリーを生成し、次いでそれを選択に供することができる。ＡＡＶライブラリーの良好な生成は、ＤＮＡシーケンシングを介して確認する。
[0331] 中和抗体（ＮＡｂ）を避け、及び／又は中枢神経系（ＣＮＳ）を標的化し得る新たなＡＡＶ株を選択するため、ＡＡＶライブラリーを非ヒト霊長類における複数のラウンドの感染に供する。それぞれの段階において、目的組織を動物対象から単離する。目的組織からハーベストされた細胞溶解物をシーケンシングして抗体中和を避けるＡＡＶ単離体を同定する。非ヒト霊長類における複数のラウンドの感染後、それぞれの変異誘発領域からの単離配列を全ての順列及び組み合わせで組み合わせる。
[0332] 具体例として、ＡＡＶカプシドタンパク質サブユニット上の一般的な抗原性モチーフ（ＶＰ１）を上記のとおり変異誘発に供した。次いで、縮重ライブラリー（図１Ａ）を非ヒト霊長類における第１のラウンドの感染に供した（静脈内注射）。組織を感染後７日目にハーベストし、シーケンシングして単一のＡＡＶ単離体を同定した。
[0333] 種々の組換えＡＡＶ単離体を組織サンプル、例として脊髄、後根神経節、前頭葉、側頭葉、後頭葉、被殻、淡蒼球、視床、扁桃体、海馬、黒質、橋、小脳中で同定した。この第１のラウンドの進化からの結果を図１Ｂに示す。
[0334] 次いで、第１のラウンドの進化（図１Ｂ）中に単離された組換えＡＡＶを第２の非ヒト霊長類中に再導入した。組織を感染後７日目にハーベストし、シーケンシングして単一のＡＡＶ単離体を同定した。この第２のラウンドの進化からの結果を図１Ｃに示す。
[0335] 最大頻度を有する組換えＡＡＶをシーケンシングした。これらのＡＡＶ中に存在する置換を表７．１及び７．２に示す。これらのデータは、表７．１及び７．２に列記される置換を含むカプシドタンパク質サブユニットを有する組換えＡＡＶビリオンが非ヒト霊長類においてインビボで中和抗体を回避し、所望の標的組織についてのトロピズムを有することを実証する。
実施例２：組換えＡＡＶベクターの製造性
[0336] 実施例１において同定された種々の組換えＡＡＶをラージスケール系で製造することができるか否かを判定するため、ＡＡＶを標準的方法に従って産生し、収量を野生型ＡＡＶベクターのものと比較した。
[0337] ＡＡＶを標準的三重形質移入プロトコルに従ってＨＥＫ２９３細胞中で産生した。簡潔に述べると、細胞を、（ｉ）野生型ＡＡＶ９カプシドタンパク質サブユニット配列、ＳＴＲＤ．１０１カプシドタンパク質サブユニットバリアント配列（配列番号１８０）又はＳＴＲＤ．１０２カプシドタンパク質サブユニットバリアント配列（配列番号１７５）のいずれかを含むプラスミド、（ｉｉ）５’ＩＴＲ、導入遺伝子及び３’ＩＴＲ配列を含むプラスミド、並びに（ｉｉ）ＡＡＶ産生に必要なヘルパー遺伝子を含むプラスミドで形質移入した。２つの異なる導入遺伝子を自己相補的構築物中でそれぞれのカプシドタンパク質サブユニットとともに使用した。続いて、細胞を溶解させ、親和性カラム、ＣｓＣｌ密度超遠心及び透析を使用してビリオンを精製した。続いて、ＰＣＲベース定量アプローチを使用してそれぞれのＡＡＶの収量を測定した。
[0338] 図２に示されるとおり、ＳＴＲＤ．１０１及びＳＴＲＤ．１０２カプシドタンパク質サブユニットを含む組換えＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ９の収量と類似の収量を有した。このデータは、組換えカプシドタンパク質サブユニットを含む組換えＡＡＶが商業的製造に好適であることを裏付ける。
実施例３：組換えＡＡＶウイルスベクターを使用するインビトロ形質導入
[0339]
実施例１の組換えＡＡＶベクターが一般に感染性であり、培養物中で細胞を形質導入し得るか否かを確認するため、種々のＡＡＶベクターを標準的プロトコルに従って調製した。
[0340] 組換えＡＡＶの感染力は、標準的ＴＣＩＤ５０アッセイを使用して試験した。簡潔に述べると、ＨｅＬａＲＣ３２細胞に組換えＡＡＶ粒子をアデノウイルス（Ａｄ５）の存在下で５桁に及ぶ用量で感染させた。７２時間後、ＤＮＡを抽出し、ベクターゲノム複製をｑＰＣＲにより定量した。
[0341] 粒子と感染力との比を計算して感染力を決定した。図３に示されるとおり、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１ベクターの感染力比は、野生型ＡＡＶ９のものと比較して低かった。感染力比が低いほど高い効力を意味するため、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１は、野生型ＡＡＶ９よりも感染性が高い。
[0342] 別個に、感染力を種々の細胞系においても決定した。ルシフェラーゼ導入遺伝子をパッケージングする組換えＡＡＶを生成し、細胞当たり１０，０００ベクターゲノム（ｖｇ）の用量で培養物中において細胞と接触させた。感染４８時間後、細胞を溶解させた。溶解物を生物発光基質と接触させ、相対蛍光単位（ＲＦＵ）を測定した。図４Ａ～４Ｄに示されるとおり、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１ベクターは、Ｕ８７細胞（ヒト膠芽腫細胞系、図４Ａ）、Ｎ２Ａ細胞（マウス神経堤由来細胞系、図４Ｂ）、ＳＹ５Ｙ細胞（ヒト神経芽腫細胞系、図４Ｃ）及びＵ２ＯＳ細胞（ヒト骨肉腫細胞系、図４Ｄ）に野生型ＡＡＶ９と同等のレベルで感染した。
[0343] したがって、このデータは、実施例１の組換えＡＡＶベクターが培養物中で細胞を有効に形質導入し得ることを実証する。
実施例４：中枢神経系を標的化する組換えＡＡＶのインビボ特徴付け
[0344] 組換えカプシドタンパク質サブユニットＳＴＲＤ．１０１及びＳＴＲＤ．１０２をインビボ特徴付けのために選択した。これらのカプシドタンパク質サブユニットを含み、天然tdTomato蛍光導入遺伝子をパッケージングする組換えＡＡＶを生成した。組換えＡＡＶを新生児マウスに脳室内注射により０日目に投与した。注射３週間後、脳組織をハーベストし、固定してtdTomato蛍光の目視評価により発現を評価した。図５は、４％ＰＦＡでの固定２４時間後の冠状ビブラトーム切片におけるtdTomato発現を示す代表的な画像を提供する。これらの同じ切片を免疫組織化学法も使用して可視化した（図６）。図５及び図６の画像に示されるとおり、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０２及びＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１ベクターはそれぞれ脳組織中の異なる分布を有し、最大導入遺伝子発現は注射部位付近に局在した。まとめると、このデータは、試験された組換えＡＡＶが導入遺伝子を標的細胞にインビボで脳室内注射後に良好に送達することを示す。
[0345] tdTomatoをパッケージングするＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１及びＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０２ベクターを４匹の成体マウスにも静脈内注射により５．５×１０１３ｖｇ／ｋｇの用量で投与した。注射３週間後、肝臓及び心臓をハーベストし、固定してtdTomato蛍光の目視評価により発現プロファイルを評価した。
[0346] ４％ＰＦＡでの固定２４時間後のビブラトーム肝切片においてtdTomato発現を示す１匹のマウスからの代表的画像を図７に提供する。特に、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０２及びＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１ベクターは、野生型ＡＡＶ９と比較して肝臓に脱標的化された。進化中に肝臓におけるカウンタースクリーンを実施しなかったため、この所望の特性は、予想外であった。
[0347] ４％ＰＦＡでの固定２４時間後のビブラトーム心切片においてtdTomato発現を示す１匹のマウスからの代表的な画像を図８に提供する。特に、試験されたベクターは、心臓について異なるトロピズムを有した。具体的には、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０２ベクターは、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１と比較して心臓において感染性が低かった。進化中に心臓スクリーンは、実施しなかったため、この示差的な形質導入は、全く予想外であった。
[0348] まとめると、このデータは、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０２及びＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１ベクターを良好に使用してＣＮＳ組織をインビボで標的化し、肝臓によるクリアランスを回避することができ、それらが遺伝子療法のための強力なツールであることを示す。これらの異なるトロピズムを考慮すると（すなわち、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１は、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０２よりも心臓において感染性が高い）、これらのベクターは、具体的に所望の組織に対する標的遺伝子療法治療のための強力なツールである。
実施例５：非ヒト霊長類における組換えＡＡＶの生体分布
[0349] 組換えＡＡＶを非ヒト霊長類に投与して生体分布を決定した。組換えＡＡＶを静脈内（ＩＶ）及び脳室内（ＩＣＶ）注射により投与した（図９）。ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１は、ＩＶ注射により１キログラム当たり２．９×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）、ＩＣＶ注射により２．１×１０１３ｖｇの用量で投与した（黒色点）。ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０２は、ＩＶ注射により２．８×１０１３ｖｇ／ｋｇ、ＩＣＶ注射により３．０×１０１３ｖｇの用量で投与した（白色点）。３０日後、動物を犠死させ、種々のＣＮＳ組織中のウイルス負荷をｑＰＣＲにより測定した。
[0350] 図９に示されるとおり、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０２及びＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１の両方が種々のＣＮＳ組織に感染した。さらに、ＡＡＶが高レベルの形質導入を示したため、このデータは、それらのＡＡＶがインビボで中和抗体を回避する可能性が高いことを示唆する。
実施例６：治療を必要とする対象を治療する細胞療法の方法
[0351] ＡＡＶベクターをエクスビボで使用して細胞を形質導入した。一部の目的のため、細胞はオートロガス（すなわち治療される対象に由来）又はアロジェニック（すなわち異なる対象／ドナーに由来）であり得る。ＡＡＶを使用する細胞の形質導入後及び導入遺伝子の発現を確認した後、標準的臨床方法を使用して細胞を対象に投与する。
[0352] 細胞は、対象に１回投与することができるか、又は投与を複数回繰り返すことができる。投与される細胞の数は、例えば、治療される疾患又は病態、対象の疾患／病態の重症度並びに体重の身長及び体重に応じて変動する。
実施例７：治療を必要とする対象を治療する遺伝子療法の方法
[0353] 本明細書に記載のＡＡＶベクター（例えば、配列番号１７５又は１８０の配列を有するカプシドタンパク質サブユニットを含むＡＡＶベクター）を、それを必要とする対象に投与し、対象は、ＣＮＳの疾患又は障害を有する。ＡＡＶベクターは、対象に１回投与するか、又は投与を複数回繰り返すことができる。投与は、１つ以上の経路、例えば静脈内（ＩＶ）、脳室内（ＩＣＶ）又は髄腔内（ＩＴ）注射によるものである。ＡＡＶベクターの用量は、例えば、治療される疾患又は病態、対象の疾患／病態の重症度並びに体重の身長及び体重に応じて変動する。例えば、ＡＡＶベクターをＩＶ注射により投与する場合、対象に投与されるＡＡＶの用量は、２．８×１０１３ｖｇ／ｋｇ又は２．９×１０１３ｖｇ／ｋｇであり得る。ＡＡＶベクターをＩＣＶ注射により投与する場合、用量は２．１×１０１３ｖｇ又は３．０×１０１３ｖｇであり得る。一部のプロトコルにおいて、ＡＡＶベクターを対象にＩＶ及びＩＣＶ注射の両方により投与することができる。
実施例８：哺乳動物細胞における組換えＡＡＶベクターの調製
[0354] ３つのプラスミドを提供する。第１のプラスミドは、２つのＩＴＲ（配列番号３００３及び３００４）によりフランキングされたＮＰＣ１をコードする導入遺伝子（配列番号３００２）を含む導入カセットを含む。第１のプラスミドは、配列番号３０１４～３０１９のいずれか１つの配列を含む。第２のプラスミドは、Ｒｅｐ及びＣａｐ遺伝子をコードする配列を含む。第３のプラスミドは、ＡＡＶ産生に要求される種々の「ヘルパー」配列（Ｅ４、Ｅ２ａ及びＶＡ）を含む。
[0355] ３つのプラスミドを、適切な形質移入試薬（例えば、Lipofectamine（商標））を使用して、ウイルス産生細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）中に形質移入する。３７℃での所定期間のインキュベーション後、ＡＡＶ粒子を培地から収集するか、又は細胞を溶解させてＡＡＶ粒子を放出させる。次いで、ＡＡＶ粒子を精製し、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）又は液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）のいずれかを標準的方法に従って使用して力価測定する。ＡＡＶ粒子は、後の使用のために－８０℃で貯蔵することができる。
実施例９：昆虫細胞中での組換えＡＡＶベクターの調製
[0356] 第１の組換えバキュロウイルスベクターを提供する。第１の組換えバキュロウイルスベクターは、２つのＩＴＲ（配列番号３００３及び３００４）によりフランキングされたＮＰＣ１をコードする導入遺伝子（配列番号３００２）を含む導入カセット配列を含む。導入カセットは、配列番号３０１４～３０１９のいずれか１つの配列を含む。
[0357] 昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）に、懸濁液培養物中で第１の組換えバキュロウイルスベクター並びにＡＡＶ Ｒｅｐ及びＣａｐタンパク質（例えば、ＳＴＲＤ．１０１又はＳＴＲＤ．０１２カプシドタンパク質サブユニット）コードする配列を含む少なくとも１つの追加の組換えバキュロウイルスベクターを共感染させる。２８℃での所定期間のインキュベーション後、ＡＡＶ粒子を培地から収集するか、又は細胞を溶解させてＡＡＶ粒子を放出させる。次いで、ＡＡＶ粒子を精製し、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）又は液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）のいずれかを標準的方法に従って使用して力価測定する。ＡＡＶ粒子は、後の使用のために－８０℃で貯蔵することができる。
実施例１０：インビトロ効力アッセイ
[0358] 本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットが培養細胞中でＮＰＣ１リソソーム表現型をレスキューし得るか否かを判定するため、ｈＮＰＣ１導入カセット（配列番号３０１４）をパッケージングする組換えＡＡＶ２ベクターを、ＨＥＫ２９３細胞中で三重形質移入プロトコル（例えば、実施例１を参照されたい）を使用して調製した。次いで、ＡＡＶ２－ｈＮＰＣ１ベクターを使用して、野生型Ｕ２ＯＳ細胞（骨肉腫）及びＮＰＣ１を発現しないＵ２ＯＳ細胞（ＮＰＣ－／－）をインビトロで５×１０３（５Ｋ）又は１０×１０３（１０Ｋ）のいずれかの感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。次いで、細胞を５％ＣＯ２雰囲気中において３７℃でインキュベートした。
[0359] ＮＰＣ１細胞は、リソソーム中でコレステロールの特徴的な蓄積を呈し、それは、細胞中のリソソームのサイズ及び数を観察することによりモニタリングすることができる。このアッセイにおいて、細胞中の蛍光オルガネラ色素LysoTracker（登録商標）（ThermoFisher Scientific（登録商標））の蓄積を測定することによりリソソーム表現型をモニタリングした。ＡＡＶ２－ｈＮＰＣ１ベクターでの形質導入の７２時間後、５０ｍＭのLysoTracker（登録商標）を細胞に添加した。２時間後、細胞を固定し、LysoTracker（登録商標）蛍光を測定した。
[0360] 結果を図１０Ａに示す。予測されるとおり、野生型Ｕ２ＯＳ細胞は、リソソーム中のLysoTracker（登録商標）蛍光の有意な蓄積を示さなかった一方、ＮＰＣ１－／－細胞は、それを示した。ＡＡＶ２－ｈＮＰＣ１を５Ｋ又は１０ＫのいずれかのＭＯＩで形質導入された細胞は、リソソーム中のLysoTracker（登録商標）蛍光の有意に低減した蓄積を有した。
[0361] 別個のアッセイにおいて、ｈＮＰＣ１を形質導入された細胞を固定し、コレステロールについての組織化学的染色剤のフィリピンを使用して染色した。フィリピン染色剤は、ストレプトマイセス・フィリピネンシス（Streptomyces filipinensis）に由来し、Polysciencesから購入し、５０μｇ／ｍＬの最終濃度で使用した。Pico Automated Cell Imaging System（ImageXpress（登録商標））を使用して細胞を可視化し、フィリピン染色剤を定量した。結果を図１０Ｂに示す。予測されるとおり、野生型Ｕ２ＯＳ細胞は、有意なコレステロール蓄積を示さなかった一方、ＮＰＣ１－／－細胞は、それを示した。ＡＡＶ２－ｈＮＰＣ１を５Ｋ又は１０ＫのいずれかのＭＯＩで形質導入された細胞は、有意に低減したコレステロール蓄積を有した。
[0362] まとめると、これらのデータは、ＡＡＶ２－ｈＮＰＣを使用する細胞の形質導入がＮＰＣ１欠損Ｕ２ＯＳ細胞におけるリソソーム表現型を良好にレスキューしたことを示す。
実施例１１：インビボ効力アッセイ
[0363] 本明細書に記載のＡＡＶ導入カセットがインビボでＮＰＣ１表現型をレスキューし得るか否かを判定するため、ｈＮＰＣ１導入カセット（配列番号３０１４）をパッケージングする組換えＡＡＶ９ベクターを、ＨＥＫ２９３細胞中で三重形質移入プロトコル（例えば、実施例１を参照されたい）を使用して調製した。ＮＰＣ１を欠損するマウス（すなわちＮＰＣ１－／－マウス）に対して、１キログラム当たり３．０×１０１４個のベクターゲノム（ｖｇ／ｋｇ）の用量で眼窩静脈叢注射により生理食塩水又はＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１ベクターのいずれかを約２４～２８日齢で静脈内注射した。結果を図１１に示す。全ての生理食塩水処理マウスは、約８０日齢までに死亡した。しかしながら、全てのＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１注射動物は、実験の継続期間にわたり生存した。ＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１注射マウスを分析のために約１００日齢で犠死させた。
[0364] マウスに平均台歩行テストも課し、マウスが平均台を歩行するときの転倒の回数を測定した。テストは、約８週（５６日）齢で実施した。図１３に示されるとおり、野生型マウスは、平均台から滑落しなかった。ＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１で処理されたＮＰＣ１－／－マウスと生理食塩水処理ＮＰＣ１－／－マウスとの間の転倒の回数に統計的有意差は存在しなかったが、ＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１群において観察された転倒の平均数は、より少なかった。
[0365] マウスの行動的表現型スコアも約１０週（７０日）齢で評価した。行動的表現型スコアは、種々の疾患症状、例として毛繕い、歩容、後弯、レッジテスト、後肢痙縮及び振戦を測定する複合的なスコアである（Alam et al, Sci Transl Med, 2016；Guyenet et al, J Vis Exp, 2010を参照されたい）。図１２に示されるとおり、ＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１で処理されたＮＰＣ１－／－マウスは、生理食塩水処理ＮＰＣ１－／－マウスと比較して有意に低減したスコアを有した。
[0366] まとめると、これらのデータは、ＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１がＮＰＣ１欠損マウスの疾患表現型を少なくとも部分的にレスキューし得ることを実証する。
実施例１２：ＮＰＣ１をコードするカセットをパッケージングするＳＴＲＤ．１０１ベクターのインビトロ及びインビボ試験
[0367] ヒトＮＰＣ１をコードする導入カセット（例えば、配列番号１４の導入カセット）を含む核酸を含むＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１ベクターを実施例８又は９の方法に従って調製した。このベクターは、本明細書においてＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１－ｈＮＰＣ１と称する。
[0368] ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１ベクターが培養細胞におけるＮＰＣ１リソソーム表現型をレスキューし得るか否かを判定するため、次いでＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１－ｈＮＰＣ１ベクターを使用して野生型Ｕ２ＯＳ細胞（骨肉腫）及びＮＰＣ１を発現しないＵ２ＯＳ細胞（ＮＰＣ－／－）をインビトロで５×１０３（５Ｋ）又は１０×１０３（１０Ｋ）のいずれかの感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入する。次いで、細胞を５％ＣＯ２雰囲気中において３７℃でインキュベートする。
[0369] ＮＰＣ１細胞は、リソソーム中でコレステロールの特徴的な蓄積を呈し、それは、細胞中のリソソームのサイズ及び数を観察することによりモニタリングすることができる。したがって、細胞中の蛍光オルガネラ色素LysoTracker（登録商標）（ThermoFisher Scientific（登録商標））の蓄積を測定することによりリソソーム表現型をモニタリングする。ＡＡＶ２－ｈＮＰＣ１ベクターでの形質導入の７２時間後、５０ｍＭのLysoTracker（登録商標）を細胞に添加する。２時間後、細胞を固定し、LysoTracker（登録商標）蛍光を測定する。
[0370] 別個のアッセイにおいて、ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１－ｈＮＰＣ１ベクターで形質導入された細胞を固定し、コレステロールについての組織化学的染色剤のフィリピンを使用して染色する。フィリピン染色剤は、ストレプトマイセス・フィリピネンシス（Streptomyces filipinensis）に由来し、５０μｇ／ｍＬの最終濃度で使用する。Pico Automated Cell Imaging System（ImageXpress（登録商標））を使用して細胞を可視化し、フィリピン染色剤を定量する。
[0371] ＡＡＶ－ＳＴＲＤ．１０１－ｈＮＰＣ１ベクターを試験してそれがＮＰＣ１表現型をインビボでレスキューし得るか否かも決定する。ＮＰＣ１を欠損するマウス（すなわちＮＰＣ１－／－マウス）に３．０×１０１４ｖｇ／ｋｇの用量において、眼窩静脈叢注射により生理食塩水又はＡＡＶ９－ｈＮＰＣ１ベクターのいずれかを約２４～２８日齢で静脈内注射する。生存率を少なくとも１００日齢までモニタリングする。
[0372] マウスに平均台歩行テストも課し、マウスが平均台を歩行した時に転倒の回数を測定する。テストは、約８週（５６日）齢で実施する。
[0373] マウスの行動的表現型スコアも約１０週（７０日）齢で評価した。行動的表現型スコアは、種々の疾患症状、例として毛繕い、歩容、後弯、レッジテスト、後肢痙縮及び振戦を測定する複合的なスコアである（Alam et al, Sci Transl Med, 2016；Guyenet et al, J Vis Exp,2010を参照されたい）。
[0374] 上記のものは本発明の説明であり、それを限定するものと解釈すべきでない。本発明は、以下の特許請求の範囲により定義され、特許請求の範囲の均等物は、それに含まれるものとする。
番号付けされた実施形態
[0375] 添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の番号付けされた実施形態を記載する。
[0376] １．（ｉ）配列番号１８０又は１７５の配列を含むカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド；及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、核酸は、導入カセットを含み；導入カセットは、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；プロモーター；ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子配列；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含む、ＡＡＶベクター。
[0377] ２．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、約１１０～約１６０ヌクレオチド長である、実施形態１のＡＡＶベクター。
[0378] ３．５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲと同じ長さである、実施形態１又は２のＡＡＶベクター。
[0379] ４．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、異なる長さを有する、実施形態１又は２のＡＡＶベクター。
[0380] ５．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのゲノムから単離されるか又はそれに由来する、実施形態１～４のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0381] ６．５’ＩＴＲは、配列番号３００３の配列を含む、実施形態１のＡＡＶベクター。
[0382] ７．３’ＩＴＲは、配列番号３００４の配列を含む、実施形態１のＡＡＶベクター。
[0383] ８．プロモーターは、構成的プロモーターである、実施形態１～７のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0384] ９．プロモーターは、誘導性プロモーターである、実施形態１～７のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0385] １０．プロモーターは、組織特異的プロモーターである、実施形態１～９のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0386] １１．プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター、ＨＳＶＴＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターからなる群から選択される、実施形態１～７のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0387] １２．プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター及びＨＳＶＴＫプロモーターからなる群から選択される、実施形態１１のＡＡＶベクター。
[0388] １３．プロモーターは、配列番号３００５、配列番号３００６、配列番号３００７又は配列番号３００８のいずれか１つと少なくとも９５％又は１００％同一の配列を含む、実施形態１～７のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0389] １４．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質である、実施形態１～１３のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0390] １５．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する、実施形態１～１３のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0391] １６．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態１５のＡＡＶベクター。
[0392] １７．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９８％同一の配列を有する、実施形態１６のＡＡＶベクター。
[0393] １８．ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号３００１の配列を含む、実施形態１～１３のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0394] １９．導入遺伝子は、配列番号３００２の配列を含む、実施形態１～１３のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0395] ２０．ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ｒＢＧ、α－グロビン、β－グロビン、ヒトコラーゲン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ポリオーマウイルス、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）から選択される、実施形態１～１８のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0396] ２１．ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである、実施形態２０のＡＡＶベクター。
[0397] ２２．ポリアデニル化シグナルは、ｒＢＧポリアデニル化シグナルである、実施形態２０のＡＡＶベクター。
[0398] ２３．ポリアデニル化シグナルは、配列番号３０１２又は配列番号３０１３と少なくとも９５％又は１００％同一の配列を含む、実施形態１～１９のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0399] ２４．エンハンサーをさらに含む、実施形態１～２３のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0400] ２５．エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサーである、実施形態２４のＡＡＶベクター。
[0401] ２６．エンハンサーは、配列番号３００９の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態２４のＡＡＶベクター。
[0402] ２７．イントロン配列をさらに含む、実施形態１～２６のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0403] ２８．イントロン配列は、キメラ配列である、実施形態２７のＡＡＶベクター。
[0404] ２９．イントロン配列は、ハイブリッド配列である、実施形態２７のＡＡＶベクター。
[0405] ３０．イントロン配列は、ＳＶ４０から単離されるか又はそれに由来する配列を含む、実施形態２７のＡＡＶベクター。
[0406] ３１．イントロン配列は、配列番号３０１０～３０１１のいずれか１つの配列を含む、実施形態２７のＡＡＶベクター。
[0407] ３２．導入カセットは、配列番号３０１４～３０１９のいずれか１つの配列を含む、実施形態１のＡＡＶベクター。
[0408] ３３．（ｉ）配列番号１８０若しくは１７５の配列又は配列番号１８０若しくは１７５に対して約１～約２５個のアミノ酸変異を含む配列を含むカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド；及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された導入カセットを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、導入カセットは、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；プロモーター；ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子配列；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含む、ＡＡＶベクター。
[0409] ３４．実施形態１～３３のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む組成物。
[0410] ３５．薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む、実施形態３４の組成物。
[0411] ３６．治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に、治療有効量の、実施形態１～３３のいずれか１つのＡＡＶベクター又は実施形態３４～３５のいずれか１つの組成物を投与することを含む方法。
[0412] ３７．対象は、ニーマン・ピック病Ｃ型を有する、実施形態３６の方法。
[0413] ３８．対象は、ヒト対象である、実施形態３６又は３７の方法。
[0414] ３９．（ｉ）配列番号１８０又は１７５の配列を含むカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド；及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された導入カセットを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、導入カセットは、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；プロモーター；配列番号３００２の配列を含む導入遺伝子配列；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含む、ＡＡＶベクター。
[0415] ４０．（ｉ）配列番号１８０又は１７５の配列を含むカプシドタンパク質を含むタンパク質カプシド；及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、核酸は、導入カセットを含み；導入カセットは、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；プロモーター；配列番号３００１の配列を含むＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子配列；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含む、ＡＡＶベクター。
[0416] ４１．ＡＡＶベクターは、導入カセットを中枢神経系の細胞又は組織に選択的に送達する、実施形態１～３３、３９及び４０のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0417] ４２．中枢神経系の組織は、運動前野、視床、小脳皮質、歯状核、脊髄又は後根神経節である、実施形態４１のＡＡＶベクター。
[0418] ４３．ＡＡＶベクターは、導入カセットを脳に送達するが、ＡＡＶベクターを心臓に送達しない、実施形態１～３３、３９及び４０のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0419] ４４．ＡＡＶベクターは、導入カセットを脳及び心臓に送達する、実施形態１～３３、３９及び４０のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0420] ４５．導入カセットの送達は、心臓よりも脳が多い、実施形態４４のＡＡＶベクター。
[0421] ４６．導入カセットの送達は、脳中、心臓中でほぼ等しい、実施形態４４のＡＡＶベクター。
[0422] ４７．実施形態１～３３及び３９～４６のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む細胞。
[0423] ４８．導入カセットを細胞中に導入するインビトロ方法であって、細胞を、実施形態１～３３及び３９～４６のいずれか１つのＡＡＶベクターと接触させることを含む方法。
[0424] ４９．医薬品として使用のための、実施形態１～３３及び３９～４６のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0425] ５０．ニーマン・ピック病Ｃ型の治療及び／又は予防を必要とする対象においてニーマン・ピック病Ｃ型を治療又は予防する方法における使用のための、実施形態１～３３及び３９～４６のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0426] ５１．カプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１８０の配列を含む、実施形態１～３３及び３９～４６のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0427] ５２．カプシドタンパク質サブユニットは、配列番号１７５の配列を含む、実施形態１～３３及び３９～４６のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0428] ５３．５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；プロモーター；導入遺伝子；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入カセットであって、導入遺伝子は、ＮＰＣ１タンパク質をコードする、ＡＡＶ導入カセット。
[0429] ５４．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、約１１０～約１６０ヌクレオチド長である、実施形態５３のＡＡＶ導入カセット。
[0430] ５５．５’ＩＴＲは、３’ＩＴＲと同じ長さである、実施形態５３又は５４のＡＡＶ導入カセット。
[0431] ５６．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲは、異なる長さを有する、実施形態５３又は５４のＡＡＶ導入カセット。
[0432] ５７．５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲの少なくとも１つは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ又はウシＡＡＶのゲノムから単離されるか又はそれに由来する、実施形態５３～５６のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
[0433] ５８．５’ＩＴＲは、配列番号３００３の配列を含む、実施形態５３のＡＡＶ導入カセット。
[0434] ５９．３’ＩＴＲは、配列番号３００４の配列を含む、実施形態５３のＡＡＶ導入カセット。
[0435] ６０．プロモーターは、構成的プロモーターである、実施形態５３～５９のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
[0436] ６１．プロモーターは、誘導性プロモーターである、実施形態５３～５９のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
[0437] ６２．プロモーターは、組織特異的プロモーターである、実施形態５３～５９のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
[0438] ６３．プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター、ＨＳＶＴＫプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ポリヘドリンプロモーター、ニワトリβ－アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＥＦ－１アルファプロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）プロモーター及びホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターからなる群から選択される、実施形態５３～５９のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
[0439] ６４．プロモーターは、ＣＢＡプロモーター、ＧＵＳＢ２４０プロモーター、ＧＵＳＢ３７９プロモーター及びＨＳＶＴＫプロモーターからなる群から選択される、実施形態６３のＡＡＶ導入カセット。
[0440] ６５．プロモーターは、配列番号３００５、配列番号３００６、配列番号３００７又は配列番号３００８のいずれか１つと少なくとも９５％又は１００％同一の配列を含む、実施形態５３～５９のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
[0441] ６６．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質である、実施形態５３～６５のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
[0442] ６７．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９０％同一の配列を有する、実施形態５３～６５のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
[0443] ６８．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９５％同一の配列を有する、実施形態６７のＡＡＶ導入カセット。
[0444] ６９．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質の配列と少なくとも９８％同一の配列を有する、実施形態６８のＡＡＶ導入カセット。
[0445] ７０．ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号３００１の配列を含む、実施形態５３～６５のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
[0446] ７１．導入遺伝子は、配列番号３００２の配列を含む、実施形態５３～６５のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
[0447] ７２．ポリアデニル化シグナルは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、ｒＢＧ、α－グロビン、β－グロビン、ヒトコラーゲン、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ポリオーマウイルス、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）から選択される、実施形態５３～７１のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
[0448] ７３．ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである、実施形態７２のＡＡＶ導入カセット。
[0449] ７４．ポリアデニル化シグナルは、ｒＢＧポリアデニル化シグナルである、実施形態７２のＡＡＶ導入カセット。
[0450] ７５．ポリアデニル化シグナルは、配列番号３０１２又は配列番号３０１３と少なくとも９５％又は１００％同一の配列を含む、実施形態５３～７１のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
[0451] ７６．カセットは、エンハンサーをさらに含む、実施形態５３～７５のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
[0452] ７７．エンハンサーは、ＣＭＶエンハンサーである、実施形態７６のＡＡＶ導入カセット。
[0453] ７８．エンハンサーは、配列番号３００９の配列又はそれと少なくとも９５％同一の配列を含む、実施形態７６のＡＡＶ導入カセット。
[0454] ７９．カセットは、イントロン配列をさらに含む、実施形態５３～７８のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット。
[0455] ８０．イントロン配列は、キメラ配列である、実施形態７９のＡＡＶ導入カセット。
[0456] ８１．イントロン配列は、ハイブリッド配列である、実施形態７９のＡＡＶ導入カセット。
[0457] ８２．イントロン配列は、ＳＶ４０から単離されるか又はそれに由来する配列を含む、実施形態７９のＡＡＶ導入カセット。
[0458] ８３．イントロン配列は、配列番号３０１０～３０１１のいずれか１つの配列を含む、実施形態７９のＡＡＶ導入カセット。
[0459] ８４．ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３０１４～３０１９のいずれか１つの配列を含む、実施形態５３のＡＡＶ導入カセット。
[0460] ８５．実施形態５３～８４のいずれか１つのＡＡＶ導入カセットを含むプラスミド。
[0461] ８６．実施形態５３～８４のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット又は実施形態８５のプラスミドを含む細胞。
[0462] ８７．組換えＡＡＶベクターを産生する方法であって、ＡＡＶ産生細胞を、実施形態５３～８４のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット又は実施形態８５のプラスミドと接触させることを含む方法。
[0463] ８８．実施形態８７の方法によって産生される組換えＡＡＶベクター。
[0464] ８９．ベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ７４、トリＡＡＶ及びウシＡＡＶから選択される血清型のものである、実施形態８８の組換えＡＡＶベクター。
[0465] ９０．実施形態５３～８４のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット、実施形態８５のプラスミド、実施形態８６の細胞又は実施形態８８若しくは８９の組換えＡＡＶベクターを含む組成物。
[0466] ９１．治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に、有効量の、実施形態５３～８４のいずれか１つのＡＡＶ導入カセット、実施形態８５のプラスミド、実施形態８６の細胞又は実施形態８８若しくは８９の組換えＡＡＶベクターを投与することを含む方法。
[0467] ９２．対象は、疾患ＮＰＣ１を罹患する、実施形態９１の方法。
[0468] ９３．対象は、ヒト対象である、実施形態９１又は９２の方法。
[0469] ９４．（ｉ）配列番号１８０の配列を含むカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド；及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、核酸は、導入カセットを含み；導入カセットは、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；プロモーター；ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含む、ＡＡＶベクター。
[0470] ９５．（ｉ）配列番号１８０の配列又は配列番号１８０に対して約１～約２５個のアミノ酸変異を含む配列を含むカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド；及び（ｉｉ）タンパク質カプシドによってカプシド化された核酸を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、核酸は、導入カセットを含み；導入カセットは、５’から３’にかけて、５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；プロモーター；ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子；ポリアデニル化シグナル；及び３’ＩＴＲを含む、ＡＡＶベクター。
[0471] ９６．導入カセットは、イントロン配列を含む、実施形態９４又は９５のＡＡＶベクター。
[0472] ９７．イントロン配列は、配列番号１０の配列を含む、実施形態９４～９６のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0473] ９８．５’ＩＴＲは、配列番号３００３の配列を含む、実施形態９４～９７のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0474] ９９．３’ＩＴＲは、配列番号３００４の配列を含む、実施形態９４～９８のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0475] １００．プロモーターは、ＣＢＡプロモーターである、実施形態９４～９９のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0476] １０１．プロモーターは、配列番号３００５の配列を含む、実施形態９４～９９のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0477] １０２．ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質である、実施形態９４～１０１のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0478] １０３．ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号３００１の配列を含む、実施形態９４～１０１のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0479] １０４．導入遺伝子は、配列番号３００２の配列を含む、実施形態９４～１０１のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0480] １０５．ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである、実施形態９４～１０４のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0481] １０６．ポリアデニル化シグナルは、配列番号３０１２の配列を含む、実施形態９４～１０４のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0482] １０７．カセットは、エンハンサーを含む、実施形態９４～１０６のいずれか１つのＡＡＶベクター。
[0483] １０８．ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３０１４の配列を含む、実施形態９４のＡＡＶベクター。
[0484] １０９．ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３０１５～３０１９のいずれか１つの配列を含む、実施形態９４のＡＡＶベクター。
[0485] １１０．実施形態９４～１０９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む組成物。
[0486] １１１．実施形態９４～１０９のいずれか１つのＡＡＶベクターを含む細胞。
[0487] １１２．治療を必要とする対象を治療する方法であって、対象に、有効量の、実施形態９４～１０９のいずれか１つのＡＡＶベクター、実施形態１１０の組成物又は実施形態１１１の細胞を投与することを含む方法。
[0488] １１３．対象は、ニーマン・ピック病Ｃ型を有する、実施形態１１２の方法。
[0489] １１４．対象は、ヒト対象である、実施形態１１２又は１１３の方法。

Claims (21)

  1. （ｉ）配列番号１８０の配列を含むカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド；及び
    （ｉｉ）前記タンパク質カプシドによってカプシド化された核酸
    を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
    前記核酸は、導入カセットを含み；
    前記導入カセットは、５’から３’にかけて、
    ５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；
    プロモーター；
    ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子；
    ポリアデニル化シグナル；及び
    ３’ＩＴＲ
    を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
  2. 前記導入カセットは、イントロン配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
  3. 前記イントロン配列は、配列番号１０の配列を含む、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
  4. 前記５’ＩＴＲは、配列番号３００３の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
  5. 前記３’ＩＴＲは、配列番号３００４の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
  6. 前記プロモーターは、ＣＢＡプロモーターである、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
  7. 前記プロモーターは、配列番号３００５の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
  8. 前記ＮＰＣ１タンパク質は、ヒトＮＰＣ１タンパク質である、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
  9. 前記ＮＰＣ１タンパク質は、配列番号３００１の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
  10. 前記導入遺伝子は、配列番号３００２の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
  11. 前記ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルである、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
  12. 前記ポリアデニル化シグナルは、配列番号３０１２の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
  13. 前記カセットは、エンハンサーを含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
  14. 前記ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３０１４の配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
  15. 前記ＡＡＶ導入カセットは、配列番号３０１５～３０１９のいずれか１つの配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
  16. （ｉ）配列番号１８０の配列又は配列番号１８０に対して約１～約２５個のアミノ酸変異を含む配列を含むカプシドタンパク質サブユニットを含むタンパク質カプシド；及び
    （ｉｉ）前記タンパク質カプシドによってカプシド化された核酸
    を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
    前記核酸は、導入カセットを含み；
    前記導入カセットは、５’から３’にかけて、
    ５’逆位末端リピート（ＩＴＲ）；
    プロモーター；
    ＮＰＣ１タンパク質をコードする導入遺伝子；
    ポリアデニル化シグナル；及び
    ３’ＩＴＲ
    を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
  17. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む組成物。
  18. 請求項１～１６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む細胞。
  19. 治療を必要とする対象を治療する方法であって、前記対象に、有効量の、請求項１～１６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター、請求項１７に記載の組成物又は請求項１８に記載の細胞を投与することを含む方法。
  20. 前記対象は、ニーマン・ピック病Ｃ型を有する、請求項１９に記載の方法。
  21. 前記対象は、ヒト対象である、請求項１９又は２０に記載の方法。
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