JP7406783B2 - パルボウイルスベクターの高められた送達のための改変キャプシドタンパク質 - Google Patents

パルボウイルスベクターの高められた送達のための改変キャプシドタンパク質 Download PDF

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Description

［優先権の陳述］
本出願は、２０１５年１２月１４日に出願された米国仮出願番号６２／２６６，９４１の利益を主張し、その内容全体は参照により本明細書中に援用される。
［連邦支援の陳述］
本発明は、国立保健研究機構によって授けられた助成金番号ＡＩ０８０７２６、ＤＫ０８４０３３、ＨＬ１１２７６１、ＡＩ０７２１７６、ＡＲ０６４３６９、およびＧＭ００７０５０の下での政府支援でなされた。政府は本発明における特定の権限を有する。
［本発明の分野］
本発明は、高められた形質導入効率を有する改変パルボウイルスキャプシドタンパク質、それを含むウイルスベクター、および、細胞または対象への核酸の送達のためにそれを使用する方法に関する。
組み換えアデノ付随ウイルス（ｒＡＡＶ）の様々な血清型が、現在のところ臨床試験で使用されている（例えば、リポタンパク質リパーゼ欠乏症に関してｒＡＡＶ１、レーバー先天黒内障に関してｒＡＡＶ２、血友病に関してｒＡＡＶ８）。これらのうち、ｒＡＡＶ１は、筋肉障害を直接治療するにしろ（例えば、筋ジストロフィー）、または、血流への治療的タンパク質の分泌から恩恵を受け得る症状にしろ（例えば、α－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）欠乏症）、筋肉内（ｉ．ｍ．）送達に最も良いと考えられている。この手法の主な制限は、高い投与量のｒＡＡＶの投与にもかかわらず、導入遺伝子発現のサブ治療的なレベルであった。例えば、ｒＡＡＶ－ＡＡＴ臨床試験による結果は、ｉ．ｍ．注入後のＡＡＴの血清レベルの用量依存的な増加を示すが、高い投与量コホートでは、たった約３％の標的ＡＡＴ発現が達成された。このコホートは、それぞれ１．３５ｍＬの１００回ｉ．ｍ．注入を必要とするので、疾患修正に必要な程度まで投与量を増加させることは実行可能であり得ない。同様の観察が、最近になって承認されたｒＡＡＶ１に基づく製剤、Ｇｌｙｂｅｒａに関して実証されている。ｒＡＡＶ遺伝子増強療法が、これらの場合において実用的な選択となることためには、筋組織における形質導入効率を改善することが必須である。
導入遺伝子の発現の増大に向けた試みは、ｒＡＡＶキャプシドおよび導入遺伝子自体が形質導入を高めるように改変される内因性の手法、および／または、補足の治療がｒＡＡＶ投与と同時的に送達される外因性の手法に分けることができる。免疫抑制のような外因性の手法は、形質導入を改善しているが、ｒＡＡＶ生物学の新たな知見を臨床試験デザインに統合する方法は、最も成功的な策略となっている。これは、非常に多くの天然起源のＡＡＶ血清型の開発、およびそれらの選択的な組織形質導入プロファイルによって最もよく説明される。これは、標的臓器に対するＡＡＶ血清型の正しいペアリングを可能にする（例えば、ｒＡＡＶのｉ．ｍ．送達を用いた臨床試験は、歴史的に使用されるｒＡＡＶ２とは対照的に、ｒＡＡＶ１が用いられた場合に明らかにより成功的になった）。加えて、血清型の比較による生物学的および構造的分析は、定向進化およびｒＡＡＶの合理的な工学を促進していて、次世代のトランスレーショナル（ｔｒａｎｓｌａｔｉｎａｌ）ベクターの開発を導く。
最も一般的なｒＡＡＶ血清型のキャプシド構造が解明されている。それぞれ、キャプシド表面のトポロジーを形成する大きなループが点在する保存されたβ－バレルコアからなる６０個の繰り返しモノマーを含む。ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ４の構造を比較することによって、最も少ない同質の血清型、合計９個の可変領域（ＶＲ；ＶＲＩ～ＶＲＩＸ）が同定された。ＶＲのアミノ酸含有量は、受容体結合、抗原性反応度および形質導入効率のような別個の表現型をそれぞれの血清型に寄与する。ｒＡＡＶ２（プロトタイプのｒＡＡＶ）のＶＲを、ｒＡＡＶ１のような、より効率的な筋肉トランスデューサ―と比較することは、最初の改変ｒＡＡＶキャプシドが臨床試験に入るのを導いた。ｒＡＡＶ２．５は、筋肉におけるｒＡＡＶ１の効率に対するそれらの寄与に関して単離されたｒＡＡＶ１由来の５個のアミノ酸によって移植されたｒＡＡＶ２キャプシドからなる。フォローアップ研究は、たった１つのアミノ酸変更；すなわち、２６４位の後ろに様々なアミノ酸の挿入し、それにより新規の２６５位を作成することが、筋肉におけるｒＡＡＶ２効率を著しく高めるのに必要であることを明らかにした。継続した臨床前試験は、ｒＡＡＶ２のトランスレータビリティ（ｔｒａｎｓｌａｔａｂｉｌｉｔｙ）が、ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６のような血清型の優れた効率ならびに集団内のｒＡＡＶ２中和抗体の高い普及性によって制限されることを示唆した。これらの「次世代」血清型は、キャプシド主鎖上の表面アミノ酸の調節によって、効率的な形質導入のためにさらに増大されている。
ｒＡＡＶ１は、筋骨格の適用のための上位選択となっていて、ｉ．ｍ．に基づく臨床試験全体の６７％、および、過去５年で８６％が用いられているので、ｒＡＡＶ１効率を改善することは、臨床トランスレーション（ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）にタイムリーである。本発明は、改善された特性を有し、および、遺伝子療法を含む多種多様の用途を有するベクターを生産するのに適切な、改変キャプシドタンパク質を提供する。
本研究は、筋肉形質導入を改善するために設計された工学戦略を開発するために、ｒＡＡＶキャプシド構造を分析した。ｒＡＡＶ２ ２６５挿入突然変異体に反して、ｒＡＡＶ１キャプシドからの２６５位の欠失は、筋組織における導入遺伝子の送達および発現の両方ともの最も高いレベルの上昇を提供した。さらに、ホモロジーモデリングおよび変異分析を通して、キャプシドの２つの領域が、一緒にアロステリックに作用して、ｒＡＡＶ６およびｒＡＡＶ２における形質導入効率を制御すると考えられることが同定された。結果は、水素結合パターンの破壊に起因したＶＲ１ループにおける局所的不安定化のメカニズムを与える。この知見は、それぞれの場合において、形質導入効率を少なくとも１桁高めるために、これらのさらなる血清型の合理的な突然変異を可能にした。さらに、キメラｒＡＡＶ血清型における臨床ＡＡＴ導入遺伝子の発現は、親のｒＡＡＶ１よりも１２．５倍まで発現を増加させて、臨床試験でのこれらの構築物の使用を支持した。この研究は、トランスレーショナル研究により適合した、改善された送達試薬のためのｒＡＡＶキャプシドの構造的モデリングおよび分子解剖を用いた合理的な設計方法を検証する。
本発明の一態様は、ＡＡＶ血清型またはＴ＝１の二十面体のキャプシド構造を有する任意の他のパルボウイルス由来のキャプシドタンパク質アミノ酸配列を含むパルボウイルスキャプシドタンパク質に関し、ここで、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質のアミノ酸残基２５８～２７２または別のＡＡＶまたはパルボウイルスキャプシドタンパク質由来の対応するアミノ酸残基を含む可変領域１（ＶＲ１）ループは、残基によって編成される水素結合パターンの標的化された破壊に起因してループ内に局所的不安定化を生じさせるように、１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失および／または置換によって改変されて、ここで、改変を含むキャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターに、改変を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して増大した形質導入効率を提供する。
本発明のさらなる態様は、本発明のキャプシドタンパク質に関し、ここで、キャプシドタンパク質は、ヘパリン硫酸に結合するＡＡＶ血清型または他のパルボウイルス由来のアミノ酸配列を含み、ヘパリン硫酸へのキャプシドタンパク質の結合を仲介する１つまたは複数のアミノ酸残基は、置換および／または欠失されて、ここで、ヘパリン硫酸へのキャプシドタンパク質の結合は、実質的に低減される。
本発明のさらなる態様は、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ８血清型由来のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質に関し、ヘパリン硫酸へのキャプシドタンパク質の結合を仲介する１つまたは複数のアミノ酸残基は、置換および／または欠失されて、ここで、ヘパリン硫酸へのキャプシドタンパク質の結合は、実質的に低減される。
本発明のさらなる態様は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、またはＡＡＶ３ｂ血清型由来のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質に関し、ここで、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質の残基２６４またはＡＡＶ３ａまたはＡＡＶ３ｂキャプシドタンパク質の対応する残基の直後に、１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入を含み、ヘパリン硫酸へのキャプシドタンパク質の結合を仲介する１つまたは複数のアミノ酸残基は、置換および／または欠失されて、ここで、ヘパリン硫酸へのキャプシドタンパク質の結合は、実質的に低減されて；ここで、キャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターに、非改変キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して増大した形質導入を提供する。
本発明のさらなる態様は、本発明のキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド、本発明のキャプシドタンパク質を含むパルボウイルスキャプシド、本発明のキャプシドタンパク質を含むウイルスベクター、および、本発明のウイルスベクターを含む医薬組成物に関する。
本発明の別の態様は、核酸を細胞に送達する方法に関し、当該方法は、核酸が細胞に入るのに十分な条件下で、ウイルスベクターまたは本発明の医薬組成物と細胞を接触させるステップを含む。
本発明のさらなる態様は、核酸を対象に送達する方法に関し、当該方法は、対象に、本発明のウイルスベクターまたは医薬組成物を投与するステップを含む。
本発明の別の態様は、核酸を対象に送達する方法に関し、当該方法は、核酸が細胞に入るのに十分な条件下で、本発明のウイルスベクターまたは医薬組成物と接触された細胞を、対象に投与するステップを含む。
本発明のさらなる態様は、組み換えパルボウイルス粒子を生産する方法に関し、パルボウイルス複製を許容する細胞に：（ａ）（ｉ）異種核酸および（ｉｉ）少なくとも１つの逆位末端配列を含む組み換えパルボウイルステンプレート；および、（ｂ）複製タンパク質コード配列（単数または複数）および本発明のキャプシドタンパク質をコードする配列（単数または複数）を含むポリヌクレオチドを；組み換えパルボウイルステンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件下で、提供するステップを含み；それにより、組み換えパルボウイルス粒子が、細胞内に生産される。
本発明のこれらおよび他の態様は、以下の本発明の説明により詳細に示される。
ｉ．ｍ．注入後のｒＡＡＶ１の２６５位突然変異体のインビボ特性を示す。（Ａ）マウスは、ＧＣ中に１ｅ１０ ｖｇ投与された。ルシフェラーゼ導入遺伝子発現を可視化して、７ｄｐｉに、生きた動物の生物発光イメージングを用いて定量化した。示されるユニットは、関心領域に対するカウント毎分である（ＣＰＭ／ＲＯＩ）。可視化目的のために、ｒＡＡＶ１は、２６５突然変異体とは異なるスケールで示される。このことは、イメージ定量に影響しない。形質導入表現型のエクスビボでの定量化のために（Ｂ）、注入された筋肉を摘出して溶解させて、ルシフェラーゼアッセイを組織溶解物に対して行なった。測定は、ｍｇ合計タンパク質に対して標準化された相対的な光の単位（ＲＬＵ／ｍｇタンパク質）として示した。（Ｃ）細胞あたりのウイルス導入遺伝子コピー数（ｖｇ／ｃｇ）を、ｑＰＣＲを用いて測定した。（Ｄ）発現カイネティクスの経時変化を、１ｅ１０ ｖｇの注入後に、ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌに関して行なった。全てのデータは、グループあたりｎ＝４を表わす；パネル（Ａ）では、グループあたり１つの代表的な画像が表示される。 ｒＡＡＶ６における２６５欠失突然変異体の表現型を示す。（Ａ）ｒＡＡＶ６またはｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌのいずれかの１ｅ１０ ｖｇのルシフェラーゼ導入遺伝子発現（７ｄｐｉ）。（Ｂ）ｒＡＡＶ１（薄い灰色）およびｒＡＡＶ６（濃い灰色）のＶＲ１キャプシド領域のアライメント。残基２６５は、ｒＡＡＶ１について濃い青色で、ｒＡＡＶ６について黄色で強調される。これらのキャプシドに関する利用可能な結晶学的座標を用いたＰｙＭｏｌにおいて生産された画像。（Ｃ）マウスＧＣ中への、ｒＡＡＶ１－＞ｒＡＡＶ６の点突然変異体の注入後の、導入遺伝子発現。ｒＡＡＶ６の測定された発現と比較して倍差として表されるデータ。全てのデータは、グループあたりｎ＝４を表わす。 ｒＡＡＶ６キャプシド上のアミノ酸２６５位および５３１位の可視化を示す。それぞれの二十面体の対称軸を標識した、ｒＡＡＶ６キャプシドの結晶学的座標のＰｙｍｏｌ表示（Ａ）。（Ｂ）残基２６５および５３１を紫色および橙色で塗って矢印によって示した、対称の３回軸（ｆｏｌｄ ａｘｉｓ）のクローズアップ。（Ｃ）残基２６５および５３１を紫色および橙色で塗って矢印によって示した、対称の５回軸のクローズアップ。（Ｄ）残基２６５および５３１を紫色および橙色で塗って矢印によって示した、対称の２回軸のクローズアップ。 ２６５突然変異の形質導入表現型に対するキャプシド：ヘパリン相互作用の効果を示す。（Ａ）ＧＣ中へのｒＡＡＶ２キャプシド突然変異体の導入遺伝子発現（７ｄｐｉ）。（Ｂ）対称の３回軸の関連における、残基Ｔ２６５（紫色）、Ｋ５３１（橙色）およびＲ５８５（青色）を示した、ｒＡＡＶ６キャプシドのＰｙｍｏｌ表示。破線の円は、ヘパリン結合フットプリントの一般的なアウトラインを表わす。（Ｃ）生理食塩水またはヘパリン硫酸溶液のいずれかにおけるプレインキュベーション後の、ＧＣ中に注入されたｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ１構築物の導入遺伝子発現。全てのデータは、グループあたりｎ＝４を表わす。 この試験に用いられたｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ６構築物の、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー溶出プロファイルを示す。この試験において用いられたｒＡＡＶ２（Ａ、Ｂ）およびｒＡＡＶ６（Ｃ、Ｄ）構築物は、ヘパリンがコンジュゲートしたアガロースビーズとともにインキュベートされて、それから、増加するストリンジェントなＮａＣｌ洗浄を用いてビーズから溶出された。溶出プロファイルは、ＲＴ－ｑＰＣＲを用いてそれぞれの溶出された画分に存在するウイルスゲノムの数を定量化することによって集められた。実験はトリプリケートで繰り返されて；グループあたり１つの代表的なクロマトグラムを示す。 ｒＡＡＶ１キャプシドにおける突然変異体をスキャンするＶＲ１欠失の導入遺伝子発現を示す。単一の欠失突然変異が、ｒＡＡＶ１キャプシドのＶＲ１ループ内に作られて、構築物が、１ｅ１０ ｖｇの投与量でマウスＧＣ中に注入された。導入遺伝子発現は、ｒＡＡＶ１の注入後に測定されたものと比較した倍差として示される。グラフの上の漫画は、この試験に関して突然変異された残基を薄い灰色で示し、２６５位は濃い灰色で示される。ＶＲ１を囲むＮ末およびＣ末βシートの位置も示される。データは、グループあたりｎ＝４の代表である。 ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６構築物のｉ．ｍ．注入後の、ｈＡＡＴの血清濃度を示す。ｈＡＡＴ導入遺伝子をパッケージングしているｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６キャプシドを、１ｅ１０ ｖｇの投与量でＧＣ筋中に注入した。注入の５週間後に、血清を集めて、ＥＬＩＳＡを用いて血液内のｈＡＡＴタンパク質の量を決定した。データはグループあたりｎ＝４を表わす。 ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６キャプシドのＶＲ１領域内の水素結合を示す。水素結合形成に関与する原子対を、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ全原子接触分析を用いてｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６の結晶学的座標に関して計算して、ＫｉＮＧグラフィックプログラムを用いて可視化した。ＶＲ１ループを含む残基はラベルされる。残基２６５から生じる水素結合は、グリーンドットを用いて可視化されて、矢印によって示される。ＶＲ１側鎖は橙色で塗られて、タンパク質主鎖は黄色で塗られる。 眼の中へのｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６構築物の注入後の導入遺伝子発現を示す。 眼の中へのｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６構築物の注入後の導入遺伝子発現を示す。 ＫｉＮＧ表示ソフトウェアによって可視化されたＶＲ１水素結合ネットワークを示す（Ａ）。タンパク質主鎖を橙色で示し、側鎖を薄い緑色で示す。水素結合は、濃い緑色の雲として示されて、矢印は、ＶＲ１内に存在する水素結合を示す。ＶＲ１残基はラベルされる。パネル（Ｂ）では、以下の結合がｒＡＡＶ１に関して強調される：ＨＧ１ Ｔ２６５～Ｏ Ｓ２６２；Ｏ Ａ２６３～ＨＧ１ Ｔ２６５；ＯＧ Ｓ２６４～Ｈ Ｔ２６５。パネル（Ｃ）では、以下の結合がｒＡＡＶ２に関して強調される：ＯＧ Ｓ２６４～Ｈ Ｇ２６５；Ｈ Ａ２６６～Ｏ Ｑ２６３。パネル（Ｄ）では、以下の結合がｒＡＡＶ３ｂに関して強調される：Ｏ Ｑ２６３～Ｈ Ａ２６６；Ｏ Ｑ２６３～Ｈ Ｇ２６５。パネル（Ｅ）では、以下の結合がｒＡＡＶ４に関して強調される：Ｏ Ｌ２５８～Ｈ Ｎ２６１。パネル（Ｆ）では、以下の結合がｒＡＡＶ５に関して強調される：Ｈ Ｓ２５８～Ｏ Ｖ２５５；Ｏ Ｓ２５８～Ｈ Ｎ２６１。パネル（Ｇ）では、以下の結合がｒＡＡＶ６に関して強調される：Ｏ Ｓ２６４ Ａ～ＨＧ Ｓ２６４ Ａ；ＨＧ１ Ｔ２６５～Ｏ Ｓ２６２；ＯＧ Ｓ２６２～ＨＤ１ Ｈ２７２。パネル（Ｈ）では、以下の結合がｒＡＡＶ８に関して強調される：ＨＧ１ Ｔ２６５～Ｏ Ｔ２６５。パネル（Ｉ）では、以下の結合がｒＡＡＶ９に関して強調される：ＨＧ Ｓ２６５～Ｏ Ｓ２６５；Ｈ Ｇ２６７～Ｏ Ｓ２６３。 様々なｒＡＡＶ血清型におけるＶＲ１水素結合ネットワークを示す。Ｐｙｍｏｌ画像は、キャプシドループＶＲ１に焦点が合わせられる。破線は、ｒＡＡＶ１の結晶構造内に存在する水素結合を表わす（ＰＤＢ ＩＤ、３ＮＧ９）、ｒＡＡＶ２（ＰＤＢ ＩＤ、１ＬＰ３）、ｒＡＡＶ３ｂ（ＰＤＢ ＩＤ、３ＫＩＣ）、ｒＡＡＶ４（ＰＤＢ ＩＤ、２Ｇ８Ｇ）、ｒＡＡＶ５（ＰＤＢ ＩＤ、３ＮＴＴ）、ｒＡＡＶ６（ＰＤＢ ＩＤ、３ＯＡＨ）、ｒＡＡＶ８（ＰＤＢ ＩＤ、２ＱＡＯ）、およびｒＡＡＶ９（ＰＤＢ ＩＤ、３ＵＸ１）。水素結合ネットワークに参加しているＶＲ１アミノ酸は、棒として示されて緑色で塗られる。この試験に関して突然変異されたアミノ酸は、シアン色で塗られる。ｒＡＡＶ１では（Ａ）、結合は、残基Ｔ２６５およびＳ２６２、Ｔ２６５およびＡ２６３、Ｔ２６５およびＳ２６４、およびＳ２６４およびＧ２６６の間に示される。ｒＡＡＶ２では（Ｂ）、結合は、残基Ｓ２６４およびＧ２６５、およびＱ２６３およびＡ２６６の間に示される。ｒＡＡＶ３ｂでは（Ｃ）、結合は、残基Ｑ２６３およびＡ２６６、およびＱ２６３およびＧ２６５の間に示される。ｒＡＡＶ４では（Ｄ）、結合は、残基Ｌ２５８およびＮ２６１の間に示される。ｒＡＡＶ５では（Ｅ）、結合は、残基Ｓ２５８およびＶ２５５、およびＳ２５８およびＮ２６１の間に示される。ｒＡＡＶ６では（Ｆ）、結合は、残基Ｔ２６５およびＳ２６２、およびＳ２６２およびＨ２７２の間に示される。ｒＡＡＶ８では（Ｇ）、結合は、残基Ｔ２６５およびＴ２６５の間に示される（水素残基はそれ自体に結合する）。ｒＡＡＶ９では（Ｈ）、結合は、残基Ｓ２６３およびＧ２６７、および、Ｓ２６５およびＳ２６５の間に示される（水素残基はそれ自体に結合する）。 ＶＲ１欠失突然変異を保有するｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６キャプシドの生体内分布を示す。構築物あたり１ｅ１１ベクターゲノムの尾静脈注入の９日後の、ｒＡＡＶ１（Ａ）およびｒＡＡＶ６（Ｄ）キャプシドの生きた動物の生物発光イメージング。１０ｄｐｉに、示される臓器を摘出して、溶解およびホモジナイズして、そして、溶解物のルシフェラーゼ発現および全タンパク質含有量を定量化した（Ｂ、Ｅ）。値は、ｍｇ合計タンパク質あたりの相対的な光の単位（ＲＬＵ／ｍｇ）で示される。臓器の示されたサブセットを、ｑＰＣＲを介してさらに処理して（Ｃ、Ｆ）、細胞ゲノムあたりのベクターゲノムの数を決定した（ｖｇ／ｃｇ）。それぞれのデータポイントはｎ＝３を表わし；画像は、グループあたりの１つの代表的なマウスである。エラーバーは標準偏差を反映する。 ＶＲ１欠失突然変異を保有するｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、およびｒＡＡＶ９キャプシドの生体内分布を示す。構築物あたり１ｅ１１ベクターゲノムの尾静脈注入の９日後の、ｒＡＡＶ７（Ａ）、ｒＡＡＶ８（Ｄ）、およびｒＡＡＶ９（Ｇ）キャプシドの生きた動物の生物発光イメージング。１０ｄｐｉに、示される臓器を摘出して、溶解およびホモジナイズして、そして、溶解物のルシフェラーゼ発現および全タンパク質含有量を定量化した（Ｂ、Ｅ、Ｈ）。値は、ｍｇ合計タンパク質あたりの相対的な光の単位（ＲＬＵ／ｍｇ）で示される。臓器の示されたサブセットを、ｑＰＣＲを介してさらに処理して（Ｃ、Ｆ、Ｉ）、細胞ゲノムあたりのベクターゲノムの数を決定した（ｖｇ／ｃｇ）。それぞれのデータポイントはｎ＝３を表わし；画像は、グループあたりの１つの代表的なマウスである。エラーバーは標準偏差を反映する。 血清型ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ３ｂにおけるＶＲ１欠失突然変異体キャプシドの定性的生体内分布を示す。パネル（Ａ）および（Ｂ）では、示された構築物のそれぞれの１ｅ１１ｖｇが、尾静脈を介して投与された。マウスは、１０ｄｐｉに画像化された。（Ｃ）および（Ｄ）では、示された構築物のそれぞれの５ｅ１１ｖｇが、尾静脈を介して投与された。マウスは、１０ｄｐｉに画像化された。全ての場合においてＮ＝３が評価された；それぞれのグループからの１つの代表的なマウスが示される。 ＶＲ１欠失突然変異体ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６キャプシドに関する定量的な生体内分布を示す。パネル（Ａ）および（Ｂ）は、示された構築物の１ｅ１１ｖｇの尾静脈注入後の内臓臓器に関する平均ＲＬＵ／ｍｇタンパク質を介したルシフェラーゼ発現を示す。パネル（Ｃ）は、心臓、肝臓およびＧＣにおける、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６２ｄｅｌおよびｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌの間の平均ＲＬＵ／ｍｇタンパク質を介したルシフェラーゼ発現を比較する。Ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を表わす。 ＶＲ１欠失突然変異体ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、およびｒＡＡＶ９キャプシドの定量的および定性的生体内分布を示す。パネル（Ａ）、（Ｂ）、および（Ｃ）は、示された構築物の１ｅ１１ｖｇの尾静脈注入後の内臓臓器に関する平均ＲＬＵ／ｍｇタンパク質を介したルシフェラーゼ発現を示す。パネル（Ｄ）では、マウスは、尾静脈を介して、示された構築物あたり１ｅ１１ｖｇを注入されて、１０ｄｐｉに画像化された。全ての実験に関してＮ＝３；エラーバーは標準偏差を表わす。（Ｄ）では、それぞれのグループからの１つの代表的なマウスが示される。 ＶＲ１挿入／置換突然変異を保有するｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３ｂ、およびｒＡＡＶ６キャプシドの生体内分布を示す。構築物あたり１ｅ１１ベクターゲノムの尾静脈注入の９日後の、ｒＡＡＶ２（Ａ）、ｒＡＡＶ３ｂ（Ｄ）、ｒＡＡＶ１（Ｇ）、およびｒＡＡＶ６（Ｊ）キャプシドの生きた動物の生物発光イメージング。１０ｄｐｉに示される臓器を摘出して、溶解およびホモジナイズして、そして、溶解物のルシフェラーゼ発現および全タンパク質含有量を定量化した（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ）。値は、ｍｇ合計タンパク質あたりの相対的な光の単位（ＲＬＵ／ｍｇ）で示される。臓器の示されたサブセットを、ｑＰＣＲを介してさらに処理して（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ）、細胞ゲノムあたりのベクターゲノムの数を決定した（ｖｇ／ｃｇ）。それぞれのデータポイントはｎ＝３を表わし；画像は、グループあたりの１つの代表的なマウスである。エラーバーは標準偏差を反映する。 ＶＲ１ ２６５Ｄ突然変異体ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３ｂ、およびｒＡＡＶ６キャプシドに関する定量的な生体内分布を示す。パネル（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）および（Ｄ）は、示された構築物の１ｅ１１ｖｇの尾静脈注入後の内臓臓器に関する平均ＲＬＵ／ｍｇタンパク質を介したルシフェラーゼ発現を示す。Ｎ＝３；エラーバーは標準偏差を表わす。 ２６５Ｄ突然変異体ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９キャプシドの定性的な生体内分布を示す。パネル（Ａ）および（Ｂ）では、示された構築物のそれぞれの１ｅ１１ｖｇが、尾静脈を介して投与された。マウスは、１０ｄｐｉに画像化された。全ての場合において、Ｎ＝３が評価された；それぞれのグループからの１つの代表的なマウスが示される。 ＶＲ１挿入／置換（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）突然変異を保有するキャプシドの形質導入効率に対する、キャプシドヘパリン結合能力の影響を示す。２６５Ｄ、ヘパリン－ヌル、および２６５Ｄヘパリンヌルの組み合わせの突然変異体を含むｒＡＡＶ２キャプシドサブセット（Ａ）；２６５Ｄ、ヘパリン－ヌル、および２６５Ｄヘパリンヌルの組み合わせの突然変異体を含むｒＡＡＶ３ｂキャプシドサブセット（Ｂ）；および、２６５Ｄ、ヘパリン－ヌル、および２６５Ｄヘパリンヌルの組み合わせの突然変異体を含むｒＡＡＶ６キャプシドサブセット（Ｃ）の、１ｅ１１ｖｇを注入されたマウスから１０ｄｐｉに得られた、肝臓サンプルに関するエクスビボでのルシフェラーゼアッセイの結果。Ｔ２６５ｄｅｌ、ヘパリン－ヌルおよびＴ２６５ｄｅｌヘパリン－ヌルの組み合わせの突然変異体を含むｒＡＡＶ６キャプシドサブセット（Ｄ）の１ｅ１１ｖｇを注入されたマウスから１０ｄｐｉに得られた、心臓、肝臓、およびＧＣサンプルに関するエクスビボでのルシフェラーゼアッセイの結果。データは、分析されたタンパク質のｍｇあたりの標準化された相対的な光の単位を表わす（ＲＬＵ／ｍｇ）。それぞれのデータポイントはｎ＝３を表わし；エラーバーは標準偏差を反映する。 心臓および肝臓組織における、野生型キャプシド形質導入効率に対するＶＲ１突然変異体の比較を示す。ＶＲ１欠失突然変異体キャプシドのパネルの１ｅ１１ｖｇの、１０ｄｐｉにおける、心臓（Ａ）および肝臓（Ｂ）から得られた組織サンプルに対する、エクスビボでのルシフェラーゼアッセイの結果。分析されたタンパク質のｍｇあたりの相対的な光の単位を測定した後の、ｒＡＡＶ９に関して得られた値と比較した倍差として表されたデータ。ＡおよびＢにおいて分析された臓器の、心臓対肝臓の形質導入の比（Ｃ）。２６５Ｄ突然変異体キャプシドのパネルの１ｅ１１ｖｇの、１０ｄｐｉに得られた肝臓組織サンプルに対する、エクスビボでのルシフェラーゼアッセイの結果（Ｄ）。分析されたタンパク質のｍｇあたりの相対的な光の単位を測定した後の、ｒＡＡＶ８に関して得られた値と比較した倍差として表されたデータ。それぞれのデータポイントはｎ＝３を表わし；エラーバーは標準偏差を反映する。 チロシンからフェニルアラニンの突然変異とともにＶＲ１突然変異を保有するｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６キャプシドの形質導入効率を示す。ＶＲ１欠失突然変異を単独で、およびＹ４４５Ｆ突然変異とともに保有する、ｒＡＡＶ１キャプシド（Ａ）のパネルから、および、同等の突然変異を有するｒＡＡＶ６キャプシド（Ｂ）のパネルから得られた、心臓、肝臓、およびＧＣ組織のパネルに対する、エクスビボでのルシフェラーゼアッセイの結果。データは、分析されたタンパク質のｍｇあたりの標準化された相対的な光の単位（ＲＬＵ／ｍｇ）を表わす。組織サンプルは、構築物あたり１ｅ１１ｖｇの１０ｄｐｉに得られた。それぞれのデータポイントはｎ＝３を表わし；エラーバーは標準偏差を反映する。 ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ８／Ｓ２６６ｄｅｌキャプシドの定性的な生体内分布を示す。示された構築物のそれぞれの１ｅ１１ｖｇを、尾静脈を介して投与した。マウスは、１０ｄｐｉに画像化された。全ての場合において、Ｎ＝３が評価された；それぞれのグループからの１つの代表的なマウスが示される。
ここで、本発明は、本発明の好ましい実施態様が示される添付の図面に関して説明される。しかしながら、本発明は異なる形で具体化され得て、本明細書中に示される実施態様に制限されると解釈されるべきでない。むしろ、これらの実施態様は、本開示が徹底的かつ完全であるように提供されて、本発明の範囲を当業者に完全に届ける。
別段の定義がされない限り、本明細書で用いられる全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者の一人により一般に理解されるのと同一の意味を有する。本発明において、本発明の説明に用いられる専門用語は、特定の実施態様を説明する目的のためのみであり、本発明の限定を意図しない。全ての刊行物、特許出願、特許、および本明細書において言及される他の参考文献は、それらの全体で参照により援用される。
ヌクレオチド配列は、本明細書において、特に別段の指示がない限り、左から右へ５’から３’への方向で、一本鎖によってのみ提供される。ヌクレオチドおよびアミノ酸は、本明細書において、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される様式で、または、（アミノ酸については）一文字コードまたは三文字コードのいずれかによって、どちらも３７ ＣＦＲ §１．８２２および確立された使用に従って示される。例えば、ＰａｔｅｎｔＩｎ Ｕｓｅｒ Ｍａｎｕａｌ，９９－１０２（Ｎｏｖ．１９９０）（米国特許商標庁）を参照。
別段の指示がある場合を除き、当業者に公知の標準的な方法が、組み換えパルボウイルスおよびＡＡＶ（ｒＡＡＶ）構築物、パルボウイルスＲｅｐおよび／またはＣａｐ配列を発現しているパッケージングベクター、および、一時的および安定的にトランスフェクトされたパッケージング細胞の構築のために用いられ得る。そのような技術は、当業者に公知である。例えば、ＳＡＭＢＲＯＯＫ ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ ２ｎｄ Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；ＡＵＳＵＢＥＬ ｅｔ ａｌ．，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照。
さらに、本発明は、本発明の一部の実施態様では、本明細書に示される任意の特性または特性の組み合わせは、除外または省略され得ることも検討される。
さらに説明するために、仮に例えば、明細書が、特定のアミノ酸はＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌおよび／またはＶから選択され得ると示す場合、この言葉は、アミノ酸は、これらのアミノ酸（単数または複数）の任意のサブセット、例えばＡ、Ｇ、ＩまたはＬ；Ａ、Ｇ、ＩまたはＶ；ＡまたはＧ；Ｌのみ；などから、あたかもそのようなサブコンビネーションのそれぞれが本明細書において明示的に示されるかのように、選択され得ることも示す。さらに、そのような言葉は、規定のアミノ酸の１つまたは複数が放棄され得ることも示す。例えば、特定の実施態様では、アミノ酸は、そのようなあり得る放棄のそれぞれが本明細書において明示的に示されるかのように、Ａ、ＧまたはＩではない；Ａではない；ＧまたはＶではない；などである。
定義
以下の用語は、本明細書における説明および添付の特許請求の範囲において用いられる。
単数形「ａ」および「ａｎ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形を同様に含むことが意図される。
さらに、本明細書において用いられる用語「約」は、例えば、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の長さの量、投与量、時間、温度などの、測定可能な値を言及する場合、規定の量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、または実に０．１％の変動を包含することを意味する。
また、本明細書において用いられる「および／または」は、関係がある列挙された項目の１つまたは複数の任意および全てのあり得る組み合わせ、ならびに、選択的に（「または」）と解釈された場合は組み合わせの欠失を指し、および包含する。
本明細書において用いられる移行句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、特許請求の範囲に記載された発明（例えば、ｒＡＡＶ複製）の、列挙された材料またはステップ、「および、基礎的および新規の特徴（単数または複数）に実質的に影響を及ぼさないもの」を包含すると解釈されるべきである。Ｉｎ ｒｅ Ｈｅｒｚ，５３７ Ｆ．２ｄ ５４９，５５１－５２，１９０ Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．４６１，４６３（ＣＣＰＡ １９７６）（オリジナルにおいて協調）を参照し；また、ＭＰＥＰ §２１１１．０３も参照。したがって、本明細書において用いられる用語「から本質的になる」は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同等であると解釈されるべきでない。
本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に加えられる用語「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」（および文法上の異形）は、列挙された配列（例えば、配列番号）、および、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能が実質的に変更されないように列挙された配列の５’および／または３’またはＮ末端および／またはＣ末端上の合計で１０個以下（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個）のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸の両方からなる、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。合計で１０個以下のさらなるヌクレオチドまたはアミノ酸は、さらなるヌクレオチドまたはアミノ酸の合計数を両末端上に合わせて含む。本発明のポリヌクレオチドに加えられる用語「実質的に変更される」は、列挙された配列からなるポリヌクレオチドの発現レベルと比較して少なくとも約５０％以上の、コードされるポリペプチドを発現する能力の増大または低減を指す。本発明のポリペプチドに加えられる用語「実質的に変更される」は、列挙された配列からなるポリペプチドの活性と比較して少なくとも約５０％以下の、形質導入活性の増大または低減を指す。
本明細書において用いられる用語「パルボウイルス」は、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーを包含し、自律複製するパルボウイルスおよびディペンドウイルスを含む。自律的パルボウイルスは、パルボウイルス、エリスロウイルス、デンソウイルス、イテラウイルス、および、コントラウイルス（Ｃｏｎｔｒａｖｉｒｕｓ）属のメンバーを含む。例示的な自律的パルボウイルスは、限定されないが、マウスの微小ウイルス、ウシのパルボウイルス、犬のパルボウイルス、ニワトリのパルボウイルス、ネコ汎白血球減少症ウイルス、ネコのパルボウイルス、ガチョウのパルボウイルス、Ｈ１パルボウイルス、バリケンのパルボウイルス、ヘビのパルボウイルス、およびＢ１９ウイルスを含む。他の自律的パルボウイルスは、当業者に公知である。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻、第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照）。
ディペンドウイルス属は、制限されないが、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、ＡＡＶタイプ１３、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、ウマＡＡＶ、およびヒツジＡＡＶを含む、アデノ付随ウイルス（ＡＡＶ）を含む。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）；および表１を参照。
本明細書において用いられる用語「アデノ付随ウイルス」（ＡＡＶ）は、制限されないが、ＡＡＶタイプ１、ＡＡＶタイプ２、ＡＡＶタイプ３（タイプ３Ａおよび３Ｂを含む）、ＡＡＶタイプ４、ＡＡＶタイプ５、ＡＡＶタイプ６、ＡＡＶタイプ７、ＡＡＶタイプ８、ＡＡＶタイプ９、ＡＡＶタイプ１０、ＡＡＶタイプ１１、ＡＡＶタイプ１２、ＡＡＶタイプ１３、ヘビＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、および、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。多くの相対的に新しいＡＡＶ血清型およびクレードが同定されている（例えば、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８：６３８１；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３－：３７５；および表１を参照）。
本発明のパルボウイルス粒子およびゲノムは、限定されないが、ＡＡＶ由来であってよい。様々な血清型のＡＡＶおよび自律的パルボウイルスのゲノム配列、ならびに、ネイティブＩＴＲ、Ｒｅｐタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当技術分野で知られている。そのような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋのような公共データベースに見られ得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーＮＣ＿００２０７７、ＮＣ＿００１４０１、ＮＣ＿００１７２９、ＮＣ＿００１８６３、ＮＣ＿００１８２９、ＮＣ＿００１８６２、ＮＣ＿０００８８３、ＮＣ＿００１７０１、ＮＣ＿００１５１０、ＮＣ＿００６１５２、ＮＣ＿００６２６１、ＡＦ０６３４９７、Ｕ８９７９０、ＡＦ０４３３０３、ＡＦ０２８７０５、ＡＦ０２８７０４、Ｊ０２２７５、Ｊ０１９０１、Ｊ０２２７５、Ｘ０１４５７、ＡＦ２８８０６１、ＡＨ００９９６２、ＡＹ０２８２２６、ＡＹ０２８２２３、ＡＹ６３１９６６、ＡＸ７５３２５０、ＥＵ２８５５６２、ＮＣ＿００１３５８、ＮＣ＿００１５４０、ＡＦ５１３８５１、ＡＦ５１３８５２およびＡＹ５３０５７９を参照し；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列の教示のために本明細書中に参照により援用される。また、例えば、Ｂａｎｔｅｌ－Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：９３９；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３０９；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９９：１１８５４；Ｍｏｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３－：３７５－３８３；Ｍｏｒｉ ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｖｉｒｏｌ．３３０：３７５；Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｖｉｒｏｌ．２２１：２０８；Ｒｕｆｆｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：３３８５；Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：３０９；Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：８９１１；Ｓｈａｄｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５８：９２１；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：５５５；Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：３９９４；国際特許公報ＷＯ００／２８０６１、ＷＯ９９／６１６０１、ＷＯ９８／１１２４４；および、米国特許第６，１５６，３０３号も参照し；その開示は、パルボウイルスおよびＡＡＶ核酸およびアミノ酸配列の教示のために本明細書中に参照により援用される。表１も参照。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２およびＡＡＶ３ ＩＴＲ配列の初期の説明は、Ｘｉａｏ，Ｘ．，（１９９６），「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）ＤＮＡ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ」Ｐｈ．Ｄ．学位論文、ピッツバーグ大学、ピッツバーグ、ペンシルバニア州によって提供される（その全体で本明細書中に援用される）。
本明細書において用いられる用語「向性」は、細胞へのウイルスの侵入を指し、任意選択で、および好ましくは、細胞においてウイルスゲノムによって保有される配列の発現（例えば、転写、および任意選択で、翻訳）、例えば、組み換えウイルスについては、異種ヌクレオチド配列（単数または複数）の発現が続く。当業者は、ウイルスゲノム由来の異種核酸配列の転写は、例えば、誘導性プロモーターまたは他の方法で制御される核酸配列に関するトランス作用因子が不存在では開始され得ないことを理解している。ＡＡＶの場合は、ウイルスゲノム由来の遺伝子発現は、安定的に組み込まれたプロウイルス、非組込みのエピソーム、ならびに、ウイルスが細胞内に取り込み得る任意の他の形態由来であってよい。
本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶによる細胞の「形質導入」は、パルボウイルス／ＡＡＶが介在する細胞中への遺伝物質の移行を指す。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９章（第３版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）参照。
用語「５’部分」および「３’部分」は、２以上のエレメント間の空間的関係を定義するための相対的用語である。したがって、例えば、ポリヌクレオチドの「３’部分」は、別のセグメントの下流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「３’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの３’末にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの３’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。同様に、ポリヌクレオチドの「５’部分」は、別のセグメントの上流であるポリヌクレオチドのセグメントを示す。用語「５’部分」は、セグメントが必ずしもポリヌクレオチドの５’末にあることを示すことを意図せず、または、必ずしもポリヌクレオチドの５’の半分にあることさえ意図しないが、そうであってよい。
本明細書において用いられる用語「ポリペプチド」は、別段の指示がない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然起源および非天然起源ヌクレオチドの両方を含む）であってよく、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ配列のいずれかであってよい。
本明細書において用いられる用語「配列同一性」は、当技術分野における標準的な意味を有する。当技術分野で知られているように、多くの異なるプログラムを用いて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが公知配列と配列同一性または類似性を有するかどうか同定することができる。配列同一性または類似性は、制限されないが、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所配列同一性アルゴリズムを含む当技術分野で知られている標準的な技術を用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の配列同一性アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４（１９８８）の類似性検索法によって、これらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩにおける、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）のコンピューター化された実行によって、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７（１９８４）により記載されるＢｅｓｔ Ｆｉｔ配列プログラム、好ましくはデフォルト設定を用いて、または調査によって、判定され得る。
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブ、ペアワイズアライメントを用いて、関連のある配列のグループから多数の配列アライメントを作る。また、アライメントを作るために用いられるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１（１９８７）のプログレッシブアライメント法の簡易化を用いて；その方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ＆Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１（１９８９）により記載される方法に似ている。
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０）およびＫａｒｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３（１９９３）に記載の、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２プログラムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：４６０（１９９６）；ｂｌａｓｔ．ｗｕｓｔｌ／ｅｄｕ／ｂｌａｓｔ／ＲＥＡＤＭＥ．ｈｔｍｌから取得した。ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２は、いくつかの検索パラメーターを用いて、それらは好ましくは、デフォルト値に設定されている。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成、および、目的の配列が検索されている特定のデータベースの構成に応じて、プログラム自体によって確立されるが；感度を増大させるために値を調節してよい。
さらなる有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９（１９９７）により報告されるギャップ化ＢＬＡＳＴである。
アミノ酸配列同一性の値のパーセンテージは、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より長い」配列の残基の合計数で割って決定される。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである（アライメントスコアを最大化するためにＷＵ－Ｂｌａｓｔ－２により導入されるギャップは無視する）。
同様の様式で、核酸配列同一性パーセントは、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチド内のヌクレオチドと同一である候補配列内のヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。
アライメントは、並べられる配列内のギャップの導入を含み得る。加えて、本明細書において具体的に開示されるポリヌクレオチドよりも多いまたは少ないヌクレオチドを含む配列に関して、一実施態様では、配列同一性のパーセンテージは、ヌクレオチドの合計数に対する、同一のヌクレオチドの数に基づいて決定されることが理解される。したがって、例えば、本明細書に具体的に開示される配列よりも短い配列の配列同一性は、一実施態様では、より短い配列におけるヌクレオチドの数を用いて決定される。同一性のパーセンテージの計算においては、相対的重量は、配列変動、例えば挿入、欠失、置換などの様々な兆候に割り当てられない。
一実施態様では、同一性のみが正にスコアされて（＋１）、ギャップを含む全ての形態の配列変動は「０」の値に割り当てられて、配列類似性計算のための、以下に記載される加重したスケールまたはパラメーターの必要性を取り除く。配列同一性パーセントは、例えば、一致する同一残基の数を、並べられた領域内の「より短い」配列の残基の合計数で割って、１００を掛けることにより、計算され得る。「より長い」配列は、並べられた領域内に最も現実の残基を有するものである。
本明細書において用いられる「単離された」ポリヌクレオチド（例えば、「単離されたＤＮＡ」または「単離されたＲＮＡ」）は、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素またはポリヌクレオチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、ポリヌクレオチドを意味する。
同様に、「単離された」ポリペプチドは、天然起源の生物またはウイルスの他の構成要素の少なくとも一部、例えば、細胞またはウイルスの構造的構成要素またはポリペプチドと関連して一般に見られる他のポリペプチドまたは核酸から、分離されたまたは実質的にフリーの、ポリペプチドを意味する。
「治療的ポリペプチド」は、細胞または対象内のタンパク質の不存在または欠陥に起因する症候を緩和または低減し得るポリペプチドである。あるいは、「治療的ポリペプチド」は、抗癌効果または移植生存性の改善のような、他の方法で対象に利益を与えるものである。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に加えられる、本明細書において用いられる用語「改変」は、１つまたは複数の欠失、付加、置換、またはそれらの任意の組み合わせに起因して、野生型配列とは異なる配列を指す。
本明細書において用いられる、ウイルスベクターを「単離する」または「精製する」（または文法的等価物）によって、ウイルスベクターが、出発原料内の他の構成要素の少なくとも一部から、少なくとも部分的に分離されることを意味する。
用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「～の治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ）」（およびそれらの文法的変形）によって、対象の状態の重症度が低減され、少なくとも部分的に改善または安定化されること、および／または、少なくとも１つの臨床症候における一部の軽減、緩和、低減または安定化が達成され、および／または、疾患または障害の進行に遅れがあることを意味する。
用語「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」および「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」（およびそれらの文法的変形）は、対象における疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発症の予防および／または遅延、および／または、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較した疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発症の重症度の低減を指す。予防は、完全であってよく、例えば、疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の全体的な不存在であってよい。また、予防は、対象における疾患、障害および／または臨床症候（単数または複数）の発生および／または発症の重症度が、本発明の不存在下で生じるであろうものよりも低いような、部分的であってもよい。
本明細書において用いられる「治療効果的な」量は、対象に何らかの改善または利益を提供するのに十分な量である。別の言い方をすると、「治療効果的な」量は、対象における少なくとも１つの臨床症候に何らかの軽減、緩和、低減、または安定化を提供する量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、治療的効果は完全または治療的である必要はないことを理解している。
本明細書において用いられる「予防効果的な」量は、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症を予防および／または遅延するのに十分な、および／または、本発明の方法の不存在下で生じるであろうものと比較して、対象における疾患、障害および／または臨床症候の発症の重症度を低減および／または遅延するのに十分な量である。当業者は、何らかの利益が対象に提供される限り、予防のレベルは完全である必要はないことを理解している。
用語「異種ヌクレオチド配列」および「異種核酸」は、本明細書において相互交換可能に用いられて、ウイルスにおける天然起源でない配列を指す。一部の実施態様では、異種核酸は、ポリペプチドまたは翻訳されていない目的ＲＮＡ（例えば、細胞または対象への送達のため）をコードするオープンリーディングフレームを含む。
本明細書において用いられる用語「ウイルスベクター」、「ベクター」または「遺伝子送達ベクター」は、核酸送達ビヒクルとして機能するウイルス（例えば、ＡＡＶ）粒子を指し、ビリオン内にパッケージされたベクターゲノム（例えば、ウイルスＤＮＡ［ｖＤＮＡ］）を含む。あるいは、一部の文脈では、用語「ベクター」は、ベクターゲノム／ｖＤＮＡ単独、またはプラスミドを指すために用いられてよい。
本発明のウイルスベクターは、さらに、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１に記載される二重のパルボウイルス粒子であってよい（その開示はその全体で参照により本明細書中に援用される）。したがって、一部の実施態様では、二本鎖（二重）ゲノムがパッケージされ得る。
「ｒＡＡＶベクターゲノム」または「ｒＡＡＶゲノム」は、１つまたは複数の異種核酸配列を含むＡＡＶゲノム（すなわち、ｖＤＮＡ）である。ｒＡＡＶベクターは、一般に、ウイルスを生産するためにｃｉｓで１４５塩基ＩＴＲのみを必要とする。全ての他のウイルス配列は不必要であり、トランスで供給され得る（Ｍｕｚｙｃｚｋａ（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７）。典型的に、ｒＡＡＶベクターゲノムは、ベクターによって効率的にパッケージされ得る導入遺伝子のサイズを最大化するように、１つまたは複数のＩＴＲ配列のみ保持する。構造的および非構造的タンパク質コード配列は、トランスで提供され得る（例えば、プラスミドのようなベクターから、または、配列をパッケージング細胞内に安定的に組み込むことによって）。本発明の実施態様では、ｒＡＡＶベクターゲノムは、少なくとも１つのＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ ＩＴＲ配列）、任意選択で２つのＩＴＲ（例えば、２つのＡＡＶ ＩＴＲ）を含み、それは典型的に、ベクターゲノムの５’および３’末にあって異種核酸と隣接するが、それに隣接する必要はない。ＩＴＲは、同一または互いに異なってよい。
用語「末端反復」または「ＴＲ」は、ヘアピン構造を形成して逆位末端配列として機能する（すなわち、所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、組込み、および／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を仲介する）、任意のウイルス末端反復または合成配列を含む。ＩＴＲは、ＡＡＶ ＩＴＲまたは非ＡＡＶ ＩＴＲであってよい。例えば、他のパルボウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ－１９）のもののような非ＡＡＶ ＩＴＲ配列、または、ＳＶ４０複製起点として作用するＳＶ４０ヘアピンが、ＩＴＲとして用いられ得て、それは、トランケーション、置換、欠失、挿入および／または付加によってさらに改変され得る。さらに、ＩＴＲは、Ｓａｍｕｌｓｋｉらの米国特許第５，４７８，７４５号に記載の「ダブル－Ｄ配列」のように、部分的または完全に合成であってよい。図２４は、本発明によって検討される合成のＩＴＲの例を提供する。
パルボウイルスゲノムは、それらの５’および３’末の両方に回文配列を有する。配列の回文性質は、相補塩基対の間の水素結合の形成によって安定化されるヘアピン構造の形成をもたらす。このヘアピン構造は、「Ｙ」または「Ｔ」形状を採用すると考えられる。例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９＆７０章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照。
「ＡＡＶ逆位末端配列」または「ＡＡＶ ＩＴＲ」は、制限されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１３、ヘビＡＡＶ、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、エビＡＡＶ、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶを含む任意のＡＡＶ由来であってよい（例えば、表１を参照）。末端反復が、例えば、複製、ウイルスパッケージング、持続性、および／またはプロウイルスレスキューなどの所望の機能を仲介する限り、ＡＡＶ ＩＴＲは、ネイティブの末端反復配列を有する必要はない（例えば、ネイティブのＡＡＶ ＩＴＲ配列は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更されてよい）。
本発明のウイルスベクターは、さらに、「標的化された」ウイルスベクター（例えば、方向付けられた向性を有する）および／または国際特許公報ＷＯ００／２８００４およびＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒａｐｙ ２：６１９に記載される「ハイブリッド」パルボウイルス（すなわち、ウイルスＩＴＲおよびウイルスキャプシドは、異なるパルボウイルス由来である）であってよい。
さらに、ウイルスキャプシドまたはゲノムのエレメントは、挿入、欠失および／または置換を含む他の改変を含んでよい。
本明細書において用いられる用語「アミノ酸」は、任意の天然起源アミノ酸、それらの改変された形態、および合成アミノ酸を包含する。
天然起源の、左旋性（Ｌ－）アミノ酸を表２に示す。
あるいは、アミノ酸は、改変されたアミノ酸残基であってよく（非限定的な例を表３に示す）、または、翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化または硫酸化）によって改変されたアミノ酸であってよい。
さらに、非天然起源アミノ酸は、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．３５：２２５－４９によって説明される「非天然」アミノ酸であってよい。これらの非天然アミノ酸は、目的分子をＡＡＶキャプシドタンパク質に化学的に結合するために有利に用いられ得る。
用語「テンプレート」または「基質」は、本明細書において、パルボウイルスウイルスＤＮＡを生産するために複製され得るポリヌクレオチド配列を指すために用いられる。ベクター生産の目的のために、テンプレートは、典型的に、制限されないが、プラスミド、ネイキッドＤＮＡベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、ＡＡＶ、バキュロウイルス、レトロウイルスベクターなど）を含む、より大きなヌクレオチド配列または構築物内に埋め込まれる。あるいは、テンプレートは、パッケージング細胞の染色体内に安定的に組み込まれ得る。
本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶ「Ｒｅｐコード配列」は、ウイルス複製および新たなウイルス粒子の生産を仲介するパルボウイルスまたはＡＡＶの非構造的タンパク質をコードする核酸配列を示す。パルボウイルスおよびＡＡＶ複製遺伝子およびタンパク質は、例えば、ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９＆７０章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）に記載されている。
「Ｒｅｐコード配列」は、パルボウイルスまたはＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質の全てをコードする必要はない。例えば、ＡＡＶに関しては、Ｒｅｐコード配列は、４つのＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０）の全てをコードする必要はなく、実際に、ＡＡＶ５は、スプライスされたＲｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質のみを発現すると考えられている。代表的な実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、ウイルスゲノム複製および新たなビリオン中へのパッケージングに必要な、少なくともこれらの複製タンパク質をコードする。Ｒｅｐコード配列は、一般に、少なくとも１つの大きなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ７８／６８）および１つの小さなＲｅｐタンパク質（すなわち、Ｒｅｐ５２／４０）をコードする。特定の実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、ＡＡＶ Ｒｅｐ７８タンパク質およびＡＡＶ Ｒｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。他の実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２および／またはＲｅｐ４０タンパク質をコードする。さらに、さらなる実施態様では、Ｒｅｐコード配列は、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ５２タンパク質、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ４０タンパク質、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ５２タンパク質、またはＲｅｐ７８およびＲｅｐ４０タンパク質をコードする。
本明細書において用いられる用語「大きなＲｅｐタンパク質」は、Ｒｅｐ６８および／またはＲｅｐ７８を指す。特許請求の範囲に記載される発明の大きなＲｅｐタンパク質は、野生型または合成のいずれかであってよい。野生型の大きなＲｅｐタンパク質は、制限されないが、血清型１、２、３ａ、３ｂ、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１３を含む任意のパルボウイルスまたはＡＡＶ、または、現在知られまたは後に発見される任意の他のＡＡＶ由来であってよい（例えば、表１を参照）。合成の大きなＲｅｐタンパク質は、挿入、欠失、トランケーションおよび／またはミスセンス突然変異によって変更され得る。
当業者は、複製タンパク質は同一のポリヌクレオチドによってコードされる必要はないことをさらに理解する。例えば、ＭＶＭに関しては、ＮＳ－１およびＮＳ－２タンパク質（スプライス変異）は、互いに独立に発現され得る。同様に、ＡＡＶに関しては、ｐ１９プロモーターは不活化され得て、大きなＲｅｐタンパク質（単数または複数）は１つのポリヌクレオチドから発現され得て、小さなＲｅｐタンパク質（単数または複数）は異なるポリヌクレオチドから発現され得る。しかしながら典型的に、単一の構築物から複製タンパク質を発現することがより便利である。一部のシステムでは、ウイルスプロモーター（例えば、ＡＡＶ ｐ１９プロモーター）は、細胞によって認識されなくてよく、したがって、別個の発現カセットから大きなおよび小さなＲｅｐタンパク質を発現する必要がある。他の例では、大きなＲｅｐおよび小さなＲｅｐタンパク質を、別個に、すなわち、別個の転写および／または翻訳制御エレメントの制御下で発現することが望ましくあり得る。例えば、小さなＲｅｐタンパク質に対する大きな方の比を低減させるように、大きなＲｅｐタンパク質の発現を制御することが望ましくあり得る。昆虫細胞の場合は、細胞に対する毒性を避けるために、大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８／６８）の発現を下方調節することが有利であり得る（例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １３：１９３５を参照）。
本明細書において用いられる、パルボウイルスまたはＡＡＶ「ｃａｐコード配列」は、機能性パルボウイルスまたはＡＡＶキャプシドを形成する構造タンパク質をコードする（すなわち、ＤＮＡをパッケージおよび標的細胞を感染することができる）。典型的に、ｃａｐコード配列は、パルボウイルスまたはＡＡＶキャプシドサブユニットの全てをコードするが、機能性キャプシドが生産される限り、全てよりも少ないキャプシドサブユニットがコードされてよい。典型的に、必ずしもではないが、ｃａｐコード配列は、単一の核酸分子上に存在する。
自律的パルボウイルスおよびＡＡＶのキャプシド構造は、ＢＥＲＮＡＲＤ Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ ｅｔ ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，第２巻，第６９＆７０章（第４版，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ－Ｒａｖｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）により詳細に説明される。
改変パルボウイルスキャプシドタンパク質
本発明は、高められた組織形質導入能および／または改変された組織特異性を提供して、細胞への核酸の効率的な送達のためのパルボウイルスベクターを調製するために用いられ得る、改変パルボウイルスキャプシドタンパク質を提供する。本発明者らは、アミノ酸残基間の水素結合の破壊によるキャプシドタンパク質の可変領域１（ＶＲ１）ループの不安定化は、高められた細胞形質導入および／または改変された組織特異性をもたらすことを見いだした。
本発明の一態様は、ＡＡＶ血清型またはＴ＝１の二十面体のキャプシド構造を有する任意の他のパルボウイルス由来のキャプシドタンパク質アミノ酸配列を含む、パルボウイルスキャプシドタンパク質に関し、ここで、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質のアミノ酸残基２５８～２７２または別のＡＡＶまたはパルボウイルスキャプシドタンパク質由来の対応するアミノ酸残基を含む可変領域１（ＶＲ１）ループは、残基によって編成される水素結合パターンの標的化された破壊に起因してループ内に局所的不安定化を生じさせるように、１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失および／または置換によって改変されて、ここで、改変を含むキャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターに、改変を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して増大した形質導入効率および／または改変された組織特異性を提供する。
ＡＡＶ血清型は、当技術分野でよく知られていて、上記の表１に記載される。ＡＡＶ血清型は、Ｔ＝１の二十面体のキャプシド構造を有する。
脊椎動物に感染することが可能なパルボウイルス科サブファミリーには８属が存在し、全て、Ｔ＝１二十面体対称を保有するキャプシドによって識別される。パルボウイルス科は、制限されずに、以下のウイルスを含む。
１．）アムドパルボウイルス（アリューシアンミンク病ウイルス、ハイイロギツネアムドウイルスを含む種）
２．）アベパルボウイルス（アベパルボウイルスを含む種）
３．）ボカパルボウイルス（食肉類ボカパルボウイルス１～３；ひれ足類ボカパルボウイルス１および２；霊長目ボカパルボウイルス１および２；有蹄類ボカパルボウイルス１－５を含む種）
４．）コピパルボウイルス（コピパルボウイルスを含む種）
５．）ディペンドパルボウイルス（アデノ付随ディペンドパルボウイルスＡ；アデノ付随ディペンドパルボウイルスＢ；カモ目ディペンドパルボウイルス１；鳥類ディペンドパルボウイルス１；翼手目ディペンドパルボウイルス１；ひれ足類ディペンドパルボウイルス１；鱗片ディペンドパルボウイルス１を含む種）
６．）エリスロパルボウイルス（霊長類エリスロパルボウイルス１～４；齧歯類エリスロパルボウイルス１；有蹄類エリスロパルボウイルス１を含む種）
７．）プロトパルボウイルス（食肉類プロトパルボウイルス１；齧歯類プロトパルボウイルス１および２；有蹄類パルボウイルス１を含む種）
８．）テトラパルボウイルス（翼手目テトラパルボウイルス１；霊長類テトラパルボウイルス１；有蹄類テトラパルボウイルス１～４を含む種）
キャプシドタンパク質配列は当技術分野で知られていてＧｅｎＢａｎｋのような配列データベースにおいて入手可能である。ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、およびＡＡＶ９由来のキャプシドタンパク質に関して本明細書において用いられるアミノ酸残基番号は、表１に挙げられるＧｅｎＢａｎｋアクセッションナンバーに開示される配列を指す。
ＶＲ１領域は、Ｔ＝１の二十面体のキャプシド構造を有するＡＡＶ血清型およびパルボウイルスのキャプシドタンパク質配列の当該分野で認識される部分である。ＶＲ１領域を構成するループは、ＡＡＶ１のアミノ酸残基２５８～２７２または別のＡＡＶまたはパルボウイルス由来の対応するアミノ酸残基から本質的になる。ＶＲ１ループは良く認識された構造であるので、対応するアミノ酸残基は、当業者によって容易に同定され得る。例えば、表４のリストは、例示的なＶＲ１アミノ酸残基のリストを含む。特定の残基が挙げられるが、ＶＲ１領域の境界はおよそであり、１つまたは２つの残基によって変化し得ることが当業者によって理解される。
パルボウイルスおよびＡＡＶのＶＲ１領域は、その領域を安定化する多くの水素結合によって特徴付けられる。例えば、ＡＡＶ１キャプシドは、ＶＲ１領域内に４つの水素結合を含み、ＡＡＶ６キャプシドは、ＢＲ１領域内に２つの水素結合を含む（図８参照）。ＶＲ１ループの安定性は、領域内の水素結合の１つまたは複数を除去することによって、例えば、水素結合に関与するアミノ酸残基を欠失させることにより、または、水素結合を形成しない残基でアミノ酸残基を置換することによって、低減され得る。一部の実施態様では、少なくとも１、２、３、または４またはそれより多くの水素結合が、ＶＲ１ループ内で破壊される。
ＶＲ１ループ内のアミノ酸残基によって形成される水素結合は、キャプシドタンパク質結晶構造、キャプシドタンパク質核磁気共鳴構造、配列ホモロジーの比較のコンピューター分析などを含む、当技術分野で知られている方法によって同定され得る。ＶＲ１ループ内の水素結合に直接関与するアミノ酸残基の例を表５に挙げる。
例えば、結晶構造は、ＮＩＨ基金を用いて作られた全ての構造のための公的にアクセス可能な貯蔵所であるＲＣＳＢタンパク質データバンク（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）のような公共データベースからダウンロードされ得る。個々のｐｄｂファイルは、与えられた構造／ｐｄｂファイルにおける水素結合の位置に関する視覚的情報を提供するために、結晶構造内の個々の分子間の幾何的関係ならびにそれらの電子雲の位置を解析する、公的に利用可能なＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ４構造検証プログラム（ｗｗｗ．ｍｏｌｐｒｏｂｉｄｉｔｙ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ）のような構造妥当性プログラムを通して実行され得る。ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙの出力は、水素結合を含む結晶構造のグラフィック表示であるＫｉｎｅｍａｇｅであり、それは、公に利用可能なソフトウェアプログラムＫｉＮＧ（ｗｗｗ．ｋｉｎｅｍａｇｅ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ）を用いて可視化され得る。
一部の実施態様では、改変キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターの形質導入効率は、改変を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％、またはそれよりも多く増大される。改変を含まないキャプシドタンパク質は、本発明の改変を含まない限り、野生型キャプシドタンパク質であってよく、または、合成のキャプシドタンパク質であってよい。形質導入効率は、当技術分野でよく知られていて本明細書に記載される技術によって測定され得る。
一部の実施態様では、改変キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターの組織特異性は、変更され得る。特定の実施態様では、筋肉、例えば、骨格筋および／または心筋の形質導入は、改変を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％、またはそれより多く増大される。特定の実施態様では、肝臓の形質導入は、改変を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％、またはそれより多く低減される。一部の実施態様では、改変を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、筋肉の形質導入は増大されて、肝臓の形質導入は低減される。特定の実施態様では、肝臓の形質導入は、改変を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％、またはそれより多く増大される。
一部の実施態様では、キャプシドは、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質のアミノ酸残基２５８～２７２または別のＡＡＶまたはパルボウイルスキャプシドタンパク質由来の対応するアミノ酸残基の１つまたは複数のアミノ酸残基を欠失または置換することによって改変されて、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０またはそれより多い残基が欠失または置換される。欠失または置換される残基は、水素結合ネットワークに参加している残基に関する回転異性体の状態に変化をもたらすＶＲ１内の任意の残基であってよい。別の実施態様では、キャプシドは、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質のアミノ酸残基２６１～２６９または別のＡＡＶまたはパルボウイルスキャプシドタンパク質由来の対応するアミノ酸残基の１つまたは複数のアミノ酸残基を欠失または置換することによって改変される。さらなる実施態様では、キャプシドは、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質のアミノ酸残基２６５または別のＡＡＶまたはパルボウイルスキャプシドタンパク質由来の対応するアミノ酸残基を欠失または置換することによって改変される。
特定の実施態様では、改変がＡＡＶ１またはＡＡＶ６キャプシドになされて、筋肉形質導入の増大および肝臓形質導入の低減をもたらす。特定の実施態様では、改変がＡＡＶ７、ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９キャプシドになされて、筋肉形質導入を維持しながら肝臓形質導入の低減をもたらす。一部の実施態様では、改変は、表６に示される改変の１つまたは複数である。特定の実施態様では、改変キャプシドは、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ４、またはＡＡＶ５由来でない。
一部の実施態様では、キャプシドは、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸残基２６４または別のＡＡＶまたはパルボウイルスキャプシドタンパク質由来の対応するアミノ酸残基の後ろに１つまたは複数のアミノ酸残基（例えば、アスパラギン酸）を挿入することによって改変される。別の実施態様では、キャプシドは、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質のアミノ酸残基２６５のアミノ酸残基または別のＡＡＶまたはパルボウイルスキャプシドタンパク質由来の対応するアミノ酸残基を（例えば、アスパラギン酸で）置換することによって改変される。
特定の実施態様では、改変がＡＡＶ１、ＡＡＶ２、またはＡＡＶ３ｂキャプシドになされて、肝臓形質導入の増大をもたらす。特定の実施態様では、改変がＡＡＶ６キャプシドになされて、肝臓形質導入および筋肉形質導入の増大をもたらす。特定の実施態様では、肝臓の形質導入は、改変を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して少なくとも約１０％、例えば、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％、５００％、またはそれより多く増大される。他の実施態様では、改変は、表７に示される改変の１つまたは複数である。
本発明のさらなる態様は、キャプシドタンパク質のヘパリン硫酸結合能の低減の、形質導入効率に対する効果に関する。本明細書における実施例は、ヘパリン硫酸へのキャプシドタンパク質の結合を実質的に低減させることは、形質導入効率を高めることを示す。ある場合には、ヘパリン硫酸結合能の実質的な低減は、ＶＲ１ループの不安定化とアロステリックに相互作用して、いずれかの改変単独と比較して、形質導入効率の実質的な増大を提供することがさらに示される。
本発明の一態様では、ＶＲ１ループ内に改変を含むキャプシドタンパク質は、ヘパリン硫酸に結合するＡＡＶ血清型または他のパルボウイルス由来であり、ヘパリン硫酸へのキャプシドタンパク質の結合を仲介する１つまたは複数のアミノ酸残基が置換および／または欠失されて、ここで、ヘパリン硫酸へのキャプシドタンパク質の結合は、実質的に低減される。本明細書において用いられる用語「実質的に低減される」は、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれよりも高い、ヘパリン硫酸結合能力の低減を指す。ヘパリン硫酸へのキャプシドタンパク質の結合は、当技術分野でよく知られていて本明細書において説明される技術によって測定され得る。
一部の実施態様では、ヘパリン硫酸に結合するキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ８血清型由来である。一部の実施態様では、ヘパリン硫酸に結合するキャプシドタンパク質は、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ８血清型由来である。これらの血清型のそれぞれにおいてヘパリン硫酸結合に関与するアミノ酸残基（単数または複数）は、当技術分野でよく知られている。例は、制限されずに、ＡＡＶ２内のＲ４８４、Ｒ４８７、Ｋ５３２、Ｒ５８５、およびＲ５８８、ＡＡＶ６内のＫ５３１、および、ＡＡＶ３ｂ内のＲ５９４を含む。一部の実施態様では、ヘパリン硫酸に結合するキャプシドタンパク質は、ヘパリン硫酸結合能を提供するように改変された任意の合成ＡＡＶまたはパルボウイルスキャプシドタンパク質を含む。
一実施態様では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ６血清型由来のアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸残基５３１は、例えばグルタミン酸で置換することによって、ヘパリン硫酸への結合を実質的に低減するように置換されている。別の実施態様では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２血清型由来のアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸残基５８５は、例えばグルタミン酸で置換することによって、ヘパリン硫酸への結合を実質的に低減するように置換されている。別の実施態様では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ３ｂ血清型由来のアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸残基５９４は、例えばアラニンで置換することによって、ヘパリン硫酸への結合を実質的に低減するように置換されている。
本発明の別の態様は、ヘパリン硫酸へのキャプシドタンパク質の結合を仲介する１つまたは複数のアミノ酸残基が置換および／または欠失されたキャプシドタンパク質に関し、ここで、ヘパリン硫酸へのキャプシドタンパク質の結合は、実質的に低減される。一部の実施態様では、これらのキャプシドタンパク質は、ＶＲ１ループ内に改変を有さない。一部の実施態様では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ８血清型由来のアミノ酸配列を含む。一実施態様では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ６血清型由来のアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸残基５３１は、例えばグルタミン酸で置換することによって、ヘパリン硫酸への結合を実質的に低減するように置換されている。
本発明のさらなる態様は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３ａ、またはＡＡＶ３ｂ血清型由来のアミノ酸配列を含むＡＡＶキャプシドタンパク質に関し、ここで、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質の残基２６４またはＡＡＶ３ａまたはＡＡＶ３ｂキャプシドタンパク質の対応する残基の直後に、１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入を含み、ヘパリン硫酸へのキャプシドタンパク質の結合を仲介する１つまたは複数のアミノ酸残基は、置換および／または欠失されて、ここで、ヘパリン硫酸へのキャプシドタンパク質の結合は、実質的に低減されて；ここで、キャプシドタンパク質は、キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターに、非改変キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して増大した形質導入効率を提供する。
ＡＡＶ２キャプシドタンパク質の残基２６４の直後の１つまたは複数のアミノ酸残基の挿入は、形質導入効率を高めることが示されている（例えば、米国特許第７，８９２，８０９号を参照し、その全体で参照により本明細書中に援用される）。一実施態様では、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質の残基２６４またはＡＡＶ３ａまたはＡＡＶ３ｂキャプシドタンパク質の対応する残基の直後の挿入は、アスパラギン酸、グルタミン酸、またはフェニルアラニン残基である。一実施態様では、キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ２血清型由来のアミノ酸配列を含み、ここで、アミノ酸残基５８５は、ヘパリン硫酸への結合を実質的に低減するように、例えばグルタミン酸によって置換されている。
本発明のさらなる態様は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質のアミノ酸残基２５８～２７２または別のＡＡＶまたはパルボウイルスキャプシドタンパク質由来の対応するアミノ酸残基の１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失および／または置換を含み、そして、例えば心臓の形質導入効率を改善するようにチロシン残基の置換をさらに含む、ＡＡＶキャプシドタンパク質に関する。ｒＡＡＶキャプシド表面上の選択チロシン残基の突然変異は、核に到達することができる前に、細胞内キャプシドの最終的なプロテアソーム分解およびリン酸化を避けることによって、ｒＡＡＶ形質導入効率を高めることが示されている（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３８１（２）：１９４（２００８））。一部の実施態様では、チロシン置換は、ＡＡＶ１またはＡＡＶ６内のＹ４４５Ｆである。
本発明の一態様は、本発明のキャプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドに関する。一部の実施態様では、ポリヌクレオチドは、本発明のキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列、例えば、本明細書に開示される配列の１つを含む、から本質的になる、またはからなる。他の実施態様では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるキャプシドタンパク質配列の１つと少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、から本質的になる、またはからなる。
本発明のさらなる他の態様は、本発明のキャプシドタンパク質を含むパルボウイルスキャプシドに関する。一部の実施態様では、キャプシド内のキャプシドタンパク質の全ては、本発明のキャプシドタンパク質である。他の実施態様では、キャプシド内のキャプシドタンパク質の全てではないが一部は、本発明のキャプシドタンパク質である。
また、本発明は、本発明のパルボウイルスキャプシドを含むウイルスベクターも提供する。ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターのようなパルボウイルスベクターであってよい。ウイルスベクターは、組み換えウイルステンプレートを含む核酸をさらに含んでよく、ここで、核酸は、パルボウイルスキャプシドによってキャプシド形成される。本発明は、本発明のキャプシドタンパク質を含む組み換えパルボウイルス粒子（例えば、組み換えＡＡＶ粒子）をさらに提供する。ウイルスベクターおよびウイルス粒子は、以下にさらに述べられる。
特定の実施態様では、ウイルスベクターは、本発明のキャプシドタンパク質の存在に起因して、改善された向性を示す。一実施態様では、パルボウイルスベクターは、骨格筋、心筋、および／または横隔膜筋に関する、例えば、骨格筋に関する全身向性を示す。他の実施態様では、パルボウイルスベクターは、野生型キャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、肝臓に関する低減された向性を有する。
ウイルスベクターを生産する方法
本発明は、ウイルスベクターを生産する方法をさらに提供する。１つの特定の実施態様では、本発明は、組み換えパルボウイルス粒子を生産する方法を提供し、パルボウイルス複製を許容する細胞に：（ａ）（ｉ）異種ヌクレオチド配列および（ｉｉ）パルボウイルスＩＴＲを含む組み換えパルボウイルステンプレート；（ｂ）本発明のＲｅｐコード配列およびＣａｐコード配列を含むポリヌクレオチドを；組み換えパルボウイルステンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件下で、提供するステップを含み；それにより、細胞において組み換えパルボウイルス粒子が生産される。組み換えパルボウイルステンプレートの複製およびパッケージングに十分な条件は、例えば、パルボウイルステンプレートの複製およびパルボウイルスキャプシド中へのキャプシド形成に十分なＡＡＶ配列（例えば、パルボウイルスｒｅｐ配列およびパルボウイルスｃａｐ配列）およびアデノウイルスおよび／またはヘルペスウイルス由来のヘルパー配列の存在であり得る。特定の実施態様では、パルボウイルステンプレートは、２つのパルボウイルスＩＴＲ配列を含み、それは、異種核酸配列に対して５’および３’に位置するが、それに直接的に隣接する必要はない。
一部の実施態様では、組み換えパルボウイルステンプレートは、Ｒｅｐによって分解されないＩＴＲを含み、国際特許公報ＷＯ０１／９２５５１において記載される二重のＡＡＶベクターを作る。
パルボウイルステンプレートおよびパルボウイルスｒｅｐおよびｃａｐ配列は、パルボウイルスキャプシド内にパッケージされたパルボウイルステンプレートを含むウイルスベクターが細胞において生産されるような条件下で提供される。当該方法は、細胞からウイルスベクターを回収するステップをさらに含んでよい。ウイルスベクターは、培地から、および／または、細胞を溶解させることによって、回収され得る。
細胞は、パルボウイルスウイルス複製を許容する細胞であってよい。当技術分野で知られている任意の適切な細胞が用いられ得る。特定の実施態様では、細胞は、哺乳類の細胞（例えば、霊長類またはヒト細胞）である。別の選択肢として、細胞は、複製欠損ヘルパーウイルスから欠失された機能を与えるトランス補完パッケージング細胞株、例えば、２９３細胞または他のＥ１ａトランス補完細胞であってよい。
パルボウイルス複製およびキャプシド配列は、当技術分野で知られている任意の方法によって提供され得る。現行のプロトコルは、典型的に、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を単一のプラスミド上に発現する。パルボウイルス複製およびパッケージング配列は、一緒に与えられる必要はないが、そうすることが便利であり得る。パルボウイルスｒｅｐおよび／またはｃａｐ配列は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクターによって提供され得る。例えば、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、ハイブリッドアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供され得る（例えば、欠失されたアデノウイルスベクターのＥ１ａまたはＥ３領域内に挿入される）。また、ＥＢＶベクターを用いてパルボウイルスｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子を発現してもよい。この方法の１つの利点は、ＥＢＶベクターがエピソームであり、さらに、継続的な細胞分裂にわたって高いコピー数を維持することである（すなわち、「ＥＢＶに基づく核エピソーム」と指定される染色体外エレメントとして細胞内に安定して組み込まれる。Ｍａｒｇｏｌｓｋｉ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．１５８：６７を参照）。
さらなる代替として、ｒｅｐ／ｃａｐ配列は、細胞内に安定的に組み込まれ得る。
典型的に、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列のレスキューおよび／またはパッケージングを防ぐために、ＴＲによって隣接されない。
パルボウイルステンプレートは、当技術分野で知られている任意の方法を用いて細胞に提供され得る。例えば、テンプレートは、非ウイルス（例えば、プラスミド）またはウイルスベクターによって供給され得る。特定の実施態様では、パルボウイルステンプレートは、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスベクターによって供給される（例えば、欠失されたアデノウイルスのＥ１ａまたはＥ３領域内に挿入される）。別の説明として、Ｐａｌｏｍｂｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５０２５は、ＡＡＶ ＴＲによって隣接されたレポーター遺伝子を保有するバキュロウイルスベクターを記載する。ＥＢＶベクターは、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に関して上述のように、テンプレートを送達するために用いられてもよい。
別の代表的な実施態様では、パルボウイルステンプレートは、複製ｒＡＡＶウイルスによって提供される。さらに他の実施態様では、パルボウイルステンプレートを含むＡＡＶプロウイルスは、細胞の染色体に安定的に組み込まれる。
ウイルス力価を高めるために、生産的なパルボウイルス感染を促進するヘルパーウイルス機能（例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス）が細胞に提供され得る。パルボウイルス複製に必要なヘルパーウイルス配列は、当技術分野で知られている。典型的に、これらの配列は、ヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスベクターによって提供される。あるいは、アデノウイルスまたはヘルペスウイルス配列は、別の非ウイルスまたはウイルスベクターによって、例えば、Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３：１２９５、および、米国特許第６，０４０，１８３号および第６，０９３，５７０号によって説明されるように、効率的なパルボウイルス生産を促進するヘルパー遺伝子の全てを保有する非感染性アデノウイルスミニプラスミドとして、提供され得る。
さらに、ヘルパーウイルス機能は、染色体内に埋め込まれた、または、安定した染色体外エレメントとして維持された、ヘルパー配列を有するパッケージング細胞によって提供され得る。一般に、ヘルパーウイルス配列は、ＡＡＶビリオン内にパッケージングされ得ず、例えば、ＩＴＲによって隣接されない。
当業者は、パルボウイルス複製、および、単一のヘルパー構築物上のキャプシド配列およびヘルパーウイルス配列（例えば、アデノウイルス配列）を提供することが有利であり得ることを理解する。このヘルパー構築物は、非ウイルスまたはウイルス構築物であってよい。１つの非限定的な例示として、ヘルパー構築物は、ＡＡＶ ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子を含むハイブリッドアデノウイルスまたはハイブリッドヘルペスウイルスであってよい。
１つの特定の実施態様では、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。このベクターは、パルボウイルステンプレートをさらに含んでよい。パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列および／またはパルボウイルステンプレートは、アデノウイルスの欠失領域（例えば、Ｅ１ａまたはＥ３領域）に挿入され得る。
さらなる実施態様では、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって供給される。この実施態様によれば、パルボウイルステンプレートは、プラスミドテンプレートとして提供され得る。
別の実例となる実施態様では、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーベクターによって提供されて、パルボウイルステンプレートは、プロウイルスとして細胞内に組み込まれる。あるいは、パルボウイルステンプレートは、染色体外エレメントとして（例えば、ＥＢＶに基づく核エピソームとして）細胞内に維持されるＥＢＶベクターによって提供される。
さらなる例示的な実施態様では、パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列およびアデノウイルスヘルパー配列は、単一のアデノウイルスヘルパーによって提供される。パルボウイルステンプレートは、別個の複製ウイルスベクターとして提供され得る。例えば、パルボウイルステンプレートは、パルボウイルス粒子または第二の組み換えアデノウイルス粒子によって提供され得る。
前述の方法によれば、ハイブリッドアデノウイルスベクターは、典型的に、アデノウイルス複製およびパッケージングに十分なアデノウイルス５’および３’ｃｉｓ配列（すなわち、アデノウイルス末端反復およびＰＡＣ配列）を含む。パルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列、および存在する場合は、ＡＡＶテンプレートは、アデノウイルス主鎖に埋め込まれて、これらの配列がアデノウイルスキャプシド内にパッケージされ得るように、５’および３’ｃｉｓ配列によって隣接される。上述のように、アデノウイルスヘルパー配列およびパルボウイルスｒｅｐ／ｃａｐ配列は、これらの配列がパルボウイルスビリオン内にパッケージされないように、一般に、ＩＴＲによって隣接されない。
Ｚｈａｎｇら（（２００１）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１８：７０４－１２）は、アデノウイルスおよびＡＡＶのｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の両方を含む、キメラヘルパーを記載する。
また、ヘルペスウイルスが、パルボウイルスパッケージング方法においてヘルパーウイルスとして用いられてもよい。パルボウイルスＲｅｐタンパク質（単数または複数）をコードするハイブリッドヘルペスウイルスは、スケーラブルなパルボウイルスベクター生産スキームを有利に促進し得る。ＡＡＶ－２ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現しているハイブリッド単純ヘルペスウイルスタイプＩ（ＨＳＶ－１）ベクターが記載されている（Ｃｏｎｗａｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．６：９８６およびＷＯ００／１７３７７。
さらなる代替として、本発明のウイルスベクターは、例えば、Ｕｒａｂｅ ｅｔ ａｌ．，（２００２）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９３５－４３によって説明されるように、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子およびパルボウイルステンプレートを送達するために、バキュロウイルスベクターを用いて昆虫細胞内に生産され得る。
ヘルパーウイルスの汚染がないパルボウイルスベクターストックは、当技術分野で知られている任意の方法によって得ることができる。例えば、パルボウイルスおよびヘルパーウイルスは、サイズに基づいて容易に区別され得る。また、パルボウイルスは、ヘパリン基質に関する親和性に基づいて、ヘルパーウイルスから区別され得る（Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：９７３）。いかなる汚染ヘルパーウイルスも複製能力がないように、欠損した複製欠損ヘルパーウイルスが用いられ得る。さらなる代替として、アデノウイルス初期遺伝子発現のみがパルボウイルスのパッケージングを仲介するのに必要とされるので、後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルスヘルパーが用いられ得る。後期遺伝子発現が欠損したアデノウイルス突然変異体は、当技術分野で知られている（例えば、ｔｓ１００Ｋおよびｔｓ１４９アデノウイルス突然変異体）。
組み換えウイルスベクター
本発明のウイルスベクターは、インビトロ、エクスビボ、およびインビボでの、細胞への核酸の送達に有用である。特に、ウイルスベクターは、哺乳類を含む動物の細胞に、核酸を送達または移行するために有利に用いられ得る。
任意の目的の異種核酸配列（単数または複数）は、本発明のウイルスベクターにおいて送達され得る。目的の核酸は、治療用（例えば、医療用または獣医用途）、免疫原性（例えば、ワクチン用）、または診断用ポリペプチドを含む、ポリペプチドをコードする核酸を含む。
治療用ポリペプチドは、限定されないが、嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン（ミニ－およびマイクロ－ジストロフィンを含む（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ５：１３０；米国特許公報番号２００３／０１７１３１；国際公報ＷＯ／２００８／０８８８９５、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９７：１３７１４－１３７１９（２０００）；および、Ｇｒｅｇｏｒｅｖｉｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６：６５７－６４（２００８）を参照）、ミオスタチンプロペプチド、ホリスタチン、アクチビンタイプＩＩ可溶性受容体、ＩＧＦ－１、抗炎症性ポリペプチド、例えばＩκＢ優勢突然変異体、サルコスパン、ユートロフィン（Ｔｉｎｓｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ３８４：３４９）、ミニ－ユートロフィン、凝固因子（例えば、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子など）、エリスロポエチン、アンギオスタシン、エンドスタチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レプチン、ＬＤＬ受容体、リポタンパク質リパーゼ、オルニチントランスカルバミラーゼ、β－グロビン、α－グロビン、スペクトリン、α１－アンチトリプシン、アデノシンデアミナーゼ、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、β－グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、リソソームヘキソサミニダーゼＡ、分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ、ＲＰ６５タンパク質、サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、インターフェロン－γ、インターロイキン－２、インターロイキン－４、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド増殖因子、神経栄養因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子、上皮増殖因子、線維芽細胞増殖因子、神経成長因子、神経栄養因子－３および－４、脳由来神経栄養因子、骨形態形成タンパク質［ＲＡＮＫＬおよびＶＥＧＦを含む］、グリア由来増殖因子、形質転換増殖因子－αおよび－βなど）、リソソーム酸α－グルコシダーゼ、β－ガラクトシダーゼＡ、受容体（例えば、腫瘍壊死増殖因子α可溶性受容体）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼタイプ６、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼタイプ２ノックダウンに影響を与える分子、例えば、トランケートされた構成的に活性のｂＡＲＫｃｔ、抗炎症性因子、例えばＩＲＡＰ、抗ミオスタチンタンパク質、アスパルトアシラーゼ、およびモノクローナル抗体（単鎖モノクローナル抗体を含む；例示的なＭａｂは、ハーセプチン（登録商標）Ｍａｂである）を含む。他の例示的な異種核酸配列は、自殺遺伝子産物（例えば、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、および腫瘍壊死因子）、癌治療で用いられる薬物に対して抵抗性を与えるタンパク質、腫瘍抑制伝子産物（例えば、ｐ５３、Ｒｂ、Ｗｔ－１）、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンド、および、それを必要とする対象において治療的効果を有する任意の他のポリペプチドをコードする。また、パルボウイルスベクターは、モノクローナル抗体および抗体フラグメント、例えば、ミオスタチンに対して向けられる抗体または抗体フラグメントを送達するためにも用いられ得る（例えば、Ｆａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：５８４－５９０（２００５）を参照）。
ポリペプチドをコードする異種核酸配列は、レポーターポリペプチド（例えば酵素）をコードするものを含む。レポーターポリペプチドは、当技術分野で知られていて、限定されないが、グリーン蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、ルシフェラーゼ、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子を含む。
あるいは、本発明の特定の実施態様では、異種核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば米国特許第５，８７７，０２２号に記載）、スプライセオソームが介在するトランス－スプライシングに作用するＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６；米国特許第６，０１３，４８７号；米国特許第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子サイレンシングを仲介する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを含む干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７：２４３１を参照）、および、他の非翻訳ＲＮＡ、例えば「ガイド」ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４９２９；Ｙｕａｎらの米国特許第５，８６９，２４８号）などをコードしてよい。例示的な非翻訳ＲＮＡは、多剤耐性（ＭＤＲ）遺伝子産物に対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療および／または防止するため、および／または、化学療法によるダメージを防ぐために心臓に投与するため）、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ（例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーのため）、ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ（例えば、腫瘍を治療および／または防止するため）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ（例えば、心血管系の疾患を治療するため、例えば、Ａｎｄｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．１０：１３２－１４２（２００８）およびＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｉｎ．２６：５１－５５（２００５）を参照）；ホスホランバン阻害またはドミナントネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ（例えば、心血管系の疾患を治療するため、例えば、Ｈｏｓｈｉｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８６４－８７１（２００２）を参照）、アデノシンキナーゼに対するＲＮＡｉ（例えば、てんかんのため）、サルコグリカンに対するＲＮＡｉ［例えば、α、β、γ］、ミオスタチン、ミオスタチンプロペプチド、ホリスタチン、またはアクチビンタイプＩＩ可溶性受容体に対するＲＮＡｉ、ＩκＢ優勢突然変異体のような抗炎症性ポリペプチドに対するＲＮＡｉ、および、病原体およびウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、ＣＭＶ、単純ヘルペスウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスなど）に対して向けられるＲＮＡｉを含む。
あるいは、本発明の特定の実施態様では、異種核酸は、タンパク質ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－１）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、β２－アドレナリン受容体、β２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼタイプ２ノックダウンに影響を与える分子、例えば、トランケートされた構成的に活性のｂＡＲＫｃｔ；カルサルシン、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害またはドミナントネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓ、または骨形態形成タンパク質（ＢＮＰ２、７など、ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦを含む）をコードしてよい。
また、ウイルスベクターは、宿主染色体上の遺伝子座と相同性を共有して組み換える異種核酸を含んでもよい。この手法は、例えば、細胞内の遺伝的欠陥を修正するために使用され得る。
また、本発明は、例えば、ワクチン接種のための、免疫原性ポリペプチドを発現するウイルスベクターも提供する。核酸は、制限されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、インフルエンザウイルス、ＨＩＶまたはＳＩＶ ｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌性抗原、ウイルス抗原など由来の免疫原を含む、当技術分野で知られている目的の任意の免疫原をコードしてよい。
ワクチンベクターとしてのパルボウイルスの使用は、当技術分野で知られている（例えば、Ｍｉｙａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ９１：８５０７；米国特許第５，９１６，５６３号（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，９０５，０４０号（Ｍａｚｚａｒａ ｅｔ ａｌ．）、米国特許第５，８８２，６５２号、米国特許第５，８６３，５４１号（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．）を参照）。抗原は、パルボウイルスキャプシド内に存在してよい。あるいは、抗原は、組み換えベクターゲノム内に導入された異種核酸から発現されてよい。本明細書に記載されて、および／または、当技術分野で知られている、目的の任意の免疫原は、本発明のウイルスベクターによって提供され得る。
免疫原性ポリペプチドは、免疫応答を引き起こすのに、および／または、制限されないが、微生物、細菌、原生動物、寄生性、真菌および／またはウイルス感染および疾患を含む感染および／または疾患に対して対象を保護するのに、適切な任意のポリペプチドであってよい。例えば、免疫原性ポリペプチドは、オルソミクソウイルス免疫原（例えば、インフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）表面タンパク質またはインフルエンザウイルス核タンパク質のようなインフルエンザウイルス免疫原、または、ウマインフルエンザウイルス免疫原）、または、レンチウイルス免疫原（例えば、ウマ伝染性貧血ウイルス免疫原、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）免疫原、または、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）免疫原、例えば、ＨＩＶまたはＳＩＶエンベロープＧＰ１６０タンパク質、ＨＩＶまたはＳＩＶマトリックス／キャプシドタンパク質、および、ＨＩＶまたはＳＩＶ ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子産物）であってよい。また、免疫原性ポリペプチドは、アレナウイルス免疫原（例えば、ラッサ熱ウイルスヌクレオカプシドタンパク質およびラッサ熱エンベロープ糖タンパク質のようなラッサ熱ウイルス免疫原）、ポックスウイルス免疫原（例えば、ワクシニアＬ１またはＬ８遺伝子産物のような、ワクシニアウイルス免疫原）、フラビウイルス免疫原（例えば、黄熱病ウイルス免疫原または日本脳炎ウイルス免疫原）、フィロウイルス免疫原（例えば、エボラウイルス免疫原、または、マールブルグウイルス免疫原、例えば、ＮＰおよびＧＰ遺伝子産物）、ブニヤウイルス免疫原（例えば、ＲＶＦＶ、ＣＣＨＦ、および／またはＳＦＳウイルス免疫原）、または、コロナウイルス免疫原（例えば、ヒトコロナウイルスエンベロープ糖タンパク質のような感染性ヒトコロナウイルス免疫原、またはブタ伝染性胃腸炎ウイルス免疫原、または鳥類感染性気管支炎ウイルス免疫原）であってもよい。免疫原性ポリペプチドは、さらに、ポリオ免疫原、ヘルペス免疫原（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶ、ＨＳＶ免疫原）、おたふく免疫原、麻疹免疫原、風疹免疫原、ジフテリア毒素または他のジフテリア免疫原、百日咳抗原、肝炎（例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎など）免疫原、および／または、当技術分野で現在知られているまたは後に免疫原として同定される任意の他のワクチン免疫原であってよい。
あるいは、免疫原性ポリペプチドは、任意の腫瘍または癌細胞抗原であってよい。任意選択で、腫瘍または癌抗原は、癌細胞の表面上に発現される。例示的な癌および腫瘍細胞抗原は、Ｓ．Ａ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １０：２８１（１９９１））に記載される。他の例示的な癌および腫瘍抗原は、限定されないが：ＢＲＣＡ１遺伝子産物、ＢＲＣＡ２遺伝子産物、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ＧＡＧＥ－１／２、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤＫ－４、β－カテニン、ＭＵＭ－１、カスパーゼ－８、ＫＩＡＡ０２０５、ＨＰＶＥ、ＳＡＲＴ－１、ＰＲＡＭＥ、ｐ１５、メラノーマ腫瘍抗原（Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：３５１５；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８０：３４７；Ｋａｗａｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３１２４）、ＭＡＲＴ－１、ｇｐ１００ ＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－２、ＭＡＧＥ－３、ＣＥＡ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、Ｐ－１５、チロシナーゼ（Ｂｒｉｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：４８９）；ＨＥＲ－２／ｎｅｕ遺伝子産物（米国特許第４，９６８，６０３号）、ＣＡ１２５、ＬＫ２６、ＦＢ５（エンドシアリン）、ＴＡＧ７２、ＡＦＰ、ＣＡ１９－９、ＮＳＥ、ＤＵ－ＰＡＮ－２、ＣＡ５０、ＳＰａｎ－１、ＣＡ７２－４、ＨＣＧ、ＳＴＮ（シアリルＴｎ抗原）、ｃ－ｅｒｂＢ－２タンパク質、ＰＳＡ、Ｌ－ＣａｎＡｇ、エストロゲン受容体、乳脂肪グロブリン、ｐ５３腫瘍抑制タンパク質（Ｌｅｖｉｎｅ，（１９９３）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：６２３）；ムチン抗原（国際特許公報番号ＷＯ９０／０５１４２）；テロメラーゼ；核マトリックスタンパク質；前立腺酸性ホスファターゼ；乳頭腫ウイルス抗原；および／または、メラノーマ、腺癌、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺癌、肝臓癌、結腸癌、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、膵癌、脳腫瘍および現在知られまたは後に同定される任意の他の癌または悪性状態を含む癌と関連することが現在知られまたは後に発見される抗原（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１－９１を参照）。
さらなる代替として、異種核酸は、インビトロ、エクスビボで、またはインビボで細胞内に好ましく生産される任意のポリペプチドをコードしてよい。例えば、ウイルスベクターは、培養細胞およびそこから単離された発現された遺伝子産物へ導入されてよい。
目的の異種核酸（単数または複数）は、適切な制御配列と動作可能に関連し得ることが当業者によって理解される。例えば、異種核酸は、転写／翻訳制御シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、および／またはエンハンサーなどのような、発現制御エレメントと動作可能に関連し得る。
当業者は、所望のレベルおよび組織特異的発現に応じて、様々なプロモーター／エンハンサーエレメントが用いられ得ることを理解する。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成的または誘導性であってよい。プロモーター／エンハンサーは、ネイティブまたは外来であってよく、天然または合成の配列であってよい。外来とは、転写開始領域が導入される野生型宿主内に、転写開始領域が見られないことを意図する。
特定の実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、標的細胞または治療される対象にネイティブであってよい。代表的な実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、異種核酸配列に対してネイティブであってよい。プロモーター／エンハンサーエレメントは、一般に、目的の標的細胞（単数または複数）内でそれが機能するように選択される。さらに、特定の実施態様では、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳類のプロモーター／エンハンサーエレメントである。プロモーター／エンハンサーエレメントは、構成的または誘導性であってよい。
誘導性発現制御エレメントは、典型的に、異種核酸配列（単数または複数）の発現に対して制御を提供することが望ましい適用において有利である。遺伝子送達のための誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、組織特異的または好適プロモーター／エンハンサーエレメントであってよく、筋肉特異的または好適（心筋、骨格筋および／または平滑筋特異的または好適を含む）、神経組織特異的または好適（脳特異的または好適を含む）、眼特異的または好適（網膜特異的および角膜特異的を含む）、肝臓特異的または好適、骨髄特異的または好適、膵臓特異的または好適、脾臓特異的または好適、および肺特異的または好適な、プロモーター／エンハンサーエレメントを含む。他の誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、ホルモン誘導性および金属誘導性エレメントを含む。例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントは、限定されないが、Ｔｅｔ ｏｎ／ｏｆｆエレメント、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、および、メタロチオネインプロモーターを含む。
異種核酸配列（単数または複数）が転写されて、その結果、標的細胞内で翻訳される実施態様では、特異的な開始シグナルが、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために一般に含まれる。これらの外因性の翻訳制御配列は、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含んでよく、天然および合成の両方の様々な由来であってよい。
本発明に係るウイルスベクターは、分裂および非分裂細胞を含む広範な細胞内に異種核酸を送達するための手段を提供する。ウイルスベクターは、例えばインビトロでポリペプチドを生産するために目的の核酸を細胞にインビトロで送達するために、または、エクスビボでの遺伝子療法のために、用いられ得る。ウイルスベクターは、例えば、免疫原性または治療的ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを発現するために、それを必要とする対象に核酸を送達する方法においてさらに有用である。このようにして、ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡは、対象においてインビボで生産され得る。対象は、ポリペプチドの不足を対象が有するのでポリペプチドを必要とし得る。さらに、当該方法は、対象でのポリペプチドまたは機能性ＲＮＡの生産が何らかの有益な効果を与え得るので実行され得る。
また、ウイルスベクターは、培養細胞または対象において、目的のポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを生産するためにも用いられ得る（例えばスクリーニング方法と組み合わせて、ポリペプチドを生産するためまたは対象に対する機能性ＲＮＡの効果を観察するためのバイオリアクターとして対象を使用する）。
一般に、本発明のウイルスベクターは、治療的ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡを送達することが有益である任意の病状を治療および／または予防するために、ポリペプチドまたは機能性ＲＮＡをコードする異種核酸を送達するために用いられ得る。例示的な病状は、限定されないが：嚢胞性繊維症（嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質）および肺の他の疾患、血友病Ａ（ＶＩＩＩ因子）、血友病Ｂ（ＩＸ因子）、サラセミア（β－グロビン）、貧血（エリスロポエチン）および他の血液障害、アルツハイマー病（ＧＤＦ；ネプリライシン）、多発性硬化症（β－インターフェロン）、パーキンソン病（グリア細胞株由来神経栄養因子［ＧＤＮＦ］）、ハンチントン病（リピートを除去するためのＲＮＡｉ）、筋萎縮性側索硬化症、てんかん（ガラニン、神経栄養因子）、および他の神経障害、癌（エンドスタチン、アンギオスタシン、ＴＲＡＩＬ、ＦＡＳ－リガンド、インターフェロンを含むサイトカイン；ＶＥＧＦに対するＲＮＡｉを含むＲＮＡｉまたは多剤耐性遺伝子産物）、糖尿病（インスリン）、Ｄｕｃｈｅｎｎｅを含む筋ジストロフィー（ジストロフィン、ミニ－ジストロフィン、インスリン様増殖因子Ｉ、サルコグリカン［例えば、α、β、γ］、ミオスタチンに対するＲＮＡｉ、ミオスタチンプロペプチド、ホリスタチン、アクチビンタイプＩＩ可溶性受容体、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優勢突然変異体、サルコスパン、ユートロフィン、ミニ－ユートロフィン、エクソンスキッピングを誘導するための、ジストロフィン遺伝子内のスプライス部位に対するＲＮＡｉ［例えば、ＷＯ／２００３／０９５６４７を参照］、エクソンスキッピングを誘導するための、Ｕ７ ｓｎＲＮＡに対するアンチセンス［例えば、ＷＯ／２００６／０２１７２４を参照］、および、ミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体フラグメント）およびベッカー、ゴーシェ病（グルコセレブロシダーゼ）、ハーラー病（α－Ｌ－イズロニダーゼ）、アデノシンデアミナーゼ欠乏症（アデノシンデアミナーゼ）、グリコーゲン蓄積症（例えば、ファブリ―病［α－ガラクトシダーゼ］およびポンぺ病［リソソーム酸α－グルコシダーゼ］）および他の代謝欠損、先天性気腫（α１－アンチトリプシン）、レッシュ・ナイハン症候群（ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ）、ニーマン・ピック病（スフィンゴミエリナーゼ）、テイ・サックス病（リソソームヘキソサミニダーゼＡ）、メープルシロップ尿症（分岐鎖ケト酸デヒドロゲナーゼ）、網膜変性疾患（および、眼および網膜の他の疾患；例えば、黄斑変性症に関するＰＤＧＦ）、固形臓器の疾患、例えば脳（パーキンソン病［ＧＤＮＦ］、星状細胞腫［エンドスタチン、アンギオスタシンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］、グリア芽腫［エンドスタチン、アンギオスタシンおよび／またはＶＥＧＦに対するＲＮＡｉ］を含む）、肝臓、腎臓、鬱血性心不全または末梢動脈疾患（ＰＡＤ）を含む心臓（例えば、タンパク質ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－１）、ｓｅｒｃａ２ａ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、Ｂａｒｋｃｔ、β２－アドレナリン受容体、β２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ホスホイノシチド－３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼタイプ６、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼタイプ２ノックダウンに影響を与える分子、例えば、トランケートされた構成的に活性のｂＡＲＫｃｔ；カルサルシン、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害またはドミナントネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅなどを、送達することによる）、関節炎（インスリン様増殖因子）、関節障害（インスリン様増殖因子１および／または２）、内膜過形成（例えば、ｅｎｏｓ、ｉｎｏｓを送達することによる）、心臓移植の生存の改善（スーパーオキシドジスムターゼ）、ＡＩＤＳ（可溶性ＣＤ４）、筋消耗（インスリン様増殖因子Ｉ）、腎臓欠乏症（エリスロポエチン）、貧血（エリスロポエチン）、関節炎（抗炎症性因子、例えば、ＩＲＡＰおよびＴＮＦα可溶性受容体）、肝炎（α－インターフェロン）、ＬＤＬ受容体欠乏症（ＬＤＬ受容体）、高アンモニア血症（オルニチントランスカルバミラーゼ）、クラッベ病（ガラクトセレブロシダーゼ）、バッテン病、ＳＣＡ１、ＳＣＡ２およびＳＣＡ３を含む脳脊髄運動失調症、フェニールケトン尿症（フェニルアラニンヒドロキシラーゼ）、自己免疫疾患などを含む。本発明は、臓器移植後にさらに用いられて、移植の成功を増大し、および／または、臓器移植または補助療法のネガティブな副作用を低減することができる（例えば、サイトカイン産生をブロックするための免疫抑制剤または阻害核酸の投与による）。別の例として、骨形態形成タンパク質（ＢＮＰ２、７など、ＲＡＮＫＬおよび／またはＶＥＧＦを含む）は、例えば、癌患者における切断または外科的除去の後に、骨同種移植片とともに投与されてよい。
遺伝子導入は、病状のための治療を理解および提供するための実質的な潜在的用途を有する。欠損遺伝子が公知でクローニングされている多くの遺伝性疾患が存在する。一般に、上記の病状は２つのクラス：一般に劣性の遺伝性である、通常は酵素の不足状態、および、制御または構成的タンパク質が関わってよくて典型的に優性の遺伝性である、非平衡状態に分けられる。不足状態の疾患については、遺伝子導入は、影響を受けた組織内に補充療法のために正常遺伝子を運ぶために、ならびに、アンチセンス突然変異を用いた疾患に関する動物モデルを作製するために、用いられてよい。非平衡病状については、遺伝子導入は、モデル系における病状を作製するために用いられてよく、それから、病状に対抗しようとする試みにおいて用いられてよい。したがって、本発明に係るウイルスベクターは、遺伝性疾患の治療および／または予防を可能にする。
また、本発明に係るウイルスベクターは、機能性ＲＮＡを細胞にインビトロまたはインビボで提供するために用いられてもよい。細胞内での機能性ＲＮＡの発現は、例えば、細胞による特定の標的タンパク質の発現を減少させることができる。したがって、機能性ＲＮＡは、それを必要とする対象において特定のタンパク質の発現を低減させるために投与され得る。また、機能性ＲＮＡは、遺伝子発現および／または細胞生理機能を調節するために、例えば細胞または組織培養系を最適化するために、インビトロで、またはスクリーニング方法で、細胞に投与されてもよい。
本発明に係るウイルスベクターは、診断およびスクリーニング方法における用途を見いだし、それにより、目的の核酸は、細胞培養系、またはあるいは、トランスジェニック動物モデルにおいて一時的または安定的に発現される。
また、本発明のウイルスベクターは、制限されないが、当業者に明らかなように、遺伝子ターゲッティング、クリアランス、転写、翻訳などを評価するためのプロトコルでの使用を含む、様々な非治療的目的のためにも用いられ得る。また、ウイルスベクターは、安全性（拡散、毒性、免疫原性など）を評価する目的のためにも用いられ得る。そのようなデータは、例えば、臨床有効性の評価の前に規制上の承認プロセスの一部として米国食品医薬品局によって考慮される。
さらなる態様として、本発明のウイルスベクターは、対象において免疫応答を生産するために用いられ得る。本実施態様によれば、免疫原性ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含むウイルスベクターは、対象に投与され得て、能動免疫応答は、対象によって免疫原性ポリペプチドに対してマウントされる。免疫原性ポリペプチドは上述される。一部の実施態様では、防御免疫応答が引き起こされる。
あるいは、ウイルスベクターは、エクスビボで細胞に投与され得て、変更された細胞が対象に投与される。異種核酸を含むウイルスベクターが細胞内に導入されて、細胞が対象に投与されて、ここで、免疫原をコードする異種核酸が発現され得て、免疫原に対する対象における免疫応答を誘導する。特定の実施態様では、細胞は、抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）である。
「能動免疫応答」または「能動免疫」は、免疫原と遭遇した後の宿主組織および細胞の「関与によって特徴付けられる。それは、リンパ細網組織内の免疫担当細胞の分化および増殖を含み、抗体の合成または細胞が介在する反応性の発達、または両方をもたらす。」Ｈｅｒｂｅｒｔ Ｂ．Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ，Ｉｍｍｕｎｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ｉｎ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ：ＢＡＳＩＣ ＰＲＯＣＥＳＳＥＳ １１７（Ｊｏｓｅｐｈ Ａ．Ｂｅｌｌａｎｔｉ ｅｄ．，１９８５）。代わりの言い方では、能動免疫応答は、感染またはワクチン接種による免疫原への曝露後に、宿主によってマウントされる。能動免疫は、受動免疫と対比することができ、それは、「能動的に免疫化された宿主から、非免疫宿主への、事前に形成された物質（抗体、伝達因子、胸腺移植片、インターロイキン－２）の移行」を通して獲得される。同上。
本明細書において用いられる「防御」免疫応答または「防御」免疫は、疾患の発生を防止または低減するという点で免疫応答が対象に何らかの利益を与えることを示す。あるいは、防御免疫応答または防御免疫は、疾患、特に癌または腫瘍の治療および／または予防に有用であり得る（例えば、癌または腫瘍形成を防止することにより、癌または腫瘍の回帰を引き起こすことにより、および／または、転移を防止することにより、および／または、転移小瘤の増殖を防止することにより）。防御効果は、完全、または、治療の利益がその任意の不利益を上回る限り部分的であってよい。
特定の実施態様では、異種核酸を含むウイルスベクターまたは細胞は、以下に説明されるように、免疫原性的有効量で投与され得る。
本発明のウイルスベクターは、１つまたは複数の癌細胞抗原（または免疫学的に類似する分子）を発現しているウイルスベクターまたは癌細胞に対して免疫応答を産生する任意の他の免疫原の投与によって、癌免疫療法のために投与されてもよい。説明すると、免疫応答は、例えば、癌を有する患者を治療するために、および／または、対象において癌が進行するのを防ぐために、癌細胞抗原をコードする異種核酸を含むウイルスベクターを投与することによって、対象における癌細胞抗原に対して産生され得る。ウイルスベクターは、本明細書に記載のように、インビボで、またはエクスビボでの方法を用いることによって、対象に投与され得る。あるいは、癌抗原は、ウイルスキャプシドの一部として発現され得て、または、上述のウイルスキャプシドと他の方法で関連する。
別の代替として、当技術分野で知られている任意の他の治療的核酸（例えば、ＲＮＡｉ）またはポリペプチド（例えば、サイトカイン）を投与して、癌を治療および／または予防することができる。
本明細書において用いられる用語「癌」は、腫瘍を形成する癌を包含する。同様に、用語「癌性組織」は、腫瘍を包含する。「癌細胞抗原」は、腫瘍抗原を包含する。
用語「癌」は、体の遠い部位に拡散する潜在性を有する（すなわち転移する）組織の無制御な増殖のような、当該分野においてその理解される意味を有する。例示的な癌は、限定されないが、メラノーマ、腺癌、胸腺腫、リンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫）、肉腫、肺癌、肝臓癌、結腸癌、白血病、子宮癌、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、腎臓癌、膵癌、脳腫瘍および現在知られまたは後に同定される任意の他の癌または悪性状態を含む。代表的な実施態様では、本発明は、腫瘍を形成する癌を治療および／または予防する方法を提供する。
また、用語「腫瘍」は、例えば、多細胞生物内の未分化細胞の異常な腫瘤として、当該分野において理解される。腫瘍は、悪性または良性であってよい。代表的な実施態様では、本明細書において開示される方法は、悪性腫瘍を予防および治療するために用いられる。
用語「癌を治療する」、「癌の治療」および同等の用語によって、癌の重症度が低減または少なくとも部分的に除去されること、および／または、疾患の進行が遅延および／または制御されること、および／または、疾患が安定化されることが意図される。特定の実施態様では、これらの用語は、癌の転移が防止または低減または少なくとも部分的に除去されること、および／または、転移小瘤の増殖が防止または低減または少なくとも部分的に除去されることを示す。
用語「癌の予防」または「癌を予防する」および同等の用語によって、その方法が、癌の発症の発生率および／または重症度を少なくとも部分的に除去または低減および／または遅延させることが意図される。別の言い方をすると、対象における癌の発症は、可能性または蓋然性が低減され得て、および／または、遅延され得る。
特定の実施態様では、細胞は、癌を有する対象から取り出されて、本発明に係るウイルスベクターと接触され得る。改変された細胞は、それから対象に投与されて、それにより、癌細胞抗原に対する免疫応答が引き起こされる。この方法は、十分な免疫応答をインビボでマウントすることができない（すなわち、十分な量で高い抗体を産生することができない）免疫不全の対象で有利に用いられ得る。
免疫応答は、免疫調節性サイトカイン（例えば、α－インターフェロン、β－インターフェロン、γ－インターフェロン、ω－インターフェロン、τ－インターフェロン、インターロイキン－１α、インターロイキン－１β、インターロイキン－２、インターロイキン－３、インターロイキン－４、インターロイキン５、インターロイキン－６、インターロイキン－７、インターロイキン－８、インターロイキン－９、インターロイキン－１０、インターロイキン－１１、インターロイキン１２、インターロイキン－１３、インターロイキン－１４、インターロイキン－１８、Ｂ細胞増殖因子、ＣＤ４０リガンド、腫瘍壊死因子－α、腫瘍壊死因子－β、単球走化性タンパク質－１、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子、およびリンホトキシン）によって高められ得ることが当技術分野で知られている。したがって、免疫調節性サイトカイン（好ましくは、ＣＴＬ誘導性サイトカイン）が、ウイルスベクターとともに対象に投与され得る。
サイトカインは、当技術分野で知られている任意の方法によって投与され得る。外因性サイトカインが対象に投与され得て、またはあるいは、サイトカインをコードする核酸が適切なベクターを用いて対象に送達され得て、そして、サイトカインがインビボで生産され得る。
対象、医薬製剤、および投与モード
本発明に係るウイルスベクターおよびキャプシドは、獣医および医療用途の両方において使用を見いだす。適切な対象は、鳥類および哺乳類の両方を含む。本明細書において用いられる用語「鳥類」は、制限されないが、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、ターキー、キジ、オウム、インコなどを含む。本明細書において用いられる用語「哺乳類」は、制限されないが、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギなどを含む。ヒト対象は、新生児、幼児、未成年および成人を含む。
特定の実施態様では、本発明は、薬学的に許容できる担体中に、および、任意選択で、他の医療薬剤、医薬品、安定化剤、バッファー、担体、アジュバント、希釈剤などの中に、本発明のウイルスベクターおよび／またはキャプシドを含む、医薬組成物を提供する。注入のために、担体は典型的に液体である。投与の他の方法のために、担体は、固体または液体のいずれかであってよい。吸入投与のために、担体は呼吸用であり、任意選択で、固体または液体微粒子形態であってよい。
「薬学的に許容できる」によって、毒性または他の方法で望ましくないようなものでない材料を意味し、すなわち、材料は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに対象に投与され得る。
本発明の一態様は、核酸を細胞にインビトロで移行する方法である。ウイルスベクターは、特定の標的細胞に適切である標準的な形質導入方法に従って、適切な感染多重度で細胞内に導入され得る。投与するウイルスベクターの力価は、標的細胞型および数、および特定のウイルスベクターに応じて変化し得て、過度の実験をせずに当業者によって決定され得る。代表的な実施態様では、少なくとも約１０３感染単位、より好ましくは少なくとも約１０５感染単位が細胞に導入される。
ウイルスベクターが導入される細胞（単数または複数）は、制限されないが、神経系細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特に、ニューロンおよびオリゴデンドロサイトのような脳細胞を含む）、肺細胞、眼の細胞（網膜細胞、網膜色素上皮、および角膜細胞を含む）、血管細胞（例えば、内皮細胞、内膜細胞）、上皮細胞（例えば、消化管および呼吸性上皮細胞）、筋肉細胞（例えば、骨格筋細胞、心筋細胞、平滑筋細胞および／または横隔膜筋細胞）、樹状細胞、膵臓細胞（膵島細胞を含む）、肝臓細胞、腎臓細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞などを含む、任意のタイプであってよい。代表的な実施態様では、細胞は、任意の前駆細胞であってよい。さらなる可能性として、細胞は、幹細胞（例えば、神経系幹細胞、肝臓幹細胞）であってよい。さらに、さらなる代替として、細胞は、癌または腫瘍細胞であってよい。さらに、細胞は、上記に説明されたように、任意の種の起源由来であってよい。
ウイルスベクターは、改変された細胞を対象に投与する目的のために、インビトロで細胞内に導入され得る。特定の実施態様では、細胞は対象から取り出されていて、ウイルスベクターがその中に導入されて、それから、細胞は元の対象内に投与される。エクスビボでの操作のために対象から細胞を取り出して、その後に元の対象に導入する方法は、当技術分野で知られている（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照）。あるいは、組み換えウイルスベクターは、ドナー対象から細胞内に、培養細胞内に、または、任意の他の適切な由来から細胞内に導入され得て、細胞は、それを必要とする対象（すなわち、「レシピエント」対象）に投与される。
エクスビボでの遺伝子送達に適切な細胞は、上述されるとおりである。対象へ投与する細胞の用量は、対象の年齢、症状および種、細胞のタイプ、細胞によって発現される核酸、投与モードなどによって変化する。典型的に、少なくとも約１０２～約１０８細胞または少なくとも約１０３～約１０６細胞が、薬学的に許容できる担体内の投与量あたり投与される。特定の実施態様では、ウイルスベクターを用いて形質導入された細胞は、調剤担体と組み合わせて治療有効量または予防有効量で対象に投与される。
一部の実施態様では、ウイルスベクターは、細胞内に導入されて、細胞は対象に投与され得て、送達されたポリペプチド（例えば、導入遺伝子としてまたはキャプシド内に発現される）に対して免疫原性応答を引き起こす。典型的に、免疫原性的有効量のポリペプチドを発現している細胞の量が、薬学的に許容できる担体と組み合わせて投与される。「免疫原性的有効量」は、医薬製剤が投与される対象においてポリペプチドに対する能動免疫応答を引き起こすのに十分な、発現されたポリペプチドの量である。特定の実施態様では、用量は、防御免疫応答（上記に定義）を産生するのに十分である。与えられる防御の程度は、免疫原性ポリペプチドを投与する利益がその任意の不利益を上回る限り、完全または永遠である必要はない。
本発明のさらなる態様は、対象へのウイルスベクターの投与の方法である。それを必要とするヒト対象または動物への本発明に係るウイルスベクターおよび／またはキャプシドの投与は、当技術分野で知られている任意の手段によるものであってよい。任意選択で、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、薬学的に許容できる担体中、治療効果的または予防効果的な投与量で送達される。
本発明のウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、免疫原性応答を引き起こすためにさらに投与され得る（例えば、ワクチンとして）。典型的に、本発明の免疫原性組成物は、免疫原性的有効量のウイルスベクターおよび／またはキャプシドを、薬学的に許容できる担体と組み合わせて含む。任意選択で、用量は、防御免疫応答（上記に定義）を産生するのに十分である。与えられる防御の程度は、免疫原性ポリペプチドを投与する利益がその任意の不利益を上回る限り、完全または永遠である必要はない。対象および免疫原は、上述のとおりである。
対象に投与されるウイルスベクターおよび／またはキャプシドの用量は、投与モード、治療および／または予防されるべき疾患または症状、個々の対象の症状、特定のウイルスベクターまたはキャプシド、および、送達されるべき核酸などに依存し、日常的な様式で決定され得る。治療的効果を達成するための例示的な投与量は、少なくとも約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５形質導入単位、任意選択で、約１０８～１０１３形質導入単位の力価である。
特定の実施態様では、１よりも多い投与（例えば、２、３、４またはそれよりも多い投与）が、様々な間隔、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年などの期間にわたって所望のレベルの遺伝子発現を達成するために用いられ得る。
例示的な投与モードは、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介する）、口腔（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼球内、経皮、内皮内、子宮内（または胚内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内［骨格筋、横隔膜筋および／または心筋の投与を含む］、胸膜内、脳内、および関節内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚および粘膜表面の両方、および経皮投与）、リンパ内など、ならびに、直接的な組織または臓器注入（例えば、肝臓、眼へ［硝子体内および網膜下を含む］、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳）を含む。
投与は、制限されずに、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、および眼からなる群より選択される部位を含む、対象内の任意の部位に対するものであってよい。
また、投与は、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節内または付近）に対するものであってもよい。任意の所定の場合における最も適切な経路は、治療および／または予防される症状の性質および重症度、および、用いられる特定のベクターの性質に依存する。
本発明に係る骨格筋への投与は、制限されないが、四肢（例えば、上腕、前腕、上肢、および／または前肢）、背中、頸部、頭部（例えば舌）、胸部、腹部、骨盤／会陰、および／または指における骨格筋への投与を含む。適切な骨格筋は、限定されないが、小指外転筋小指外転筋（手内）、小指外転筋小指外転筋（足内）、母指外転筋、第五中足骨外転筋、短母指外転筋、長母指外転筋、短内転筋、母趾内転、長内転筋、大内転筋、母指内転筋、肘筋、前斜角筋、膝関節筋、上腕二頭筋、大腿二頭筋、上腕筋、腕橈骨筋、頬筋、烏口腕筋、皺眉筋、三角筋、口角下制筋、下唇下制筋、二腹筋、背側骨間筋（手内）、背側骨間筋（足内）、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、尺側手根伸筋、小指伸筋、指伸筋、短指伸筋、長指伸筋、短母指伸筋、長母趾伸筋、示指伸筋、短母指伸筋、長母指伸筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、短小指屈筋（手内）、短小指屈筋（足内）、短趾屈筋、長趾屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短母指屈筋、長母指屈筋、前頭筋、腓腹筋、オトガイ舌骨筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、薄筋、頚腸肋筋、腰腸肋筋、胸腸肋筋、腸骨筋、下双子筋、下斜筋、下直筋、棘下筋、棘間筋、横突間筋、外側翼突筋、外側直筋、広背筋、口角挙筋、眼窩下筋、上唇鼻翼挙筋、上眼瞼挙筋、肩甲挙筋、長回旋筋、頭最長筋、頸最長筋、胸最長筋、頭長筋、頸長筋、虫様筋（手内）、虫様筋（足内）、咬筋、内側翼突筋、内側直筋、中斜角筋、多裂筋、顎舌骨筋、下頭斜筋、上頭斜筋、外閉鎖筋、内閉鎖筋、後頭筋、肩甲舌骨筋、小指対立筋、母指対立筋、眼輪筋、口輪筋、掌側骨間筋、短掌筋、長掌筋、恥骨筋、大胸筋、小胸筋、短腓骨筋、長腓骨筋、第３腓骨筋、梨状筋、底側骨間筋、足底筋、広頸筋、膝窩筋、後斜角筋、方形回内筋、円回内筋、大腰筋、大腿方形筋、足底方形筋、前頭直筋、外側頭直筋、大後頭直筋、小後頭直筋、大腿直筋、大菱形筋、小菱形筋、笑筋、縫工筋、最小斜角筋、半膜様筋、頭半棘筋、頚半棘筋、胸半棘筋、半腱様筋、前鋸筋、短回旋筋、ヒラメ筋、頭棘筋、頚棘筋、胸棘筋、頭板状筋、頚板状筋、胸鎖乳突筋、胸骨舌骨筋、胸骨甲状筋、茎突舌骨筋、鎖骨下筋、肩甲下筋、上双子筋、上斜筋、上直筋、回外筋、棘上筋、側頭筋、大腿筋膜張筋、大円筋、小円筋、胸郭、甲状舌骨、前脛骨筋、後脛骨筋、僧帽筋、上腕三頭筋、中間広筋、外側広筋、内側広筋、大頬骨筋、および、小頬骨筋、および当技術分野で知られている任意の他の適切な骨格筋を含む。
ウイルスベクターは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、四肢灌流、（任意選択で、足および／または腕の単離された四肢灌流；例えばＡｒｒｕｄａ ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ １０５：３４５８－３４６４を参照）、および／または、直接的な筋肉内注入によって、骨格筋に送達され得る。特定の実施態様では、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、四肢灌流、任意選択で、単離された四肢灌流（例えば、静脈内または関節内投与によって、対象（例えば、ＤＭＤのような筋ジストロフィーを有する対象）の四肢（腕および／または足）に投与される。本発明の実施態様では、本発明のウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、「流体力学」技術を用いずに有利に投与され得る。従来技術ベクターの組織送達（例えば、筋肉への）は、血管系内の圧力を増大させてベクターが内皮細胞バリアを横切る能力を促進する流体力学技術（例えば、大量の静脈内／静脈内投与）によって、しばしば高められる。特定の実施態様では、本発明のウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、大量インフュージョンおよび／または高められた血管内圧力（例えば、正常の収縮期圧よりも高い、例えば、正常の収縮期圧よりも、血管内圧が５％、１０％、１５％、２０％、２５％以下の増加）のような流体力学技術の不存在下で投与され得る。そのような方法は、浮腫、神経損傷および／またはコンパートメント症候群のような、流体力学技術と関連する副作用を低減または防止し得る。
心筋への投与は、左心房、右心房、左心室、右心室および／または隔膜への投与を含む。ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、静脈内投与、動脈内投与、例えば、大動脈内投与、直接的な心臓注入（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室へ）、および／または冠動脈灌流によって、心筋に送達され得る。
横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹膜内投与を含む任意の適切な方法によるものであってよい。
平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹膜内投与を含む任意の適切な方法によるものであってよい。一実施態様では、投与は、平滑筋内、付近および／または上に存在する内皮細胞に対するものであってよい。
標的組織への送達は、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドを含むデポーを送達することによっても達成され得る。代表的な実施態様では、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドを含むデポーは、骨格筋、平滑筋、心筋および／または横隔膜筋組織へ移植されて、または、組織は、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドを含むフィルムまたは他のマトリックスと接触され得る。そのような移植可能なマトリックスまたは基材は、米国特許第７，２０１，８９８号に記載される。
特定の実施態様では、本発明に係るウイルスベクターは、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィーまたは心疾患［例えば、ＰＡＤまたは鬱血性心不全］を治療および／または予防するため）。
代表的な実施態様では、本発明は、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋の障害を治療および／または予防するために用いられる。
代表的な実施態様では、本発明は、それを必要とする対象において筋ジストロフィーを治療および／または予防する方法を提供し、当該方法は、治療または予防有効量の本発明のウイルスベクターを哺乳類対象に投与するステップを含み、ここで、ウイルスベクターは、ジストロフィン、ミニ－ジストロフィン、マイクロ－ジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、ホリスタチン、アクチビンタイプＩＩ可溶性受容体、ＩＧＦ－１、抗炎症性ポリペプチド、例えばＩκＢ優勢突然変異体、サルコスパン、ユートロフィン、マイクロ－ジストロフィン、ラミニン－α２、α－サルコグリカン、β－サルコグリカン、γ－サルコグリカン、δ－サルコグリカン、ＩＧＦ－１、ミオスタチンまたはミオスタチンプロペプチドに対する抗体または抗体フラグメント、および／またはミオスタチンに対するＲＮＡｉをコードする異種核酸を含む。特定の実施態様では、ウイルスベクターは、明細書の他のどこかに記載のように、骨格筋、横隔膜筋および／または心筋に投与され得る。
あるいは、本発明は、骨格筋、心筋または横隔膜筋に核酸を送達するために実施され得て、血中を正常に循環するポリペプチド（例えば、酵素）または機能性ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の生産のため、または、障害（例えば、糖尿病のような代謝障害（例えば、インスリン）、血友病（例えば、ＩＸ因子またはＶＩＩＩ因子）、ムコ多糖障害（例えば、Ｓｌｙ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラー－シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群など）またはリソソーム蓄積症（例えば、ゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］、ポンぺ病［リソソーム酸α－グルコシダーゼ］またはファブリ―病［α－ガラクトシダーゼＡ］）または糖原病（例えば、ポンぺ病［リソソーム酸αグルコシダーゼ］）を治療および／または予防するための他の組織への全身送達のための、プラットフォームとして用いられ得る。代謝障害を治療および／または予防するための他の適切なタンパク質は、上述されるとおりである。目的の核酸を発現するためのプラットフォームとしての筋肉の使用は、米国特許公報番号２００２／０１９２１８９に記載される。
したがって、一態様として、本発明は、それを必要とする対象において代謝障害を治療および／または予防する方法をさらに包含し、当該方法は、治療または予防有効量の本発明のウイルスベクターを、対象（例えば、対象の骨格筋）に投与するステップを含み、ここで、ウイルスベクターは、ポリペプチドをコードする異種核酸を含み、ここで、代謝障害は、ポリペプチドの不足および／または欠損の結果である。例示的な代謝障害およびポリペプチドをコードする異種核酸は、本明細書において記載される。任意選択で、ポリペプチドは、分泌される（例えば、そのネイティブの状態での分泌ポリペプチドである、または、例えば、当技術分野で知られている分泌型シグナル配列との動作可能な関連性によって分泌されるように改変されている、ポリペプチド）。本発明のいかなる特定の理論にも制限されずに、本実施態様によれば、骨格筋への投与は、体循環へのポリペプチドの分泌および標的組織（単数または複数）への送達をもたらし得る。ウイルスベクターを骨格筋へ送達する方法は、本明細書においてより詳細に説明される。
また、本発明は、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉまたは全身送達のための他の機能性ＲＮＡ（例えば、リボザイム）を生産するためにも実施され得る。
また、本発明は、それを必要とする対象において、先天性心不全またはＰＡＤを治療および／または予防する方法も提供して、当該方法は、治療または予防有効量の本発明のウイルスベクターを、哺乳類対象に投与するステップを含み、ここで、ウイルスベクターは、例えば、筋小胞体内Ｃａ２＋－ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、血管新生因子、ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ－１）、ホスホランバンに対するＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害またはドミナントネガティブ分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ、ホスホランバン遺伝子を調節するジンクフィンガータンパク質、β２－アドレナリン受容体、β２－アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ＰＩ３キナーゼ、カルサルカン、β－アドレナリン受容体キナーゼ阻害剤（βＡＲＫｃｔ）、タンパク質ホスファターゼ１の阻害剤１、Ｓ１００Ａ１、パルブアルブミン、アデニリルシクラーゼタイプ６、Ｇタンパク質共役受容体キナーゼタイプ２ノックダウンに影響を与える分子、例えば、トランケートされた構成的に活性のｂＡＲＫｃｔ、Ｐｉｍ－１、ＰＧＣ－１α、ＳＯＤ－１、ＳＯＤ－２、ＥＣ－ＳＯＤ、カルクレイン、ＨＩＦ、チモシン－β４、ｍｉｒ－１、ｍｉｒ－１３３、ｍｉｒ－２０６および／またはｍｉｒ－２０８をコードする異種核酸を含む。
注入剤は、従来の形態で、液体の溶液または懸濁液のいずれかとして、注入前の液体中の溶液または懸濁液に適切な固体形態、またはエマルションとして、調製され得る。あるいは、本発明のウイルスベクターおよび／またはウイルスキャプシドは、全身性よりむしろ局所的に、例えば、デポーまたは徐放性製剤において投与し得る。さらに、ウイルスベクターおよび／またはウイルスキャプシドは、外科的に移植可能なマトリックス（例えば、米国特許公報番号２００４－００１３６４５に記載）に付着されて送達され得る。
本明細書に開示されるウイルスベクターは、任意の適切な手段によって、任意選択で、対象が吸入するウイルスベクターおよび／またはウイルスキャプシドからなる呼吸用粒子のエアロゾル懸濁液を投与することによって、対象の肺へ投与され得る。呼吸用粒子は、液体または固体であってよい。ウイルスベクターおよび／またはウイルスキャプシドを含む液体粒子のエアロゾルは、任意の適切な手段によって、例えば、当業者に公知の圧力駆動のエアロゾル噴霧器または超音波噴霧器を用いて生産され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照。ウイルスベクターおよび／またはキャプシドを含む固体粒子のエアロゾルは、調剤分野において公知の技術によって、任意の固体微粒子薬品エアロゾル発生器を用いて同様に生産され得る。
ウイルスベクターは、ＣＮＳの組織（例えば、脳、眼）に投与され得て、本発明の不存在で観察されるよりも広範なウイルスベクターまたはキャプシドの分配を有利にもたらし得る。
特定の実施態様では、本発明の送達ベクターは、遺伝性障害、神経変性疾患、精神障害および腫瘍を含むＣＮＳの疾患を治療するために投与され得る。例示的なＣＮＳの疾患は、限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥーレット症候群、原発性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症、進行性筋萎縮症、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊髄または頭部損傷に起因する外傷、テイ・サックス病、レッシュ・ナイハン病、てんかん、脳梗塞、気分障害（例えば、うつ病、双極性感情障害、持続性感情障害、二次的気分障害）、神経分裂症、薬物依存症（例えば、アルコールおよび他の物質依存症）、ノイローゼ（例えば、不安、強迫観念障害、身体表現性障害、解離性障害、悲嘆、産後うつ病）、精神病（例えば、幻覚および妄想）、認知症、偏執病、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛性障害、摂食または体重障害（例えば、肥満、カヘキシー、神経性食欲不振、および過食症）を含む精神障害、および、ＣＮＳの癌および腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）を含む。
ＣＮＳの障害は、網膜、後部束（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｔｒａｃｔ）、および視神経と関与する眼の障害（例えば、網膜色素変性症、糖尿病性網膜症および他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢黄斑変性、緑内障）を含む。
眼の疾患および障害は、全てでないにしてもほとんど、３つのタイプの適応症：（１）血管新生、（２）炎症、および（３）変性の１つまたは複数と関連する。本発明の送達ベクターは、抗血管新生因子；抗炎症性因子；細胞変性を遅らせる、細胞温存（ｓｐａｒｉｎｇ）を促進する、または、細胞増殖を促進する因子を送達するため、および前述の組み合わせのために、用いられ得る。
糖尿病性網膜症は、例えば、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、１つまたは複数の抗血管新生因子を、眼内（例えば、硝子体内）または眼球周囲（例えば、テノン嚢下領域内）のいずれかに送達することによって治療され得る。１つまたは複数の神経栄養因子が、眼内（例えば、硝子体内または網膜下）または眼球周囲のいずれかに共送達されてもよい。
ブドウ膜炎は、炎症を含む。１つまたは複数の抗炎症性因子は、本発明の送達ベクターの眼球内（例えば、硝子体または前房）投与によって投与され得る。
網膜色素変性症は、比較によって、網膜変性によって特徴付けられる。代表的な実施態様では、網膜色素変性症は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする送達ベクターの眼球内（例えば、硝子体投与）によって治療され得る。
加齢黄斑変性は、血管新生および網膜変性の両方を含む。この障害は、１つまたは複数の神経栄養因子をコードする本発明の送達ベクターを眼内（例えば、硝子体）に投与すること、および／または、１つまたは複数の抗血管新生因子を眼内または眼球周囲（例えば、テノン嚢下領域内）に投与することによって治療され得る。
緑内障は、眼圧の増大および網膜神経節細胞の喪失によって特徴付けられる。緑内障の治療は、本発明の送達ベクターを用いた興奮毒性ダメージから細胞を保護する１つまたは複数の神経保護剤の投与を含む。そのような薬剤は、眼内に、任意選択で硝子体内に、送達される、Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）拮抗薬、サイトカイン、および神経栄養因子を含む。
他の実施態様では、本発明は、発作を治療するため、例えば、発作の発症、発生率または重症度を低減するために用いられ得る。発作のための治療的治療の有効性は、行動（例えば、眼または口のシェイキング、チック）および／または電気記録手段（ほとんどの発作は、署名の電気記録異常を有する）によって評価され得る。したがって、本発明は、時間とともに多数の発作によってマークされるてんかんを治療するためにも用いられ得る。
代表的な一実施態様では、下垂体腫瘍を治療するために、ソマトスタチン（またはその活性フラグメント）が、本発明の送達ベクターを用いて脳に投与される。本実施態様によれば、ソマトスタチン（またはその活性フラグメント）をコードする送達ベクターは、下垂体内にマイクロインフュージョンによって投与される。同様に、そのような治療は、先端巨大症（下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を治療するために用いられ得る。ソマトスタチンの核酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ００３０６）およびアミノ酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ０１１６６；プロセッシングされた活性ペプチドソマトスタチン－２８およびソマトスタチン－１４を含む）配列は、当技術分野で知られている。
特定の実施態様では、ベクターは、米国特許第７，０７１，１７２号に記載の分泌型シグナルを含んでよい。
本発明の代表的な実施態様では、ウイルスベクターおよび／またはウイルスキャプシドは、ＣＮＳ（例えば、脳または眼）に投与される。ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭、側頭、頭頂および前頭葉を含む大脳。皮質、基底核、海馬および扁桃体（ｐｏｒｔａａｍｙｇｄａｌａ））、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、および下丘へ投与され得る。また、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、眼の異なる領域、例えば、網膜、角膜および／または視神経へ投与されてもよい。
ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、送達ベクターのより分散した投与のために、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺によって）送達され得る。ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、血液脳関門が混乱されている状況において（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）、ＣＮＳへ血管内にさらに投与されてよい。
ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、制限されないが、髄腔内、眼内、脳内、心室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）および眼周囲（例えば、テノン嚢下領域）送達ならびに運動ニューロンへの後退送達を伴う筋肉内送達を含む、当技術分野で知られている任意の経路によって、ＣＮＳの所望の領域（単数または複数）に投与され得る。
特定の実施態様では、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、ＣＮＳ内の所望の領域または区画へ直接注入（例えば、定位的注入）によって液体製剤で投与される。他の実施態様では、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、所望の領域への局所適用またはエアロゾル製剤の経鼻内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によるものであってよい。さらなる代替として、ウイルスベクターおよび／またはキャプシドは、固体、徐放製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照）。
さらに、さらなる実施態様では、ウイルスベクターは、運動ニューロンと関与する疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など）を治療および／または予防するために、後退輸送のために用いられ得る。例えば、ウイルスベクターは筋組織へ送達され得て、そこからニューロンに遊走することができる。
本発明を説明したが、同様のものが、説明目的のみのために本明細書に含まれる以下の実施例においてより詳細に説明されて、それは、本発明を制限することを意図しない。
［実施例１］
材料および方法
プラスミドおよびウイルス。全てのプラスミドは、ノースカロライナ大学Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｅｎｔｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉｔｙから得た。ＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションを介してウイルスを生産して、塩化セシウム密度超遠心分離によって精製した。ルシフェラーゼ導入遺伝子を認識するように設計された以下のプライマーセット：（フォワード）５’－ＡＡＡ ＡＧＣ ＡＣＴ ＣＴＧ ＡＴＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＴＡＣ－３’（配列番号９）および（リバース）５’－ＣＣＴ ＴＣＧ ＣＴＴ ＣＡＡ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＡＡ Ｃ－３’（配列番号１０）；またはヒトα１抗トリプシン遺伝子を認識するように設計された以下のプライマーセット：（フォワード）５’－ＧＡＡ ＧＴＣ ＡＡＧ ＧＡＣ ＡＣＣ ＧＡＧ ＧＡ－３’（配列番号１１）および（リバース）５’－ＣＣＣ ＡＧＣ ＴＧＧ ＡＣＡ ＧＴＣ ＴＣＴ ＴＡ－３’（配列番号１２）によるリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を用いてウイルス力価を得た。全ての実験群に関して、関連のあるウイルス構築物は、用いられる前に同一のｑＰＣＲプレート上で一緒に滴定した。部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）をヌクレオチド欠失または置換に用いた。表８は、本研究で試験された全てのＶＲ１突然変異体に用いられたプライマー配列を列挙する。ｒＡＡＶ１－＞ｒＡＡＶ６の点突然変異体（例えば、ｒＡＡＶ６．１など）は、既に、一般的なラボストックの一部であった。この作業で用いられたそれぞれのプラスミドについてＤＮＡシーケンシングを行なって、ウイルスを作製する前に配列同一性を確認した。
生きた動物試験。全ての動物は、Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌのノースカロライナ大学でのＩＡＣＵＣによって承認されるプロトコルの下で、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈガイドラインに従って維持および処置された。ＣＢＡ－ルシフェラーゼまたはＣＢＡ－ｈＡＡＴ導入遺伝子のいずれかをパッケージングしているｒＡＡＶ変異を、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のＧＣに、示された量で注入した。全ての注入は、注入あたり５０μＬの合計容量で行なった。注入前にイソフルランガスを用いてマウスに麻酔をかけた。ルシフェラーゼ導入遺伝子発現を、１２０ｍｇ／ｋｇ体重でのＤ－ルシフェリン基質（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ）の腹腔内注入の後に、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて示された時点でモニターした。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて生物発光画像解析を行なった。ルシフェラーゼ発現は、ＣＰＭ／ＲＯＩ（選択された関心領域にわたるカウント毎分）で報告される。
導入遺伝子発現およびコピー数のエクスビボでの定量。エクスビボでのルシフェラーゼアッセイのために、マウスを１ｅ１０ ｖｇの７ｄｐｉに屠殺して、注入した筋組織を採取した。各組織のおよそ５０ｍｇを氷上で細かく切り刻んだ。各組織のアリコートを、それから、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅａｒｏｒ（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ）を用いて１５０μＬの２Ｘ Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でホモジナイズした。３５μＬの溶解物および１００μＬのＤ－ルシフェリン基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、Ｖｉｃｔｏｒ２ルミノメーター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いた発光分析のために９６ウェルプレートに移した。組織溶解物中の合計タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を介して決定した。１ｅ１０ ｖｇの３ｄｐｉに、注入されたＧＣを採取／ホモジナイズして、上記のように溶解させて、ＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて約２５ｍｇの組織アリコートを処理して、宿主およびベクターゲノムＤＮＡを抽出した。細胞の数を、マウスラミン（ハウスキーピング遺伝子）に特異的に設計された以下のプライマーによるｑＰＣＲを介して決定した：（フォワード）５’－ＧＧＡ ＣＣＣ ＡＡＧ ＧＡＣ ＴＡＣ ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＧ－３’（配列番号２５）および（リバース）５’－ＡＧＧ ＧＣＡ ＣＣＴ ＣＣＡ ＴＣＴ ＣＧＧ ＡＡＡ Ｃ－３’（配列番号２６）。細胞あたりのウイルスゲノムの数を、上述のようにルシフェラーゼ導入遺伝子に特異的に設計されたプライマーによるｑＰＣＲを介して決定した。
ヘパリン競合。示された構築物を、リンガー生理食塩水（ＲＳＳ）中に溶解されたブタヘパリン硫酸ナトリウム塩（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の２５０μｇ／ｍＬ溶液、またはリンガー生理食塩水単独のいずれかにおいて、回転させて４℃で一晩インキュベートした。各グループの１ｅ１０ ｖｇを、注入あたり５０μＬの合計容量でＧＣあたり注入した。７ｄｐｉに、生きた動物の生物発光イメージングを行なった。
分子モデリング。ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２またはｒＡＡＶ６の三次元構造は、以前に公表されたＰｙＭｏｌ内の座標（ｗｗｗ．ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）を用いて、キャプシド全体として表示された（Ｄｒ．Ｍａｖｉｓ Ａｇｂａｎｄｊｅ－ＭｃＫｅｎｎａより寄贈）。ＰｙＭｏｌ整列コマンドは、様々な構造を整列するために用いた。水素結合に関与する原子ペアを、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙを用いて結晶構造座標上に計算して、ＫｉＮＧグラフィックソフトウェア（ｋｉｎｅｍａｇｅ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ）を用いて可視化した。
ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー。示された構築物を、ヘパリン硫酸コンジュゲートアガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに、４℃で回転させて一晩インキュベートした。スラリーをマイクロクロマトグラフィーカラム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に移して、ＲＳＳで３回洗浄して、次第にストリンジェントなＮａＣｌ洗浄を続けた。溶液は、溶液内に既に存在するＮａＣｌの量に調節した後に、適切な量のＮａＣｌをＲＳＳに溶解させることにより作製した。全ての洗浄画分を集めた。それぞれの画分に含まれるウイルスのパーセントを、上述のルシフェラーゼ導入遺伝子に対して設計されたプライマーを用いて、それぞれの洗浄内に含まれるウイルス粒子のｑＰＣＲ定量化によって決定した。
ヒトＡＡＴのＥＬＩＳＡ検出。マウス血液を、ヘパリン化キャピラリーチューブ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて後眼窩の出血を介して回収した。回収直後に、サンプルをペレット化して、血清を集めて－８０℃で後の使用のために保管した。マウスを、出血前にイソフルランガスで麻酔した。９６ウェルプレートを、４℃にて一晩、１０ｍｇ／ｍＬでウサギ抗ヒトＡＡＴ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）によってコーティングした。それからプレートを洗浄して、血清希釈溶液（２．５％ウシアルブミンおよび０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ）で室温にて１時間ブロッキングした。示された血清希釈（各サンプルあたり合計１００μＬ）をプレートに添加して、室温にて２時間インキュベートした。ＰＢＳで４回洗浄した後に、１００μＬのＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＡＡＴ抗体（１０ｕｇ／ｍＬ；Ａｂｃａｍ）を室温で１時間、プレートに添加した。さらなる洗浄後に、ＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加によって発色させて、１０％ Ｈ２ＳＯ４によって止めた。ｉＭａｒｋマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて光学濃度を読み取った。ミューリンＡＡＴは、このアッセイでは検出されなかった。
［実施例２］
ｒＡＡＶ１キャプシド上の２６５位の突然変異は、骨格筋の形質導入を高める。
ｒＡＡＶ２キャプシド内の２６４位の後ろのアスパラギン酸、グルタミン酸またはフェニルアラニンの挿入（新規の２６５位を作る）は、骨格筋形質導入を１桁高めたので、我々は、ｒＡＡＶ１内の２６５位に天然に存在するトレオニンをＤ、Ｅ、またはＦで置換することは、この血清型における骨格筋形質導入を高めると仮定した（ｒＡＡＶ１は、このキャプシドループがｒＡＡＶ２よりも１アミノ酸長い）。コントロールとして、未改変のｒＡＡＶ２に似るようにｒＡＡＶ１からＴ２６５を欠失させた。ニワトリβアクチンプロモーター駆動のホタルルシフェラーゼ（ＣＢＡ－ｌｕｃ）導入遺伝子をパッケージングしているｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５Ｄ、ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５Ｅ、ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ＦおよびｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌキャプシドを、１ｅ１０ウイルスゲノム（ｖｇ）の投与量でミューリン腓腹筋（ＧＣ）筋肉中に注入した。放射光線の測定を介して導入遺伝子発現を定量化するために、注入の７日後に、生きた動物の生物発光イメージングを行なった（ｄｐｉ）（図１Ａ）。ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５Ｄ、ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ＥおよびｒＡＡＶ１／Ｔ２６５Ｆは、ｒＡＡＶ１と比較して、導入遺伝子発現をそれぞれ２８倍、３４倍、および３６倍高めて、ｒＡＡＶ２キャプシド主鎖における我々の以前の分析をサポートした。驚くべきことに、ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌは、形質導入をｒＡＡＶ１のおよそ２００倍高めた。この現象をよりよく理解する試みにおいて、２６５欠失突然変異体を本研究での残っている分析の大部分で用いた。
上記データを作製するために用いられた画像定量化方法が、注入された筋組織内の導入遺伝子発現レベルの正確な表示であったことを確認するために、注入されたＧＣを取り出して、ホモジナイズ／溶解させて、組織溶解物に対してエクスビボでルシフェラーゼアッセイを行なった。このアッセイにおいて、分析された組織のｍｇあたり放射される相対的な光の単位に関して標準化された場合、ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌでの形質導入効率は、ｒＡＡＶ１よりも１３７倍高かった（図１Ｂ）。ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌレポーター遺伝子発現の増大は、筋肉への高い導入遺伝子送達と相関した：定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析によってｒＡＡＶ１と比較して、筋肉細胞あたり１４．５倍多いウイルスゲノムコピーが検出された（図１Ｃ）。測定された効果がバッチまたは精製方法に特有でないことを確認するために、いくつかの方法（例えば、密度超遠心分離、アフィニティクロマトグラフィー）によって精製されたベクターの非依存性製剤を用いた多数の実験において全ての結果を確認した。
適切な時点が試験されたことを確認するために、ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌ導入遺伝子発現の経時変化を、７、１４、２１および４２ｄｐｉに集められた測定値を用いて行なった（図１Ｄ）。発現カイネティクスは同様に現れて、７ｄｐｉにロバストな発現が観察されて、ｒＡＡＶ１の注入後７～４２日に７．５倍増大して、ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌの注入後の同じ期間中に１２倍増大した。全ての時点で、ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌは、およそ２桁（７日で１００倍、１４日で１７６倍、２１日で８１倍、および、４２日で１５９倍）ｒＡＡＶ１よりも優れていた。合わせて、これらのデータは、ｒＡＡＶ１キャプシド主鎖におけるアミノ酸２６５の欠失が、骨格筋組織における導入遺伝子送達および発現の両方を高めるための非常に効果的なストラテジーであることを示す。より重要なことに、この上昇は、持続した期間にわたって維持されて、ｑＰＣＲ分析によって記されたベクターゲノムコピー数の増大の我々の観察をサポートする。
［実施例３］
形質導入効率を調整するために２６５とともに作用する遠位残基
ｒＡＡＶ６は、筋骨格遺伝子療法の適用のための別の上位候補と考えられて、ｒＡＡＶ１に対して最も高いキャプシド配列相同性（９９．２％）を有する血清型である。ｒＡＡＶ１キャプシドにおける２６５位の欠失により得られる高い形質導入表現型がｒＡＡＶ６の関連において保存されるかどうか決定するために、ＣＢＡ－ｌｕｃをパッケージングしているｒＡＡＶ６およびｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌキャプシドを作製した。１ｅ１０ ｖｇの投与量でのミューリンＧＣへのそれぞれの注入の７日後に、導入遺伝子発現を定量化した。興味深いことに、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌの注入後の導入遺伝子発現は、ｒＡＡＶ６を用いた場合に測定されるもののたった８２％であった（図２Ａ）。ｒＡＡＶ１内に生じた２６５位の欠失の形質導入に対する劇的な効果、および、ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６で異なるたった６アミノ酸のうち直接的な相互作用を形成するように２６５位に十分に空間的に近接して位置するものが１つもないことを考慮すると、これは驚くべきことであった。さらに、ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６間で異なる任意の残基は、２６５位から少なくとも２２Ａ離れて位置する。水素結合のような直接的な相互作用を形成するためには、残基は互いに約３Ａ以内になければならない。これにもかかわらず、それぞれに関する利用可能な結晶学的データの整列によって可視化されるように、２６５位付近のｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６の構造に立体構造の違いが存在する（図２Ｂ）。
ｒＡＡＶ６キャプシド内のどの残基が、２６５位の欠失が形質導入効率を高める有効性を阻害し得るのか解明するために、マーカーレスキュー実験のバージョンを用いて、ここで、ｒＡＡＶ６キャプシドは、ｒＡＡＶ１内に存在するアミノ酸に対してｒＡＡＶ１とｒＡＡＶ６との間で異なる各残基において、２６５の欠失とともに突然変異された。突然変異体は、それぞれ、ｒＡＡＶ６．１（ｒＡＡＶ１内の同等のアミノ酸に対して突然変異された最初の保存されていない残基残基（Ｆ１２９Ｌ）を有するｒＡＡＶ６）、ｒＡＡＶ６．２（Ｄ４１８Ｅ）、ｒＡＡＶ６．３（Ｋ５３１Ｅ）、ｒＡＡＶ６．４（Ｌ５８４Ｆ）、ｒＡＡＶ６．５（Ｖ５９８Ａ）およびｒＡＡＶ６．６（Ｈ６４２Ｎ）と指定された。ｒＡＡＶ６キャプシドに対する変化の大部分は、形質導入に対して最小限の変化を生じさせた（図２Ｃ）。導入遺伝子発現は、構築物ｒＡＡＶ６．１、ｒＡＡＶ６．１／Ｔ２６５ｄｅｌ、ｒＡＡＶ６．２、ｒＡＡＶ６．２／Ｔ２６５ｄｅｌおよびｒＡＡＶ６．３によって、それぞれ≦２倍低減した。導入遺伝子発現は、ｒＡＡＶ６．４およびｒＡＡＶ６．４／Ｔ２６５ｄｅｌの両方においておよそ２倍増大した。５９８位および６４２位における突然変異（ｒＡＡＶ６．５およびｒＡＡＶ６．６）は、他の突然変異よりも劇的にｒＡＡＶ６と比較して導入遺伝子発現を低減させて、それぞれ３．４倍および１３．１倍低減させた。ｒＡＡＶ６．５およびｒＡＡＶ６．６と併せて２６５位の欠失は、これらの構築物の性能に対して小さな変化を生じて、ｒＡＡＶ６．４／Ｔ２６５ｄｅｌおよびｒＡＡＶ６．５／Ｔ２６５ｄｅｌにおいて、導入遺伝子発現をそれぞれ４．８倍および８．７倍低減させた。際立ったことに、５３１位での単一のアミノ酸変化のみが（ｒＡＡＶ６．３）、ｒＡＡＶ１で観察される２６５の表現型をレスキューするのに必要とされて、ｒＡＡＶ６．３／Ｔ２６５ｄｅｌは、ｒＡＡＶ６と比較して形質導入効率を２３倍高めた（図２Ｃ）。
残基５３１と２６５との間の空間的関係性を、ｒＡＡＶ６結晶構造の関連において試験した（図３Ａ～３Ｄ）。アミノ酸２６５および５３１は、二十面体の対称軸のいずれにおいても、直接的な相互作用を形成するのに十分に近くない。２回軸では、２６５位と５３１位は約２６．７Ａ離れていて、一方で、５回軸では、それらは約４２．６Ａ離れている。しかしながら、対称の３回軸では、約２２．８Ａ離れて位置しているにもかかわらず、両方の残基は、同一平面内に表面が露出している（図３Ｂ）。残基５３１は、それぞれの３倍の「スパイク」のベースに存在し、２６５は、スパイクの間のわずかな突出に存在する。合わせると、この時点で、上記のデータは、２６５位および５３１位が一緒に形質導入効率を調整し得る最も可能性のあるコンテキストは、対称の３回軸を形成している突出によることを示唆する。
［実施例４］
キャプシドヘパリン結合能力は、２６５表現型に影響を及ぼし、逆も同様である。
ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６の両方とも、一次受容体としてＮ結合シアル酸に係合するが、ｒＡＡＶ６もヘパリン硫酸部分に結合する。以前に、我々の結果は、Ｋ５３１が、ｒＡＡＶ６がヘパリン硫酸と相互作用するのに必要とされる唯一の残基であることを示した。また、Ｋ５３１は、ｒＡＡＶ１において観察される２６５欠失表現型をレスキューするのに必要とされる唯一の残基でもある。キャプシドヘパリン結合および２６５位の突然変異によって生じる高い形質導入の間の機能的な関係をさらに調べるために、我々は、感染のための一次受容体としてヘパリン硫酸プロテオグリカンを利用することが知られるプロトタイプの血清型であるｒＡＡＶ２を試験した。ｒＡＡＶ２は、前述した新規の２６５位を作るためのアスパラギン酸の挿入とともに、５８５位で突然変異された（ｒＡＡＶ２ヘパリン結合を弱めることが知られる突然変異）。ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ２／２６５Ｄ、ｒＡＡＶ２／Ｋ５８５ＥおよびｒＡＡＶ２／２６５Ｄ、Ｋ５８５Ｅを、１ｅ１０ ｖｇの投与量でミューリンＧＣ内に注入した。以前の報告と一致して、ヘパリン結合のアブレーションは、骨格筋のｒＡＡＶ２形質導入を高めた。しかしながら、付随する２６５位の突然変異およびヘパリン結合能力の除去は、形質導入効率の最強の上昇を生じて（図４Ａ）、形質導入をｒＡＡＶ２の９６倍、および、ｒＡＡＶ２／２６５Ｄの７倍増大させて、ｒＡＡＶ６に関して観察された上記の結果と一致した（図２Ｃ）。残基５３１が突然変異されてｒＡＡＶ６におけるヘパリン結合がアブレーションされて、残基５８５が突然変異されてｒＡＡＶ２におけるヘパリン結合がアブレーションされたことは、注目に値する。残基５３１および５８５は、直線配列では互いに近くないが、それらは両方とも、ヘパリン結合に関するフットプリントであるキャプシド表面上の重複する基礎パッチ内に入る（図４Ｂ）。
ヘパリン結合の直接的な阻害が２６５突然変異体の形質導入を高めるかどうかを解明するために、２６５突然変異体構築物をマウスに注入する前にヘパリン競合を行なった。ｒＡＡＶ２は、ｒＡＡＶ６よりも強い親和性でヘパリンに結合して、ヘパリン硫酸溶液内のインキュベーション後に形質導入が効果的に減少することが歴史的に示された唯一の血清型であり、したがって、この疑問はｒＡＡＶ２の関連において試験された。ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２／２６５Ｄキャプシドを、生理食塩水または２５０μｇ／ｍＬヘパリン硫酸溶液のいずれかで一晩インキュベートした。ｒＡＡＶ１をコントロールとして含んだ。ウイルスを１ｅ１０ ｖｇの投与量でミューリンＧＣに投与して、マウスを７ｄｐｉに画像化した。ヘパリン硫酸とのインキュベーションは、ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２／２６５Ｄの両方において形質導入効率をおよそ３倍低減させて、ｒＡＡＶ１に対しては実質的に効果が無く、形質導入を０．３倍低減させた（図４Ｃ）。これらの結果は、２６５位の突然変異が形質導入を高めるのに効果的であるためにヘパリン硫酸結合をアブレーションする必要性は、ヘパリン結合自体の阻害ではなくキャプシド内の構造的変化に起因することを示唆する。
ヘパリンアフィニティクロマトグラフィーは、ヘパリン結合を低減するために作られた全てのｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ６キャプシド突然変異が期待通りに行なわれたことを確認した（図５Ａ～５Ｄ）。関連のある構築物を、ヘパリンコンジュゲートアガロースとともにインキュベートして、増加するＮａＣｌ勾配で溶出した。興味深いことに、２６５位が突然変異されたキャプシドでは、親のキャプシドと比較してヘパリン結合が弱められた。例えば、ウイルスのカラムローディング後の１回目の洗浄ステップ中に、ｒＡＡＶ２よりも２０％多いｒＡＡＶ２／２６５Ｄが溶出した。同様に、ｒＡＡＶ２よりも２０％少ないｒＡＡＶ２／２６５Ｄが３００ｍＭ ＮａＣｌ画分中に溶出した。同様に、ｒＡＡＶ６よりも３７％多いｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌがカラム洗浄中に溶出して、一方で、ｒＡＡＶ６よりも２５％少ないｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌが２００ｍＭ ＮａＣｌ洗浄で溶出して、これらの２つのタンパク質モチーフ間の相互作用の仮説をサポートした（ｒＡＡＶ２よりも低いストリンジェントの洗浄画分中のｒＡＡＶ６の溶出は、以前の研究と一致する）。ｒＡＡＶ２／Ｋ５８５ＥはｒＡＡＶ２ヘパリン結合を弱めたが、ｒＡＡＶ２／２６５Ｄ、Ｋ５８５Ｅは、この効果をさらに進めた。ｒＡＡＶ２／Ｋ５８５Ｅの７５％およびｒＡＡＶ２／２６５Ｄ、Ｋ５８５Ｅの９６．５％は、最初の洗浄ステップ中に溶出した。ｒＡＡＶ２／Ｋ５８５Ｅよりも１０％少ないｒＡＡＶ２／２６５Ｄ、Ｋ５８５Ｅが、２００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。図３および図４に示されるデータと組み合わせて、これらの結果は、２６５位を保有するキャプシド領域に対する変化は、ヘパリン結合部位を保有するその領域の構造的コンフォメーションに影響を及ぼし、逆も同様であるという証拠を加える。
［実施例５］
ＶＲ１構造に対する多数の破壊は、骨格筋の形質導入を高める
これまでに提供されたデータは、ＶＲ１の構造的コンフォメーション単独の変化は、２６５位の突然変異後の高い形質導入の背後の原動力であることを示唆する。したがって、我々は、ＶＲ１構造に対するさらなる破壊が、同様の高い形質導入表現型を生じることができるかどうか決定するために探し求めた。したがって、図６Ａに示されるようにＳ２６１ｄｅｌ、Ｓ２６２ｄｅｌ、Ａ２６３ｄｅｌ、Ｓ２６４ｄｅｌ、Ｇ２６６ｄｅｌ、Ａ２６７ｄｅｌ、Ｓ２６８ｄｅｌおよびＮ２６９ｄｅｌを生産するようにｒＡＡＶ１を突然変異させた。これらの構築物を、ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌとともに、１ｅ１０ ｖｇでミューリンＧＣに注入した。導入遺伝子発現を７ｄｐｉに定量した（図６Ｂ）。それぞれの突然変異体は、ｒＡＡＶ１と比較して異なる程度に形質導入効率を高めた。形質導入は、Ｓ２６１、Ｓ２６２およびＮ２６９欠失構築物において≦３倍高められた。Ｇ２６６およびＳ２６８欠失構築物は、形質導入を、ｒＡＡＶ１と比較して、約５倍高めて、Ａ２６３ｄｅｌおよびＡ２６７ｄｅｌは、約１０倍高めた。Ｓ２６４およびＴ２６５欠失構築物は、ｒＡＡＶ１よりも最もロバストに形質導入を高めて、導入遺伝子発現をそれぞれ２５倍および１００倍増大させた。これらのデータは、アミノ酸の欠失を介してＶＲ１ループに対してなされる任意の破壊が、ｒＡＡＶ１における形質導入を高めて、そのような上昇は、２６５位の欠失を介してピークになり、突然変異が２６５位からさらに離れるにつれて少なくなることを示す（図６ｂ）。
［実施例６］
２６５欠失突然変異体は、治療的導入遺伝子の発現を改善する
２６５欠失パネルの相対的有効性を比較するために、６個のキャプシドを、現在臨床試験で使用中のｈＡＡＴ発現カセットでパッケージングした。ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌ、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌ、ｒＡＡＶ６．３およびｒＡＡＶ６．３／Ｔ２６５ｄｅｌキャプシドを、１ｅ１０ ｖｇでミューリンＧＣ中に注入した。ｈＡＡＴの血清濃度を、注入の５週間後にＥＬＩＳＡを介して測定した（図７）。上記と一致して、導入遺伝子発現は、２６５位の欠失によって高められたが、上昇の程度は、ルシフェラーゼアッセイによって測定されたレベルに届かなかった（例えば、ＥＬＩＳＡによって、ｒＡＡＶ１よりもｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌ発現の９倍の増大が存在し、一方で、ルシフェラーゼアッセイによって測定された平均は、＞１００倍であった）。それにもかかわらず、全ての２６５突然変異体は、親の血清型よりも優れていて、ｒＡＡＶ６．３／Ｔ２６５ｄｅｌは、ｈＡＡＴの最大の血清濃度を産生した。
［実施例７］
眼における形質導入効率の上昇
ＡＡＶ構築物を、ケタミン／キシラジンカクテルによって麻酔をかけられたマウス内に、網膜下（ＳＲＩ）または硝子体内（ＩＶ）のいずれかで注入した。全てのＡＡＶキャプシドは、ニワトリβアクチンプロモーター（ＣＢｈ）の下にレポーター遺伝子ルシフェラーゼをパッケージングした。試験された構築物は、ＡＡＶ１（１－ＣＢｈ）、ＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌ（１．１－ＣＢｈ）、ＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌ（６．１－ＣＢｈ）、ＡＡＶ６／Ｋ５３１Ｅ（６．３－ＣＢｈ）、ＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌ＿Ｋ５３１Ｅ（６．３．１－ＣＢｈ）、および、我々の研究室において以前に特徴付けられたＡＡＶ２変異であるＡＡＶ２．５（２．５－ＣＢｈ）を含んだ（Ｂｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（２）：４４３（２０１２））。導入遺伝子発現は、ＩＶＩＳルーメンの生きた動物のイメージングシステムを用いて、注入後の示された時点において、ルシフェラーゼ活性として測定した。１２０ｍｇ／ｋｇ体重でのＤ－ルシフェリン基質（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ）の腹腔内注入後にマウスを画像化して、ＩＶＩＳの製造元の説明書に従って所定の関心領域内の光子を測定することによって、画像を定量化した。結果を図９および図１０に示す。
ｒＡＡＶ遺伝子療法のトランスレーション（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）における成功は、インビボでの低い形質導入効率によって挑戦されている。本研究は、骨格筋における高い形質導入表現型を有する新規のキャプシド変異体を明らかに生じることのできる合理的な工学戦略を開発するために、ｒＡＡＶキャプシドの構造解析を用いた。全体的な手法は、我々の研究室による、より初期の報告によって可能にされて、ｒＡＡＶ２における形質導入効率の重要な決定因子としてＶＲ１を明らかにした。ｒＡＡＶ２において我々が既に発見したように、形質導入の上昇は、ｒＡＡＶ１内の２６５位における様々なアミノ酸の置換（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）により観察された。しかしながら、注目すべきことに、より医療的に関連のあるｒＡＡＶ１における単一のアミノ酸の欠失を介したＶＲ１の破壊は、形質導入が何桁も高い新規のベクターを生じた（図１）。この観察は単独で、現在ｒＡＡＶ１を利用している患者投薬プロトコルに関する重大な影響を有して、ベクター生産の容易性（ｅａｓｅｍｅｎｔ）を前進させ得る。ｒＡＡＶ６キャプシドでは、ヘパリン硫酸結合活性を与えることが以前に示された塩基性アミノ酸パッチを破壊するために二次的な突然変異が作られた後にのみであるが、同様の成果が得られることは注目に値した。キャプシド配列相同性を分析することによって可能にされるマーカーレスキュー手法を用いて、一緒に協力して形質導入効率および一次受容体認識を調整するキャプシド表面の２つの遠位領域を同定して、ウイルスのライフサイクル中のキャプシドトポロジーの複雑な役割に光を当てた。
２６５位および一次受容体の結合の間の拮抗する関係性は、２６５欠失表現型が、キャプシドと結合パートナーとの間のタンパク質：タンパク質相互作用における改変に起因することを示唆する。これが、細胞表面への最初の付着時または侵入後イベント中に生じるのかどうかは、決定されていないままである。導入遺伝子発現に対する唯一の測定可能な相関が、発現カイネティクスまたは長寿命ではなく、細胞あたりのベクターゲノムの数の増大であったことは、２６５表現型が、細胞の侵入現象の変化の結果であることを強く示唆する。ＶＲ１は、ｒＡＡＶ２において、ならびに定向進化を介して生産されるキメラベクターにおいて、受容体結合に関与しているが、これらの相互作用の性質の明らかな構造的詳細は未だ同定されていない。対称の３回軸－受容体係合を担うキャプシドの一次領域－を含む突出に対する２６５位の空間的関係は、このアイディアに対するさらなる証拠をもたらす。注目すべきことに、野生型と突然変異体構築物の間に、１．）キャプシド安定性を試験する熱変性分析、２．）キャプシドタンパク質の比率およびサイズを試験するためのウェスタンブロッティング、または、３．）充填キャプシドに対する空キャプシドのキャプシドトポロジーまたは集団分配における明白な違いに関して調査するための電子顕微鏡に、違いは見られなかった。さらに、投与量応答データは、２６５の上昇した形質導入プロファイルが、それぞれの臨床適用（例えば、ＡＡＴ対リポタンパク質リパーゼ不足）のためにダイアルインされ得る（ｃａｎ ｂｅ ｄｉａｌｅｄ ｉｎ）ことを示唆する。
トレオニン残基のリン酸化は、細胞内タンパク質の動力学に作用することがよく知られている。実際に、ｒＡＡＶキャプシド表面上の選択セリン、トレオニンおよびチロシン残基のリン酸化は、導入遺伝子送達の前にキャプシドのプロテアソームのクリアランスを最終的にもたらし、これらの残基の、リン酸化が不可能な種への突然変異は、キャプシドクリアランスを防ぎ、それにより、形質導入効率を高める。２６５位における多数の異なるタイプのアミノ酸（トレオニンの欠失、リン酸化模倣による置換または嵩高い疎水性）が全て形質導入を高めたことは、リン酸化が、２６５突然変異によって仲介される形質導入の上昇に関与するとは思われないことを示唆する。さらに、ＶＲ１の構造は、改善された形質導入表現型を得るために、ループ全体にわたって破壊され得る。これらの破壊は、キャプシドが阻害タンパク質と相互作用するのを緩和することがあり得るが、これは未だ決定されていない。しかしながら、ｒＡＡＶ２において同様の効果の証拠があり、それは、キャプシドヘパリン結合能力のアブレーションが、筋組織の形質導入を実質的に改善する（（ヌル）（ヌル））。実際に、そのようなデータは、本研究において総括された。ｒＡＡＶ２がヘパリン硫酸プロテオグリカンに結合する能力は、ウイルスの組織培養適応を通して進化されたこと、および、そのような受容体への結合は、この血清型のインビボの形質導入効率に有害であったことが議論されている。同様に、アデノウイルスの場合、ロバストな肝臓の形質導入は、キャプシドがその一次係留受容体への結合を遮断するように突然変異される場合でさえも維持されて、ＣＡＲは、キャプシドの代替領域として、代替の受容体との生産的な相互作用を促進することによって補うことが可能である。
特に、２６５位の欠失後に形質導入効率がピークになることは興味深い。ｒＡＡＶ１におけるＶＲ１の水素結合ネットワークの分析において（図８Ａ）、ＶＲ１が、２６５位によって主に編成された水素結合のネットワークによって安定化されることは注目に値する。実際に、２番目に良いトランスデューサ―は、２６４位および２６３位の欠失により生じ、その両方とも、このネットワークを介してＶＲ１の構造的安定化にも関わる。もちろん、ＶＲ１の安定性に対するこれらの突然変異の効果を本当に試験するための唯一の方法は、これらの構築物の結晶学的解決によるであろう。しかしながら、ｒＡＡＶ６が２６５位の周りで本質的に安定性が低いこと（図８Ｂ）、および、実際にはｒＡＡＶ６は、２６５位表現型を複製するためにさらなる突然変異が必要であることは、重大である。多くの研究が、非常に関連のあるｒＡＡＶ１とｒＡＡＶ６との間の表現型の不一致（例えば、受容体選択性および組織向性の違い）を解明しようとしている。実質的に全ての以前の研究は、これらの位置を正確に示すことがウイルスのライフスタイルに直接影響するキャプシド領域の解剖を可能にするという理解によって、これらの２つのウイルス間で異なる６個のキャプシドアミノ酸を試験した。これは真実であるが、我々はここで、ウイルス生物学を調節するために、これらの２つの血清型の間で構造的なレベルで異なるキャプシド構造のさらなるよりいっそう緻密な層を、これらの属性を利用するための合理的な設計手法とともに初めて示す。
別の説得力のある知見は、分泌されたタンパク質の導入遺伝子発現の測定（すなわち、ｈＡＡＴの濃度を決定するためのＥＬＩＳＡ、９倍の上昇を生じた）に対して、注入された組織内で、直接、導入遺伝子発現を試験する場合（すなわち、エクスビボでのルシフェラーゼアッセイ、１３７倍の上昇を生じた）に、ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌの間の測定された形質導入の上昇の矛盾である。改変されたキャプシドを用いた場合にｒＡＡＶ２と比較してルシフェラーゼ発現が桁単位で増大したにもかかわらず、ｉ．ｍ．注入されたｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ２．５およびＡＡＶ２／２６５Ｄから分泌されたｈＡＡＴの測定を比較する以前の実験において、ＥＬＩＳＡによって明らかな違いが見られなかったことは注目に値する。同様に、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブが、ルシフェラーゼアッセイによって測定した場合に肝臓組織におけるｒＡＡＶ２形質導入をおよそ１０倍高めることができることが見いだされたが、その上昇は、分泌されたＩＸ因子の発現に関して血清を測定する場合、２倍未満に落ちる。採取された組織から直接、導入遺伝子発現を測定することは、血清に対して細胞内環境におけるタンパク質半減期のような違いならびにタンパク質発現と比較したタンパク質分泌物の全体的効率に起因して、分泌された因子の回収その後の測定よりも感度の高い技術であると思われる。そのような知見は、分泌タンパク質をコードする導入遺伝子を送達することが意味されるｒＡＡＶベクターを設計する場合に、トランスレータブル（ｔｒａｎｓｌａｔａｂｌｅ）な適用性が達成されるのを必要とする形質転換における絶妙な増大を強調する。
これらの努力のゴールは、例えば、治療に有益な導入遺伝子レベルを達成するのに必要とされるベクター投与の低減によって、遺伝子療法がより実用的で効果的な臨床選択になるような、ｒＡＡＶベクター技術の継続的な改善である。そのような努力は、ベクター用量依存的な毒性に関する臨床上の心配を軽減し得て、臨床グレードのベクター生産の努力を軽くさせる。我々は、直接注入によって骨格筋を標的化する臨床試験で現在用いられているｒＡＡＶ血清型の性能を改善するための単純かつ効果的なストラテジーをここに示す。このストラテジーは、ｒＡＡＶベクター開発における他の主な進歩に特有のキャプシドの領域を利用するので（例えば、ＴｙｒからＰｈｅのキャプシド突然変異体）、遺伝子療法にｒＡＡＶベクターをさらに最適化するためのそのような技術的進歩と相乗的に統合され得るかどうか決定することは興味深い。我々の２６５突然変異体パネルが、心臓組織において、ならびに全身投与後に体の全骨格筋において、導入遺伝子発現を標的化して高める潜在性を我々は評価し続けているので、本明細書に含まれる研究は、次世代のトランスレーショナル（ｔｒａｎｓｌａｔｉｎａｌ）ｒＡＡＶベクターの開発のためのスタートの基礎を提供する。さらに我々は、単一アミノ酸がｒＡＡＶベクター生物学において果たす特有かつ重大な役割のより総合的な理解を最終的にもたらすさらに詳細な（例えば、結晶学的）分析のために利用可能なｒＡＡＶキャプシド試薬のコレクションを生産した。
［実施例８］
材料および方法
プラスミドおよびウイルス：全てのプラスミドは、ノースカロライナ大学のＧｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｃｅｎｔｅｒ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅ ｆａｃｉｌｉｔｙから得られた。ＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションを介してウイルスを作製して、前述のとおり塩化セシウム密度超遠心分離によって精製した（Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１（３）：１４１２（２００６））。ルシフェラーゼ導入遺伝子を認識するように設計された以下のプライマーセットによるリアルタイム定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析を用いてウイルス力価を測定した：（フォワード）５’－ＡＡＡ ＡＧＣ ＡＣＴ ＣＴＧ ＡＴＴ ＧＡＣ ＡＡＡ ＴＡＣ－３’（配列番号１０）および（リバース）５’－ＣＣＴ ＴＣＧ ＣＴＴ ＣＡＡ ＡＡＡ ＡＴＧ ＧＡＡ Ｃ－３’（配列番号１１）。それぞれの実験群について、関連のあるウイルス構築物を、使用される前に同一のｑＰＣＲプレート上で一緒に滴定した。部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ）を用いて、ヌクレオチド欠失または置換を作製した。表９は、この研究で作製された全てのＶＲ１突然変異体に用いたプライマー配列を列挙する。ウイルスを作製する前に、この作業で用いられる各プラスミドの配列同一性が正しいことを確認するためにＤＮＡシーケンスを行なった。
構造解析および分子モデリング：示されたｐｄｂファイルを、ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ構造検証ソフトウェア（ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ）により処理して、必要な場合はＡｓｎ／Ｇｌｎ／Ｈｉｓフリップの包含を介したＨ結合最適化を用いて、電子雲ｘ－Ｈ結合の長さに基づき水素結合を加えた。それから、全ての原子の接触および形状に関してファイルを解析して、ＫｉＮＧ（ｋｉｎｅｍａｇｅ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｄｕｋｅ．ｅｄｕ）において可視化して、水素結合に関与しているＶＲ１原子を決定した。それから、ＰＤＢをＰｙＭｏｌ（ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇ）内で開いて、水素を可視化してスティック線図として示して、ＫｉＮＧにおいて同定された水素結合を、物差しを用いて破線に変換した。
生きた動物試験：動物は、Ｃｈａｐｅｌ Ｈｉｌｌのノースカロライナ大学でのＩＡＣＵＣによって承認されるプロトコルの下で、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈガイドラインに従って維持されて取り扱われた。ＣＢＡ－ルシフェラーゼ導入遺伝子をパッケージングしているｒＡＡＶ変異を、６～８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の尾静脈に、示された量で注入した。全ての注入は注入あたり２００μＬの合計容量で行なった（容量は、１×ＰＢＳを用いて２００μＬにされた）。１２０ｍｇ／ｋｇ体重でのＤ－ルシフェリン基質（Ｎａｎｏｌｉｇｈｔ）の腹腔内注入後、ルシフェラーゼ導入遺伝子発現を、Ｘｅｎｏｇｅｎ ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて可視化した。Ｌｉｖｉｎｇ Ｉｍａｇｅソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて生物発光画像解析を行なった。
導入遺伝子発現およびコピー数のエクスビボでの定量化：エクスビボでのルシフェラーゼアッセイを介した分析のための組織サンプルを得るために、１０ｄｐｉにマウスを屠殺して、示された臓器を採取して急速冷凍した。カミソリ刃を用いて組織を氷上でホモジナイズして、各組織ホモジネートのおよそ５０ｍｇを、それから２５０μＬの２× Ｐａｓｓｉｖｅ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）中に懸濁して、Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅａｒｏｒ（Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ）を用いて機械的に溶解させた。それから、それぞれの組織溶解物の３５μＬを９６ウェルプレートに移して、Ｖｉｃｔｏｒ２ルミノメーター（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いた発光分析を実施する直前に、１００μＬのＤ－ルシフェリン基質（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合した。各組織溶解物の合計タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）によって決定した。加えて、ＤＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて上記の生産された組織ホモジネートの約２５ｍｇアリコートを処理して、宿主およびベクターゲノムＤＮＡを抽出した。細胞の数を、マウスラミン（ハウスキーピング遺伝子）に特異的に設計された以下のプライマーによるｑＰＣＲを用いて決定した：（フォワード）５’－ＧＧＡ ＣＣＣ ＡＡＧ ＧＡＣ ＴＡＣ ＣＴＣ ＡＡＧ ＧＧ－３’（配列番号４５）および（リバース）５’－ＡＧＧ ＧＣＡ ＣＣＴ ＣＣＡ ＴＣＴ ＣＧＧ ＡＡＡ Ｃ－３’（配列番号４６）。また、細胞あたりのウイルスゲノムの数も、上述のルシフェラーゼ導入遺伝子に特異的に設計されたプライマーによるｑＰＣＲを用いて決定した。
［実施例９］
ＶＲ１における水素結合ネットワークを同定するためのｒＡＡＶキャプシドの構造解析
我々は、ｒＡＡＶ１キャプシドのＶＲ１内の選択アミノ酸の欠失が、マウスへの筋肉内注入後の形質導入効率においてｌｏｇオーダーの増大をもたらすことを以前に示した（Ｗａｒｉｓｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１５）。ｒＡＡＶ１結晶構造の解析は、最も効率的なＶＲ１欠失突然変異が、ループ内水素結合ネットワークに関与しているアミノ酸に対応することを明らかにして、ＶＲ１構造エレメントの不安定化が、高い形質導入表現型をもたらすことを示唆した。本研究のゴールは：１）ｒＡＡＶ１ ＶＲ１突然変異体キャプシドが、静脈内注入後に筋組織を効率的に標的化することができるかどうか（高い形質導入の表現型を単純に有するのに対して）、および２）標的化されたＶＲ１構造エレメントの不安定化が、さらなるｒＡＡＶ血清型における形質導入を改善する保存された方法であるかどうか、決定することであった。これらの疑問に対処するために、ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３、ｒＡＡＶ４、ｒＡＡＶ５、ｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、およびｒＡＡＶ９を含むｒＡＡＶキャプシドのコレクションを、オープンソースの構造検証ソフトウェアＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３５（ウェブサーバー版）：Ｗ３７５（２００７））およびＫｉＮＧ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．１８（１１）：２４０３（２００９））において可視化されたＶＲ１水素結合パターンを用いて解析した（図１１Ａ～１１Ｈ）。これらの血清型は、キャプシド結晶構造データ（Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０（２３）：１１５５６（２００６）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｆ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６２（Ｐｔ １２）：１２７１（２００６）；Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９９（１６）：１０４０５（２００２）；Ｌｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ４０３（１）：２６（２０１０）；Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８７（２０）：１１１８７（２０１３）；Ｘｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｆ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６４（Ｐｔ １１）：１０７４（２００８）；Ｎａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１（２２）：１２２６０（２００７）；Ｍｉｔｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｓｅｃｔ．Ｆ Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．６５（Ｐｔ ７）：７１５（２００９））および、それらのインビボ形質導入表現型の既存の知識（Ｚｉｎｃａｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１６（６）：１０７３（２００８））の両方の利用性に基づいて解析に選択された。ｒＡＡＶ７に関する公に利用可能な構造的情報は存在しないが、この血清型は、完全性のために含まれた。見やすさのために、同定された水素結合パターンを、それから、ＰｙＭｏｌ画像に変換した（図１２Ａ～１２Ｈ）。
これらの解析に基づき、ループ内ＶＲ１水素結合ネットワークに関与していることが見いだされたそれぞれの血清型由来のアミノ酸を、欠失に選択した。表１０は、血清型ｒＡＡＶ１－ｒＡＡＶ９に関するＶＲ１アミノ酸配列、および、本研究において突然変異に選択されたアミノ酸、ならびに、いくつの水素結合がそれぞれの突然変異で破壊されると仮定されるのかを列挙する。ｒＡＡＶ７の場合は、２６５位でのトレオニンの突然変異を、ｒＡＡＶ１について得られた以前の結果に基づいて選択した（Ｗａｒｉｓｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１５）。ｒＡＡＶ９の場合は、ＶＲ１の構造は、２つの位置における水素結合によって安定化されると考えられ、１つ目は、残基Ｓ２６３付近に由来する結合によって主に編成されて、２つ目は、残基Ｓ２６５付近に由来する結合による。したがって、二重突然変異体ｒＡＡＶ９／Ｓ２６３ｄｅｌ＿Ｓ２６５ｄｅｌに加えて、ｒＡＡＶ９／Ｓ２６３ｄｅｌおよびｒＡＡＶ９／Ｓ２６５ｄｅｌを含む突然変異体キャプシドが作製された。しかしながら、二重欠失突然変異体は、無傷のウイルス粒子を生産することができず、ｒＡＡＶ９／Ｓ２６３Ａ＿Ｓ２６５ｄｅｌを作製するために、Ｓ２６５位の欠失とともにＳ２６３位をアラニンに突然変異する代替のストラテジーをもたらした。本研究内に含まれる全ての血清型に関して観察される水素結合関係の詳細な原子的説明のために、図１１に関する凡例を言及する。
［実施例１０］
ＶＲ１内の水素結合ネットワークを不安定化するように突然変異されたｒＡＡＶキャプシドの生体内分布
上記に詳述された野生型およびＶＲ１突然変異体キャプシドの組織分布および形質導入効率を可視化するために、コレクションの各メンバーを、ニワトリβアクチンプロモーター駆動のホタルルシフェラーゼ（ＣＢＡ－ｌｕｃ）レポーター導入遺伝子とともにパッケージして、注入あたり１ｅ１１ウイルスゲノム（ｖｇ）の投与量で尾静脈を介してマウスに注入した。生きた動物の生物発光イメージングを、注入の９日後に行なった（ｄｐｉ）。１０ｄｐｉにマウスを屠殺して、選択臓器を取り出して、ホモジナイズおよび溶解した。それから、導入遺伝子発現を測定するために組織溶解物をエクスビボでのルシフェラーゼ分析に、および、細胞あたりのウイルスゲノムコピー数を定量化するためにｑＰＣＲ分析に供することによって、ベクター生体内分布を定量化した。ＶＲ１アミノ酸の欠失は、４つの表現型：１）ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６に関して観察されるような、心筋および／または骨格筋の選択的およびロバストな標的化（図１３）；２）ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、およびｒＡＡＶ９に観察されるような、肝臓の形質導入における実質的な低減と組み合わせた先天性の心筋および／または骨格筋形質導入効率の維持（図１４）；３）ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ３のような、形質導入の広範な不存在（図１５Ａ～１５Ｂ）；および、４）ｒＡＡＶ４およびｒＡＡＶ５の場合のような、無傷のウイルス粒子を生産する不可能性をもたらす。
ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６キャプシドにおけるＶＲ１突然変異は、心筋および骨格筋組織における形質導入効率の実質的な獲得をもたらした（図１３）。導入遺伝子発現は、ｒＡＡＶ１に対して、ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌによって処置されたマウスから得られた心筋で２１倍高く、腓腹筋（ＧＣ）組織サンプルで２６倍高い測定であった。また、ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌ形質導入効率は、いくつかの他の組織タイプでも高く、横隔膜（２６倍）、脾臓（３．５倍）、腎臓（５倍）、膵臓（６倍）、および肺（８倍）を含んだ（図１６Ａ）。驚くべきことに、ｒＡＡＶ１と比較して、肝臓の形質導入が３．５倍低減した（図１３Ｂ）。同様に、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌキャプシドは、野生型ｒＡＡＶ６よりも１４倍および３倍高いレベルで心筋およびＧＣ筋を形質導入して、肝臓の形質導入の２８倍低減が付随した（図１３Ｅ）。試験された他の組織ではいずれも、ｒＡＡＶ６およびｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌキャプシドの間に、測定された導入遺伝子発現の著しい違いはなかった（図１６Ｂ）。ｒＡＡＶ６／Ｓ２６２ｄｅｌは、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌと同様の表現型を生じて、心筋およびＧＣ筋において、それぞれ、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌよりも、３．５倍低いレベルおよび６倍高いレベルで、そして、肝臓においては、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌの１倍以内で、形質導入した（図１６Ｃ）。これらの結果は、ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６ ＶＲ１突然変異体構築物が、マウスに全身投与された場合に、筋組織に優先的に形質導入することを示唆する。
宿主細胞あたり存在するベクターゲノムの数を、心臓、ＧＣ、および肝臓を含む臓器のサブセットに対してｑＰＣＲを介して定量化した（図１３Ｃ、１３Ｆ）。ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌおよびｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌキャプシドによって処置されたマウスから得られた組織サンプルでは、ｑＰＣＲによって測定された宿主細胞導入遺伝子集団における変化は、ルシフェラーゼアッセイによって測定された導入遺伝子発現に関して観察されたものと同様の傾向であった（すなわち、より多くのベクターゲノムが導入遺伝子発現の増大と相関し、逆も同様である）。しかしながら、導入遺伝子集団の測定の間の違いは、形質導入効率に関して得られたものよりも微細であった。例えば、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌによって処置されたマウスにおいては、ｒＡＡＶ６によって処置されたマウスよりも、心臓細胞あたり４倍多くのベクターゲノムが存在し、一方で、突然変異体キャプシドによる心臓の形質導入においては１４倍増大した（図１３Ｆ）。同様に、形質導入において２８倍の低減に対して、肝臓細胞あたりｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌゲノムは４倍少なかった。興味深いことに、両方の構築物において心臓の形質導入は肝臓のものよりもはるかに多かったにもかかわらず、心臓細胞あたりのベクターゲノムは、ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌの両方の場合において肝臓細胞あたり測定されたものよりも実質的に少なかった。まとめると、これらのデータは、ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６ ＶＲ１突然変異体キャプシドが肝臓を形質導入する能力の低減は、これらのキャプシドが持続的な導入遺伝子を肝臓細胞に送達することが不可能であることと対応することを示す。加えて、ＶＲ１突然変異体キャプシドによって筋組織に送達される導入遺伝子は、それらの野生型対照物によって送達されるものよりも効果的に発現されると考えられる。最後に、肝臓の微小環境のいくつかの面は、核に侵入する、またはそこでいったん脱殻する、ｒＡＡＶ１キャプシドの能力に向けたハードルを設けると考えられる。
ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９キャプシドからのＶＲ１アミノ酸の欠失は、著しく似た表現型を有する生体内分布プロファイルを作製した（図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｇ）。それぞれに関して観察された主な特性は、肝臓の形質導入における急な低減（野生型キャプシドと比較して、ｒＡＡＶ７で４２７倍、ｒＡＡＶ８で２３倍およびｒＡＡＶ９で１０７倍）であり、一方で、ネイティブの心筋および骨格筋形質導入レベルは維持された。筋組織における形質導入効率は、ｒＡＡＶ７とｒＡＡＶ７／Ｔ２６５ｄｅｌの間で著しく変わらなかったが、ｒＡＡＶ８／Ｔ２６５ｄｅｌは、ＧＣ組織における形質導入効率をｒＡＡＶ８と比較しておよそ８倍高めた（図１４Ｅ）。ｒＡＡＶ９／Ｓ２６３Ａ＿Ｓ２６５ｄｅｌは、筋組織において可変の効果を生じて、ｒＡＡＶ９よりも心臓組織を３倍低く、ＧＣ組織を２倍高く形質導入した（図１４Ｈ）。サンプルされた他の組織タイプのいずれにおいても、このサブセットのＶＲ１突然変異体と野生型キャプシドとのあいだに、顕著な形質導入の違いは存在しなかった（図１７Ａ～１７Ｃ）。Ｓ２６３位およびＳ２６５位における同時の突然変異が、ｒＡＡＶ９において筋肉を標的化した生体内分布プロファイルを生じるのに必要であったこと、および、これらの位置のいずれかにおける単一の欠失が、全体的な形質導入効率を実質的に低減させたことは、注目に値する（図１４Ｄ）。
宿主細胞あたり存在するベクターゲノムのコピー数を、心臓、ＧＣおよび肝臓組織サンプルにおいて定量化した。このサブセットの全てのＶＲ１突然変異体キャプシドにおいて、肝臓の導入遺伝子発現の低減は、肝臓細胞内の導入遺伝子集団の低減に対応した（ｒＡＡＶ７／Ｔ２６５ｄｅｌに関して肝臓細胞あたり８５倍少ないベクターゲノム、ｒＡＡＶ８／Ｔ２６５ｄｅｌに関して２７倍少ない、および、ｒＡＡＶ９／Ｓ２６３ｄｅｌ＿Ｓ２６５ｄｅｌに関して７倍少ない；図１４Ｃ、１４Ｆ、１４Ｉ）。導入遺伝子集団と形質導入効率との間の関係は、筋組織サンプルにおいてより明白でなかった。例えば、ｒＡＡＶ７に対してｒＡＡＶ７／Ｔ２６５ｄｅｌを比較した場合、心臓細胞あたり導入遺伝子コピーが２２倍低減して、まだなお、キャプシド間の形質導入効率は実質的に同一であった。これらのデータは、このサブセットのＶＲ１突然変異体キャプシドは、安定した導入遺伝子集団を肝臓細胞に送達する能力が欠損していて、一方で、これらのキャプシドによって筋組織に送達される導入遺伝子は、それらの野生型対照物によって送達されるものよりも効果的に発現されることを示唆する。
ＶＲ１アミノ酸の欠失は、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３ｂ、ｒＡＡＶ４およびｒＡＡＶ５キャプシドにおいて有害効果を生じた。ｒＡＡＶ４およびｒＡＡＶ５では、ＶＲ１アミノ酸欠失は、無傷のビリオンを生産するのを不可能にさせた。ベクター生産は、この結果の再現性を確認するために、両方の構築物を用いて何度か試みられた。ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ３ｂでは、ＶＲ１アミノ酸欠失は、ベクター生産に対して測定可能な影響を有さなかったが、これらの血清型の両方において、ＶＲ１欠失突然変異は、静脈内注入後にマウスにおいて測定可能な形質導入の除去をもたらした（図１５Ａ～１５Ｂ）。再度、これらの結果の再現性を確認するために、これらの実験を、５倍高い投与量（５ｅ１１ｖｇ／注入）のｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２／Ｓ２６４ｄｅｌでマウスの２番目のコホートにおいて、ベクターの新鮮なストックを用いてデュプリケートした（図１５Ｃ）。全体的に、ＶＲ１欠失突然変異に応答してこれらの血清型において見られた劇的な効果は、規定されたＶＲ１構造を維持することが、これらのキャプシドの能力が生産的なウイルスライフサイクルを完了するために重要であることを示唆する。
［実施例１１］
非常に効率的な肝臓の形質導入を可能にするキャプシドモチーフの同定
以前の研究は、キャプシドタンパク質において２６４位の後にアミノ酸挿入突然変異を保有する（新規の２６５位を作る）ｒＡＡＶ２キャプシドは、筋肉内注入後の骨格筋において著しく高い形質導入効率を示すことを示した（Ｂｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０（２）：４４３（２０１２）；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１２．８６（１５）：７７５２（２０１２））。特に、アスパラギン酸の挿入は（ｒＡＡＶ２／２６５Ｄ）、形質導入を何桁も高めることが見いだされた（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１２．８６（１５）：７７５２（２０１２））。ＶＲ１アミノ酸の欠失は、形質導入が不可能なｒＡＡＶ２キャプシドを与えたので、我々は次に、代替－ＶＲ１へのアミノ酸の挿入－が、ｒＡＡＶ２の生体内分布表現型を高めることができるかどうか試験した。ＣＢＡ－ｌｕｃをパッケージングしているｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２／２６５Ｄキャプシドを、マウスの尾静脈中に注入して、生きた動物の生物発光イメージングを９ｄｐｉに行なった（図１８Ａ）。１０ｄｐｉに臓器を採取して、上述のとおりに導入遺伝子発現について定量化した。興味深いことに、他の血清型におけるＶＲ１アミノ酸欠失は、肝臓の形質導入の急な低減をもたらしたが、ＶＲ１へのさらなるアミノ酸の挿入は、反対の表現型をもたらした。肝臓の形質導入は、ｒＡＡＶ２と比較してｒＡＡＶ２／２６５Ｄにおいて１０倍増大されて（図１４Ｂ）、一方で、２つのキャプシド間の形質導入の違いは、全ての他の試験した組織において≦２倍異なった（図１４Ｂおよび図１５Ａ）。宿主細胞あたりのベクターゲノムコピーは、心臓およびＧＣ組織において、２つのキャプシド間で１倍未満異なったが、ｒＡＡＶ２に対して、ｒＡＡＶ２／２６５Ｄを投与されたマウスにおいて、肝臓細胞あたりのベクターゲノムコピーが１０倍増大した（図１８Ｃ）。したがって、ｒＡＡＶ２／２６５Ｄキャプシドは、ｒＡＡＶ２キャプシドよりも、肝臓細胞の標的化および侵入のいずれかが可能であり、または、これらの突然変異体キャプシドによって送達されるゲノムは、これらの細胞内でより良好に存続することが可能である（または両方）。
ＶＲ１におけるアスパラギン酸の存在が、さらなる血清型において肝臓の形質導入を高めることができるかどうか決定するために、置換突然変異（表１１）をｒＡＡＶ１（ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５Ｄ）およびｒＡＡＶ６（ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５Ｄ）において作製して、挿入突然変異をｒＡＡＶ３ｂにおいて作製した（ｒＡＡＶ３ｂ／２６５Ｄ）。全ての場合において、肝臓に関する強い形質導入選択性が観察された：ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５Ｄは、ｒＡＡＶ１よりもおよそ２１２．５倍高く肝臓を形質導入し（図１８Ｈ）、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５Ｄは、ｒＡＡＶ６と比較して２８倍（図１８Ｋ）、および、ｒＡＡＶ３ｂ／２６５Ｄは、ｒＡＡＶ３ｂと比較して９倍であった（図１８Ｅ）。ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ１／Ｔ２６５Ｄの場合は、２つの構築物の間の形質導入の違いは、試験した全ての他の組織において、２．５倍以下異なった（図１８Ｈおよび図１９Ｃ）。ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５Ｄは、ｒＡＡＶ６と比較して、心筋およびＧＣ筋の形質導入を、それぞれ３２倍および４．５倍高めた（図１８Ｋ）。全ての残っている組織において、２つの構築物の形質導入効率は実質的に同一であった（図１９Ｄ）。最後に、ｒＡＡＶ３ｂおよびｒＡＡＶ３ｂ／２６５Ｄの生体内分布を比較すると、突然変異体構築物は、心臓および横隔膜組織において形質導入をおよそ３倍高めて、一方で、２つの構築物の間の著しい形質導入の違いは、いかなる残っている組織においても観察されなかった（図１８Ｅおよび図１９Ｂ）。合わせると、データは、ＶＲ１へのアスパラギン酸の挿入または置換は、ｒＡＡＶの静脈内投与後に肝臓の形質導入を優先的に高めることを示す。

形質導入効率がそれぞれの組織内でのゲノムコピー数と相関するかどうか決定するために、宿主細胞あたりのベクターゲノムコピーを、心臓、肝臓、およびＧＣ組織サンプルについて定量した。野生型対照物と比較して、ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ＤおよびｒＡＡＶ３ｂ／２６５Ｄによって処置されたマウスの肝臓において存在するベクターゲノムの数が増大した（それぞれ、４．５倍および１８２倍；図１８Ｆ、１８Ｉ）。ｒＡＡＶ６の場合は、肝臓細胞あたりのベクターゲノムコピーは、野生型と突然変異体キャプシドとの間で実質的に同一であった（図１８Ｉ）。ＶＲ１アスパラギン酸突然変異もまた、ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ＤまたはｒＡＡＶ３ｂ／Ｔ２６５Ｄによって処置されたマウスにおいてＧＣ細胞あたりのベクターゲノムコピー数が実質的に上昇したが（それぞれ、野生型よりも６０倍および５１倍多いゲノム；図１８Ｆ、１８Ｉ、１８Ｌ）、この組織タイプにおける突然変異体と野生型構築物との間の形質導入効率は同一であった（いずれの場合も、値は、野生型キャプシドに関して得られたものの２倍以内に測定された）。ベクターゲノムコピー数と形質導入効率との間の一貫した相関の欠如は、ウイルスキャプシドの侵入後のプロセッシングが、これらの突然変異体キャプシドの高い肝臓形質導入効率を駆動するのを少なくとも部分的に担っていることを強く示唆する。
ｒＡＡＶ１、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３ｂおよびｒＡＡＶ６キャプシドは、２６５Ｄ突然変異の後に同一のＳＳＸＳＤＧＡＳ（配列番号４７）ＶＲ１アミノ酸配列を含むように作られたが、ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９は、キャプシドのこの領域内に実質的に異なるアミノ酸配列を有する（表１１）。したがって、２６５Ｄ突然変異を保有するキャプシドによって生産される高い選択的肝臓形質導入が、アスパラギン酸自体によって与えられる一部の静電気または構造上の効果に対し、一次アミノ酸配列に起因したかどうかを明らかにするために、２６５Ｄ突然変異をｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９キャプシド内に作製した。ＣＢＡ－ｌｕｃをパッケージングしているｒＡＡＶ８／Ｔ２６５ＤおよびｒＡＡＶ９／Ｔ２６５Ｄキャプシドを、ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９とタンデムで生産して、全てをマウスに静脈内注入した。生物発光イメージングを１０ｄｐｉに行なった。ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９キャプシドにおいて、Ｔ２６５Ｄ突然変異は、野生型キャプシドと比較して全体的な形質導入効率を実質的に低減させた（図２０）。これらの結果は、ＳＳＸＳＤＧＡＳ（配列番号４８）ＶＲ１アミノ酸配列が、関連のあるｒＡＡＶキャプシドにおける高い肝臓の形質導入効率の背後の駆動力であり、アスパラギン酸自体によって与えられる構造上の特性ではないことを示唆する。
［実施例１２］
ＶＲ１突然変異体キャプシドの形質導入効率に対する、キャプシドヘパリン結合能力の影響
我々は、所定のキャプシドがヘパリン硫酸に結合する能力が、筋肉内注入を介して投与されたキャプシドにおけるＶＲ１突然変異によって生産される高い形質導入表現型を妨げることを以前に示した（Ｗａｒｉｓｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１５）。ヘパリン結合は、それぞれのキャプシドにおける単一の点突然変異によって、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３ｂ、およびｒＡＡＶ６において破壊され得ることが以前に示されている（Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（２０）：１１０７２（２００３）；Ｏｐｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（１２）：６９９５（２００３）；Ｌｅｒｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，４２３（１）：６（２０１２）；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０（２２）：１１３９３（２００６））。したがって、ＶＲ１突然変異体キャプシド形質導入効率がさらに高められ得るかどうかを決定するために、これらの突然変異を、ｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３ｂ、およびｒＡＡＶ６内に組み込んで、ｒＡＡＶ２／Ｒ５８５Ｅ、ｒＡＡＶ３ｂ／Ｒ５９４Ａ、およびｒＡＡＶ６／Ｋ５３１Ｅを作製した。これらの突然変異体キャプシドがヘパリンと相互作用することができないことを、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィーを用いて確認した。上記のキャプシドをＣＢＡ－ｌｕｃとともにパッケージして、ｒＡＡＶ２／２６５Ｄ＿Ｒ５８５Ｅ、ｒＡＡＶ３ｂ／２６５Ｄ＿５９４Ａ、および、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５Ｄ＿Ｋ５３１Ｅ、およびそれらの単一の突然変異体および野生型対照物とタンデムでマウスに静脈内投与した。１０ｄｐｉにマウスを屠殺して、導入遺伝子発現の定量化のために肝臓を取り出した。以前に示されているように（Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（１）：７９（２０１０）；Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（２０）：１１０７２（２００３））、ｒＡＡＶ２キャプシドによるヘパリン結合の阻害は、マウスにおける肝臓の形質導入を約６．５倍低減させた（図２１Ａ）。しかしながら、ヘパリン－ヌルｒＡＡＶ２キャプシドをＶＲ１突然変異２６５Ｄと組み合わせると、生じたｒＡＡＶ２／２６５Ｄ＿Ｒ５８５Ｅは、肝臓においてｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２／２６５Ｄの両方ともを、それぞれ１３２倍および１１倍上回っていた（図２１Ａ）。ｒＡＡＶ３ｂおよびｒＡＡＶ６におけるキャプシドヘパリン結合能力の阻害もまた、ＶＲ１ ２６５Ｄ突然変異と組み合わせて、それぞれの親キャプシドと比較して形質導入を高めた。ｒＡＡＶ３ｂ／２６５Ｄ＿Ｒ５９４Ａは、ｒＡＡＶ３ｂよりも５３倍、および、ｒＡＡＶ３ｂ．２６５Ｄよりも２．５倍、肝臓を形質導入したが、一方で、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５Ｄ＿Ｋ５３１Ｅは、ｒＡＡＶ６およびｒＡＡＶ６／Ｔ２６５Ｄよりも、それぞれ４６倍および４倍効率的であった（図２１Ｂ、２１Ｃ）。最後に、ｒＡＡＶ６キャプシドに適用されたＶＲ１欠失突然変異は筋組織における形質導入効率を高めたので（ＶＲ１アミノ酸欠失の後に形質導入欠損となったｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ３ｂにおける同様の突然変異とは異なる）、我々は、ｒＡＡＶ６ヘパリン結合の無効化がこのコンテキスト内で形質導入をさらに増大する役割を果たすかどうかも決定しようとした。個々のマウスに、１ｅ１１ｖｇのｒＡＡＶ６、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌ、ｒＡＡＶ６／Ｋ５３１ＥまたはｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌ＿Ｋ５３１Ｅを投与した。１０ｄｐｉにマウスを屠殺して、心臓およびＧＣサンプルを取り出して、エクスビボでのルシフェラーゼ発現を決定した。上記のｒＡＡＶ６／Ｔ２６５Ｄと同様に、ｒＡＡＶ６キャプシドヘパリン結合能力の廃止は、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌの形質導入効率をさらに高めた。ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌ＿Ｋ５３１Ｅは、ｒＡＡＶ６およびｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌよりも、それぞれ、心臓組織を形質導入するのが１７０倍および１３倍、効率的であり、ＧＣ組織では、それぞれよりも９０２７倍および２７９５倍、効率的であった（図２１Ｄ）。合わせると、これらの研究は、ＶＲ１突然変異体キャプシドの形質導入効率を最適化するためには、キャプシドヘパリン結合能が、適用可能な血清型から除去されることを確実にする必要があることを示す。
［実施例１３］
最も効率的な野生型血清型と比較した、ＶＲ１突然変異体キャプシドの形質導入
マウスに静脈内で送達される場合、ｒＡＡＶ８およびｒＡＡＶ９は一般に、それぞれ、肝臓および心臓組織を形質導入する最も効率的な血清型であると考えられる（Ｂｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１９（１２）：１３５９（２００８）；Ｄａｖｉｄｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１（６）：８７５（２００５））。したがって、既存の試薬のコンテキスト内でのＶＲ１突然変異体キャプシドの我々のコレクションのインビボ性能を適切に評価するために、ＶＲ１欠失突然変異を保有するキャプシドおよびＶＲ１挿入突然変異を保有するものを、それぞれ、ｒＡＡＶ９およびｒＡＡＶ８とタンデムで評価した。ＣＢＡ－ｌｕｃをパッケージングしているｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌ、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌ、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌ＿Ｋ５３１Ｅ、ｒＡＡＶ７／Ｔ２６５ｄｅｌ、ｒＡＡＶ８／Ｔ２６５ｄｅｌ、ｒＡＡＶ９／Ｓ２６４ｄｅｌ＿Ｓ２６６ｄｅｌおよびｒＡＡＶ９キャプシドを同時に生産して、ｑＰＣＲを介して同一の反応プレート内で一緒に滴定した。１ｅ１１ｖｇのそれぞれの構築物を個々にマウスに注入して、１０ｄｐｉに屠殺して、定量分析のために心臓および肝臓組織サンプルを集めた。ベクター特異性の尺度として、心臓に加えて肝臓組織を集めた。ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌ、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌ、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌ＿Ｋ５３１Ｅ、およびｒＡＡＶ７／Ｔ２６５ｄｅｌは、それぞれ、ｒＡＡＶ９と同一レベルで心臓を形質導入したが、一方で、ｒＡＡＶ８／Ｔ２６５ｄｅｌは、ｒＡＡＶ９よりも、およそ５倍効率的であり、ｒＡＡＶ９／Ｓ２６３Ａ＿Ｓ２６５ｄｅｌは、およそ３倍効率が低かった（図２２Ａ）。我々は次に、我々の突然変異体が、肝臓などの他の臓器よりも優先的に心臓組織を形質導入するかどうか決定しようとした。ｒＡＡＶ９と同等レベルで肝臓を形質導入したｒＡＡＶ８／Ｔ２６５ｄｅｌを除き、全てのＶＲ１突然変異体キャプシドは、ｒＡＡＶ９よりも高い心臓向性を示した（図２２Ｂ、２２Ｃ）。ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌは、最も有望な心臓向性プロファイルを生じ、肝臓よりもたった２倍だけ効率的に心臓を形質導入したｒＡＡＶ９に対して、肝臓よりもおよそ５８２倍効率的に心臓を形質導入した（図２２Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ｒＡＡＶ９よりも好ましい心臓向性を有する６つの新たな試薬を示す。
ｒＡＡＶ８と比較して、我々の２６５Ｄ突然変異体キャプシドパネルが肝臓を形質導入する能力を評価するために、ＣＢＡ－ｌｕｃをパッケージングしているｒＡＡＶ１／Ｔ２６５Ｄ、ｒＡＡＶ２／２６５Ｄ＿Ｒ５８５Ｅ、ｒＡＡＶ３ｂ／２６５Ｄ＿Ｒ５９４Ａ、およびｒＡＡＶ６／Ｔ２６５Ｄ＿Ｋ５３１Ｅベクターを、ｒＡＡＶ８とタンデムで生産した。全ての構築物を同一のｑＰＣＲプレート上で滴定して、１ｅ１１ｖｇの投与量でマウスに注入した。１０ｄｐｉにマウスを屠殺して、肝臓組織のサンプルを分析のために取り出した。ｒＡＡＶ８の形質導入効率に到達した２６５Ｄ突然変異体キャプシドはなかったが、ｒＡＡＶ２／２６５Ｄ＿Ｒ５８５Ｅは＜３倍内になった（図２２Ｄ）。ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ＤおよびｒＡＡＶ６／Ｔ２６５Ｄ＿Ｋ５３１Ｅは、それぞれ、ｒＡＡＶ８よりもおよそ８倍低い効率で、および、ｒＡＡＶ３ｂ／２６５Ｄ＿Ｒ５９４Ａは、およそ１７倍低い効率で、肝臓を形質導入した（図２２Ｄ）。まとめると、これらの結果は、ＶＲ１へのアスパラギン酸残基の挿入または置換は、非常に多くの血清型において肝臓の形質導入効率を実質的に高めることができるが、ｒＡＡＶ８は、このマウスモデルでの肝臓の形質導入において、さらに優れていることを示す。
［実施例１４］
ＶＲ１突然変異体キャプシドの心臓向性は、Ｙ－＞Ｆ突然変異の取り込みによって高められる。
ｒＡＡＶキャプシド表面上の選択チロシン残基の突然変異は、それらが核に到達することができる前に細胞内キャプシドのリン酸化および最終的なプロテアソーム分解を避けることによって、ｒＡＡＶ形質導入効率を高めることが示されている（Ｚｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ３８１（２）：１９４（２００８））。我々は、これらの突然変異が、ＶＲ１突然変異によって与えられる体内分布の表現型を維持しながら、ＶＲ１突然変異体キャプシドと協力して形質導入効率を高めることができるかどうか決定しようとした。ｒＡＡＶ１は、心筋および骨格筋疾患を修正する目的でトランスレーショナル（ｔｒａｎｓｌａｔｉｎａｌ）ヒト研究に最も使用される血清型であったので（Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２２（１０）：１２３９（２０１１）；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，ＪＡＣＣ Ｈｅａｒｔ Ｆａｉｌ．２（１）：８４（２０１４））、Ｙ４４５ＦおよびＴ２６５ｄｅｌ突然変異の両方を含むようにｒＡＡＶ１キャプシドを作製した。チロシンをフェニルアラニンにする突然変異は、ｒＡＡＶ１の関連において以前に評価されていないが、Ｙ４４５Ｆは、筋肉内注入後のｒＡＡＶ６において形質導入効率を高めることが証明されている（Ｑｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１（１０）：１３４３（２０１０））。ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６は、キャプシドタンパク質配列において＞９９％相同性を有し（Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０（２２）：１１３９３（２００６））、したがって、この突然変異が、ｒＡＡＶ１の関連において同様に機能し得ると期待することは合理的であった。それにもかかわらず、ｒＡＡＶ６は、この分析にも含まれた。ＣＢＡ－ｌｕｃをパッケージングしている野生型ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６キャプシドを、単一および二重のＴ２６５ｄｅｌおよびＹ４４５Ｆ突然変異体キャプシドと同時に生産した。それぞれ１ｅ１１ｖｇを、尾静脈を介してマウスに注入して、心臓、肝臓、およびＧＣ組織サンプルを、分析のために、１０ｄｐｉに取りだした。両方の血清型において、二重のＴ２６５ｄｅｌ＿Ｙ４４５Ｆ突然変異体キャプシドは、心臓の形質導入効率をさらに改善して：ｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌ＿Ｙ４４５Ｆは、ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ１／Ｔ２６５ｄｅｌよりも、それぞれ、６６倍および９倍高く心臓を形質導入して（図２３Ａ）、一方で、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌ＿Ｙ４４５Ｆは、ｒＡＡＶ６およびｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌよりも３０倍および３倍高く形質導入した。二重のＴ２６５ｄｅｌ＿Ｙ４４５Ｆ突然変異は、ＧＣ組織において可変の効果をもたらし、ここで、形質導入は、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌに対して、ｒＡＡＶ６／Ｔ２６５ｄｅｌ＿Ｙ４４５Ｆにおいて３．５倍上昇して（図２３Ｂ）、これらの突然変異体に対するｒＡＡＶ１対照間で実質的に同一であった。両方の血清型において、ＶＲ１突然変異体キャプシドによって与えられる肝臓の非標的化（ｄｅｔａｒｇｅｔｉｎｇ）は、Ｙ４４５Ｆ突然変異の関連において完全に維持された。奇妙なことに、細胞培養実験では、突然変異体が野生型キャプシドよりも著しく形質導入を高めたという事実にもかかわらず、Ｙ４４５Ｆ突然変異体そのものは、静脈内送達後にｒＡＡＶ１またはｒＡＡＶ６のいずれの形質導入効率も高めることができなかった。我々の知識では、これらの突然変異体は、マウスへの静脈内注入後に、以前に評価されたことがなく、したがって、なぜこれらが、この送達経路を介して、それらの親対照物よりも優れなかったのか推測することは難しい。おそらく、４４５位のチロシン残基が、血液脈管構造によって課されるバリアを横切る成功的なトラフィッキングに必要である。合わせると、これらのデータは、Ｙ４４５ＦをＶＲ１突然変異体キャプシドに取り込むことは、肝臓非標的化の生体内分布プロファイルを維持しながら、心臓の形質導入をさらに高めることができることを示唆する。
我々はここで、全身送達されたｒＡＡＶにおいて、筋組織の標的化および形質導入を改善するために用いることのできる、新規のキャプシドのエンジニアリング方法を提供する。以前の観察は、選択アミノ酸の欠失を介したｒＡＡＶ１キャプシドループＶＲ１の安定性の破壊は、筋肉内注入後の骨格筋形質導入を著しく高めたことを示している（Ｗａｒｉｓｃｈａｌｋ，Ｊ．Ｋ．ａ．Ｓ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１５）。形質導入を高めるのに最も効率的な突然変異は、ＶＲ１ループ内水素結合ネットワークに対して最も破壊的なものに相関した。これらの観察は、ｒＡＡＶ１における標的化されたＶＲ１の不安定化が、静脈内投与後に筋組織の選択的な標的化を誘導することができるかどうか、および、同様の成果を産生するようにさらなるｒＡＡＶ血清型を操作するためにこの手法が用いられ得るかどうか、我々に調査させた。我々のストラテジーは、試験した９個の血清型のうち５個の体内分布のプロファイルを高めるのに効果的であった。ｒＡＡＶ１およびｒＡＡＶ６キャプシドでは、心筋および／または骨格筋組織の形質導入における機能のロバストな獲得が観察されたが、ｒＡＡＶ７、ｒＡＡＶ８、およびｒＡＡＶ９キャプシドでは、筋組織においてネイティブの形質導入レベルが維持されて、一方で、肝臓形質導入効率は劇的に低減した。ＶＲ１突然変異後の重大な有害効果は、残りの血清型において著しく、ｒＡＡＶ４およびｒＡＡＶ５における無傷のビリオンを生産する不可能性、および、ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ３ｂにおける重度の形質導入の欠乏を含んだ。したがって、我々の方法は、新規のベクターを設計する場合に体系的に取り込まれまたは避けられ得るキャプシドトポロジーに機能的見識を提供する。
タンパク質内水素結合ネットワークは、非常に多くのウイルス種を含む実質的に全てのクラスのタンパク質において、機能上および構造上の動力学を調節する（例えば、Ｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｅｖｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：１６１（２０１０）を参照）。しかしながら、経験的構造データの獲得がなければ、相関的な証拠のみが、現在のところ、水素結合不安定化が本研究で作製されるＶＲ１突然変異体キャプシドの改善された表現型の背後の駆動力であることを支持する。それにもかかわらず、証拠は、その仮説の合理的な支持を提供する。第一に、ストラテジーは、試験された血清型の大部分において意図されたとおりに働いた。第二に、ｒＡＡＶ６残基Ｓ２６２およびＴ２６５は、ＶＲ１の残りを安定化するために一緒に働く水素結合ペアを形成し（図１１Ｆ）、これらの残基のいずれかの個々の欠失は、同等の体内分布の表現型をもたらした（図１６Ｃ）。第三に、ＶＲ１安定性は、ｒＡＡＶ９内の水素結合パートナーの２つの異なるセットに依存すると考えられて（図１１Ｈ）、所望の筋肉向性の生体内分布の表現型は、それらの両方の突然変異後にのみ得ることができて（図１４Ｇ）；いずれかの残基の個々の突然変異は効果がなかった（図１７Ｄ）。最後に、ｒＡＡＶ８において、ＶＲ１内にはたった１つの水素結合のみ存在して：それは、それ自体へのＴ２６５位アミノ酸側鎖の水素結合である（図１１Ｇ）。Ｔ２６５の欠失は、肝臓の実質的な非標的化をもたらしたが（図１４Ｅ）、隣のＳ２６６の除去は、そうしなかった（図２４）。ＶＲ１不安定化がｒＡＡＶ２、ｒＡＡＶ３ｂ、ｒＡＡＶ４およびｒＡＡＶ５に対して有する破壊的効果と組み合わせて、証拠は、このキャプシドループに関して正確に規定された構造が、そのライフスタイルを通してｒＡＡＶの生産的進歩に大きな影響を与えることを示唆する。
ＶＲ１構造に対する破壊は、高い全身特性を有するベクターを明らかにもたらすが、これらの新規の表現型を支配しているメカニズムの背後のさらなる詳細が分からないままである。個々の水素結合ペアは、様々なウイルス種において、キャプシド安定性および感染性効率を制御することが見いだされていて（Ｔｉｐｐｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８８（１８）：１０２８９（２０１４）；Ｔｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４２６（１０）：２１１２（２０１４）；Ｒｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（１４）：８００９（２００３）；Ｓｐｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０（７）：３５８２（２００６））、加えて、ｒＡＡＶ集合を調整すると仮定されている（Ｇｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０（１１）：５１９９（２００６））。しかしながら、ｒＡＡＶキャプシド安定性を測定するために設計された、確立された熱解離プロトコル（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８７（６）：２９９４（２０１３））は、野生型とＶＲ１突然変異体キャプシドとの間の違いを明らかにしなかった。さらに、キャプシド解離性における単純な増大は、ベクター生体内分布に対して広範な変化をもたらさないであろうと考えられる。ｒＡＡＶのＶＲ１ループは、露出したキャプシド表面上の単量体サブユニット間の界面に存在し、したがって、さらなるタンパク質と潜在的に相互作用することができる。キャプシド内の水素結合ネットワークは、インフルエンザノイラミニダーゼによるグリカン触媒作用（ｖｏｎ Ｇｒａｆｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．３３（１）：１０４（２０１５））、ヒトポリオーマウイルスによる受容体係合（Ｋｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８８（１１）：６１００（２０１４））、および、ＨＩＶ－２による抗ウイルス因子ＴＲＩＭ５αの回避（Ｍｉｙａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ６（７）：ｅ２２７７９（２０１１））中などに、結合パートナーとのキャプシド相互作用を調整することが知られている。ＶＲ１突然変異は、したがって、好ましい細胞表面受容体とのキャプシド相互作用を妨げるようにキャプシド安定性を変更し得て、核への代替の侵入路を可能にする。ＶＲ１欠失突然変異体キャプシドが投与されたマウスの、肝臓のベクターゲノム集団における一貫した低減は、突然変異体キャプシドによって心臓細胞に送達されたベクターゲノムが、野生型対照物によって送達されたものよりもずっと効率的に発現されたという知見と同様に、この概念を支持する。さらに、ヘパリン結合を除外するようにキャプシドが突然変異された場合に、ｒＡＡＶ２は筋肉標的化の改善および肝臓形質導入の低減を示すので、このコンセプトは、先例がないわけではない（Ａｓｏｋａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（１）：７９（２０１０）；Ｋｅｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（２０）：１１０７２（２００３））。また、ｒＡＡＶ９は、ガラクトース結合を低減するように突然変異された場合、肝臓非標的化の、全身性に高い表現型も示す（Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６（１９）：１０４０８（２０１２））。ＶＲ１突然変異は、ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ６キャプシドがヘパリン硫酸に結合する能力を低減することが示されていることは注目に値する（Ｗａｒｉｓｃｈａｌｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１５）。加えて、ＶＲ１のＮ末領域は、ｒＡＡＶ９のガラクトース結合フットプリントと、２つの領域間の直接的な相互作用が実行可能であるように十分に近接した近さ（＜３Ａ）のキャプシド上に位置する（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８６（１３）：７３２６（２０１２））。そのような観察は、異なるｒＡＡＶ血清型に関してインビトロで同定された受容体が、細胞培養を経ることによる（ｆｒｏｍ ｐａｓｓａｇｉｎｇ ｔｈｒｏｕｇｈ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）潜在的アーチファクトであるかどうか、および、ｒＡＡＶが、そのようなアーチファクトが変異的にアブレーションされる場合に、以前に信じられていたよりもさらにいっそう高いインビボでの形質導入の潜在性を有することができるかどうかについて、興味深い疑問をもたらす。
構造的見地から、ＶＲ１欠失突然変異は、ｒＡＡＶ４およびｒＡＡＶ５が無傷のビリオンを生産できないようにさせるという観察は、ありのままである。これらの血清型の両方において、ＶＲ１は、下にあるＢシートに対して主に水素結合される相対的に短いループを形成する。したがって、キャプシドのこの領域の安定化を破壊することは、キャプシドモノマーが互いに相互作用するのを防ぐ大まかな構造変化をあるいはもたらし得る。なぜＶＲ１欠失突然変異がｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ３ｂを形質導入欠損にさせるのかという理解は明白でない。マウス組織を形質導入することはできないにもかかわらず、ｒＡＡＶ２／Ｓ２６４ｄｅｌおよびｒＡＡＶ３ｂ／Ｓ２６２ｄｅｌは、培地中の細胞を形質導入することができる。したがって、マウス組織の形質導入における任意の欠乏は、インビボ環境の一部の面に起因する。将来の実験は、これらの観察をさらに解剖することを目的とする。ＶＲ１アミノ酸欠失によってｒＡＡＶ２を改善することはできなかったが、ＶＲ１へのアスパラギン酸の挿入が、欠失突然変異の反対の表現型：ベクターの全身投与後の肝臓の形質導入のロバストな上昇を生じるという、新発見をする能力のある知見をもたらしたので、長所がないわけではなかった。ＶＲ１挿入突然変異体の挙動を支配しているメカニズムの詳細は、現在のところ分かっていない。アスパラギン酸は、リン酸化模倣が知られていて、したがって、細胞内でのキャプシドトラフィッキングを潜在的に向け直すことができる。実際に、セリンおよびトレオニンリン酸化は、プロテアソーム分解のためにｒＡＡＶキャプシドをタグ付することが示唆されている（Ｇａｂｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．２４（２）：８０（２０１３））。しかしながら、オープンソースのリン酸化部位予測ソフトウェア（ＮｅｔＰｈｏｓ２．０）は、ＶＲ１（改変または未改変）をリン酸化の部位として示さず、プロテアソーム阻害剤を利用した細胞培養実験によるデータは、２６５Ｄ突然変異体キャプシドの表現型が、プロテアソームのクリアランスの低減の結果であることを支持しない。別の可能性は、ＶＲ１へのアスパラギン酸挿入が、アミノ酸欠失の逆の効果を生じることであり：ＶＲ１の構造を、破壊するのとは逆に安定化する。アスパラギン酸残基は、カルボニルスタッキング（Ｄｅａｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１２）：１０２５（１９９９））、塩架橋（Ｓｐｅａｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（１４）：１２５２２（２００３））、および、水素結合ネットワーク（Ｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，ＢＭＣ Ｅｖｏｌ．Ｂｉｏｌ．１０：１６１（２０１０））のような、タンパク質内相互作用における関与を通したタンパク質構造に対するそれらの安定化効果についてよく知られている。これがもし本当ならば、ＶＲ１欠失突然変異は、所定の受容体との相互作用を防止するようにキャプシドのこの領域を不安定化するが、ＶＲ１へのアスパラギン酸挿入は、その代わりに、キャプシド構造安定性および生じたタンパク質：タンパク質相互作用の両方を高めると考えられる。２６５Ｄ突然変異体キャプシドの大部分は、肝臓およびＧＣの両方においてベクターゲノム集団を増大させて、２６５Ｄ突然変異が細胞侵入を高めることを示唆した。しかしながら、これは肝臓の形質導入の場合には有利に見えるが、ＧＣにおける形質導入効率は、２６５Ｄ突然変異の関連において上昇せず、キャプシドの付着後プロセッシングも突然変異によって影響を受けることを示唆した。
要約すると、我々の研究は、インビボでの組織標的化および形質導入効率に対するｒＡＡＶキャプシドのＶＲ１領域の影響に、新たな構造的見解を提供する。これらの見解は、ベクターの全身投与後の組織標的化を改善する２つの保存された合理的な工学戦略の開発を可能にした。一見すると、心臓の標的化をｒＡＡＶ９のレベルまたはそれよりも高いレベルで行なうことができる６個の新規のベクターが開発されたので、ＶＲ１欠失突然変異体キャプシドのコレクションは、より医療的に関連があるように見える。これは実際に、ｒＡＡＶベクター学（ｖｅｃｔｏｒｏｌｏｇｙ）における価値の進展であるが、２６５Ｄ突然変異体キャプシドのコレクションは、臨床価値の観点から見落とされるべきでない。ｒＡＡＶ８は、マウスモデルにおいて最も良い肝臓のトランスデューサ―であると一貫して考えられるが（Ｄａｖｉｄｏｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１（６）：８７５（２００５））、そして、我々の研究において、２６５Ｄキャプシドのコレクションは、ｒＡＡＶ８に勝ることはできなかったが、ｒＡＡＶ８が、トランスレーショナル（ｔｒａｎｓｌａｔｉｎａｌ）ヒト遺伝子療法の適用のための最も理想的なベクターであることができないことも、注目に値する。実際に、ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ３ｂの変異体の両方とも、ｒＡＡＶ８よりも高い効率でヒト肝臓細胞を感染することが見いだされている（Ｌｉｓｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５０６（７４８８）：３８２（２０１４））。したがって、我々のＶＲ１突然変異体キャプシドのコレクションの両方とも、筋肉または肝臓に配向された遺伝子療法適用のいずれかのために利用可能な試薬プールを拡張する能力を有する。この拡張が、遺伝子療法のより良好なパーソナリゼーションが前進するのを可能にして、おそらく、患者の前から存在する中和抗体プロファイル（Ｌｏｕｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈ．２４（２）：５９（２０１３））が、それらの個々のニーズに最も適合する血清型を選択するのを助けるのを可能にして、および、必要な場合にベクターを再投与（ｒｅａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）する能力を高めることが、我々の望みである。
前述は本発明の例示であり、その限定と解釈されるべきではない。本発明は、以下の特許請求の範囲によって、その中に含まれるべき特許請求の範囲の同等物とともに定義される。

Claims (12)

  1. 可変領域１（ＶＲ１）ループ中の１つまたは複数のアミノ酸残基の欠失および／または置換を含む改変されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシドタンパク質であって、
    前記欠失および／または置換は、前記残基によって編成される水素結合パターンの標的化された破壊に起因して前記ループ内に局所的不安定化を生じ、ここで、
    ａ）前記キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１由来のアミノ酸配列を含み、前記欠失は、Ｓ２６１、Ｓ２６２、Ａ２６３、Ｓ２６４、Ｇ２６６、Ａ２６７、Ｓ２６８、またはＮ２６９（ＶＰ１ナンバリング）の位置であり、前記改変ＡＡＶキャプシドタンパク質は、前記キャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターに、前記欠失を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、増大した骨格筋に対しての形質導入効率を提供する；
    ｂ）前記キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１由来のアミノ酸配列を含み、前記欠失は、Ｔ２６５（ＶＰ１ナンバリング）の位置であり、前記改変ＡＡＶキャプシドタンパク質は、前記キャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターに、前記欠失を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、骨格筋、心筋、肺、横隔膜、脾臓および膵臓に対しての増大した形質導入効率、ならびに減少した肝臓に対しての形質導入効率を提供する；
    ｃ）前記キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ６由来のアミノ酸配列を含み、前記欠失は、Ｔ２６５（ＶＰ１ナンバリング）の位置であり、前記改変ＡＡＶキャプシドタンパク質は、前記キャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターに、前記欠失を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、骨格筋、心筋、脾臓および膵臓に対しての増大した形質導入効率、ならびに減少した肝臓に対しての形質導入効率を提供する；
    ｄ）前記キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ７由来のアミノ酸配列を含み、前記欠失は、Ｔ２６５（ＶＰ１ナンバリング）の位置であり、前記改変ＡＡＶキャプシドタンパク質は、前記キャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターに、前記欠失を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、減少した肝臓に対しての形質導入効率を提供する；
    ｅ）前記キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ６由来のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基５３１（ＶＰ１ナンバリング）はグルタミン酸で置換され、かつ、Ｔ２６５が欠失されており、前記改変ＡＡＶキャプシドタンパク質は、前記キャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターに、前記改変を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、骨格筋における増大した導入遺伝子発現を提供する；
    ｆ）前記キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ８由来のアミノ酸配列を含み、前記欠失は、Ｔ２６５（ＶＰ１ナンバリング）の位置であり、前記改変ＡＡＶキャプシドタンパク質は、前記キャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターに、前記欠失を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、骨格筋および横隔膜に対しての増大した形質導入効率、ならびに減少した肝臓に対しての形質導入効率を提供する；
    ｇ）前記キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ６由来のアミノ酸配列を含み、前記置換は、２６５位（ＶＰ１ナンバリング）のスレオニンに対するアスパラギン酸であり、前記改変ＡＡＶキャプシドタンパク質は、前記キャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターに、前記置換を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、増大した肝臓に対しての形質導入効率を提供する；
    ｈ）前記キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ９由来のアミノ酸配列を含み、アミノ酸残基２６３（ＶＰ１ナンバリング）のセリンはアラニンで置換され、かつ、Ｓ２６５が欠失されており、前記改変ＡＡＶキャプシドタンパク質は、前記キャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターに、前記置換および欠失を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、減少した肝臓に対しての形質導入効率を提供する；
    ｉ）前記キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１由来のアミノ酸配列を含み、前記置換は、２６５位（ＶＰ１ナンバリング）のスレオニンに対するアスパラギン酸であり、前記改変ＡＡＶキャプシドタンパク質は、前記キャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターに、前記置換を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、肝臓および骨格筋における増大した形質導入効率を提供する；
    ｊ）前記キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ１由来のアミノ酸配列を含み、前記置換は、２６５位（ＶＰ１ナンバリング）のスレオニンに対するグルタミン酸またはフェニルアラニンであり、前記改変ＡＡＶキャプシドタンパク質は、前記キャプシドタンパク質を含むＡＡＶベクターに、前記置換を含まないキャプシドタンパク質を含むウイルスベクターと比較して、骨格筋における増大した形質導入効率を提供する；
    改変キャプシドタンパク質。
  2. 請求項１の改変キャプシドタンパク質をコードする、
    ポリヌクレオチド。
  3. 請求項１の改変キャプシドタンパク質を含む、
    アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）キャプシド。
  4. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって：
    （ａ）請求項３のＡＡＶキャプシド；および
    （ｂ）組み換えウイルステンプレートを含む核酸、
    を含み、
    前記核酸は、前記ＡＡＶキャプシドによってキャプシド形成される、
    ＡＡＶウイルスベクター。
  5. 請求項４のＡＡＶウイルスベクターを、薬学的に許容できる担体中に含む、
    医薬組成物。
  6. 核酸を細胞に送達するインビトロの方法であって、
    前記方法は、前記細胞を、請求項４のＡＡＶウイルスベクターまたは請求項５の医薬組成物と、前記核酸が前記細胞に入るのに十分な条件下で接触させるステップを含む、
    方法。
  7. 請求項５の医薬組成物であって、
    対象に核酸を送達するための、
    医薬組成物。
  8. 請求項７に記載の医薬組成物であって、
    前記核酸が細胞に入るのに十分な条件下で請求項５の医薬組成物と接触された細胞が、対象に送達される、
    医薬組成物。
  9. 請求項７または８の医薬組成物であって、
    前記対象はヒト対象である、
    医薬組成物。
  10. 請求項７から９のいずれか一項の医薬組成物であって、
    前記対象は、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、血友病Ａ、血友病Ｂ、多発性硬化症、糖尿病、ゴーシェ病、ファブリ―病、ポンぺ病、癌、関節炎、筋消耗、心疾患、先天性心不全、末梢動脈疾患、内膜過形成、神経障害、てんかん、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、自己免疫疾患、嚢胞性繊維症、サラセミア、ハーラー症候群、Ｓｌｙ症候群、シャイエ症候群、ハーラー－シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群、クラッベ病、フェニールケトン尿症、バッテン病、脳脊髄運動失調症、ＬＤＬ受容体欠乏症、高アンモニア血症、貧血、関節炎、網膜変性疾患、黄斑変性症、およびアデノシンデアミナーゼ欠乏症からなる群より選択される障害を有する、またはそのリスクがある、
    医薬組成物。
  11. 請求項７から１０のいずれか一項の医薬組成物であって、
    前記の医薬組成物は、骨格筋、心筋および／または横隔膜筋に投与され、または、静脈内に投与される、
    医薬組成物。
  12. 請求項７から１１のいずれか一項の医薬組成物であって、
    前記対象は、筋ジストロフィー、心疾患、鬱血性心不全または末梢動脈疾患から選択される状態を有する、またはそのリスクがある、または、代謝障害を有する、またはそのリスクがある、
    医薬組成物。
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