TW202128736A - 用於治療ｃ型尼曼—匹克病之腺相關病毒載體 - Google Patents

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Abstract

本文提供用於治療、預防及/或治愈NPC1之基因治療組合物及方法。更特定而言，本揭示案提供用於遞送核酸之腺相關病毒(AAV)載體及用於治療、預防及/或治愈NPC1之核酸(包括AAV轉移盒)。

Description

用於治療C型尼曼-匹克病之腺相關病毒載體
本申請案係關於重組腺相關病毒(AAV)載體。在一些實施例中，重組AAV載體逃避中和抗體而不降低轉導效率。
C1型尼曼-匹克病(Niemann-Pick Disease, type C1，NPC1)係特徵在於內質溶酶體區室中之膽固醇累積之神經變性病症。其係由編碼NPC1之基因突變引起，NPC1係調介細胞內膽固醇輸送之內質溶酶體蛋白。
NPC1可存在於嬰兒、兒童或成人中。新生兒可因肝浸潤而出現腹水及嚴重肝病，及/或因肺浸潤而出現呼吸衰竭。其他沒有肝病或肺病之嬰兒具有低張症及發育遲緩。典型表現發生在兒童中晚期，伴有共濟失調、垂直核上性凝視麻痹(VSGP)及失智症之隱匿性發作。肌張力障礙及癲癇較為常見。發音困難及吞咽困難最終變得無能，使得無法進行口服餵養；通常在第二個十年後期或第三個十年因吸入性肺炎而死亡。成人更可能出現失智症或精神病症狀。
已顯示在NPC1動物模型中2-羥丙基-ß-環糊精(HPBCD)减少膽固醇及脂質累積且延長存活期。然而，目前尚無經美國食品藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准之NPC1療法。因此，迫切需要用於治療、治癒及/或預防NPC1之組合物及方法。
本文提供用於治療、預防及/或治愈NPC1之基因治療組合物及方法。更特定而言，本揭示案提供用於治療、預防及/或治愈NPC1之腺相關病毒(AAV)載體及核酸(包括包含AAV轉移盒之核酸)。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含：(i)蛋白質衣殼，其包含含有SEQ ID NO: 180之序列之衣殼蛋白次單元；及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之核酸；其中核酸包含轉移盒；其中轉移盒自5’至3’包含：5’反向末端重複(ITR)；啟動子；編碼NPC1蛋白之轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含：(i)蛋白質衣殼，該蛋白質衣殼包含衣殼蛋白次單元，該衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 180之序列或相對於SEQ ID NO: 180包含約1至約25個胺基酸突變之序列；及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之核酸；其中核酸包含轉移盒；其中轉移盒自5’至3’包含：5’反向末端重複(ITR)；啟動子；編碼NPC1蛋白之轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR。
在一些實施例中，轉移盒包含內含子序列。在一些實施例中，內含子序列包含SEQ ID NO: 10之序列。在一些實施例中，內含子序列可位於啟動子與轉殖基因之間。
在一些實施例中，5’ ITR包含SEQ ID NO: 3003之序列。在一些實施例中，3’ ITR包含SEQ ID NO: 3004之序列。
在一些實施例中，啟動子係CBA啟動子。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO: 3005之序列。
在一些實施例中，NPC1蛋白係人類NPC1蛋白。在一些實施例中，NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 3001之序列。在一些實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO: 3002之序列。
在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號係SV40多聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號包含SEQ ID NO: 3012之序列。
在一些實施例中，轉移盒包含增強子。
在一些實施例中，轉移盒包含SEQ ID NO: 3014之序列。在一些實施例中，轉移盒包含SEQ ID NO: 3015-3019中任一者之序列。
本文亦提供包含本揭示案之AAV載體之組合物。本文亦提供包含本揭示案之AAV載體之細胞。
本文亦提供治療有需要之個體之方法，其包括向個體投與有效量之本揭示案之AAV載體、核酸、組合物或細胞。在一些實施例中，個體患有C型尼曼-匹克病。在一些實施例中，個體係人類個體。
該等及其他實施例更詳細闡述於下文中。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張於2020年9月24日提出申請之美國臨時申請案第63/082,899號、於2020年9月23日提出申請之美國臨時申請案第63/082,425號、於2019年10月18日提出申請之美國臨時申請案第62/923,253號及於2019年10月17日提出申請之美國臨時申請案第62/916,749號之優先權，該等美國臨時申請案中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。電子提交之文字檔案之描述
本文電子提交之文字檔案之內容之全文皆以引用方式併入：序列表之電腦可讀格式拷貝(檔案名稱：STRD_021_02WO_SeqList_ST25.txt，記錄日期為2020年10月14日，檔案大小為約425千位元組)。
本文提供逃避抗體識別及/或選擇性靶向CNS組織之重組AAV載體。該等AAV載體可用於治療、預防及/或治愈疾病，例如NPC1。
AAV可用作基因遞送劑，且係人類基因療法之有力工具。使用AAV，可在活體內及活體外在多種細胞中達成高頻DNA遞送及穩定表現。與一些其他病毒載體系統不同，AAV不需要活性細胞分裂穩定整合於靶細胞中。
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語具有與熟習本揭示案所屬領域者通常理解之含義相同之含義。在本文之詳細描述中使用之術語僅出於闡述特定實施例之目的而非意欲進行限制。
本文提及之所有出版物、專利申請案、專利、GenBank或其他登錄號及其他參考文獻之全文出於所有目的以引用方式併入。
在本揭示案及所附申請專利範圍中，AAV衣殼蛋白次單元中胺基酸位置之指定係關於VP1編號。熟習此項技術者應理解，若將本文所述之修飾插入AAV cap基因中，可能導致VP1、VP2及/或VP3區之修飾。替代地，VP1、VP2及/或VP3可獨立地表現以僅在該等區域中之一或兩者中達成修飾(VP1、VP2、VP3、VP1 + VP2、VP1 + VP3或VP2 +VP3)。定義
在本文之描述及所附申請專利範圍中使用以下術語。
除非上下文另有明確指示，否則單數形式「一(a、an)」及「該」亦欲包括複數形式。
此外，如本文所用之術語「約」在提及可量測之值(例如多核苷酸或多肽序列之長度、劑量、時間、溫度及諸如此類之量)時意欲涵蓋指定值之± 20%、± 10%、± 5%、± 1%、± 0.5%或甚至± 0.1%之變化。
同樣如本文所用之「及/或」係指並涵蓋一或多個相關之所列條目之任何及所有可能之組合，以及當在替代方案中解釋時缺少組合(「或」)。
除非上下文另有指示，否則本文所述之各種特徵可明確意欲以任何組合使用。此外，在一些實施例中，可排除或省略本文所述之任一特徵或特徵之組合。為進一步說明，例如，若說明書指示特定胺基酸可選自A、G、I、L及/或V，則該語言亦指示該胺基酸可選自該(等)胺基酸之任何子集，例如A、G、I或L；A、G、I或V；A或G；僅L等，如同每個該子組合在本文中明確闡述一般。此外，該語言亦指示，可放棄一或多個指定之胺基酸。舉例而言，在一些實施例中，胺基酸不為A、G或I；不為A；不為G或V等，如同每個該可能之放棄在本文中明確闡述一般。
如本文所用之術語「減少(reduce、reduces、reduction)」及類似術語意指減少至少約10%、約15%、約20%、約25%、約35%、約50%、約75%、約80%、約85%、約90%、約95%、約97%或更多。
如本文所用之術語「增加」、「改良」、「增強(enhance、enhances、enhancement)」及類似術語指示增加至少約10%、約15%、約20%、約25%、約50%、約75%、約100%、約150%、約200%、約300%、約400%、約500%或更多。
如本文所用之術語「細小病毒」涵蓋細小病毒科(Parvoviridae)，包括自主複製細小病毒及依賴病毒。自主細小病毒包括原細小病毒屬(Protoparvovirus )、紅細小病毒屬(Erythroparvovirus )、博卡病毒屬(Bocaparvovirus )及濃核病毒屬(Densovirus )亞科之成員。例示性自主細小病毒包括(但不限於)小鼠微小病毒、牛細小病毒、犬細小病毒、雞細小病毒、貓泛白血球症病毒、貓細小病毒、鵝細小病毒、H1細小病毒、番鴨細小病毒、B19病毒及現在已知或後來發現之任何其他自主細小病毒。其他自主細小病毒為熟習此項技術者已知。例如，參見BERNARD N. FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers；Cotmore等人，Archives of Virology DOI 10.1007/s00705-013-1914-I)。
如本文所用之術語「腺相關病毒」 (AAV)包括(但不限於) 1型AAV、2型AAV、3型(包括3A型及3B型) AAV、4型AAV、5型AAV、6型AAV、7型AAV、8型AAV、9型AAV、10型AAV、11型AAV、12型AAV、13型AAV、rh32.33型AAV、rh8型AAV、rh10型AAV、rh74型AAV、hu.68型AAV、鳥AAV、牛AAV、犬AAV、馬AAV、綿羊AAV、蛇AAV、髭頰蜥AAV、AAV2i8、AAV2g9、AAV-LK03、AAV7m8、AAV Anc80、AAV PHP.B及現在已知或後來發現之任何其他AAV。例如，參見BERNARD N. FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第69章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)。已鑒別出多種AAV血清型及演化支(例如，參見Gao等人(2004) J. Virology 78:6381-6388；Moris等人(2004) Virology 33-:375-383；及表2)。AAV1-9、AAVrh.10及AAV11之例示性AAV衣殼蛋白次單元序列提供於SEQ ID NO: 1-11中。
如本文所用之術語「嵌合AAV」係指包含含有衣殼蛋白次單元之蛋白質衣殼之AAV，該等衣殼蛋白次單元具有衍生自兩種或更多種不同的AAV血清型之區域、結構域、個別胺基酸。在一些實施例中，嵌合AAV包含衣殼蛋白次單元，該衣殼蛋白次單元包含衍生自第一AAV血清型之第一區及衍生自第二AAV血清型之第二區。在一些實施例中，嵌合AAV包含衣殼蛋白次單元，該衣殼蛋白次單元包含衍生自第一AAV血清型之第一區、衍生自第二AAV血清型之第二區及衍生自第三AAV血清型之第三區。在一些實施例中，嵌合AAV可包含衍生自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11及/或AAV12之區域、結構域、個別胺基酸。舉例而言，嵌合AAV可包括如下文(表1)所示之來自第一及第二AAV血清型之區域、結構域及/或個別胺基酸，其中AAVX+Y指示包括衍生自AAVX及AAVY之序列之嵌合AAV：表 1 ：嵌合 AAV
Figure 02_image001
藉由在一個衣殼蛋白次單元中納入來自多種AAV血清型之個別胺基酸或區域，可獲得具有單獨衍生自多種AAV血清型之多種期望性質之衣殼蛋白次單元。
各種AAV血清型及自主細小病毒之基因體序列以及天然末端重複(TR)、Rep蛋白及衣殼蛋白次單元之序列為此項技術中已知。該等序列可參見文獻或諸如GenBank之公共資料庫。例如，參見GenBank登錄號NC_002077、NC_001401、NC_001729、NC_001863、NC_001829、NC_001862、NC_000883、NC_001701、NC_001510、NC_006152、NC_006261、AF063497、U89790、AF043303、AF028705、AF028704、J02275、J01901、J02275、X01457、AF288061、AH009962、AY028226、AY028223、NC_001358、NC_001540、AF513851、AF513852、AY530579；其關於教示細小病毒以及AAV核酸及胺基酸序列之揭示內容以引用方式併入本文中。亦參見例如Srivistava等人(1983) J. Virology 45:555；Chiorini等人(1998) J Virology 71:6823；Chiorini等人(1999) J. Virology 73: 1309；Bantel-Schaal等人(1999) J Virology 73:939；Xiao等人(1999) J Virology 73:3994；Muramatsu等人(1996) Virology 221:208；Shade等人(1986) J. Virol. 58:921；Gao等人(2002) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99:11854；Moris等人(2004) Virology 33:375-383；國際專利公開案WO 00/28061、WO 99/61601、WO 98/11244；及美國專利第6,156,303號；其關於教示細小病毒以及AAV核酸及胺基酸序列之揭示內容以引用方式併入本文中。亦參見表2。自主細小病毒及AAV之蛋白質衣殼結構更詳細闡述於BERNARD N. FIELDS等人，VIROLOGY，第2卷，第69及70章(第4版，Lippincott-Raven Publishers)中。亦參見AAV2 (Xie等人(2002) Proc. Nat. Acad. Sci. 99: 10405-10)、AAV9 (DiMattia等人(2012) J. Virol. 86:6947-6958)、AAV8 (Nam等人(2007) J. Virol. 81: 12260-12271)、AAV6 (Ng等人(2010) J. Virol. 84:12945-12957)、AAV5 (Govindasamy等人(2013) J. Virol. 87, 11187-11199)、AAV4 (Govindasamy等人(2006) J. Virol. 80:11556-11570)、AAV3B (Lerch等人(2010) Virology 403:26-36)、BPV (Kailasan等人(2015) J. Virol. 89:2603-2614)及CPV (Xie等人(1996) J. Mol. Biol. 6:497-520及Tsao等人(1991) Science 251:1456-64)之晶體結構之描述。表 2 ： AAV 血清型及演化支
GenBank 登錄號    GenBank 登錄號    GenBank 登錄號
完整基因體 演化支C Rh57 AY530569
腺相關病毒1 NC_002077, AF063497 Hu9 AY530629 Rh50 AY530563
腺相關病毒2 NC_001401 Hu10 AY530576 Rh49 AY530562
腺相關病毒3 NC_001729 Hu11 AY530577 Hu39 AY530601
腺相關病毒3B NC_001863 Hu53 AY530615 Rh58 AY530570
腺相關病毒4 NC_001829 Hu55 AY530617 Rh61 AY530572
腺相關病毒5 Y18065, AF085716 Hu54 AY530616 Rh52 AY530565
腺相關病毒6 NC_001862 Hu7 AY530628 Rh53 AY530566
鳥AAV ATCC VR-865 AY186198, AY629583, NC_004828 Hu18 AY530583 Rh51 AY530564
鳥AAV品系DA-1 NC_006263, AY629583 Hu15 AY530580 Rh64 AY530574
牛AAV NC_005889, AY388617, AAR26465 Hu16 AY530581 Rh43 AY530560
AAV11 AAT46339, AY631966 Hu25 AY530591 AAV8 AF513852
AAV12 ABI16639, DQ813647 Hu60 AY530622 Rh8 AY242997
演化支A    Ch5 AY243021 Rh1 AY530556
AAV1 NC_002077, AF063497 Hu3 AY530595 演化支F   
AAV6 NC_001862 Hu1 AY530575 Hu14 (AAV9) AY530579
Hu.48 AY530611 Hu4 AY530602 Hu31 AY530596
Hu 43 AY530606 Hu2 AY530585 Hu32 AY530597
Hu 44 AY530607 Hu61 AY530623 HSC1 MI332400.1
Hu 46 AY530609 演化支D    HSC2 MI332401.1
演化支B    Rh62 AY530573 HSC3 MI332402.1
Hu. 19 AY530584 Rh48 AY530561 HSC4 MI332403.1
Hu. 20 AY530586 Rh54 AY530567 HSC5 MI332405.1
Hu 23 AY530589 Rh55 AY530568 HSC6 MI332404.1
Hu22 AY530588 Cy2 AY243020 HSC7 MI332407.1
Hu24 AY530590 AAV7 AF513851 HSC8 MI332408.1
Hu21 AY530587 Rh35 AY243000 HSC9 MI332409.1
Hu27 AY530592 Rh37 AY242998 HSC11 MI332406.1
Hu28 AY530593 Rh36 AY242999 HSC12 MI332410.1
Hu 29 AY530594 Cy6 AY243016 HSC13 MI332411.1
Hu63 AY530624 Cy4 AY243018 HSC14 MI332412.1
Hu64 AY530625 Cy3 AY243019 HSC15 MI332413.1
Hu13 AY530578 Cy5 AY243017 HSC16 MI332414.1
Hu56 AY530618 Rh13 AY243013 HSC17 MI332415.1
Hu57 AY530619 演化支E    Hu68   
Hu49 AY530612 Rh38 AY530558 純系分離物   
Hu58 AY530620 Hu66 AY530626 AAV5 Y18065, AF085716
Hu34 AY530598 Hu42 AY530605 AAV 3 NC_001729
Hu35 AY530599 Hu67 AY530627 AAV 3B NC_001863
AAV2 NC_001401 Hu40 AY530603 AAV4 NC_001829
Hu45 AY530608 Hu41 AY530604 Rh34 AY243001
Hu47 AY530610 Hu37 AY530600 Rh33 AY243002
Hu51 AY530613 Rh40 AY530559 Rh32 AY243003
Hu52 AY530614 Rh2 AY243007 其他   
Hu T41 AY695378 Bb1 AY243023 Rh74   
Hu S17 AY695376 Bb2 AY243022 髭頰蜥AAV   
Hu T88 AY695375 Rh10 AY243015 蛇AAV NC_006148.1
Hu T71 AY695374 Hu17 AY530582      
Hu T70 AY695373 Hu6 AY530621      
Hu T40 AY695372 Rh25 AY530557      
Hu T32 AY695371 Pi2 AY530554      
Hu T17 AY695370 Pi1 AY530553      
Hu LG15 AY695377 Pi3 AY530555      
重組AAV (rAAV)載體可使用病毒產生細胞株在培養物中產生。術語「病毒產生細胞(viral production cell)」、「病毒產生細胞株(viral production cell line)」或「病毒產生細胞(viral producer cell)」係指用於產生病毒載體之細胞。HEK293及239T細胞係常用的病毒產生細胞株。下表3列出用於各種病毒載體之例示性病毒產生細胞株。rAAV之產生通常需要在細胞中存在三種元件：1)側接有AAV反向末端重複(ITR)序列之轉殖基因，2) AAV rep及cap基因，及3)輔助病毒蛋白序列。該三種元件可提供於一或多種質體上，且轉染或轉導至細胞中。表 3 ：例示性病毒產生細胞株
病毒載體 例示性病毒產生細胞株
腺病毒 HEK293、911、pTG6559、PER.C6、GH329、N52.E6、HeLa-E1、UR、VLI-293
腺相關病毒(AAV) HEK293、Sf9
反轉錄病毒 HEK293
慢病毒 293T
「HEK293」係指最初衍生自生長於組織培養物中之人類胚腎細胞之細胞株。HEK293細胞株易於生長於培養物中，且常用於病毒產生。如本文所用之「HEK293」亦可指一或多種變異體HEK293細胞株，即另外包含一或多個遺傳變化之衍生自原始HEK293細胞株之細胞株。已開發出許多變異體HEK293細胞株且經最佳化用於一或多種特定應用。舉例而言，293T細胞株含有SV40大T-抗原，其允許含有SV40複製起點之轉染質體之游離型複製，從而增加期望基因產物之表現。
「Sf9」係指昆蟲細胞株，其係衍生自親代草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞株IPLB-Sf-21-AE之純系分離物。Sf9細胞可在血清不存在下生長且可附著或懸浮培養。
「轉染試劑」意指增強核酸轉移至細胞中之組合物。此項技術中常用之一些轉染試劑包括一或多種結合至核酸及細胞表面之脂質(例如LipofectamineTM )。
如本文所用之術語「感染複數」或「MOI」係指與細胞接觸之病毒粒子數。舉例而言，經培養細胞可以介於1 × 102 至1 × 105 個病毒粒子/細胞範圍內之MOI與AAV接觸。
術語「自互補AAV」或「scAAV」係指包含核酸(即DNA)之重組AAV載體，該核酸形成自發退火之二聚體反向重複序列分子，從而產生與習用單股(ss) AAV基因體相比更早且更穩健之轉殖基因表現。例如，參見McCarty, D.M.等人，Gene Therapy 8, 1248-1254 (2001)。與習用ssAAV不同，scAAV可繞過第二股合成，其係基因表現之限速步驟。此外，雙鏈scAAV在病毒轉導後不太傾向於DNA降解，從而增加穩定游離基因體之拷貝數。應注意，scAAV通常僅可容納為約2.4kb之基因體，大小為習用AAV載體之一半。在一些實施例中，本文所述之AAV載體係自互補AAV。
如本文所用之術語「肽」係指短胺基酸序列。術語肽可用於指AAV衣殼蛋白次單元胺基酸序列之部分或區域。肽可為在天然AAV衣殼蛋白中天然存在之肽或並不在天然AAV衣殼蛋白中天然存在之肽。AAV衣殼蛋白中之天然AAV肽可經非天然肽取代。舉例而言，非天然肽可取代至AAV衣殼蛋白中以提供經修飾之衣殼蛋白，使得用非天然肽替代天然肽。
如本文所用之術語「向性」係指病毒優先進入某些細胞或組織中，隨後視情況地表現(例如轉錄及視情況地轉譯)細胞中病毒基因體攜帶之序列，例如對於重組病毒，表現相關轉殖基因。
如本文所用之「全身向性」及「全身性轉導」 (及等效術語)指示，如本文所述之病毒載體或病毒樣顆粒分別對全身組織(例如腦、肺、骨骼肌、心臟、肝、腎及/或胰臟)展現向性或轉導。在一些實施例中，達成肌肉組織(例如骨骼肌、橫膈膜及心肌)之全身性轉導。在一些實施例中，達成骨骼肌組織之全身性轉導。舉例而言，在一些實施例中，轉導基本上全身所有的骨骼肌(但轉導之效率可因肌肉類型而不同)。在一些實施例中，達成四肢肌肉、心肌及膈肌之全身性轉導。視情況地，病毒載體或病毒樣顆粒係經由全身性途徑(例如諸如靜脈內、關節內或淋巴內之全身性途徑)來投與。
替代地，在一些實施例中，病毒載體或病毒樣顆粒係經局部遞送(例如足墊、肌內、真皮內、皮下、局部)。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣顆粒係經局部遞送至中樞神經系統(CNS)之組織，例如腦或脊髓。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣顆粒係藉由鞘內、大腦內或腦室內注射來投與。
除非另有指示，否則「有效轉導」或「有效向性」或類似術語可藉由參考適宜對照來確定(例如轉導或向性分別為對照之至少約50%、約60%、約70%、約80%、約85%、約90%、約95%或更多)。在一些實施例中，病毒載體(例如AVV載體)有效地轉導骨骼肌、心肌、膈肌、胰臟(包括β-胰島細胞)、脾、胃腸道(例如上皮及/或平滑肌)、中樞神經系統細胞、肺、關節細胞及/或腎或對其具有有效向性。適宜對照將取決於多種因素，包括期望向性特徵。舉例而言，AAV8及AAV9高度有效地轉導骨骼肌、心肌及膈肌，但具有亦高效轉導肝之缺點。因此，可鑒別出展示AAV8或AAV9之骨骼肌、心肌及/或膈肌之有效轉導、但肝之轉導效率低得多之病毒載體。此外，由於相關向性特征可反映對多種靶組織之向性，故應了解適宜病毒載體可代表一定折衷。為進行說明，病毒載體在轉導骨骼肌、心肌及/或膈肌方面可能不如AAV8或AAV9有效，但由於肝之低轉導水準，可能仍係非常合意的。
類似地，藉由參考適宜對照，可確定病毒是否「不能有效地轉導靶組織」或「對靶組織不具有效向性」，或類似術語。在一些實施例中，病毒載體不能有效地轉導(即不具有效向性)肝、腎、性腺及/或生殖細胞。在一些實施例中，組織(例如肝)之不期望轉導為期望靶組織(例如骨骼肌、膈肌、心肌及/或中樞神經系統細胞)之轉導水準之約20%或更小、約10%或更小、約5%或更小、約1%或更小、約0.1%或更小。
如本文結合AAV載體(或其蛋白質衣殼、衣殼蛋白次單元或肽)所用之術語「選擇性結合(selectively binds)」、「選擇性結合(selective binding)」及類似術語係指AAV載體(或其蛋白質衣殼、衣殼蛋白次單元或肽)以依賴於存在特定分子結構之方式與靶結合。在一些實施例中，選擇性結合係指AAV主要結合至特定靶，而不與其他靶實質性或顯著結合。在一些實施例中，AAV載體(或其蛋白質衣殼、衣殼蛋白次單元或肽)特異性結合至相關細胞或組織中之受體，但不展現與其他受體之實質性或顯著結合。
「多核苷酸」係核苷酸鹼基之序列，且可為RNA、DNA或DNA-RNA雜合序列(包括天然及非天然核苷酸二者)。在一些實施例中，多核苷酸係單股或雙股DNA序列。
如本文所用之「經分離」多核苷酸(例如「經分離DNA」或「經分離RNA」)意指至少部分地與天然生物體或病毒之至少一些其他組分(例如細胞或病毒結構組分或通常發現之與多核苷酸相關之其他多肽或核酸)分離之多核苷酸。在一些實施例中，「經分離」核苷酸與起始材料相比富集至少約10倍、約100倍、約1000倍、約10,000倍或更多。
同樣，「經分離」多肽意指至少部分地與天然生物體或病毒之至少一些其他組分(例如細胞或病毒結構組分或通常發現之與多肽相關之其他多肽或核酸)分離之多肽。在一些實施例中，「經分離」多肽與起始材料相比富集至少約10倍、約100倍、約1000倍、約10,000倍或更多。
如本文所用之「分離」或「純化」 (或語法等效物)病毒載體意指病毒載體至少部分地與起始材料中之至少一些其他組分分離。在一些實施例中，「經分離」或「經純化」之病毒載體與起始材料相比富集至少約10倍、約100倍、約1000倍、約10,000倍或更多。
「治療性」多肽或蛋白質係可緩和、減輕、預防、延遲及/或穩定由細胞或個體中蛋白質缺失或缺陷引起之症狀之多肽或蛋白質，及/或係以其他方式賦予個體益處(例如抗癌效應或移植存活性之改良)之多肽。
術語「治療(treat、treating或treatment of)」 (及其語法變化形式)意指個體疾患之嚴重程度降低、至少部分地改良或穩定，及/或至少一種臨床症狀達成一定程度之緩和、減輕、減少或穩定，及/或疾病或病症之進展有所延遲。
術語「預防(prevent、preventing及prevention)」 (及其語法變化形式)係指預防及/或延遲個體之疾病、病症及/或臨床症狀之發作，及/或相對于在沒有本文所述之組合物及/或方法之情況下會發生之疾病、病症及/或臨床症狀之發作嚴重程度有所降低。預防可為完全的，例如完全沒有疾病、病症及/或臨床症狀。預防亦可為部分的，使得個體之疾病、病症及/或臨床症狀之發生及/或發作之嚴重程度小於沒有本文所述之組合物及/或方法時會發生之情況。
如本文所用之「有效量」係可有效地治療或預防個體之疾病或病症或改善其體征或症狀之AAV載體、核酸或本文所提供之其他劑之量。「有效量」可端視例如疾病及/或疾病之症狀、疾病及/或疾病或病症之症狀之嚴重程度、欲治療患者之年齡、體重及/或健康狀況以及開處方醫師之判斷而變化。在任何給定情況下，合適之量可由熟習此項技術者確定，或可能夠藉由常規實驗來確定。
如本文所用之術語「病毒載體」、「載體」係指病毒(例如AAV)顆粒，其用作核酸遞送媒劑且包含包裝在病毒粒子或病毒樣顆粒內之載體基因體(例如 包含轉殖基因之核酸)。
「腺相關病毒載體」或「AAV載體」通常包含蛋白質衣殼及經蛋白質衣殼殼體化之核酸(例如包含轉殖基因之核酸)。「蛋白質衣殼」係近球形蛋白質外殼，其包含以T=1二十面體對稱締合及排列之個別「衣殼蛋白次單元」 (例如約60個衣殼蛋白次單元)。本文所述AAV載體之蛋白質衣殼包含複數個衣殼蛋白次單元。當AAV載體闡述為包含AAV衣殼蛋白次單元時，應理解，AAV載體包含蛋白質衣殼，其中蛋白質衣殼包含一或多個AAV衣殼蛋白次單元。如本文所用之術語「衣殼蛋白」有時用於指衣殼蛋白次單元。術語「病毒樣顆粒(viral-like particle或virus-like particle)」係指不包含含有轉移盒或轉殖基因之任何載體基因體或核酸之蛋白質衣殼。
在一些實施例中，AAV載體可包含含有「轉移盒」之核酸，即包含一或多個可藉由AAV遞送至細胞之序列之核酸。在一些實施例中，核酸係自互補的(即雙股)。在一些實施例中，核酸不為自互補的(即單股)。
「rAAV載體基因體」或「rAAV基因體」係包含一或多個異源核酸序列之AAV基因體(即vDNA)。rAAV載體通常僅需要順式反向末端重複(ITR)來促進核酸複製。所有其他病毒序列係可有可無的且可以反式 供應(Muzyczka, (1992) Curr. Topics Microbiol. Immunol. 158:97)。通常，rAAV載體基因體將僅保留一個或兩個ITR序列以最大化可經AAV載體有效包裝之轉殖基因之大小。結構及非結構蛋白編碼序列可以反式提供(例如自質體，或藉由將序列穩定整合至包裝細胞中)。在一些實施例中，rAAV載體基因體包含至少一個ITR序列(例如AAV ITR序列)，視情況地兩個ITR (例如兩個AAV ITR)，其通常將在載體基因體之5'端及3’端(即5’ ITR及3’ ITR)且側接異源核酸，但無需與其鄰接。
本文所述之病毒載體另外可為如國際專利公開案WO00/28004及Chao等人(2000) Molecular Therapy 2:619中所述之「靶向」病毒載體(例如具有定向向性)及/或「雜合」病毒載體(即其中病毒ITR及病毒蛋白質衣殼來自不同之病毒)。在一些實施例中，病毒載體係靶向CNS之細胞及/或組織。
本文所述之病毒載體另外可為如國際專利公開案WO 01/92551 (其揭示內容之全文皆以引用方式併入本文中)中所述之雙鏈病毒顆粒。因此，在一些實施例中，雙股(雙鏈)基因體可包裝至本文所述之病毒蛋白質衣殼中。此外，蛋白質衣殼、蛋白質衣殼次單元或基因體元件可含有其他修飾，包括插入、缺失及/或取代。
如本文所用之術語「胺基酸」 涵蓋任何天然胺基酸、其經修飾形式及合成胺基酸。天然左旋(L-)胺基酸顯示於表4中。表 4 ：胺基酸殘基及縮寫。
胺基酸殘基 縮寫
三字母代碼 單字母代碼
丙胺酸 Ala A
精胺酸 Arg R
天冬醯胺 Asn N
天冬胺酸(天冬胺酸鹽) Asp D
半胱胺酸 Cys C
麩醯胺酸 Gln Q
麩胺酸(麩胺酸鹽) Glu E
甘胺酸 Gly G
組胺酸 His H
異白胺酸 Ile I
白胺酸 Leu L
離胺酸 Lys K
甲硫胺酸 Met M
苯丙胺酸 Phe F
脯胺酸 Pro P
絲胺酸 Ser S
蘇胺酸 Thr T
色胺酸 Trp W
酪胺酸 Tyr Y
纈胺酸 Val V
替代地，胺基酸可為經修飾之胺基酸殘基(非限制性實例顯示於表5中)及/或可為藉由轉譯後修飾(例如乙醯化、醯胺化、甲醯化、羥基化、甲基化、磷酸化或硫酸化)修飾之胺基酸。化學修飾胺基酸之方法為此項技術中已知(例如，參見Greg T. Hermanson, Bioconjugate Techniques，第1版，Academic Press, 1996)。表 5 ：經修飾之胺基酸殘基
經修飾之胺基酸殘基 縮寫
胺基酸殘基衍生物
2-胺基己二酸 Aad
3-胺基己二酸 bAad
β-丙胺酸，β-胺基丙酸 bAla
2-胺基丁酸 Abu
4-胺基丁酸，六氫吡啶酸 4Abu
6-胺基己酸 Acp
2-胺基庚酸 Ahe
2-胺基異丁酸 Aib
3-胺基異丁酸 bAib
2-胺基庚二酸 Apm
第三丁基丙胺酸 t-BuA
瓜胺酸 Cit
環己基丙胺酸 Cha
2,4-二胺基丁酸 Dbu
鎖鏈素 Des
2,21-二胺基庚二酸 Dpm
2,3-二胺基丙酸 Dpr
N-乙基甘胺酸 EtGly
N-乙基天冬醯胺 EtAsn
高精胺酸 hArg
高半胱胺酸 hCys
高絲胺酸 hSer
羥離胺酸 Hyl
別-羥離胺酸 aHyl
3-羥脯胺酸 3Hyp
4-羥脯胺酸 4Hyp
異鎖鏈素 Ide
別-異白胺酸 aIle
甲硫胺酸亞碸 MSO
N-甲基甘胺酸，肌胺酸 MeGly
N-甲基異白胺酸 MeIle
6-N-甲基離胺酸 MeLys
N-甲基纈胺酸 MeVal
2-萘基丙胺酸 2-Nal
正纈胺酸 Nva
正白胺酸 Nle
鳥胺酸 Orn
4-氯苯丙胺酸 Phe(4-C1)
2-氟苯丙胺酸 Phe(2-F)
3-氟苯丙胺酸 Phe(3-F)
4-氟苯丙胺酸 Phe(4-F)
苯基甘胺酸 Phg
β-2-噻吩基丙胺酸 Thi
此外，非天然(non-naturally occurring)胺基酸可為「非天然(unnatural)」胺基酸(如Wang等人，Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)所述)。該等非天然胺基酸可有利地用於將相關分子化學連接至AAV蛋白質衣殼或衣殼蛋白次單元。經修飾之 AAV 蛋白質衣殼次單元、蛋白質衣殼及包含其之 AAV 載體 AAV 載體
本文另外提供腺相關病毒(AAV)載體，其包含(i)包含重組衣殼蛋白次單元之蛋白質衣殼，及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之轉移盒。在一些實施例中，重組衣殼蛋白次單元(包括VP1區、VP2區及/或VP3區)可在其胺基酸序列中包含不存在于任何天然AAV衣殼蛋白次單元序列中之肽。包含本文所述肽之衣殼蛋白次單元可賦予病毒載體一或多種期望性質，包括(但不限於)逃避中和抗體之能力。因此，本文所述之AAV載體解決了與習用AAV載體相關之限制。
因此，在一些實施例中，本揭示案提供腺相關病毒(AAV)載體，其包含(i)一或多種重組衣殼蛋白及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之轉移盒；其中衣殼蛋白包含具有SEQ ID NO: 12-20中任一者之序列之肽。在一些實施例中，轉移盒包含5’及3’ AAV反向末端重複。在一些實施例中，轉移盒包含轉殖基因(例如NPC1轉殖基因)。在一些實施例中，轉移盒係雙股的。在一些實施例中，轉移盒係單股的。在一些實施例中，轉殖基因編碼治療蛋白或RNA。在一些實施例中，重組衣殼蛋白與AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或鳥AAV衣殼蛋白之天然序列具有至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之序列一致性。在一些實施例中，重組衣殼蛋白與AAV9衣殼蛋白之天然序列具有至少90%序列一致性。
在一些實施例中，肽位於對應於天然AAV9衣殼蛋白次單元之胺基酸451-458或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基之胺基酸位置，且肽係選自SEQ ID NO: 12-18中之任一者。在一些實施例中，肽位於對應於天然AAV9衣殼蛋白次單元之胺基酸587-594或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基之胺基酸位置，且肽係選自SEQ ID NO: 19或20。
在一些實施例中，重組衣殼蛋白次單元包含a)具有SEQ ID NO: 12-18中任一者之序列之第一肽；及b)具有SEQ ID NO: 19-20中任一者之序列之第二肽。在一些實施例中，第一肽處於胺基酸位置451-458，且第二肽處於胺基酸587-594，其中胺基酸編號係基於天然AAV9衣殼蛋白次單元或AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh32.33、AAVrh74、牛AAV或鳥AAV中之等效胺基酸殘基。
在一些實施例中，肽抑制至少一種抗體與蛋白質衣殼或其衣殼蛋白次單元之結合。在一些實施例中，肽抑制抗體對AAV載體之感染性之中和。
在一些實施例中，肽選擇性結合至在中樞神經系統(CNS)之細胞表面上表現之受體。在一些實施例中，細胞處於前運動皮質、視丘、小腦皮質、齒狀核、脊髓或背根神經節中。在一些實施例中，肽選擇性結合至在心臟之細胞表面上表現之受體。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含：(i)包含突變體AAV9衣殼蛋白次單元之蛋白質衣殼及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之轉移盒，其中衣殼蛋白次單元包含在天然AAV9衣殼蛋白次單元序列之胺基酸451-458處具有序列 X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 (SEQ ID NO: 158)之肽，其中肽不存在於天然AAV9衣殼蛋白次單元序列中。在一些實施例中，X1 不為I，X2 不為N，X3 不為G，X4 不為S，X5 不為G，X6 不為Q，X7 不為N，及/或X8 不為Q。在一些實施例中，X1 係S、F、Q、G、K或R。在一些實施例中，X2 係C、G、R、D、T或Q。在一些實施例中，X3 係Q、V、G、Y、R、F或D。在一些實施例中，X4 係P、Q、A或R。在一些實施例中，X5 係T、N、A、P或I。在一些實施例中，X6 係V、Q、A或I。在一些實施例中，X7 係M、P、R、Q或N。在一些實施例中，X8 係N、L、F、E、H或A。在一些實施例中，X1 係S，X2 係C，X3 係Q，X4 係P，X5 係T，X6 係V，X7 係M，且X8 係N。在一些實施例中，X1 係F，X2 係G，X3 係V，X4 係P，X5 係N，X6 係Q，X7 係P，且X8 係L。在一些實施例中，X1 係Q，X2 係R，X3 係G，X4 係Q，X5 係A，X6 係A，X7 係P，且X8 係F。在一些實施例中，X1 係G，X2 係D，X3 係Y，X4 係A，X5 係P，X6 係I，X7 係R，且X8 係E。在一些實施例中，X1 係K，X2 係T，X3 係R，X4 係R，X5 係I，X6 係V，X7 係Q，且X8 係H。在一些實施例中，X1 係F，X2 係G，X3 係F，X4 係P，X5 係N，X6 係Q，X7 係P，且X8 係L。在一些實施例中，X1 係R，X2 係Q，X3 係D，X4 係Q，X5 係P，X6 係I，X7 係N，且X8 係A。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含：(i)包含突變體AAV9衣殼蛋白次單元之蛋白質衣殼及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之轉移盒，其中衣殼蛋白次單元包含在天然AAV9衣殼蛋白次單元序列之胺基酸587-594處具有序列X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 (SEQ ID NO: 158)之肽，其中肽不存在於天然AAV9衣殼蛋白次單元序列中。在一些實施例中，X1 不為A，X2 不為Q，X3 不為A，X4 不為Q，X5 不為A，X6 不為Q，X7 不為T，及/或X8 不為G。在一些實施例中，X1 係S。在一些實施例中，X2 係K或T。在一些實施例中，X3 係V。在一些實施例中，X4 係E或D。在一些實施例中，X5 係S。在一些實施例中，X6 係W或I。在一些實施例中，X7 係T或A。在一些實施例中，X8 係E或I。在一些實施例中，X1 係S，X2 係K，X3 係V，X4 係E，X5 係S，X6 係W，X7 係T，且X8 係E。在一些實施例中，X1 係S，X2 係T，X3 係V，X4 係D，X5 係S，X6 係I，X7 係A，且X8 係I。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含：(i)包含重組衣殼蛋白次單元之蛋白質衣殼及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之轉移盒，其中衣殼蛋白次單元包含與SEQ ID NO: 165-187中之任一者至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 165-187中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 175之胺基酸序列。在一些實施例中，衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 180之胺基酸序列。
在一些實施例中，AAV載體將轉移盒選擇性遞送至中樞神經系統之細胞或組織。在一些實施例中，中樞神經系統之組織係前運動皮質、視丘、小腦皮質、齒狀核、脊髓或背根神經節。在一些實施例中，AAV載體將轉移盒遞送至腦，但不將AAV載體遞送至心臟。在一些實施例中，AAV載體將轉移盒遞送至腦及心臟。在一些實施例中，轉移盒至腦之遞送大於至心臟之遞送。在一些實施例中，轉移盒之遞送在腦及心臟中大致相同。AAV 衣殼蛋白次單元及包含其之蛋白質衣殼
在一些實施例中，本揭示案提供與天然AAV衣殼蛋白次單元相比包含一或多個胺基酸修飾(例如取代及/或缺失)之腺相關病毒(AAV)衣殼蛋白次單元，其中一或多個修飾修飾AAV衣殼蛋白次單元上之一或多個抗原位點。一或多個抗原位點之修飾可減少抗體對一或多個抗原位點之識別及/或抑制包含AAV衣殼蛋白次單元之病毒顆粒之感染性之中和。一或多個胺基酸修飾(例如 取代及/或缺失)可處於藉由肽抗原決定基定位及/或含有AAV衣殼蛋白次單元之AAV-抗體複合物之低溫電子顯微術研究鑒別之一或多個抗原足跡中。在一些實施例中，一或多個抗原位點係如WO 2017/058892中所述之常用抗原基元或CAM，該申請案之全文皆以引用方式併入本文中。在一些實施例中，抗原位點處於AAV衣殼蛋白次單元之可變區(VR)中，例如VR-I、VR-II、VR-III、VR-IV、VR-V、VR-VI、VR-VII、VR-VIII、VR-IX。在一些實施例中，一或多個抗原位點處於AAV衣殼蛋白次單元之HI環中。
在一些實施例中，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh32.22、牛AAV或鳥AAV衣殼蛋白次單元包含下表6中所鑒別之一或多個區域之胺基酸修飾(例如取代或缺失)。表 6 ：多種 AAV 衣殼蛋白次單元上之可部分或完全經取代 / 替代之例示性抗原區或其他區域。 顯示天然AAV衣殼蛋白次單元序列中之殘基之各別VP1編號。
AAV1 序列 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV2 序列 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV3 序列 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV4 序列 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV5 序列 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO
SASTGAS (262-268) 2591 SQSGAS (262-267) 2601 SQSGAS (262-267) 2611 RLGESLQS (253-260) 2621 EIKSGSVDGS (249-258) 2631
VFMIPQYGYL (370-379) 2592 VFMVPQYGYL (369-378) 2602 VFMVPQYGYL (369-378) 2612 VFMVPQYGYC (360-369) 2622 VFTLPQYGYA (360-369) 2632
NQSGSAQNK (451-459) 2593 TPSGTTTQS (450-458) 2603 TTSGTTNQS (451- 459) 2613 GTTLNAGTA (445-453) 2623 STNNTGGVQ (440-448) 2633
SV (472-473) 2594 RD (471-472) 2604 SL (472-473) 2614 SN (466-467) 2624 AN (458-459) 2634
KTDNNNSN (493-500) 2595 SADNNNSE (492-499) 2605 ANDNNNSN (493-500) 2615 ANQNYKIPATGS (487-498) 2625 SGVNRAS (479-485) 2635
KDDEDKF (528-534) 2596 KDDEEKF (527-533) 2606 KDDEEKF (528-534) 2616 GPADSKF (527-533) 2626 LQGSNTY (515-521) 2636
SAGASN (547-552) 2597 GSEKTN (546-551) 2607 GTTASN (547-552) 2617 QNGNTA (545-560) 2627 ANPGTTAT (534-541) 2637
STDPATGDVH (588-597) 2598 NRQAATADVN (587-596) 2608 NTAPTTGTVN (588-597) 2618 SNLPTVDRLT (583-595) 2628 TTAPATGTYN (577-586) 2638
AN (709-710) 2599 VN (708-709) 2609 VN (709-710) 2619 NS (707-708) 2629 QF (697-698) 2639
DNNGLYT (716-722) 2600 DTNGVYS (715-721) 2610 DTNGVYS (716-722) 2620 DAAGKYT (714-720) 2630 DSTGEYR (704-710) 2640
AAV6 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV7 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV8 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAV9 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO AAVrh8 ( 胺基酸編號) SEQ ID NO
SASTGAS (262-268) 2641 SETAGST (263-269) 2651 NGTSGGAT (263-270) 2661 NSTSGGSS (262-269) 2671 NGTSGGST (262-269) 2681
VFMIPQYGYL (370-379) 2642 VFMIPQYGYL (371-380) 2652 VFMIPQYGYL (372-381) 2662 VFMIPQYGYL (371-380) 2672 VFMVPQYGYL (371-380) 2682
NQSGSAQNK (451-459) 2643 NPGGTAGNR (453-461) 2653 TTGGTANTQ (453-461) 2663 INGSGQNQQ (451-459) 2673 QTTGTGGTQ (451-459) 2683
SV (472-473) 2644 AN (474-475) 2654 AN (474-475) 2664 AV (472-473) 2674 AN (472-473) 2684
KTDNNNSN (493-500) 2645 LDQNNNSN (495-502) 2655 TGQNNNSN (495-502) 2665 VTQNNNSE (493-500) 2675 TNQNNNSN (493-500) 2685
KDDKDKF (528-534) 2646 KDDEDRF (530-536) 2656 KDDEERF (530-536) 2666 KEGEDRF (528-534) 2676 KDDDDRF (528-534) 2686
SAGASN (547-552) 2647 GATNKT (549-554) 2657 NAARDN (549-554) 2667 GTGRDN (547-552) 2677 GAGNDG (547-552) 2687
STDPATGDVH (588-897) 2648 NTAAQTQVVN (589-598) 2658 NTAPQIGTVNS (590-600) 2668 QAQAQTGWVQ (588-597) 2678 NTQAQTGLVH (588-597) 2688
AN (709-710) 2649 TG (710-711) 2659 TS (711-712) 2669 NN (709-710) 2679 TN (709-710) 2689
DNNGLYT (716-722) 2650 DSQGVYS (717-723) 2660 NTEGVYS (718-724) 2670 NTEGVYS (716-722) 2680 NTEGVYS (716-722) 2690
AAVrh10 ( 胺基酸編號 ) SEQ ID NO AAV10 ( 胺基酸編號 ) SEQ ID NO AAV11 ( 胺基酸編號 ) SEQ ID NO AAV12 ( 胺基酸編號 ) SEQ ID NO AAVrh32.33 ( 胺基酸編號 ) SEQ ID NO
NGTSGGST (263-270) 2691 NGTSGGST (263-270) 2701 RLGTTSSS (253-260) 2711 RIGTTANS (262-269) 2721 RLGTTSNS (253-260) 2731
VFMIPQYGYL (372-381) 2692 VFMIPQYGYL (372-381) 2702 VFMVPQYGYC (360-369) 2712 VFMVPQYGYC (369-378) 2722 VFMVPQYGYC (360-369) 2732
STGGTAGTQ (453-461) 2693 STGGTQGTQ (453-461) 2703 GETLNQGNA (444-452) 2713 GNSLNQGTA (453-461) 2723 GETLNQGNA (444-452) 2733
SA (474-475) 2694 SA (474-475) 2704 AF (465-466) 2714 AY (474-475) 2724 AF (465-466) 2734
LSQNNNSN (495-502) 2695 LSQNNNSN (495-502) 2705 ASQNYKIPASGG (486-497) 2715 ANQNYKIPASGG (495-506) 2725 ASQNYKIPASGG (486-497) 2735
KDDEERF (530-536) 2696 KDDEERF (530-536) 2706 GPSDGDF (526-532) 2716 GAGDSDF (535-541) 2726 GPSDGDF (526-532) 2736
GAGKDN (549-554) 2697 GAGRDN (549-554) 2707 VTGNTT (544-549) 2717 PSGNTT (553-558) 2727 VTGNTT (544-549) 2737
NAAPIVGAVN (590-599) 2698 NTGPIVGNVN (590-599) 2708 TTAPITGNVT (585-594) 2718 TTAPHIANLD (594-503) 2728 TTAPITGNVT (585-594) 2738
TN (711-712) 2699 TN (711-712) 2709 SS (706-707) 2719 NS (715-716) 2729 SS (706-707) 2739
NTDGTYS (718-724) 2700 NTEGTYS (718-724) 2710 DTTGKYT (713-719) 2720 DNAGNYH (722-728) 2730 DTTGKYT (713-719) 2740
牛 AAV ( 胺基酸編號 ) SEQ ID NO 鳥 AAV ( 胺基酸編號 ) SEQ ID NO
RLGSSNAS (255-262) 2741 RIQGPSGG (265-272) 2751
VFMVPQYGYC (362-371) 2742 IYTIPQYGYC (375-384) 2752
GGTLNQGNS (447-455) 2743 VSQAGSSGR (454-462) 2753
SG (468-469) 2744 AA (475-476) 2754
ASQNYKIPQGRN (489-500) 2745 ASNITKNNVFSV (496-507) 2755
ANDATDF (529-535) 2746 FSGEPDR (533-539) 2756
ITGNTT (547-552) 2747 VYDQTTAT (552-559) 2757
TTVPTVDDVD (588-597) 2748 VTPGTRAAVN (595-604) 2758
DS (709-710) 2749 AD (716-717) 2759
DNAGAYK (716-722) 2750 SDTGSYS (723-729) 2760
在一些實施例中，胺基酸取代替代以下血清型中任一者之AAV衣殼蛋白次單元中之任八個胺基酸：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh32.22、牛AAV或鳥AAV。舉例而言，胺基酸取代可替代上文所列出之AAV血清型中任一者之以下胺基酸(VP1編號)：355-362、363-370、371-378、379-386、387-394、395-402、403-410、411-418、419-426、427-434、435-442、443-450、451-458、459-466、467-474、475-482、483-490、491-498、499-506、507-514、515-522、523-530、531-538、539-546、547-554、555-562、563-570、571-578、579-586、587-594、595-602、603-610、611-618、619-626、627-634、635-642、643-650、651-658、659-666、667-674、675-682、683-690、691-698、699-706、707-714、715-722。
在一些實施例中，胺基酸取代係選自SEQ ID NO: 19-20中之任一者。在一些實施例中，胺基酸取代與SEQ ID NO: 12-18中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之序列一致性。在一些實施例中，取代處於對應於野生型AAV9衣殼蛋白次單元之胺基酸587-594之胺基酸。在一些實施例中，取代處於對應於野生型AAV1衣殼蛋白次單元之胺基酸587-594之胺基酸。在一些實施例中，取代處於對應於野生型AAV6衣殼蛋白次單元之胺基酸587-594之胺基酸。在一些實施例中，取代處於對應於野生型AAV8衣殼蛋白次單元之胺基酸589-596之胺基酸。在一些實施例中，取代處於對應於野生型AAVrh8衣殼蛋白次單元之胺基酸587-594之胺基酸。在一些實施例中，取代處於對應於野生型AAVrh10衣殼蛋白次單元之胺基酸589-596之胺基酸。
在一些實施例中，胺基酸取代係選自SEQ ID NO: 18-20中之任一者。在一些實施例中，胺基酸取代與SEQ ID NO: 18-20中之任一者具有至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之序列一致性。在一些實施例中，取代處於對應於野生型AAV9衣殼蛋白次單元之胺基酸451-458之胺基酸。
在一些實施例中，胺基酸缺失包含與野生型衣殼蛋白次單元相比缺失至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或至少十個胺基酸。
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含一或多個胺基酸取代及一或多個胺基酸缺失。在一些實施例中，衣殼蛋白次單元包含至少一個胺基酸取代及至少一個胺基酸缺失。在一些實施例中，衣殼蛋白次單元包含至少一個胺基酸取代及至少一個胺基酸缺失，其中至少一個胺基酸取代及至少一個胺基酸缺失在衣殼蛋白次單元胺基酸序列中彼此緊鄰。
在一些實施例中，衣殼蛋白次單元經修飾以產生AAV衣殼蛋白次單元，該AAV衣殼蛋白次單元在存在於AAV病毒顆粒或AAV病毒載體中時具有選擇性靶向CNS (例如腦、脊髓)之表型。在一些實施例中，衣殼蛋白次單元經修飾以產生AAV衣殼蛋白次單元，該AAV衣殼蛋白次單元在存在於AAV病毒顆粒或AAV病毒載體中時具有逃避中和抗體之表型。除逃避中和抗體及/或靶向CNS之表型外，AAV病毒樣顆粒或AAV載體亦可具有增強或維持轉導效率之表型。
在一些實施例中，一或多個取代可將一或多個序列自第一AAV血清型之衣殼蛋白次單元引入不同於第一AAV血清型之第二AAV血清型之衣殼蛋白次單元中。
向其添加修飾之基礎AAV衣殼蛋白次單元可為選自以下之AAV血清型之衣殼蛋白次單元：AAV1、AAV2、AAV3、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh.8、AAVrh.10、AAVrh.32.33、AAVrh74、牛AAV、鳥AAV或現在已知或後來鑒別之任何其他AAV。在一些實施例中，基礎AAV衣殼蛋白次單元具有AAV9血清型。在一些實施例中，基礎AAV衣殼蛋白次單元係嵌合的。在一些實施例中，基礎AAV衣殼蛋白次單元係AAV8/9嵌合體。
本文提供經修飾AAV衣殼蛋白次單元之若干實例。在以下實例中，衣殼蛋白次單元可包含所述之特定取代，且在一些實施例中可包含少於或多於所述彼等取代之取代。如本文所用之「取代」可指單一胺基酸取代或一個以上之鄰接胺基酸取代。舉例而言，在一些實施例中，衣殼蛋白次單元可包含至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個等單一胺基酸取代。在一些實施例中，衣殼蛋白次單元可包含多個鄰接胺基酸之一或多個取代，例如2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個或12個鄰接胺基酸之一或多個取代。
此外，在本文所述之一些實施例(其中胺基酸殘基經除存在於野生型或天然胺基酸序列中之胺基酸殘基外之任一胺基酸殘基取代)中，任何其他胺基酸殘基可為此項技術中已知之任何天然或非天然胺基酸殘基(例如，參見表2及表4)。在一些實施例中，取代可為保守取代，且在一些實施例中，取代可為非保守取代。在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含一或多個胺基酸取代，其中胺基酸取代係各自獨立地選自如表7.1中所示之SEQ ID NO: 12-18。表 7.1 ：胺基酸取代
胺基酸取代 SEQ ID NO.
SCQPTVMN 12
FGVPNQPL 13
QRGQAAPF 14
GDYAPIRE 15
KTRRIVQH 16
FGFPNQPL 17
RQDQPINA 18
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含一或多個胺基酸取代，其中胺基酸取代係各自選自如表7.2中所示之SEQ ID NO: 19-20。表 7.2 ：胺基酸取代
胺基酸取代 SEQ ID NO.
SKVESWTE 19
STVDSIAI 20
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元可包含選自表7.1中所列出之序列之第一取代及選自表7.2中所列出之序列之第二取代。在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元可包含如表7.3及表7.4中所示之第一取代、第二取代。表 7.3 ：胺基酸取代之組合
第一取代 (SEQ ID NO) 第二取代 (SEQ ID NO)
12、13、14、15、16、17或18 19或20
表 7.4 胺基酸取代之組合
第一取代 (SEQ ID NO) 第二取代 (SEQ ID NO)
12 19
12 20
13 19
13 20
14 19
14 20
15 19
15 20
16 19
16 20
17 19
17 20
18 19
18 20
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含胺基酸修飾(例如取代及/或缺失)，其中胺基酸修飾修飾AAV衣殼蛋白次單元上之一或多個表面暴露區域，例如抗原區。
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含一或多個胺基酸取代，其中至少一個胺基酸取代包含SEQ ID NO: 19-20中之一者。在一些實施例中，取代替代對應於野生型AAV9衣殼蛋白次單元之胺基酸587-594之胺基酸。
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含一或多個胺基酸取代，其中至少一個胺基酸取代包含SEQ ID NO: 12-18中之一者。在一些實施例中，取代替代對應於野生型AAV9衣殼蛋白次單元之胺基酸451-458之胺基酸。
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含取代，該取代包含八胺基酸序列(X1 -X2 -X3 -X4 -X5 -X6 -X7 -X8 ) (SEQ ID NO: 158)，該序列不存在於天然衣殼蛋白次單元序列中。在一些實施例中，X1 不為I，X2 不為N，X3 不為G，X4 不為S，X5 不為G，X6 不為Q，X7 不為N，及/或X8 不為Q。在一些實施例中，X1 係S、F、Q、G、K或R。在一些實施例中，X2 係C、G、R、D、T或Q。在一些實施例中，X3 係Q、V、G、Y、R、F或D。在一些實施例中，X4 係P、Q、A或R。在一些實施例中，X5 係T、N、A、P或I。在一些實施例中，X6 係V、Q、A或I。在一些實施例中，X7 係M、P、R、Q或N。在一些實施例中，X8 係N、L、F、E、H或A。在一些實施例中，X1 係S，X2 係C，X3 係Q，X4 係P，X5 係T，X6 係V，X7 係M，且X8 係N。在一些實施例中，X1 係F，X2 係G，X3 係V，X4 係P，X5 係N，X6 係Q，X7 係P，且X8 係L。在一些實施例中，X1 係Q，X2 係R，X3 係G，X4 係Q，X5 係A，X6 係A，X7 係P，且X8 係F。在一些實施例中，X1 係G，X2 係D，X3 係Y，X4 係A，X5 係P，X6 係I，X7 係R，且X8 係E。在一些實施例中，X1 係K，X2 係T，X3 係R，X4 係R，X5 係I，X6 係V，X7 係Q，且X8 係H。在一些實施例中，X1 係F，X2 係G，X3 係F，X4 係P，X5 係N，X6 係Q，X7 係P，且X8 係L。在一些實施例中，X1 係R，X2 係Q，X3 係D，X4 係Q，X5 係P，X6 係I，X7 係N，且X8 係A。
在一些實施例中，X1 不為A，X2 不為Q，X3 不為A，X4 不為Q，X5 不為A，X6 不為Q，X7 不為T，及/或X8 不為G。在一些實施例中，X1 係S。在一些實施例中，X2 係K或T。在一些實施例中，X3 係V。在一些實施例中，X4 係E或D。在一些實施例中，X5 係S。在一些實施例中，X6 係W或I。在一些實施例中，X7 係T或A。在一些實施例中，X8 係E或I。在一些實施例中，X1 係S，X2 係K，X3 係V，X4 係E，X5 係S，X6 係W，X7 係T，且X8 係E。在一些實施例中，X1 係S，X2 係T，X3 係V，X4 係D，X5 係S，X6 係I，X7 係A，且X8 係I。
在一些實施例中，AAV次單元蛋白包含一或多個胺基酸缺失，其中胺基酸缺失包含與野生型AAV衣殼蛋白次單元相比缺失至少六個或至少八個胺基酸。在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含與天然衣殼蛋白次單元序列相比缺失八個連續胺基酸。在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含與天然衣殼蛋白次單元序列相比缺失六個連續胺基酸。
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含序列LSKTQTLK (SEQ ID NO: 1374)或序列LSKTDPQTLK (SEQ ID NO: 1375)。在一些實施例中，包含SEQ ID NO: 1374或1375之AAV衣殼蛋白次單元具有選自以下之血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、鳥AAV及牛AAV。
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含含有選自SEQ ID NO: 12-18之序列之第一取代；及含有選自SEQ ID NO: 19-20之序列之第二取代。
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含胺基酸缺失及取代，其中取代包含選自SEQ ID NO: 12-20之序列。
在一些實施例中，重組衣殼蛋白次單元具有與SEQ ID NO: 9 (AAV9)至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致且包含一或多個以下胺基酸取代之序列：I451S、I451F、I451Q、I451G、I451K、I451R、N452C、N452G、N452R、N452D、N452T、N452Q、G453Q、G453V、G453Y、G453R、G453F、G453D、S454P、S454Q、S454A、S454R、G455T、G455N、G455A、G455P、G455I、Q456V、Q456A、Q456I、N457M、N457P、N457R、N457Q、Q458N、Q458L、Q458F、Q458E、Q458H、Q458A、A587S、Q588K、Q588T、A589V、Q590E、Q590D、A591S、Q592W、Q592I、T593A、G594E、G594I。
任一本文所述AAV衣殼蛋白次單元可進一步包含HI環之修飾(例如取代或缺失)。HI環係AAV衣殼蛋白次單元表面上之主要結構域，介於β股βH與βI之間，其自各病毒蛋白(VP)次單元延伸，與相鄰之五重VP重疊。在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含HI環中之一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個或八個胺基酸取代。在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含HI環中之一或多個以下取代：P661R、T662S、Q666G、S667D，其中編號對應於野生型AAV8衣殼蛋白次單元(SEQ ID NO: 8)。在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含HI環中之一或多個以下取代：P659R、T660S、A661T、K664G，其中編號對應於野生型AAV9衣殼蛋白次單元(SEQ ID NO: 9)。
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含一個、兩個、三個或四個胺基酸取代，其中每一取代修飾AAV衣殼蛋白次單元上之不同抗原位點，且其中至少一個胺基酸取代修飾衣殼蛋白次單元之HI環。
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含第一、第二、第三及第四個胺基酸取代。在一些實施例中，至少一個取代修飾衣殼蛋白次單元之HI環。在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含HI環中之一或多個以下取代：P661R、T662S、Q666G、S667D，其中編號對應於野生型AAV8衣殼蛋白次單元(SEQ ID NO: 8)；或P659R、T660S、A661T、K664G，其中編號對應於野生型AAV9衣殼蛋白次單元(SEQ ID NO: 9)。在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 185-187中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元包含與SEQ ID NO: 165-187中之任一者共用至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
本文亦提供編碼一或多種本文所述AAV衣殼蛋白次單元之核酸或包含該核酸之質體。核苷酸序列可為DNA序列或RNA序列。在一些實施例中，細胞包含一或多種本文所述之核酸或質體。
在一些實施例中，AAV蛋白質衣殼包含如本文所述之AAV衣殼蛋白次單元。本文進一步提供包含AAV蛋白質衣殼之病毒載體以及包含醫藥學上可接受之載劑中之AAV蛋白質衣殼、AAV衣殼蛋白次單元及/或病毒載體之組合物。
在一些實施例中，一或多個抗原位點之修飾可減少抗體與一或多個抗原位點之結合。在一些實施例中，一或多個抗原位點之修飾可抑制包含AAV衣殼蛋白次單元之病毒顆粒之感染性之中和。
如本文所述，來自多種AAV之衣殼蛋白次單元之核酸及胺基酸序列為此項技術中已知。因此，可容易地確定任何其他AAV之「對應於」天然AAV衣殼蛋白次單元之胺基酸位置之胺基酸(例如藉由使用序列比對)。
經修飾之衣殼蛋白次單元可藉由修飾現在已知或後來發現之任何AAV之衣殼蛋白次單元來產生。此外，欲修飾之基礎AAV衣殼蛋白次單元可為天然AAV衣殼蛋白次單元(例如AAV2、AAV3a或3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11衣殼蛋白次單元或表2中所示之任一AAV)，但不限於此。熟習此項技術者應理解，對AAV衣殼蛋白次單元之多種操縱為此項技術中已知且本揭示案並不限於天然AAV衣殼蛋白次單元之修飾。舉例而言，欲修飾之衣殼蛋白與天然AAV相比可能已具有變化(例如衍生自天然AAV衣殼蛋白次單元，例如AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或現在已知或後來發現之任何其他AAV)。在一些實施例中，衣殼蛋白次單元可為嵌合衣殼蛋白次單元。在一些實施例中，衣殼蛋白次單元可為經改造之AAV，例如AAV2i8、AAV2g9、AAV-LK03、AAV7m8、AAV Anc80、AAV PHP.B。
因此，在一些實施例中，欲修飾之AAV衣殼蛋白次單元可衍生自天然AAV，但進一步包含插入及/或取代至衣殼蛋白次單元中之一或多個外源序列(例如天然病毒之外源)及/或已藉由缺失一或多個胺基酸而改變。
因此，當本文提及特定AAV衣殼蛋白次單元(例如AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11衣殼蛋白次單元或來自表2中所示之任一AAV之衣殼蛋白次單元等)時，其意欲涵蓋天然衣殼蛋白次單元以及具有除本文所述修飾外之變化之衣殼蛋白次單元。該等變化包括取代、插入及/或缺失。在一些實施例中，與天然AAV衣殼蛋白次單元序列相比，衣殼蛋白次單元包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個、少於20個、少於30個、少於40個、少於50個、少於60個或少於70個插入其中之胺基酸(本文所述之插入除外)。在一些實施例中，與天然AAV衣殼蛋白次單元序列相比，衣殼蛋白次單元包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19或20個、少於20個、少於30個、少於40個、少於50個、少於60個或少於70個胺基酸取代(本文所述之胺基酸取代除外)，在一些實施例中，與天然AAV衣殼蛋白次單元序列相比，衣殼蛋白次單元包含缺失1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個或20個、少於20個、少於30個、少於40個、少於50個、少於60個或少於70個胺基酸。
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元具有與天然AAV衣殼蛋白次單元序列至少約90%、約95%、約97%、約98%或約99%相似或一致之胺基酸序列。
測定兩個或更多個胺基酸序列之間之序列相似性或一致性之方法為此項技術中已知。序列相似性或一致性可針對整個核酸長度或所指示核酸部分來測定。序列相似性或一致性可使用標準技術來測定，該等標準技術包括(但不限於) Smith及Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 482 (1981)之局部序列一致性演算法；Needleman及Wunsch, J Mol. Biol. 48,443 (1970)之序列一致性比對演算法；Pearson及Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)之相似性搜索方法；該等演算法(Wisconsin Genetics軟體包中之GAP、BESTFIT、FASTA及TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WI)之計算實施；Devereux等人，Nucl. Acid Res. 12, 387-395 (1984)所述之最佳擬合序列程式或檢查。
另一適宜演算法係Altschul等人，J Mol. Biol. 215, 403-410, (1990)及Karlin等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 5873-5787 (1993)中所述之BLAST演算法。尤其有用之BLAST程式係自Altschul等人，Methods in Enzymology, 266, 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html獲得之WU-BLAST-2程式。WU-BLAST-2利用若干搜索參數，該等搜索參數視情況地設定為預設值。該等參數係動態值且由程式本身端視特定序列之組成及正在搜索相關序列之特定資料庫之組成來建立；然而，可調整該等值以增加靈敏度。
此外，另一有用之演算法係如Altschul等人(1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402報導之空位化BLAST。
出於本揭示案之目的，除非另有指示，否則一致性%係使用可在blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi上在線獲得之基本局部比對搜索工具(BLAST)來計算。熟習此項技術者應理解，可視需要取代其他演算法。
在一些實施例中，蛋白質衣殼包含如本文所述之經修飾AAV衣殼蛋白次單元。在一些實施例中，蛋白質衣殼係細小病毒衣殼，其可進一步為自主細小病毒衣殼或依賴病毒衣殼。視情況地，蛋白質衣殼係AAV蛋白質衣殼。在一些實施例中，AAV蛋白質衣殼係AAV1、AAV2、AAV3a、AAV3b、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、牛AAV蛋白質衣殼、鳥AAV蛋白質衣殼或現在已知或後來鑒別之任何其他AAV。AAV血清型之非限制性列表顯示於表2中。AAV蛋白質衣殼可為表2中所列出之任一AAV血清型或因一或多個插入、取代及/或缺失而衍生自前述任一者。可由經修飾之病毒蛋白質衣殼包裝並轉移至細胞中之分子包括轉移盒(例如異源DNA或RNA)、多肽、有機小分子、金屬或其組合。
異源分子定義為並非天然存在於AAV感染中之彼等分子，例如 並不由野生型AAV基因體編碼之彼等分子。此外，治療上有用之分子可與嵌合蛋白質衣殼之外部締合以將分子轉移至宿主靶細胞中。該等締合之分子可包括DNA、RNA、有機小分子、金屬、碳水化合物、脂質及/或多肽。在一些實施例中，治療上有用之分子共價連接(即結合或化學偶合)至蛋白質衣殼或其衣殼蛋白。共價連接分子之方法為熟習此項技術者已知。
經修飾之蛋白質衣殼亦可用於產生針對新穎蛋白質衣殼結構之抗體。作為另一替代，可將外源胺基酸序列插入經修飾之蛋白質衣殼或其衣殼蛋白次單元中以將抗原呈遞至細胞，例如投與個體以產生針對外源胺基酸序列之免疫反應。
在一些實施例中，可在投與遞送編碼相關多肽或功能性RNA之核酸之病毒載體之前及/或與其同時(例如在彼此之數分鐘或數小時內)投與蛋白質衣殼以阻斷某些細胞位點。舉例而言，可遞送本發明之蛋白質衣殼以阻斷肝細胞上之細胞受體，且可隨後或同時投與遞送載體(例如AAV載體)，此可減少肝細胞之轉導，並增強其他靶(例如骨骼肌、心肌及/或膈肌)之轉導。
根據一些實施例，經修飾之蛋白質衣殼可在如本文所述之經修飾病毒載體之前及/或同時投與個體。此外，本揭示案提供組合物及醫藥調配物，其包含本發明之經修飾蛋白質衣殼或其衣殼蛋白次單元；視情況地，組合物亦包含如本文所述之經修飾病毒載體。
在一些實施例中，核酸(視情況地經分離核酸)編碼本文所述之經修飾蛋白質衣殼次單元。進一步提供核酸及包含本文所述之核酸及/或病毒載體之細胞(活體內或於培養物中)。作為一個實例，病毒載體可包含：(a)蛋白質衣殼，其包含如本文所述之經修飾AAV衣殼蛋白次單元；及(b)核酸，其包含至少一個末端重複序列，其中核酸經AAV蛋白質衣殼殼體化。
適宜病毒載體包括例如腺病毒、AAV、皰疹病毒、牛痘、痘病毒、杆狀病毒、慢病毒、冠狀病毒及諸如此類。適宜核酸包括(但不限於)質體、噬菌體、YAC、BAC及諸如此類。該等核酸及細胞可用作例如用於產生如本文所述之經修飾病毒蛋白質衣殼、蛋白質衣殼次單元或病毒載體之試劑(例如輔助包裝構築體或包裝細胞)。
本文所述之蛋白質衣殼及衣殼蛋白次單元可使用此項技術中已知之任一方法、例如藉由使用杆狀病毒系統(Brown等人(1994) Virology 198:477-488)來產生。
對如本文所述之AAV衣殼蛋白次單元之修飾係「選擇性」修飾。此方法與使用AAV血清型之間之整個次單元或大結構域調換之先前工作(例如，參見國際專利公開案WO 00/28004及Hauck等人(2003) J. Virology 77:2768-2774)有所不同。在一些實施例中，「選擇性」修飾產生少於或等於約20個、18個、15個、12個、10個、9個、8個、7個、6個、5個、4個或3個鄰接胺基酸之插入及/或取代及/或缺失。
本文所述之經修飾衣殼蛋白次單元及蛋白質衣殼可進一步包含現在已知或後來鑒別之任何其他修飾。舉例而言，AAV衣殼蛋白次單元及蛋白質衣殼可為嵌合之原因在於，其可包含另一病毒、視情況地另一細小病毒或AAV之衣殼蛋白次單元之全部或一部分，例如如國際專利公開案WO 00/28004中所述。
在一些實施例中，蛋白質衣殼或衣殼蛋白次單元可為靶向蛋白質衣殼或衣殼蛋白次單元，其包含靶向序列(例如取代或插入蛋白質衣殼或衣殼蛋白次單元中)，該靶向序列將蛋白質衣殼或衣殼蛋白次單元定向至與存在於期望靶組織上之細胞表面分子相互作用(例如，參見國際專利公開案WO 00/28004及Hauck等人(2003) J. Virology 77:2768-2774)；Shi等人，Human Gene Therapy 17:353-361 (2006) [闡述在AAV衣殼蛋白次單元之位置520及/或584插入整聯蛋白受體結合基元RGD]；及美國專利第7,314,912號[闡述在AAV2衣殼蛋白次單元之胺基酸位置447、534、573及587之後插入含有RGD基元之PI肽])。AAV衣殼蛋白次單元內之耐受插入之其他位置為此項技術中已知(例如Grifman等人，Molecular Therapy 3:964-975 (2001)所述之位置449及588)。
舉例而言，如本文所述之蛋白質衣殼或衣殼蛋白次單元可對某些相關靶組織(例如肝、骨骼肌、心臟、膈肌、腎、腦、胃、腸、皮膚、內皮細胞及/或肺)具有相對無效之向性。靶向序列可有利地納入該等低轉導載體中，藉此賦予蛋白質衣殼(或其衣殼蛋白次單元)期望向性及視情況地對特定組織之選擇向性。包含靶向序列之AAV衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼及AAV載體闡述於例如國際專利公開案WO 00/28004中。作為另一實例，如Wang 等人，Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35:225-49 (2006)所述之一或多個非天然胺基酸可在正交位點納入如本文所述之AAV衣殼蛋白次單元中作為將低轉導載體重定向至期望靶組織之方式。該等非天然胺基酸可有利地用於將相關分子化學連接至AAV衣殼蛋白次單元，包括(但不限於)：聚糖(甘露糖-樹突細胞靶向)；RGD、鈴蟾素或神經肽，用於靶向遞送至特定癌細胞類型；選自靶向特定細胞表面受體(例如生長因子受體、整聯蛋白及諸如此類)之噬菌體展示之RNA適配體或肽。
在一些實施例中，靶向序列可為將感染定向至特定細胞類型之衣殼蛋白次單元序列(例如自主細小病毒衣殼序列、AAV衣殼蛋白次單元序列或任何其他病毒衣殼序列)。
作為另一非限制性實例，可將肝素或硫酸乙醯肝素結合結構域(例如呼吸道融合病毒肝素結合結構域)插入或取代至通常不結合HS受體之衣殼蛋白次單元(例如AAV4、AAV5)中以賦予肝素及/或硫酸乙醯肝素與所得突變體結合。
B19使用紅血球糖苷酯作為其受體感染原代紅血球祖細胞(Brown等人(1993) Science 262: 114)。B19之結構已確定至8Å解析度(Agbandje-McKenna等人(1994) Virology 203: 106)。B19衣殼之結合至紅血球糖苷酯之區域已定位於胺基酸399-406之間(Chapman等人(1993) Virology 194:419)，其係β-桶結構E與F之間之成環區域(Chipman等人(1996) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 93:7502)。因此，B19衣殼之紅血球糖苷酯受體結合結構域可取代至AAV衣殼蛋白次單元中以使蛋白質衣殼或包含其之病毒載體靶向紅血球。
在一些實施例中，外源靶向序列可為編碼改變包含經修飾AAV衣殼蛋白次單元之蛋白質衣殼或病毒載體之向性之肽的任一胺基酸序列。在一些實施例中，靶向肽或蛋白質可為天然的或替代地完全或部分合成的。例示性靶向序列包括結合至細胞表面受體及糖蛋白之配位體及其他肽，例如ROD肽序列、緩激肽、激素、肽生長因子(例如表皮生長因子、神經生長因子、纖維母細胞生長因子、血小板源性生長因子、胰島素樣生長因子I及II等)、細胞介素、黑色素細胞刺激激素(例如α、β或γ)、神經肽及內啡肽及諸如此類，以及其保留使細胞靶向其同源受體之能力之片段。其他說明性肽及蛋白質包括物質P、角質細胞生長因子、神經肽Y、胃泌素釋放肽、介白素2、雞蛋清溶菌酶、促紅血球生成素、性腺激素、皮質抑素、β-內啡肽、白胺腦素、強啡肽B、α-新腦啡肽、血管收縮肽、促加壓素肽(pneumadin)、血管活性腸肽、神經調壓素、腸動素及如上文所述各者之片段。作為另一替代，可將毒素(例如破傷風毒素或蛇毒素(例如α-銀環蛇毒素)及諸如此類)之結合結構域取代至衣殼蛋白次單元中作為靶向序列。在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元可藉由如Cleves (Current Biology 7:R318 (1997))所述將「非典型」輸入/輸出信號肽(例如纖維母細胞生長因子-1及-2、介白素1、HIV-1 Tat蛋白、皰疹病毒VP22蛋白及諸如此類)取代至AAV衣殼蛋白次單元中來修飾。亦涵蓋定向特定細胞之攝取之肽基元，例如FVFLP (SEQ ID NO: 22)肽基元觸發肝細胞之攝取。
可使用噬菌體展示技術以及此項技術中已知之其他技術來鑒別識別任一相關細胞類型之肽。
靶向序列可編碼靶向細胞表面結合位點之任一肽，包括受體(例如蛋白質、碳水化合物、糖蛋白或蛋白多糖)。細胞表面結合位點之實例包括(但不限於)硫酸乙醯肝素、硫酸軟骨素及其他糖胺聚糖、在黏蛋白上發現之唾液酸部分、糖蛋白及神經節苷酯、MHC 1糖蛋白、在膜糖蛋白上發現之碳水化合物組分，包括甘露糖、N-乙醯基-半乳糖胺、N-乙醯基-葡糖胺、岩藻糖、半乳糖及諸如此類。
在一些實施例中，硫酸乙醯肝素(HS)或肝素結合結構域取代至衣殼蛋白次單元中(例如在原本不與HS或肝素結合之AAV蛋白質衣殼次單元中)。此項技術中已知，HS/肝素結合係由精胺酸及/或離胺酸中富含之「鹼性小片段(basic patch)」調介。在一些實施例中，可採用基元BXXB之序列(SEQ ID NO: 23)，其中「B」係鹼性殘基且X係中性及/或疏水殘基。作為非限制性實例，BXXB可為RGNR (SEQ ID NO: 24)。作為另一非限制性實例，用BXXB取代天然AAV2衣殼蛋白次單元中之胺基酸位置262至265或另一AAV血清型之衣殼蛋白次單元中之相應位置。
表8顯示適宜靶向序列之其他非限制性實例。表 8 ：靶向序列
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Y*係磷酸基-Tyr
在一些實施例中，靶向序列可為可用於化學偶合(例如，可包含可經由其R基團化學偶合之精胺酸及/或離胺酸殘基)至靶向進入細胞中之另一分子之肽。
在一些實施例中，AAV衣殼蛋白次單元或蛋白質衣殼可包含如WO 2006/066066中所述之突變。舉例而言，衣殼蛋白次單元可包含天然AAV2衣殼蛋白次單元之胺基酸位置263、705、708及/或716之選擇性胺基酸取代或另一AAV血清型之衣殼蛋白次單元中之相應變化。
另外或替代地，在一些實施例中，衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼或病毒載體包含緊跟在AAV2衣殼蛋白次單元之胺基酸位置264之後之選擇性胺基酸插入或其他AAV之衣殼蛋白次單元中之相應變化。「緊跟在胺基酸位置X之後」欲指插入緊跟著所指示胺基酸位置(例如「在胺基酸位置264之後」指示位置265之點插入或例如位置265至268之較大插入等)。
此外，在一些實施例中，衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼或病毒載體可包含例如PCT公開案第WO 2010/093784號(例如2i8)及/或PCT公開案第WO 2014/144229號(例如雙重聚糖)中所述之胺基酸修飾。
在一些實施例中，相對於衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼或病毒載體所起源之AAV血清型之轉導效率，衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼或病毒載體可具有等效或增強之轉導效率。在一些實施例中，相對於衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼或病毒載體所起源之AAV血清型之轉導效率，衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼或病毒載體可具有減小之轉導效率。在一些實施例中，相對於衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼或病毒載體所起源之AAV血清型之向性，衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼或病毒載體可具有等效或增強之向性。在一些實施例中，相對於衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼或病毒載體所起源之AAV血清型之向性，衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼或病毒載體可具有改變或不同之向性。在一些實施例中，衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼或病毒載體可具有或經改造具有針對腦組織之向性。在一些實施例中，衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼或病毒載體可具有或經改造具有針對肝組織之向性。
本文所述之AAV載體可用於將異源核酸遞送至細胞或個體。舉例而言，經修飾載體可用於治療如本文所述之溶酶體儲積症，例如黏多糖沈積症(例如斯賴症候群(Sly syndrome) [β-葡萄糖醛酸苷酶]、赫爾勒症候群(Hurler Syndrome) [α-L-艾杜糖醛酸酶]、沙伊症候群(Scheie Syndrome) [α-L-艾杜糖醛酸酶]、赫爾勒-沙伊二氏症候群(Hurler-Scheie Syndrome)[α-L-艾杜糖醛酸酶]、亨特氏症候群(Hunter's Syndrome) [艾杜糖醛酸硫酸酯酶]、聖菲利柏氏症候群(Sanfilippo Syndrome) (A [乙醯肝素硫酸酯酶]、B [N-乙醯葡萄糖胺酶]、C [乙醯基-CoA:α-葡萄胺糖苷乙醯基轉移酶]、D [N-乙醯葡萄糖胺6-硫酸酯酶])、莫奇症候群(Morquio Syndrome) (A [半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶]、B [β-半乳糖苷酶])、馬-拉二氏症候群(Maroteaux-Lamy Syndrome) [N-乙醯半乳糖胺-4-硫酸酯酶]等)、法佈瑞氏病(Fabry disease) (a-半乳糖苷酶)、高歇氏病(Gaucher's disease) (葡萄糖腦苷脂酶)或肝糖儲積症(例如龐貝氏病(Pompe disease)；溶酶體酸性α-葡萄糖苷酶)。
熟習此項技術者應了解，對於一些AAV衣殼蛋白次單元，相應修飾將為插入及/或取代，此取決於相應胺基酸位置係部分抑或完全存在於病毒中或替代地完全不存在。
在一些實施例中，病毒載體包含本文所述之經修飾衣殼蛋白次單元及蛋白質衣殼。在一些實施例中，病毒載體係細小病毒載體(例如 包含細小病毒蛋白質衣殼及/或載體基因體)，例如AAV載體(例如 包含AAV蛋白質衣殼及/或載體基因體)。在一些實施例中，病毒載體包含含有如本文所述之經修飾衣殼蛋白次單元之經修飾AAV蛋白質衣殼及載體基因體。
舉例而言，在一些實施例中，病毒載體包含：(a)經修飾之蛋白質衣殼(例如 經修飾之AAV蛋白質衣殼)，其包含本文所述之經修飾衣殼蛋白次單元；及(b)核酸，其包含末端重複序列(例如AAV TR)，其中包含末端重複序列之核酸經該經修飾之蛋白質衣殼殼體化。核酸可視情況地包含兩個末端重複(例如兩個AAV TR)。
在一些實施例中，病毒載體係包含編碼相關多肽或功能性RNA之異源核酸之重組病毒載體。重組病毒載體更詳細闡述於下文中。
在一些實施例中，病毒載體(i)與不含經修飾之衣殼蛋白次單元之病毒載體之轉導水準相比，具有減少之肝轉導；(ii)與藉由不含經修飾之衣殼蛋白次單元之病毒載體觀察到之水準相比，展現動物個體中增強之病毒載體全身性轉導；(iii)與藉由不含經修飾之衣殼蛋白次單元之病毒載體之移動水準相比，展示增強之跨內皮細胞移動，及/或(iv)展現肌肉組織(例如骨骼肌、心肌及/或膈肌)之轉導之選擇性增強，(v)展現肝組織轉導之選擇性增強，及/或(vi)與藉由不含經修飾之衣殼蛋白次單元之病毒載體之轉導水準相比，減少腦組織(例如神經元)之轉導。在一些實施例中，病毒載體具有針對肝之全身性轉導。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含：(i)蛋白質衣殼，其包含含有SEQ ID NO: 180或175之序列之衣殼蛋白次單元；及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之轉移盒；其中轉移盒自5’至3’包含：5’反向末端重複(ITR)；啟動子；編碼NPC1蛋白之轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR。在一些實施例中，衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 180之序列。在一些實施例中，衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 175之序列。
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)載體包含：(i)蛋白質衣殼，該蛋白質衣殼包含衣殼蛋白次單元，該衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 180或175之序列或相對於SEQ ID NO: 180或175包含約1至約25個胺基酸突變之序列；及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之轉移盒；其中轉移盒自5’至3’包含：5’反向末端重複(ITR)；啟動子；編碼NPC1蛋白之轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR。在一些實施例中，衣殼蛋白次單元相對於SEQ ID NO: 180或175包含1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個或更多個胺基酸突變。
在一些實施例中，5’ ITR及3’ ITR中之至少一者之長度為約110至約160個核苷酸。在一些實施例中，5’ ITR之長度與3’ ITR之長度相同。在一些實施例中，5’ ITR與3’ ITR具有不同之長度。在一些實施例中，5’ ITR及3’ ITR中之至少一者係自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、鳥AAV或牛AAV之基因體分離或衍生而來。在一些實施例中，5’ ITR包含SEQ ID NO: 3003之序列。在一些實施例中，3’ ITR包含SEQ ID NO: 3004之序列。
在一些實施例中，啟動子係組成型啟動子。在一些實施例中，啟動子係誘導型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。在一些實施例中，啟動子係選自由以下組成之群：CBA啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子、HSVTK啟動子、CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、多角體蛋白啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1α啟動子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。在一些實施例中，啟動子係選自由以下組成之群：CBA啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子及HSVTK啟動子。在一些實施例中，啟動子包含與SEQ ID NO: 3005、SEQ ID NO: 3006、SEQ ID NO: 3007或SEQ ID NO: 3008中之任一者至少95%或100%一致之序列。
在一些實施例中，NPC1蛋白係人類NPC1蛋白。在一些實施例中，NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少90%一致之序列。在一些實施例中，NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少95%一致之序列。在一些實施例中，NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少98%一致之序列。在一些實施例中，NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 3001之序列。
在一些實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO: 3002之序列。
在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號係選自猿猴病毒40 (SV40)、rBG、α-球蛋白、β-球蛋白、人類膠原、人類生長激素(hGH)、多瘤病毒、人類生長激素(hGH)及牛生長激素(bGH)。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號係SV40多聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號係rBG多聚腺苷酸化信號。
在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號包含與SEQ ID NO: 3012或與SEQ ID NO: 3013至少95%或100%一致之序列。
在一些實施例中，轉移盒進一步包含增強子。在一些實施例中，增強子係CMV增強子。在一些實施例中，增強子包含SEQ ID NO: 3009之序列或與其至少95%一致之序列。
在一些實施例中，轉移盒進一步包含內含子序列。在一些實施例中，內含子序列係嵌合序列。
在一些實施例中，內含子序列係雜合序列。在一些實施例中，內含子序列包含自SV40分離或衍生而來之序列。在一些實施例中，內含子序列包含SEQ ID NO: 3010-3011中任一者之序列。在一些實施例中，AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 3014-3019中任一者之序列。
熟習此項技術者應理解，本文所述之經修飾衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼及病毒載體不包括在其天然狀態(即不為突變體)下在指定位置具有所指示胺基酸之彼等衣殼蛋白次單元、蛋白質衣殼及病毒載體。AAV 轉移盒
本文闡述用於產生重組腺相關病毒(rAAV)載體之AAV轉移盒、核酸及質體。所揭示之盒、核酸及質體包含之序列可用於表現具有改善、治療及/或預防一或多種疾病或病症之治療效能之一或多種轉殖基因。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’反向末端重複(ITR)；轉殖基因；及3’ ITR。在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、啟動子、轉殖基因及3’ ITR。在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、啟動子、轉殖基因、多聚腺苷酸化序列及3’ ITR。在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、啟動子、轉殖基因、多聚腺苷酸化序列及3’ ITR；其中轉移盒包含內含子序列。在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、啟動子、內含子序列、轉殖基因、多聚腺苷酸化序列及3’ ITR。在一些實施例中，其中轉殖基因編碼NPC1蛋白或其片段或變異體。 反向末端重複
反向末端重複或ITR序列係調介AAV原病毒整合且用於將AAV DNA包裝至病毒粒子中之序列。ITR參與AAV生命週期中之多種活動。舉例而言，可形成髮夾結構之ITR序列在轉染後自質體切除、載體基因體之複製以及自宿主細胞基因體整合及拯救中起作用。
本揭示案之AAV轉移盒可包含5’ ITR 及3’ ITR。ITR序列之長度可為約110至約160個核苷酸，例如長度為110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159或160個核苷酸。在一些實施例中，ITR序列之長度可為 約141個核苷酸。在一些實施例中，5’ ITR之長度與3’ ITR之長度相同。在一些實施例中，5’ ITR與3’ ITR具有不同之長度。在一些實施例中，5’ ITR長於3’ ITR，且在其他實施例中，3’ ITR長於5’ ITR。
ITR可自任一AAV (例如表1中所列出之AAV)之基因體分離或衍生而來。在一些實施例中，5’ ITR及3’ ITR中之至少一者係自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、鳥AAV或牛AAV之基因體分離或衍生而來。在一些實施例中，5’ ITR及3’ITR中之至少一者可為自除AAV外之另一細小病毒屬種之成員分離或衍生而來之野生型或突變ITR。舉例而言，在一些實施例中，ITR可為自博卡病毒(bocavirus)或細小病毒B19分離或衍生而來之野生型或突變體ITR。
在一些實施例中，ITR包含促進scAAV產生之修飾。在一些實施例中，促進scAAV產生之修飾係自ITR缺失末端解析序列(TRS)。在一些實施例中，5’ ITR係野生型ITR，且3’ ITR係缺少末端解析序列之突變ITR。在一些實施例中，3’ ITR係野生型ITR，且5’ ITR係缺少末端解析序列之突變ITR。在一些實施例中，末端解析序列不存在於5’ ITR及3’ITR二者。在其他實施例中，促進scAAV產生之修飾係用不同的髮夾形成序列(例如shRNA形成序列)替代ITR。
在一些實施例中，5’ ITR可包含SEQ ID NO: 3003之序列或與其至少95%一致之序列。在一些實施例中，3’ ITR可包含SEQ ID NO: 3004之序列或與其至少95%一致之序列。在一些實施例中，5’ ITR包含SEQ ID NO: 3003之序列，且3’ ITR包含SEQ ID NO: 3004之序列。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含一或多個「代用」 ITR，即與ITR具有相同功能之非ITR序列。例如，參見Xie, J.等人，Mol. Ther., 25(6): 1363-1374 (2017)。在一些實施例中，AAV轉移盒中之ITR經代用ITR替代。在一些實施例中，代用ITR包含髮夾形成序列。在一些實施例中，代用ITR係短髮夾(sh)RNA形成序列。 啟動子、增強子、抑制子及其他調控序列
基因表現可由側接給定蛋白質之編碼區之核苷酸序列(稱為啟動子及增強子)來控制。
如本文所用之術語「啟動子」係指一或多個引導可操作連接之核酸之轉錄之核酸控制序列。啟動子可包括轉錄起始位點附近之核酸序列，例如TATA元件。啟動子亦可包括可由轉錄因子結合之順式作用多核苷酸序列。
「組成型」啟動子係在大多數環境及發育條件下有活性之啟動子。「誘導型」啟動子係在環境或發育調控下有活性之啟動子。術語「可操作連接」係指核酸表現控制序列(例如啟動子或轉錄因子結合位點之陣列)與第二核酸序列之間之功能連接，其中表現控制序列引導對應於第二序列之核酸之轉錄。
基因表現亦可由一或多種遠端「增強子」或「抑制子」元件來控制，該等元件可位於距轉錄起始位點多達數千個鹼基對處。增強子或抑制子元件以類似於轉錄起始位點附近之順式作用元件之方式調控轉錄，只是增強子元件可在離轉錄起始位點一定距離之處起作用。
在一些實施例中，本文所述之AAV轉移盒包含啟動子。啟動子可為例如組成型啟動子或誘導型啟動子。在一些實施例中，啟動子係組織特異性啟動子。
可用於本文所述之AAV轉移盒中之例示性啟動子包括CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、多角體蛋白啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。在一些實施例中，啟動子係選自由以下組成之群：雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1α啟動子及EF-1α短啟動子。在一些實施例中，啟動子包含選自SEQ ID NO: 3005-3008中任一者之序列或與其至少95%一致之序列。
在一些實施例中，本文所述之AAV轉移盒包含增強子。增強子可為例如CMV增強子。在一些實施例中，增強子包含SEQ ID NO: 3009之序列或與其至少95%一致之序列。
可用於本文所述之AAV轉移盒中之例示性組織特異性啟動子及增強子之非限制性列表包括：HMG-COA還原酶啟動子；固醇調控元件1 (SRE-1)；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)啟動子；人類C-反應蛋白(CRP)啟動子；人類葡萄糖激酶啟動子；膽固醇7-α羥化酶(CYP-7)啟動子；β-半乳糖苷酶α-2,6唾液酸轉移酶啟動子；胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFBP-1)啟動子；醛醇縮酶B啟動子；人類運鐵蛋白啟動子；I型膠原啟動子；前列腺酸磷酸酶(PAP)啟動子；前列腺分泌蛋白94 (PSP 94)啟動子；前列腺特異性抗原複合物啟動子；人類腺激肽釋放酶基因啟動子(hgt-1)；肌細胞特異性增強子結合因子MEF-2；肌肉肌酸激酶啟動子；胰臟炎相關之蛋白質啟動子(PAP)；彈性蛋白酶1轉錄增強子；胰臟特異性澱粉酶及彈性蛋白酶增強子啟動子；胰臟膽固醇酯酶基因啟動子；子宮球蛋白啟動子；膽固醇側鏈裂解(SCC)啟動子；γ-γ烯醇酶(神經元特異性烯醇酶，NSE)啟動子；神經纖絲重鏈(NF-H)啟動子；人類CGL-1/顆粒酶B啟動子；末端去氧轉移酶(TdT)、λ5、VpreB及lck (淋巴球特異性酪胺酸蛋白激酶p561ck)啟動子；人類CD2啟動子及其3'轉錄增強子；人類NK及T細胞特異性活化(NKG5)啟動子；pp60c-src酪胺酸激酶啟動子；器官特異性新抗原(OSN) mw 40 kDa (p40)啟動子；結腸特異性抗原-P啟動子；人類α-乳清蛋白啟動子；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(PEPCK)啟動子、HER2/neu啟動子、酪蛋白啟動子、IgG啟動子、絨毛膜胚胎抗原啟動子、彈性蛋白酶啟動子、膽色素原去胺酶啟動子、胰島素啟動子、生長激素因子啟動子、酪胺酸羥化酶啟動子、白蛋白啟動子、甲胎蛋白啟動子、乙醯基-膽鹼受體啟動子、醇去氫酶啟動子、α或β球蛋白啟動子、T細胞受體啟動子、骨鈣化素啟動子、IL-2啟動子、IL-2受體啟動子、乳清(wap)啟動子及II類MHC啟動子。 轉殖基因
本文所述之AAV轉移盒包含用於在靶細胞中表現之轉殖基因。
轉殖基因可為任何相關異源核酸序列。該等核酸可包括編碼多肽之核酸，該等多肽包括治療性(例如用於醫學或獸醫用途)或免疫原性(例如用於疫苗)多肽或RNA。替代地，核酸可編碼反義核酸、核酶、影響剪接體介導之剪接/隨機剪接之RNA、調介基因沈默之干擾RNA (RNAi，包括siRNA、shRNA或miRNA)以及其他非轉譯RNA。在一些實施例中，核酸序列可指導基因編輯。舉例而言，核酸可編碼基因編輯分子，例如嚮導RNA或核酸酶。在一些實施例中，核酸可編碼鋅指核酸酶、歸巢核酸內切酶、TALEN (轉錄活化劑樣效應物核酸酶)、NgAgo (農桿菌核酸內切酶)、SGN (結構導向核酸內切酶)或RGN (RNA導向核酸酶，例如Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶)。在一些實施例中，核酸可與宿主染色體上之基因座共用同源性並重組。此方法可用於例如校正宿主細胞中之遺傳缺陷。
本揭示案之病毒載體提供將轉殖基因遞送至寬範圍之細胞(包括分裂細胞及非分裂細胞)中之手段。病毒載體可用於將轉殖基因遞送至活體外細胞，例如，以產生活體外多肽或用於離體基因療法。病毒載體另外可用於將轉殖基因遞送至有需要之個體，例如以表現免疫原性或治療性多肽或功能性RNA之方法中。以此方式，多肽或功能性RNA可在個體之活體內產生。個體可能需要多肽之原因在於，個體缺乏該多肽。此外，該方法可實踐之原因在於，個體中多肽或功能性RNA之產生可賦予一些有益之效應。如本文所用之術語「功能性RNA」係指在細胞中具有一或多種功能之任何非編碼RNA序列，例如前段中所述之彼等RNA序列。
病毒載體亦可用於遞送核酸，以在經培養細胞或個體中產生相關多肽或功能性RNA (例如，將個體用作生物反應器來產生多肽或觀察功能性RNA對個體之效應，例如與篩選方法結合)。
一般而言，本揭示案之病毒載體可用於遞送編碼多肽或功能性RNA之轉殖基因，以治療及/或預防遞送治療性多肽或功能性RNA係有益之任何疾病狀態。
在一些實施例中，轉殖基因可用於治療NPC1。在一些實施例中，轉殖基因編碼NPC1蛋白。NPC1蛋白可為例如人類NPC1蛋白。在一些實施例中，NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少90%一致、至少95%一致或至少98%一致之序列。在一些實施例中，NPC1蛋白包含表9中所列出之一或多個單核苷酸變化(基於SEQ ID NO: 3001或3020編號)。在一些實施例中，NPC1蛋白係人類NPC1蛋白之截短形式。在一些實施例中，NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 3001之序列，或與其至少90%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之序列。在一些實施例中，NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 3020之序列，或與其至少90%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之序列。在一些實施例中，NPC1蛋白包含具有表9中所列出之一或多個單核苷酸變化之SEQ ID NO: 3001或3020之序列。在一些實施例中，NPC1蛋白具有如UniProt登錄號O15118中所示之序列，該UniProt登錄號整個以引用方式併入本文中。
在一些實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO: 3002之序列，或與其至少90%一致、至少95%一致、至少96%一致、至少97%一致、至少98%一致或至少99%一致之序列。在一些實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO: 3002之序列，或相對於其具有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個或更多個核酸變化之序列。在一些實施例中，轉殖基因編碼SEQ ID NO: 3001之胺基酸序列。在一些實施例中，轉殖基因編碼SEQ ID NO: 3020之胺基酸序列。表 9 ： NPC1 變異體序列
位置編號基於SEQ ID NO: 3001或SEQ ID NO: 3020。
位置 突變 位置 突變 位置 突變
63 C→R 691 P→L 1012 G→D
74 C→Y 695 L→V 1015 G→V
92 Q→R 700 D→N 1016 H→R
113 C→R 703 F→S 1023 V→G
137 T→M 724 L→P 1034 G→R
151 S→G 727 V→F 1035 A→V
166 P→S 734 S→I 1036 T→K
177 C→G 742 E→K 1036 T→M
177 C→Y 745 A→E 1049 A→V
215 H→R 754 M→K 1054 A→T
222 N→S 757 V→A 1059 R→Q
231 V→G 763 F→L 1061 I→T
237 P→S 767 A→V 1062 A→V
242 D→H 775 Q→P 1066 T→N
242 D→N 789 R→C 1087 F→L
247 C→Y 789 R→G 1088 Y→C
248 G→V 825 Y→C 1089 E→K
272 M→R 849 S→I 1094 I→T
333 G→D 858 I→V 1097 D→N
372 R→W 862 Q→L 1137 N→I
378 V→A 865 S→L 1140 G→V
380 L→F 871 Y→C 1142 M→T
381 W→C 873 V→A 1150 N→K
388 A→P 874 D→V 1156 N→I
389 R→C 888 P→S 1156 N→S
401 P→T 889 V→M 1165 V→M
404 R→P 890 Y→C 1167 F→L
404 R→Q 899 Y→D 1168 C→Y
404 R→W 910 G→S 1174 A→V
433 P→L 917 D→Y 1186 R→H
434 P→L 926 A→T 1189 E→G
434 P→S 927 A→V 1205 T→K
451 E→K 928 Q→P 1205 T→R
472 L→P 929 L→P 1212 V→L
473 S→P 934 R→Q 1213 L→F
474 P→L 940 S→L 1213 L→V
479 C→Y 942 W→C 1216 A→V
509 Y→S 943 I→M 1220 I→T
510 H→P 944 D→N 1224 F→L
511 T→M 945 D→N 1236 G→E
512 H→R 948 D→H 1240 G→R
518 R→Q 948 D→N 1249 S→G
518 R→W 948 D→Y 1266 R→Q
521 A→S 950 V→M      
537 F→L 954 S→L      
543 P→L 956 C→Y      
574 T→K 958 R→L      
576 K→R 958 R→Q      
605 A→V 959 V→E      
612 E→D 961-966 NITDQF→S      
615 R→C 961 N→S      
615 R→L 968 N→S      
631 M→R 971 V→G      
640 G→R 976 C→R      
642 M→I 978 R→C      
652 S→W 986 G→S      
660 G→S 992 G→A      
664 V→M 992 G→R      
666 S→N 992 G→W      
670 C→W 996 M→R      
673 G→V 1004 S→L      
684 L→F 1007 P→A      
多聚腺苷酸化(聚A)信號
多聚腺苷酸化信號係在幾乎所有的哺乳動物基因中發現之核苷酸序列且控制一串約200個腺苷殘基(聚(A)尾)添加至基因轉錄物之3′端。聚(A)尾有助於mRNA穩定性，且缺少聚(A)尾之mRNA會迅速降解。亦有證據表明，聚(A)尾之存在藉由影響轉譯之起始而對mRNA之可轉譯性有積極之貢獻。
在一些實施例中，本揭示案之AAV轉移盒包含多聚腺苷酸化信號。多聚腺苷酸化信號可選自猿猴病毒40 (SV40)、α-球蛋白、β-球蛋白、人類膠原、人類生長激素(hGH)、多瘤病毒、人類生長激素(hGH)及牛生長激素(bGH)之多聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號係SV40多聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號係rBG多聚腺苷酸化信號。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號包含SEQ ID NO: 3012或SEQ ID NO: 3013之序列。在一些實施例中，多聚腺苷酸化信號包含與SEQ ID NO: 3012或SEQ ID NO: 3013之序列至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。 填充序列
AAV載體通常接受具有通常為約4 kb至約5.2 kb或稍大一些之確定大小範圍之DNA插入。因此，對於較短之轉殖基因序列，在插入片段中可能需要包括額外核酸以達成AAV載體可接受之所需長度。因此，在一些實施例中，本揭示案之AAV轉移盒可包含填充序列。填充序列可為例如長度介於1-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、300-400、400-500、500-750、750-1,000、1,000-1,500、1,500-2,000、2,000-2,500、2,500-3,000、3,000-3,500、3,500-4,000、4,000-4,500至4,500-5,000個核苷酸之間之序列。填充序列可位於盒中任何期望之位置，使得其不妨礙載體之功能或活性。 內含子序列
在一些實施例中，本揭示案之AAV轉移盒可包含內含子序列。與不含內含子序列之表現相比，內含子序列之納入可增強表現。在一些中，內含子序列可增加基因表現而不用作轉錄因子之結合位點。舉例而言，內含子序列可藉由影響轉錄速率、核輸出及轉錄物穩定性來增加轉錄物水準。在一些實施例中，內含子序列增加mRNA轉譯之效率。
在一些實施例中，內含子序列係雜合或嵌合序列。在一些實施例中，內含子序列係自SV40、β-球蛋白、雞β-肌動蛋白、小鼠微小病毒(MVM)、IX因子及/或人類IgG (重鏈或輕鏈)中之一或多者之內含子序列分離或衍生而來。在一些實施例中，內含子序列係自SV40分離或衍生而來。在一些實施例中，內含子序列係嵌合的。在一些實施例中，內含子序列包含SEQ ID NO: 3010或SEQ ID NO:3011之序列，或與其至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%一致之序列。
內含子序列可位於轉移盒中不干擾AAV載體產生之任何地方。舉例而言，在一些實施例中，內含子序列可位於啟動子與轉殖基因之間。 說明性AAV轉移盒
在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)轉移盒包含5’反向末端重複(ITR)、啟動子、轉殖基因、多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。在一些實施例中，腺相關病毒(AAV)轉移盒包含5’反向末端重複(ITR)、啟動子、內含子序列、轉殖基因、多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。在一些實施例中，轉殖基因編碼NPC1蛋白。在一些實施例中，AAV轉移盒進一步包含增強子。在一些實施例中，AAV轉移盒進一步包含內含子序列。
在一些實施例中，5’ ITR包含SEQ ID NO: 3003之序列且3’ ITR包含SEQ ID NO: 3004之序列。在一些實施例中，增強子包含SEQ ID NO: 3009之序列。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO: 3005-3008中任一者之序列。在一些實施例中，內含子序列包含SEQ ID NO: 3010或3011之序列。在一些實施例中，轉殖基因包含SEQ ID NO: 3002之序列。在一些實施例中，聚A信號包含SEQ ID NO: 3012或3013之序列。在一些實施例中，AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 3014-3019中任一者之序列。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、CBA啟動子、SV40內含子、編碼NPC1蛋白之轉殖基因、SV40多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、GUSB240啟動子、嵌合內含子、編碼NPC1蛋白之轉殖基因、rBG多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、GUSB379啟動子、SV40內含子、編碼NPC1蛋白之轉殖基因、rBG多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、GUSB240啟動子、嵌合內含子、編碼NPC1蛋白之轉殖基因、SV40多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、GUSB240啟動子、SV40內含子、編碼NPC1蛋白之轉殖基因、SV40多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。在一些實施例中，AAV轉移盒包含5’ ITR、CMV增強子、HSVTK啟動子、編碼NPC1蛋白之轉殖基因、rBG多聚腺苷酸化信號及3’ ITR。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含含有SEQ ID NO: 3003之序列之5’ ITR、含有SEQ ID NO: 3005之序列之CBA啟動子、含有SEQ ID NO: 3010之序列之SV40內含子、編碼NPC1蛋白(SEQ ID NO: 3001)之轉殖基因、含有SEQ ID NO: 3012之SV40多聚腺苷酸化信號及含有SEQ ID NO: 3004之序列之3’ ITR。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含含有SEQ ID NO: 3003之序列之5’ ITR、含有SEQ ID NO: 3006之序列之GUSB240啟動子、含有SEQ ID NO: 3011之嵌合內含子、編碼NPC1蛋白(SEQ ID NO: 3001)之轉殖基因、含有SEQ ID NO: 3013之rBG多聚腺苷酸化信號及含有SEQ ID NO: 3004之序列之3’ ITR。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含含有SEQ ID NO: 3003之序列之5’ ITR、含有SEQ ID NO: 3006之GUSB379啟動子、含有SEQ ID NO: 3010之序列之SV40內含子、編碼NPC1蛋白(SEQ ID NO: 3001)之轉殖基因、含有SEQ ID NO: 3013之序列之rBG多聚腺苷酸化信號及含有SEQ ID NO: 3004之序列之3’ ITR。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含含有SEQ ID NO: 3003之序列之5’ ITR、含有SEQ ID NO: 3007之GUSB240啟動子、含有SEQ ID NO: 3011之序列之嵌合內含子、編碼NPC1蛋白(SEQ ID NO: 3001)之轉殖基因、含有SEQ ID NO: 3012之SV40多聚腺苷酸化信號及含有SEQ ID NO: 3004之序列之3’ ITR。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含含有SEQ ID NO: 3003之序列之5’ ITR、含有SEQ ID NO: 3006之GUSB240啟動子、含有SEQ ID NO: 3010之序列之SV40內含子、編碼NPC1蛋白(SEQ ID NO: 3001)之轉殖基因、含有SEQ ID NO: 3012之SV40多聚腺苷酸化信號及含有SEQ ID NO: 3004之序列之3’ ITR。
在一些實施例中，AAV轉移盒包含含有SEQ ID NO: 3003之序列之5’ ITR、CMV增強子、含有SEQ ID NO: 3008之HSVTK啟動子、編碼NPC1蛋白(SEQ ID NO: 3001)之轉殖基因、含有SEQ ID NO: 3013之序列之rBG多聚腺苷酸化信號及含有SEQ ID NO: 3004之序列之3’ ITR。
在一些實施例中，核酸包含AAV轉移盒。在一些實施例中，核酸包含轉殖基因，其中轉殖基因編碼SEQ ID NO: 3001之胺基酸序列。在一些實施例中，核酸包含轉殖基因，其中轉殖基因編碼SEQ ID NO: 3020之胺基酸序列。在一些實施例中，核酸自5’至3’包含5’反向末端重複(ITR)；啟動子；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中轉殖基因編碼SEQ ID NO: 3001或SEQ ID NO: 3020之胺基酸序列。在一些實施例中，核酸自5’至3’包含5’反向末端重複(ITR)；啟動子；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中核酸包含內含子序列；其中轉殖基因編碼SEQ ID NO: 3001或SEQ ID NO: 3020之胺基酸序列。在一些實施例中，核酸自5’至3’包含5’反向末端重複(ITR)；雞β-肌動蛋白啟動子；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中轉移盒包含內含子序列；其中轉殖基因編碼SEQ ID NO: 3001或SEQ ID NO: 3020之胺基酸序列。在一些實施例中，核酸自5’至3’包含5’反向末端重複(ITR)；啟動子；內含子序列；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中轉殖基因編碼SEQ ID NO: 3001或SEQ ID NO: 3020之胺基酸序列。在一些實施例中，核酸自5’至3’包含5’反向末端重複(ITR)；雞β-肌動蛋白啟動子；內含子序列；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中轉殖基因編碼SEQ ID NO: 3001或SEQ ID NO: 3020之胺基酸序列。本文所述之AAV轉移盒可使用標準分子生物學技術納入載體(例如質體或杆狀病毒質體)中。載體(例如質體或杆狀病毒質體)可進一步包含一或多種在AAV產生期間使用之遺傳元件，包括例如AAV rep及cap基因及輔助病毒蛋白序列。產生病毒載體之方法
本文亦提供產生病毒載體之方法。在一些實施例中，產生逃避中和抗體之AAV載體之方法包括：a)鑒別出在AAV衣殼蛋白次單元或蛋白質衣殼上形成三維抗原足跡之接觸胺基酸殘基；b)產生包含(a)中所鑒別出之接觸胺基酸殘基之胺基酸取代之AAV衣殼蛋白次單元文庫；c)產生包含(b)之AAV衣殼蛋白次單元文庫之衣殼蛋白次單元之AAV顆粒；d)使(c)之AAV顆粒與細胞在可進行感染及複製之條件下接觸；e)選擇可完成至少一個感染週期且複製至與對照AAV顆粒相似之效價之AAV顆粒；f)使(e)中所選之AAV顆粒與中和抗體及細胞在可進行感染及複製之條件下接觸；及g)選擇未經(f)之中和抗體中和之AAV顆粒。用於鑒別接觸胺基酸殘基之方法之非限制性實例包括肽抗原決定基定位及/或低溫電子顯微術。
解析及鑒別三維抗原足跡內之抗體接觸殘基允許經由隨機、合理及/或簡併誘變對其進行後續修飾以產生逃避抗體之AAV蛋白質衣殼及/或衣殼蛋白次單元，其可經由進一步選擇及/或篩選來鑒別。
因此，在一些實施例中，產生逃避中和抗體之AAV載體之方法包括：a)鑒別出在AAV衣殼蛋白次單元及/或蛋白質衣殼上形成三維抗原足跡之接觸胺基酸殘基；b)藉由隨機、合理及/或簡併誘變產生包含(a)中所鑒別出之接觸胺基酸殘基之胺基酸取代之AAV衣殼蛋白次單元；c)產生包含(b)之AAV衣殼蛋白次單元之衣殼蛋白次單元之AAV顆粒；d)使(c)之AAV顆粒與細胞在可進行感染及複製之條件下接觸；e)選擇可完成至少一個感染週期且複製至與對照AAV顆粒相似之效價之AAV顆粒；f)使(e)中所選之AAV顆粒與中和抗體及細胞在可進行感染及複製之條件下接觸；及g)選擇未經(f)之中和抗體中和之AAV顆粒。
用於鑒別接觸胺基酸殘基之方法之非限制性實例包括肽抗原決定基定位及/或低溫電子顯微術。藉由隨機、合理及/或簡併誘變產生包含接觸胺基酸殘基之胺基酸取代之AAV衣殼蛋白次單元的方法為此項技術中已知。
此綜合方法提供可應用於修飾任何AAV蛋白質衣殼及/或衣殼蛋白次單元之平臺技術。此平臺技術之應用產生衍生自原始AAV衣殼蛋白次單元模板之AAV抗原變異體且不損失轉導效率。作為一個優點及益處，此技術之應用將擴大有資格接受AAV載體基因療法之患者隊列。
在一些實施例中，產生病毒載體之方法包括向細胞提供：(a)包含至少一個TR序列(例如AAV TR序列)之核酸模板，及(b)足以使核酸模板複製並殼體化成AAV蛋白質衣殼之AAV序列(例如編碼AAV衣殼次單元之AAV rep序列及AAV cap序列)。視情況地，核酸模板進一步包含至少一個異源核酸序列。在一些實施例中，核酸模板包含兩個AAV ITR序列，該兩個AAV ITR序列位於異源核酸序列(若存在)之5'及3'，但無需與其直接鄰接。
核酸模板以及AAV rep及cap序列係在使得在細胞中產生包含包裝在AAV蛋白質衣殼內之核酸模板之病毒載體之條件下提供。該方法可進一步包括自細胞收集病毒載體之步驟。病毒載體可自培養基及/或藉由溶解細胞來收集。
細胞可為容許AAV病毒複製之細胞。可採用此項技術中已知之任一適宜細胞。在一些實施例中，細胞係哺乳動物細胞。作為另一選擇，細胞可為提供自複製缺陷型輔助病毒缺失之功能之反式互補包裝細胞株，例如293細胞或其他E1a反式互補細胞。
AAV複製及衣殼蛋白次單元序列可藉由此項技術中已知之任一方法提供。目前方案通常在單一質體上表現AAV rep/cap基因。AAV複製及包裝序列無需一起提供，但其一起提供可能較為方便。AAV rep及/或cap序列可由任一病毒或非病毒載體提供。舉例而言，rep/cap序列可由雜合腺病毒或皰疹病毒載體提供(例如插入缺失腺病毒載體之E1a或E3區中)。亦可採用EBV載體來表現AAV cap及rep基因。此方法之一個優點在於，EBV載體為游離型，但在整個連續細胞分裂中將維持高拷貝數(即作為染色體外元件穩定整合至細胞中，稱為「基於EBV之核游離基因體」，參見Margolski, (1992) Curr. Top. Microbiol. Immun. 158:67)。
作為另一替代，rep/ cap序列可穩定納入細胞中。
通常，AAV rep/ cap序列將不側接TR，以防止該等序列之拯救及/或包裝。
核酸模板可使用此項技術中已知之任一方法提供至細胞。舉例而言，模板可由質體或病毒載體供應。在一些實施例中，核酸模板係由皰疹病毒或腺病毒載體提供(例如插入缺失腺病毒之E1a或E3區中)。作為另一說明，Palombo等人(1998) J. Virology 72:5025闡述攜帶側接有AAV TR之報導基因之杆狀病毒載體。亦可採用EBV載體來遞送模板，如上文關於rep/cap基因所述。
在一些實施例中，核酸模板係藉由使rAAV病毒複製來提供。在一些實施例中，包含核酸模板之AAV原病毒穩定整合至細胞核中。
為提高病毒效價，可向細胞提供促進產生性AAV感染之輔助病毒功能(例如腺病毒或皰疹病毒)。AAV複製所必需之輔助病毒序列為此項技術中已知。通常，該等序列將由輔助腺病毒或皰疹病毒載體提供。替代地，腺病毒或皰疹病毒序列可由另一非病毒或病毒載體提供，例如作為攜帶促進有效AAV產生之所有輔助基因之非感染性腺病毒微質體，如Ferrari等人(1997) Nature Med. 3: 1295及美國專利第6,040,183號及第6,093,570號所述。
此外，輔助病毒功能可由包裝細胞提供，且輔助序列包埋於染色體中或維持為穩定的染色體外元件。通常，輔助病毒序列無法包裝至AAV病毒粒子中，例如不側接ITR。
熟習此項技術者應了解，在單一輔助構築體上提供AAV複製及衣殼蛋白次單元序列以及輔助病毒序列(例如腺病毒序列)可為有利的。此輔助構築體可為非病毒或病毒性構築體。作為一個非限制性說明，輔助構築體可為包含AAV rep/cap基因之雜合腺病毒或雜合皰疹病毒。
在一些實施例中，AAV rep/cap序列及腺病毒輔助序列係由單一腺病毒輔助載體供應。此載體另外可進一步包含核酸模板。AAV rep/cap序列及/或rAAV模板可插入腺病毒之缺失區域(例如E1a或E3區)中。
在一些實施例中，AAV rep/cap序列及腺病毒輔助序列係由單一腺病毒輔助載體供應。根據此實施例，rAAV模板可提供為質體模板。
在一些實施例中，AAV rep/cap序列及腺病毒輔助序列係由單一腺病毒輔助載體提供，且rAAV模板整合至細胞中作為原病毒。替代地，rAAV模板係由作為染色體外元件(例如作為基於EBV之核游離基因體)維持在細胞內之EBV載體提供。
在一些實施例中，AAV rep/cap序列及腺病毒輔助序列係由單一輔助腺病毒提供。rAAV模板可提供為單獨的複製病毒載體。舉例而言，rAAV模板可由rAAV顆粒或第二重組腺病毒顆粒提供。
根據前述方法，雜合腺病毒載體通常包含足以進行腺病毒複製及包裝之腺病毒5'及3’順式序列(即腺病毒末端重複及PAC序列)。AAV rep/cap序列及(若存在) rAAV模板包埋於腺病毒主鏈中且側接有5'及3’順式序列，以使得該等序列可包裝至腺病毒蛋白質衣殼中。如上文所述，腺病毒輔助序列及AAV rep/cap序列通常不側接ITR，以使得該等序列不包裝至AAV病毒粒子中。Zhang等人((2001) Gene Ther. 18:704-12)闡述包含腺病毒及AAV rep及cap基因二者之嵌合輔助病毒。
皰疹病毒亦可用作AAV包裝方法中之輔助病毒。編碼AAV Rep蛋白之雜合皰疹病毒可有利地促進可縮放的AAV載體產生方案。已闡述表現AAV-2 rep及cap基因之I型雜合單純皰疹病毒(HSV-1)載體(Conway等人(1999) Gene Therapy 6:986及WO 00/17377)。
作為另一替代，病毒載體可在使用杆狀病毒載體遞送rep/cap基因及rAAV模板之昆蟲細胞中產生，如例如Urabe等人(2002) Human Gene Therapy 13: 1935-43所述。
可藉由此項技術中已知之任一方法獲得不含污染之輔助病毒之AAV載體原液。舉例而言，AAV及輔助病毒可容易地基於大小來區分。AAV亦可基於對肝素受質之親和力自輔助病毒分離(Zolotukhin等人(1999) Gene Therapy 6:973)。可使用缺失的複製缺陷型輔助病毒，以使得任一污染之輔助病毒不能複製。作為另一替代，可採用缺少晚期基因表現之輔助腺病毒，此乃因僅需要腺病毒早期基因表現來調介AAV病毒之包裝。晚期基因表現缺陷之腺病毒突變體為此項技術中已知(例如ts100K及ts149腺病毒突變體)。重組病毒載體
本文所述之病毒載體可用於將核酸活體外、離體及活體內遞送至細胞。具體而言，病毒載體可有利地用於將核酸遞送或轉移至動物(包括哺乳動物)細胞。因此，在一些實施例中，核酸可經本文所述之蛋白質衣殼殼體化。在一些實施例中，核酸係轉移盒。在一些實施例中，轉移盒包含載體基因體(例如5’ ITR、轉殖基因及3’ ITR)。在一些實施例中，核酸係AAV轉移盒。
由病毒載體遞送之轉移盒序列可為任何相關異源核酸序列。相關核酸包括編碼多肽之核酸，該等多肽包括治療性(例如用於醫學或獸醫用途)或免疫原性(例如用於疫苗)多肽或RNA。在一些實施例中，轉移盒包含5’ ITR及3’ ITR。在一些實施例中，轉移盒包含5’ ITR、轉殖基因及3’ITR。在一些實施例中，轉殖基因編碼治療蛋白或RNA。
治療性多肽包括(但不限於)囊性纖維化跨膜調控蛋白(CFTR)、肌肉萎縮蛋白(包括微小肌肉萎縮蛋白及微肌肉萎縮蛋白，例如參見Vincent等人(1993) Nature Genetics 5: 130；美國專利公開案第2003/017131號；國際公開案WO/2008/088895；Wang等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 1 3714-13719 (2000)；及Gregorevic等人，Mol. Ther. 16:657-64 (2008))、肌肉生長抑制素前肽、濾泡抑素、11型活化素可溶性受體、IGF-1、載脂蛋白如apoA (apoA1、apoA2、apoA4、apoA-V)、apoB (apoB100、ApoB48)、apoC (apoCI、apoCII、apoCIII、apoCIV)、apoD、apoE、apoH、apoL、apo(a)、抗發炎多肽(例如IκB顯性突變體)、類澱粉β、τ、肌長蛋白、肌營養相關蛋白(Tinsley等人(1996) Nature 384:349)、微小肌營養相關蛋白、凝血因子(例如VIII因子、IX因子、X因子等)、促紅血球生成素、血管抑素、內皮抑素、過氧化氫酶、酪胺酸羥化酶、超氧化物歧化酶、瘦素、LDL受體、脂蛋白脂酶、顆粒蛋白前體、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶、β-球蛋白、α-球蛋白、血影蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、腺苷去胺酶、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶、β-葡萄糖腦苷脂酶、巴藤素、鞘磷脂酶、溶酶體己糖胺酶A、具支鏈酮酸去氫酶、共濟蛋白、RP65蛋白、細胞介素(例如α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、介白素-2、介白素-4、α突觸核蛋白、帕金蛋白、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子、淋巴毒素及諸如此類)、肽生長因子、神經營養因子及激素(例如生長激素、胰島素、胰島素樣生長因子1及2、血小板源性生長因子、表皮生長因子、纖維母細胞生長因子、神經生長因子、神經營養因子-3及-4、腦源神經營養因子、骨形態發生蛋白[包括RANKL及VEGF]、神經膠質源性生長因子、轉化生長因子-α及-β及諸如此類)、亨廷素(huntingin)、溶酶體酸性α-葡萄糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-磺基葡萄糖胺磺基水解酶、α-半乳糖苷酶A、受體(例如腫瘤壞死生長因子可溶性受體)、S100A1、泛素蛋白連接酶E3、小清蛋白、6型腺苷酸環化酶、調節鈣處置之分子(例如SERCA2A 、PP1及其片段之抑制劑1 [例如WO 2006/029319及WO 2007/100465])、實現2型G-蛋白偶聯受體激酶敲低之分子(例如截短的組成型活性bARKct)、抗發炎因子(例如IRAP)、抗肌肉生長抑制素蛋白、天冬醯轉移酶、單株抗體(包括單鏈單株抗體；例示性Mab係Herceptin® Mab)、神經肽及其片段(例如加蘭肽(galanin)、神經肽Y (參見U.S. 7,071,172))、血管生成抑制劑(例如血管抑制素及其他VEGF抑制劑，例如血管抑制素2 [參見WO JP2006/073052])。其他說明性異源核酸序列編碼自殺基因產物(例如胸苷激酶、胞嘧啶去胺酶、白喉毒素及腫瘤壞死因子)、增強或抑制宿主因子轉錄之蛋白質(例如連接至轉錄增強子或抑制元件之核酸酶死亡Cas9、連接至轉錄增強子或抑制元件之鋅指蛋白、連接至轉錄增強子或抑制元件之轉錄活化劑樣(TAL)效應物)、賦予癌症療法中所用之藥物抗性之蛋白質、腫瘤抑制基因產物(例如p53、Rb、Wt-1)、TRAIL、FAS配位體及在有需要之個體中具有治療效應之任何其他多肽。AAV載體亦可用於遞送單株抗體及抗體片段，例如針對肌肉生長抑制素之抗體或抗體片段(例如，參見Fang等人，Nature Biotechnology 23:584-590 (2005))。編碼多肽之異源核酸序列包括編碼報導基因多肽(例如酶)之彼等核酸序列。報導基因多肽為此項技術中已知且包括(但不限於)綠色螢光蛋白、β-半乳糖苷酶、鹼性磷酸酶、螢光素酶及氯黴素乙醯基轉移酶基因。
視情況地，異源核酸編碼分泌多肽(例如在其天然狀態下為分泌多肽或已經改造為分泌(例如藉由與如此項技術中已知之分泌信號序列可操作締合)之多肽)。
替代地，在一些實施例中，異源核酸可編碼反義核酸、核酶(例如如美國專利第5,877,022號中所述)、實現剪接體介導之剪接/隨機剪接之RNA (參見Puttaraju等人(1999) Nature Biotech. 17:246；美國專利第6,013,487號；美國專利第6,083,702號)、干擾RNA (RNAi，包括調介基因沈默之siRNA、shRNA或miRNA) (參見Sharp等人(2000) Science 287:2431)及其他非轉譯RNA，例如「嚮導」RNA (Gorman等人(1998) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95 :4929；授予Yuan等人之美國專利第5,869,248號)及諸如此類。例示性非轉譯RNA包括針對多重抗藥性(MDR)基因產物之RNAi (例如用於治療及/或預防腫瘤及/或投與心臟以預防化學療法之損傷)、針對肌肉生長抑制素之RNAi (例如用於杜興氏肌營養不良症(Duchenne muscular dystrophy))、針對VEGF之RNAi (例如用於治療及/或預防腫瘤)、針對受磷蛋白之RNAi (例如用於治療心血管疾病，例如參見Andino等人，J. Gene Med. 10: 132-142 (2008)及Li等人，Acta Pharmacol Sin. 26:51-55 (2005))；受磷蛋白抑制性或顯性-陰性分子，例如受磷蛋白S16E (例如用於治療心血管疾病，例如參見Hoshijima等人，Nat. Med. 8:864-871 (2002))、針對腺苷激酶之RNAi (例如用於癲癇)及針對病原體生物體及病毒之RNAi (例如B型及/或C型肝炎病毒、人類免疫缺失病毒、CMV、單純皰疹病毒、人類乳頭瘤病毒等)。
此外，可遞送指導選擇式剪接之核酸序列。為進行說明，與肌肉萎縮蛋白外顯子51之5'及/或3'剪接位點互補之反義序列(或其他抑制序列)可與U1或U7小核(sn) RNA啟動子結合遞送以誘導此外顯子之跳躍。舉例而言，包含位於反義/抑制性序列之5’之U1或U7 snRNA啟動子之DNA序列可在經修飾之蛋白質衣殼中包裝並遞送。
在一些實施例中，可遞送指導基因編輯之核酸序列。舉例而言，核酸可編碼嚮導RNA。在一些實施例中，嚮導RNA係包含crRNA序列及tracrRNA序列之單嚮導RNA (sgRNA)。在一些實施例中，核酸可編碼核酸酶。在一些實施例中，核酸酶係鋅指核酸酶、歸巢核酸內切酶、TALEN (轉錄活化劑樣效應物核酸酶)、NgAgo (農桿菌核酸內切酶)、SGN (結構導向核酸內切酶)、RGN (RNA導向核酸酶)或其經修飾或截短變異體。在一些實施例中，RNA導向核酸酶係Cas9核酸酶、Cas12(a)核酸酶(Cpf1)、Cas12b核酸酶、Cas12c核酸酶、TrpB樣核酸酶、Cas13a核酸酶(C2c2)、Cas13b核酸酶或其經修飾或截短變異體。在一些實施例中，Cas9核酸酶係自化膿性鏈球菌(S. pyogenes )或金黃色葡萄球菌(S. aureus )分離或衍生而來。
在一些實施例中，可遞送指導基因敲低之核酸序列。舉例而言，核酸序列可編碼siRNA、shRNA、微小RNA或反義核酸。病毒載體亦可包含與宿主染色體上之基因座共用同源性且與其重組之異源核酸。此方法可用於例如校正宿主細胞中之遺傳缺陷。
亦提供表現例如用於疫苗接種之免疫原性多肽之病毒載體。核酸可編碼此項技術中已知之任何相關免疫原，包括(但不限於)人類免疫缺失病毒(HIV)、猿猴免疫缺失病毒(SIV)、流行性感冒病毒、HIV或SIV gag蛋白、腫瘤抗原、癌症抗原、細菌抗原、病毒抗原及諸如此類之免疫原。
使用細小病毒作為疫苗載體為此項技術中已知(例如，參見Miyamura等人(1994) Proc. Nat. Acad. Sci USA 91:8507；授予Young等人之美國專利第5,916,563號、授予Mazzara等人之美國專利第5,905,040號、美國專利第5,882,652號、授予Samulski等人之美國專利第5,863,541號)。抗原可呈遞於細小病毒衣殼中。
替代地，抗原可自引入重組載體基因體中之異源核酸表現。在一些實施例中，如本文所述及/或如此項技術中已知之任一相關免疫原可由本文所述之病毒載體提供。
免疫原性多肽可為適於引發免疫反應及/或保護個體免受感染及/或疾病之任一多肽，該感染及/或疾病包括(但不限於)微生物、細菌、原生動物、寄生蟲、真菌及/或病毒感染及疾病。舉例而言，免疫原性多肽可為正黏液病毒免疫原(例如流行性感冒病毒免疫原，例如流行性感冒病毒血球凝集素(HA)表面蛋白或流行性感冒病毒核蛋白或馬流行性感冒病毒免疫原)或慢病毒免疫原(例如馬感染性貧血病毒免疫原、猿猴免疫缺失病毒(SIV)免疫原或人類免疫缺失病毒(HIV)免疫原，例如HIV或SIV包膜GP 160蛋白、HIV或SIV基質/衣殼蛋白及HIV或SIV gag、pol及env基因產物)。免疫原性多肽亦可為沙狀病毒免疫原(例如拉沙熱病毒(Lassa fever virus)免疫原，例如拉沙熱病毒核衣殼蛋白及拉沙熱包膜糖蛋白)、痘病毒免疫原(例如牛痘病毒免疫原，例如牛痘LI或L8基因產物)、黃病毒免疫原(例如黃熱病毒免疫原或日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)免疫原)、絲狀病毒免疫原(例如伊波拉病毒(Ebola virus)免疫原或馬堡病毒(Marburg virus)免疫原，例如NP及GP基因產物)、崩芽病毒免疫原(例如RVFV、CCHF及/或SFS病毒免疫原)或冠狀病毒免疫原(例如感染性人類冠狀病毒免疫原，例如人類冠狀病毒包膜糖蛋白或豬可傳播性胃腸炎病毒免疫原或鳥感染性支氣管炎病毒免疫原)。免疫原性多肽另外可為脊髓灰質炎免疫原、皰疹免疫原(例如CMV、EBV、HSV免疫原)、腮腺炎免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、白喉毒素或其他白喉免疫原、百日咳抗原、肝炎(例如A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎等)免疫原及/或此項技術中現在已知或後來鑒別為免疫原之任何其他疫苗免疫原。
替代地，免疫原性多肽可為任何腫瘤或癌細胞抗原。視情況地，腫瘤或癌症抗原係在癌細胞之表面上表現。
例示性癌細胞及腫瘤細胞抗原闡述於S.A. Rosenberg (Immunity 10:281 (1991))中。其他說明性癌症及腫瘤抗原包括(但不限於)：BRCA1基因產物、BRCA2基因產物、gp100、酪胺酸酶、GAGE- 1/2、BAGE、RAGE、LAGE、NY-ESO-1、CDK-4、β-連環蛋白、MUM-1、半胱天冬酶-8、ΚΙΑA0205、HPVE、SART-1、FRAME、p15、黑色素瘤腫瘤抗原(Kawakami等人(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3515；Kawakami等人(1994) J. Exp. Med., 180:347；Kawakami等人(1994) Cancer Res. 54:3124)、MART-1、gp100、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、CEA、TRP-1、TRP-2、P-15、酪胺酸酶(Brichard等人(1993) J Exp. Med. 178:489)；HER-2/neu基因產物(美國專利第4.968.603號)、CA 125、LK26、FB5 (內皮唾液酸蛋白)、TAG 72、AFP、CA 19-9、NSE、DU-PAN-2、CA50、SPan-1、CA72-4、HCG、STN (唾液醯基Tn抗原)、c-erbB-2蛋白、PSA、L-CanAg、雌激素受體、牛乳球蛋白、p53腫瘤抑制蛋白(Levine, (1993) Ann. Rev. Biochem. 62:623)；黏蛋白抗原(國際專利公開案第WO 90/05142號)；端粒酶；核基質蛋白；前列腺酸磷酸酶；乳頭瘤病毒抗原；及/或現在已知或後來發現之與以下癌症相關之抗原：黑色素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤(例如非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、霍奇金氏淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、結腸癌、白血病、子宮癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、胰臟癌、腦癌及現在已知或後來鑒別之任何其他癌症或惡性疾患或其轉移(例如，參見Rosenberg (1996) Ann. Rev. Med. 47:481-91)。
作為另一替代，異源核酸可編碼合意地在活體外、離體或活體內在細胞中產生之任一多肽。舉例而言，可將病毒載體引入經培養之細胞及自其分離之所表現基因產物中。
熟習此項技術者應理解，相關異源核酸可與適當控制序列可操作地締合。舉例而言，異源核酸可與表現控制元件(例如轉錄/轉譯控制信號、複製起點、多聚腺苷酸化信號、內部核糖體進入位點(IRES)、啟動子及/或增強子及諸如此類)可操作地締合。
此外，調控相關異源核酸之表現可在轉錄後水準上、例如藉由根據選擇性阻斷特定位點之剪接活性(例如如WO 2006/119137中所述)之寡核苷酸、小分子及/或其他化合物之存在或不存在調控不同內含子之選擇性剪接來達成。
熟習此項技術者應了解，根據期望水準及組織特異性表現，可使用多種啟動子/增強子元件。啟動子/增強子可為組成型或誘導型，此端視期望表現之模式而定。啟動子/增強子可為天然(native)或外源的且可為天然(natural)或合成序列。外源欲指在其中引入轉錄起始區之野生型宿主中未發現轉錄起始區。
在一些實施例中，啟動子/增強子元件對於靶細胞或欲治療之個體可為天然的。在一些實施例中，啟動子/增強子元件對於異源核酸序列可為天然的。啟動子/增強子元件通常經選擇以使得其在相關靶細胞中起作用。此外，在一些實施例中，啟動子/增強子元件係哺乳動物啟動子/增強子元件。啟動子/增強子元件可為組成型或誘導型。
誘導型表現控制元件通常在期望對異源核酸序列之表現提供調控之彼等應用中係有利的。用於基因遞送之誘導型啟動子/增強子元件可為組織特異性或較佳啟動子/增強子元件，且包括肌肉特異性或較佳啟動子/增強子元件(包括心肌、骨骼肌及/或平滑肌特異性或較佳啟動子/增強子元件)、神經組織特異性或較佳啟動子/增強子元件(包括腦特異性或較佳啟動子/增強子元件)、眼特異性或較佳啟動子/增強子元件(包括視網膜特異性啟動子/增強子元件及角膜特異性啟動子/增強子元件)、肝特異性或較佳啟動子/增強子元件、骨髓特異性或較佳啟動子/增強子元件、胰臟特異性或較佳啟動子/增強子元件、脾特異性或較佳啟動子/增強子元件及肺特異性或較佳啟動子/增強子元件。其他誘導型啟動子/增強子元件包括激素誘導型元件及金屬誘導型元件。例示性誘導型啟動子/增強子元件包括(但不限於) Tet開/關元件、RU486誘導型啟動子、蛻皮激素誘導型啟動子、雷帕黴素(rapamycin)誘導型啟動子及金屬硫蛋白啟動子。
在一些實施例(其中異源核酸序列在靶細胞中轉錄且然後轉譯)中，通常包括特異性起始信號以有效轉譯插入之蛋白質編碼序列。可包括ATG起始密碼子及相鄰序列之該等外源轉譯控制序列可具有多種來源，天然及合成的。
本文所述之病毒載體提供將異源核酸遞送至寬範圍之細胞(包括分裂及非分裂細胞)中之方式。病毒載體可用於將相關核酸遞送至活體外細胞，例如以產生活體外多肽或用於離體基因療法。病毒載體另外可用於將核酸遞送至有需要之個體，例如以表現免疫原性或治療性多肽或功能性RNA之方法中。以此方式，多肽或功能性RNA可在個體之活體內產生。個體可能需要多肽之原因在於，個體缺乏該多肽。此外，該方法可實踐之原因在於，個體中多肽或功能性RNA之產生可賦予一些有益之效應。
病毒載體亦可用於在經培養細胞或個體中產生相關多肽或功能性RNA (例如使用個體作為生物反應器以產生多肽或觀察功能性RNA對個體之效應，例如結合篩選方法)。
一般而言，本文所述之病毒載體可用於遞送編碼多肽或功能性RNA之異源核酸以治療及/或預防遞送治療性多肽或功能性RNA有益之任何疾病狀態。說明性疾病狀態包括(但不限於)：囊性纖維化(囊性纖維化跨膜調控蛋白)及其他肺病、血友病A (VIII因子)、血友病B (IX因子)、地中海貧血(β-球蛋白)、貧血(促紅血球生成素)及其他血液病症。阿茲海默氏病(Alzheimer's disease，GDF；腦啡肽酶)、多發性硬化(β-干擾素)、帕金森氏病(Parkinson's disease，神經膠質細胞株源性神經營養因子[GDNF])、亨廷頓氏病(Huntington's disease，移除重複之RNAi)、康納丸氏病(Canavan’s disease)、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、癲癇(加蘭肽、神經營養因子)及其他神經病症、癌症(內皮抑素、血管抑素、TRAIL、FAS配位體、細胞介素(包括干擾素)；RNAi (包括針對VEGF或多重抗藥性基因產物之RNAi)、mir-26a [例如用於肝細胞癌])、糖尿病(胰島素)、肌營養不良(包括杜興氏肌肉萎縮症(Duchenne)，肌肉萎縮蛋白、微小肌肉萎縮蛋白、胰島素樣生長因子I、肌聚糖[例如a、β、γ]、針對肌靜力肌肉生長抑制素前肽之RNAi、濾泡抑素、II型活化素可溶性受體、抗發炎多肽(例如IκB顯性突變體)、肌長蛋白、肌營養相關蛋白、微小肌營養相關蛋白、針對肌肉萎縮蛋白基因中之剪接接合處以誘導外顯子跳躍之反義或RNAi [例如，參見WO/2003/095647]、針對U7 snRNA以誘導外顯子跳躍之反義[例如，參見WO/2006/021724]及針對肌肉生長抑制素或肌肉生長抑制素前肽之抗體或抗體片段)及貝克氏肌強直性營養不良1或2、面肩胛臂肌營養不良症(FSHD)、高歇氏病(葡萄糖腦苷脂酶)、赫爾勒病(a-L-艾杜糖醛酸酶)、腺苷去胺酶缺陷(腺苷去胺酶)、肝糖儲積病(例如法佈瑞氏病[a-半乳糖苷酶]及龐貝氏病[溶酶體酸性α-葡萄糖苷酶])及其他代謝失調、先天性肺氣腫(α-1-抗胰蛋白酶)、萊-尼二氏症候群(Lesch-Nyhan Syndrome，次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶)、尼曼-匹克病(鞘磷脂酶)、泰-薩二氏病(Tay-Sachs disease，溶酶體己糖胺酶A)、額顳葉失智症、楓糖漿尿病(Maple Syrup Urine Disease，具支鏈酮酸去氫酶)、視網膜變性疾病(以及眼及視網膜之其他疾病；例如PDGF用於黃斑變性及/或血管抑制素或VEGF之其他抑制劑或治療/預防視網膜病症(例如在I型糖尿病中)之其他血管生成抑制劑)、實體器官(例如腦)之疾病(包括帕金森氏病[GDNF]、星細胞瘤[內皮抑素、血管抑素及/或針對VEGF之RNAi]、神經膠母細胞瘤[內皮抑素、血管抑素及/或針對VEGF之RNAi])、肝、腎、心臟(包括鬱血性心臟衰竭或外周動脈疾病(PAD)) (例如藉由遞送蛋白質磷酸酶抑制劑I (I-1)及其片段(例如IlC)、serca2a、調控受磷蛋白基因之鋅指蛋白、Barkct、[32-腎上腺素受體、2-腎上腺素受體激酶(BARK)、磷酸肌醇-3激酶(PI3激酶)、S100A1、小清蛋白、6型腺苷酸環化酶、實現2型G-蛋白偶聯受體激酶敲低之分子(例如截短的組成型活性bARKct)；鈣調素(calsarcin)、針對受磷蛋白之RNAi；受磷蛋白抑制性或顯性-陰性分子(例如受磷蛋白S16E)等)、關節炎(胰島素樣生長因子)、關節病症(胰島素樣生長因子1及/或2)、內膜增生(例如藉由遞送enos、inos)、改良心臟移植之存活(超氧化物歧化酶)、AIDS (可溶性CD4)、肌肉消瘦(胰島素樣生長因子I)、腎缺陷(促紅血球生成素)、貧血(促紅血球生成素)、關節炎(抗發炎因子，例如I RAP及TNFa可溶性受體)、肝炎(a-干擾素)、LDL受體缺陷(LDL受體)、高胺血症(鳥胺酸胺甲醯基轉移酶)、克拉培氏病(Krabbe's disease，半乳糖腦苷脂酶)、巴騰氏病(Batten's disease)、脊腦共濟失調(包括SCA1、SCA2及SCA3)、苯丙酮尿(苯丙胺酸羥化酶)、自體免疫疾病及諸如此類。本文所揭示之組合物及方法可進一步用於器官移植後以增加移植之成功及/或減少器官移植或附加療法之負面副作用(例如藉由投與免疫抑制劑或抑制性核酸以阻斷細胞介素產生)。作為另一實例，骨形態發生蛋白(包括BNP 2、7等、RANKL及/或VEGF)可與骨同種異體移植物一起投與，例如在癌症患者骨折或手術移除之後。
在一些實施例中，本文所述之病毒載體可用於遞送編碼多肽或功能性RNA之異源核酸以治療及/或預防肝疾病或病症。肝疾病或病症可為例如原發性膽汁性肝硬化、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、自體免疫肝炎、B型肝炎、C型肝炎、酒精性肝病、纖維化、黃疸、原發性硬化性膽道炎(PSC)、巴-克二氏症候群(Budd-Chiari syndrome)、血色素沈著症、威爾森氏病(Wilson’s disease)、酒精性纖維化、非酒精性纖維化、肝脂肪變性、吉伯特氏症候群(Gilbert’s syndrome)、膽道閉鎖、α-1-抗胰蛋白酶缺陷、阿拉吉歐症候群(alagille syndrome)、進行性家族性肝內膽汁淤積、血友病B、遺傳性血管性水腫(HAE)、同型接合家族性高膽固醇血症(HoFH)、異型接合家族性高膽固醇血症(HeFH)、馮吉爾克病(Von Gierke's Disease，GSD I)、血友病A、甲基丙二酸血症、丙酸血症、高胱胺酸尿症、苯丙酮尿(PKU)、1型酪胺酸血症、精胺酸酶1缺陷、精胺酸琥珀酸溶解酶缺陷、磷酸胺甲醯基酯合成酶1缺陷、1型瓜胺酸血症、檸檬素缺陷、1型克-納二氏症候群(Crigler-Najjar Syndrome Type 1)、胱胺酸病、法佈瑞氏病、1b型肝糖儲積病、LPL缺陷、N-乙醯麩胺酸合成酶缺陷、鳥胺酸胺甲醯基轉移酶缺陷、鳥胺酸移位酶缺陷、1型原發性高草酸尿症或ADA SCID。
本文所述之組合物及方法亦可用於產生經誘導之多潛能幹細胞(iPS)。舉例而言，本文所述之病毒載體可用於將幹細胞相關之核酸遞送至非多潛能細胞，例如成人纖維母細胞、皮膚細胞、肝細胞、腎細胞、脂肪細胞、心臟細胞、神經細胞、上皮細胞、內皮細胞及諸如此類。
與幹細胞相關之核酸編碼因子為此項技術中已知。該等與幹細胞及多潛能性相關之因子之非限制性實例包括Oct-3/4、SOX家族(例如SOX 1、SOX2、SOX3及/或SOX 15)、Klf家族(例如Klfl、KHZ Klf4及/或Klf5)、Myc家族(例如C-myc、L-myc及/或N-myc)、NANOG及/或LIN28。
亦可實踐本文所述之方法以治療及/或預防代謝失調，例如糖尿病(例如胰島素)、血友病(例如IX因子或VIII因子)、溶酶體儲積症(例如黏多糖沈積症，例如斯賴症候群[β-葡萄糖醛酸苷酶]、赫爾勒症候群[α-L-艾杜糖醛酸酶]、沙伊症候群[α-L-艾杜糖醛酸酶]、赫爾勒-沙伊二氏症候群[α-L-艾杜糖醛酸酶]、亨特氏症候群[艾杜糖醛酸硫酸酯酶]、聖菲利柏氏症候群A [乙醯肝素硫酸酯酶]、B [N-乙醯葡萄糖胺酶]、C [乙醯基-CoA:α-葡萄胺糖苷乙醯基轉移酶]、D [N-乙醯葡萄糖胺6-硫酸酯酶]、莫奇症候群A [半乳糖硫酸酯硫酸酯酶]、B [β-半乳糖苷酶]、馬-拉二氏症候群[N-乙醯半乳糖胺-4-硫酸酯酶]等)、法佈瑞氏病(α-半乳糖苷酶)、高歇氏病(葡萄糖腦苷脂酶)或肝糖儲積症(例如龐貝氏病；溶酶體酸性α-葡萄糖苷酶)。
基因轉移對於理解疾病狀態及提供該等疾病狀態之療法具有重要用途。許多遺傳病之缺陷基因係已知且已經選殖。一般而言，上述疾病狀態分為兩類：缺陷狀態(通常為酶)，其通常以隱性方式遺傳；及不平衡狀態，其可涉及調控或結構蛋白，且通常以顯性方式遺傳。對於缺陷狀態之疾病，可使用基因轉移將正常基因帶入受侵襲之組織中進行替代治療，以及使用反義突變創建該疾病之動物模型。對於不平衡之疾病狀態，可使用基因轉移在模型系統中創建疾病狀態，然後可將其用於對抗疾病狀態。因此，如本文所述之病毒載體容許治療及/或預防遺傳病。
本文所述之病毒載體亦可用於將功能性RNA在活體外或活體內提供至細胞。功能性RNA可為例如非編碼RNA。在一些實施例中，功能性RNA在細胞中之表現可減少細胞對特定靶蛋白之表現。因此，可投與功能性RNA以減少有需要之個體中特定蛋白質之表現。在一些實施例中，功能性RNA在細胞中之表現可增加細胞對特定靶蛋白之表現。因此，可投與功能性RNA以增加有需要之個體中特定蛋白質之表現。在一些實施例中，功能性RNA之表現可調控細胞中特定靶RNA之剪接。因此，可投與功能性RNA以調控有需要之個體中特定RNA之剪接。在一些實施例中，細胞中功能性RNA之表現可調控細胞特定靶蛋白之功能。因此，可投與功能性RNA以調控有需要之個體中特定蛋白質之功能。亦可將功能性RNA活體外投與細胞以調控基因表現及/或細胞生理學，例如以最佳化細胞或組織培養系統或篩選方法。
另外，如本文所述之病毒載體可用於診斷及篩選方法中，其中相關核酸在細胞培養系統或替代地基因轉殖動物模型中瞬時或穩定表現。
病毒載體亦可用於多種非治療目的，包括(但不限於)用於評價基因靶向、清除、轉錄、轉譯等之方案中，如熟習此項技術者將明了。病毒載體亦可用於評估安全性(擴散、毒性、免疫原性等)之目的。例如，美國食品藥品管理局將該等資料視為臨床效能評估前監管審批流程之一部分。
在一些實施例中，病毒載體可用於在個體中產生免疫反應。根據此實施例，可將包含編碼免疫原性多肽之異源核酸序列之病毒載體投與個體，且個體針對免疫原性多肽產生主動免疫反應。免疫原性多肽係如上文所述。在一些實施例中，引發保護性免疫反應。
替代地，可將病毒載體離體投與細胞且將改變之細胞投與個體。將包含異源核酸之病毒載體引入細胞中，且將細胞投與個體，其中編碼免疫原之異源核酸可在個體中表現且誘導個體中針對免疫原之免疫反應。在一些實施例中，細胞係抗原呈遞細胞(例如樹突細胞)。
「主動免疫反應」或「主動免疫性」之特徵在於「在遇到免疫原後宿主組織及細胞之參與。其涉及淋巴網狀組織中免疫勝任細胞之分化及增殖，從而導致抗體之合成或細胞介導之反應性之發展，或兩者皆有」。Herbert B. Herscowitz, Immunophysiology: Cell Function and Cellular Interactions in Antibody Formation, IMMUNOLOGY: BASIC PROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti編輯，1985)。換言之，在藉由感染或接種暴露于免疫原後，宿主產生主動免疫反應。主動免疫可與被動免疫形成對比，被動免疫係經由將預成型物質(抗體、轉移因子、胸腺移植物、介白素-2)自經主動免疫之宿主轉移至非免疫宿主來獲得。
如本文所用之「保護性」免疫反應或「保護性」免疫性指示，免疫反應賦予個體一定之益處在於，其預防或減少疾病之發生。替代地，保護性免疫反應或保護性免疫性可用於治療及/或預防疾病，尤其癌症或腫瘤(例如藉由預防癌症或腫瘤形成、藉由使癌症或腫瘤消退及/或藉由預防轉移及/或藉由預防轉移性結節之生長)。保護效應可為完全的或部分的，只要治療之益處超過其任何缺點即可。
在一些實施例中，包含異源核酸之病毒載體或細胞可以免疫原性有效量投與，如下文所述。
在一些實施例中，可藉由投與表現一或多種癌細胞抗原(或免疫相似分子)之病毒載體或產生針對癌細胞之免疫反應之任何其他免疫原來投與病毒載體用於癌症免疫療法。為進行說明，可藉由投與包含編碼癌細胞抗原之異源核酸之病毒載體在個體中產生針對癌細胞抗原之免疫反應，例如來治療患有癌症之患者及/或預防癌症在個體中發生。病毒載體可在活體內或藉由使用離體方法投與個體，如本文所述。
替代地，癌症抗原可作為衣殼蛋白次單元之一部分表現，或以其他方式與蛋白質衣殼締合(例如如上文所述)。
作為另一替代，可投與此項技術中已知之任何其他治療性核酸(例如RNAi)或多肽(例如細胞介素)來治療及/或預防癌症。
如本文所用之術語「癌症」涵蓋腫瘤形成癌症。同樣，術語「癌性組織」涵蓋腫瘤。「癌細胞抗原」涵蓋腫瘤抗原。
術語「癌症」在此項技術中具有其理解之含義，例如，有可能擴散至身體之遠端位點之組織不受控生長(即轉移)。例示性癌症包括(但不限於)黑色素瘤、腺癌、胸腺瘤、淋巴瘤(例如非霍奇金氏淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤)、肉瘤、肺癌、肝癌、結腸癌、白血病、子宮癌、乳癌、前列腺癌、卵巢癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎癌、胰臟癌、腦癌及現在已知或後來鑒別之任何其他癌症或惡性疾患。在一些實施例中，提供治療及/或預防腫瘤形成癌症之方法。
術語「腫瘤」在此項技術中亦理解為例如多細胞生物體內未分化細胞之異常團塊。腫瘤可為惡性或良性的。在一些實施例中，本文所揭示之方法用於預防及治療惡性腫瘤。
術語「治療癌症」、「癌症之治療」及等效術語欲指降低或至少部分地消除癌症之嚴重程度、及/或減緩及/或控制疾病之進展、及/或使疾病穩定。在一些實施例中，該等術語指示，防止或減少或至少部分地消除癌症之轉移、及/或防止或減少或至少部分地消除轉移性結節之生長。
術語「癌症之預防」或「預防癌症」及等效術語欲指該等方法至少部分地消除或減少及/或延遲癌症發作之發生率及/或嚴重程度。換言之，個體之癌症發作之可能性或概率可降低及/或個體之癌症發作可延遲。
在一些實施例中，可自患有癌症之個體取出細胞，並與表現如本文所述癌細胞抗原之病毒載體接觸。然後將經修飾細胞投與個體，由此引發針對癌細胞抗原之免疫反應。此方法可有利地用於無法在活體內引起足夠免疫反應(即無法產生足量增強抗體)之免疫受損之個體。
此項技術中已知，免疫調節劑細胞介素(例如 α-干擾素、β-干擾素、γ-干擾素、ω-干擾素、τ-干擾素、介白素-1-α、介白素-1β、介白素-2、介白素-3、介白素-4、介白素5、介白素-6、介白素-7、介白素-8、介白素-9、介白素-10、介白素-11、介白素-12、介白素-13、介白素-14、介白素-18、B細胞生長因子、CD40配位體、腫瘤壞死因子-α、腫瘤壞死因子-β、單核球化學吸引蛋白-1、顆粒球-巨噬細胞群落刺激因子及淋巴毒素)可增強免疫反應。因此，免疫調節劑細胞介素(較佳CTL誘導性細胞介素)可與病毒載體結合投與個體。細胞介素可藉由此項技術中已知之任一方法來投與。可將外源細胞介素投與個體，或替代地可使用適宜載體將編碼細胞介素之核酸遞送至個體，並在活體內產生細胞介素。個體、醫藥調配物及投與模式
如本文所述之病毒載體及病毒樣顆粒可用於獸醫及醫學應用二者。適宜個體包括鳥及哺乳動物二者。如本文所用之術語「鳥」包括(但不限於)雞、鴨、鵝、鵪鶉、火雞、雉、鸚鵡、長尾鸚鵡及諸如此類。如本文所用之術語「哺乳動物」包括(但不限於)人類、非人類靈長類動物、牛、綿羊、山羊、馬、貓、犬、兔類動物等。人類個體包括新生兒、嬰兒、青少年、成年及老年個體。
在一些實施例中，個體「需要」本文所述之方法。
在一些實施例中，提供醫藥組合物，其包含醫藥學上可接受之載劑中之病毒載體及/或病毒樣顆粒以及視情況選用之其他藥劑、醫藥劑、穩定劑、緩衝劑、載劑、佐劑、稀釋劑等。對於注射，載劑通常將為液體。對於其他投與方法，載劑可為固體或液體。對於吸入投與，載劑將為可吸入的，且視情況地可呈固體或液體微粒形式。
「醫藥學上可接受之」意指無毒或原本不期望之材料，即該材料可投與個體而不會引起任何不期望之生物效應。
本文亦提供將核酸活體外轉移至細胞之方法。可以適當感染複數根據適用於特定靶細胞之標準轉導方法將病毒載體引入細胞中。欲投與之病毒載體之效價可根據靶細胞類型及數量以及特定病毒載體而變化，且可由熟習此項技術者在沒有過度實驗之情況下確定。在一些實施例中，將至少約103 個感染單位、視情況地至少約105 個感染單位引入細胞中。
其中引入病毒載體之細胞可具有任一類型，包括(但不限於)神經細胞(包括外周及中樞神經系統之細胞，具體而言腦細胞，例如神經元及寡突神經膠質細胞)、肺細胞、眼細胞(包括視網膜細胞、視網膜色素上皮細胞及角膜細胞)、上皮細胞(例如腸及呼吸上皮細胞)、肌肉細胞(例如骨骼肌細胞、心肌細胞、平滑肌細胞及/或膈肌細胞)、樹突細胞、胰臟細胞(包括胰島細胞)、肝細胞、心肌細胞、骨細胞(例如骨髓幹細胞)、造血幹細胞、脾細胞、角質細胞、纖維母細胞、內皮細胞、前列腺細胞、生殖細胞及諸如此類。在一些實施例中，細胞可為任何祖細胞。作為其他可能性，細胞可為幹細胞(例如神經幹細胞、肝幹細胞)。作為另一替代，細胞可為癌細胞或腫瘤細胞。此外，細胞可來自任何起源物種，如上文所指示。
可將病毒載體活體外引入細胞中用於將經修飾細胞投與個體之目的。在一些實施例中，已自個體取出細胞，將病毒載體引入該等細胞中，且然後將細胞投與回至個體中。自個體取出細胞用於離體操縱、然後引入回至個體中之方法為此項技術中已知(例如，參見美國專利第5,399,346號)。替代地，可將重組病毒載體引入供體個體之細胞、經培養細胞或任何其他適宜來源之細胞中，且將細胞投與有需要之個體(即「接受者」個體)。
適用於離體核酸遞送之細胞係如上文所述。欲投與個體之細胞之劑量將根據個體之年齡、疾患及物種、細胞類型、細胞表現之核酸、投與模式及諸如此類而變化。通常，在醫藥學上可接受之載劑中，每劑量將投與至少約102 至約108 個細胞或至少約103 至約106 個細胞。在一些實施例中，經病毒載體轉導之細胞係以有效量與醫藥載劑組合投與個體。
在一些實施例中，將病毒載體引入細胞中且可將細胞投與個體以引發針對所遞送多肽(例如表現為轉殖基因或於蛋白質衣殼中)之免疫原性反應。通常，投與一定量之表現免疫原性有效量之多肽之細胞與醫藥學上可接受之載劑之組合。「免疫原性有效量」係在投與醫藥調配物之個體中足以引發針對多肽之主動免疫反應之所表現多肽之量。在一些實施例中，該劑量足以產生保護性免疫反應(如上文所定義)。所賦予之保護程度無需為完全或永久的，只要投與免疫原性多肽之益處超過其任何缺點即可。
因此，在一些實施例中，將核酸投與細胞之方法包括使細胞與如本文所述之病毒載體、病毒顆粒及/或組合物接觸。
本文亦提供向個體投與如本文所述之病毒載體、病毒顆粒及/或病毒樣顆粒之方法。在一些實施例中，將核酸遞送至個體之方法包括向個體投與如本文所述之病毒顆粒、病毒載體及/或組合物。向有需要之人類個體或動物投與病毒載體、病毒顆粒及/或病毒樣顆粒可藉由此項技術中已知之任何方式進行。視情況地，病毒載體、病毒顆粒及/或病毒樣顆粒係以有效劑量於醫藥學上可接受之載劑中遞送。在一些實施例中，遞送有效量之病毒載體、病毒顆粒及/或病毒樣顆粒。
可進一步投與本文所述之病毒載體及/或病毒樣顆粒以引發免疫原性反應(例如作為疫苗)。通常，免疫原性組合物包含免疫原性有效量之病毒載體及/或病毒樣顆粒與醫藥學上可接受之載劑之組合。視情況地，該劑量足以產生保護性免疫反應(如上文所定義)。所賦予之保護程度無需為完全或永久的，只要投與免疫原性多肽之益處超過其任何缺點即可。個體及免疫原係如上文所述。
欲投與個體之病毒載體及/或病毒樣顆粒之劑量端視投與模式、欲治療及/或預防之疾病或疾患、個別個體之疾患、具體病毒載體或蛋白質衣殼及欲遞送之核酸及諸如此類而定，且可以常規方式確定。在一些實施例中，重組AAV之劑量係有效劑量。例示性有效劑量可為例如至少約105 、約106 、約107 、約108 、約109 、約1010 、約1011 、約1012 、約1013 、約1014 、約1015 個轉導單位、視情況地約108 至約1013 個轉導單位之劑量。在一些實施例中，重組AAV之有效劑量係介於每公斤個體體重約1 × 1011 至約1 × 1015 個載體基因體之劑量。舉例而言，有效劑量可為約1 × 1011 、約5 × 1011 、約1 × 1012 、約5 × 1012 、約1 × 1013 、約5 × 1013 、約1 × 1014 、約5 × 1014 或約1 × 1015 個載體基因體/公斤(vg/kg)個體體重。在一些實施例中，所投與AAV之劑量可為2.8 × 1013 vg/kg或2.9 × 1013 vg/kg。在一些實施例中，劑量可為2.1 × 1013 vg或3.0 × 1013 vg。
在一些實施例中，可採用一次以上之投與(例如兩次、三次、四次或更多次投與)在不同之時間間隔(例如每天、每週、每月、每年等)內達成期望之基因表現水準。
例示性投與模式包括口服、直腸、經黏膜、鼻內、吸入(例如經由氣溶膠)、經頰(例如舌下)、陰道、鞘內、眼內、經皮、子宮內(或卵內)、胃腸外(例如靜脈內、皮下、皮內、肌內[包括投與骨骼肌、膈肌及/或心肌]、皮內、胸膜內、腦內及關節內)、局部(例如投與皮膚及黏膜表面，包括氣道表面及經皮)、淋巴內及諸如此類以及直接組織或器官注入(例如投與肝、骨骼肌、心肌、膈肌或腦)。投與亦可為投與腫瘤(例如在腫瘤或淋巴結中或附近)。在任何給定之情況下，最適宜途徑將端視所治療及/或預防之疾患之性質及嚴重程度以及所用具體載體之性質而定。
對骨骼肌之投與包括(但不限於)對四肢(例如上臂、下臂、大腿及/或小腿)、背、頸、頭(例如舌)、胸、腹、骨盆/會陰及/或手指中之骨骼肌之投與。適宜骨骼肌包括(但不限於)外展小指肌(在手)、外展小趾肌(在腳)、外展拇肌、第五蹠骨展肌、外展拇短肌、外展拇長肌、內收短肌、內收拇肌、內收長肌、內收大肌、內收拇肌、肘肌、前斜角肌、膝關節肌、肱二頭肌、股二頭肌、肱肌、肱橈肌、頰肌、喙肱肌、皺眉肌、三角肌、降口角肌、降下唇肌、二腹肌、骨間背側肌(在手)、骨間背側肌(在腳)、橈側伸腕短肌、橈側伸腕長肌、尺側伸腕肌、伸小指肌、伸趾肌、伸趾短肌、伸趾長肌、伸拇趾短肌、伸拇趾長肌、伸食指肌、伸拇指短肌、伸拇指長肌、橈側腕屈肌、尺側腕屈肌、屈小指短肌(在手)、屈小指短肌(在腳)、屈趾短肌、屈趾長肌、屈指深肌、屈指淺肌、屈拇趾短肌、屈拇趾長肌、屈拇短肌、屈拇長肌、額肌、腓腸肌、頦舌骨肌、臀大肌、臀中肌、臀小肌、股薄肌、項髂肋肌、腰髂肋肌、胸髂肋肌、髂肌、孖下肌、下斜肌、下直肌、棘下肌、棘間肌、橫突間肌、外翼肌、外直肌、背闊肌、犬齒肌、提上唇肌、鼻脣舉肌、提上瞼肌、提肩胛肌、長旋肌、頭最長肌、頸最長肌、胸最長肌、頭長肌、頸長肌、蚓狀肌(在手)、蚓狀肌(在腳)、嚼肌、翼內側肌、內直肌、中斜角肌、多裂肌、頜舌骨肌、頭下斜肌、頭上斜肌、閉孔外肌、閉孔內肌、枕骨肌、肩舌肌、小指對掌肌、拇指對掌肌、眼輪匝肌、口輪匝肌、掌側骨間肌、掌短肌、掌長肌、恥骨肌、胸大肌、胸小肌、腓骨短肌、腓骨長肌、腓骨第三肌、梨狀肌、骨間足底肌、蹠肌、闊肌、膕肌、後斜角肌、旋前方肌、旋前圓肌、腰大肌、股方肌、蹠方肌、小頭前直肌、頭側直肌、大頭後直肌、小頭後直肌、股直肌、大菱形肌、小菱形肌、笑肌、縫匠肌、小斜角肌、半膜肌、頭半棘肌、頸半棘肌、胸半棘肌、半腱肌、前鋸肌、短旋肌、比目魚肌、頭棘肌、頸棘肌、胸棘肌、頭夾肌、頸夾肌、胸鎖乳頭肌、胸舌肌、胸盾肌、莖舌骨肌、鎖骨下肌、肩胛下肌、孖上肌、上斜肌、上直肌、旋後肌、棘上肌、顳肌、闊筋膜張肌、大圓肌、小圓肌、胸肌、甲舌骨肌、脛骨前肌、脛骨後肌、斜方肌、肱三頭肌、股中間肌、外股肌、內股肌、顴大肌及顴小肌以及如此項技術中已知之任何其他適宜骨骼肌。
病毒載體及/或病毒樣顆粒可藉由靜脈內投與、動脈內投與、腹膜內投與、四肢灌注(視情況地分離之腿及/或臂四肢灌注；例如，參見Arruda等人(2005) Blood 105: 3458-3464)及/或直接肌內注射遞送至骨骼肌。在一些實施例中，病毒載體及/或病毒樣顆粒係藉由四肢灌注、視情況地分離之四肢灌注(例如藉由靜脈內或關節內投與)投與個體(例如患有肌營養不良症、例如杜興氏肌營養不良症(DMD)或肢帶肌營養不良症(LGMD)之個體)之四肢(臂及/或腿)。在一些實施例中，病毒載體及/或病毒樣顆粒可有利地在不採用「流體動力學」技術之情況下投與。先前技術載體之組織遞送(例如至肌肉)通常係由流體動力學技術(例如大體積之靜脈內/靜脈內投與)來增強，該等流體動力學技術增加血管系統中之壓力且促進載體穿過內皮細胞障壁之能力。在一些實施例中，病毒載體及/或病毒樣顆粒可在流體動力學技術(例如高體積輸注及/或升高血管內壓力，例如大於正常收縮壓，例如與正常收縮壓相比血管內壓力之增加小於或等於5%、10%、15%、20%、25%)不存在下投與。該等方法可減少或避免與流體動力學技術相關之副作用，例如水腫、神經損傷及/或區室症候群。對心肌之投與包括對左心房、右心房、左心室、右心室及/或膈膜之投與。病毒載體及/或病毒樣顆粒可藉由靜脈內投與、動脈內投與(例如主動脈內投與)、直接心臟注射(例如注入左心房、右心房、左心室、右心室中)及/或冠狀動脈灌注遞送至心肌。
投與至膈肌可藉由任何適宜方法(包括靜脈內投與、動脈內投與及/或腹膜內投與)進行。
遞送至靶組織亦可藉由遞送包含病毒載體及/或病毒樣顆粒之貯庫來達成。如本文所述，「貯庫」之遞送係指投與允許病毒緩慢釋放及/或逐漸傳播之持續作用調配物，以使得病毒可比標準注射作用更長之時間。在一些實施例中，將包含病毒載體及/或病毒樣顆粒之貯庫植入骨骼肌、心肌及/或膈肌組織中或可使組織與包含病毒載體及/或病毒樣顆粒之膜或其他基質接觸。該等可植入基質或受質闡述於美國專利第7,201,898號中。
因此，在一些實施例中，將病毒載體及/或病毒樣顆粒投與骨骼肌、膈肌及/或心肌(例如來治療及/或預防肌營養不良症、心臟病[例如PAD或鬱血性心臟衰竭])。
在一些實施例中，本文所述之組合物及方法用於治療及/或預防骨骼肌、心肌及/或膈肌之疾病或病症。肌肉之疾病或病症可為例如肌營養不良症、肌病、運動神經元疾病及心肌病。肌肉之疾病或病症可為例如肌肉萎縮症、杜興氏肌營養不良症、貝克氏肌營養不良症、肌強直性營養不良(例如肌強直性營養不良1及2)、面肩胛臂肌營養不良症(FDHD)、艾-杜二氏肌營養不良症(Eimery-Dreifuss muscular dystrophy)、肢帶疾病、面肩胛臂肌營養不良症、眼咽肌營養不良症、遠端肌營養不良症、先天肌營養不良症、青少年黃斑失養症、中央核肌病、肌中央軸空病及包涵體肌炎。
在一些實施例中，提供治療及/或預防有需要之個體之肌營養不良症之方法，該方法包括：向哺乳動物個體投與有效量之病毒載體之治療或預防，其中病毒載體包含編碼以下蛋白質之異源核酸：肌肉萎縮蛋白、微小肌肉萎縮蛋白、微肌肉萎縮蛋白、肌肉生長抑制素前肽、濾泡抑素、II型活化素可溶性受體、IGF-1、抗發炎多肽(例如IκB顯性突變體)、肌長蛋白、肌營養相關蛋白、微肌肉萎縮蛋白、層黏連蛋白-a2、α-肌聚糖、β-肌聚糖、γ-肌聚糖、δ-肌聚糖、IGF-1、針對肌肉生長抑制素或肌肉生長抑制素前肽之抗體或抗體片段及/或針對肌肉生長抑制素之RNAi。在一些實施例中，可將病毒載體投與如本文中別處所述之骨骼肌、膈肌及/或心肌。
替代地，可實踐本文所述之方法以將核酸遞送至骨骼肌、心肌或膈肌，其用作產生通常在血液中循環之多肽(例如酶)或功能性RNA (例如RNAi、微小RNA、反義RNA)之平台或用於全身性遞送至其他組織以治療及/或預防病症(例如代謝失調，例如糖尿病[例如胰島素]、血友病[例如IX因子或Vlll因子]、黏多糖病症[例如斯賴症候群、赫爾勒症候群、沙伊症候群、赫爾勒-沙伊二氏症候群、亨特氏症候群、聖菲利柏氏症候群A、B、C、D、莫奇症候群、馬-拉二氏症候群等]或溶酶體儲積症(例如高歇氏病[葡萄糖腦苷脂酶]或法佈瑞氏病[a-半乳糖苷酶A])或肝糖儲積症(例如龐貝氏病[溶酶體酸α葡萄糖苷酶]))。本文闡述用於治療及/或預防代謝失調之其他適宜蛋白質。使用肌肉作為平台來表現相關核酸闡述於美國專利公開案US 2002/0192189中。
在一些實施例中，治療及/或預防有需要之個體之代謝失調之方法包括：將治療或預防有效量之病毒載體投與個體之骨骼肌，其中病毒載體包含編碼多肽之異源核酸，其中代謝失調係由多肽之缺陷及/或缺乏引起。本文闡述說明性代謝失調及編碼多肽之異源核酸。視情況地，多肽係分泌的(例如在其天然狀態下為分泌多肽或已經改造為分泌(例如藉由與如此項技術中已知之分泌信號序列可操作地締合)之多肽)。不受限於任何特定理論，根據此實施例，投與骨骼肌可使多肽分泌至體循環中並遞送至靶組織。將病毒載體遞送至骨骼肌之方法更詳細闡述於本文中。
亦可實踐本文所述之方法以產生用於全身性遞送之非編碼RNA，例如反義RNA、RNAi或其他功能性RNA (例如核酶)。
在一些實施例中，治療及/或預防有需要之個體之先天性心臟衰竭或PAD之方法包括：向哺乳動物個體投與治療或預防有效量之病毒載體，其中病毒載體包含編碼例如以下蛋白質之異源核酸：肌漿內質網Ca2+ -ATPase (SERCA2a)、血管生成因子、磷酸酶抑制劑I (I-1)及其片段(例如I1C)、針對受磷蛋白之RNAi；受磷蛋白抑制性或顯性-陰性分子，例如受磷蛋白S16E、調控受磷蛋白基因之鋅指蛋白、β-2-腎上腺素受體、β-2-腎上腺素受體激酶(BARK)、PI3激酶、卡沙星(calsarcan)、β-腎上腺素受體激酶抑制劑(PARKct)、蛋白質磷酸酶1及其片段之抑制劑1 (例如I1 C)、S100A1、小清蛋白、6型腺苷酸環化酶、實現2型G-蛋白偶聯受體激酶敲低之分子(例如截短組成型活性bARKct)、Pim-1、PGC-Ι α、SOD-1、SOD-2、EC-SOD、激肽釋放酶、HIF、胸腺素-p4、mir-1、mir-133、mir-206、mir-208及/或mir-26a。
可注射物可以習用形式製備，以液體溶液或懸浮液形式，以適用於注射前液體中之溶液或懸浮液之固體形式或以乳液形式。替代地，可以局部而非全身之方式、例如以貯庫或持續釋放調配物之形式投與病毒載體及/或病毒樣顆粒。此外，病毒載體及/或病毒樣顆粒可黏附至手術可植入基質來遞送(例如如美國專利公開案第US-2004-0013645-A1號中所述)。
本文所揭示之病毒載體及/或病毒樣顆粒可藉由任何適宜方式、視情況地藉由投與個體吸入之包含病毒載體及/或病毒樣顆粒之可吸入顆粒之氣溶膠懸浮液來投與個體之肺。可吸入顆粒可為液體或固體。包含病毒載體及/或病毒樣顆粒之液體顆粒之氣溶膠可藉由如熟習此項技術者已知之任何適宜方式、例如使用壓力驅動之氣溶膠霧化器或超音波霧化器來產生。例如，參見美國專利第4,501,729號。包含病毒載體及/或病毒樣顆粒之固體顆粒之氣溶膠同樣可使用任何固體微粒藥物氣溶膠發生器、藉由醫藥技術中已知之技術來產生。
病毒載體及病毒樣顆粒可投與CNS之組織(例如腦、眼)且可有利地產生比原本不存在本文所述之組合物及方法時所觀察到之病毒載體或病毒樣顆粒分佈更廣泛的病毒載體或病毒樣顆粒分佈。
在一些實施例中，可投與本文所述之病毒載體來治療CNS疾病，包括遺傳病症、神經變性病症、精神異常及腫瘤。說明性CNS疾病包括(但不限於)腎上腺腦白質失養症(AMN)、阿茲海默氏病、安格曼症候群、額顳葉失智症、帕金森氏病、亨廷頓氏病、X染色體易裂症候群、康納丸氏病、萊氏病(Leigh's disease)、雷夫蘇姆氏病(Refsum disease)、圖雷特症候群(Tourette syndrome)、原發性脊髓側索硬化症、肌肉萎縮性脊髓側索硬化症、進行性肌肉萎縮、匹克病(Pick's disease)、肌營養不良症、多發性硬化、重症肌無力、賓斯旺格病(Binswanger’s disease)、因脊髓或頭損傷引起之創傷、戴薩克斯病(Tay Sachs disease，GM2神經節苷脂貯積病)、萊-尼二氏病、MC4R肥胖症、異染性白質失養症(MLD)、MPS I (赫爾勒/沙伊)、MPS IIIA (聖菲利柏A)、尼曼匹克C1、雷特氏症候群、脊髓性肌萎縮(SMA)、AADC缺陷、單基因性肌萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)、α甘露糖儲積症、天冬胺醯葡萄糖胺尿症、德拉韋症候群(Dravet Syndrome)、巨軸索神經病變、球狀細胞腦白質失養症(克拉伯(Krabbe))、Glut 1缺陷、GM1神經節苷脂貯積病、嬰兒神經元蠟樣脂褐質沈積症(INCL，巴頓(Batten))、青少年神經元蠟樣脂褐質沈積症(JNCL，巴頓)、晚期嬰兒神經元蠟樣脂褐質沈積症(LINCL，巴頓)、MPS II (亨特)、MPS IIIB (聖菲利柏B)、MPS IIIC (聖菲利柏C)、MPS IVA (莫奇症候群)、MPS VI (馬-拉)、過氧化物酶體生物發生障礙(澤爾韋格症候群譜系(Zellweger Syndrome Spectrum))、桑德霍夫病(Sandhoff Disease，GM2神經節苷脂貯積病)、癲癇、大腦梗死、精神異常(包括情緒障礙，例如抑鬱症、雙相情感障礙、持續性情感障礙、繼發性情緒障礙)、精神分裂症、藥物依賴(例如酒精中毒及其他物質依賴)、神經症(例如焦慮症、強迫症、身體型病症、多重人格障礙、悲傷、產後抑鬱症)、精神病(例如幻覺及妄想)、失智症、妄想症、注意力缺失症、性心理障礙、睡眠障礙、疼痛病症、飲食或體重病症(例如肥胖症、惡病質、神經性厭食症及易餓症)以及CNS之癌症及腫瘤(例如垂體瘤)。
CNS病症包括眼部病症，涉及視網膜、視網膜眼後部通道及視神經(例如色素性視網膜炎、糖尿病視網膜病變及其他視網膜變性疾病、眼色素層炎、年齡相關之黃斑變性、青光眼)。
大多數(若非全部)眼部疾病及病症與三種適應症中之一或多者相關：(1)血管生成，(2)發炎，及(3)變性。本文所述之病毒載體可用於遞送抗血管生成因子；抗發炎因子；延緩細胞變性、促進細胞保存或促進細胞生長之因子以及上述因子之組合。
例如，糖尿病視網膜病變之特徵在於血管生成。糖尿病視網膜病變可藉由眼內(例如在玻璃體中)或眼周(例如在筋膜下區中)遞送一或多種抗血管生成因子來治療。一或多種神經營養因子亦可經眼內(例如玻璃體內)或眼周共遞送。
眼色素層炎涉及發炎。一或多種抗發炎因子可藉由病毒載體之眼內(例如玻璃體或前房)投與來投與。
藉由比較，色素性視網膜炎之特徵在於視網膜變性。在一些實施例中，色素性視網膜炎可藉由眼內(例如玻璃體)投與編碼一或多種神經營養因子之病毒載體來治療。
年齡相關之黃斑變性涉及血管生成及視網膜變性二者。此病症可藉由眼內(例如玻璃體)投與編碼一或多種神經營養因子之本發明病毒載體及/或眼內或眼周(例如在筋膜下區中)投與編碼一或多種抗血管生成因子之本發明病毒載體來治療。
青光眼之特徵在於增加的眼部壓力及視網膜神經節細胞損失。青光眼之治療包括使用本發明病毒載體投與一或多種保護細胞免於興奮性毒素損害之神經保護劑。該等劑包括眼內、視情況地玻璃體內遞送之N-甲基-D-天冬胺酸鹽(NMDA)拮抗劑、細胞介素及神經營養因子。
在一些實施例中，本文所述之組合物及方法可用於治療癲癇，例如以減少癲癇之發作、發生或嚴重程度。癲癇之治療性治療之效能可藉由行為(例如顫抖、眨眼或張口)及/或電子圖方式(大多數癲癇具有特征性電子圖異常)來評價。因此，亦可治療以隨時間多次癲癇發作為特征之癲癇。
在一些實施例中，治療有需要之個體之方法包括：向個體投與包含含有衣殼蛋白次單元之蛋白質衣殼之AAV載體，其中衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 165-187中任一者之胺基酸序列。在一些實施例中，AAV載體包含蛋白質衣殼，該蛋白質衣殼包含含有SEQ ID NO: 175之胺基酸序列或與其至少95%一致之序列之衣殼蛋白次單元。在一些實施例中，AAV載體包含蛋白質衣殼，該蛋白質衣殼包含含有SEQ ID NO: 175之胺基酸序列或與其至少95%一致之序列之衣殼蛋白次單元。在一些實施例中，個體患有爪費症候群(Dravet syndrome)。在一些實施例中，個體患有雷特氏症候群(Rett syndrome)。在一些實施例中，個體患有安格曼症候群(Angelman syndrome)。在一些實施例中，個體患有尼曼-匹克病。在一些實施例中，個體患有X染色體易裂症候群。在一些實施例中，個體患有阿茲海默氏病。在一些實施例中，個體患有高歇氏病。在一些實施例中，個體患有亨廷頓氏病。在一些實施例中，個體患有帕金森氏病。在一些實施例中，個體患有弗氏共濟失調(Friedrich’s ataxia)。在一些實施例中，AAV載體係藉由腦室內(ICV)注射投與個體。在一些實施例中，AAV載體係藉由鞘內(IT)注射投與個體。在一些實施例中，AAV載體係藉由靜脈內(IV)注射投與個體。
在一些實施例中，治療有需要之個體之方法包括：向個體投與包含含有衣殼蛋白次單元之蛋白質衣殼之AAV載體，其中衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 175或180之胺基酸序列，其中個體患有爪費症候群、雷特氏症候群、安格曼症候群、尼曼-匹克病或X染色體易裂症候群，且其中AAV載體係藉由ICV或IT注射投與個體。
在一些實施例中，治療有需要之個體之方法包括：向個體投與包含含有衣殼蛋白次單元之蛋白質衣殼之AAV載體，其中衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 175或180之胺基酸序列，其中個體患有高歇氏病、亨廷頓氏病、帕金森氏病或弗氏共濟失調，且其中AAV載體係藉由ICV或IT注射投與個體。
在一些實施例中，使用病毒載體將體抑素(或其活性片段)投與腦來治療垂體瘤。根據此實施例，編碼體抑素(或其活性片段)之病毒載體係藉由微輸注至垂體中來投與。同樣，該治療可用於治療肢端肥大症(垂體之異常生長激素分泌)。體抑素之核酸(例如GenBank登錄號J00306)及胺基酸(例如GenBank登錄號P01166；含有經處理之活性肽體抑素-28及體抑素-14)序列為此項技術中已知。
在一些實施例中，病毒載體可包含如美國專利第7,071,172號中所述之分泌信號。
在一些實施例中，將病毒載體及/或病毒樣顆粒投與CNS (例如投與腦或眼)。可將病毒載體及/或病毒樣顆粒引入脊髓、腦幹(延髓、腦橋)、中腦(下視丘、視丘、上視丘、垂體腺、黑質、松果腺)、小腦、端腦(紋狀體、大腦(包括枕骨、顳骨、頂骨及額葉)、皮質、基底神經節、海馬體及門杏仁核)、邊緣系統、新皮質、紋狀體、大腦及下丘中。亦可將病毒載體及/或病毒樣顆粒投與眼之不同區域，例如視網膜、角膜及/或視神經。
可將病毒載體及/或病毒樣顆粒遞送至腦脊髓液(例如藉由腰椎穿刺術)中以更分散地投與載體。可在血腦障壁已受到干擾(例如腦瘤或大腦梗死)之情況下將病毒載體及/或病毒樣顆粒進一步血管內投與CNS。
可藉由此項技術中已知之任一途徑將病毒載體及/或病毒樣顆粒投與CNS之期望區域，該任一途徑包括(但不限於)鞘內、眼內、大腦內、室內、靜脈內(例如在糖如甘露醇存在下)、鼻內、耳內、眼內(例如玻璃體內、視網膜下、前房)及眼周(例如筋膜下區)遞送以及肌內遞送及逆向遞送至運動神經元。在一些實施例中，病毒載體及/或病毒樣顆粒係以液體調配物形式藉由直接注射(例如立體定位注射)投與CNS中之期望區域或區室。在一些實施例中，病毒載體及/或病毒樣顆粒可藉由局部施加至期望區域或藉由鼻內投與氣溶膠調配物來提供。可藉由局部施加液滴來投與眼。作為另一替代，病毒載體及/或病毒樣顆粒可以固體、緩慢釋放調配物來投與(例如，參見美國專利第7,201,898號)。
在一些實施例中，病毒載體可用於逆向運輸來治療及/或預防涉及運動神經元之疾病及病症(例如肌肉萎縮性脊髓側索硬化症(ALS)；脊髓性肌萎縮(SMA)等)。舉例而言，病毒載體可遞送至其可遷移至神經元中之肌肉組織。實例
本文包括之以下實例僅用於說明目的並不欲進行限制。如本文所用，使用術語STRD.101及STRD.102來闡述衣殼蛋白次單元序列，且使用AAV-STRD.101及AAV-STRD.102來闡述包含重組或經修飾之衣殼蛋白次單元序列之AAV載體。然而，術語STRD.101及STRD.102可在一些上下文中用於闡述包含含有所命名衣殼蛋白次單元之蛋白質衣殼之AAV載體，如熟習此項技術者將明了。實例 1. 逃避抗體之 AAV 載體之組合改造及選擇
根據以下方法製備逃避抗體之AAV突變體。第一步涉及例如使用低溫電子顯微術鑒別AAV衣殼蛋白衣殼表面上之構形3D抗原決定基。然後使用簡併引子對抗原基元內選定之殘基進行誘變，每個密碼子經核苷酸NNK取代且基因片段藉由吉布森組裝(Gibson assembly)及/或多步聚PCR組合在一起。將含有突變抗原基元簡併文庫之衣殼蛋白次單元編碼基因選殖至野生型AAV基因體中以替代原始編碼Cap之DNA序列，從而產生質體文庫。然後用腺病毒輔助質體將質體文庫轉染至293產生細胞株中以產生AAV衣殼蛋白次單元文庫，然後進行選擇。經由DNA測序證實AAV文庫之成功產生。
為選擇可逃避中和抗體(NAb)及/或靶向中樞神經系統(CNS)之新AAV品系，使AAV文庫在非人類靈長類動物中經受多輪感染。在每個階段，自動物個體中分離出相關組織。對自相關組織收穫之細胞溶解物進行測序，以鑒別逃避抗體中和之AAV分離物。在非人類靈長類動物中經過多輪感染後，將自每個誘變區分離之序列以所有排列及組合進行組合。
作為特定實例，如上所述對AAV衣殼蛋白次單元(VP1)上之共同抗原基元進行誘變。然後在非人類靈長類動物中對簡併文庫(圖 1A )進行第一輪感染(靜脈注射)。在感染後7天收穫組織且測序以鑒別單一AAV分離物。
在組織樣品中鑒別各種重組AAV分離物，包括脊髓、背根神經節、額葉、顳葉、枕葉、殼核、蒼白球、視丘、杏仁核、海馬體、黑質、腦橋、小腦、髓質。此第一輪進化之結果顯示於圖 1B 中。
然後將在第一輪進化中分離之重組AAV (圖 1B )再引入第二隻非人類靈長類動物中。在感染後7天收穫組織且測序以鑒別單一AAV分離物。此第二輪進化之結果顯示於圖 1C 中。
對具有最高頻率之重組AAV進行測序。存在於該等AAV中之取代顯示於表7.1及表7.2中。該等資料表明，具有包含表7.1及表7.2中所列出取代之衣殼蛋白次單元之重組AAV病毒粒子在非人類靈長類動物活體內逃避中和抗體，且對期望靶組織具有向性。實例 2 ：重組 AAV 載體之可製造性
為確定實例1中鑒別之各種重組AAV是否可在大規模系統中製造，根據標準方法產生AAV，並比較產量與野生型AAV載體之產量。
根據標準三重轉染方案，在HEK293細胞中產生AAV。簡言之，用以下質體轉染細胞：(i)包含野生型AAV9衣殼蛋白次單元序列、STRD.101衣殼蛋白次單元變異體序列(SEQ ID NO: 180)或STRD.102衣殼蛋白次單元變異體序列(SEQ ID NO: 175)之質體，(ii)包含5’ITR、轉殖基因及3’ ITR序列之質體，及(iii)包含AAV產生所需之輔助基因之質體。在自互補構築體中，將兩個不同的轉殖基因與每個衣殼蛋白次單元一起使用。隨後溶解細胞並使用親和管柱、CsCl密度超速離心及透析來純化病毒粒子。隨後，使用基於PCR之定量方法量測每個AAV之產量。
如圖 2 中所示，包含STRD.101及STRD.102衣殼蛋白次單元之重組AAV載體具有與野生型AAV9之產量相似之產量。此資料證實，包含重組衣殼蛋白次單元之重組AAV適於商業製造。實例 3 ： 使用重組 AAV 病毒載體之活體外轉導
為證實實例1之重組AAV載體是否通常具有感染性並且能夠轉導培養物中之細胞，根據標準方案製備各種AAV載體。
使用標準TCID50分析測試重組AAV之感染性。簡言之，在腺病毒(Ad5)存在下，用重組AAV顆粒以跨越5個數量級之劑量感染HeLaRC32細胞。72小時後，提取DNA且藉由qPCR量化載體基因體複製。
計算顆粒對感染性比率以確定感染性。如圖 3 中所示，AAV-STRD.101載體之感染性比率低於野生型AAV9之感染性比率。由於較低之感染性比率轉化為較高之功效，AAV-STRD.101比野生型AAV9更具感染性。
單獨地，亦在不同細胞株中測定感染性。產生包裝螢光素酶轉殖基因之重組AAV且使其以10,000個載體基因體(vg)/細胞之劑量與培養物中之細胞接觸。在感染後48小時，溶解細胞。使溶解物與生物發光受質接觸，且量測相對螢光單位(RFU)。如圖 4A-4D 中所示，AAV-STRD.101載體以與野生型AAV9相當之水準感染U87細胞(人類神經膠母細胞瘤細胞株，圖 4A )、N2A細胞(小鼠神經嵴源性細胞株，圖 4B )、SY5Y細胞(人類神經胚細胞瘤細胞株，圖 4C )及U2OS細胞(人類骨肉瘤細胞株，圖 4D )。
因此，此資料表明，實例1之重組AAV載體可有效地轉導培養物中之細胞。實例 4 ：靶向中樞神經系統之重組 AAV 之活體內表徵
選擇重組衣殼蛋白次單元STRD.101及STRD.102進行活體內表徵。產生包含該等衣殼蛋白次單元且包裝天然tdTomato螢光轉殖基因之重組AAV。在第0天藉由腦室內注射將重組AAV投與新生小鼠。在注射後三週，收穫腦組織且固定以藉由tdTomato螢光之視覺評價來評估表現。圖 5 提供顯示在用4% PFA固定後24小時冠狀振動切片中之tdTomato表現之代表性影像。亦使用免疫組織化學使該等相同切片可視化(圖 6 )。如圖 5 及圖 6 之影像中所示，AAV9、AAV-STRD.102及AAV-STRD.101載體在腦組織中各自具有不同之分佈，其中最高轉殖基因表現位於注射位點附近。綜上所述，此資料顯示，在腦室內注射後，所測試重組AAV將轉殖基因成功地遞送至活體內靶細胞。
亦藉由靜脈內注射以5.5 × 1013 vg/kg之劑量將包裝tdTomato之AAV-STRD.101及AAV-STRD.102載體投與四隻成年小鼠。在注射後三週，收穫肝及心臟並固定以藉由tdTomato螢光之視覺評價來評估表現譜。
圖 7 中提供一隻小鼠之代表性影像，其顯示在用4% PFA固定後24小時後振動肝切片中之TdTomato表現。應注意，與野生型AAV9相比，AAV-STRD.102及AAV-STRD.101載體不再靶向肝。此合意性質係出乎意料的，此乃因在進化期間未實施肝中之複篩。
圖 8 提供一隻小鼠之代表性影像，其顯示在用4% PFA固定後24小時後振動心臟切片中之TdTomato表現。應注意，所測試載體對心臟具有不同之向性。具體而言，AAV-STRD.102載體在心臟中之感染性低於AAV-STRD.101。由於在進化期間未實施心臟篩查，故此種差異轉導係完全出乎意料的。
綜上所述，該等資料表明，AAV-STRD.102及AAV-STRD.101載體可成功地用於靶向活體內CNS組織，避免肝之清除，且係基因療法之強有力工具。鑒於其不同之向性(即AAV-STRD.101在心臟中之感染性強於AAV-STRD.102)，該等載體將為將基因療法治療靶向特定期望組織之強有力工具。實例 5 ：重組 AAV 在非人類靈長類動物中之生物分佈
將重組AAV投與非人類靈長類動物以測定生物分佈。重組AAV係藉由靜脈內(IV)及腦血管內(ICV)注射來投與(圖 9 )。AAV-STRD.101係以2.9 × 1013 個載體基因體/公斤(vg/kg)之劑量藉由IV注射及以2.1 × 1013 vg之劑量藉由ICV注射來投與(黑點)。AAV-STRD.102係以2.8 × 1013 vg/kg之劑量藉由IV注射及以3.0 × 1013 vg之劑量藉由ICV注射來投與(白點)。30天後，將動物殺死，且藉由qPCR量測不同CNS組織中之病毒負荷。
如圖 9 中所示，AAV-STRD.102及AAV-STRD.101二者感染不同之CNS組織。另外，由於AAV顯示高轉導水準，此資料表明該等AAV可能避免活體內中和抗體。實例 6 ：用於治療有需要之個體之細胞治療方法
使用AAV載體離體轉導細胞。出於一些目的，細胞可為自體(即衍生自欲治療之個體)或同種異體(即衍生自不同之個體/供體)。在使用AAV轉導細胞後且在已驗證轉殖基因之表現後，使用標準臨床方法將細胞投與個體。
細胞可一次性投與個體，或投與可重複多次。所投與細胞之數量端視例如欲治療之疾病或疾患、個體疾病/疾患之嚴重程度以及個體之身高及體重而變化。實例 7 ：用於治療有需要之個體之基因治療方法
將本文所述之AAV載體(例如包含具有SEQ ID NO: 175或180之序列之衣殼蛋白次單元之AAV載體)投與有需要之個體，其中個體患有CNS疾病或病症。AAV載體係一次性投與個體，或投與可重複多次。投與係藉由一或多個途徑，例如靜脈內(IV)、腦室內(ICV)或鞘內(IT)注射。AAV載體之劑量端視例如欲治療之疾病或疾患、個體疾病/疾患之嚴重程度以及個體之身高及體重而變化。舉例而言，當藉由IV注射投與AAV載體時，投與個體之AAV之劑量可為2.8 × 1013 vg/kg或2.9 × 1013 vg/kg。當藉由ICV注射投與AAV載體時，劑量可為2.1 × 1013 vg或3.0 × 1013 vg。在一些方案中，AAV載體可藉由IV及ICV注射投與個體。實例 8 ：哺乳動物細胞中重組 AAV 載體之製備
提供三種質體。第一種質體包含轉移盒，該轉移盒包含側接有兩個ITR (SEQ ID NO: 3003及3004)之編碼NPC1之轉殖基因(SEQ ID NO: 3002)。第一種質體包含SEQ ID NO: 3014-3019中任一者之序列。第二種質體包含編碼Rep及Cap基因之序列。第三種質體包含AAV產生所需之各種「輔助」序列(E4、E2a及VA)。
使用適當轉染試劑(例如LipofectamineTM )將三種質體轉染至病毒產生細胞(例如HEK293)中。在37℃下培育預定時間段後，自培養基收集AAV顆粒或溶解細胞以釋放AAV顆粒。然後根據標準方法，使用定量PCR (qPCR)或點滴數位PCR (ddPCR)對AAV顆粒進行純化及滴定。可將AAV顆粒儲存在-80℃下以備後用。實例 9 ：昆蟲細胞中重組 AAV 載體之製備
提供第一種重組杆狀病毒載體。第一種重組杆狀病毒載體包含轉移盒序列，該轉移盒序列包含側接有兩個ITR (SEQ ID NO: 3003及3004)之編碼NPC1之轉殖基因(SEQ ID NO: 3002)。轉移盒包含SEQ ID NO: 3014-3019中任一者之序列。
將昆蟲細胞(例如Sf9)在懸浮培養物中與第一種重組杆狀病毒載體及至少一種額外重組杆狀病毒載體共感染，該至少一種額外重組杆狀病毒載體包含編碼AAV Rep及Cap蛋白(例如STRD.101或STRD.012衣殼蛋白次單元)之序列。在28℃下培育預定時間段後，自培養基收集AAV顆粒或溶解細胞以釋放AAV顆粒。然後根據標準方法，使用定量PCR (qPCR)或點滴數位PCR (ddPCR)對AAV顆粒進行純化及滴定。可將AAV顆粒儲存在-80℃下以備後用。實例 10 ：活體外功效分析
為確定本文所述之AAV轉移盒是否能夠拯救經培養細胞中之NPC1溶酶體表型，在HEK293細胞中使用三重轉染方案製備包裝hNPC1轉移盒(SEQ ID NO: 3014)之重組AAV2載體(例如，參見實例1)。然後使用AAV2-hNPC1載體活體外轉導野生型U2OS細胞(骨肉瘤)及不表現NPC1 (NPC-/- )之U2OS細胞，感染複數(MOI)為5 × 103 (5K)或10 × 103 (10K)。然後在37℃下在5% CO2 氣氛中培育細胞。
NPC1細胞在溶酶體中展現特征性膽固醇累積，其可藉由觀察細胞中溶酶體之大小及數量來監測。在此分析中，藉由量測細胞中螢光細胞器染料LysoTracker® (ThermoFisher Scientific® )之累積來監測溶酶體表型。用AAV2-hNPC1載體轉導72小時後，將50 mM LysoTracker® 添加至細胞中。2小時後，固定細胞並量測LysoTracker® 螢光。
結果顯示於圖 10A 中。如預期，野生型U2OS細胞在溶酶體中未顯示顯著之LysoTracker® 螢光累積，而NPC1-/- 細胞顯示顯著之螢光累積。用AAV2-hNPC1以5K或10K之MOI轉導之細胞在溶酶體中具有顯著減少之LysoTracker® 螢光之累積。
在單獨分析中，將用hNPC1轉導之細胞固定並使用非律平染色，非律平係膽固醇之組織化學染色劑。衍生自菲律賓鏈黴菌(Streptomyces filipinensis )之非律平染色劑購自Polysciences，且以50 µg/mL之最終濃度使用。使用Pico自動化細胞成像系統(ImageXpress® )使細胞可視化，且量化非律平染色劑。結果顯示於圖 10B 中。如預期，野生型U2OS細胞未顯示顯著之膽固醇累積，而NPC1-/- 細胞顯示顯著之膽固醇累積。用AAV2-hNPC1以5K或10K之MOI轉導之細胞具有顯著降低之膽固醇累積。
綜上所述，該等資料表明，使用AAV2-hNPC之細胞轉導成功地拯救了NPC1缺陷型U2OS細胞之溶酶體表型。實例 11 ：活體內功效分析
為確定本文所述之AAV轉移盒是否能夠拯救活體內NPC1表型，在HEK293細胞中使用三重轉染方案製備包裝hNPC1轉移盒(SEQ ID NO: 3014)之重組AAV9載體(例如，參見實例1)。藉由眶後注射向約24-28日齡之NPC1缺陷型小鼠(即NPC1-/- 小鼠)靜脈內注射劑量為3.0 × 1014 個載體基因體/公斤(vg/kg)之鹽水或AAV9-hNPC1載體。結果顯示於圖 11 中。所有用鹽水處理之小鼠在約80日齡時死亡。然而，所有注射AAV9-hNPC1之動物在整個實驗持續時間內皆存活。將注射AAV9-hNPC1之小鼠在約100日齡時處死用於分析。
小鼠亦在平衡木行走測試中受到挑戰，其中當小鼠走過平衡木時量測滑倒次數。測試係在約8週齡(56天)時實施。如圖 13 中所示，野生型小鼠沒有自平衡木上滑落。儘管用AAV9-hNPC1處理之NPC1-/- 小鼠與用鹽水處理之NPC1-/- 小鼠之間之滑倒次數沒有統計學上顯著之差異，但在AAV9-hNPC1組中觀察到之平均滑倒次數較少。
亦在約10週齡(70天)時評價小鼠之行為表型評分。行為表型評分係量測各種疾病症狀，包括儀容整潔、步態、駝背、壁架測試、後肢彎曲及震顫之綜合評分。(參見Alam等人，Sci Transl Med, 2016；Guyenet等人，J Vis Exp, 2010)。如圖 12 中所示，經AAV9-hNPC1處理之NPC1-/- 小鼠與經鹽水處理之NPC1-/- 小鼠相比具有顯著減小的評分。
綜上所述，該等資料表明，AAV9-hNPC1可至少部分地拯救NPC1缺陷型小鼠之疾病表型。實例 12 ：在活體外及活體內測試包裝編碼 NPC1 之盒之 STRD.101 載體
根據實例8或實例9之方法製備包含含有編碼人類NPC1之轉移盒(例如SEQ ID NO: 14之轉移盒)之核酸之AAV-STRD.101載體。此載體在本文中稱為AAV-STRD.101-hNPC1。
為確定AAV-STRD.101載體是否能夠拯救經培養細胞中之NPC1溶酶體表型，隨後使用AAV-STRD.101-hNPC1載體來轉導野生型U2OS細胞(骨肉瘤)及不表現NPC1 (NPC-/- )之活體外U2OS細胞，感染複數(MOI)為5 × 103 (5K)或10 × 103 (10K)。然後在37℃在5% CO2 氣氛中培育細胞。
NPC1細胞在溶酶體中展現特征性膽固醇累積，其可藉由觀察細胞中溶酶體之大小及數量來監測。因此，藉由量測細胞中螢光細胞器染料LysoTracker® (ThermoFisher Scientific® )之累積來監測溶酶體表型。在用AAV2-hNPC1載體轉導後72小時，將50 mM之LysoTracker® 添加至細胞中。2小時後，將細胞固定且量測LysoTracker® 螢光。
在單獨分析中，將經AAV-STRD.101-hNPC1載體轉導之細胞固定且使用非律平染色劑染色，非律平染色劑係膽固醇之組織化學染色劑。衍生自菲律賓鏈黴菌之非律平染色劑係以50 µg/mL之最終濃度使用。使用Pico自動化細胞成像系統(ImageXpress® )使細胞可視化，且量化非律平染色。
亦測試AAV-STRD.101-hNPC1載體以確定其是否可拯救活體內 NPC1表型。藉由眶後注射向約24-28日齡之NPC1缺陷型小鼠(即NPC1-/- 小鼠)靜脈內注射劑量為3.0 × 1014 vg/kg之鹽水或AAV9-hNPC1載體。監測直至至少100日齡之存活率。
小鼠亦在平衡木行走測試中受到挑戰，其中當小鼠走過平衡木時量測滑倒次數。在約8週齡(56天)時實施測試。
亦在約10週齡(70天)時評價小鼠之行為表型評分。行為表型評分係量測各種疾病症狀，包括儀容整潔、步態、駝背、壁架測試、後肢彎曲及震顫之綜合評分。(參見Alam等人，Sci Transl Med, 2016；Guyenet等人，J Vis Exp, 2010)。
前述內容係對本發明之說明，且不應理解為限制本發明。本發明係由所附申請專利範圍限定，其中包括申請專利範圍之等效內容。經編號之實施例
儘管附有申請專利範圍，但本揭示案闡述以下經編號之實施例： 1. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含：(i)蛋白質衣殼，其包含含有SEQ ID NO: 180或175之序列之衣殼蛋白次單元；及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之核酸；其中核酸包含轉移盒；其中轉移盒自5’至3’包含：5’反向末端重複(ITR)；啟動子；編碼NPC1蛋白之轉殖基因序列；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR。 2. 如實施例1之AAV載體，其中5’ ITR及3’ ITR中之至少一者之長度為約110至約160個核苷酸。 3. 如實施例1或2之AAV載體，其中5’ ITR之長度與3’ ITR之長度相同。 4. 如實施例1或2之AAV載體，其中5’ ITR與3’ ITR具有不同之長度。 5. 如實施例1-4中任一者之AAV載體，其中5’ ITR及3’ ITR中之至少一者係自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、鳥AAV或牛AAV之基因體分離或衍生而來。 6. 如實施例1之AAV載體，其中5’ ITR包含SEQ ID NO: 3003之序列。 7. 如實施例1之AAV載體，其中3’ ITR包含SEQ ID NO: 3004之序列。 8. 如實施例1-7中任一者之AAV載體，其中啟動子係組成型啟動子。 9. 如實施例1-7中任一者之AAV載體，其中啟動子係誘導型啟動子。 10. 如實施例1-9中任一者之AAV載體，其中啟動子係組織特異性啟動子。 11. 如實施例1-7中任一者之AAV載體，其中啟動子係選自由以下組成之群：CBA啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子、HSVTK啟動子、CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、多角體蛋白啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1α啟動子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。 12. 如實施例11之AAV載體，其中啟動子係選自由以下組成之群：CBA啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子及HSVTK啟動子。 13. 如實施例1-7中任一者之AAV載體，其中啟動子包含與SEQ ID NO: 3005、SEQ ID NO: 3006、SEQ ID NO: 3007或SEQ ID NO: 3008中之任一者至少95%或100%一致之序列。 14. 如實施例1-13中任一者之AAV載體，其中NPC1蛋白係人類NPC1蛋白。 15. 如實施例1-13中任一者之AAV載體，其中NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少90%一致之序列。 16. 如實施例15之AAV載體，其中NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少95%一致之序列。 17. 如實施例16之AAV載體，其中NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少98%一致之序列。 18. 如實施例1-13中任一者之AAV載體，其中NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 3001之序列。 19. 如實施例1-13中任一者之AAV載體，其中轉殖基因包含SEQ ID NO: 3002之序列。 20. 如實施例1-18中任一者之AAV載體，其中多聚腺苷酸化信號係選自猿猴病毒40 (SV40)、rBG、α-球蛋白、β-球蛋白、人類膠原、人類生長激素(hGH)、多瘤病毒、人類生長激素(hGH)及牛生長激素(bGH)。 21. 如實施例20之AAV載體，其中多聚腺苷酸化信號係SV40多聚腺苷酸化信號。 22. 如實施例20之AAV載體，其中多聚腺苷酸化信號係rBG多聚腺苷酸化信號。 23. 如實施例1-19中任一者之AAV載體，其中多聚腺苷酸化信號包含與SEQ ID NO: 3012或與SEQ ID NO: 3013至少95%或100%一致之序列。 24. 如實施例1-23中任一者之AAV載體，其中盒進一步包含增強子。 25. 如實施例24之AAV載體，其中增強子係CMV增強子。 26. 如實施例24之AAV載體，其中增強子包含SEQ ID NO: 3009之序列或與其至少95%一致之序列。 27. 如實施例1-26中任一者之AAV載體，其中盒進一步包含內含子序列。 28. 如實施例27之AAV載體，其中內含子序列係嵌合序列。 29. 如實施例27之AAV載體，其中內含子序列係雜合序列。 30. 如實施例27之AAV載體，其中內含子序列包含自SV40分離或衍生而來之序列。 31. 如實施例27之AAV載體，其中內含子序列包含SEQ ID NO: 3010-3011中任一者之序列。 32. 如實施例1之AAV載體，其中AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 3014-3019中任一者之序列。 33. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含：(i)蛋白質衣殼，該蛋白質衣殼包含衣殼蛋白次單元，該衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 180或175之序列或相對於SEQ ID NO: 180或175包含約1至約25個胺基酸突變之序列；及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之轉移盒；其中轉移盒自5’至3’包含：5’反向末端重複(ITR)；啟動子；編碼NPC1蛋白之轉殖基因序列；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR。 34. 一種組合物，其包含如實施例1-33中任一者之AAV載體。 35. 如實施例34之組合物，其中組合物包含醫藥學上可接受之載劑或賦形劑。 36. 一種治療有需要之個體之方法，其包括向個體投與治療有效量之如實施例1-33中任一者之AAV載體或如實施例34-35中任一者之組合物。 37. 如實施例36之方法，其中個體患有C型尼曼-匹克病。 38. 如實施例36或37之方法，其中個體係人類個體。 39. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含：(i)蛋白質衣殼，其包含含有SEQ ID NO: 180或175之序列之衣殼蛋白次單元；及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之轉移盒；其中轉移盒自5’至3’包含：5’反向末端重複(ITR)；啟動子；包含SEQ ID NO: 3002之序列之轉殖基因序列；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR。 40. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含：(i)蛋白質衣殼，其包含含有SEQ ID NO: 180或175之序列之衣殼蛋白；及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之核酸；其中核酸包含轉移盒；其中轉移盒自5’至3’包含：5’反向末端重複(ITR)；啟動子；編碼NPC1蛋白之轉殖基因序列，其中NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 3001之序列；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR。 41. 如實施例1-33、39及40中任一者之AAV載體，其中AAV載體將轉移盒選擇性遞送至中樞神經系統之細胞或組織。 42. 如實施例41之AAV載體，其中中樞神經系統之組織係前運動皮質、視丘、小腦皮質、齒狀核、脊髓或背根神經節。 43. 如實施例1-33、39及40中任一者之AAV載體，其中AAV載體將轉移盒遞送至腦，但不將AAV載體遞送至心臟。 44. 如實施例1-33、39及40中任一者之AAV載體，其中AAV載體將轉移盒遞送至腦及心臟。 45. 如實施例44之AAV載體，其中轉移盒遞送至腦大於遞送至心臟。 46. 如實施例44之AAV載體，其中轉移盒之遞送在腦中及在心臟中大致相等。 47. 一種細胞，其包含如實施例1-33及39-46中任一者之AAV載體。 48. 一種將轉移盒引入細胞中之活體外方法，其包括使細胞與如實施例1-33及39-46中任一者之AAV載體接觸。 49. 如實施例1-33及39-46中任一者之AAV載體，其用作藥劑。 50. 如實施例1-33及39-46中任一者之AAV載體，其用於治療或預防有需要之個體之C型尼曼-匹克病之方法中。 51. 如實施例1-33及39-46中任一者之AAV載體，其中衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 180之序列。 52. 如實施例1-33及39-46中任一者之AAV載體，其中衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 175之序列。 53. 一種腺相關病毒(AAV)轉移盒，其自5’至3’包含：5’反向末端重複(ITR)；啟動子；轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR；其中轉殖基因編碼NPC1蛋白。 54. 如實施例53之AAV轉移盒，其中5’ ITR及3’ ITR中之至少一者之長度為約110至約160個核苷酸。 55. 如實施例53或54之AAV轉移盒，其中5’ ITR之長度與3’ ITR之長度相同。 56. 如實施例53或54之AAV轉移盒，其中5’ ITR與3’ ITR具有不同之長度。 57. 如實施例53-56中任一者之AAV轉移盒，其中5’ ITR及3’ ITR中之至少一者係自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、鳥AAV或牛AAV之基因體分離或衍生而來。 58. 如實施例53之AAV轉移盒，其中5’ ITR包含SEQ ID NO: 3003之序列。 59. 如實施例53之AAV轉移盒，其中3’ ITR包含SEQ ID NO: 3004之序列。 60. 如實施例53-59中任一者之AAV轉移盒，其中啟動子係組成型啟動子。 61. 如實施例53-59中任一者之AAV轉移盒，其中啟動子係誘導型啟動子。 62. 如實施例53-59中任一者之AAV轉移盒，其中啟動子係組織特異性啟動子。 63. 如實施例53-59中任一者之AAV轉移盒，其中啟動子係選自由以下組成之群：CBA啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子、HSVTK啟動子、CMV啟動子、SV40早期啟動子、SV40晚期啟動子、金屬硫蛋白啟動子、鼠類乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、多角體蛋白啟動子、雞β-肌動蛋白(CBA)啟動子、EF-1α啟動子、二氫葉酸還原酶(DHFR)啟動子及磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。 64. 如實施例63之AAV轉移盒，其中啟動子係選自由以下組成之群：CBA啟動子、GUSB240啟動子、GUSB379啟動子及HSVTK啟動子。 65. 如實施例53-59中任一者之AAV轉移盒，其中啟動子包含與SEQ ID NO: 3005、SEQ ID NO: 3006、SEQ ID NO: 3007或SEQ ID NO: 3008中之任一者至少95%或100%一致之序列。 66. 如實施例53-65中任一者之AAV轉移盒，其中NPC1蛋白係人類NPC1蛋白。 67. 如實施例53-65中任一者之AAV轉移盒，其中NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少90%一致之序列。 68. 如實施例67之AAV轉移盒，其中NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少95%一致之序列。 69. 如實施例68之AAV轉移盒，其中NPC1蛋白具有與人類NPC1蛋白之序列至少98%一致之序列。 70. 如實施例53-65中任一者之AAV轉移盒，其中NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 3001之序列。 71. 如實施例53-65中任一者之AAV轉移盒，其中轉殖基因包含SEQ ID NO: 3002之序列。 72. 如實施例53-71中任一者之AAV轉移盒，其中多聚腺苷酸化信號係選自猿猴病毒40 (SV40)、rBG、α-球蛋白、β-球蛋白、人類膠原、人類生長激素(hGH)、多瘤病毒、人類生長激素(hGH)及牛生長激素(bGH)。 73. 如實施例72之AAV轉移盒，其中多聚腺苷酸化信號係SV40多聚腺苷酸化信號。 74. 如實施例72之AAV轉移盒，其中多聚腺苷酸化信號係rBG多聚腺苷酸化信號。 75. 如實施例53-71中任一者之AAV轉移盒，其中多聚腺苷酸化信號包含與SEQ ID NO: 3012或與SEQ ID NO: 3013至少95%或100%一致之序列。 76. 如實施例53-75中任一者之AAV轉移盒，其中盒進一步包含增強子。 77. 如實施例76之AAV轉移盒，其中增強子係CMV增強子。 78. 如實施例76之AAV轉移盒，其中增強子包含SEQ ID NO: 3009之序列或與其至少95%一致之序列。 79. 如實施例53-78中任一者之AAV轉移盒，其中盒進一步包含內含子序列。 80. 如實施例79之AAV轉移盒，其中內含子序列係嵌合序列。 81. 如實施例79之AAV轉移盒，其中內含子序列係雜合序列。 82. 如實施例79之AAV轉移盒，其中內含子序列包含自SV40分離或衍生而來之序列。 83. 如實施例79之AAV轉移盒，其中內含子序列包含SEQ ID NO: 3010-3011中任一者之序列。 84. 如實施例53之AAV轉移盒，其中AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 3014-3019中任一者之序列。 85. 一種質體，其包含如實施例53-84中任一者之AAV轉移盒。 86. 一種細胞，其包含如實施例53-84中任一者之AAV轉移盒或如實施例85之質體。 87. 一種產生重組AAV載體之方法，該方法包括使AAV產生細胞與如實施例53-84中任一者之AAV轉移盒或如實施例85之質體接觸。 88. 一種藉由如實施例87之方法產生之重組AAV載體。 89. 如實施例88之重組AAV載體，其中載體具有選自以下之血清型：AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh32.33、AAVrh74、鳥AAV及牛AAV。 90. 一種組合物，其包含如實施例53-84中任一者之AAV轉移盒、如實施例85之質體、如實施例86之細胞或如實施例88或89之重組AAV載體。 91. 一種治療有需要之個體之方法，其包括向個體投與有效量之如實施例53-84中任一者之AAV轉移盒、如實施例85之質體、如實施例86之細胞或如實施例88或89之重組AAV載體。 92. 如實施例91之方法，其中個體患有疾病NPC1。 93. 如實施例91或92之方法，其中個體係人類個體。 94. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含：(i)蛋白質衣殼，其包含含有SEQ ID NO: 180之序列之衣殼蛋白次單元；及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之核酸；其中核酸包含轉移盒；其中轉移盒自5’至3’包含：5’反向末端重複(ITR)；啟動子；編碼NPC1蛋白之轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR。 95. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含：(i)蛋白質衣殼，該蛋白質衣殼包含衣殼蛋白次單元，該衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 180之序列或相對於SEQ ID NO: 180包含約1至約25個胺基酸突變之序列；及(ii)經蛋白質衣殼殼體化之核酸；其中核酸包含轉移盒；其中轉移盒自5’至3’包含：5’反向末端重複(ITR)；啟動子；編碼NPC1蛋白之轉殖基因；多聚腺苷酸化信號；及3’ ITR。 96. 如實施例94或95之AAV載體，其中轉移盒包含內含子序列。 97. 如實施例94-96中任一者之AAV載體，其中內含子序列包含SEQ ID NO: 10之序列。 98. 如實施例94-97中任一者之AAV載體，其中5’ ITR包含SEQ ID NO: 3003之序列。 99. 如實施例94-98中任一者之AAV載體，其中3’ ITR包含SEQ ID NO: 3004之序列。 100. 如實施例94-99中任一者之AAV載體，其中啟動子係CBA啟動子。 101. 如實施例94-99中任一者之AAV載體，其中啟動子包含SEQ ID NO: 3005之序列。 102. 如實施例94-101中任一者之AAV載體，其中NPC1蛋白係人類NPC1蛋白。 103. 如實施例94-101中任一者之AAV載體，其中NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 3001之序列。 104. 如實施例94-101中任一者之AAV載體，其中轉殖基因包含SEQ ID NO: 3002之序列。 105. 如實施例94-104中任一者之AAV載體，其中多聚腺苷酸化信號係SV40多聚腺苷酸化信號。 106. 如實施例94-104中任一者之AAV載體，其中多聚腺苷酸化信號包含SEQ ID NO: 3012之序列。 107. 如實施例94-106中任一者之AAV載體，其中盒包含增強子。 108. 如實施例94之AAV載體，其中AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 3014之序列。 109. 如實施例94之AAV載體，其中AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 3015-3019中任一者之序列。 110. 一種組合物，其包含如實施例94-109中任一者之AAV載體。 111. 一種細胞，其包含如實施例94-109中任一者之AAV載體。 112. 一種治療有需要之個體之方法，其包括向個體投與有效量之如實施例94-109中任一者之AAV載體、如實施例110之組合物或如實施例111之細胞。 113. 如實施例112之方法，其中個體患有C型尼曼-匹克病。 114. 如實施例112或113之方法，其中個體係人類個體。
圖 1A-1C . 顯示文庫多樣性、定向進化及新穎抗原足跡富集之分析之泡泡圖。使用Illumina MiSeq平臺對親代(圖1A)及來自第一輪(圖1B)及第二輪(圖1C)進化之進化文庫進行高通量測序。用定制之Perl腳本分析後，對富集之胺基酸序列進行繪圖。每個泡代表不同之衣殼蛋白次單元胺基酸序列，泡之半徑與各別文庫中該變異體之讀數成比例。y軸表示測序運行之總讀數之百分比。為便於可視化，資料沿x軸分佈。獨特純系之減少百分比(96.5%)直接表明，許多「不匹配」序列在第一輪及第二輪進化後被移除。選擇優勢分離物進行進一步分析。圖 2. 與野生型AAV9相比，包含含有衣殼蛋白次單元變異體STRD.101及STRD.102之蛋白質衣殼之AAV載體之體積產量。各條代表平均值+/- 95%信賴區間。圖 3. 使用標準TCID50分析測定之AAV-STRD.101及野生型AAV9之感染性值。資料繪製為產生感染單位所需之粒子數(P:I比率)之自然對數。誤差條代表標準偏差。圖 4A-4D. 包含STRD.101衣殼蛋白次單元且包裝螢光素酶轉殖基因之重組AAV載體與以類似方式包裝螢光素酶序列之野生型AAV9載體相比對U87細胞(圖4A)、N2A細胞(圖4B)、Sy5Y細胞(圖4C)及U2OS細胞(圖4D)之轉導。誤差條代表標準誤差。圖 5. 顯示在用4% PFA固定後24小時冠狀振動切片中之tdTomato表現之代表性螢光顯微術影像。每個切片之厚度為25 μm。上圖顯示使用4×物鏡獲得之帶有天然tdTomato螢光之影像。下圖顯示使用10×物鏡獲得之帶有天然tdTomato螢光之影像。圖 6. 顯示在用4% PFA固定後24小時冠狀振動切片中之tdTomato表現之代表性免疫組織化學影像。每個切片之厚度為25 μm。圖 7. 顯示在用4% PFA固定後24小時振動肝切片中之TdTomato表現之代表性螢光顯微術影像。每個切片之厚度為25 μm。各圖顯示用DAPI複染之天然tdTomato螢光。圖 8. 顯示在用4% PFA固定後24小時振動心臟切片中之TdTomato表現之代表性螢光顯微術影像。每個切片之厚度為50 μm。各圖顯示用DAPI複染之天然tdTomato螢光。圖 9. 重組AAV在非人類靈長類動物中之生物分佈。水平線顯示偵測限值。圖 10A 係顯示如藉由量測LysoTracker® 累積所測定，野生型U2OS細胞、NPC1缺陷型(NPC1-/- ) U2OS細胞及以5 × 103 或10 × 103 之感染複數(MOI)經AAV2-hNPC轉導之NPC1-/- 細胞中之溶酶體表型的圖。使用單因子ANOVA確定統計學顯著性。誤差條代表平均值之標準誤差(SEM)。圖 10B 係顯示如使用非律平(filipin)染色所測定，野生型U2OS細胞、NPC1缺陷型(NPC1-/- ) U2OS細胞及以5 × 103 或10 × 103 之感染複數(MOI)經AAV2-hNPC轉導之NPC1-/- 細胞中之膽固醇累積的圖。使用單因子ANOVA確定統計學顯著性。誤差條代表SEM。圖 11 係顯示在眶後注入鹽水或AAV9-hNPC1後NPC1-/- 小鼠之存活率之卡普蘭-邁耶存活率曲線(Kaplan-Meier survival curve)。所有注入AAV9-hNPC1之動物在整個實驗之持續時間內存活，且在約100日齡時殺死用於組織學分析。圖 12 顯示野生型小鼠、鹽水處理之NPC1-/- 小鼠或注入AAV9-hNPC1之NPC1-/- 小鼠在約10週齡(70天)時之行為表型評分。使用未配對T-測試來確定統計學顯著性，且誤差條代表SEM。圖 13 顯示野生型小鼠、鹽水處理之NPC1-/- 小鼠或經AAV9-hNPC1處理之NPC1-/- 小鼠在約8週齡(56天)時在平衡木行走測試中滑倒之次數。誤差條代表標準偏差。
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Claims (21)

  1. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含： (i) 蛋白質衣殼，其包含含有SEQ ID NO: 180之序列之衣殼蛋白次單元；及 (ii) 經該蛋白質衣殼殼體化之核酸； 其中該核酸包含轉移盒； 其中該轉移盒自5’至3’包含： 5’反向末端重複(ITR)； 啟動子； 編碼NPC1蛋白之轉殖基因； 多聚腺苷酸化信號；及 3’ ITR。
  2. 如請求項1之AAV載體，其中該轉移盒包含內含子序列。
  3. 如請求項1或2之AAV載體，其中該內含子序列包含SEQ ID NO: 10之序列。
  4. 如請求項1至3中任一項之AAV載體，其中該5’ ITR包含SEQ ID NO: 3003之序列。
  5. 如請求項1至4中任一項之AAV載體，其中該3’ ITR包含SEQ ID NO: 3004之序列。
  6. 如請求項1至5中任一項之AAV載體，其中該啟動子係CBA啟動子。
  7. 如請求項1至5中任一項之AAV載體，其中該啟動子包含SEQ ID NO: 3005之序列。
  8. 如請求項1至7中任一項之AAV載體，其中該NPC1蛋白係人類NPC1蛋白。
  9. 如請求項1至7中任一項之AAV載體，其中該NPC1蛋白包含SEQ ID NO: 3001之序列。
  10. 如請求項1至7中任一項之AAV載體，其中該轉殖基因包含SEQ ID NO: 3002之序列。
  11. 如請求項1至10中任一項之AAV載體，其中該多聚腺苷酸化信號係SV40多聚腺苷酸化信號。
  12. 如請求項1至10中任一項之AAV載體，其中該多聚腺苷酸化信號包含SEQ ID NO: 3012之序列。
  13. 如請求項1至12中任一項之AAV載體，其中該盒包含增強子。
  14. 如請求項1之AAV載體，其中該AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 3014之序列。
  15. 如請求項1之AAV載體，其中該AAV轉移盒包含SEQ ID NO: 3015-3019中任一者之序列。
  16. 一種腺相關病毒(AAV)載體，其包含： (i) 蛋白質衣殼，該蛋白質衣殼包含衣殼蛋白次單元，該衣殼蛋白次單元包含SEQ ID NO: 180之序列或相對於SEQ ID NO: 180包含約1至約25個胺基酸突變之序列；及 (ii) 經該蛋白質衣殼殼體化之核酸； 其中該核酸包含轉移盒； 其中該轉移盒自5’至3’包含： 5’反向末端重複(ITR)； 啟動子； 編碼NPC1蛋白之轉殖基因； 多聚腺苷酸化信號；及 3’ ITR。
  17. 一種組合物，其包含如請求項1至16中任一項之AAV載體。
  18. 一種細胞，其包含如請求項1至16中任一項之AAV載體。
  19. 一種治療有需要之個體之方法，其包括向該個體投與有效量之如請求項1至16中任一項之AAV載體、如請求項17之組合物或如請求項18之細胞。
  20. 如請求項19之方法，其中該個體患有C型尼曼-匹克病(Neimann-Pick Disease Type C)。
  21. 如請求項19或20之方法，其中該個體係人類個體。
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