JP7393766B2 - 抗体回避ウイルスベクターのための方法および組成物 - Google Patents

抗体回避ウイルスベクターのための方法および組成物 Download PDF

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Description

優先権の陳述
本出願は、２０１８年６月２０日提出の米国特許仮出願第６２／６８７，５８３号、および２０１８年２月２８日提出の米国特許仮出願第６２／６３６，５９８号の、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下での利益を主張するものであり、前記特許文献の全内容は引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
政府支援の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所により与えられる認可番号ＨＬ１１２７６１、ＧＭ０８２９４６、およびＨＬ０８９２２１の下、政府出資で行われた。政府は、本発明にある特定の権利を有する。
配列表の電子ファイリングに関する陳述
ＡＳＣＩＩテキストフォーマットでの配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１の下で提出され、表題は５４７０－８３８ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと付けられ、サイズは２２３，９７０バイトで、２０１９年２月２８日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを経て提出され、ハードコピーに代わって提供される。本配列表は、その開示のために引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
分野
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来の改変カプシドタンパク質ならびに前記同一カプシドタンパク質を含むウイルスカプシドおよびウイルスベクターに関する。特に、本開示は、改変ＡＡＶカプシドタンパク質およびウイルスベクター中に組み込んで、形質導入効率が減少せずに中和抗体を回避する表現型を与えることができる前記同一カプシドタンパク質を含むカプシドに関する。
ＡＡＶまたは組換えＡＡＶベクターに自然に遭遇すると産生される宿主由来の既存の抗体は、ワクチンとしてのおよび／または遺伝子療法のためのＡＡＶベクターの初回のならびに繰り返し投与を妨げる。血清学研究によって、世界中のヒト集団における抗体の高保有率が明らかになり、ＡＡＶ１に対する抗体を有するのは約６７％のヒト、ＡＡＶ２に対しては７２％、およびＡＡＶ５からＡＡＶ９までに対しては約４０％である。
さらに、遺伝子療法において、遺伝子サイレンシングまたは組織変性を含むある特定の臨床シナリオには、トランス遺伝子の長期発現を持続するためには複数のＡＡＶベクター投与が必要となる場合がある。したがって、ｒＡＡＶを含む遺伝子療法の効率を高める組成物および方法があれば、広く有用になると考えられる。効果的な臨床使用を促進するため、抗体認識を回避する組換えＡＡＶベクター（ＡＡＶｅ）が必要とされる。そのようなＡＡＶベクターは、ａ）ＡＡＶベースの遺伝子療法に適した患者の適格なコーホートを広げる、およびｂ）ＡＡＶベースの遺伝子療法ベクターの複数の、繰り返し投与を可能にするのに役立つ。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を含み、当技術分野における以前の欠点を克服する方法および組成物が本明細書で提供される。ＡＡＶカプシドタンパク質は、１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、この置換によりこれらの改変カプシドタンパク質を含むＡＡＶベクター中に宿主抗体を回避する能力が導入される。
最近の、ｒＡＡＶ粒子を用いた遺伝子送達の成功にもかかわらず、対象に投与されたｒＡＡＶ粒子を中和することができる既存の抗体が重大な難問となっている。少なくとも、中和抗体を回避するまたは免れる能力のあるｒＡＡＶ粒子の、遺伝子療法を必要とする対象に投与するのに必要とされる濃度は、そのような能力のないｒＡＡＶ粒子と比べてもっと低くて済むという理由で、これらの中和抗体との相互作用を減らす、または完全に免れるｒＡＡＶ粒子の組成物および方法があれば有用であると考えられる。
一態様では、本開示は、配列番号８として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸位６６１～６７０（ＶＰ１番号付け）に対応し、配列番号２６として特定されるＡＡＶ９の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸位６５９～６６８（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸に、または他のいずれかのＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における等価なアミノ酸位に、アミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４－Ｋ－Ｌ－Ｘ５（配列番号１９７）を生じる置換を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、Ｘ１はＰ以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ２はＴ以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ３はＱ以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ４はＳ以外の任意のアミノ酸であり；および／またはＸ５はＮ以外の任意のアミノ酸である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を提供する。
追加の態様として、本開示は、配列番号８として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸位６６１～６７０（ＶＰ１番号付け）に対応し、配列番号２６として特定されるＡＡＶ９の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸位６５９～６６８（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸に、または他のいずれかのＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における等価なアミノ酸位に、アミノ酸配列：ＶＧＴＦＮＥＡＫＬＨ（ｈ１；配列番号１６６）、ＶＳＴＦＮＰＡＫＬＭ（ｈ９；配列番号１６７）、ＰＬＴＦＮＣＣＫＬＮ（ｄ５；配列番号１６８）、ＰＶＴＦＮＱＤＫＬＷ（ｄ４；配列番号１６９）、ＰＶＴＦＮＳＧＫＬＣ（ｈ６；配列番号１７０）、ＩＧＴＦＮＧＱＫＬＣ（ｈ４；配列番号１７１）、ＱＶＴＦＮＧＧＫＬＦ（ｈ５；配列番号１７２）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＷ（ｈ３；配列番号１７３）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＡ（ｈ８；配列番号１７４）、ＰＧＴＦＮＲＧＫＬＱ（ｈ７；配列番号１７５）、ＰＧＴＦＮＤＧＫＬＧ（ｄ６；配列番号１７６）、ＰＳＴＦＮＣＭＫＬＰ（ｈ２；配列番号１７７）、ＰＳＴＦＮＣＰＫＬＱ（ｈ１１；配列番号１７８）、ＰＳＴＦＮＬＧＫＬＳ（ｄ１；配列番号１７９）、ＰＳＴＦＮＧＧＫＬＰ（ｄ７；配列番号１８０）、ＳＣＴＦＮＬＨＫＬＣ（ｈ１２；配列番号１８１）、ＱＤＴＦＮＲＴＫＬＣ（ｈ１０；配列番号１８２）、ＰＴＴＦＮＲＴＫＬＭ（ｄ３；配列番号１８３）、ＦＶＴＦＮＧＤＫＬＭ（ｘｘ４；配列番号１８４）、ＲＲＴＦＮＳＲＫＬＫ（ｘｘ２；配列番号１８５）、ＳＶＴＦＮＳＡＫＬＱ（ｅ２；配列番号１８６）、ＶＬＴＦＮＧＳＫＬＡ（ｅ１；配列番号１８７）、ＰＴＴＦＮＰＳＫＬＷ（ｘｘ３；配列番号１８８）、ＰＶＴＦＮＥＧＫＬＦ（ｅ３；配列番号１８９）、ＰＴＴＦＮＱＧＫＬＱ（ｅ５；配列番号１９０）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＧ（ｘｘ１；配列番号１９１）、ＰＬＴＦＮＮＧＫＬＳ（ｘｘ５；配列番号１９２）、ＲＳＴＦＮＧＤＫＬＮ（ｈｉ－Ｃ；配列番号１９３）、ＰＴＴＦＮＶＤＫＬＧ（ｈｉ－Ａ；配列番号１９４）、ＰＩＴＦＮＥＰＫＬＡ（ｈｉ－Ｂ；配列番号１９５）、またはＷＰＴＦＮＡＧＫＬＲ（ｈｉ－ｅ；配列番号１９６）を生じる置換を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を提供する。
追加の態様として、本開示は、配列番号８として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸位６６１～６６７（ＶＰ１番号付け）に対応し、配列番号２６として特定されるＡＡＶ９の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸位６５９～６６５（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸に、または他のいずれかのＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における等価なアミノ酸位に、アミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４（配列番号１９８）を生じる置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質であって、Ｘ１はＰ以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ２はＴ以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ３はＱ以外の任意のアミノ酸であり；および／またはＸ４はＳ以外の任意のアミノ酸である、ＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。
さらに、本開示は、少なくとも一部は、ＡＡＶ粒子上での中和抗体の抗原フットプリント、またはマップの作成、および１つまたは複数の中和抗体に対する反応性の減少を生じるこれらのフットプリント内でのアミノ酸置換を有するｒＡＡＶ粒子の開発に基づいている。特に、本開示の発明者らは、ＡＡＶ粒子の５回領域において抗原フットプリントを開発した。
したがって、改変５回領域を含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）カプシドタンパク質が本明細書で提供され、この改変５回領域は１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、改変５回領域における１つまたは複数のアミノ酸置換により、改変５回領域なしでカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子（すなわち、ＶＰ）と比べて、中和抗体に対する反応性の減少を生じる。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは血清型１のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換は、配列番号１８として特定されるＡＡＶ１の参照アミノ酸配列に基づいて、位置２５０～２５８、３２４～３３３、３７１、３７２、５４６～５５０、５５７、６５５～６７４または７１６～７２１（ＶＰ１番号付け）にある。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは血清型２のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換は、配列番号１９として特定されるＡＡＶ２の参照アミノ酸配列に基づいて、位置２５０～２５８、３２３～３３２、３７０、３７１、５４５～５４８、５５６、６５５～６７３または７１５～７２０（ＶＰ１番号付け）にある。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは血清型５のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換は、配列番号２２として特定されるＡＡＶ５の参照アミノ酸配列に基づいて、位置２４０～２４８、３１４～３２３、３７２、３７３、５３２～５３５、５４６、６４４～６６２または７０４～７０９（ＶＰ１番号付け）にある。ｒＡＡＶが血清型２のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換が、位置２５０～２５８、３２３～３３２、３７０、３７１、５４５～５４８、５５６、６５５～６７３または７１５～７２０にある一部の実施形態では、中和抗体はＡＶＢである。ｒＡＡＶが血清型５のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換が、位置２４０～２４８、３１４～３２３、３７２、３７３、５３２～５３５、５４６、６４４～６６２または７０４～７０９にある一部の実施形態では、中和抗体はＡＶＢである。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは血清型９のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換は、配列番号２６として特定されるＡＡＶ９の参照アミノ酸配列に基づいて、位置２５１～２５５、２６４、３２５～３３４または６５６～６７４（ＶＰ１番号付け）にある。ｒＡＡＶが血清型９のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換が、位置２５１～２５５、２６４、３２５～３３４または６５６～６７４にある一部の実施形態では、中和抗体はＣＳＡＬ９である。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは血清型８のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換は、配列番号２５として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて、位置２５２～２６６、３２６～３３５、６５８～６７６または７２０（ＶＰ１番号付け）にある。ｒＡＡＶが血清型８のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換が、位置２５２～２６６、３２６～３３５、６５８～６７６または７２０にある一部の実施形態では、中和抗体はＨＬ２３７２である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは血清型９のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換は、配列番号２６として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて、位置２５１～２６６、３２５～３３４、６５７～６７３または７１８（ＶＰ１番号付け）にある。ｒＡＡＶが血清型９のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換が、位置２５１～２６６、３２５～３３４、６５７～６７３または７１８にある一部の実施形態では、中和抗体はＨＬ２３７２である。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは血清型５のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換は、配列番号２２として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて、位置２１８、２４０～２５８、２６１、２６３、２６７、２７９、３３１、３５０、３５５～３６０、３６４、３６５、３７７、３７８、３９５、４２９～４３２、４３７、４５０、４５１、４５３～４５６、４５８、４５９、５３０～５４３、５４５～５４８、６３９、６４１、６４２、６４８～６５１、６５３～６５８、６６０～６６２、６９７～７００または７０４～７１（ＶＰ１番号付け）にある。ｒＡＡＶが血清型５のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換が、位置２１８、２４０～２５８、２６１、２６３、２６７、２７９、３３１、３５０、３５５～３６０、３６４、３６５、３７７、３７８、３９５、４２９～４３２、４３７、４５０、４５１、４５３～４５６、４５８、４５９、５３０～５４３、５４５～５４８、６３９、６４１、６４２、６４８～６５１、６５３～６５８、６６０～６６２、６９７～７００または７０４～７１にある一部の実施形態では、中和抗体はＡＤＫ５ａである。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶは血清型５のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換は、配列番号２２として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて、位置２４１～２４８、３１３～３１９、３２１、３２３、３５５、３５６、３５８～３６２、４４０～４４３、４４６～４４９、５３０～５４８、６４５～６５１、６５３～６６１、６９７、６９８または７０４～７１２（ＶＰ１番号付け）にある。ｒＡＡＶが血清型５のものであり、その１つまたは複数のアミノ酸置換が、位置２４１～２４８、３１３～３１９、３２１、３２３、３５５、３５６、３５８～３６２、４４０～４４３、４４６～４４９、５３０～５４８、６４５～６５１、６５３～６６１、６９７、６９８または７０４～７１２にある一部の実施形態では、中和抗体はＡＤＫ５ｂである。
本開示は、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドも提供する。本開示のＡＡＶカプシドを含むウイルスベクターならびに本開示のＡＡＶカプシドタンパク質、ＡＡＶカプシドおよび／またはウイルスベクターを薬学的に許容される担体中に含む組成物が本明細書ではさらに提供される。
本開示は、ＡＡＶカプシドに対する抗体の存在下で核酸を細胞中に導入する方法であって、細胞を本開示のウイルスベクターに接触させるステップを含む方法をさらに提供する。細胞は対象中に存在することが可能であり、一部の実施形態では、対象はヒト対象が可能である。
本発明のこれらのおよび他の態様は、以下に示される本発明の説明においてさらに詳細に表明される。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の態様をさらに実証するために含まれ、本開示は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つまたは複数を参照することによりさらによく理解することができる。図面に説明されるデータは本開示の範囲を決して限定しないことは理解されるべきである。
それぞれの位置（強調されている）で無作為化されたＡＡＶカプシドライブラリーの選択に続いて進化させた異なるアミノ酸残基を示している。 同定され図１において示された配列由来の例示的な突然変異体ＡＡＶカプシドの抗体回避能力の評価を示している。手短に言えば、ＧＦＰ配列をパッケージしている例示的なＡＡＶ突然変異体は、漸増濃度量の中和抗体ＨＬ２３７２と一緒にインキュベートした（倍希釈度として示される）。野生型バージョンのアミノ酸配列を含有するカプシドは、高度に希釈された試料中（１対４４８０）では容易に中和され、培養細胞におけるＧＦＰ発現（白色点）は著しく減少する。これとは対照的に、突然変異体ｈｉＡおよびｈｉＣ、ならびに程度はこれより低いがｘｘ１は中和されず、ＧＦＰ発現はロバストであり、これらの進化した変異体がＨＬ２３７２を回避するという考えを支持していた。 ＨＬ抗体の交差反応性を示す。異なる血清型の組換えＡＡＶカプシドは、左側に示される順にドットブロット膜上に負荷した。タンパク質の存在は、Ｂ１抗体を使用する検出により確かめられ、このＢ１抗体は変性ＶＰを検出する。同じ負荷パターンを用いて、異なるＡＡＶ血清型のカプシドはＨＬ２３７２抗体によっても検出された。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９のみがＨＬ２３７２抗体に反応した（Ｔｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２３６：１０５－１１０）。 ｒＡＡＶ９粒子の形質導入効率をルシフェラーゼ活性として測定するためのアッセイにおけるＨＬ抗体によるインビトロ中和を示しており、その遺伝子はｒＡＡＶ粒子により細胞に送達される。ＡＤＫ４抗体は、負の対照として使用した。ＡＤＫ９抗体は正の対照として使用した。ＨＬ２３７２抗体についてのデータは箱に入っている。 Ｂａｌｂ／Ｃマウスの肝臓、脾臓、または心臓においてルシフェラーゼ活性により証明されるｒＡＡＶ９粒子の形質導入効率を測定するためのアッセイにおけるＨＬ抗体によるインビボ中和を示している。マウスはルシフェラーゼをコードする核酸を含むｒＡＡＶ粒子を投与された。ＡＤＫ４抗体は、負の対照として使用した。ＡＤＫ９抗体は正の対照として使用した。ＨＬ２３７２抗体についてのデータは箱に入っている。 ＨＬ２３７２抗体と複合体化したｒＡＡＶ粒子の構造および作成された抗原フットプリントを示している。図６Ａは、濃い灰色のＡＡＶ８－ＨＬ２３７２複合体と薄い灰色のＦａｂ密度を示している。フットプリントを形成する残基はカプシド画像の下に２Ｄロードマップ画像で示されている。ロードマップ（またはフットプリント）は、カプシドの非対称画像上の表面画像を示している。 ＨＬ２３７２抗体と複合体化したｒＡＡＶ粒子の構造および作成された抗原フットプリントを示している。図６Ｂは、濃い灰色で示されるＡＡＶ９－ＨＬ２３７２複合体と薄い灰色のＦａｂ密度を示している。フットプリントを形成する残基はカプシド画像の下に２Ｄロードマップ画像で示されている。ロードマップ（またはフットプリント）は、カプシドの非対称画像上の表面画像を示している。
本発明は、これから、添付の図面を参照して説明され、ここで本発明の代表的な実施形態が示される。しかし、本発明は、異なる形で具体化してもよく、本明細書に表明される実施形態に限定されると解釈するべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的で完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように、提供される。いくつかの発明の実施形態が本明細書で説明され図解されてきたが、当業者であれば、本明細書に記載される機能を実行し、ならびに／または結果および／もしくは利点の１つもしくは複数を得るために種々の他の手段および／または構造を容易に想定することになるが、そのような変形および／または修正のそれぞれが本明細書に記載される発明の実施形態の範囲内であると見なされる。さらに一般的には、当業者であれば、本明細書に記載されるすべてのパラメータ、寸法、材料、および立体配置は例示的なものであることが意図されていること、ならびに、実際のパラメータ、寸法、材料、および立体配置が、本発明の教え（単数または複数）が使用される特定の適用（単数または複数）に依拠することを容易に認識する。当業者であれば、本明細書に記載される特定の発明の実施形態の多くの均等物を認識する、または決まりきった実験だけを使用して確かめることができる。したがって、前述の実施形態は例としてのみ提示されること、ならびに添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、発明の実施形態は、具体的に記載され請求される以外の方法で実行しうることを理解するべきである。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載されるそれぞれ個々の特長、システム、項目、材料、キットおよび／または方法を対象とする。さらに、２つまたはそれよりも多いそのような特長、システム、項目、材料、キットおよび／または方法のいかなる組合せも、そのような特長、システム、項目、材料、キットおよび／または方法が互いに矛盾しなければ、本開示の発明の範囲内に含まれる。
別段定義されなければ、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。本明細書で本発明の説明に使用される用語法は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明を限定することを意図していない。すべての定義は、本明細書で定義され使用される場合、辞書の定義、引用することにより本明細書の一部をなすものとする文書における定義、および／または定義された用語の通常の意味を総轄すると理解されるべきである。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、ジェンバンク受託番号および他の参考文献は、それぞれが引用される主題に関して引用することにより本明細書の一部をなし、それぞれは場合によって、その文書の全体を包含することがある。
説明および添付の特許請求の範囲におけるＡＡＶカプシドタンパク質中のすべてのアミノ酸位の呼称は、ＶＰ１カプシドサブユニット番号付けに関してのものである。本明細書に記載される改変は、ＡＡＶｃａｐ遺伝子中に挿入される場合には、ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３カプシドサブユニットでの改変を生じる可能性があることは、当業者であれば理解する。あるいは、カプシドサブユニットは独立して発現させて、カプシドサブユニットの１つまたは２つ（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ１＋ＶＰ２、ＶＰ１＋ＶＰ３、またはＶＰ２＋ＶＰ３）だけでの改変を達成することができる。
定義
以下の用語は、本明細書での説明および添付の特許請求の範囲において使用される。
不定冠詞「１つ（ａ）」および「１つ（ａｎ）」は、本明細書の明細書でおよび特許請求の範囲で使用される場合、反対であるとはっきり示されなければ、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が別段はっきりと示していなければ、複数形も同様に含むことが意図されている。
さらに、用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さ、用量、時間、温度、および同類のものの量などの測定可能値に言及するときに本明細書で使用される場合、特定量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、または±０．１％までもの変動を包含することが意味されている。
その上本明細書で使用される場合、「および／または」とは、関連する収載された項目のうちの１つまたは複数のありとあらゆる考えられる組合せ、ならびに、選択的に（「または」）と解釈された場合は組合せの欠如を指し、包含する。語句「および／または」は、本明細書の明細書でおよび特許請求の範囲で使用される場合、そのように結びつけられた要素、すなわち、一部の場合には接続的に存在しており、他の場合には離接的に存在している要素の「どちらかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」付きで収載されている複数の要素は、同じ様式で、すなわち、そのように結びつけられた要素の「１つまたは複数」と解釈されるべきである。他の要素が、「および／または」の語句により具体的に特定される要素以外に、具体的に同定されたそれらの要素と関係があっても関係がなくても、任意選択で存在しうる。したがって、非限定的例として、「Ａおよび／またはＢ」への言及は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのオープンエンド表現と併せて使用される場合、一実施形態では、Ａのみを（任意選択でＢ以外の要素を含む）、別の実施形態では、Ｂのみを（任意選択でＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態では、ＡとＢの両方を（任意選択で他の要素を含む）、等を指すことが可能である。
本明細書の明細書でおよび特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、一覧中で項目を分ける場合、「または」または「および／または」は包括的である、すなわち、いくつかのまたは一覧の要素のうち少なくとも１つを包含するが、１つよりも多くも含み、任意選択で、追加の未収載項目を包含すると解釈されるものとする。「の１つだけ」または「の正確に１つ」または、特許請求の範囲で使用される場合は、「からなる」などの反対であるとはっきり示されている用語のみ、いくつかのまたは一覧の要素のうち正確に１つの要素を包含することを指すことになる。一般に、本明細書で使用される用語「または」は、「どちらか」、「の１つ」、「の１つだけ」、または「の正確に１つ」などの排他的な用語が先行する場合にのみ排他的な選択肢（すなわち、「１つまたは残りの１つ、しかし両方ではない）を示していると解釈するものとする。「本質的にからなる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用されるその通常の意味を持つものとする。
本明細書の明細書でおよび特許請求の範囲で使用される場合、１つまたは複数の要素の一覧に関して、語句「少なくとも１つ」は、要素の一覧中の要素のいずれか１つまたは複数から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素の一覧内に具体的に収載されているありとあらゆる要素の少なくとも１つを含むわけではなく、要素の一覧中の要素のいかなる組合せも排除しない。この定義は、語句「少なくとも１つ」が指す要素の一覧内に具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に同定されたそれらの要素と関係があっても関係がなくても、任意選択で存在しうることも認める。したがって、非限定的例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」または、同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つの、任意選択で１つよりも多いＡを含み、Ｂは存在しない（および任意選択で、Ｂ以外の要素を含む）；別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択で１つよりも多いＢを含み、Ａは存在しない（および任意選択で、Ａ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、少なくとも１つの、任意選択で１つよりも多いＡを含み、および少なくとも１つの、任意選択で１つよりも多いＢを含む（および任意選択で、他の要素を含む）；等を指すことができる。
反対であるとはっきり示されなければ、１つよりも多いステップまたは行為を含む本明細書で請求されるいかなる方法においても、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも、方法のステップまたは行為が列挙される順序に限定されるわけではないことも理解するべきである。
特許請求の範囲では、ならびに、上の明細書では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「担持する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「で構成されている（ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ）」、および同類のものなどのすべての移行句は、オープンエンドである、すなわち、含むが限定されない、を意味すると理解されるべきである。移行句の「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」のみは、米国特許庁米国特許審査基準、セクション２１１１．０３に表明される通り、それぞれ、クローズドまたは半クローズド移行句であるものとする。オープンエンド移行句（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）を使用して本文書に記載される実施形態は、代替的な実施形態では、オープンエンド移行句により記載される特長「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」および「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」としても想定されることは認識するべきである。例えば、本開示が「ＡおよびＢを含む組成物」と記載する場合、本開示は代替的な実施形態を「ＡおよびＢからなる組成物」および「本質的にＡおよびＢからなる組成物」とも想定する。
文脈が別段指示しなければ、本明細書に記載される本発明の種々の特長はいかなる組合せでも使用することができることは特に意図されている。
さらに、本発明は、本発明の一部の実施形態において、本明細書に表明されるいかなる特長もおよび特長の組合せも排除するまたは省くことができることも想定している。
さらに説明するため、例えば、明細書が特定のアミノ酸をＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択可能であることを示している場合、この表現は、アミノ酸がこれらのアミノ酸（単数または複数）の任意のサブセット、例えば、Ａ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ；ＡまたはＧ、Ｌのみ；等から選択可能であることも、それぞれのそのような部分的組合せが本明細書に明白に表明されているかのように、示している。さらに、そのような表現は、特定のアミノ酸の１つまたは複数を否認することができることも示している。例えば、特定の実施形態では、それぞれのそのような考えられる否認が本明細書に明白に表明されているかのように、アミノ酸はＡでもＧでもＩでもない；Ａではない；ＧでもＶでもない；等である。
本明細書で使用される場合、用語「減らす（ｒｅｄｕｃｅ）」、「減らす（ｒｅｄｕｃｅｓ）」、「減少（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ）」および類似する用語は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３５％、５０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％またはそれよりも多い減少を意味する。
本明細書で使用される場合、用語「増強する（ｅｎｈａｎｃｅ）」、「増強する（ｅｎｈａｎｃｅｓ）」、「増強（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」および類似する用語は、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％、１５０％、２００％、３００％、４００％、５００％またはそれよりも多い増加を示す。
本明細書で使用される用語「パルボウイルス」は、自律複製パルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科を包含する。自律性パルボウイルスは、プロトパルボウイルス（Ｐｒｏｔｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属、エリスロパルボウイルス（Ｅｒｙｔｈｒｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属、ボカパルボウイルス（Ｂｏｃａｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属、およびデンソウイルス（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｕｓ）亜科のメンバーを含む。例示的な自律性パルボウイルスは、これらに限定されないが、マウスの微小ウイルス、ウシパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ニワトリパルボウイルス、ネコ汎血球減少症ウイルス、ネコパルボウイルス、ガチョウパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、ノバリケンパルボウイルス、Ｂ１９ウイルス、および現在知られておりまたは後に発見される他の任意の自律性パルボウイルスを含む。他の自律性パルボウイルスは当業者には公知である。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｃｏｔｍｏｒｅ ｅｔ ａｌ．Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ＤＯＩ １０．１００７／ｓ００７０５－０１３－１９１４－Ｉ）を参照されたい。
本明細書で使用される場合、用語「アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）」は、これらに限定されないが、ＡＡＶ１型、ＡＡＶ２型、ＡＡＶ３型（３Ａ型および３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４型、ＡＡＶ５型、ＡＡＶ６型、ＡＡＶ７型、ＡＡＶ８型、ＡＡＶ９型、ＡＡＶ１０型、ＡＡＶ１１型、ＡＡＶ１２型、ＡＡＶ１３型、ＡＡＶｒｈ３２．３３型、ＡＡＶｒｈ８型、ＡＡＶｒｈ１０型、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、および現在知られておりまたは後に発見される他の任意のＡＡＶを含む。例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｃｈａｐｔｅｒ ６９（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照されたい。いくつかのＡＡＶ血清型およびクレードが同定されてきた（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７８：６３８１－６３８８；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３－：３７５－３８３；および表１を参照）。
ＡＡＶおよび自律性パルボウイルスの種々の血清型のゲノム配列ならびに天然の末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、およびカプシドサブユニットの配列は当技術分野では公知である。そのような配列は文献にまたはジェンバンクなどの公開のデータベースに見出しうる。例えば、ジェンバンク受託番号ＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２、ＡＹ５３０５７９を参照されたい。これら受託番号の開示はパルボウイルスならびにＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列を教えるために引用することにより本明細書の一部をなすものとする。例えば、Ｓｒｉｖｉｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４５：５５５；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：１３０９；Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：９３９；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３９９４；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２２１：２０８；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３３－：３７５－３８３；国際特許公開第００／２８０６１号、国際特許公開第９９／６１６０１号、国際特許公開第９８／１１２４４号；および米国特許第６，１５６，３０３号も参照されたい。これら文献の開示はパルボウイルスならびにＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列を教えるために引用することにより本明細書の一部をなすものとする。表１も参照されたい。自律性パルボウイルスおよびＡＡＶのカプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ６９＆７０（４ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）にさらに詳細に記載されている。ＡＡＶ２（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１０４０５－１０）、ＡＡＶ９（ＤｉＭａｔｔｉａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６：６９４７－６９５８）、ＡＡＶ８（Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１２２６０－１２２７１）、ＡＡＶ６（Ｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８４：１２９４５－１２９５７）、ＡＡＶ５（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，（２０１３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８７，１１１８７－１１１９９）、ＡＡＶ４（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０：１１５５６－１１５７０）、ＡＡＶ３Ｂ（Ｌｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，（２０１０）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４０３：２６－３６）、ＢＰＶ（Ｋａｉｌａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９：２６０３－２６１４）およびＣＰＶ（Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．６：４９７－５２０およびＴｓａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１４５６－６４）の結晶構造の説明も参照されたい。
本明細書で使用される用語「トロピズム」とは、ウイルスがある特定の細胞または組織に優先的に侵入し、任意選択で、続いて、細胞中でウイルスゲノムが担持する配列（複数可）の発現（例えば、転写、および、任意選択で、翻訳）、例えば、組換えウイルスでは、目的の異種核酸（複数可）の発現をすることである。
当業者であれば、ウイルスゲノムからの異種核酸配列の転写は、例えば、誘導性プロモーターまたは別の方法で調節される核酸配列では、トランス作用因子が存在しなければ開始されない場合があることを認識する。ｒＡＡＶゲノムの場合では、ウイルスゲノムからの遺伝子発現は、安定的に組み込まれたプロウイルスから、組み込まれていないエピソーム、ならびに細胞内でウイルスがとりうる他の任意の形態からでもよい。
本明細書で使用される場合、「全身的トロピズム」および「全身的形質導入」（および同等な用語）は、本開示のウイルスカプシドまたはウイルスベクターが、それぞれ、身体全体の組織（例えば、脳、肺、骨格筋、心臓、肝臓、腎臓および／または膵臓）に対してトロピズムを示すまたは形質導入することを示す。本開示の実施形態では、筋肉組織（例えば、骨格筋、横隔膜および心筋）の全身的形質導入が観察される。他の実施形態では、骨格筋組織の全身的形質導入が達成される。例えば、特定の実施形態では、身体全体の本質的にすべての骨格筋が形質導入される（が、形質導入の効率は筋肉型によって変動しうる）。特定の実施形態では、手足筋、心筋および横隔膜筋の全身的形質導入が達成される。任意選択で、ウイルスカプシドまたはウイルスベクターは全身経路（例えば、静脈内に、関節内にまたはリンパ管内になどの全身経路）を介して投与される。あるいは、他の実施形態では、カプシドまたはウイルスベクターは局所的に（ｌｏｃａｌｌｙ）（例えば、足蹠に、筋肉内に、皮内に、皮下に、局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ））送達される。
別段指示されなければ、「効率的な形質導入」または「効率的なトロピズム」または類似する用語は、適切な対照を参照することにより決定することができる（例えば、対照の、それぞれ、形質導入またはトロピズムの少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれよりも多い）。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、骨格筋、心筋、横隔膜筋、膵臓（β島細胞を含む）、脾臓、消化管（例えば、上皮および／または平滑筋）、中枢神経系の細胞、肺、関節細胞、および／または腎臓を効率的に形質導入するまたはこれらに対して効率的なトロピズムを有する。適切な対照は、所望のトロピズムプロファイルを含む種々の要因に依存することになる。例えば、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９は、骨格筋、心筋および横隔膜筋を形質導入するのが高度に効率的であるが、肝臓も高い効率で形質導入する不都合がある。したがって、本開示は、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９の骨格筋、心筋および／または横隔膜筋の効率的な形質導入を示すが、肝臓では形質導入効率がはるかに低いウイルスベクターを同定するために実行することができる。さらに、目的のトロピズムプロファイルは複数の標的組織に対するトロピズムを反映することがあるので、適切なベクターはいくつかのトレードオフを表しうることが認識される。実例を示すと、本開示のウイルスベクターは、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋を形質導入するのがＡＡＶ８またはＡＡＶ９ほど効率的ではないことがあるが、肝臓の形質導入のレベルが低いせいで、それにもかかわらず、非常に望ましい場合がある。
同様に、ウイルスが標的組織、もしくは類似する用語を「効率的に形質導入しない」のかまたは標的組織、もしくは類似する用語に対して「効率的なトロピズムを持たない」のかどうかを、適切な対照を参照することにより判定することができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、肝臓、腎臓、生殖腺および／または生殖細胞については効率的に形質導入しない（すなわち、効率的なトロピズムを持たない）。特定の実施形態では、組織（複数可）（例えば、肝臓）の望ましくない形質導入は、所望の標的組織（複数可）（例えば、骨格筋、横隔膜筋、心筋および／または中枢神経系の細胞）の形質導入のレベルの２０％またはそれよりも少ない、１０％またはそれよりも少ない、５％またはそれよりも少ない、１％またはそれよりも少ない、０．１％またはそれよりも少ない。
本明細書で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、別段指示されなければ、ペプチドとタンパク質の両方を包含する。
「ポリヌクレオチド」はヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（自然に存在するヌクレオチドと自然には存在しないヌクレオチドの両方を含む）でもよいが、代表的な実施形態では、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ配列のどちらかである。
本明細書で使用される場合、「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、自然に存在する生物もしくはウイルスのその他の成分の少なくとも一部、例えば、細胞もしくはウイルス構成成分、またはポリヌクレオチドに付随しているのが一般に見出される他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離されたポリヌクレオチドを意味する。代表的な実施形態では、「単離された」ヌクレオチドは、出発物質と比べた場合、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれよりも多く濃縮される。
同様に、「単離された」ポリペプチドは、自然に存在する生物もしくはウイルスのその他の成分の少なくとも一部、例えば、細胞もしくはウイルス構成成分、またはポリペプチドと会合しているのが一般に見出される他のポリペプチドもしくは核酸から少なくとも部分的に分離されたポリペプチドを意味する。代表的な実施形態では、「単離された」ポリペプチドは、出発物質と比べた場合、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれよりも多く濃縮される。
本明細書で使用される場合、ウイルスベクターを「単離する」または「精製する」（または文法上の等価物）とは、ウイルスベクターが出発物質中のその他の成分の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されることを意味する。代表的な実施形態では、「単離された」または「精製された」ウイルスベクターは、出発物質と比べた場合、少なくとも約１０倍、１００倍、１０００倍、１０，０００倍またはそれよりも多く濃縮される。
「治療ポリペプチド」は、細胞もしくは対象中のタンパク質の非存在もしくは欠損から生じる症状を軽減する、減少させる、予防する、遅延するおよび／もしくは安定化することができるポリペプチドである、ならびに／または他の方法で対象に利益、例えば、抗がん効果もしくは移植生存可能性の改善を与えるポリペプチドである。
用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「の処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ）」（およびその文法的変化）は、対象の状態の重症度が減少される、少なくとも部分的に改善されるもしくは安定化されることおよび／または少なくとも１つの臨床症状のある程度の軽減、緩和、減少もしくは安定化が達成されるおよび／または疾患もしくは障害の進行が遅延されることを意味する。
用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」、「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（およびその文法的変化）とは、本開示の方法がない場合に生じると考えられることと比べて、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状（複数可）の発症の予防および／もしくは遅延、ならびに／または疾患、障害および／もしくは臨床症状（複数可）の発症の重症度の低減のことである。予防は、完全である、例えば、疾患、障害および／または臨床症状（複数可）が全くないことが可能である。予防は、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状（複数可）の発生ならびに／または発症の重症度が、本開示の方法および組成物がなければ起こると考えられることよりも少ないように、部分的であることも可能である。
本明細書で使用される「処置有効」量は、対象にある程度の改善または利益を提供するのに十分な量である。別の言い方をすれば、「処置有効」量は、対象において少なくとも１つの臨床症状のある程度の軽減、緩和、減少または安定化を提供する量である。当業者であれば、治療効果は、対象にある程度の利益が提供されさえすれば、完全であるまたは治癒的である必要はないことを認識する。
本明細書で使用される「予防有効」量は、本開示の方法がない場合に生じると考えられることと比べて、対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状の発症を予防するおよび／もしくは遅延する、ならびに／または対象における疾患、障害および／もしくは臨床症状の発症の重症度を減らすおよび／もしくは遅延するのに十分である量である。当業者であれば、予防のレベルは、対象にある程度の利益が提供されさえすれば、完全である必要はないことを認識する。
用語「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸」は本明細書では互換的に使用され、ウイルスに自然には存在しない配列のことである。一般に、異種核酸は、目的のポリペプチドまたは非翻訳ＲＮＡをコードするオープンリーディングフレームを含む（例えば、細胞または対象への送達のため）。
本明細書で使用される場合、用語「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」とは、核酸送達媒体として機能し、ビリオン内にパッケージされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含むウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子のことである。あるいは、一部の文脈では、用語「ベクター」は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡ単独を指すのに使用してもよい。
「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、１つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＶＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは一般に、ウイルスを作製するためにはシスの末端反復（複数可）（ＴＲ）のみを必要とする。他のウイルス配列はすべて不必要であり、トランスで供給されてもよい（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。典型的には、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターが効率的にパッケージすることができるトランス遺伝子のサイズを最大にするために１つまたは複数のＴＲ配列を保持するだけである。構造および非構造タンパク質コード配列はトランスで提供してもよい（例えば、プラスミドなどのベクターから、または配列をパッケージング細胞中に安定的に組み込むことにより）。実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ配列）、任意選択で、２つのＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含み、ＴＲは典型的には、ベクターゲノムの５’および３’末端にあり、異種核酸に隣接しているが、それに連続している必要はない。ＴＲは互いに同じであるまたは異なっていることが可能である。
用語「末端反復」または「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成し逆位末端反復として機能する（すなわち、複製、ウイルスパッケージング、組込みおよび／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能、ならびに同類のものを媒介する）任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＴＲはＡＡＶ ＴＲまたは非ＡＡＶ ＴＲが可能である。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、マウスパルボウイルス（ＭＶＭ）、ヒトパルボウイルスＢ－１９）の配列などの非ＡＡＶ ＴＲ配列または他の任意の適切なウイルス配列（例えば、ＳＶ４０複製起点としての役割を果たすＳＶ４０ヘアピン）はＴＲとして使用可能であり、これは、切詰め、置換、欠失、挿入および／または付加によりさらに改変することができる。さらに、ＴＲは
Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．への米国特許第５，４７８，７４５号に記載される「二重Ｄ配列」などの、部分的または完全な合成が可能である。
「ＡＡＶ末端反復」または「ＡＡＶ ＴＲ」は、これらに限定されないが、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３を含む任意のＡＡＶまたは現在知られておりもしくは後に発見される他の任意のＡＡＶ由来でもよい（例えば、表１参照）。ＡＡＶ末端反復は、末端反復が所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込みおよび／またはプロウイルスレスキュー、ならびに同類のものを媒介しさえすれば、天然の末端反復配列を持つ必要はない（例えば、天然のＡＡＶ ＴＲ配列は、挿入、欠失、切詰めおよび／またはミスセンス突然変異により変更しうる）。
本開示のウイルスベクターは、国際特許公開第００／２８００４号およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載されているように、「標的化」ウイルスベクター（例えば、指向性トロピズムを有する）および／または「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＴＲおよびウイルスカプシドが異なるパルボウイルス由来である）がさらに可能である。
本開示のウイルスベクターは、国際特許公開第０１／９２５５１号に記載されている二重鎖パルボウイルス粒子がさらに可能である（前記特許文献の開示は引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。したがって、一部の実施形態では、二本鎖（二重鎖）ゲノムは本開示のウイルスカプシド中にパッケージすることができる。
さらに、ウイルスカプシドまたはゲノムエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の改変を含有できる。
本明細書で使用される場合、用語「アミノ酸」は、任意の自然に存在するアミノ酸、その改変型、および合成アミノ酸を包含する。
自然に存在する左旋性（Ｌ－）アミノ酸は表２に示されている。
あるいは、アミノ酸は改変アミノ酸残基が可能である（非限定的例は表３に示されている）および／または翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化）により改変されるアミノ酸が可能である。
さらに、天然には存在しないアミノ酸は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５－４９（２００６）により記載される「非自然」アミノ酸が可能である。これら非自然アミノ酸は、目的の分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結するのに都合よく使用することができる。
改変ＡＡＶカプシドタンパク質ならびに前記同一カプシドタンパク質を含むウイルスカプシドおよびウイルスベクター
本開示は、アミノ酸配列に改変（例えば、置換）を含むＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２および／またはＶＰ３）ならびに改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドおよびウイルスベクターを提供する。発明者らは、ＡＡＶカプシドタンパク質を改変すると改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスベクターに、限定せずに中和抗体を回避する能力を含む１つまたは複数の望ましい特性を与えることができることを発見していた。したがって、本開示は、従来のＡＡＶベクターに関連する制限のいくつかに取り組む。
したがって、一態様では、本開示は、１つまたは複数のアミノ酸置換を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を提供し、１つまたは複数の置換はＡＡＶカプシドタンパク質上で１つまたは複数の抗原部位を改変する。１つまたは複数の抗原部位の改変により、抗体による１つまたは複数の抗原部位への結合の阻害が生じ、および／または前記ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルス粒子の感染力の中和の阻害が生じる。１つまたは複数のアミノ酸置換は、ＡＡＶカプシドタンパク質を含有するＡＡＶ－抗体複合体のペプチドエピトープマッピングおよび／または低温電子顕微鏡研究により同定される１つまたは複数の抗原フットプリントにあることが可能である。
本開示のカプシドタンパク質は、中和抗体を回避する表現型を有するＡＡＶウイルス粒子またはＡＡＶウイルスベクター中に存在しているＡＡＶカプシドを産生するように改変される。本開示のＡＡＶウイルス粒子またはベクターは、中和抗体を回避する表現型に加えて増強されたまたは維持された形質導入効率の表現型も有することができる。「中和抗体を回避する」とは、自然のＡＡＶ粒子上の最初のアミノ酸配列に結合すると考えられる抗体が、特に、置換された残基が任意の自然のＡＡＶ血清型の残基と適合しない場合には、本明細書に記載されるＡＡＶ粒子を認識せずしたがって結合しないことを意味する。
したがって、一実施形態では、本開示は、配列番号８として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸位６６１～６７０（ＶＰ１番号付け）に対応し、配列番号２６として特定されるＡＡＶ９の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸位６５９～６６８（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸に、または他の任意のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質において等価なアミノ酸位でアミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４－Ｋ－Ｌ－Ｘ５（配列番号１９７）を生じる置換を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、Ｘ１はＰ以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ２はＴ以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ３はＱ以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ４はＳ以外の任意のアミノ酸であり；および／またはＸ５はＮ以外の任意のアミノ酸である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を提供する。
一部の実施形態では、Ｘ１はＶ、Ｉ、Ｑ、Ｓ、Ｆ、Ｒ、またはＷが可能である。
一部の実施形態では、Ｘ２はＧ、Ｓ、Ｌ、Ｖ、Ｃ、Ｄ、Ｒ、Ｉ、またはＰが可能である。
一部の実施形態では、Ｘ３はＥ、Ｐ、Ｃ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ｎ、Ｖ、またはＡが可能である。
一部の実施形態では、Ｘ４はＰ、Ｑ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｃ、Ａ、Ｍ、Ｈ、またはＴが可能である。
一部の実施形態では、Ｘ５はＨ、Ｍ、Ｗ、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｑ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｗ、またはＲが可能である。
一部の実施形態では、Ｘ１はＰであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＧであり、Ｘ４はＧであり、およびＸ５はＧである。一部の実施形態では、Ｘ１はＲであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＧであり、Ｘ４はＤであり、およびＸ５はＮである。一部の実施形態では、Ｘ１はＰであり、Ｘ２はＴであり、Ｘ３はＶであり、Ｘ４はＤであり、およびＸ５はＧである。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号８として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸位６６１～６６７（ＶＰ１番号付け）に対応し、配列番号２６として特定されるＡＡＶ９の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸位６５９～６６５（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸に、または他の任意のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質において等価なアミノ酸位でアミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４（配列番号１９８）を生じる置換を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、Ｘ１はＰ以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ２はＴ以外の任意のアミノ酸であり；Ｘ３はＱ以外の任意のアミノ酸であり；および／またはＸ４はＳ以外の任意のアミノ酸である、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を提供する。一部の実施形態では、Ｘ１はＲであり、Ｘ２はＳであり、Ｘ３はＧであり、およびＸ４はＤである。
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４および／またはＸ５のいずれかでの置換は、置換された部位のいかなる組合せでもおよび置換された部位での置換のいかなる組合せでも可能である。例えば、カプシドはＸ１、Ｘ２およびＸ４にアミノ酸置換をならびにＸ３およびＸ５に野生型残基を含んでいてもよい。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号８として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸位６６１～６７０（ＶＰ１番号付け）に対応し、配列番号２６として特定されるＡＡＶ９の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸位６５９～６６８（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸に、または他の任意のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における等価なアミノ酸位に、アミノ酸配列：ＶＧＴＦＮＥＡＫＬＨ（ｈ１；配列番号１６６）、ＶＳＴＦＮＰＡＫＬＭ（ｈ９；配列番号１６７）、ＰＬＴＦＮＣＣＫＬＮ（ｄ５；配列番号１６８）、ＰＶＴＦＮＱＤＫＬＷ（ｄ４；配列番号１６９）、ＰＶＴＦＮＳＧＫＬＣ（ｈ６；配列番号１７０）、ＩＧＴＦＮＧＱＫＬＣ（ｈ４；配列番号１７１）、ＱＶＴＦＮＧＧＫＬＦ（ｈ５；配列番号１７２）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＷ（ｈ３；配列番号１７３）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＡ（ｈ８；配列番号１７４）、ＰＧＴＦＮＲＧＫＬＱ（ｈ７；配列番号１７５）、ＰＧＴＦＮＤＧＫＬＧ（ｄ６；配列番号１７６）、ＰＳＴＦＮＣＭＫＬＰ（ｈ２；配列番号１７７）、ＰＳＴＦＮＣＰＫＬＱ（ｈ１１；配列番号１７８）、ＰＳＴＦＮＬＧＫＬＳ（ｄ１；配列番号１７９）、ＰＳＴＦＮＧＧＫＬＰ（ｄ７；配列番号１８０）、ＳＣＴＦＮＬＨＫＬＣ（ｈ１２；配列番号１８１）、ＱＤＴＦＮＲＴＫＬＣ（ｈ１０；配列番号１８２）、ＰＴＴＦＮＲＴＫＬＭ（ｄ３；配列番号１８３）、ＦＶＴＦＮＧＤＫＬＭ（ｘｘ４；配列番号１８４）、ＲＲＴＦＮＳＲＫＬＫ（ｘｘ２；配列番号１８５）、ＳＶＴＦＮＳＡＫＬＱ（ｅ２；配列番号１８６）、ＶＬＴＦＮＧＳＫＬＡ（ｅ１；配列番号１８７）、ＰＴＴＦＮＰＳＫＬＷ（ｘｘ３；配列番号１８８）、ＰＶＴＦＮＥＧＫＬＦ（ｅ３；配列番号１８９）、ＰＴＴＦＮＱＧＫＬＱ（ｅ５；配列番号１９０）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＧ（ｘｘ１；配列番号１９１）、ＰＬＴＦＮＮＧＫＬＳ（ｘｘ５；配列番号１９２）、ＲＳＴＦＮＧＤＫＬＮ（ｈｉ－Ｃ；配列番号１９３）、ＰＴＴＦＮＶＤＫＬＧ（ｈｉ－Ａ；配列番号１９４）、ＰＩＴＦＮＥＰＫＬＡ（ｈｉ－Ｂ；配列番号１９５）、またはＷＰＴＦＮＡＧＫＬＲ（ｈｉ－ｅ；配列番号１９６）を生じる置換を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質を提供する。
最近の、ｒＡＡＶ粒子を用いた遺伝子送達の成功にもかかわらず、入ってくるベクターを中和することができる既存の抗体が重大な難問になっている。この目的のため、発明者らは、中和抗ＡＡＶ（例えば、抗ＡＡＶ８、または抗ＡＡＶ９）カプシド抗体のパネルを作成した。発明者らは、この抗原マップまたはフットプリント内に１つまたは複数のアミノ酸置換を有するカプシドタンパク質を開発できるように、これらの抗体を使用してＡＡＶの抗原フットプリントをマッピングした。したがって、抗原フットプリントは、抗ＡＡＶ抗体と相互作用するＡＡＶカプシド上のアミノ酸残基の一覧である。これらの改変カプシドタンパク質を含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）粒子が有する中和抗体に対する反応性は減少し、したがって、中和抗体の存在下では形質導入効率が向上すると考えられる。例えば、低温電子顕微鏡（低温－ＥＭ）および画像再構成技法を使用して、発明者らは、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９、ＨＬ２３７２と反応するように慎重に選択した抗体についてのフットプリントを作成した。この抗体はＡＡＶカプシドの構造的に保存された５回領域に結合し、カプシド内部を外部に接続するチャネルを遮断する。一部の実施形態では、このチャネルは、感染中、ホスホリパーゼＡ２酵素および細胞核への輸送中に必要なエレメントの外在化ならびにビリオン形成中のゲノムパッケージングを含む、複数の機能を果たす。一部の実施形態では、中和機構はこれらのステップの１つの阻害を含む。
したがって、改変５回領域を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質およびｒＡＡＶ粒子が本明細書で提供される。一部の実施形態では、改変５回領域は、１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、改変５回領域を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質およびｒＡＡＶ粒子は、非改変５回領域のあるカプシドタンパク質および粒子と比べて、中和抗体に対する反応性が低減または減少している。改変５回領域を含むｒＡＡＶ粒子を作製する方法ならびに改変５回領域を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質およびｒＡＡＶ粒子を使用して目的の１つまたは複数の遺伝子を細胞、器官、組織、または対象に送達する方法も本明細書で提供される。
ＡＡＶ構造および５回領域
野生型ＡＡＶゲノムは一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）であり、ポジティブまたはネガティブセンスである。ゲノムは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）、ＤＮＡ鎖のそれぞれの末端に１つ、および２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ＩＴＲ間にｒｅｐおよびｃａｐを含む。ｒｅｐ ＯＲＦは、ＡＡＶ生活環に必要なＲｅｐタンパク質をコードする４つのオーバーラップ遺伝子：Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０を含む。ｃａｐ ＯＲＦはカプシドタンパク質：ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードするオーバーラップ遺伝子を含み、これらのカプシドタンパク質は互いに相互作用してウイルスカプシドを形成する。ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３は２つの選択的にスプライスされた転写物から翻訳される。カプシドは６０の個々のカプシドタンパク質サブユニットの超分子集合体を形成して、ＡＡＶゲノムを保護することができる無エンベロープのＴ－１正二十面体カプシドになる。集合したカプシドは、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３（分子質量はそれぞれおおよそ８７、７３、および６２ｋＤａ）で約１対１対１０の比で構成されている。
大半のＡＡＶ血清型では、ＶＰ１は７３５～７３８アミノ酸を有する。ＡＡＶ５ ＶＰ１は７２４アミノ酸を有する。大半の血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ８）では、カプシドタンパク質ＶＰ２はＶＰ１のアミノ酸１３８～７３５または１３８～７３８で構成されている。一部の血清型、例えば、ＡＡＶ５では、カプシドタンパク質ＶＰ２はＶＰ１のアミノ酸１３７～７２４で構成されている。大半の血清型では、カプシドタンパク質ＶＰ３はＶＰ１のアミノ酸２０３～７３５で構成されている。
ＡＡＶカプシド表面トポロジーはそれぞれのサブユニットのコアベータ鎖を接続するループから生じ、３回対称軸を取り囲む突起したスパイク、５回対称軸（本明細書では「５回領域」とも呼ばれる）近くのポアを取り囲む円筒形の突起、および２回対称軸近くのくぼみを含む顕著な特長を生み出す。異なるＡＡＶ血清型の介在ループの違いは独特なカプシド構造特長をもたらし、これらの特長は、血清型特異的受容体相互作用、免疫認識、細胞トロピズム、および形質導入効率に寄与する。３回対称軸、５回領域、および２回対称軸の画像は、Ｌｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．２０１０ Ｊｕｌ ２０；４０３（１）：２６－３６）、およびＧｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１３，８７（２０）：１１１８７－１１１９９）に示されている。前記文献のそれぞれは引用することにより本明細書の一部をなすものとし、および特に５回領域の描写のためにも本明細書の一部をなすものとする。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶの５回領域は、ＡＡＶ ＤＥ－ループ、ＡＡＶ ＨＩ－ループ、２／５回ウォール、および取り囲む表面残基を含む領域である。一部の実施形態では、ＤＥ－ループは、配列番号１８として特定されるＡＡＶ１の参照アミノ酸配列に基づいてアミノ酸３２３～３３５（ＶＰ１番号付け）を含む。一部の実施形態では、ＨＩ－ループは、配列番号１８として特定されるＡＡＶ１の参照アミノ酸配列に基づいてアミノ酸６５９～６６８（ＶＰ１番号付け）を含む。一部の実施形態では、２／５回ウォールは、配列番号１８として特定されるＡＡＶ１の参照アミノ酸配列に基づいてアミノ酸２５８～２７７、５４５～５５０、および７１６～７２０（ＶＰ１番号付け）を含む。一部の実施形態では、ＤＥ－ループは、配列番号１８として特定されるＡＡＶ１の参照アミノ酸配列に基づいてアミノ酸３２３～３３５（ＶＰ１番号付け）からなる。一部の実施形態では、ＨＩ－ループは、配列番号１８として特定されるＡＡＶ１の参照アミノ酸配列に基づいてアミノ酸６５９～６６８（ＶＰ１番号付け）からなる。一部の実施形態では、２／５回ウォールは、配列番号１８として特定されるＡＡＶ１の参照アミノ酸配列に基づいてアミノ酸２５８～２７７、５４５～５５０、および７１６～７２０（ＶＰ１番号付け）からなる。一部の実施形態では、５回領域は、配列番号１８として特定されるＡＡＶ１の参照アミノ酸配列に基づいてＤＥ－ループ、ＡＡＶ ＨＩ－ループ、および２／５回ウォールの外側のアミノ酸（例えば、２５０～２５７、３６５～３７５、または５５０～５５７、６５５～６５７；ＶＰ１番号付け）を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶの５回領域は、表４の第１列に収載されるアミノ酸残基を含む。
改変５回領域を含む組換えＡＡＶカプシドタンパク質
改変５回領域（a modified 5-fold region）を含むｒＡＡＶカプシドタンパク質が本明細書で提供される。改変は、例えば、置換、欠失、および／または挿入を含みうる。一部の実施形態では、改変５回領域は、１つまたは複数のアミノ酸置換（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多いアミノ酸置換）を含む。一部の実施形態では、改変５回領域は、天然の配列と比べてＤＥ－ループに１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、改変５回領域は、天然の配列と比べてＨＩ－ループに１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、改変５回領域は、天然の配列と比べて２／５回ウォールに１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、改変５回領域は、ＤＥ－ループおよびＨＩ－ループに１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、改変５回領域は、ＤＥ－ループおよび２／５回ウォールに１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、改変５回領域は、ＨＩ－ループおよび２／５回ウォールに１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、改変５回領域は、ＤＥ－ループ、ＨＩ－ループ、および２／５回ウォールに１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、天然のＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸６６１～６７０に対応するアミノ酸に以下のアミノ酸配列：ＶＧＴＦＮＥＡＫＬＨ（ｈ１；配列番号１６６）、ＶＳＴＦＮＰＡＫＬＭ（ｈ９；配列番号１６７）、ＰＬＴＦＮＣＣＫＬＮ（ｄ５；配列番号１６８）、ＰＶＴＦＮＱＤＫＬＷ（ｄ４；配列番号１６９）、ＰＶＴＦＮＳＧＫＬＣ（ｈ６；配列番号１７０）、ＩＧＴＦＮＧＱＫＬＣ（ｈ４；配列番号１７１）、ＱＶＴＦＮＧＧＫＬＦ（ｈ５；配列番号１７２）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＷ（ｈ３；配列番号１７３）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＡ（ｈ８；配列番号１７４）、ＰＧＴＦＮＲＧＫＬＱ（ｈ７；配列番号１７５）、ＰＧＴＦＮＤＧＫＬＧ（ｄ６；配列番号１７６）、ＰＳＴＦＮＣＭＫＬＰ（ｈ２；配列番号１７７）、ＰＳＴＦＮＣＰＫＬＱ（ｈ１１；配列番号１７８）、ＰＳＴＦＮＬＧＫＬＳ（ｄ１；配列番号１７９）、ＰＳＴＦＮＧＧＫＬＰ（ｄ７；配列番号１８０）、ＳＣＴＦＮＬＨＫＬＣ（ｈ１２；配列番号１８１）、ＱＤＴＦＮＲＴＫＬＣ（ｈ１０；配列番号１８２）、ＰＴＴＦＮＲＴＫＬＭ（ｄ３；配列番号１８３）、ＦＶＴＦＮＧＤＫＬＭ（ｘｘ４；配列番号１８４）、ＲＲＴＦＮＳＲＫＬＫ（ｘｘ２；配列番号１８５）、ＳＶＴＦＮＳＡＫＬＱ（ｅ２；配列番号１８６）、ＶＬＴＦＮＧＳＫＬＡ（ｅ１；配列番号１８７）、ＰＴＴＦＮＰＳＫＬＷ（ｘｘ３；配列番号１８８）、ＰＶＴＦＮＥＧＫＬＦ（ｅ３；配列番号１８９）、ＰＴＴＦＮＱＧＫＬＱ（ｅ５；配列番号１９０）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＧ（ｘｘ１；配列番号１９１）、ＰＬＴＦＮＮＧＫＬＳ（ｘｘ５；配列番号１９２）、ＲＳＴＦＮＧＤＫＬＮ（ｈｉ－Ｃ；配列番号１９３）、ＰＴＴＦＮＶＤＫＬＧ（ｈｉ－Ａ；配列番号１９４）、ＰＩＴＦＮＥＰＫＬＡ（ｈｉ－Ｂ；配列番号１９５）、またはＷＰＴＦＮＡＧＫＬＲ（ｈｉ－ｅ；配列番号１９６）の１つを生じる置換を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、天然のＡＡＶ８配列のＰ６６１、Ｔ６６２、Ｑ６６６、Ｓ６６７、およびＮ６７０に対応するアミノ酸の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つすべてにアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、天然のＡＡＶ８カプシドタンパク質配列に少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％類似するまたは同一である配列を含み、天然のＡＡＶ８配列のＰ６６１、Ｔ６６２、Ｑ６６６、Ｓ６６７、およびＮ６７０に対応するアミノ酸の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つすべてにアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、組換えＡＡＶカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸置換：Ｐ６６１Ｖ、Ｐ６６１Ｉ、Ｐ６６１Ｑ、Ｐ６６１Ｓ、Ｐ６６１Ｆ、Ｐ６６１Ｒ、Ｐ６６１Ｗ、Ｔ６６２Ｇ、Ｔ６６２Ｓ、Ｔ６６２Ｌ、Ｔ６６２Ｖ、Ｔ６６２Ｃ、Ｔ６６２Ｄ、Ｔ６６２Ｒ、Ｔ６６２Ｉ、Ｔ６６２Ｐ、Ｑ６６６Ｅ、Ｑ６６６Ｐ、Ｑ６６６Ｃ、Ｑ６６６Ｓ、Ｑ６６６Ｇ、Ｑ６６６Ｒ、Ｑ６６６Ｄ、Ｑ６６６Ｌ、Ｑ６６６Ｎ、Ｑ６６６Ｖ、Ｑ６６６Ａ、Ｓ６６７Ｐ、Ｓ６６７Ｑ、Ｓ６６７Ｇ、Ｓ６６７Ｒ、Ｓ６６７Ｄ、Ｓ６６７Ｃ、Ｓ６６７Ａ、Ｓ６６７Ｍ、Ｓ６６７Ｈ、Ｓ６６７Ｔ、Ｎ６７０Ｈ、Ｎ６７０Ｍ、Ｎ６７０Ｗ、Ｎ６７０Ｃ、Ｎ６７０Ｆ、Ｎ６７０Ａ、Ｎ６７０Ｑ、Ｎ６７０Ｇ、Ｎ６７０Ｐ、Ｎ６７０Ｓ、Ｎ６７０Ｋ、Ｎ６７０Ｗ、またはＮ６７０Ｒ（配列番号８として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づく番号付け）のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、組換えＡＡＶカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸置換：Ｐ６６１Ｒ、Ｐ６６２Ｓ、Ｐ６６６Ｇ、およびＰ６６７Ｄを含む。
一部の実施形態では、組換えＡＡＶカプシドタンパク質は、天然のＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸６５９～６６８に対応するアミノ酸に以下のアミノ酸配列：ＶＧＴＦＮＥＡＫＬＨ（ｈ１；配列番号１６６）、ＶＳＴＦＮＰＡＫＬＭ（ｈ９；配列番号１６７）、ＰＬＴＦＮＣＣＫＬＮ（ｄ５；配列番号１６８）、ＰＶＴＦＮＱＤＫＬＷ（ｄ４；配列番号１６９）、ＰＶＴＦＮＳＧＫＬＣ（ｈ６；配列番号１７０）、ＩＧＴＦＮＧＱＫＬＣ（ｈ４；配列番号１７１）、ＱＶＴＦＮＧＧＫＬＦ（ｈ５；配列番号１７２）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＷ（ｈ３；配列番号１７３）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＡ（ｈ８；配列番号１７４）、ＰＧＴＦＮＲＧＫＬＱ（ｈ７；配列番号１７５）、ＰＧＴＦＮＤＧＫＬＧ（ｄ６；配列番号１７６）、ＰＳＴＦＮＣＭＫＬＰ（ｈ２；配列番号１７７）、ＰＳＴＦＮＣＰＫＬＱ（ｈ１１；配列番号１７８）、ＰＳＴＦＮＬＧＫＬＳ（ｄ１；配列番号１７９）、ＰＳＴＦＮＧＧＫＬＰ（ｄ７；配列番号１８０）、ＳＣＴＦＮＬＨＫＬＣ（ｈ１２；配列番号１８１）、ＱＤＴＦＮＲＴＫＬＣ（ｈ１０；配列番号１８２）、ＰＴＴＦＮＲＴＫＬＭ（ｄ３；配列番号１８３）、ＦＶＴＦＮＧＤＫＬＭ（ｘｘ４；配列番号１８４）、ＲＲＴＦＮＳＲＫＬＫ（ｘｘ２；配列番号１８５）、ＳＶＴＦＮＳＡＫＬＱ（ｅ２；配列番号１８６）、ＶＬＴＦＮＧＳＫＬＡ（ｅ１；配列番号１８７）、ＰＴＴＦＮＰＳＫＬＷ（ｘｘ３；配列番号１８８）、ＰＶＴＦＮＥＧＫＬＦ（ｅ３；配列番号１８９）、ＰＴＴＦＮＱＧＫＬＱ（ｅ５；配列番号１９０）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＧ（ｘｘ１；配列番号１９１）、ＰＬＴＦＮＮＧＫＬＳ（ｘｘ５；配列番号１９２）、ＲＳＴＦＮＧＤＫＬＮ（ｈｉ－Ｃ；配列番号１９３）、ＰＴＴＦＮＶＤＫＬＧ（ｈｉ－Ａ；配列番号１９４）、ＰＩＴＦＮＥＰＫＬＡ（ｈｉ－Ｂ；配列番号１９５）、またはＷＰＴＦＮＡＧＫＬＲ（ｈｉ－ｅ；配列番号１９６）の１つを生じる置換を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、天然のＡＡＶ９配列のＰ６５９、Ｔ６６０、Ａ６６１、Ｋ６６４、およびＮ６６８に対応するアミノ酸の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つすべてにアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、天然のＡＡＶ９カプシドタンパク質配列に少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％または９９％類似するまたは同一である配列を含み、天然のＡＡＶ９配列のＰ６５９、Ｔ６６０、Ａ６６１、Ｋ６６４、およびＮ６６８に対応するアミノ酸の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つすべてにアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、組換えＡＡＶカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸置換：Ｐ６５９Ｒ、Ｔ６６０Ｓ、Ａ６６１Ｔ、および／またはＫ６６４Ｇの１つまたは複数を含む。一実施形態では、組換えＡＡＶカプシドタンパク質は、以下のアミノ酸置換：Ｐ６５９Ｒ、Ｔ６６０Ｓ、Ａ６６１Ｔ、およびＫ６６４Ｇを含む。
一部の実施形態では、改変５回領域は、抗原フットプリント内の位置のいずれかにおいて１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、抗原フットプリントは表５に収載される抗原フットプリントの１つである。例えば、改変５回領域における１つまたは複数のアミノ酸置換は、アミノ酸位（例えば、２５０～２５８、３２４～３３３、３７１、３７２、５４６～５５０、５５７、６５５～６７４、および７１６～７２１；２５０～２５８、３２３～３３２、３７０、３７１、５４５～５４８、５５６、６５５～６７３、および７１５～７２０；または２４０～２４８、３１４～３２３、３７２、３７３、５３２～５３５、５４６、６４４～６６２、および７０４～７０９）に関して、ＡＶＢについての抗原フットプリント内でもよい。一部の実施形態では、改変５回領域における１つまたは複数のアミノ酸置換は、アミノ酸位（例えば、２５１～２５５、２６４、３２５～３３４、および６５６～６７４）に関して、ＡＡＶ９に対するＣａｐｔｕｒｅ Ｓｅｌｅｃｔ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｌｉｇａｎｄ（ＣＳＡＬ９）についての抗原フットプリント内でもよい。一部の実施形態では、改変５回領域における１つまたは複数のアミノ酸置換は、アミノ酸位（例えば、２５２～２６６、３２６～３３５、６５８～６７６、および７２０；または２５１～２６６、３２５～３３４、６５７～６７３、および７１８）に関して、ＨＬ２３７２についての抗原フットプリント内でもよい。一部の実施形態では、改変５回領域における１つまたは複数のアミノ酸置換は、アミノ酸位（例えば、２１８、２４０～２５８、２６１、２６３、２６７、２７９、３３１、３５０、３５５～３６０、３６４、３６５、３７７、３７８、３９５、４２９～４３２、４３７、４５０、４５１、４５３～４５６、４５８、４５９、５３０～５４３、５４５～５４８、６３９、６４１、６４２、６４８～６５１、６５３～６５８、６６０～６６２、６９７～７００、７０４～７１２）に関して、ＡＤＫ５ａについての抗原フットプリント内でもよい。一部の実施形態では、改変５回領域における１つまたは複数のアミノ酸置換は、アミノ酸位（例えば、２４１～２４８、３１３～３１９、３２１、３２３、３５５、３５６、３５８～３６２、４４０～４４３、４４６～４４９、５３０～５４８、６４５～６５１、６５３～６６１、６９７、６９８、および７０４～７１２）に関して、ＡＤＫ５ｂについての抗原フットプリント内でもよい。
一部の実施形態では、改変５回領域は、表５に収載されるアミノ酸位のいずれか内の位置のいずれかにおいて１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、１つよりも多いアミノ酸置換が単一フットプリント内に存在する。一部の実施形態では、１つよりも多いアミノ酸置換が存在し、その１つよりも多いアミノ酸置換は異なる抗原フットプリント内にある。例えば、改変５回領域は、ＡＤＫ５ａについてのフットプリントに１つまたは複数のアミノ酸置換、およびＡＤＫ５ｂについてのフットプリントに１つまたは複数のアミノ酸置換を有していてもよい。一部の実施形態では、改変５回領域は、表５に示されるアミノ酸の範囲内に１つまたは複数のアミノ酸置換および／またはこれらの範囲の一方の側にまたは両側に最大１０アミノ酸（例えば、これらの範囲の一方の側にまたは両側に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸）までの１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、改変５回領域は、アミノ酸位３２８～３３３、６５８～６６３、６７１、７１９～７２１、およびこれらの範囲の一方の側にまたは両側に最大１０アミノ酸まで（例えば、これらの範囲の一方の側にまたは両側に１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０アミノ酸）を含む。
一部の実施形態では、改変５回領域は、表４の第１の列に収載される位置のいずれかにおいて１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、改変５回領域は、表４の他のＡＡＶ血清型および抗体により共有されている（すなわち、「ｘ」と印されている）として収載されている位置のいずれかにおいて１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、改変５回領域は、表４において特定の血清型に独特である（すなわち、「ｘ」と印されていない）として収載されている位置のいずれかにおいて１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、５回対称抗原領域またはエピトープ内の残基は、ＡＡＶカプシドの３回対称軸、または２／５回ウォール領域に結合する抗体に対する抗体エピトープとは重複しない。
一部の実施形態では、改変５回領域は、特定の中和抗体（例えば、ＡＶＢ、ＣＳＡＬ９、ＨＬ２３７２、ＡＤＫ５ａ、またはＡＤＫ５ｂ）に特異的であるフットプリント内に１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、中和抗体は、特定の血清型のＡＡＶ粒子またはカプシドに特異的であるまたはこれを特異的に認識する。例えば、ＨＬ２３７２はＡＡＶ８およびＡＡＶ９を認識する（図３参照）、ＡＤＫ５ａおよびＡＤＫ５ｂはＡＡＶ５を認識する、ＣＳＡＬ９はＡＡＶ９を認識する、ＡＶＢはＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８を認識する、など。特異的な認識は、抗体が特定の血清型のＡＡＶ粒子を他の血清型のＡＡＶ粒子よりも大きな程度に（例えば、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、２～５倍、５～１０倍、もしくは１０倍またはそれよりも多く）認識することを意味する。
アミノ酸置換
一部の実施形態では、改変５回領域でのアミノ酸置換は、荷電アミノ酸（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、またはＨ）の非荷電または極性アミノ酸（例えば、Ａ、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、またはＶ）での置換を含む。一部の実施形態では、改変５回領域でのアミノ酸置換は、非荷電または極性アミノ酸（例えば、Ａ、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、Ｖ）の荷電アミノ酸（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｋ、Ｒ、またはＨ）での置換を含む。
一部の実施形態では、改変５回領域でのアミノ酸置換は、負電荷アミノ酸（例えば、Ｄ、またはＥ）の正電荷アミノ酸（例えば、Ｋ、Ｒ、またはＨ）での置換を含む。一部の実施形態では、改変５回領域でのアミノ酸置換は、正電荷アミノ酸（例えば、Ｋ、Ｒ、またはＨ）の負電荷アミノ酸（例えば、Ｄ、またはＥ）での置換を含む。
一部の実施形態では、改変５回領域でのアミノ酸置換は、極性アミノ酸（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、またはＹ）の非極性アミノ酸（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｖ、またはＷ）での置換を含む。一部の実施形態では、改変５回領域でのアミノ酸置換は、非極性アミノ酸（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｖ、またはＷ）の極性アミノ酸（例えば、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｔ、またはＹ）での置換を含む。
一部の実施形態では、改変５回領域でのアミノ酸置換は、酸性アミノ酸（例えば、Ｄ、またはＥ）の塩基性アミノ酸（例えば、Ｈ、Ｋ、またはＲ）での置換を含む。一部の実施形態では、改変５回領域でのアミノ酸置換は、塩基性アミノ酸（例えば、Ｈ、Ｋ、またはＲ）の酸性アミノ酸（例えば、Ｄ、またはＥ）での置換を含む。
一部の実施形態では、アミノ酸置換は、等価な位置での別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質中のアミノ酸での置換を含む。例えば、ＡＡＶ９でのアミノ酸Ｅ７１８は、等価な位置でのＡＡＶ２におけるような、Ｎで置換することができる。
本開示は、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシドも提供する。本開示のＡＡＶカプシドを含むウイルスベクターならびに本開示のＡＡＶカプシドタンパク質、ＡＡＶカプシドおよび／またはウイルスベクターを薬学的に許容される担体中に含む組成物が本明細書でさらに提供される。
一部の実施形態では、本開示のウイルスベクターはその親ＡＡＶ血清型とは免疫学的に異なり、親血清型に結合する抗体（例えば、中和抗体）により認識されない。
本開示は、ＡＡＶカプシドに対する抗体の存在下で細胞中に核酸を導入する方法であって、細胞を本開示のウイルスベクターに接触させることを含む方法をさらに提供する。細胞は対象中に存在することが可能であり、一部の実施形態では、対象はヒト対象であることが可能である。
特定の実施形態では、本開示の改変ウイルスカプシドタンパク質は、１つのＡＡＶカプシドタンパク質由来のアミノ酸が別のＡＡＶカプシドタンパク質中に置換されるＡＡＶカプシドタンパク質に限定されず、置換されたおよび／または挿入されたアミノ酸はいかなる供給源由来でも可能であり、さらに自然に存在するまたは部分的にもしくは完全に合成でも可能である。
本明細書に記載される場合、いくつかのＡＡＶ由来の核酸およびカプシドタンパク質のアミノ酸配列は当技術分野では公知である。したがって、天然のＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸位に「対応する」アミノ酸は、他のいかなるＡＡＶについても容易に決定することができる（例えば、配列アライメントを使用することにより）。
本開示の改変カプシドタンパク質は、現在知られているまたは後に発見される任意のＡＡＶのカプシドタンパク質を改変することにより産生することが可能であると想定されている。さらに、改変されることになるＡＡＶカプシドタンパク質は自然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａもしくは３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶ１１カプシドタンパク質または表１に示されるＡＡＶのいずれか）が可能であるが、これらに限定されない。当業者であれば、ＡＡＶカプシドタンパク質への種々の操作は当技術分野では公知であるが、本開示は自然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質の改変に限定されないことを理解する。例えば、改変されることになるカプシドタンパク質は、自然に存在するＡＡＶ（例えば、自然に存在するＡＡＶカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２または現在知られているもしくは後に発見される他の任意のＡＡＶ由来である）と比べた場合、すでに変更があってもよい。そのようなＡＡＶカプシドタンパク質も本開示の範囲内である。
したがって、特定の実施形態では、改変されることになるＡＡＶカプシドタンパク質は、自然に存在するＡＡＶに由来するが、カプシドタンパク質中に挿入されるおよび／もしくは置換されるならびに／または１つもしくは複数のアミノ酸の欠失によりすでに変更されている１つまたは複数の外来配列（例えば、天然のウイルスに対して外因性である）をさらに含むことができる。
したがって、特定のＡＡＶカプシドタンパク質（例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、もしくはＡＡＶ１１カプシドタンパク質または表１に示されるＡＡＶのいずれか由来のカプシドタンパク質、など）に本明細書で言及する場合、天然のカプシドタンパク質ならびに本開示の改変以外の変更を有するカプシドタンパク質を包含することが意図されている。そのような変更は、置換、挿入および／または欠失を含む。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、天然のＡＡＶカプシドタンパク質配列と比べた場合、（本開示の挿入以外）そこに挿入された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満、または７０未満のアミノ酸を含む。本開示の実施形態では、カプシドタンパク質は、天然のＡＡＶカプシドタンパク質配列と比べた場合、（本開示に従ったアミノ酸置換以外）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満、または７０未満のアミノ酸置換を含む。実施形態では、カプシドタンパク質は、天然のＡＡＶカプシドタンパク質配列と比べた場合、（本開示のアミノ酸欠失以外）１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０、２０未満、３０未満、４０未満、５０未満、６０未満、または７０未満のアミノ酸の欠失を含む。
したがって、例えば、用語「ＡＡＶ２カプシドタンパク質」は、天然のＡＡＶ２カプシドタンパク質配列（ジェンバンク受託番号ＡＡＣ０３７８０参照）を有するＡＡＶカプシドタンパク質ならびに天然のＡＡＶ２カプシドタンパク質配列において置換、挿入および／または欠失（前の段落に記載されているように）を含むＡＡＶカプシドタンパク質を含む。
特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は天然のＡＡＶカプシドタンパク質配列を有するまたは天然のＡＡＶカプシドタンパク質配列に少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％類似するもしくは同一であるアミノ酸配列を有する。例えば、特定の実施形態では、「ＡＡＶ２」カプシドタンパク質は天然のＡＡＶ２カプシドタンパク質配列ならびに天然のＡＡＶ２カプシドタンパク質配列に少なくとも約９０％、９５％、９７％、９８％または９９％類似するまたは同一である配列を包含する。
２つまたはそれよりも多いアミノ酸配列間の配列類似性または同一性を決定する方法は当技術分野では公知である。配列類似性または同一性は、これに限定されないが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２，４８２（１９８１）のローカル配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズムによる、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５，２４４４（１９８８）の類似性検索法による、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実施（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）による、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２，３８７－３９５（１９８４）により記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、または精査による、を含む、当技術分野で公知の標準技法を使用して決定しうる。
別の適切なアルゴリズムはＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３－４１０，（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０，５８７３－５７８７（１９９３）に記載されている。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６，４６０－４８０（１９９６）；ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから得られた。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２はいくつかの検索パラメータを使用し、パラメータは任意選択でデフォルト値に設定される。パラメータは動的値であり、特定の配列の組成、および目的の配列の検索を行う特定のデータベースの組成に応じてプログラムそれ自体により確立されるが、値は感度を増やすように調整しうる。
さらに、追加の有用なアルゴリズムはＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５，３３８９－３４０２により報告されているギャップドＢＬＡＳＴである。
本開示の改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含む、本質的にからなる、またはからなるウイルスカプシドも提供される。特定の実施形態では、ウイルスカプシドはパルボウイルスカプシドであり、これはさらに自律性パルボウイルスカプシドまたはディペンドウイルスカプシドでもよい。任意選択で、ウイルスカプシドはＡＡＶカプシドである。特定の実施形態では、ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ウシＡＡＶカプシド、トリＡＡＶカプシドまたは現在知られているまたは後に特定される他の任意のＡＡＶである。ＡＡＶ血清型の非限定的一覧は表１に示されており、本開示のＡＡＶカプシドは、表１に収載されているまたは１つもしくは複数の挿入、置換および／もしくは欠失による前述のもののいずれかに由来する任意のＡＡＶ血清型が可能である。
改変ウイルスカプシドは、例えば、米国特許第５，８６３，５４１号に記載されてきたように、「カプシド媒体（ｃａｐｓｉｄ ｖｅｈｉｃｌｅｓ）」として使用できる。改変ウイルスカプシドがパッケージし細胞内に移入することができる分子は、異種ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、小有機分子、金属、または前記同一物の組合せを含む。
異種分子は、ＡＡＶ感染において自然には見出されない分子、例えば、野生型ＡＡＶゲノムによりコードされない分子と定義される。さらに、治療的に有用な分子は、宿主標的細胞中への分子の移入のためにキメラウイルスカプシドの外側に会合することができる。そのような会合した分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小有機分子、金属、炭水化物、脂質および／またはポリペプチドを含むことができる。本開示の一実施形態では、治療的に有用な分子はカプシドタンパク質に共有結合している（すなわち、コンジュゲートしているまたは化学的に連結している）。分子を共有結合させる方法は当業者には公知である。
本開示の改変ウイルスカプシドは、新規のカプシド構造物に対する抗体を産生するのにも用途がある。さらなる代案として、外因性アミノ酸配列を、細胞への抗原提示のために、例えば、外因性アミノ酸配列に対して免疫応答を生じるように対象に投与するために、改変ウイルスカプシド中に挿入してもよい。
他の実施形態では、ウイルスカプシドを投与すれば、目的のポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする核酸を送達するウイルスベクターの投与に先立っておよび／または同時に（例えば、互いから数分または数時間内に）ある特定の細胞部位を遮断することができる。例えば、本発明のカプシドを送達すれば肝臓細胞上の細胞受容体を遮断することができ、送達ベクターはその後にまたは同時に投与することができ、これにより肝臓細胞の形質導入を減らし、他の標的（例えば、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋）の形質導入を増強しうる。
代表的な実施形態によれば、改変ウイルスカプシドは、本開示に従って改変ウイルスベクターに先立っておよび／または同時に対象に投与することができる。さらに、開示は、本発明の改変ウイルスカプシドを含む組成物および医薬製剤を提供し、任意選択で、組成物は本開示の改変ウイルスベクターも含む。
本開示の改変ウイルスカプシドおよびカプシドタンパク質をコードする核酸（任意選択で、単離された核酸）も提供される。核酸を含むベクター、ならびに本開示の核酸および／またはベクターを含む細胞（インビボでまたは培養で）がさらに提供される。一例として、本開示は、（ａ）本開示の改変ＡＡＶカプシド、および（ｂ）少なくとも１つの末端反復配列を含む核酸、を含むウイルスベクターを提供し、核酸はＡＡＶカプシドによりカプシド形成される。
他の適切なベクターは、限定せずに、ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、ワクシニア、ポックスウイルス、バキュロウイルス、および同類のもの）、プラスミド、ファージ、ＹＡＣ、ＢＡＣ、および同類のものを含む。そのような核酸、ベクターおよび細胞は、例えば、本明細書に記載される改変ウイルスカプシドまたはウイルスベクターの産生のための試薬（例えば、ヘルパーパッキング構築物またはパッキング細胞）として使用することができる。
本開示に従ったウイルスカプシドは、当技術分野で公知のいかなる方法を使用しても、例えば、バキュロウイルスからの発現によって（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９８：４７７－４８８）産生することができる。
本開示に従ったＡＡＶカプシドタンパク質への改変は「選択的」改変である。このアプローチは、ＡＡＶ血清型間の全サブユニットまたは大きなドメインの交換を用いた以前の研究（例えば、国際特許公開第００／２８００４号およびＨａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：２７６８－２７７４参照）とは対照的である。特定の実施形態では、「選択的」改変により、約２０、１８、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４または３連続アミノ酸未満の挿入および／または置換および／または欠失が生じる。
本開示の改変カプシドタンパク質およびカプシドは、現在知られているまたは後に特定される他の任意の改変をさらに含むことができる。
例えば、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質およびウイルスカプシドは、別のウイルス、任意選択で、例えば、国際特許公開第００／２８００４号に記載されている別のパルボウイルスまたはＡＡＶ由来のカプシドサブユニットのすべてまたは一部を含むことができる点でキメラであることが可能である。
一部の実施形態では、ウイルスカプシドは標的化ウイルスカプシドが可能であり、ウイルスカプシドを、所望の標的組織（複数可）上に存在する細胞表面分子と相互作用するように向けるターゲティング配列（例えば、ウイルスカプシドにおいて置換されているまたは挿入されている）を含む（例えば、国際特許公開第００／２８００４号およびＨａｕｃｋ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７７：２７６８－２７７４）；Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １７：３５３－３６１（２００６）［ＡＡＶカプシドサブユニットの位置５２０および／または５８４でのインテグリン受容体結合モチーフＲＧＤの挿入を説明している］；および米国特許第７，３１４，９１２号［ＡＡＶ２カプシドサブユニットのアミノ酸位４４７、５３４、５７３および５８７に続くＲＧＤモチーフを含有するＰ１ペプチドの挿入を説明している］参照）。挿入を許容するＡＡＶカプシドサブユニット内の他の位置は当技術分野では公知である（例えば、Ｇｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：９６４－９７５（２００１）により記載される位置４４９および５８８）。
例えば、本開示のウイルスカプシドは目的のある特定の標的組織（例えば、肝臓、骨格筋、心臓、横隔膜筋、腎臓、脳、胃、腸、皮膚、内皮細胞、および／または肺）に対して比較的非効率的なトロピズムを有することがある。ターゲティング配列は、これらの低形質導入ベクターに都合よく組み込まれそれによってウイルスカプシドに所望のトロピズムおよび、任意選択で、特定の組織（複数可）に対する選択的トロピズムを与えることができる。ターゲティング配列を含むＡＡＶカプシドタンパク質、カプシドおよびベクターは、例えば、国際特許公開第００／２８００４号に記載されている。別の例として、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５－４９（２００６）により記載されている１つまたは複数の自然に存在しないアミノ酸を、低形質導入ベクターを所望の標的組織（複数可）に向け直す手段として、本開示のＡＡＶカプシドサブユニットの直交性部位に組み込むことができる。これらの非自然アミノ酸は、限定せずに、グリカン（マンノース、これは樹状細胞ターゲティングをもたらす）；特定のがん細胞型への標的化送達のためのＲＧＤ、ボンベシンまたは神経ペプチド；成長因子受容体、インテグリン、および同類のものなどの特定の細胞表面受容体を標的としたファージディスプレイから選択されたＲＮＡアプタマーまたはペプチドを含む、目的の分子をＡＡＶカプシドタンパク質に化学的に連結するために都合よく使用することができる。アミノ酸を化学的に改変する方法は当技術分野では公知である（例えば、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１ｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９６参照）。
一部の実施形態では、ターゲティング配列は、感染を特定の細胞型（複数可）に向けるウイルスカプシド配列（例えば、自律性パルボウイルスカプシド配列、ＡＡＶカプシド配列、または他の任意のウイルスカプシド配列）でもよい。
別の非限定的例として、ヘパリン結合ドメイン（例えば、呼吸器多核体ウイルスヘパリン結合ドメイン）は、典型的にＨＳ受容体に結合しないカプシドサブユニット（例えば、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５）中に挿入するまたは置換して、得られた突然変異体にヘパリン結合を与えてもよい。
Ｂ１９は、グロボシドをその受容体として使用して一次赤血球前駆細胞に感染する（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２：１１４）。Ｂ１９の構造は８Å解像度まで決定されている（Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０３：１０６）。Ｂ１９カプシドのうちグロボシドに結合する領域は、アミノ酸３９９～４０６の間（Ｃｈａｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９４：４１９）、βバレル構造物ＥとＦの間のループアウト領域（Ｃｈｉｐｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：７５０２）にマッピングされている。したがって、Ｂ１９カプシドのグロボシド受容体結合ドメインを、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質中に置換して、前記同一ドメインを含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターを、赤血球細胞を標的として向けてもよい。
一部の実施形態では、外因性ターゲティング配列は、改変ＡＡＶカプシドタンパク質を含むウイルスカプシドまたはウイルスベクターのトロピズムを変更するペプチドをコードするいかなるアミノ酸配列でもよい。特定の実施形態では、ターゲティングペプチドまたはタンパク質は、自然に存在しているまたは代わりに、完全にもしくは部分的に合成でもよい。例示的なターゲティング配列は、ＲＧＤペプチド配列、ブラジキニン、ホルモン、ペプチド成長因子（例えば、上皮成長因子、神経成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ、等）、サイトカイン、メラニン細胞刺激ホルモン（例えば、α、βまたはγ）、神経ペプチドおよびエンドルフィン、および同類のものなどの、細胞表面受容体および糖タンパク質に結合するリガンドおよび他のペプチド、ならびにその同族受容体を標的として細胞を向ける能力を保持するそれらの断片を含む。他の説明的なペプチドおよびタンパク質は、サブスタンスＰ、ケラチノサイト成長因子、神経ペプチドＹ、ガストリン放出ペプチド、インターロイキン２、ニワトリ卵白リゾチーム、エリスロポエチン、ゴナドリベリン、コルチコスタチン（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔａｔｉｎ）、βエンドルフィン、ロイシンエンケファリン、リモルフィン、αネオエンケファリン、アンジオテンシン、ニューマディン（ｐｎｅｕｍａｄｉｎ）、血管作用性小腸ペプチド、ニューロテンシン、モチリン、および上記のその断片を含む。その上さらなる代替物として、毒素（例えば、破傷風毒素またはαブンガロトキシンなどの蛇毒および同類のもの）由来の結合ドメインをターゲティング配列としてカプシドタンパク質中に置換することができる。さらなる代表的実施形態では、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｃｌｅｖｅｓ（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ７：Ｒ３１８（１９９７））により記載される「非古典的」輸入／輸出シグナルペプチド（例えば、線維芽細胞成長因子－１および－２、インターロイキン１、ＨＩＶ－１ Ｔａｔタンパク質、ヘルペスウイルスＶＰ２２タンパク質、および同類のもの）のＡＡＶカプシドタンパク質中への置換により改変することができる。特定の細胞による取込みを指示するペプチドモチーフも包含される、例えば、ＦＶＦＬＰ（配列番号３１）ペプチドモチーフは肝臓細胞による取込みの引き金を引く。
ファージディスプレイ技法、ならびに当技術分野で公知の他の技法を使用して、目的の任意の細胞型を認識するペプチドを同定してもよい。
ターゲティング配列は、受容体を含む細胞表面結合部位（例えば、タンパク質、炭水化物、糖タンパク質またはプロテオグリカン）を標的にする任意のペプチドをコードしてもよい。細胞表面結合部位の例は、これらに限定されないが、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、および他のグリコサミノグリカン、ムチン、糖タンパク質、およびガングリオシド上に見られるシアル酸部分、ＭＨＣ Ｉ糖タンパク質、マンノースを含む膜糖タンパク質上に見られる炭水化物成分、Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎ－アセチルグルコサミン、フコース、ガラクトース、ならびに同類のものを含む。
特定の実施形態では、ヘパラン硫酸（ＨＳ）またはヘパリン結合ドメインはウイルスカプシド（例えば、他の方法ではＨＳにもヘパリンにも結合しないＡＡＶカプシドに）中に置換される。ＨＳ／ヘパリン結合が、アルギニンおよび／またはリジンに豊富にある「塩基性パッチ」により媒介されることは当技術分野では公知である。例示的な実施形態では、モチーフＢＸＸＢ（配列番号３２）、「Ｂ」は塩基性残基でありＸは中性および／または疎水性である、に続く配列を用いることができる。非限定的例として、ＢＸＸＢはＲＧＮＲ（配列番号３３）が可能である。別の非限定的例として、ＢＸＸＢは、天然のＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸位２６２から２６５までの代わりに、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における対応する位置（複数可）で置き換わる。
適切なターゲティング配列の他の非限定的例は、Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２１：１０４０－１０４６（２００３）により同定された冠動脈内皮細胞を標的にするペプチド（コンセンサス配列ＮＳＶＲＤＬ（Ｇ／Ｓ）（配列番号３４）、ＰＲＳＶＴＶＰ（配列番号３５）、ＮＳＶＳＳＸ（Ｓ／Ａ）（配列番号３６）；Ｇｒｉｆｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：９６４－９７５（２００１）により記載されている腫瘍ターゲティングペプチド（例えば、ＮＧＲ、ＮＧＲＡＨＡ（配列番号３７））；Ｗｏｒｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：６８３－６９３（２００６）により記載されている肺または脳ターゲティング配列（ＱＰＥＨＳＳＴ［配列番号３８］、ＶＮＴＡＮＳＴ［配列番号３９］、ＨＧＰＭＱＫＳ［配列番号４０］、ＰＨＫＰＰＬＡ［配列番号４１］、ＩＫＮＮＥＭＷ［配列番号４２］、ＲＮＬＤＴＰＭ［配列番号４３］、ＶＤＳＨＲＱＳ［配列番号４４］、ＹＤＳＫＴＫＴ［配列番号４５］、ＳＱＬＰＨＱＫ［配列番号４６］、ＳＴＭＱＱＮＴ［配列番号４７］、ＴＥＲＹＭＴＱ［配列番号４８］、ＱＰＥＨＳＳＴ［配列番号４９］、ＤＡＳＬＳＴＳ［配列番号５０］、ＤＬＰＮＫＫＴ［配列番号５１］、ＤＬＴＡＡＲＬ［配列番号５２］、ＥＰＨＱＦＮＹ［配列番号５３］、ＥＰＱＳＮＨＴ［配列番号５４］、ＭＳＳＷＰＳＱ［配列番号５５］、ＮＰＫＨＮＡＴ［配列番号５６］、ＰＤＧＭＲＴＴ［配列番号５７］、ＰＮＮＮＫＴＴ［配列番号５８］、ＱＳＴＴＨＤＳ［配列番号５９］、ＴＧＳＫＱＫＱ［配列番号６０］、ＳＬＫＨＱＡＬ［配列番号６１］、およびＳＰＩＤＧＥＱ［配列番号６２］）；Ｈａｊｉｔｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＴＣＭ １６：８０－８８（２００６）により記載される血管ターゲティング配列（ＷＩＦＰＷＩＱＬ［配列番号６３］、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ［配列番号６４］、ＣＮＧＲＣ［配列番号６５］、ＣＰＲＥＣＥＳ［配列番号６６］、ＧＳＬ，ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ［配列番号６７］、ＣＧＲＲＡＧＧＳＣ［配列番号６８］、ＣＫＧＧＲＡＫＤＣ［配列番号６９］、およびＣＶＰＥＬＧＨＥＣ［配列番号７０］）；Ｋｏｉｖｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４０：８８３－８８８（１９９９）により記載されるターゲティングペプチド（ＣＲＲＥＴＡＷＡＫ［配列番号７１］、ＫＧＤ，ＶＳＷＦＳＨＲＹＳＰＦＡＶＳ［配列番号７２］、ＧＹＲＤＧＹＡＧＰＩＬＹＮ［配列番号７３］、ＸＸＸＹ＊ＸＸＸ［配列番号７４；Ｙ＊はホスホチロシン］、Ｙ＊Ｅ／ＭＮＷ［配列番号７５］、ＲＰＬＰＰＬＰ［配列番号７６］、ＡＰＰＬＰＰＲ［配列番号７７］、ＤＶＦＹＰＹＰＹＡＳＧＳ［配列番号７８］、ＭＹＷＹＰＹ［配列番号７９］、ＤＩＴＷＤＱＬＷＤＬＭＫ［配列番号８０］、ＣＷＤＤ（Ｇ／Ｌ）ＷＬＣ［配列番号８１］、ＥＷＣＥＹＬＧＧＹＬＲＣＹＡ［配列番号８２］、ＹＸＣＸＸＧＰＸＴＷＸＣＸＰ［配列番号８３］、ＩＥＧＰＴＬＲＱＷＬＡＡＲＡ［配列番号８４］、ＬＷＸＸ（Ｙ／Ｗ／Ｆ／Ｈ）［配列番号８５］、ＸＦＸＸＹＬＷ［配列番号８６］、ＳＳＩＩＳＨＦＲＷＧＬＣＤ［配列番号８７］、ＭＳＲＰＡＣＰＰＮＤＫＹＥ［配列番号８８］、ＣＬＲＳＧＲＧＣ［配列番号８９］、ＣＨＷＭＦＳＰＷＣ［配列番号９０］、ＷＸＸＦ［配列番号９１］、ＣＳＳＲＬＤＡＣ［配列番号９２］、ＣＬＰＶＡＳＣ［配列番号９３］、ＣＧＦＥＣＶＲＱＣＰＥＲＣ［配列番号９４］、ＣＶＡＬＣＲＥＡＣＧＥＧＣ［配列番号９５］、ＳＷＣＥＰＧＷＣＲ［配列番号９６］、ＹＳＧＫＷＧＷ［配列番号９７］、ＧＬＳＧＧＲＳ［配列番号９８］、ＬＭＬＰＲＡＤ［配列番号９９］、ＣＳＣＦＲＤＶＣＣ［配列番号１００］、ＣＲＤＶＶＳＶＩＣ［配列番号１０１］、ＣＮＧＲＣ［配列番号１０２］、およびＧＳＬ））；ならびにＮｅｗｔｏｎ＆Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｐｈａｇｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｄｉｓｐｌａｙ ｉｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ １４５－１６３，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（２００８）により記載される腫瘍ターゲティングペプチド（ＭＡＲＳＧＬ［配列番号１０３］、ＭＡＲＡＫＥ［配列番号１０４］、ＭＳＲＴＭＳ［配列番号１０５］、ＫＣＣＹＳＬ［配列番号１０６］、ＷＲＲ，ＷＫＲ，ＷＶＲ，ＷＶＫ，ＷＩＫ，ＷＴＲ，ＷＶＬ，ＷＬＬ，ＷＲＴ，ＷＲＧ，ＷＶＳ，ＷＶＡ，ＭＹＷＧＤＳＨＷＬＱＹＷＹＥ［配列番号１０７］、ＭＱＬＰＬＡＴ［配列番号１０８］、ＥＷＬＳ［配列番号１０９］、ＳＮＥＷ［配列番号１１０］、ＴＮＹＬ［配列番号１１１］、ＷＩＦＰＷＩＱＬ［配列番号１１２］、ＷＤＬＡＷＭＦＲＬＰＶＧ［配列番号１１３］、ＣＴＶＡＬＰＧＧＹＶＲＶＣ［配列番号１１４］、ＣＶＰＥＬＧＨＥＣ［配列番号１１５］、ＣＧＲＲＡＧＧＳＣ［配列番号１１６］、ＣＶＡＹＣＩＥＨＨＣＷＴＣ［配列番号１１７］、ＣＶＦＡＨＮＹＤＹＬＶＣ［配列番号１１８］、ＣＶＦＴＳＮＹＡＦＣ［配列番号１１９］、ＶＨＳＰＮＫＫ［配列番号１２０］、ＣＤＣＲＧＤＣＦＣ［配列番号１２１］、ＣＲＧＤＧＷＣ［配列番号１２２］、ＸＲＧＣＤＸ［配列番号１２３］、ＰＸＸ（Ｓ／Ｔ）［配列番号１２４］、ＣＴＴＨＷＧＦＴＬＣ［配列番号１２５］、ＳＧＫＧＰＲＱＩＴＡＬ［配列番号１２６］、Ａ（Ａ／Ｑ）（Ｎ／Ａ）（Ｌ／Ｙ）（Ｔ／Ｖ／Ｍ／Ｒ）（Ｒ／Ｋ）［配列番号１２７］、ＶＹＭＳＰＦ［配列番号１２８］、ＭＱＬＰＬＡＴ［配列番号１２９］、ＡＴＷＬＰＰＲ［配列番号１３０］、ＨＴＭＹＹＨＨＹＱＨＨＬ［配列番号１３１］、ＳＥＶＧＣＲＡＧＰＬＱＷＬＣＥＫＹＦＧ［配列番号１３２］、ＣＧＬＬＰＶＧＲＰＤＲＮＶＷＲＷＬＣ［配列番号１３３］、ＣＫＧＱＣＤＲＦＫＧＬＰＷＥＣ［配列番号１３４］、ＳＧＲＳＡ［配列番号１３５］、ＷＧＦＰ［配列番号１３６］、ＬＷＸＸＡｒ［Ａｒ＝Ｙ，Ｗ，Ｆ，Ｈ］［配列番号８５］、ＸＦＸＸＹＬＷ［配列番号１３７］、ＡＥＰＭＰＨＳＬＮＦＳＱＹＬＷＹＴ［配列番号１３８］、ＷＡＹ（Ｗ／Ｆ）ＳＰ［配列番号１３９］、ＩＥＬＬＱＡＲ［配列番号１４０］、ＤＩＴＷＤＱＬＷＤＬＭＫ［配列番号１４１］、ＡＹＴＫＣＳＲＱＷＲＴＣＭＴＴＨ［配列番号１４２］、ＰＱＮＳＫＩＰＧＰＴＦＬＤＰＨ［配列番号１４３］、ＳＭＥＰＡＬＰＤＷＷＷＫＭＦＫ［配列番号１４４］、ＡＮＴＰＣＧＰＹＴＨＤＣＰＶＫＲ［配列番号１４５］、ＴＡＣＨＱＨＶＲＭＶＲＰ［配列番号１４６］、ＶＰＷＭＥＰＡＹＱＲＦＬ［配列番号１４７］、ＤＰＲＡＴＰＧＳ［配列番号１４８］、ＦＲＰＮＲＡＱＤＹＮＴＮ［配列番号１４９］、ＣＴＫＮＳＹＬＭＣ［配列番号１５０］、Ｃ（Ｒ／Ｑ）Ｌ／ＲＴ（Ｇ／Ｎ）ＸＸＧ（Ａ／Ｖ）ＧＣ［配列番号１５１］、ＣＰＩＥＤＲＰＭＣ［配列番号１５２］、ＨＥＷＳＹＬＡＰＹＰＷＦ［配列番号１５３］、ＭＣＰＫＨＰＬＧＣ［配列番号１５４］、ＲＭＷＰＳＳＴＶＮＬＳＡＧＲＲ［配列番号１５５］、ＳＡＫＴＡＶＳＱＲＶＷＬＰＳＨＲＧＧＥＰ［配列番号１５６］、ＫＳＲＥＨＶＮＮＳＡＣＰＳＫＲＩＴＡＡＬ［配列番号１５７］、ＥＧＦＲ［配列番号１５８］、ＲＶＳ，ＡＧＳ，ＡＧＬＧＶＲ［配列番号１５９］、ＧＧＲ，ＧＧＬ，ＧＳＶ，ＧＶＳ，ＧＴＲＱＧＨＴＭＲＬＧＶＳＤＧ［配列番号１６０］、ＩＡＧＬＡＴＰＧＷＳＨＷＬＡＬ［配列番号１６１］、ＳＭＳＩＡＲＬ［配列番号１６２］、ＨＴＦＥＰＧＶ［配列番号１６３］、ＮＴＳＬＫＲＩＳＮＫＲＩＲＲＫ［配列番号１６４］、ＬＲＩＫＲＫＲＲＫＲＫＫＴＲＫ［配列番号１６５］、ＧＧＧ，ＧＦＳ，ＬＷＳ，ＥＧＧ，ＬＬＶ，ＬＳＰ，ＬＢＳ，ＡＧＧ，ＧＲＲ，ＧＧＨおよびＧＴＶ）を含む。
その上さらなる実施形態として、ターゲティング配列は、細胞中への進入を標的にする別の分子への化学的結合のために使用することができる（例えば、そのＲ基を通じて化学的に結合することができるアルギニンおよび／またはリジン残基を含むことができる）ペプチドでもよい。
別の実施形態として、本開示のＡＡＶカプシドタンパク質またはウイルスカプシドは、ＷＯ２００６／０６６０６６に記載される突然変異を含むことができる。例えば、カプシドタンパク質は、天然のＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸位２６３、７０５、７０８および／または７１６に選択的アミノ酸置換または別のＡＡＶ血清型由来のカプシドタンパク質における対応する変化（複数可）を含むことができる。
さらに、またはあるいは、代表的な実施形態では、カプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸位２６４に直接続いて選択的アミノ酸挿入または他のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質における対応する変化を含む。「アミノ酸位Ｘに直接続いて」により、挿入が指示されたアミノ酸位に直ちに続く（例えば、「アミノ酸位２６４に続く」は、２６５位での点挿入またはもっと大きな挿入、例えば、２６５位から２６８位まで、等、を示している）ことが意図されている。
さらに、代表的な実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、国際出願ＰＣＴ第２０１０／０９３７８４号（例えば、２ｉ８）におよび／または国際出願ＰＣＴ第２０１４／１４４２２９号（例えば、デュアルグリカン）に記載されるもののようなアミノ酸改変を含むことができる。
一部の実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターが由来するもとのＡＡＶ血清型の形質導入効率と比べて等価なまたは増強された形質導入効率を有することができる。一部の実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターが由来するもとのＡＡＶ血清型の形質導入効率と比べて減少した形質導入効率を有することができる。一部の実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターが由来するもとのＡＡＶ血清型のトロピズムと比べて等価なまたは増強されたトロピズムを有することができる。一部の実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターが由来するもとのＡＡＶ血清型のトロピズムと比べて変更されたまたは異なるトロピズムを有することができる。
一部の実施形態では、本開示のカプシドタンパク質、ウイルスカプシドまたはベクターは、脳組織に対してトロピズムを有するまたは有するように操作することができる。
前述の実施形態を使用すれば、本明細書に記載される細胞または対象に異種核酸を送達することができる。例えば、改変ベクターを使用すれば、本明細書に記載されるムコ多糖症障害（例えば、スライ症候群［βグルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハーラーシャイエ症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリッポ症候群Ａ［ヘパランスルファミダーゼ］、Ｂ［Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチル－ＣｏＡ：α－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ－アセチルグルコサミン ６－スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース－６－スルフェートスルファターゼ］、Ｂ［β－ガラクトシダーゼ］、マロトーラミー症候群［Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ］、等）、ファブリー病（α－ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、または糖原貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸α－グルコシダーゼ）などのリソソーム貯蔵障害を処置することができる。
当業者であれば、一部のＡＡＶカプシドタンパク質では、対応する改変は、対応するアミノ酸位がウイルスに部分的にもしくは完全に存在するまたは、あるいはまったく存在しないかどうかに応じて、挿入および／または置換になることを認識している。同様に、ＡＡＶ２以外のＡＡＶを改変する場合、特定のアミノ酸位（複数可）はＡＡＶ２での位置と異なっていてもよい（例えば、表６参照）。本明細書の別のところで考察するように、対応するアミノ酸位（複数可）は周知の技法を使用すれば当業者には容易に明らかになる。
いくつかの他のＡＡＶにおける対応する位置の非限定的例は表６（位置２）に示されている。特定の実施形態では、アミノ酸挿入または置換は、スレオニン、アスパラギン酸、グルタミン酸またはフェニルアラニンである（この位置にそれぞれスレオニン、グルタミン酸またはフェニルアラニンを有するＡＡＶは除く）。
他の代表的な実施形態では、本開示の改変カプシドタンパク質またはウイルスカプシドは、ＷＯ２００７／０８９６３２に記載される１つまたは複数の突然変異をさらに含む（例えば、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸位５３１または別のＡＡＶ由来のカプシドタンパク質の対応する位置でのＥ→Ｋ突然変異）。
さらなる実施形態では、改変カプシドタンパク質またはカプシドは、ＷＯ２００９／１０８２７４に記載される突然変異を含むことができる。
もう１つの可能性として、ＡＡＶカプシドタンパク質は、Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３８１：１９４－２０２（２００８）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５：７８２７－３２（２００８））により記載される突然変異を含むことができる。例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質は、アミノ酸位７３０にＹ→Ｆ突然変異を含むことができる。
上記の改変は、互いにおよび／または現在知られているもしくは後に発見される他の任意の改変と組み合わせて、本開示のカプシドタンパク質またはカプシド中に組み込むことができる。
本開示は、本開示の改変カプシドタンパク質およびカプシドを含むウイルスベクターも包含する。特定の実施形態では、ウイルスベクターはパルボウイルスベクター（例えば、パルボウイルスカプシドおよび／またはベクターゲノムを含む）、例えば、ＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶカプシドおよび／またはベクターゲノムを含む）である。代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、本開示の改変カプシドサブユニットを含む改変ＡＡＶカプシドおよびベクターゲノムを含む。
例えば、代表的な実施形態では、ウイルスベクターは（ａ）本開示の改変カプシドタンパク質を含む改変ウイルスカプシド（例えば、改変ＡＡＶカプシド）、および（ｂ）末端反復配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ）を含む核酸を含み、末端反復配列を含む核酸は改変ウイルスカプシドによりカプシド形成される。核酸は、任意選択で、２つの末端反復（例えば、２つのＡＡＶ ＴＲ）を含むことができる。
代表的な実施形態では、ウイルスベクターは、目的のポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする異種核酸を含む組換えウイルスベクターである。組換えウイルスベクターは下でさらに詳細に説明される。
特定の実施形態では、本開示のウイルスベクターは（ｉ）改変カプシドタンパク質のないウイルスベクターによる形質導入のレベルと比べた場合、肝臓の形質導入が減少している、（ｉｉ）改変カプシドタンパク質のないウイルスベクターにより観察されるレベルと比べた場合、動物対象におけるウイルスベクターによる増強された全身形質導入を示す、（ｉｉｉ）改変カプシドタンパク質のないウイルスベクターによる運動のレベルと比べた場合、内皮細胞を横断する増強された運動を示す、ならびに／または（ｉｖ）筋肉組織（例えば、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋）の形質導入において選択的な増強、および／もしくは（ｖ）改変カプシドタンパク質のないウイルスベクターによる形質導入のレベルと比べた場合、脳組織（例えば、ニューロン）の減少した形質導入を示す。特定の実施形態では、ウイルスベクターは筋肉に向かう全身形質導入を有する、例えば、身体全体の複数の骨格筋群を形質導入する、ならびに任意選択で、心筋および／または横隔膜筋を形質導入する。
本明細書に開示される組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスベクター、すなわち、粒子は、ウイルスカプシドおよび核酸ベクターを含んでいてよく、この核酸ベクターはウイルスカプシドによりカプシド化される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは、空のカプシドでもよく、いかなるトランス遺伝子も含まない（例えば、ウイルス様粒子、ＶＬＰ）。本明細書で言及される場合、カプシドはＡＡＶの外側タンパク膜である。カプシドは空でもまたは核酸ベクターを含んでいてもよい。一部の実施形態では、ｒＡＡＶは自己相補的でもよい（ｓｃＡＡＶ）。一部の実施形態では、ｒＡＡＶはキメラ（例えば、異なる血清型のアミノ酸を含むカプシドタンパク質または異なる血清型の塩基対を含むｒｅｐ遺伝子を含有する）でもよい。一部の実施形態では、ｒＡＡＶはシュードタイプ化（例えば、１つの血清型のカプシドタンパク質および別の血清型のｒｅｐ遺伝子を含む）である。
組換えＡＡＶ粒子は、核酸ベクターを含んでもよく、このベクターは、最低限でも、（ａ）目的のタンパク質もしくはポリペプチドまたは目的のＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ）をコードする配列を含む１つまたは複数の異種核酸領域、および（ｂ）１つまたは複数の核酸領域（例えば、異種核酸領域）に隣接している逆位末端反復（ＩＴＲ）配列（例えば、野生型ＩＴＲ配列または操作されたＩＴＲ配列）を含む１つまたは複数の領域を含みうる。本明細書では、目的のタンパク質または目的のＲＮＡをコードする配列を含む異種核酸領域は目的の遺伝子と呼ばれる。
一部の実施形態では、目的の遺伝子は検出可能な分子をコードする。一部の実施形態では、検出可能な分子は、蛍光タンパク質、生物発光タンパク質、または色を出すタンパク質（例えば、β－ガラクトシダーゼ、β－ラクタマーゼ、β－グルクロニダーゼ、またはスフェリオデノン（ｓｐｈｅｒｉｏｄｅｎｏｎｅ））である。一部の実施形態では、検出可能な分子は、蛍光、生物発光、または酵素タンパク質またはその機能的ペプチドもしくは機能的ポリペプチドである。一部の実施形態では、目的の遺伝子は治療タンパク質または治療ＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、治療遺伝子は、抗体、ペプチボディー（ｐｅｐｔｉｂｏｄｙ）、成長因子、凝固因子、ホルモン、膜タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、細胞表面受容体もしくはイオンチャネルに作用する活性化もしくは阻害ペプチド、細胞内プロセスを標的にする細胞浸透性ペプチド、血栓溶解剤、酵素、骨形成タンパク質、遺伝子編集のために使用されるヌクレアーゼもしくは他のタンパク質、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝血剤、ヌクレアーゼ、ガイドＲＮＡ、または遺伝子編集のための他の核酸もしくはタンパク質をコードする。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶに含まれる核酸ベクターはサイズが４ｋｂ～５．２ｋｂ（例えば、サイズが４．２～５．２ｋｂ）である。本明細書に記載されるいかなる核酸ベクターでも、ＡＡＶ８もしくはＡＡＶ９カプシドまたは他の任意の血清型などのウイルスカプシドによりカプシド化してもよく、ウイルスカプシドは本明細書に記載されるキメラカプシドタンパク質を含んでいてもよい。一部の実施形態では、核酸ベクターは環状である。一部の実施形態では、核酸ベクターは一本鎖である。一部の実施形態では、核酸ベクターは二本鎖である。一部の実施形態では、二本鎖核酸ベクターは、例えば、核酸ベクターの別の領域に相補的である核酸ベクターの領域を含有し、核酸ベクターの二本鎖の形成を開始する自己相補的ベクターでもよい。
上記の通り、一部の実施形態では、核酸ベクターは、（１）目的のＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含む１つまたは複数の異種核酸領域、（２）異種核酸領域の発現を促進する配列（例えば、プロモーター）を含む１つまたは複数の核酸領域、および（３）対象のゲノム中への異種核酸領域（任意選択で、発現を促進する配列を含む１つまたは複数の核酸領域と一緒に）の組込みを促進する配列を含む１つまたは複数の核酸領域を含む。一部の実施形態では、組込みを促進するウイルス配列は、逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。一部の実施形態では、核酸ベクターは、制御エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結された目的のＲＮＡ、タンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含む１つまたは複数の異種核酸領域を含み、１つまたは複数の異種核酸領域はＩＴＲ配列とそれぞれの側で隣接している。そのような核酸ベクターは本明細書では、目的の１つまたは複数の遺伝子を含有するＡＡＶ－ＩＴＲとも呼ばれる。ＩＴＲ配列は、任意のＡＡＶ血清型（例えば、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３）に由来することができるまたは１つよりも多い血清型に由来することができる。
ＩＴＲ配列およびＩＴＲ配列を含有するプラスミドは当技術分野では公知であり、市販されている（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ；Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ；およびＡｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡから入手可能な製品およびサービス；ならびに“Ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ａ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ”Ｋｅｓｓｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１９９６ Ｎｏｖ ２６；９３（２４）：１４０８２－７；およびＭａｃｈｉｄａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ． Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．１０．１３８５／１－５９２５９－３０４－６：２０１（Ｃ）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．２００３．Ｃｈａｐｔｅｒ １０．“Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ”Ｗｅｉｔｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．米国特許第５，１３９，９４１号および米国特許第５，９６２，３１３号参照）。前記文献はすべて引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
ｒＡＡＶ粒子のカプシドは、カプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３を含みうる。一部の実施形態では、カプシドは２つのカプシドタンパク質だけを含む。
一部の実施形態では、核酸ベクターは、核酸（例えば、異種核酸）の発現を促進する配列、例えば、核酸に作動可能に連結された発現制御配列を含む１つまたは複数の領域を含む。数多くのそのような配列が当技術分野では公知である。発現制御配列の非限定的例は、プロモーター、インシュレーター、サイレンサー、応答エレメント、イントロン、エンハンサー、開始部位、終結シグナル、およびポリ（Ａ）テイルを含む。そのような制御配列の任意の組合せ（例えば、プロモーターとエンハンサー）が本明細書では想定されている。
目的のタンパク質またはポリペプチドの適切な発現レベルを達成するために、選択された宿主細胞において使用するのに適したいくつかのプロモーターのいずれでも用いてよい。プロモーターは、例えば、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、または合成プロモーターでもよい。例えば、異なる強度の構成的プロモーターを使用することができる。本明細書に記載される核酸ベクターは、ウイルスプロモーターまたは一般に転写を促進するのが活性である哺乳動物遺伝子由来のプロモーターなどの１つまたは複数の構成的プロモーターを含みうる。構成的ウイルスプロモーターの非限定的例は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、Ａｄ Ｅ１Ａおよびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含む。構成的哺乳動物プロモーターの非限定的例は、β－アクチンプロモーター（例えば、ニワトリβ－アクチンプロモーター）およびヒト伸長因子－１α（ＥＦ－１α）プロモーターにより例証される、種々のハウスキーピング遺伝子プロモーターを含む。
誘導性プロモーターおよび／または調節エレメントを、目的のタンパク質またはポリペプチドの適切な発現レベルを達成するために想定してもよい。適切な誘導性プロモーターの非限定的例は、チトクロムＰ４５０遺伝子、熱ショックタンパク質遺伝子、メタロチオネイン遺伝子、およびエストロゲン遺伝子プロモーターなどのホルモン誘導性遺伝子などの遺伝子由来の誘導性プロモーターを含む。誘導性プロモーターの別の例は、テトラサイクリンに応答性であるｔｅｔＶＰ１６プロモーターである。
組織特異的プロモーターおよび／または調節エレメントも本明細書で想定されている。使用しうるそのようなプロモーターの非限定的例は、気道上皮細胞特異的プロモーターを含む。
合成プロモーターも本明細書では想定されている。合成プロモーターは、例えば、既知のプロモーターの領域、調節エレメント、転写因子結合部位、エンハンサーエレメント、リプレッサーエレメント、および同類のものを含んでいてよい。
組換えＡＡＶ粒子は、任意の誘導体またはシュードタイプ（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、２／１、２／５、２／８、２／９、３／１、３／５、３／８、または３／９）を含む、任意のＡＡＶ血清型のものでよい。シュードタイプ化とは、１つの血清型のカプシドおよび別の血清型のゲノムの使用、または異なるウイルス血清型由来のカプシドおよびゲノムの混合のことである。これらの血清型はスラッシュを使用して表示されるので、ＡＡＶ２／５は、血清型５由来のカプシドにパッケージされた血清型２のゲノムを含有するウイルスを示している。
本明細書で使用される場合、ｒＡＡＶ粒子の血清型とは、組換えウイルスのカプシドタンパク質の血清型のことである。誘導体およびシュードタイプの非限定的例は、ｒＡＡＶ２／１、ｒＡＡＶ２／５、ｒＡＡＶ２／８、ｒＡＡＶ２／９、ＡＡＶ２－ＡＡＶ３ハイブリッド、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｈｕ．１４、ＡＡＶ３ａ／３ｂ、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶ－ＨＳＣ１５、ＡＡＶ－ＨＳＣ１７、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４３、ＣＨｔ－Ｐ６、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ－ＨＳＣ１５／１７、ＡＡＶＭ４１、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ６（Ｙ４４５Ｆ／Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ－ＨＡＥ１／２、ＡＡＶクローン３２／８３、ＡＡＶＳｈＨ１０、ＡＡＶ２（Ｙ－＞Ｆ）、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）、ＡＡＶ２．１５、ＡＡＶ２．４、ＡＡＶｒ３．４５、および表１に収載される誘導体およびシュードタイプを含む。
ＡＡＶ血清型１、２、３、３Ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、および１３の配列についてのジェンバンク照会番号は特許公開第２０１２０６４９６０号に収載されており、前記特許文献は、ジェンバンク照会番号を組み込む目的でならびに他の任意の目的のために引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
野生型ＶＰ１カプシドタンパク質配列の非限定的例は、配列番号１～３０として本明細書に提供される。ＤＥループ残基の例は、下線を施したアミノ酸として示されている。ＨＩループ残基の例は、大文字のイタリック体で示されている。２／５回ウォール残基の例は太字で示されている。
本開示の改変カプシドタンパク質、ウイルスカプシドおよびウイルスベクターは、その天然状態において指定された位置に指定されたアミノ酸を有する（すなわち、突然変異体ではない）カプシドタンパク質、カプシドおよびウイルスベクターを排除することは当業者であれば理解する。
ウイルスベクターを作製する方法
一実施形態では、本開示はウイルスベクターを作製する方法であって、（ａ）少なくとも１つのＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＴＲ配列）を含む核酸鋳型、および（ｂ）核酸鋳型の複製およびＡＡＶカプシド中へのカプシド化に十分なＡＡＶ配列（例えば、ＡＡＶｒｅｐ配列および本開示のＡＡＶカプシドをコードするＡＡＶｃａｐ配列）を細胞に提供することを含む方法を提供する。任意選択で、核酸鋳型は、少なくとも１つの異種核酸配列をさらに含む。特定の実施形態では、核酸鋳型は２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列を含み、これらの配列は異種核酸配列（存在する場合）の５’側および３’側に位置しているが、それに直接隣接する必要はない。
核酸鋳型ならびにＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ配列は、ＡＡＶカプシド内にパッケージされた核酸鋳型を含むウイルスベクターが細胞中で産生されるような条件下で提供される。方法は、細胞からウイルスベクターを収集するステップをさらに含むことができる。ウイルスベクターは、培地からおよび／または細胞を溶解することにより収集することができる。
細胞は、ＡＡＶウイルス複製に対して許容的である細胞が可能である。当技術分野で公知のどの適切な細胞を用いてもよい。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠落している機能を提供するトランス補完パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス補完細胞が可能である。
ＡＡＶ複製およびカプシド配列は当技術分野で公知のいかなる方法でも提供しうる。現在のプロトコールは典型的には、単一プラスミド上のＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を発現する。ＡＡＶ複製およびパッケージング配列は一緒に提供する必要はないが、一緒に提供するのが都合のよい場合もある。ＡＡＶｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、いかなるウイルスまたは非ウイルスベクターにより提供してもよい。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターにより提供してもよい（例えば、欠失アデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域中に挿入される）。ＥＢＶベクターも、ＡＡＶｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現するために用いてよい。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターはエピソームであるが、連続する細胞分裂の間ずっと高コピー数を維持することである（すなわち、「ＥＢＶベースの核エピソーム」と呼ばれる染色体外エレメントとして細胞中に安定的に組み込まれる、Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７参照）。
さらなる代案として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞中に安定的に組み込まれうる。
典型的には、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列には、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを妨げるために、ＴＲが隣接していない。
核酸鋳型は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して細胞に提供することができる。例えば、鋳型は非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターにより供給することができる。特定の実施形態では、核酸鋳型はヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターにより供給される（例えば、欠失アデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域中に挿入される）。別の説明として、Ｐａｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５０２５は、ＡＡＶ ＴＲが隣接するレポーター遺伝子を担持するバキュロウイルスベクターを記載している。ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上に記載されるように、ＥＢＶベクターも鋳型を送達するために用いうる。
別の代表的実施形態では、核酸鋳型は、複製しているｒＡＡＶウイルスにより提供される。さらに他の実施形態では、核酸鋳型を含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体に安定的に組み込まれている。
ウイルス力価を増強するために、増殖性ＡＡＶ感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）を細胞に提供することができる。ＡＡＶ複製に必要なヘルパーウイルス配列は当技術分野では公知である。典型的には、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターにより提供される。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５、ならびに、米国特許第６，０４０，１８３号および米国特許第６，０９３，５７０号により記載されるように、例えば、効率的なＡＡＶ産生を促進するヘルパー遺伝子のすべてを担持する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして、別の非ウイルスまたはウイルスベクターにより提供することができる。
さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体に包埋されているまたは安定した染色体外エレメントとして維持されているヘルパー配列を有するパッケージング細胞により提供しうる。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン中にパッケージできない、例えば、ＴＲが隣接していない。
当業者であれば、単一のヘルパー構築物上にＡＡＶ複製およびカプシド配列ならびにヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を提供すれば都合がよくなる場合があることを認識する。このヘルパー構築物は、非ウイルスまたはウイルス構築物でもよい。１つの非限定的例として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスが可能である。
一つの特定の実施形態では、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより供給される。このベクターは核酸鋳型をさらに含むことがさらに可能である。ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはｒＡＡＶ鋳型は、アデノウイルスの欠失領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）中に挿入することができる。
さらなる実施形態では、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより供給される。この実施形態に従えば、ｒＡＡＶ鋳型はプラスミド鋳型として提供することができる。
別の説明的実施形態では、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターにより提供され、ｒＡＡＶ鋳型はプロウイルスとして細胞中に組み込まれる。あるいは、ｒＡＡＶ鋳型は、染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶベースの核エピソームとして）細胞内に維持されるＥＢＶベクターにより提供される。
さらなる例示的な実施形態では、ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーにより提供される。ｒＡＡＶ鋳型は分離した複製ウイルスベクターとして提供することができる。例えば、ｒＡＡＶ鋳型は、ｒＡＡＶ粒子または第２の組換えアデノウイルス粒子により提供することができる。
前述の方法に従えば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは典型的には、アデノウイルス複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス５’および３’シス配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。ＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列および、存在する場合には、ｒＡＡＶ鋳型は、これらの配列がアデノウイルスカプシド中にパッケージされるように、アデノウイルス骨格に包埋されており、５’および３’シス配列が隣接している。上記のように、アデノウイルスヘルパー配列およびＡＡＶｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列がＡＡＶビリオン中にパッケージされないように、一般にはＴＲが隣接していない。
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４－１２）は、アデノウイルスとＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方を含むキメラヘルパーを記載している。
ヘルペスウイルスは、ＡＡＶパッケージング法においてヘルパーウイルスとしても使用されうる。ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（複数可）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、スケーラブルなＡＡＶベクター作製計画を有利に促進しうる。ＡＡＶ－２ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッド単純ヘルペスウイルスＩ型（ＨＳＶ－１）ベクターは記載されている（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９８６およびＷＯ００／１７３７７）。
さらなる代案として、本明細書に記載されるウイルスベクターは、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５－４３により記載されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびｒＡＡＶ鋳型を送達するバキュロウイルスベクターを使用して昆虫細胞において産生することができる。
夾雑するヘルパーウイルスのないＡＡＶベクターストックは、当技術分野で公知のいかなる方法により入手してもよい。例えば、ＡＡＶおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別されうる。ＡＡＶは、ヘパリン基質に対する親和性に基づいてヘルパーウイルスから分離してもよい（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９７３）。欠失複製欠損ヘルパーウイルスは、いかなる夾雑するヘルパーウイルスも複製能がないように使用することができる。さらなる代案として、ＡＡＶウイルスのパッケージングを媒介するのに必要なのはアデノウイルス初期遺伝子発現だけなので、後期遺伝子発現を欠くアデノウイルスヘルパーを用いてもよい。後期遺伝子発現を欠くアデノウイルス突然変異体は当技術分野では公知である（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス突然変異体）。
ｒＡＡＶを産生するまたはパッケージする方法は当技術分野では公知であり、試薬は市販されている（例えば、Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｒｏｔｙｐｅ １，２，ａｎｄ ５ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２８（２００２）１５８－１６７；ならびに米国特許出願公開第２００７００１５２３８号および米国特許出願公開第２０１２０３２２８６１号参照。これら前記文献は引用することにより本明細書の一部をなすものとし、プラスミドおよびキットはＡＴＣＣおよびＣｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から入手可能である）。例えば、目的の遺伝子を含むプラスミドは、例えば、ｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする）およびｃａｐ遺伝子（本明細書に記載される改変ＶＰ２領域を含む、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３をコードする）を含有し、ｒＡＡＶをパッケージし続いて精製することができるように組換え細胞中にトランスフェクトされる１つまたは複数のヘルパープラスミドと組み合わせてもよい。
一部の実施形態では、パッケージングは、哺乳動物細胞または昆虫細胞などのヘルパー細胞または産生細胞において実施される。例示的な哺乳動物細胞は、これらに限定されないが、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、またはＣＨＯ細胞を含む（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６５１（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１６５０（商標）、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１０（商標）、またはＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－６１（商標）参照）を含む。例示的な昆虫細胞は、これに限定されないが、Ｓｆ９細胞（例えば、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１７１１（商標）参照）を含む。ヘルパー細胞は、本明細書に記載される方法で使用するためのＲｅｐタンパク質および／またはＣａｐタンパク質をコードするｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子を含んでいてもよい。一部の実施形態では、パッケージングはインビトロで実施される。
一部の実施形態では、目的の遺伝子を含むプラスミドは、例えば、最初の血清型のｒｅｐ遺伝子および同じ血清型または異なる血清型のｃａｐ遺伝子を含有し、ｒＡＡＶがパッケージされるようにヘルパー細胞中にトランスフェクトされる１つまたは複数のヘルパープラスミドと組み合わされる。
一部の実施形態では、１つまたは複数のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子とｃａｐ遺伝子を含む第１のヘルパープラスミド、ならびに以下のヘルパー遺伝子：Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、およびＶＡ遺伝子の１つまたは複数を含む第２のヘルパープラスミドを含む。明確にするため、ヘルパー遺伝子は、ヘルパータンパク質Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ４、Ｅ２ａ、およびＶＡをコードする遺伝子である。一部の実施形態では、ｃａｐ遺伝子は、タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の１つまたは複数が発現されないように改変される。一部の実施形態では、ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ２が発現されないように改変される。そのような改変をするための方法は、当技術分野では公知である（Ｌｕｘ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７９：１１７７６－８７）。
ヘルパープラスミド、およびそのようなプラスミドを作製する方法は当技術分野では公知であり、市販されている（例えば、ｐＤＦ６、ｐＲｅｐ、ｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰ１ｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）、およびＰｌａｓｍｉｄＦａｃｔｏｒｙ、Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ、Ｇｅｒｍａｎｙ社製のｐＤＰ８．ａｐｅプラスミド；Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ；Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、Ｃａ；およびＡｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡから入手可能な他の製品およびサービス；ｐｘｘ６；Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｎｏｖｅｌ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ａｄｅｎｏ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．９，２７４５－２７６０；Ｋｅｒｎ，Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｈｅｐａｒｉｎ－Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｍｏｔｉｆ ｏｎ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２ Ｃａｐｓｉｄｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７７，１１０７２－１１０８１；Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｈｅｌｐｅｒ Ｖｉｒｕｓ－Ｆｒｅｅ，Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ Ｃｏｎｔｒｏｌｌａｂｌｅ，ａｎｄ Ｔｗｏ－Ｐｌａｓｍｉｄ－Ｂａｓｅｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｏｆ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ １ ｔｏ ６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．７，８３９－８５０；Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（２００５），Ａ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ Ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｔｈｅ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｔｙｐｅ ２ Ｃａｐｓｉｄ Ｌｅａｄｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｆ Ｈｉｄｄｅｎ ＶＰ１ Ｎ Ｔｅｒｍｉｎｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７９，５２９６－５３０３；およびＭｏｕｌｌｉｅｒ，Ｐ．ａｎｄ Ｓｎｙｄｅｒ，Ｒ．Ｏ．（２００８），Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｅｆｆｏｒｔｓ ｆｏｒ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｓｔａｎｄａｒｄｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ．１６，１１８５－１１８８参照）。特定の血清型についての野生型ＡＡＶコード領域をコードするプラスミドも公知であり入手可能である。例えば、ｐＳｕｂ２０１は、野生型ＡＡＶ２ゲノムのコード領域を含むプラスミドである（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８７），Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６：３０９６－３１０１）。
ＡＡＶ誘導体／シュードタイプ、およびそのような誘導体／シュードタイプを作製する方法は当技術分野では公知である（例えば、Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ａｐｒ；２０（４）：６９９－７０８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔ．２０１１．２８７．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｊａｎ ２４．“Ｔｈｅ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ ｔｏｏｌｋｉｔ：ｐｏｉｓｅｄ ａｔ ｔｈｅ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ”参照）。シュードタイプ化したｒＡＡＶベクターを作製し使用するための方法は当技術分野では公知である（例えば、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：７６６２－７６７１，２００１；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：１５２４－１５３２，２０００；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８：１５８－１６７，２００２；およびＡｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．，１０：３０７５－３０８１，２００１参照）。
例示的、非限定的ｒＡＡＶ産生法が次に記載される。１つまたは複数のヘルパープラスミドが産生されるまたは入手され、このプラスミドは、その天然のプロモーターの転写制御の下で、所望のＡＡＶ血清型のためのｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦ、ならびにアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のヘルパープラスミドは、その天然のプロモーターの転写制御の下で、ｒｅｐ遺伝子、ｃａｐ遺伝子、および任意選択で、アデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子の１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数のヘルパープラスミドは、その天然のプロモーターの転写制御の下で、所望のＡＡＶ血清型のためのｃａｐ ＯＲＦ（および任意選択で、ｒｅｐ ＯＲＦ）、ならびにアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子を含む。ｃａｐ ＯＲＦも、本明細書に記載される改変カプシドタンパク質を産生するために１つまたは複数の改変を含んでもよい。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）から入手可能）は、ヘルパープラスミド（複数可）および本明細書に記載される核酸ベクターを含有するプラスミドを用いて、ＣａＰＯ４媒介トランスフェクション、脂質またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの重合体分子を経てトランスフェクトされる。次に、ＨＥＫ２９３細胞は少なくとも６０時間インキュベートして、ｒＡＡＶ産生を可能にする。あるいは、ＨＥＫ２９３細胞は、目的の１つまたは複数の遺伝子を含有するＡＡＶ－ＩＴＲ、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする遺伝子を含むヘルパープラスミドを用いて上記の方法を経てトランスフェクトされ、ヘルパーウイルスを共感染される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶの複製を可能にするウイルスである。ヘルパーウイルスの例はアデノウイルスおよびヘルペスウイルスである。
あるいは、別の例では、Ｓｆ９ベースの産生安定細胞株は、核酸ベクターを含有する単一組換えバキュロウイルスを感染させる。さらなる代案として、別の例では、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞株は、核酸ベクターを含有するＨＳＶ、ならびに任意選択で、その天然のプロモーターの転写制御の下で、本明細書に記載されるｒｅｐおよびｃａｐ ＯＲＦならびにアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子を含有する１つまたは複数のヘルパーＨＳＶを感染させる。次に、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、またはＳｆ９細胞は少なくとも６０時間インキュベートさせて、ｒＡＡＶ産生を可能にする。次に、ｒＡＡＶは当技術分野で公知のまたは本明細書に記載されるいずれかの方法を使用して、例えば、イオジキサノールステップ勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィー、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈澱により精製することができる。
本開示のカプシドタンパク質をコードする核酸が本明細書で提供される。一部の実施形態では、カプシドタンパク質をコードする核酸は、核酸ベクター、例えば、プラスミドに存在する。これらの核酸ベクターを使用して、上記のヘルパー細胞または産生細胞をトランスフェクトし、ｒＡＡＶ粒子を産生してもよい。
組換えウイルスベクター
本開示のウイルスベクターは、インビトロ、エクスビボ、およびインビボでの核酸の細胞への送達に有用である。特に、ウイルスベクターは、哺乳動物を含む動物の細胞に核酸を送達するまたは移入するために都合よく用いることができる。
目的のいかなる異種核酸配列（複数可）も、本開示のウイルスベクターで送達してよい。目的の核酸は、治療（例えば、医学的または獣医的利用のため）または免疫原性（例えば、ワクチンのため）ポリペプチドを含む、ポリペプチドをコードする核酸を含む。
治療ポリペプチドは、これらに限定されないが、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ミニ－およびミクロ－ジストロフィンを含む、例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０；米国特許出願公開第２００３／０１７１３１号；国際公開第／２００８／０８８８９５号、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３７１４－１３７１９（２０００）；およびＧｒｅｇｏｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：６５７－６４（２００８）参照）、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、ａｐｏＡ（ａｐｏＡ１、ａｐｏＡ２、ａｐｏＡ４、ａｐｏＡ－Ｖ）、ａｐｏＢ（ａｐｏＢ１００、ＡｐｏＢ４８）、ａｐｏＣ（ａｐｏＣＩ、ａｐｏＣＩＩ、ａｐｏＣＩＩＩ、ａｐｏＣＩＶ）、ａｐｏＤ、ａｐｏＥ、ａｐｏＨ、ａｐｏＬ、ａｐｏ（ａ）などのアポリポタンパク質、ＩカッパＢ優性突然変異体などの抗炎症性ポリペプチド、サルコスパン（ｓａｒｃｏｓｐａｎ）、ユートロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ ３８４：３４９）、ミニユートロフィン、凝固因子（例えば、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、等）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、プログラヌリン、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α１－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、バテニン、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、フラタキシン、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、アルファシヌクレイン、パーキン、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシン、および同類のもの）、ペプチド成長因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様成長因子１および２、血小板由来成長因子、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子、神経栄養因子－３および－４、脳由来神経栄養因子、骨形成タンパク質［ＲＡＮＫＬおよびＶＥＧＦを含む］、グリア由来成長因子、トランスフォーミング成長因子－αおよび－β、ならびに同類のもの）、ハンチンチン、リソソーム酸α－グルコシダーゼ、イズロン酸－２－スルファターゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、α－ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死成長因子α可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、ユビキチンタンパク質リガーゼＥ３、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、カルシウムハンドリングを調節する分子（例えば、ＳＥＲＣＡ２Ａ、ＰＰ１の阻害因子１およびその断片［例えば、ＷＯ２００６／０２９３１９およびＷＯ２００７／１００４６５］）、切り詰められた構成的に活性なｂＡＲＫｃｔなどのＧタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子、ＩＲＡＰなどの抗炎症性因子、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、モノクローナル抗体（一本鎖モノクローナル抗体を含む；例示的なＭａｂはＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）Ｍａｂである）、神経ペプチドおよびその断片（例えば、ガラニン、神経ペプチドＹ（米国特許第７，０７１，１７２号参照）、バソヒビン（Ｖａｓｏｈｉｂｉｎｓ）および他のＶＥＧＦ阻害因子などの血管新生抑制剤（例えば、バソヒビン２［ＷＯ ＪＰ２００６／０７３０５２参照］）を含む。他の説明的な異種核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、および腫瘍壊死因子）、がん治療に使用される薬物に対する抵抗性を与えるタンパク質、腫瘍抑制遺伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳリガンド、およびそれを必要とする対象において治療効果のある他の任意のポリペプチドをコードする。ＡＡＶベクターを使用すれば、モノクローナル抗体および抗体断片、例えば、ミオスタチンに向けられる抗体または抗体断片も送達することができる（例えば、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：５８４－５９０（２００５）参照）。
ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、レポーターポリペプチド（例えば、酵素）をコードする異種核酸配列を含む。レポーターポリペプチドは当技術分野では公知であり、これらに限定されないが、緑色蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。
任意選択で、異種核酸は分泌ポリペプチドをコードする（例えば、その天然状態で分泌ポリペプチドであるまたは、例えば、当技術分野で公知の分泌シグナル配列に、作動可能に付随させることにより分泌されるように操作されているポリペプチド）。
あるいは、特定の実施形態では、異種核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載されているように）、スプライソソーム媒介トランススプライシングをもたらすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号参照）、遺伝子サイレンシングを媒介するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１参照）、および「ガイド」ＲＮＡなどの他の非翻訳ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９；Ｙｕａｎ ｅｔ ａｌ．への米国特許第５，８６９，２４８号）、および同類のものをコードしてもよい。例示的な非翻訳ＲＮＡは、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を処置するおよび／もしくは予防するためならびに／または化学療法による損傷を予防するための心臓への投与のため）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのため）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を処置するおよび／または予防するため）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、循環器疾患を処置するため；例えば、Ａｎｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１３２－１４２（２００８）およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．２６：５１－５５（２００５）参照）、ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン阻害性またはドミナントネガティブ分子（例えば、循環器疾患を処置するため、例えば、Ｈｏｓｈｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８６４－８７１（２００２）参照）、アデノシンキナーゼへのＲＮＡｉ（例えば、癲癇のため）、および病原性生物およびウイルス（例えば、Ｂ型肝炎および／またはＣ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、等）に向けられるＲＮＡｉを含む。
さらに、選択的スプライシングを指示する核酸配列を送達することができる。実例を示すと、ジストロフィンエクソン５１の５’および／または３’スプライス部位に相補的なアンチセンス配列（または他の阻害配列）は、Ｕ１またはＵ７低分子核内（ｓｎ）ＲＮＡプロモーターと併せて送達すれば、このエクソンのスキッピングを誘導することができる。例えば、アンチセンス／阻害配列（複数可）の５’側に位置するＵ１またはＵ７ ｓｎＲＮＡプロモーターを含むＤＮＡ配列を、本開示の改変カプシドにパッケージして送達することができる。
一部の実施形態では、遺伝子編集を指示する核酸配列を送達することができる。例えば、核酸はガイドＲＮＡをコードしうる。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ配列およびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む単一のガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。一部の実施形態では、核酸はヌクレアーゼをコードしうる。一部の実施形態では、ヌクレアーゼは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）、ＮｇＡｇｏ（アルゴノートエンドヌクレアーゼ）、ＳＧＮ（構造ガイドエンドヌクレアーゼ）、ＲＧＮ（ＲＮＡガイドヌクレアーゼ）、またはそれらの改変もしくは切詰め型変異体である。一部の実施形態では、ＲＮＡガイドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２（ａ）ヌクレアーゼ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂヌクレアーゼ、Ｃａｓ１２ｃヌクレアーゼ、ＴｒｐＢ様ヌクレアーゼ、Ｃａｓ１３ａヌクレアーゼ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂヌクレアーゼ、またはそれらの改変もしくは切詰め型変異体である。一部の実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）または黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）から単離されるまたは由来である。
一部の実施形態では、遺伝子ノックダウンを指示する核酸配列を送達することができる。例えば、核酸配列は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、またはアンチセンス核酸をコードしうる。
ウイルスベクターは、宿主染色体上の遺伝子座と相同性を共有し組み換える異種核酸も含んでいてよい。このアプローチを利用すれば、例えば、宿主細胞の遺伝子欠損を修正することができる。
本開示は、例えば、ワクチン接種のために、免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスベクターも提供する。核酸は、これらに限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶまたはＳＩＶｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、がん抗原、細菌抗原、ウイルス抗原、および同類のもの由来の免疫原を含む当技術分野で公知の目的の任意の免疫原をコードしていてもよい。
ワクチンベクターとしてのパルボウイルスの使用は当技術分野では公知である（例えば、Ｍｉｙａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：８５０７；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．への米国特許第５，９１６，５６３号、Ｍａｚｚａｒａ ｅｔ ａｌ．への米国特許第５，９０５，０４０号、Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．への米国特許第５，８８２，６５２号、米国特許第５，８６３，５４１号参照）。抗原はパルボウイルスカプシドに提示されてもよい。あるいは、抗原は、組換えベクターゲノム中に導入される異種核酸から発現されてもよい。本明細書に記載されるおよび／または当技術分野で公知の目的の任意の免疫原は、本開示のウイルスベクターにより提供することができる。
免疫原性ポリペプチドは、免疫応答を誘発するならびに／またはこれらに限定されないが、微生物、細菌、原生動物、寄生虫性、真菌および／もしくはウイルス感染症および疾患を含む感染症および／もしくは疾患から対象を防御するのに適した任意のポリペプチドが可能である。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルソミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルス赤血球凝集素（ＨＡ）表面タンパク質またはインフルエンザウイルス核タンパク質、またはウマインフルエンザウイルス免疫原などのインフルエンザウイルス免疫原）またはレンチウイルス免疫原（例えば、ウマ感染性貧血ウイルス免疫原、ＨＩＶもしくはＳＩＶエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶもしくはＳＩＶマトリックス／カプシドタンパク質、ならびにＨＩＶもしくはＳＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物などのサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原、またはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原）が可能である。免疫原性ポリペプチドは、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルスヌクレオカプシドタンパク質およびラッサ熱エンベロープ糖タンパク質などのラッサ熱ウイルス免疫原）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアＬ１またはＬ８遺伝子産物などのワクシニアウイルス免疫原）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、ＮＰもしくはＧＰ遺伝子産物などの、エボラウイルス免疫原、またはマールブルグウイルス免疫原）、ブニアウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦ、および／またはＳＦＳウイルス免疫原）、またはコロナウイルス免疫原（例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質などの感染性ヒトコロナウイルス免疫原、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原、またはトリ感染性気管支炎ウイルス免疫原）も可能である。免疫原性ポリペプチドは、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）、流行性耳下腺炎免疫原、はしか免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素または他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、等）免疫原、および／または免疫原として当技術分野で現在知られているまたは後に特定される他の任意のワクチン免疫原がさらに可能である。
あるいは、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍またはがん細胞抗原が可能である。任意選択で、腫瘍またはがん抗原はがん細胞の表面で発現される。例示的ながんおよび腫瘍細胞抗原はＳ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１（１９９１））に記載されている。他の説明的ながんおよび腫瘍抗原は、これらに限定されないが、ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ－１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＫ－４、β－カテニン、ＭＵＭ－１、カスパーゼ－８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ－１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４）、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００ ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＣＥＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、Ｐ－１５、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９）；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）、ＣＡ １２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９、ＮＳＥ、ＤＵ－ＰＡＮ－２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ－１、ＣＡ７２－４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ－ｅｒｂＢ－２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ－ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ，（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３）；ムチン抗原（国際特許公開第９０／０５１４２号）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；パピローマウイルス抗原；および／または以下のがん；メラノーマ、腺癌、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんに関連する現在知られているもしくは後に発見される抗原および現在知られているもしくは後に特定される他の任意のがんもしくは悪性状態を含む（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１－９１参照）。
さらなる代案として、異種核酸は、インビトロで、エクスビボで、またはインビボで細胞において望ましく産生されるいかなるポリペプチドでもコードすることができる。例えば、ウイルスベクターは培養細胞中に導入され、発現された遺伝子産物はそこから単離しうる。
目的の異種核酸（複数可）は適切な制御配列に、作動可能に付随させることができることは当業者であれば理解する。例えば、異種核酸は、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、および／またはエンハンサー、ならびに同類のものなどの発現制御エレメントに、作動可能に付随させることができる。
さらに、目的の異種核酸（複数可）の調節された発現は、例えば、特定の部位でスプライシング活性を選択的に遮断するオリゴヌクレオチド、小分子および／または他の化合物の存在または非存在により異なるイントロンの選択的スプライシングを調節することにより、転写後レベルで達成することができる（例えば、ＷＯ２００６／１１９１３７に記載されているように）。
当業者であれば、種々のプロモーター／エンハンサーエレメントは、望まれるレベルおよび組織特異的発現に応じて使用することができることを認識する。プロモーター／エンハンサーは、望まれる発現パターンに応じて、構成的または誘導性が可能である。プロモーター／エンハンサーは、天然または外来性が可能であり、自然配列または合成配列が可能である。外来性とは、転写開始領域が導入される野生型宿主には転写開始領域が見出されないことが意図されている。
特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、処置される標的細胞または対象に固有であることが可能である。代表的な実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列に固有であることが可能である。プロモーター／エンハンサーエレメントは一般的には、それが目的の標的細胞（複数可）において機能するように選ばれる。さらに、特定の実施形態では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳動物プロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的または誘導性でもよい。
誘導性発現制御エレメントは典型的には、異種核酸配列（複数可）の発現を調節するのが望ましい適用において都合がよい。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または組織好適プロモーター／エンハンサーエレメントが可能であり、筋肉特異的または好適（心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または好適を含む）、神経組織特異的または好適（脳特異的または好適を含む）、眼特異的または好適（網膜特異的および角膜特異的を含む）、肝臓特異的または好適、骨髄特異的または好適、膵臓特異的または好適、脾臓特異的または好適、および肺特異的または好適プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、これらに限定されないが、Ｔｅｔ ｏｎ／ｏｆｆエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターを含む。
異種核酸配列（複数可）が標的細胞において転写され、次に翻訳される実施形態では、特定の開始シグナルが一般に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために含まれる。これらの外因性翻訳制御配列は、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含んでもよいが、天然でも合成でも、種々の起源のものが可能である。
本開示に従ったウイルスベクターは、分裂および非分裂細胞を含む広範囲の細胞中に異種核酸を送達するための手段を提供する。ウイルスベクターを用いれば、例えば、ポリペプチドをインビトロで産生するためまたはエクスビボ遺伝子療法のために目的の核酸を細胞にインビトロで送達することができる。ウイルスベクターはさらに、例えば、免疫原もしくは治療ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを発現するために、それを必要とする対象に核酸を送達する方法において有用である。このようにして、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを、対象においてインビボで産生することができる。対象はポリペプチドを必要としていることが可能である。なぜならば、対象はポリペプチドを欠損しているからである。さらに、対象におけるポリペプチドまたは機能的ＲＮＡの産生はある有益効果を与える可能性があるので、方法を実行することが可能である。
ウイルスベクターを使用すれば、培養細胞においてまたは対象において目的のポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを産生することも可能である（例えば、ポリペプチドを産生するためのまたは、例えば、スクリーニング法に関連して対象に対する機能的ＲＮＡの効果を観察するためのバイオリアクターとして対象を使用して）。
一般に、本明細書に開示されるウイルスベクターを用いれば、治療ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡを送達するのが有益である任意の疾患状態を処置するおよび／または予防するためにポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする異種核酸を送達することができる。説明的な疾患状態は、これらに限定されないが、嚢胞性線維症（嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質）および他の肺の疾患、血友病Ａ（第ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（第ＩＸ因子）、サラセミア（β－グロビン）、貧血病（エリスロポエチン）および他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β－インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞株由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（反復を取り除くためのＲＮＡｉ）、キャナヴァン病、筋委縮性側索硬化症、癲癇（ガラニン、神経栄養因子）および他の神経障害、がん（エンドスタチン、アンジオスタチン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳリガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；ＶＥＧＦまたは多剤耐性遺伝子産物に対するＲＮＡｉを含むＲＮＡｉ、ｍｉｒ－２６ａ［例えば、肝細胞癌のための］）、真性糖尿病（インスリン）、デュシェンヌを含む筋ジストロフィー（ジストロフィン、ミニジストロフィン、インスリン様成長因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩカッパＢ優性突然変異体などの抗炎症性ポリペプチド、サルコスパン、ユートロフィン、ミニユートロフィン、エクソンスキッピングを誘導するジストロフィン遺伝子におけるスプライスジャンクションに対するアンチセンスまたはＲＮＡｉ［例えば、ＷＯ／２００３／０９５６４７参照］、エクソンスキッピングを誘導するＵ７ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス［例えば、ＷＯ／２００６／０２１７２４参照］、およびミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体断片）およびベッカーゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（α－Ｌ－イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠損（アデノシンデアミナーゼ）、糖原貯蔵疾患（例えば、ファブリー病［α－ガラクトシダーゼ］およびポンペ病［リソソーム酸α－グルコシダーゼ］）および他の代謝障害、先天性肺気腫（α１－アンチトリプシン）、レッシュナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマンピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイサックス病（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ）、網膜変性疾患（ならびに眼および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性症および／もしくはバソヒビンに対するＰＤＧＦまたは、例えば、Ｉ型糖尿病において、網膜障害を処置する／予防するためのＶＥＧＦの他の阻害因子もしくは他の血管新生阻害因子）、脳などの実質臓器の疾患（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンジオスタチンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、神経膠芽腫［エンドスタチン、アンギオスタチンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、肝臓、腎臓、鬱血性心不全または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を含む心臓（例えば、タンパク質ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－１）およびその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節する亜鉛フィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、β２－アドレナリン受容体、β２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、切詰め型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔなどのＧタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子；カルサルシン（ｃａｌｓａｒｃｉｎ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン阻害性またはドミナントネガティブ分子、等を送達することにより）、関節炎（インスリン様成長因子）、関節障害（インスリン様成長因子１および／または２）、内膜過形成（例えば、内皮型一酸化窒素合成酵素、誘導型一酸化窒素合成酵素を送達することにより）、心臓移植の生存を改善する（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様成長因子Ｉ）、腎臓欠損（エリスロポエチン）、貧血症（エリスロポエチン）、関節炎（ＩＲＡＰおよびＴＮＦα可溶性受容体などの抗炎症性因子）、肝炎（α－インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠損（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２およびＳＣＡ３を含む脊髄小脳失調症、フェニルケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患、および同類のものを含む。本開示のウイルスベクターは、移植の成功を増やしおよび／または臓器移植術もしくは補助治療のネガティブな副作用を減らすために臓器移植術に続いてさらに使用することができる（例えば、サイトカイン産生を遮断するために免疫抑制剤または阻害性核酸を投与することにより）。別の例として、骨形成タンパク質（ＢＮＰ２、７、等、ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦを含む）を、例えば、骨折またはがん患者における手術切除に続いて、移植骨と一緒に投与することができる。
本開示のウイルスベクターを使用すれば、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ）も作製することができる。例えば、本開示のウイルスベクターを使用すれば、幹細胞関連核酸（複数可）を、成人線維芽細胞、皮膚細胞、肝臓細胞、腎臓細胞、脂肪細胞、心細胞、神経細胞、上皮細胞、内皮細胞、および同類のものなどの非多能性細胞中に送達することができる。幹細胞に関連している因子をコードする核酸は当技術分野では公知である。幹細胞および多能性に関連しているそのような因子の非限定的例は、Ｏｃｔ－３／４、ＳＯＸファミリー（例えば、ＳＯＸ１、ＳＯＸ２、ＳＯＸ３および／またはＳＯＸ１５）、Ｋｌｆファミリー（例えば、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２、Ｋｌｆ４および／またはＫｌｆ５）、Ｍｙｃファミリー（例えば、Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃおよび／またはＮ－ｍｙｃ）、ＮＡＮＯＧおよび／またはＬＩＮ２８を含む。
本開示は、糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子）、ムコ多糖症障害などのリソソーム貯蔵障害（例えば、スライ症候群［β－グルクロニダーゼ］、ハーラー症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、シャイエ症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハーラーシャイエ症候群［α－Ｌ－イズロニダーゼ］、ハンター症候群［イズロン酸スルファターゼ］、サンフィリッポ症候群Ａ［ヘパランスルファミダーゼ］、Ｂ［Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ］、Ｃ［アセチル－ＣｏＡ：α－グルコサミニドアセチルトランスフェラーゼ］、Ｄ［Ｎ－アセチルグルコサミン ６－スルファターゼ］、モルキオ症候群Ａ［ガラクトース－６－スルフェートスルファターゼ］、Ｂ［β－ガラクトシダーゼ］、マロトーラミー症候群［Ｎ－アセチルガラクトサミン－４－スルファターゼ］、等）、ファブリー病（α－ガラクトシダーゼ）、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、または糖原貯蔵障害（例えば、ポンペ病；リソソーム酸α－グルコシダーゼ）などの代謝障害を処置するおよび／または予防するために実行することもできる。
遺伝子移入は、疾患状態を理解しそれに対する治療を提供するための実質的で有望な用途がある。欠損遺伝子が知られておりクローン化されているいくつかの遺伝病が存在する。一般に、上記の疾患状態は２つの種類；一般に劣性様式で遺伝する欠損状態（常は酵素の欠損状態）、および調節または構造タンパク質を含むことがあり、典型的には優性様式で遺伝する不均衡状態に分類される。欠損状態疾患では、遺伝子移入を使用すれば、補充療法のために正常な遺伝子を罹患組織中に運ぶ、ならびに、アンチセンス突然変異を使用して疾患についての動物モデルを作り出すことができる。不均衡疾患状態では、遺伝子移入を使用すれば、モデル系に疾患状態を作り出すことができ、次にこれを疾患状態を相殺する試みに使用することができる。したがって、本開示に従ったウイルスベクターは、遺伝子疾患の処置および／または予防を可能にする。
本開示に従ったウイルスベクターを用いて、インビトロまたはインビボで機能的ＲＮＡを細胞に提供してもよい。細胞で機能的ＲＮＡが発現すれば、例えば、細胞による特定の標的タンパク質の発現を減らすことができる。したがって、機能的ＲＮＡを投与すれば、それを必要とする対象において特定のタンパク質の発現を減少することができる。例えば、細胞もしくは組織培養系を最適化するために、またはスクリーニング法において、遺伝子発現および／または細胞生理を調節するために機能的ＲＮＡをインビトロで細胞に投与することもできる。
さらに、本開示に従ったウイルスベクターは診断およびスクリーニング法に用途があり、それにより目的の核酸は、細胞培養系、または代わりに、トランスジェニック動物モデルにおいて一過性にまたは安定的に発現される。
本開示のウイルスベクターは、当業者には明らかになると考えられるように、これらに限定されないが、遺伝子ターゲティング、クリアランス、転写、翻訳、等を評価するためのプロトコールにおける使用を含む、種々の非治療目的にも使用することができる。ウイルスベクターは、安全性（伝播、毒性、免疫原性、等）を評価する目的にも使用することができる。そのようなデータは、例えば、米国食品医薬品局により、臨床効果の評価に先立つ規制承認過程の一部として検討される。
さらなる態様として、本開示のウイルスベクターを使用して対象において免疫応答を生じてもよい。この実施形態に従えば、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むウイルスベクターを対象に投与することができ、免疫原性ポリペプチドに対する能動的な免疫応答が対象により開始される。免疫原性ポリペプチドは上文に記載される通りである。一部の実施形態では、防御免疫応答が誘発される。
あるいは、ウイルスベクターはエクスビボで細胞に投与してもよく、変更された細胞が対象に投与される。異種核酸を含むウイルスベクターは細胞中に導入され、細胞は対象に投与され、そこで免疫原をコードする異種核酸を発現させ、免疫原に対して対象において免疫応答を誘導することができる。特定の実施形態では、細胞は抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。
「能動的な免疫応答」または「能動免疫」は「免疫原との遭遇後の宿主組織および細胞の関与」を特徴とする。この関与は、リンパ細網組織における免疫担当細胞の分化および増殖を含み、これにより抗体の合成もしくは細胞媒介反応性の発生または両方がもたらされる」Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｉｎ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ １１７（Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ ｅｄ．，１９８５）。代わりに述べると、能動的な免疫応答は、感染によるまたはワクチン接種による免疫原への曝露後宿主により開始される。能動免疫は受動免疫と対照をなすことができ、受動免疫は、「能動免疫された宿主から非免疫宿主への予め形成された物質（抗体、トランスファー因子、胸腺移植片、インターロイキン－２）の移入」を通じて獲得される。同文献。
本明細書で使用される「防御」免疫応答または「防御」免疫は、免疫応答が疾病の発生を予防するまたは減少する点で、免疫応答が対象にある効果を与えることを示している。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、疾患、特に、がんまたは腫瘍の処置および／または予防に有用でありうる（例えば、がんもしくは腫瘍形成を予防することにより、がんもしくは腫瘍の退縮を引き起こすことによりならびに／または転移を予防することによりおよび／もしくは転移小結節の成長を予防することにより）。防御効果は、処置の利益がそのいかなる不利益より勝りさえすれば、完全でも部分的でもよい。
特定の実施形態では、異種核酸を含むウイルスベクターまたは細胞は、下に記載されるように、免疫原性的有効量で投与することができる。
本開示のウイルスベクターは、１つもしくは複数のがん細胞抗原（または免疫学的に類似する分子）またはがん細胞に対する免疫応答を生じる他の任意の免疫原を発現するウイルスベクターの投与によるがん免疫療法のためにも投与することができる。実例を示すと、例えば、がんのある患者を処置するためにおよび／または対象においてがんが発症するのを予防するために、がん細胞抗原をコードする異種核酸を含むウイルスベクターを投与することにより、対象においてがん細胞抗原に対して免疫応答を生じることができる。ウイルスベクターは、本明細書に記載される通りに、インビボでまたはエクスビボ方法を使用することにより対象に投与してもよい。あるいは、がん抗原は、ウイルスカプシドの一部として発現させるまたは他の方法でウイルスカプシドに会合させることができる（例えば、上記のように）。
別の代案として、当技術分野で公知の他の任意の治療核酸（例えば、ＲＮＡｉ）またはポリペプチド（例えば、サイトカイン）を、がんを処置するおよび／または予防するために投与することができる。
本明細書で使用される場合、用語「がん」は、腫瘍形成がんを包含する。同様に、用語「がん組織」は腫瘍を包含する。「がん細胞抗原」は腫瘍抗原を包含する。
用語「がん」は、当技術分野でその理解されている意味、例えば、身体の遠隔部位に広がる可能性のある（すなわち、転移）組織の制御されていない成長を有する。例示的ながんは、これらに限定されないが、メラノーマ、腺がん、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺がん、肝臓がん、結腸がん、白血病、子宮がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸がん、膀胱がん、腎臓がん、膵臓がん、脳がんおよび現在知られているまたは後に特定される他の任意のがんまたは悪性状態を含む。代表的な実施形態では、本開示は、腫瘍形成がんを処置するおよび／または予防する方法を提供する。
用語「腫瘍」は、例えば、多細胞生物内の非分化細胞の異常な塊としても当技術分野では理解されている。腫瘍は悪性または良性が可能である。代表的な実施形態では、本明細書で開示される方法は悪性腫瘍を予防するおよび処置するために使用される。
用語「がんを処置する」、「がんの処置」および等価語により、がんの重症度が低減されるもしくは少なくとも部分的に取り除かれるならびに／または疾患の進行を遅らせるおよび／もしくは制御されるならびに／または疾患が安定化されることが意図されている。特定の実施形態では、これらの用語は、がんの転移が予防されるもしくは低減されるもしくは少なくとも部分的に取り除かれることおよび／または転移小結節の成長が予防されるもしくは低減されるもしくは少なくとも部分的に取り除かれることを示している。
用語「がんの予防」または「がんを予防する」および等価語により、方法が、がんの発生および／または発病の重症度を少なくとも部分的に取り除くもしくは低減するおよび／または遅延することが意図されている。代わりに述べると、対象におけるがんの発病はたぶんまたはおそらく低減されるおよび／または遅延されてもよい。
特定の実施形態では、細胞をがんのある対象から取り除き、本開示に従ったがん細胞抗原を発現するウイルスベクターに接触させてもよい。次に、改変された細胞は対象に投与され、それによってがん細胞抗原に対する免疫応答が誘発される。この方法は、インビボで十分な免疫応答を開始することができない（すなわち、促進抗体を十分な量で産生できない）免疫無防備状態の対象で都合よく用いることができる。
免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン、ω－インターフェロン、τ－インターフェロン、インターロイキン－１α、インターロイキン－１β、インターロイキン－２、インターロイキン－３、インターロイキン－４、インターロイキン－５、インターロイキン－６、インターロイキン－７、インターロイキン－８、インターロイキン－９、インターロイキン－１０、インターロイキン－１１、インターロイキン－１２、インターロイキン－１３、インターロイキン－１４、インターロイキン－１８、Ｂ細胞成長因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子－α、腫瘍壊死因子－β、単球走化性タンパク質－１、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、およびリンホトキシン）により増強しうることは当技術分野では公知である。したがって、免疫調節性サイトカイン（好ましくは、ＣＴＬ誘導性サイトカイン）をウイルスベクターと併せて対象に投与してもよい。
サイトカインは、当技術分野で公知のいかなる方法によっても投与しうる。外因性サイトカインを対象に投与してもよく、または代わりに、サイトカインをコードする核酸を適切なベクターを使用して対象に送達して、サイトカインがインビボで産生されてもよい。
中和抗体および中和抗体の回避を測定する方法
ＡＡＶ粒子に結合することができインビボで細胞に感染するその能力を減らす抗体は「中和抗体」である。一部の実施形態では、中和抗体は自然に存在する。一部の実施形態では、中和抗体は、組換えｒＡＡＶ粒子またはカプシドを対象（例えば、ウサギ、またはマウス）中に注入することにより発生させる。一部の実施形態では、中和抗体と投与されたｒＡＡＶ粒子の間の相互作用により免疫応答が生じる。一部の実施形態では、中和抗体と投与されたｒＡＡＶ粒子の間の相互作用により、細胞、組織、臓器、または対象を形質導入するｒＡＡＶ粒子の効率を下げるので、抗体中和に起因する喪失を穴埋めするためにもっと高用量のｒＡＡＶ粒子を対象に投与しなければならなくなる。
ｒＡＡＶ粒子が中和抗体を回避する能力を測定するため、インビトロまたはエクスビボ条件下、中和抗体の存在下で細胞の形質導入を実行することができる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、細胞に形質導入させるまたは感染させておく前に中和抗体とプレインキュベートさせる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を中和することが分かっている精製された抗体を使用して、抗体を回避する粒子の能力を試験する。一部の実施形態では、中和抗体はポリクローナルである。一部の実施形態では、中和抗体はモノクローナルである。中和抗体の非限定的例は上で考察されている。中和抗体の他の非限定的例は、４Ｅ４、５Ｈ７、Ａ２０、Ｃ３７－Ｂ、Ｄ３、ＡＤＫ８、ＡＤＫ１、およびＡＤＫ６である。５回領域および／または２／５回ウォールを含む中和抗体の例は、ＡＤＫ１ｂ、Ａ２０、ＡＤＫ５ａ、ＡＤＫ５ｂ、ＡＶＢ、ＣＳＡＬ９、およびＨＬ２３７２を含む。３回領域が関与する中和抗体の例は、４Ｅ４、５Ｈ７、ＡＤＫ１ａ、ＡＤＫ４、ＡＤＫ６、ＡＤＫ８、ＡＤＫ９、Ｃ３７－Ｂ、ＨＬ２３７０、ＨＬ２３７４、ＨＬ２３８１、およびＨＬ２３８３を含む。
本明細書に開示される抗体は、Ｔｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ Ｉ（ＡＡＶ１）－ａｎｄ ＡＡＶ５－ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｒｅｖｅａｌ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｏｍｍｏｎａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９（３）：１７９４－１８０８（２０１５）（ＡＤＫ１ａ，ＡＤＫ５ａ，ＡＤＫ５ｂ）；Ｔｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ．“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉ－Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ８（ＡＡＶ８）ａｎｄ ａｎｔｉ－ＡＡＶ９ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３６：１０５－１１０（２０１６）（ＨＬ２３７２）；Ｗｏｂｕｓ ｅｔ ａｌ．“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２（ＡＡＶ－２）ｃａｐｓｉｄ：ｅｐｉｔｏｐｅ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｐｓｉｄ ｄｏｍａｉｎｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ＡＡＶ－２－ｃｅｌｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＡＡＶ－２ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４（１９）：９２８１－９２９３（２０００）およびＭｃＣｒａｗ ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ－２ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａ２０”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ４３１（１－２）：４０－４９（２０１２）（Ａ２０）；およびＧｕｒｄａ ｅｔ ａｌ．“Ｃａｐｓｉｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ａｄｅｎｏ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｖｉｒｕｓ Ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ Ｂｉｎｄ Ｃｏｍｍｏｎ Ｒｅｇｉｏｎｓ”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８７（１６）：９１１１－９１２４（２０１３）、Ｇｕｒｄａ ｅｔ ａｌ．“Ｍａｐｐｉｎｇ ａ ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ｅｐｉｔｏｐｅ ｏｎｔｏ ｔｈｅ ｃａｐｓｉｄ ｏｆ ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｓｅｒｏｔｙｐｅ ８”Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６（１５）：７７３９－７７５１（２０１２）およびＢｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．“ＡＡＶ６ Ｋ５３１ ｓｅｒｖｅｓ ａ ｄｕａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＡＤＫ６ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ”Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５１８：３６９－３７６（２０１８）（４Ｅ４，５Ｈ７，ＡＤＫ１ａ，ＡＤＫ４，ＡＤＫ６，ＡＤＫ８，ＡＤＫ９，ａｎｄ Ｃ３７－Ｂ）にさらに記載されており、前記文献の開示は、それが本明細書で表明される開示と矛盾しない範囲内で引用することにより本明細書の一部をなすものとする。ＡＶＢ抗体のＡＡＶ結合断片はＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから市販されており（「ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ」）、ＣＳＡＬ９抗体のＡＡＶ結合断片はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから市販されており（「ＰＯＲＯＳ ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ ＡＡＶ９」）、これら製品の開示は、それが本明細書で表明される開示と矛盾しない範囲内で引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
下の実施例は、そのような抗体を精製する方法を記載しており、抗体によるＡＡＶ粒子の中和を測定する１つのやり方も提供している。一部の実施形態では、対象または動物モデルから精製された免疫グロブリンは、中和抗体の供給源として使用される。一部の実施形態では、対象の血液または血清は、中和抗体の供給源として使用される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の中和は、粒子対中和抗体（単数／複数）の異なる比で試験される。
ＡＡＶ粒子による細胞の形質導入は、いくつかの異なるやり方で試験することができる。例えば、形質導入は、細胞中に移入される遺伝子の量を測定することにより測定可能である（例えば、ｑＰＣＲまたは移入された遺伝子から発現されるタンパク質についてのタンパク質アッセイなどの方法を使用して）。一部の実施形態では、形質導入は、複製されるウイルスの量を測定することにより測定可能である。
血清陽性を測定する
一部の実施形態では、ＡＡＶａについて血清陽性である対象に、本開示のカプシドタンパク質（例えば、アミノ酸配列Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４－Ｋ－Ｌ－Ｘ５（配列番号１９７）、アミノ酸配列Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４（配列番号１９８）を生じる置換を含むカプシドタンパク質および／または改変５回領域を含むカプシドタンパク質）を含むｒＡＡＶ粒子を投与する方法は、対象が、投与されることになる血清型のＡＡＶについて血清陽性であるかどうかを判定することをさらに含む。
対象が特定の血清型のＡＡＶについて血清陽性であるかどうかを判定する方法は当技術分野では公知である。例えば、Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４，５（８２）：１）を参照されたい。一部の実施形態では、対象が特定の血清型のＡＡＶについて血清陽性であるかどうかを判定することは、対象がＡＡＶエピトープに向けられた抗ＡＡＶ抗体および／またはＴ細胞を有するかどうかを判定することを含む。対象の血液または血清中の抗ＡＡＶ抗体の存在は、対象の血液または血清の試料を１つまたは複数のＡＡＶカプシド抗原と一緒にインキュベートし、その後、１つまたは複数のＡＡＶカプシド抗原に結合している抗ＡＡＶ抗体の量を測定することにより検出可能である。カプシド抗原の非限定的例は、ＡＡＶカプシドの消化物、または精製されたカプシドペプチド、ポリペプチド、および／もしくはタンパク質の組合せを含む。一部の実施形態では、１つのカプシドペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質だけがＡＡＶ６抗原として使用される。一部の実施形態では、抗原として使用されるタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、ＡＡＶ ＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドタンパク質に含まれる配列を有する。
一部の実施形態では、対象の血液または血清中の抗ＡＡＶ抗体の存在は、対象の血液または血清の試料を全カプシドと一緒にインキュベートすることにより検出可能である。
カプシド抗原または全カプシドに結合している抗体の量は、任意の数の生化学的および生物物理的技法を使用して決定することができる。例えば、Ｎｅｒｉ ｅｔ ａｌ（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６，１４（１２）：４６５）、これは抗体－抗原親和性を決定する生物物理的方法を考察している、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９３，５（２）：２７８）、これはＥＬＩＳＡおよびＲＩＡに基づいて抗体－抗原親和性を測定するための方法を考察している、Ｑｕｉｎｔｅｒｏ－Ｒｏｎｄｅｒｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ： Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｂｅｄｓｉｄｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ ４８，Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２０１３）およびＲａｐｔｉ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１２ Ｊａｎ；２０（１）：７３－８３）を参照されたい。前記文献のそれぞれは引用することによりその全体が本明細書の一部をなすものとする。抗体と抗原および／またはカプシドの間の相互作用を測定する生化学的アプローチの非限定的例は、共免疫沈降、二分子蛍光補完、アフィニティー電気泳動、ＥＬＩＳＡおよびその種々の形式（例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ）を含む。抗体と抗原および／またはカプシドの間の相互作用を測定する生物物理的アプローチの非限定的例は、生体層干渉法（ｂｉｏ－ｌａｙｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）、二重偏光干渉法（ｄｕａｌ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ）、静的光散乱、動的光散乱、表面プラズモン共鳴、蛍光偏光法／異方性、蛍光相関分光法、蛍光共鳴エネルギー移動、および等温滴定熱量測定を含む。抗ＡＡＶ抗体を検出する一部の実施形態では、抗原またはカプシドは、結合抗体を非結合抗体から分離するために固体支持体上に固定させる。一部の実施形態では、固体支持体はビーズである。
一部の実施形態では、対象がＡＡＶについて血清陽性であるかどうかを判定することは、対象がＡＡＶ６エピトープに向けられたＴ細胞を有するかどうかを判定することを含む。Ｆｅｒｒｅｉｒａ ｅｔ ａｌ．（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４，５（８２）：１）は、ＡＡＶ６に適合させることができるＡＡＶ１特異的Ｔリンパ球についてのアッセイを記載している。
中和抗体に対する反応性の減少による形質導入効率の改善
一部の実施形態では、本明細書に開示されるように、本開示のカプシドタンパク質を含む（例えば、アミノ酸配列Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４－Ｋ－Ｌ－Ｘ５（配列番号１９７）、アミノ酸配列Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４（配列番号１９８）を生じる置換を含むおよび／または改変５回領域を含む）１つまたは複数のｒＡＡＶ粒子を、ｒＡＡＶを受けることになっているまたは受けたことがある対象に投与すれば、対照（例えば、アミノ酸配列Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４－Ｋ－Ｌ－Ｘ５（配列番号１９７）、アミノ酸配列Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４（配列番号１９８）を生じる置換のないおよび／または改変５回領域のないＶＰタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子）の投与と比べて、中和抗体に対する反応性の減少、または投与されたｒＡＡＶの形質導入効率の改善を生じる。一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれか１つは、本開示のカプシドタンパク質を含む１つまたは複数のｒＡＡＶ粒子を、中和抗体に対する反応性の減少、またはインビボでのＡＡＶ形質導入効率の増加を生じる量で投与することを含む。
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法のいずれか１つは、本開示のカプシドタンパク質を含む１つまたは複数のｒＡＡＶ粒子を、たとえインビボで投与される場合でも、インビトロの状況でＡＡＶ形質導入効率の増加を生じる量で投与することを含む。例えば、ｒＡＡＶのインビボ投与についての形質導入効率の増加は、中和抗体の存在下インビトロで培養された細胞にｒＡＡＶを導入し、本開示のカプシドタンパク質なしのｒＡＡＶ（例えば、アミノ酸配列Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４－Ｋ－Ｌ－Ｘ５（配列番号１９７）、アミノ酸配列Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４（配列番号１９８）を生じる置換のないおよび／または改変５回領域のないＶＰタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子）と、導入される細胞への形質導入効率を比べることにより判定することができる。ＡＡＶ形質導入効率のインビトロ測定のために使用される細胞は、培養皿で、またはオルガノイド内で培養してもよい。
形質導入効率は、固定された感染多重度（ＭＯＩ）のｒＡＡＶを細胞に感染させておき、ｒＡＡＶ粒子により送達される遺伝的負荷から発現されたＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することにより測定可能である。例えば、蛍光（例えば、ＥＧＦＰ）またはルシフェラーゼ遺伝子はｒＡＡＶ粒子を使用して送達することができ、一定の時間（例えば、２４時間または４８時間）後、蛍光もしくはルシフェラーゼＲＮＡ発現またはルシフェラーゼタンパク質を当技術分野で公知である数多くの技法（例えば、細胞分画、ポリメラーゼ連鎖反応、顕微鏡、および／またはルシフェラーゼ酵素アッセイ）の１つを使用して測定可能である。
本明細書で提供される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質への改変（例えば、アミノ酸配列Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４－Ｋ－Ｌ－Ｘ５（配列番号１９７）、アミノ酸配列Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４（配列番号１９８）を生じる置換（複数可）および／または５回領域での改変）により、改変のないｒＡＡＶ粒子が投与される場合と比べた場合、１．２分の１～１００分の１（例えば、１．２分の１～１００分の１、１．３分の１～５分の１、１．４分の１～５分の１、１．５分の１～２分の１、１．２分の１～１０分の１、１０分の１～２０分の１、１０分の１～１５分の１、１２分の１～１８分の１、１５分の１～２０分の１、１．５分の１未満、２分の１未満、３分の１未満、４分の１未満、５分の１未満、６分の１未満、７分の１未満、８分の１未満、１０分の１未満、１２分の１未満、１４分の１未満、１６分の１未満、または２０分の１未満）への、中和抗体に対する反応性の減少が生じる。本明細書で提供される方法のいずれか１つの一部の実施形態では、本明細書に開示されるｒＡＡＶ粒子のカプシドタンパク質への改変は、改変のないｒＡＡＶ粒子が投与される場合と比べた場合、１．２～１００倍の係数（例えば、１．２～１００、１．３～５、１．４～５、１．５～２、１．２～１０、１０～２０、１０～１５、１２～１８、１５～２０、１．５倍よりも多い、２倍よりも多い、３倍よりも多い、４倍よりも多い、５倍よりも多い、６倍よりも多い、７倍よりも多い、８倍よりも多い、１０倍よりも多い、１２倍よりも多い、１４倍よりも多い、１６倍よりも多い、または２０倍よりも多い）でＡＡＶ形質導入効率の改善を生じる。
ｒＡＡＶ粒子上での抗原フットプリントの作成
種々の血清型のｒＡＡＶ粒子上で抗原フットプリントを作成する方法も本明細書で提供される。一部の実施形態では、特定のｒＡＡＶ粒子上での特定の抗体についての抗原フットプリントを作成する方法は、ハイブリドーマ上澄み由来の抗体の精製（例えば、カラム精製を使用して）、精製抗体を酵素を使用して切断し、Ｆａｂを精製し、それをｒＡＡＶ粒子またはウイルス様粒子（空のカプシド）と種々のモル比（例えば、６０対１、７０対１、８０対１、９０対１、１００対１、１１対１、１２０対１）で複合体化し、電子顕微鏡を使用して低温ＥＭデータを収集し、複合体の個別の画像を分離し、単一粒子再構成を実施し、ウイルスカプシドの入手可能な結晶構造および一般的なＦａｂ構造を使用して再構成密度マップを解釈し、Ｆａｂとカプシドの間の相互作用している残基を視覚化することを含む。一部の実施形態では、カプシド－Ｆａｂ構造の解像度は、Ｆａｂとカプシドの間の相互作用している残基を視覚化するのに十分高い。一部の実施形態では、低温ＥＭを使用して作成されるフットプリントは変異誘発を使用して確認される。
対象、医薬製剤、および投与様式
本開示に従ったウイルスベクターおよびカプシドは、獣医と医学応用の両方において用途がある。適切な対象はトリと哺乳動物の両方を含む。本明細書で使用される用語「トリ」は、これらに限定されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ、キジ、オウム、インコ、および同類のものを含む。本明細書で使用される用語「哺乳動物」は、これらに限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、等を含む。ヒト対象は、新生児、幼児、少年少女、成人および老人対象を含む。
代表的な実施形態では、対象は、本開示の方法を「必要として」いる。
特定の実施形態では、本開示は、薬学的に許容される担体中に本開示のウイルスベクターおよび／またはカプシドおよび／またはカプシドタンパク質および／またはウイルス粒子、ならびに、任意選択で、他の薬剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、アジュバント、希釈剤、等を含む医薬組成物を提供する。注射では、担体は典型的には、液体になる。他の投与方法では、担体は固体または液体でもよい。吸入投与では、担体は呼吸に適しており、任意選択で、固体または液体微粒子形態が可能である。
「薬学的に許容される」により、毒性がないまたは他の点で望ましくないものではない材料が意味されており、すなわち、その材料はいかなる望ましくない生物学的効果を引き起こさずに対象に投与しうる。
本開示のカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶ粒子のいずれか１つを含む組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、本明細書で提供される組成物のいずれか１つは、薬学的に許容される担体を含む。用語「担体」とは、ｒＡＡＶ粒子と一緒に対象に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルのことである。そのような医薬担体は、鉱油などの石油系油分、ピーナッツ油、ダイズ油、およびゴマ油などの植物油、動物油、または合成起源の油の無菌液体を含む、水と油などの無菌液体が可能である。生理食塩水および水性デキストロースおよびグリセリン溶液も液体担体として用いることができる。薬学的に許容される担体の非限定的例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、生理食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリアクリル酸、潤滑剤（タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油などの）、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤（メチル－、エチル－、およびプロピル－ヒドロキシ安息香酸などの）、およびｐＨ調整剤（無機および有機酸ならびに塩基などの）を含む。担体の他の例は、リン酸緩衝食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水、および注射用水を含み、これらのいずれも、任意選択で、塩化カルシウム二水和物、無水リン酸二ナトリウム（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ａｎｈｙｄｒｏｕｓ）、塩化マグネシウム六水和物、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、塩化ナトリウム、またはスクロースの１つまたは複数と組み合わせてもよい。使用しうる担体の他の例は、生理食塩水（例えば、無菌無発熱物質生理食塩水）、塩類緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、および重炭酸塩緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール類、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールを含む。ＵＳＰグレード担体および賦形剤は、ヒト対象へのｒＡＡＶ粒子の送達には特に有用である。
典型的には、そのような組成物は、治療薬（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の少なくとも約０．１％またはそれよりも多くを含有してもよいが、活性成分（複数可）のパーセンテージは、当然のことながら、変動してもよく、都合よく、全製剤の重量または容量の約１または２％と約７０％または８０％またはそれよりも多いの間でもよい。もちろん、それぞれの治療的に有用な組成物中の治療薬（複数可）（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の量は、適切な投与量が化合物の所与の単位用量で得られるように調製してもよい。可溶性、生物学的利用能、生物学的半減期、投与経路、製品貯蔵寿命などの要因、ならびに他の薬理学的考慮点は、そのような医薬製剤を調製する当業者により想定されることになり、したがって、種々の投与量および処置レジメンを設計しうる。
一部の実施形態では、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の濃度は、１０６～１０１４粒子／ｍｌもしくは１０３～１０１５粒子／ｍｌの範囲に及ぶ桁で、または、例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、もしくは１０１４粒子／ｍｌなどの、どちらかの範囲についてのその中間の任意の値でもよい。一部の実施形態では、１０１３粒子／ｍｌよりも高い濃度のｒＡＡＶ粒子が投与される。一部の実施形態では、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の濃度は、１０６～１０１４ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍｌもしくは１０３～１０１５ｖｇ／ｍｌの範囲に及ぶ桁で、または、どちらかの範囲についてのその中間の任意の値（例えば、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４ｖｇ／ｍｌ）でもよい。一部の実施形態では、１０１３ｖｇ／ｍｌよりも高い濃度のｒＡＡＶ粒子が投与される。ｒＡＡＶ粒子は、処置を受けている特定の疾患または障害の治療を達成するのに必要とされることがある単一用量として投与する、または２回もしくはそれよりも多い投与に分けることができる。一部の実施形態では、０．０００１ｍｌ～１０ｍｌが対象に送達される。一部の実施形態では、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の数は、１０６～１０１４ｖｇ／ｋｇの範囲に及ぶ桁で、または、その中間の任意の値（例えば、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４ｖｇ／ｍｇ）でもよい。一部の実施形態では、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の用量は、１０１２～１０１４ｖｇ／ｋｇの範囲に及ぶ桁でよい。一部の実施形態では、対象に送達される（例えば、本明細書に記載される１つまたは複数の投与経路を経て）ｒＡＡＶ６組成物の容量は、０．０００１ｍＬ～１０ｍＬである。
本明細書に開示される本開示のカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶ粒子は、アミノ酸配列Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４－Ｋ－Ｌ－Ｘ５（配列番号１９７）、アミノ酸配列Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４（配列番号１９８）を生じる置換（複数可）のないおよび／または５回領域での改変がない粒子と比べると中和抗体に対する反応性が減少しており、したがって、形質導入効率が大きくなっているので、必要とされる本開示のカプシドタンパク質を有するｒＡＡＶ粒子の用量はもっと少なくて済む。したがって、本明細書で開示される改変されたカプシドタンパク質のない粒子と比べると、必要とされる本開示のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子の濃度はもっと少なくまたは容量はもっと少なくて済む。
本開示の一態様は、核酸をインビトロで細胞に移入する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適した標準形質導入法に従って適切な感染多重度で細胞中に導入しうる。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞型および数、ならびに特定のウイルスベクターに応じて変動することができ、不要な実験をせずに当業者により決定することができる。代表的な実施形態では、少なくとも約１０３感染単位、任意選択で、少なくとも約１０５感染単位が細胞に導入される。
ウイルスベクターを導入する細胞（複数可）は、これらに限定されないが、神経細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特に、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトなどの脳細胞を含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、および角膜細胞を含む）、上皮細胞（例えば、腸および呼吸器上皮細胞）、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞および／または横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞、および同類のものを含む任意の型が可能である。代表的な実施形態では、細胞は任意の前駆細胞が可能である。さらなる可能性として、細胞は幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝臓幹細胞）が可能である。その上さらなる代案として、細胞はがんまたは腫瘍細胞が可能である。さらに、細胞は、上で示されるように、いかなる起源の種由来でも可能である。
ウイルスベクターは、改変細胞を対象に投与する目的で、インビトロで細胞中に導入することができる。特定の実施形態では、細胞はすでに対象から取り除かれており、ウイルスベクターがその中に導入され、次に、細胞は元の対象に投与され戻される。エクスビボでの操作のために対象から細胞を取り除き、続いてその対象中に再び導入する方法は当技術分野では公知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号参照）。あるいは、組換えウイルスベクターをドナー対象由来の細胞中に、培養細胞中に、または他の任意の適切な供給源由来の細胞中に導入することができ、細胞はそれを必要とする対象（すなわち、「レシピエント」対象）に投与される。
エクスビボ核酸送達に適した細胞は上に記載されている通りである。対象に投与する細胞の投与量は、対象の年齢、状態および種、細胞の型、細胞が発現している核酸、投与様式、ならびに同類のものにより変動する。典型的には、薬学的に許容される担体中用量あたり少なくとも約１０２～約１０８細胞または少なくとも約１０３～約１０６細胞が投与される。特定の実施形態では、ウイルスベクターを形質導入された細胞は、医薬担体と組み合わせて処置有効量または予防有効量で対象に投与される。
一部の実施形態では、ウイルスベクターを細胞中に導入され、細胞は対象に投与して、送達されたポリペプチド（例えば、トランス遺伝子としてまたはカプシドにおいて発現される）に対して免疫原性応答を誘発することができる。典型的には、薬学的に許容される担体と組み合わせた免疫原性的有効量のポリペプチドを発現する量の細胞が投与される。「免疫原性的有効量」とは、医薬製剤が投与される対象においてポリペプチドに対する能動的な免疫応答を惹起するのに十分である発現されたポリペプチドの量である。特定の実施形態では、投与量は防御免疫応答（上で定義されている）を生じるのに十分である。与えられる防御の程度は、免疫原性ポリペプチドを投与する利益がそのいかなる不利益にも勝りさえすれば、完璧であるまたは永久的である必要はない。
したがって、本開示は、核酸を細胞に投与する方法であって、細胞を本開示のウイルスベクター、ウイルス粒子および／または組成物に接触させることを含む方法を提供する。
本開示のさらなる態様は、本開示のウイルスベクター、ウイルス粒子および／またはウイルスカプシドを対象に投与する方法である。したがって、本開示は、核酸を対象に送達する方法であって、本開示のウイルス粒子、ウイルスベクターおよび／または組成物を対象に投与することを含む方法も提供する。本開示に従ったウイルスベクター、ウイルス粒子および／またはカプシドのそれを必要とするヒト対象または動物への投与は、当技術分野で公知のいかなる手段によっても可能である。任意選択で、ウイルスベクター、ウイルス粒子および／またはカプシドは、薬学的に許容される担体中処置有効用量または予防有効用量で送達される。
本開示のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、免疫原性応答を誘発するためにさらに投与することができる（例えば、ワクチンとして）。典型的には、本開示の免疫原性組成物は、免疫原性的有効量のウイルスベクターおよび／またはカプシドを薬学的に許容される担体と組み合わせて含む。任意選択で、投与量は防御免疫応答（上で定義されている）を生じるのに十分である。与えられる防御の程度は、免疫原性ポリペプチドを投与する利益がそのいかなる不利益にも勝りさえすれば、完璧であるまたは永久的である必要はない。対象および免疫原は上に記載される通りである。
上記の通りに、本明細書で開示されるｒＡＡＶ粒子のいずれか１つは、対照（例えば、本明細書に記載されるような改変を受けていないｒＡＡＶ、例えば、野生型ｒＡＡＶ粒子、例えば、アミノ酸配列Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４－Ｋ－Ｌ－Ｘ５（配列番号１９７）および／またはアミノ酸配列Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４（配列番号１９８）を生じる置換（複数可）を含むカプシドタンパク質を含まないｒＡＡＶ粒子、例えば、改変５回領域がないｒＡＡＶ粒子、または非改変５回領域を有するｒＡＡＶ粒子）と比べて、中和抗体との相互作用を低減することにより抗原応答を回避する能力を有する。野生型ｒＡＡＶカプシドタンパク質の例は、配列番号１～３０に提供されている。本明細書に開示される本開示のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子のいずれか１つを使用すれば、１つまたは複数の目的の遺伝子を、ｒＡＡＶ粒子を中和することができる抗体を有する対象に送達することができる。したがって、本明細書で開示される改変カプシドタンパク質を有するｒＡＡＶのいずれか１つのＡＡＶに血清陽性である対象に投与する方法が本明細書で提供される。
対象は、投与されたｒＡＡＶ粒子に対する免疫応答が対照対象における応答よりも統計的に高い場合には、「ＡＡＶに血清陽性」である。一部の実施形態では、対象は、対象において（例えば、対象の血清において）検出された抗ＡＡＶ抗体のレベルが対照対象において検出された抗ＡＡＶ抗体のレベルよりも統計的に高い場合には、「ＡＡＶに血清陽性」である。対照対象は、以前ＡＡＶ粒子（例えば、ｒＡＡＶ粒子または特定の血清型）に曝露されたことがない対象でもよい。対象は、ＡＡＶ９粒子への曝露により免疫応答が生じる場合には、「ＡＡＶ９に血清陽性」でありうる。一部の実施形態では、ＡＡＶに血清陽性である対象は、ＡＡＶエピトープに向けられた前から存在する抗ＡＡＶ抗体および／またはＴ細胞を有する。一部の実施形態では、対象は、ＡＡＶへの以前の曝露のせいでＡＡＶを認識する中和抗体（すなわち、「ＡＡＶ抗体」または「抗ＡＡＶ抗体」）を有する場合がある。対象が以前曝露されたことがあるＡＡＶは、自然の供給源（すなわち、自然に存在するＡＡＶ粒子）のものでもよい。一部の実施形態では、対象が以前曝露されたことがあるＡＡＶ粒子は、例えば、治療遺伝子による処置のための組換え（すなわち、人が作製したｒＡＡＶ粒子）でもよい。
ｒＡＡＶ粒子の組成物（例えば、治療遺伝子を含む）の投与により、対象がＡＡＶに血清陽性になる場合がある。そのような例では、ｒＡＡＶ粒子（または少なくとも同じ血清型のｒＡＡＶ粒子）を対象に投与するもしくは再投与することは可能ではない場合がある、またはその次のｒＡＡＶ粒子の投与により望ましくない免疫応答が生じる。そのような例では、その次のｒＡＡＶ粒子を対象に投与することを含む方法が本明細書で提供され、その次のｒＡＡＶ粒子は本開示のカプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、方法はその次のｒＡＡＶ粒子を対象に投与することを含み、その次のｒＡＡＶ粒子は、本開示の改変カプシドタンパク質を有するｒＡＡＶ粒子のいずれか１つである。
一部の実施形態では、その次のｒＡＡＶ粒子は、以前受けたまたは投与されたｒＡＡＶ粒子から１２カ月以内（例えば、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１カ月以内）に投与される。一部の実施形態では、その次のｒＡＡＶ粒子は、以前受けたまたは投与されたｒＡＡＶ粒子から１カ月以内（例えば、３１日、３０日、２５日、２０日、２１日、１４日、７日、５日、３日、２日、１日、１８時間、１２時間、６時間、４時間、２時間以内、または１時間以内）に投与される。一部の実施形態では、その次のｒＡＡＶ粒子は、以前受けたまたは投与されたｒＡＡＶ粒子の１２カ月以上後に（例えば、１年、１８カ月、２年、３年、５年、１０年、２０年、または５０年後）に投与される。
一部の実施形態では、対象は以前ｒＡＡＶ粒子を投与されたことがある。一部の実施形態では、対象が以前曝露されたことがあるＡＡＶ粒子は、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３のものである。
本開示の態様は、対象で使用するための方法に関する。一部の実施形態では、対象は哺乳動物である。一部の実施形態では、哺乳動物対象はヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ハムスター、マウス、ラット、ブタ、ウマ、ウシ、ロバまたはウサギである。非ヒト霊長類対象の非限定的例は、マカク（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）、マーモセット、タマリン、クモザル、ヨザル、サバンナモンキー、リスザル、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、およびオランウータンを含む。一部の実施形態では、対象は実験動物、例えば、マウスである。一部の実施形態では、対象はヒト対象である。一部の実施形態では、対象は成人（例えば、成人ヒトまたは成体マウス）である。一部の実施形態では、対象は少年少女（例えば、幼児、または１０代の少年少女）である。
一部の実施形態では、「投与する」または「投与」は、薬理学的に有用であるように対象に物質を提供することを意味する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は対象に経腸的に投与される。一部の実施形態では、経腸投与は経口である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は対象に非経口的に投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は対象に、皮下に、眼内に、硝子体内に、網膜下に、静脈内に（ＩＶ）、脳室内に、筋肉内に、くも膜下腔内に（ＩＴ）、大槽内に、腹腔内に、吸入を経て、局所的に、または１つもしくは複数の細胞、組織もしくは器官への直接注射により投与される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、肝動脈または門脈中への注射により対象に投与される。
一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ粒子のいずれか１つは対象において疾患を処置するために投与される。疾患を「処置する」は、その用語が本明細書で使用される場合、対象が経験する疾患または障害の少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度を低減することを意味する。上にまたは本明細書の他の場所に記載される組成物は典型的には、有効量、すなわち、望ましい結果を生じることができる量で対象に投与される。望ましい結果は、投与されている活性薬剤に依拠することになる。例えば、ｒＡＡＶ粒子の有効量は、発現構築物を宿主器官、組織、または細胞に移入することができる粒子の量でよい。治療的に許容される量は、本明細書に開示される改変カプシドタンパク質を有するｒＡＡＶ９粒子を使用して、疾患、例えば、神経変性疾患を処置することができる量でよい。医学および獣医学の分野で周知であるように、いずれか１つの対象のための投与量は、対象のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の組成物、組成物中の活性成分（複数可）、投与の時間および経路、健康全般、ならびに同時に投与される他の薬物を含む、多くの要因に依拠する。さらに、特定の組織型または器官を標的にするための特定のＡＡＶ血清型の使用は、ＡＡＶトロピズムに基づいて周知である。例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を使用して中枢神経系を標的にしてもよく、ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を使用して心臓を標的にしてもよい。ＡＡＶ２を使用して腎臓を標的にしてもよい。ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を使用して肝臓を標的にしてもよい。ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ９を使用して肺を標的にしてもよい。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、またはＡＡＶ８を使用して眼の異なる領域を標的にしてもよい。ＡＡＶ１、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９を使用して骨格筋を標的にしてもよい。
対象に投与されるウイルスベクターおよび／またはカプシドの投与量は、投与様式、処置されるおよび／または予防される疾患または状態、個々の対象の状態、特定のウイルスベクターまたはカプシド、ならびに送達される核酸、ならびに同類のものに依拠し、決まりきったやり方で決定することができる。治療効果を達成するための例示的な投与量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０３、１０１４、１０１５形質導入単位、任意選択で、約１０８～１０１３形質導入単位の力価である。
特定の実施形態では、１回より多い投与（例えば、２回、３回、４回またはそれよりも多い投与）を用いて、種々の間隔の期間、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年、等にわたって、所望のレベルの遺伝子発現を達成してもよい。
例示的な投与様式は、経口、直腸、経粘膜的、鼻腔内の、吸入（例えば、エアゾール噴霧器を経て）、頬側の（例えば、舌下の）、膣の、くも膜下腔内の、眼内の、経皮的な、子宮内の（または胚内で）、非経口の（例えば、静脈内の、皮下の、皮内の、筋肉内の［骨格筋、横隔膜筋および／または心筋への投与を含む］、皮内の、胸膜内の、脳内の、および関節内の）、局所的（例えば、気道表面、および経皮投与を含む、皮膚と粘膜表面の両方へ）、リンパ内、および同類のもの、ならびに直接組織または器官注射（例えば、肝臓、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳へ）を含む。投与は腫瘍へも可能である（例えば、腫瘍またはリンパ節中にまたその近くに）。所与の場合のもっとも適した経路は、処置されているおよび／または予防されている状態の性質および重症度にならびに使用されている特定のベクターの性質に依拠することになる。
本発明に従った骨格筋への投与は、これらに限定されないが、肢（例えば、上腕、前腕、上腿、および／または下腿）、背中、首、頭部（例えば、舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰、および／または指の骨格筋への投与を含む。適切な骨格筋は、これらに限定されないが、小指外転筋（手の）、小趾外転筋（足の）、母趾外転筋、第五中足骨外転筋、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転筋、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、肘筋、前斜角筋（ａｎｔｅｒｉｏｒ ｓｃａｌｅｎｅ）、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、鳥口腕筋（ｃｏｒａｃｏｂｒａｃｈｉａｌｉｓ）、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、二腹筋、背側骨間筋（手の）、背側骨間筋（足の）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、短指伸筋、長指伸筋、短母指伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指外転筋、手の長母指伸筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手の）、短小指屈筋（足の）、短指屈筋、長指屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、薄筋、頚腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋、横突間（ｉｎｔｅｒｔｒａｎｓｖｅｒｓｉ）、外側翼突筋、外側直筋、広背筋、口角挙筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋（ｌｏｎｇ ｒｏｔａｔｏｒｓ）、頭最長筋、頚最長筋、胸最長筋、頭長筋、頚長筋、中様筋（手の）、中様筋（足の）、咬筋、内側翼突筋、内直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第三腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頚筋、膝窩筋、後斜角筋、方回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半腹様筋、頭半棘筋、頚半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短外旋筋（ｓｈｏｒｔ ｒｏｔａｔｏｒｓ）、ヒラメ筋、頭棘筋、頚棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頚板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸郭、甲状舌骨、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋および小頬骨筋、ならびに当技術分野で公知の他の任意の適切な骨格筋を含む。
ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流（任意選択で、脚および／または腕の分離式肢灌流；例えば、Ａｒｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８－３４６４参照）および／または直接筋肉内注射により骨格筋に送達することができる。特定の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、四肢灌流、任意選択で、分離式肢灌流により（例えば、静脈内または関節内投与により）対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーのある対象）の肢（腕および／または脚）に投与される。本開示の実施形態では、本開示のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、「流体力学」技法を用いずに都合よく投与することができる。先行技術ベクターの組織送達（例えば、筋肉への）は流体力学技法（例えば、大容量での静脈内／静脈内投与）により増強されることが多く、この技法は脈管構造において圧力を増し、内皮細胞障壁を横切るベクターの能力を促進する。特定の実施形態では、本開示のウイルスベクターおよび／またはカプシドは、大容量注入および／または脈管内圧の上昇（例えば、通常の収縮期血圧よりも大きい、例えば、通常の収縮期血圧よりも脈管内圧の、５％、１０％、１５％、２０％、２５％以下の増加）などの流体力学技法なしで投与することができる。そのような方法は、浮腫、神経損傷および／またはコンパートメント症候群などの流体力学技法に関連する副作用を低減するまたは回避する可能性がある。
心筋への投与は、左心房、右心房、左心室、右心室および／または隔膜への投与を含む。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、静脈内投与、大動脈内投与、直接心臓注射（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室中へ）、および／または冠動脈灌流などの動脈内投与により心筋に送達することができる。
横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の適切な方法により可能である。
標的組織への送達は、ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むデポーを送達することによっても達成することができる。代表的な実施形態では、ウイルスベクターおよび／もしくはカプシドを含むデポーは、骨格、心および／もしくは横隔膜筋組織中に移植される、または組織をウイルスベクターおよび／またはカプシドを含むフィルムもしくは他のマトリックスに接触させることができる。そのような移植可能なマトリックスまたは基質は米国特許第７，２０１，８９８号に記載されている。
特定の実施形態では、本開示に従ったウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィー、心臓疾患［例えば、ＰＡＤまたは鬱血性心不全］を処置するおよび／または予防するために）。
代表的な実施形態では、本開示は、骨格、心および／または横隔膜筋の障害を処置するおよび／または予防するために使用される。
代表的な実施形態では、本開示は、それを必要とする対象において筋ジストロフィーを処置するおよび／または予防する方法であって、本開示の処置または予防有効量のウイルスベクターを哺乳動物対象に投与することを含み、ウイルスベクターは、ジストロフィン、ミニジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ－１、ＩカッパＢ優性突然変異体などの抗炎症性ポリペプチド、サルコスパン、ユートロフィン、マイクロジストロフィン、ラミニン－α２、α－サルコグリカン、β－サルコグリカン、γ－サルコグリカン、δ－サルコグリカン、ＩＧＦ－１、ミオスタチンもしくはミオスタチンプロペプチドに対する抗体もしくは抗体断片、および／またはミオスタチンに対するＲＮＡｉをコードする異種核酸を含む、方法を提供する。特定の実施形態では、ウイルスベクターは、本明細書の他の場所に記載されている骨格、横隔膜および／または心筋に投与することができる。
あるいは、本開示を実行すれば、核酸を骨格、心または横隔膜筋に送達することができ、これらの筋肉は、障害（例えば、糖尿病［例えば、インスリン］、血友病［例えば、第ＩＸ因子または第ＶＩＩＩ因子］などの代謝障害、ムコ多糖症障害［例えば、スライ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラーシャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリッポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトーラミー症候群、等］、またはゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］もしくはファブリー病［α－ガラクトシダーゼＡ］などのリソソーム貯蔵障害またはポンペ病［リソソーム酸α－グルコシダーゼ］など糖原貯蔵障害）を処置するおよび／または予防するために、血液中を正常に循環しているポリペプチド（例えば、酵素）または機能的ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の産生のためのまたは他の組織への全身送達のためのプラットフォームとして使用される。代謝障害を処置するおよび／または予防するのに適した他のタンパク質は本明細書に記載されている。目的の核酸を発現するためのプラットフォームとしての筋肉の使用は、米国特許出願公開第２００２／０１９２１８９号に記載されている。
したがって、一態様として、本開示は、それを必要とする対象において代謝障害を処置するおよび／または予防する方法であって、本開示の処置または予防有効量のウイルスベクターを対象の骨格筋に投与することを含み、ウイルスベクターがポリペプチドをコードする異種核酸を含み、代謝障害がポリペプチドの欠乏および／または欠損の結果である方法をさらに包含する。説明的な代謝障害およびポリペプチドをコードする異種核酸は本明細書に記載されている。任意選択で、ポリペプチドは分泌される（例えば、その天然状態では分泌ポリペプチドであるまたは、例えば、当技術分野で公知の分泌シグナル配列に、作動可能に付随させることにより分泌されるように操作されているポリペプチド）。いかなる特定の理論にも限定されることなく、本実施形態に従えば、骨格筋への投与により、ポリペプチドを全身循環中に分泌され、標的組織（複数可）に送達することができる。ウイルスベクターを骨格筋に送達する方法は本明細書にさらに詳細に記載される。
本開示を実行すれば、全身送達のためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉまたは他の機能的ＲＮＡ（例えば、リボザイム）も産生できる。
本開示は、それを必要とする対象において先天性心不全またはＰＡＤを処置するおよび／または予防する方法であって、本開示の処置または予防有効量のウイルスベクターを哺乳動物対象に投与することを含み、ウイルスベクターが、例えば、筋形質小胞体（ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ ｅｎｄｏｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、血管新生因子、ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－１）およびその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバンＳ１６Ｅなどのホスホランバン阻害性もしくはドミナントネガティブ分子、ホスホランバン遺伝子を調節する亜鉛フィンガータンパク質、β２－アドレナリン受容体、β２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ＰＩ３キナーゼ、カルサルカン（ｃａｌｓａｒｃａｎ）、β－アドレナリン受容体キナーゼ阻害因子（βＡＲＫｃｔ）、タンパク質ホスファターゼ１の阻害因子１およびその断片（例えば、Ｉ１Ｃ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、切詰め型の構成的に活性なｂＡＲＫｃｔ、Ｐｉｍ－１、ＰＧＣ－１α、ＳＯＤ－１、ＳＯＤ－２、ＥＣ－ＳＯＤ、カリクレイン、ＨＩＦ、チモシン－β４、ｍｉｒ－１、ｍｉｒ－１３３、ｍｉｒ－２０６、ｍｉｒ－２０８および／またはｍｉｒ－２６ａなどのＧタンパク質共役受容体キナーゼ２型ノックダウンをもたらす分子をコードする異種核酸を含む方法も提供する。
注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液、注射に先立って液体中の溶液もしくは懸濁液に適した固体形態として、または乳状液として、従来の形態で調製することができる。あるいは、本開示のウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを、全身的というより局所的様式で、例えば、デポーまたは徐放性製剤で投与してもよい。さらに、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、外科的に移植可能なマトリックスに付着させて送達することができる（例えば、米国特許出願公開第２００４－００１３６４５－Ａ１号に記載される通りに）。
本明細書に開示されるウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、任意の適切な手段により、任意選択で、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを含む呼吸用粒子のエアゾール懸濁液を投与することにより、対象の肺に投与することができ、これを対象は吸い込む。呼吸用粒子は液体または固体が可能である。ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドを含む液体粒子のエアゾールは、当業者には公知であるように、圧力駆動エアゾールネブライザーまたは超音波ネブライザーを用いてなどの任意の適切な手段により作製してもよい。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。ウイルスベクターおよび／またはカプシドを含む固体粒子のエアゾールは同様に、製薬分野で公知の技法により、任意の固体微粒子薬剤エアゾール発生器を用いて作製してもよい。
ウイルスベクターおよびウイルスカプシドは、ＣＮＳ（例えば、脳、眼）の組織に投与することができ、本開示がない場合に観察されると考えられるよりも広いウイルスベクターまたはカプシドの分布が有利に生じうる。
特定の実施形態では、本開示の送達ベクターを投与して、遺伝性障害、神経変性障害、精神障害および腫瘍を含む、ＣＮＳの疾患を処置してもよい。ＣＮＳの説明的な疾患は、これらに限定されないが、アルツハイマー病、バッテン病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、ゴーシェ病、リー症候群、ハンター症候群、レフサム病、トゥレット症候群、原発性側索硬化症、筋委縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、サンフィリポ症候群、アンジェルマン症候群、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊髄または頭部損傷に起因する精神的外傷、フリードライヒ運動失調症、テイサックス病、レッシュナイハン症候群（Ｌｅｓｃｈ－Ｎｙａｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、癲癇、脳梗塞、気分障害（例えば、うつ病、双極性感情障害、持続性感情障害、二次気分障害）を含む精神障害、精神分裂病、薬物依存（例えば、アルコール依存症および他の物質依存症）、ノイローゼ（例えば、不安、強迫観念障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、産後うつ病）、精神病（例えば、幻覚および妄想）、痴呆、パラノイア、注意欠陥障害、性心理障害（ｐｓｙｃｈｏｓｅｘｕａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）、睡眠障害、疼痛性障害、摂食または体重障害（例えば、肥満、悪液質、神経性食欲不振症、および過食症）ならびにＣＮＳのがんおよび腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）を含む。
ＣＮＳの障害は、網膜、後方路、および視神経（例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症および他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性、緑内障）を含む目の障害を含む。
すべてではないにしても大半の眼の疾患および障害は、３種の徴候：（１）血管新生、（２）炎症、および（３）変性のうちの１つまたは複数を伴う。本開示の送達ベクターを用いれば、抗血管新生因子；抗炎症性因子；細胞変性を遅延させ、細胞温存を促進し、または細胞成長を促進する因子および前述の組合せを送達することができる。
糖尿病性網膜症は、例えば、血管新生を特徴とする。糖尿病性網膜症は、１つまたは複数の抗血管新生因子を、眼内に（例えば、硝子体に）または眼周囲に（例えば、テノン嚢下領域に）送達することにより処置可能である。１つまたは複数の神経栄養因子も、眼内に（例えば、硝子体内に）または眼周囲に同時送達してもよい。
ブドウ膜炎は炎症を含む。１つまたは複数の抗炎症性因子は、本開示の送達ベクターの眼内（例えば、硝子体または前眼房）投与により投与することができる。
網膜色素変性症は、対照的に、網膜変性症を特徴とする。代表的な実施形態では、網膜色素変性症は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼内（例えば、硝子体）投与により処置することができる。
加齢性黄斑変性は、血管新生と網膜変性の両方を含む。この障害は、１つもしくは複数の神経栄養因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内（例えば、硝子体）におよび／または１つもしくは複数の抗血管新生因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内にもしくは眼周囲に（例えば、テノン嚢下領域に）投与することにより処置することができる。
緑内障は、眼圧の増加および網膜神経節細胞の喪失を特徴とする。緑内障のための処置は、本発明の送達ベクターを使用して興奮毒性損傷から細胞を防御する１つまたは複数の神経保護薬の投与を含む。そのような薬剤は、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパルテート（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカイン、および神経栄養因子を含み、眼内に、任意選択で、硝子体内に、送達される。
他の実施形態では、本開示を使用して、例えば、発作の発症、発生率または重症度を低減するために、発作を処置してもよい。発作のための治療的処置の効率は、行動学的手段（例えば、揺れ、眼または口のチック（ｔｉｃｋｓ））および／または電子写真方式（大半の発作はシグネチャ電子写真異常を有する）により評価することができる。したがって、本開示を使用すれば癲癇も処置することができ、癲癇は長い時間をかけた複数の発作を特色とする。
一つの代表的実施形態では、ソマトスタチン（またはその活性断片）は、本開示の送達ベクターを使用して脳に投与され、下垂体腫瘍を処置する。この実施形態に従えば、ソマトスタチン（またはその活性断片）をコードする送達ベクターは、下垂体中への微量注入法により投与される。同様に、そのような処置を使用すれば、先端巨大症（下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を処置することができる。ソマトスタチンの核酸（例えば、ジェンバンク受託番号Ｊ００３０６）およびアミノ酸（例えば、ジェンバンク受託番号Ｐ０１１６６；処理された活性ペプチドソマトスタチン－２８およびソマトスタチン－１４を含有する）配列は当技術分野では公知である。
特定の実施形態では、ベクターは、米国特許第７，０７１，１７２号に記載の分泌シグナルを含むことができる。
代表的な実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはウイルスカプシドは、ＣＮＳに（例えば、脳にまたは眼に）投与される。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭、側頭、頭頂および前頭葉を含む大脳、大脳皮質、大脳基底核、海馬、ならびに偏桃体）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、および下丘中に導入してもよい。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、網膜、角膜および／または視神経などの眼の異なる領域にも投与してよい。
ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、送達ベクターのさらに分散した投与のために脳脊髄液中に送達してもよい（例えば、腰椎穿刺により）。ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、血液脳関門が乱されている状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）でＣＮＳにさらに血管内投与してもよい。
ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、これらに限定されないが、くも膜下腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下で）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）および眼周囲（例えば、テノン嚢下領域）送達ならびに運動ニューロンへの逆行送達での筋肉内送達を含む、当技術分野で公知の任意の経路によりＣＮＳの所望の領域（複数可）に投与することができる。
特定の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、ＣＮＳにおいて所望の領域または区画に直接注射（例えば、定位的注入）により液体製剤で投与される。他の実施形態では、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、所望の領域への局所的適用によりまたはエアロゾル製剤の鼻腔内投与により提供してもよい。眼への投与は、液滴の局所的適用によるものでもよい。さらなる代案として、ウイルスベクターおよび／またはカプシドは、固体緩効性製剤として投与してもよい（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号参照）。
さらに追加の実施形態では、ウイルスベクターは、運動ニューロンを含む疾患および障害（例えば、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、等）を処置するおよび／または予防するための逆行輸送に使用することができる。例えば、ウイルスベクターは筋肉組織に送達することができ、そこからウイルスベクターはニューロン内に移動することができる。
［実施例１］突然変異体ＡＡＶカプシドの抗体回避能力の評価
抗体ＨＬ２３７２のフットプリントに無作為化された改変のある配列のライブラリーを作製し、複製可能ＡＡＶ粒子を産生する能力についてスクリーニングし、ＤＮＡを適切に折り畳みも、組み立ても、パッケージもしないことがある存続不能な配列をふるい落とした。抗体ＨＬ２３７２による結合を回避することができる配列で、集合してゲノムパッケージング粒子になることができる配列を含む複製可能ＡＡＶ突然変異体を選択し作製した。本明細書に開示される方法から同定され、抗体ＨＬ２３７２のフットプリントにおいて改変され、したがって、抗体ＨＬ２３７２による結合を回避することができる存続可能なカプシド配列は図１に示されている。下線を施された残基は、野生型ＡＡＶ８配列（配列番号８）のその位置に適合している。突然変異した残基はＰ６６１、Ｔ６６２、Ｑ６６６、Ｓ６６７、Ｎ６７０である。それぞれの位置で無作為化されたＡＡＶカプシドライブラリーの選択に続いて進化された異なるアミノ酸残基は強調されている。突然変異した残基は、野生型ＡＡＶ配列と比べて類似するウイルス粒子数を生じるように進化させた。
緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列をパッケージする例示的なＡＡＶ突然変異体（例えば、ｈｉＡ、ｈｉＣ、およびｘｘ１カプシド配列を含む）は、図２に示すように、漸増濃度量の中和抗体ＨＬ２３７２（倍希釈度として示されている）と一緒にさらにインキュベートした。アミノ酸配列の野生型バージョンを含有するカプシドは高度に希釈された試料（１対４４８０）において容易に中和され；培養細胞中のＧＦＰ発現（白色点）は著しく減少した。これとは対照的に、ＧＦＰ発現はロバストだったので、突然変異体ｈｉＡおよびｈｉＣならびに程度は少ないがｘｘ１は中和されず、これらの進化した変異体はＨＬ２３７２を回避するという考えを支持していた。これらの結果から、この表面モチーフでの新しいアミノ酸残基の進化は、ＡＡＶカプシドに対する中和抗体を回避することができる新規の合成ＡＡＶ変異体を生じることが確かめられる。
［実施例２］ｒＡＡＶ粒子上での抗原フットプリントの作成
ＡＡＶ８およびＡＡＶ９カプシドの発現および精製：組換えＡＡＶ８およびＡＡＶ９ウイルス様粒子（ＶＬＰ）は、以前報告された通りに（Ｌａｎｅ ｅｔ ａｌ．２００５；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２００９）、Ｂａｃ－ｔｏ－Ｂａｃバキュロウイルス－Ｓｆ９昆虫細胞発現系（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して発現させ、２０％のスクロースクッション続いてスクロース勾配（５～４０％［ｗｔ／ｖｏｌ］）を使用して精製した。精製されたＡＡＶ８およびＡＡＶ９ ＶＬＰは、１～３ｍｇ／ｍｌまで濃縮され、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．４中にバッファー交換した。試料の濃度は、光学密度測定（ｍｇ／ｍｌでの計算ではＯＤ２８０およびＥ＝１．７を使用して）、ならびにＢＳＡ濃度標準のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動により評価した。使用に先立って、ＶＬＰの純度および完全性も、それぞれＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび陰性染色ＥＭによりモニターした。
ＡＡＶカプシド特異的モノクローナル抗体の産生：生後６週間のメスＢＡＬＢ／ＣＢｙｊマウスを、５、１０、２５、５０または７５μｇのＡＡＶカプシドの皮下注射を２１日間の間隔で３回、最後のブーストとして１２０日目に１回腹腔内注射を用いて免疫した。最初の３回の皮下注射はＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添え、このシステムは０．５ｍｇのモノホスホリルリピドＡ、４４μｌのスクアレン油中０．５ｍｇの合成トレハロースジコリノミコラート、０．２％のＴＷＥＥＮ８０および水を含有する。免疫動物からの試験出血は、動物管理プロトコールに従って、すべてのブースター注射の１０～１４日後に得た。収集した血清は、下に記載されるＥＬＩＳＡおよびドットブロット（無傷のカプシドに対して）アッセイを使用して高特異的抗体応答について試験した。最終ブースト注射の４日後、免疫マウスの脾細胞を、融剤として５０％のＰＥＧ １５００（ポリエチレングリコール）を使用してマウス骨髄腫Ｓｐ２／０細胞と融合させた。融合ハイブリッドは、ＨＡＴ（ヒポキサンチンアミノプテリンチミジン）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）補充ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養して、非融合骨髄腫細胞をなくした。もっとも高い特異的抗ＡＡＶカプシド抗体応答のある、陽性ハイブリドーマクローンを得るため、下に記載される通りに、得られたハイブリドーマ細胞由来の上澄みを収集し全部で５ラウンドのＥＬＩＳＡアッセイによりスクリーニングした。
ＶＬＰ ＥＬＩＳＡを使用するマウス血清またはハイブリドーマ上澄みのスクリーニング：ハイブリドーマの上澄みを、ＡＡＶ８およびＡＡＶ９ウイルス様粒子（ＶＬＰ）ＥＬＩＳＡアッセイを使用してスクリーニングした。手短に言えば、Ｎｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ ９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）を、それぞれのＥＬＩＳＡアッセイに先立って４℃ Ｏ／ＮでＡＡＶ ＶＬＰを用いて被覆した。次に、プレートは室温で１時間、ＰＢＳ中１％のＢＳＡで遮断し、次に洗浄バッファー（１×ＰＢＳと０．５％のＴｗｅｅｎ２０）で洗浄した。免疫されたマウス血清またはハイブリドーマ上澄みをプレートに適用し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、二次抗体であるウサギ抗マウスＩｇＧ全分子ＡＰ（アルカリホスファターゼ）、ヤギ抗マウスＩｇＧガンマ鎖特異的ＡＰ、またはヤギ抗マウスＩｇＭミュー鎖特異的ＡＰ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を室温で１時間、それぞれ１％のＢＳＡを含むＰＢＳ中１対１０００、１対４０００、および１対４０００希釈度で添加した。最後に、数回の洗浄後、基質であるｐ－ニトロフェニルホスフェート二ナトリウム（Ｓｉｇｍａ）をプレートに適用し、１時間インキュベートし、次に、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ３８４ Ｐｌｕｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用して４０５ｎｍで光学密度読みを読み取った。
抗ＡＡＶ ＶＬＰドットブロット分析：ＡＡＶ ＶＬＰをドットブロットマニフォールド（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ、Ｄａｓｓｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ）において支持されたニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）上に吸着させておいた。過剰な液体は減圧濾過により膜を通じて引き抜いた。膜はマニフォールドから取り除き、ＰＢＳ中１０％の牛乳で、ｐＨ７．４、１時間遮断した。抗ＡＡＶマウス血清、ハイブリドーマ上澄み、または精製されたＭａｂの形態での一次抗体は、試験している試料に応じて異なる希釈度で、５％牛乳を含むＰＢＳ中膜に適用し、１時間インキュベートした。これに続いて、膜はＰＢＳで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）連結二次抗体は、ＰＢＳ中１対５０００の希釈度で適用し、１時間インキュベートした。膜はＰＢＳで洗浄し、次に、Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＷＡ）を膜に適用し、シグナルはＸ線フィルム上で検出した。Ｂ１抗体は、ＡＡＶ４を除いてすべてのＡＡＶ血清型においてウイルスカプシドタンパク質のＣ終端に結合する（Ｗｉｓｔｕｂａ ｅｔ ａｌ．１９９５）が、対照として使用して、変性カプシド（煮沸しブロットした）を使用してＡＡＶカプシドタンパク質の存在を確かめた。ＡＤＫ８およびＡＤＫ９（Ｓｏｎｎｔａｇ ｅｔ ａｌ．２０１１）はそれぞれＡＡＶ８およびＡＡＶ９についての陽性対照として使用して、無傷（煮沸していない）のカプシドにおいて検出した。
抗ＡＡＶ ＭＡｂについてのアイソタイプの決定：新たに産生された抗ＡＡＶ抗体のアイソタイプはＩｓｏＳｔｒｉｐマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）を使用して決定した。ハイブリドーマ細胞培養物の上澄みは、上澄み中の抗体の濃度に応じてＰＢＳ中で１対１０～１対１００まで希釈した。希釈した試料は、キット中に提供される開発チューブ（ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｔｕｂｅ）上にローディングし、３０秒間インキュベートした。１つのアイソタイピングストライプをそれぞれの開発チューブに置き、その位置がＭＡｂのアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＭまたはＩｇＡ）および軽鎖タイプ（カッパまたはラムダ）を示す青色バンドの出現まで５～１０分間インキュベートした。
中和アッセイ：新たに産生された抗ＡＡＶ８および抗ＡＡＶ９抗体の中和能力はＨｅＬａ細胞においてアッセイした（Ｖｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１２；１８８：６４１８－６４２４）。手短に言えば、ルシフェラーゼ遺伝子をパッケージした組換えｒＡＡＶ８－ＬｕｃまたはｒＡＡＶ９－Ｌｕｃベクターを容積比１対１で異なるハイブリドーマ上澄みと混合し、次に、これを使用して１０，０００ ＭＯＩ（感染多重度）でＨｅＬａ細胞に感染させた。２４時間後、細胞を溶解し、発現されたルシフェラーゼ活性は、ルシフェラーゼアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を製造業者のプロトコールに記載される通りに使用して複合体ごとにアッセイした。このアッセイでは、ＡＡＶ４を特異的に認識するＭＡｂであるＡＤＫ４（Ｋｕｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００７；１４０：１７－２４）は負の対照として使用し、ＡＤＫ８およびＡＤＫ９は、それぞれＡＡＶ８（Ｇｕｒｄａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１２；８６：７７３９－７７５１）およびＡＡＶ９（Ｓｏｎｎｔａｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２０１１；８５：１２６８６－１２６９７）による感染を中和することが知られているが、正の対照として使用した。
抗原フットプリントの同定：精製されたＦＡｂは、カプシド上のＶＰ結合部位あたり１～２リガンド分子の比でＡＡＶウイルス様粒子（ＶＬＰ）と複合体化して、６０～１２０対１のリガンド対カプシドモル比を得た。これらの複合体を使用して、ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ ＴＦ２０電子顕微鏡上で低温電子顕微鏡データを収集した。個々の複合体画像は分離し、単一粒子再構築のために使用した。再構築された密度マップは、ウイルスカプシドの入手可能な結晶構造および一般的なＦＡｂ構造を使用して解釈し、これら２つの構造を複合体密度マップにドッキングさせて、２つのモデルの間の境界面を分析した。抗体フットプリントは、相互作用している残基を視覚化することにより同定し、続いて変異誘発により確認した。
結果：図３は、ＨＬ抗体の交差反応性を示している。異なるＡＡＶカプシドを示される順にドットブロット膜上にローディングし、タンパク質の存在は、変性ＶＰを認識するＢ１抗体による検出により確かめた。同じローディングパターンを使用して、異なるＡＡＶ血清型のカプシドもＨＬ２３７２抗体により検出した。ＡＡＶ８およびＡＡＶ９のみが反応した。
インビトロ中和アッセイでは、ｒＡＡＶ９の形質導入効率は、以下の抗体：ＨＬ２３６８、ＨＬ２３７０、ＨＬ２３７２、およびＨＬ２３７４により減少することが分かった（図４）。それぞれＡＤＫ４抗体は負の対照として使用し、ＡＤＫ９抗体は正の対照として使用した。
インビボで試験した場合、ＨＬ２３７０、ＨＬ２３７２、およびＨＬ２３７４は、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの肝臓、脾臓、および心臓において形質導入効率の減少を引き起こした（図５）。
図６Ａ～６Ｂは、それぞれ、ＨＬ２３７２とＡＡＶ８ ＶＬＰ、およびＨＬ２３７２とＡＡＶ９ ＶＬＰの複合体から得られたＨＬ２３７２抗体の抗原フットプリントを示している。抗体と、作製されたＡＡＶ ＶＬＰの他の複合体についてのフットプリントは表５に見出せる。
他の実施形態
本明細書で開示される特長のすべてはいかなる組み合わせで組み合わせてもよい。本明細書で開示されるそれぞれの特長は、同じ、等価な、または類似する目的にかなう別の特長により置き換えてもよい。したがって、別段明白に述べられなければ、開示されるそれぞれの特長は一般的な一連の等価なまたは類似する特長の例にすぎない。
上記の記載から、当業者であれば、本開示の本質的な特徴を容易に確かめることができ、その精神と範囲から逸脱することなく、本開示の種々の変化および改変を加えて本開示を種々の利用および条件に適合させることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内である。
前述のものは本発明を説明しており、それを限定するものと解釈するべきではない。本発明は以下の特許請求の範囲により定義され、特許請求の範囲の均等物も本発明に含まれる。さらなる詳細なしで、当業者であれば、上記の記載に基づいて、本開示をその最大限まで利用することができると考えられる。本明細書に記載される特定の実施形態は、したがって、説明的なものにすぎず、本開示の残りを何一つ限定しないと解釈されるべきである。本明細書に引用されるすべての刊行物は、本明細書で参照される目的または主題のために引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
出願時の特許請求の範囲は、以下の通り。
［請求項１］
配列番号８として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸位６６１～６７０（ＶＰ１番号付け）に対応し、配列番号２６として特定されるＡＡＶ９の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸位６５９～６６８（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸に、または他の任意のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における等価なアミノ酸位に、アミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４－Ｋ－Ｌ－Ｘ５（配列番号１９７）を生じる置換を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、
Ｘ１はＰ以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ２はＴ以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ３はＱ以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ４はＳ以外の任意のアミノ酸であり；および／または
Ｘ５はＮ以外の任意のアミノ酸である、
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質。
［請求項２］
Ｘ１がＶ、Ｉ、Ｑ、Ｓ、Ｆ、Ｒ、またはＷである、請求項１に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項３］
Ｘ２がＧ、Ｓ、Ｌ、Ｖ、Ｃ、Ｄ、Ｒ、Ｉ、またはＰである、請求項１または２のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項４］
Ｘ３がＥ、Ｐ、Ｃ、Ｓ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｌ、Ｎ、Ｖ、またはＡである、請求項１～３のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項５］
Ｘ４がＰ、Ｑ、Ｇ、Ｒ、Ｄ、Ｃ、Ａ、Ｍ、Ｈ、またはＴである、請求項１～４のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項６］
Ｘ５がＨ、Ｍ、Ｗ、Ｃ、Ｆ、Ａ、Ｑ、Ｇ、Ｐ、Ｓ、Ｋ、Ｗ、またはＲである、請求項１～５のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項７］
配列番号８として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸位６６１～６７０（ＶＰ１番号付け）に対応し、配列番号２６として特定されるＡＡＶ９の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸位６５９～６６８（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸に、または他の任意のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における等価なアミノ酸位に、アミノ酸配列：ＶＧＴＦＮＥＡＫＬＨ（ｈ１；配列番号１６６）、ＶＳＴＦＮＰＡＫＬＭ（ｈ９；配列番号１６７）、ＰＬＴＦＮＣＣＫＬＮ（ｄ５；配列番号１６８）、ＰＶＴＦＮＱＤＫＬＷ（ｄ４；配列番号１６９）、ＰＶＴＦＮＳＧＫＬＣ（ｈ６；配列番号１７０）、ＩＧＴＦＮＧＱＫＬＣ（ｈ４；配列番号１７１）、ＱＶＴＦＮＧＧＫＬＦ（ｈ５；配列番号１７２）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＷ（ｈ３；配列番号１７３）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＡ（ｈ８；配列番号１７４）、ＰＧＴＦＮＲＧＫＬＱ（ｈ７；配列番号１７５）、ＰＧＴＦＮＤＧＫＬＧ（ｄ６；配列番号１７６）、ＰＳＴＦＮＣＭＫＬＰ（ｈ２；配列番号１７７）、ＰＳＴＦＮＣＰＫＬＱ（ｈ１１；配列番号１７８）、ＰＳＴＦＮＬＧＫＬＳ（ｄ１；配列番号１７９）、ＰＳＴＦＮＧＧＫＬＰ（ｄ７；配列番号１８０）、ＳＣＴＦＮＬＨＫＬＣ（ｈ１２；配列番号１８１）、ＱＤＴＦＮＲＴＫＬＣ（ｈ１０；配列番号１８２）、ＰＴＴＦＮＲＴＫＬＭ（ｄ３；配列番号１８３）、ＦＶＴＦＮＧＤＫＬＭ（ｘｘ４；配列番号１８４）、ＲＲＴＦＮＳＲＫＬＫ（ｘｘ２；配列番号１８５）、ＳＶＴＦＮＳＡＫＬＱ（ｅ２；配列番号１８６）、ＶＬＴＦＮＧＳＫＬＡ（ｅ１；配列番号１８７）、ＰＴＴＦＮＰＳＫＬＷ（ｘｘ３；配列番号１８８）、ＰＶＴＦＮＥＧＫＬＦ（ｅ３；配列番号１８９）、ＰＴＴＦＮＱＧＫＬＱ（ｅ５；配列番号１９０）、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＧ（ｘｘ１；配列番号１９１）、ＰＬＴＦＮＮＧＫＬＳ（ｘｘ５；配列番号１９２）、ＲＳＴＦＮＧＤＫＬＮ（ｈｉ－Ｃ；配列番号１９３）、ＰＴＴＦＮＶＤＫＬＧ（ｈｉ－Ａ；配列番号１９４）、ＰＩＴＦＮＥＰＫＬＡ（ｈｉ－Ｂ；配列番号１９５）、またはＷＰＴＦＮＡＧＫＬＲ（ｈｉ－ｅ；配列番号１９６）を生じる置換を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質。
［請求項８］
前記置換がＲＳＴＦＮＧＤＫＬＮ（ｈｉ－Ｃ；配列番号１９３）である、請求項７に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項９］
配列番号８として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸位６６１～６６７（ＶＰ１番号付け）に対応し、配列番号２６として特定されるＡＡＶ９の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ９カプシドタンパク質のアミノ酸位６５９～６６５（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸に、または他の任意のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質において等価なアミノ酸位に、アミノ酸配列：Ｘ１－Ｘ２－Ｔ－Ｆ－Ｎ－Ｘ３－Ｘ４（配列番号１９８）を生じる置換を含むＡＡＶカプシドタンパク質であって、
Ｘ１はＰ以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ２はＴ以外の任意のアミノ酸であり；
Ｘ３はＱ以外の任意のアミノ酸であり；および／または
Ｘ４はＳ以外の任意のアミノ酸である
ＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項１０］
Ｘ１のうちの少なくとも１つがＲであり、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＧであり、および／またはＸ４がＤである、請求項９に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項１１］
Ｘ１がＲであり、Ｘ２がＳであり、Ｘ３がＧであり、およびＸ４がＤである、請求項９に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項１２］
改変５回領域を含み、前記改変５回領域が１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）カプシドタンパク質。
［請求項１３］
前記ｒＡＡＶカプシドタンパク質の前記改変５回領域における前記１つまたは複数のアミノ酸置換により、改変５回領域のないカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子と比べて、中和抗体に対する反応性が減少しているＡＡＶ粒子が生じる、請求項１２に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶ粒子。
［請求項１４］
ｒＡＡＶが血清型１のものであり、前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号１８として特定されるＡＡＶ１の参照アミノ酸配列に基づいて位置２５０～２５８、３２４～３３３、３７１、３７２、５４６～５５０、５５７、６５５～６７４、または７１６～７２１（ＶＰ１番号付け）にある、請求項１２または１３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項１５］
ｒＡＡＶが血清型２のものであり、前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号１９として特定されるＡＡＶ２の参照アミノ酸配列に基づいて位置２５０～２５８、３２３～３３２、３７０、３７１、５４５～５４８、５５６、６５５～６７３、または７１５～７２０（ＶＰ１番号付け）にある、請求項１２または１３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項１６］
ｒＡＡＶが血清型５のものであり、前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号２２として特定されるＡＡＶ５の参照アミノ酸配列に基づいて位置２４０～２４８、３１４～３２３、３７２、３７３、５３２～５３５、５４６、６４４～６６２、または７０４～７０９（ＶＰ１番号付け）にある、請求項１２または１３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項１７］
前記中和抗体がＡＶＢである、請求項１４～１６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項１８］
ｒＡＡＶが血清型９のものであり、前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号２６として特定されるＡＡＶ９の参照アミノ酸配列に基づいて位置２５１～２５５、２６４、３２５～３３４、または６５６～６７４（ＶＰ１番号付け）にある、請求項１２または１３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項１９］
前記中和抗体がＣＳＡＬ９である、請求項１８に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項２０］
ｒＡＡＶが血清型８のものであり、前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号２５として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて位置２５２～２６６、３２６～３３５、６５８～６７６または７２０（ＶＰ１番号付け）にある、請求項１２または１３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項２１］
ｒＡＡＶが血清型９のものであり、前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号２６として特定されるＡＡＶ９の参照アミノ酸配列に基づいて位置２５１～２６６、３２５～３３４、６５７～６７３または７１８（ＶＰ１番号付け）にある、請求項１２または１３に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項２２］
前記中和抗体がＨＬ２３７２である、請求項２０または２１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項２３］
ｒＡＡＶが血清型５のものであり、前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号２２として提供されるＡＡＶ５の参照アミノ酸配列に基づいて位置２１８、２４０～２５８、２６１、２６３、２６７、２７９、３３１、３５０、３５５～３６０、３６４、３６５、３７７、３７８、３９５、４２９～４３２、４３７、４５０、４５１、４５３～４５６、４５８、４５９、５３０～５４３、５４５～５４８、６３９、６４１、６４２、６４８～６５１、６５３～６５８、６６０～６６２、６９７～７００、または７０４～７１２（ＶＰ１番号付け）にある、請求項１２または１３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項２４］
前記中和抗体がＡＤＫ５ａである、請求項２３に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項２５］
ｒＡＡＶが血清型５のものであり、前記１つまたは複数のアミノ酸置換が、配列番号２２として提供されるＡＡＶ５の参照アミノ酸配列に基づいて位置２４１～２４８、３１３～３１９、３２１、３２３、３５５、３５６、３５８～３６２、４４０～４４３、４４６～４４９、５３０～５４８、６４５～６５１、６５３～６６１、６９７、６９８、および７０４～７１２（ＶＰ１番号付け）にある、請求項１２または１３に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項２６］
前記中和抗体がＡＤＫ５ｂである、請求項２５に記載のｒＡＡＶカプシドタンパク質。
［請求項２７］
請求項１～２６のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド。
［請求項２８］
請求項２７に記載のＡＡＶカプシドを含むＡＡＶウイルス粒子。
［請求項２９］
（ａ）請求項２７に記載のＡＡＶカプシド、および
（ｂ）少なくとも１つの末端反復配列を含む核酸であって、前記ＡＡＶカプシドによりカプセル化されている核酸
を含むウイルスベクター。
［請求項３０］
前記核酸が、治療タンパク質または治療ＲＮＡをコードする配列を含む、請求項２９に記載のウイルスベクター。
［請求項３１］
前記ウイルスベクターが、その親ＡＡＶ血清型とは免疫学的に異なっており、前記親血清型に結合する抗体により認識されない、請求項２９に記載のウイルスベクター。
［請求項３２］
請求項１～２６のいずれか１項に記載のＡＡＶカプシドタンパク質、請求項２７に記載のＡＡＶカプシド、請求項２８に記載のＡＡＶウイルス粒子、および／または請求項２９～３１に記載のウイルスベクターを、薬学的に許容される担体中に含む組成物。
［請求項３３］
細胞に核酸を投与する方法であって、前記細胞を、請求項２９～３１のいずれか１項に記載のウイルスベクターまたは請求項３２に記載の組成物に接触させるステップを含む方法。
［請求項３４］
核酸を対象に送達する方法であって、請求項２５もしくは２６に記載のウイルスベクターまたは請求項２７に記載の組成物を前記対象に投与するステップを含む方法。
［請求項３５］
前記対象がヒト対象である、請求項３４に記載の方法。
配列
ＡＡＶ１カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＡＡＤ２７７５７）（配列番号１）
ＡＡＶ２カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＹＰ＿６８０４２６）（配列番号２）
ＡＡＶ３カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＡＡＣ５５０４９）（配列番号３）
ＡＡＶ４カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＮＰ＿０４４９２７）（配列番号４）
ＡＡＶ５カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＡＡＤ１３７５６）（配列番号５）
ＡＡＶ６カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＡＡＢ９５４５０）（配列番号６）
ＡＡＶ７カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＡＡＮ０３８５５）（配列番号７）
ＡＡＶ８カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＡＡＮ０３８５７）（配列番号８）
ＡＡＶ９カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＡＡＳ９９２６４）（配列番号９）
ＡＡＶｒｈ．８カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＡＡＯ８８１８３）（配列番号１０）
ＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＡＡＯ８８２０１）（配列番号１１）
ＡＡＶ１０カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＡＡＴ４６３３７）（配列番号１２）
ＡＡＶ１１カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＡＡＴ４６３３９）（配列番号１３）
ＡＡＶ１２カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＡＢＩ１６６３９）（配列番号１４）
ＡＡＶｒｈ．３２．３３カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＡＣＢ５５３１８）（配列番号１５）
ウシＡＡＶカプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＹＰ＿０２４９７１）（配列番号１６）
トリＡＡＶ ＡＴＣＣ ＶＲ－８６５カプシドタンパク質（ジェンバンク受託番号ＮＰ＿８５２７８１）（配列番号１７）
ＡＡＶ１ ＶＰ１カプシドタンパク質配列の例
ＡＡＶ２ ＶＰ１カプシドタンパク質配列の例
ＡＡＶ３ ＶＰ１カプシドタンパク質配列の例
ＡＡＶ４ ＶＰ１カプシドタンパク質配列の例
ＡＡＶ５ ＶＰ１カプシドタンパク質配列の例
ＡＡＶ６ ＶＰ１カプシドタンパク質配列の例
ＡＡＶ７ ＶＰ１カプシドタンパク質配列の例
ＡＡＶ８ ＶＰ１カプシドタンパク質配列の例
ＡＡＶ９ ＶＰ１カプシドタンパク質配列の例
ＡＡＶ１０ ＶＰ１カプシドタンパク質配列の例
ＡＡＶ１１ ＶＰ１カプシドタンパク質配列の例
ＡＡＶ１２ ＶＰ１カプシドタンパク質配列の例
ＡＡＶ１３ ＶＰ１カプシドタンパク質配列の例

Claims (11)

  1. 配列番号８として特定されるＡＡＶ８の参照アミノ酸配列に基づいて天然のＡＡＶ８カプシドタンパク質のアミノ酸位６６１～６７０（ＶＰ１番号付け）に対応するアミノ酸位に、ＰＧＴＦＮＧＧＫＬＧ（ｘｘ１；配列番号１９１）、ＲＳＴＦＮＧＤＫＬＮ（ｈｉ－Ｃ；配列番号１９３）、または、ＰＴＴＦＮＶＤＫＬＧ（ｈｉ－Ａ；配列番号１９４）を生じる置換を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質。
  2. 前記置換がＲＳＴＦＮＧＤＫＬＮ（ｈｉ－Ｃ；配列番号１９３）である、請求項１に記載のＡＡＶカプシドタンパク質。
  3. 請求項１または２に記載のＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶカプシド。
  4. 請求項３に記載のＡＡＶカプシドを含むＡＡＶウイルス粒子。
  5. （ａ）請求項３に記載のＡＡＶカプシド、および
    （ｂ）少なくとも１つの末端反復配列を含む核酸であって、前記ＡＡＶカプシドによりカプセル化されている核酸
    を含むウイルスベクター。
  6. 前記核酸が、治療タンパク質または治療ＲＮＡをコードする配列を含む、請求項５に記載のウイルスベクター。
  7. 前記ウイルスベクターが、その親ＡＡＶ血清型とは免疫学的に異なっており、前記親血清型に結合する抗体により認識されない、請求項５に記載のウイルスベクター。
  8. 請求項１または２に記載のＡＡＶカプシドタンパク質、請求項３に記載のＡＡＶカプシド、請求項４に記載のＡＡＶウイルス粒子、または請求項５～７のいずれか１項に記載のウイルスベクターを、薬学的に許容される担体中に含む組成物。
  9. 細胞を、請求項５～７のいずれか１項に記載のウイルスベクターまたは請求項８に記載の組成物に接触させるステップを含む細胞に核酸を投与する方法において使用するための、請求項５～７のいずれか１項に記載のウイルスベクターまたは請求項８に記載の組成物。
  10. 請求項５～７のいずれか1項に記載のウイルスベクターまたは請求項８に記載の組成物を対象に投与するステップを含む核酸を対象に送達する方法において使用するための、請求項５～７のいずれか１項に記載のウイルスベクターまたは請求項８に記載の組成物。
  11. 前記対象がヒト対象である、請求項１０に記載のウイルスベクターまたは組成物。
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