JP5575486B2

JP5575486B2 - 筋鞘にｎＮＯＳを回復させる合成ミニ／ミクロジストロフィン遺伝子

Info

Publication number: JP5575486B2
Application number: JP2009546436A
Authority: JP
Inventors: ドワンドンシェン; イーライ; ヨーンピーンユエ
Original assignee: ユニヴァーシティオブミズーリー−コロンビア
Priority date: 2007-01-18
Filing date: 2008-01-18
Publication date: 2014-08-20
Anticipated expiration: 2028-01-18
Also published as: EP2125006A2; JP2010516252A; CN101711164A; EP2125006B1; CN101711164B; US20080249052A1; EP2125006A4; HK1143326A1; WO2008088895A2; WO2008088895A3; WO2008088895A9; US7892824B2

Description

政府の権利に関する記述
本発明は、少なくとも部分的に米国国立衛生研究所からのグラント番号ＡＲ４９４１９下の政府支援により行われた。米国政府は本発明に一定の権利を有することができる。

関連出願の相互参照
本出願は、２００７年１月１８日に出願された米国仮出願シリアル番号６０／８８１，１２９および２００７年１０月１６日に出願された６０／９９９，３２１の利益を主張する。

本発明は、全長ジストロフィン遺伝子の本質的な生物学的機能を保持する新規ジストロフィンミニ／ミクロ遺伝子に関する。より詳細には、本発明は、筋鞘に神経の一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）を回復させることができる、一組の合成ミニ／ミクロジストロフィン遺伝子に関する。

ジストロフィン欠損筋肉疾患は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）およびＸ連鎖性拡張型心筋症（ＸＬＤＣ）を含む。それらは最も一般的な遺伝性疾患の一つであり、３，０００人の新生児当たり１人以上の男児が発症する。患者は進行性の筋変性および衰弱のために通常１０代前半までに車椅子使用を余儀なくされ、２０代前半までに死に至る。女性保因者も４０代から５０代に発症する。上述の筋肉疾患は、ジストロフィン遺伝子中の変異（特にＸ連鎖性劣性突然変異）によって引き起こされる。ジストロフィン遺伝子は現在までに知られている最大の遺伝子であり、７９エクソン、約１１．５ｋｂのコード配列および高率のデノボ変異でＸ染色体上のおよそ２４０万塩基対にわたって存在する。

現在のところ、ジストロフィン欠損疾患のための効果的な治療はない。細胞治療法および遺伝子治療法を含む新規遺伝学研究法が積極的に探究されてきた。しかしながら、ジストロフィンの遺伝子およびｍＲＮＡ（１４キロベース；ｋｂ）の並はずれた大きさは、遺伝子治療法の開発への手ごわい障壁である。この理由のために、より小さな簡略型のミニジストロフィンまたはミクロジストロフィン遺伝子の開発に注目した研究が行なわれてきた。これらの簡略伝子はウイルスベクター（ＡＡＶベクターおよびレンチウイルスベクターなど）経由で、または幹細胞（中胚葉性血管芽細胞、ＣＤ１３３＋幹細胞およびサイドポピュレーション細胞など）経由で導入することができる（Yuasa et al., 1998; Wang et al., 2000; Ferrer et al., 2000; Harper et al., 2002; Fabb et al., 2002; Sakamoto et al., 2002; Bachrach et al., 2004; Sampaolesi et al., 2006; Benchaouir et al 2007, Cell Stem Cell 1 :646-657）。ミクロ遺伝子は、５ｋｂ以下のコード配列を有しており、単一のアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）中にパッケージジングできる、天然に存在するジストロフィン遺伝子および合成ジストロフィン遺伝子を一般的に指す。ミニ遺伝子は、１０ｋｂと等しいかまたはそれ未満であるが５ｋｂよりも大きいコード配列を有する合成ジストロフィン遺伝子を指す。ミニ遺伝子は単一のＡＡＶベクター中にパッケージングできないが、オーバーラッピングベクター、トランススプライシングベクターおよびハイブリッドベクターなどデュアルベクターの変形物を介して提供することができる。

野生型ジストロフィン遺伝子は２つの主要な生物学的機能を保有する。１つは、筋肉膜が収縮の間に安定化されるように、細胞骨格と細胞外マトリックスの間の機械的結合を提供することである。他は多数の重要な細胞活動のためのシグナル伝達機能を提供することである。ジストロフィンのシグナル伝達機能は、神経の一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）と呼ばれるパートナータンパク質を介して主に遂行される（Rando, 2001）。いくつかの研究は、ｎＮＯＳが全長ジストロフィンタンパク質によって筋鞘に動員されることを示してきた（Brenman et al., 1995; Brenman et al., 1996）。最近の研究は、ジストロフィン欠損筋肉中のｎＮＯＳの損失がＤＭＤの動物モデルおよびヒトＤＭＤ患者における疾患進行に有意に関与することをさらに示唆した（Brenman et al., 1995; Chang et al., 1996; Thomas et al., 1998; Sander et al., 2000）。さらに、ｎＮＯＳの遺伝子導入による過剰発現は、ＤＭＤのｍｄｘマウスモデルにおける筋肉病理を改善する（Wehling et al., 2001; Tidball and Wehling-Henricks, 2004; Shiao et al., 2004; Wehling-Henricks et al., 2005）。

ジストロフィンのミニ遺伝子およびミクロ遺伝子を作製する試みが報告された。例えば、ΔＲ４−Ｒ２３／ΔＣミクロジストロフィンは、ＤＭＤのマウスモデルにおける組織病理を低減することができる。しかしこのミクロタンパク質は、筋肉特異的力を正常レベルへ回復することができない（Harper et al, 2002; Gregorevic et al., 2004; Liu et al., 2005; Yue et al., 2006; Gregorevic et al., 2006）。ΔＨ２−Ｒ１９ミニジストロフィン遺伝子は非常に軽症の患者に由来する（England et al., 1990; Harper et al., 2002）。このミニ遺伝子は全長ジストロフィン遺伝子と同じレベルへ筋肉特異的力を回復できるので、このミニ遺伝子はΔＲ４−Ｒ２３ミクロ遺伝子またはΔＲ４−Ｒ２３／ΔＣミクロ遺伝子よりも優れている（Harper et al., 2002; Lai et al., 2005）。しかし、このミニ遺伝子はｎＮＯＳを回復することができない。実際のところ、既存のミニジストロフィン遺伝子またはミクロジストロフィン遺伝子のどれも、筋鞘へｎＮＯＳを動員する能力を有していない（表１）（Chao et al., 1996; Crawford et al., 2000; Warner et al., 2002; Wells et al., 2003; Torelli et al., 2004; Lai et al., 2005; Yue et al., 2006; Li et al., 2006; Judge et al., 2006）。筋鞘のｎＮＯＳを回復させないことは、著しく最小化ジストロフィン遺伝子の治療有効性を低減するだろう。

以前には、ｎＮＯＳは、ジストロフィンタンパク質のＣ末端ドメインを通して筋鞘に動員されると考えられた（Brenman et al., 1995; Brenman et al., 1996）。全長ジストロフィンタンパク質は，Ｎ末端ドメイン、中央のロッドドメイン、システインリッチドメインおよびＣ末端ドメインを含む４つのドメインを有する。Ｎ末端ドメインおよび中央のロッドドメインの一部は、細胞骨格タンパクＦアクチンと相互作用する。中央のロッドドメインは２４のスペクトリン様リピートおよび４つのヒンジを含む。システインリッチドメインは、細胞外マトリックスへジストロフィンを結合するために膜貫通型タンパク質ジストログリカンと相互作用する。Ｃ末端ドメインは、２つのシントロフィン結合部位および１つのジストロブレビン結合部位を含む。いくつかの研究は、ｎＮＯＳとα−シントロフィンとの間のＰＤＺ／ＰＤＺドメイン相互作用を介して、筋鞘にｎＮＯＳが動員されることを示唆する（Brenman et al., 1996; Hillier et al., 1999; Kameya et al., 1999; Tochio et al., 1999; Adams et al., 2001; Miyagoe-Suzuki and Takeda, 2001）。このことから、Ｃ末端ドメインを備えたミニ遺伝子またはミクロ遺伝子が筋鞘へｎＮＯＳを動員することを示唆するように思われる。しかし、既存のＣ末端ドメイン含有ミニ／ミクロジストロフィンタンパク質のどれもｎＮＯＳを筋鞘にもたらすことができないが、シントロフィンはこれらの場合において筋鞘に完全に局在することが研究により繰り返し示された（Chao et al., 1996; Lai et al., 2005）。さらに、Ｃ末端短縮型全長ジストロフィンタンパク質はｎＮＯＳを筋鞘へ動員することが示された（Crawford et al., 2000）。

表１は、いくつかの天然に存在するジストロフィン遺伝子ならびにいくつかの代表的な合成ジストロフィンミニ遺伝子およびミクロ遺伝子の構造および機能を評価し要約する。検査したすべての遺伝子の中で、天然アイソフォームのＤｐ４２７（全長ジストロフィン遺伝子）およびＤｐ２６０（全長遺伝子の網膜のアイソフォーム）、ならびにＣ末端短縮型全長遺伝子（Δ７１７８）のみが筋鞘にｎＮＯＳを回復させることが確認された。しかし上で論じられたように、これらの遺伝子はＡＡＶまたはレンチウイルスのベクターパッケージングのためには大きすぎる。

したがって、筋鞘にｎＮＯＳを回復させ、ＤＭＤ、ＢＭＤおよびＸＬＤＣの治療における遺伝子療法のために使用される能力を備えた新規ミニ／ミクロジストロフィン遺伝子またはそのシリーズを開発する必要がある。

本発明は、全長ジストロフィン遺伝子と比較して著しく減少した大きさであり、機械的結合機能および筋鞘への神経の一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）などのシグナル伝達機能の両方を回復できる新規ジストロフィンミニ遺伝子およびミクロ遺伝子を同定した。

１つの態様において、本発明は、全長ジストロフィンタンパク質のＮ末端ドメイン、システインリッチドメイン、中央のロッドドメインの２つまたは複数のリピートおよび中央のロッドドメインの２つまたは複数のヒンジを保持する修飾されたジストロフィンポリペプチドまたは非全長のジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（本出願においてミニ遺伝子またはミクロ遺伝子とも呼ばれる）を対象とする。好ましくは、核酸分子は、中央のロッドドメインの保持されるリピートの中の少なくともＲ１６およびＲ１７を保持する。Ｈ１およびＨ４は中央のロッドドメインの中の好ましい保持されるヒンジである。特定の態様において、本発明のミニ遺伝子またはミクロ遺伝子によってコードされる修飾されたジストロフィンポリペプチドまたは非全長ジストロフィンポリペプチドは、全長ジストロフィンタンパク質のＣ末端ドメインをさらに保持する。

他の特定の態様において、本発明はミニ／ミクロジストロフィン遺伝子ΔＨ２−Ｒ１５（配列番号：７）、ΔＨ２−Ｒ１５／ΔＣ（配列番号：１０）、ΔＨ２−Ｒ１５／ΔＲ１８−１９（配列番号：８）、ΔＲ３−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ（配列番号：１２）、ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ（）（配列番号：１３）、ΔＲ２−１５／ΔＨ３−Ｒ２３／ΔＣ（配列番号：１１）のそれぞれ、またはその修飾物もしくは変形物によってコードできる配列番号：１に記載されるようなアミノ酸配列を有する、修飾されたジストロフィンポリペプチド分子または非全長ジストロフィンポリペプチド分子を提供する。図１Ｂおよび１Ｃも参照。

別の態様において、本発明は、筋鞘に神経の一酸化窒素合成酵素（ｎＮＯＳ）を回復させることができる、本発明の核酸分子（ミニジストロフィン遺伝子および／またはミクロジストロフィン遺伝子）を送達するために、組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）を対象とする。本発明に従う組換えＡＡＶベクター（単一ベクターまたはデュアルベクター）は、筋鞘にｎＮＯＳを回復させることができる本発明の核酸分子（ミニジストロフィン遺伝子またはミクロジストロフィン遺伝子）の任意の１つ、発現カセット（プロモーターおよびポリＡ）およびウイルス逆方向末端リピート（ＩＴＲ）を含む。本発明の特定の態様は、ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ、ＡＶ．ミニＣＭＶ．ΔＲ３−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ、ＡＶ．ミニＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＨ３−Ｒ２３／ΔＣ、ＡＶ．ΔＨ２−Ｒ１５ドナー／ＡＶ．ΔＨ２−Ｒ１５アクセプター、ＡＶ．ΔＨ２−Ｒ１５／ΔＲ１８−１９．ヘッド／ＡＶ．ΔＨ２−Ｒ１５／ΔＲ１８−１９．テイルおよび修飾物またはその変形物を含むが、これらに限定されない例示的なＡＡＶベクターを提供する。本発明は、レンチ．ＣＫ６．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ、レンチ．ＣＫ６．ΔＲ３−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣおよびレンチ．ＣＫ６．ΔＨ２−Ｒ１５を含むが、これらに限定されない例示的なレンチウイルスベクターもまた提供する。図２を参照。本発明に従って、デュアル組換えＡＡＶベクターシステムは２つのＡＡＶベクターを含み、２つのＡＡＶベクターの１つは本発明の核酸分子の一部、ミニ遺伝子またはミクロ遺伝子を含み、もう１つのベクターは残りの部分の核酸分子、ミニ遺伝子またはミクロ遺伝子を含み、２つのベクターは互いとの組換えで全長の核酸分子、ミニ遺伝子またはミクロ遺伝子を産生することを可能にする配列をさらに含む。

さらに別の態様において、本発明は、薬学的に許容される担体あり、またはその担体なしで、本発明（ミニ／ミクロジストロフィン遺伝子）の核酸分子の治療上の有効量を被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ）に投与することによって、被験体におけるＤＭＤ、ＢＭＤおよび／またはＸＬＤＣの治療のための方法を対象とする。特定の態様において、本発明の方法に従う投与経路は、患者における局部的な筋肉機能を改良する局部的または局所的な筋肉内注射、患者の部位または全身におけるすべての筋肉への全身的な送達（静脈内、動脈内、腹腔内および心臓内などの）、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクターによる筋幹細胞のインビトロの感染に続く局部的および／または全身的な送達を含むが、これらに限定されない。なおさらなる別の態様において、本発明は、１つまたは複数の本発明のＡＡＶベクターおよびレンチウイルスベクターならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象とする。
本特許または出願ファイルは、少なくとも１枚のカラーで作製された図面を含む。カラー図面を備えたこの特許または特許出願公報のコピーは、請求して必要な料金の支払いをすると官庁によって提供される。

全長ジストロフィン遺伝子および一連のミニ／ミクロジストロフィン遺伝子の構造および対応するｎＮＯＳ回復能力を示した図である。ヒトジストロフィン遺伝子およびタンパク質からのＲ１６およびＲ１７のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示した図である。垂直線の前の配列はＲ１６であり、垂直線の後の配列はＲ１７である。ヒト、アカゲザル（マカカ・ムラタ（ｍａｃａｃａｍｕｌａｔｔａ））、ブタ（サス・スクローファ（ｓｕｓｓｃｒｏｆａ））、イヌ（カニス・ファミリアリス（ｃａｎｉｓｆａｍｉｌｌｉａｒｉｓ））、マウス（ムス・ムスクルス（ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ））およびニワトリ（ガルス・ガルス（ｇａｌｌｕｓｇａｌｌｕｓ））を含む、異なる種からのジストロフィン遺伝子のＲ１６およびＲ１７からのＤＮＡ配列アライメントを示した図である。異なる種の間で同一のアミノ酸を星印でマークする。異なる種の間で相同性の高いアミノ酸を２つのドットでマークする。異なる種の間で相同性が中程度のアミノ酸を１つのドットでマークする。発明のジストロフィンミニ／ミクロ遺伝子を保有する、ＡＡＶベクターおよびレンチウイルスベクターの構造を示した図である。全長ジストロフィン遺伝子、および本発明者によって開発されたいくつかの合成ミニジストロフィン遺伝子の診断用の切断を示した図である。これらのミニ遺伝子の構造は図１中で略述される。これらのミニ遺伝子のｎＮＯＳ回復に関する生物学的機能は、図４中で詳細に検討される。全長ジストロフィン遺伝子またはいくつかの合成のミニジストロフィン遺伝子（ΔＨ２−Ｒ１５、ΔＨ２−Ｒ１６、ΔＨ２−Ｒ１７またはΔＨ２−Ｒ１９）を保有するプラスミドによる処理後に、２か月齢のジストロフィン欠損ｍｄｘマウスの骨格筋におけるｎＮＯＳ回復およびジストロフィン発現の免疫蛍光法（ＩＦ）分析を示した図である。未処理のｍｄｘ筋肉中の復帰線維のクローンもまた示す。発現を注入後に２〜３週間で検討した。本発明者の研究室において合成された追加のミニ／ミクロ遺伝子（ΔＨ２−Ｒ１５／ΔＲ１８−１９、ΔＨ２−Ｒ１５／ΔＣおよびΔＲ３−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ）を保有するプラスミドによる処理後に、ジストロフィン欠損ｍｄｘマウスの骨格筋におけるｎＮＯＳ回復およびジストロフィン発現の追加のＩＦ分析、ならびにｎＮＯＳ活性の組織酵素染色を示した図である。未処理の（プラスミドなし）ｍｄｘ筋肉中の復帰線維もまた示す。他の研究者（Wangなど、2000）によって開発されたΔ３８４９ミクロ遺伝子発現カセットの構造に対して、本発明者によって開発されたミクロ遺伝子ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣを保有するＡＡＶベクターの構造を比較した図である。正常マウス筋肉におけるｎＮＯＳ、ヒトジストロフィンおよびｎＮＯＳ活性のＩＦおよび組織酵素染色を示した図である。ｍｄｘマウス筋肉における、ｎＮＯＳ、ヒトジストロフィンおよびｎＮＯＳ活性のＩＦおよび組織酵素染色を示した図である。 Δ３８４９ミクロ遺伝子による遺伝子導入ｍｄｘマウス筋肉における、ｎＮＯＳ、ヒトジストロフィンおよびｎＮＯＳ活性のＩＦおよび組織酵素染色を示した図である。発明のΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子を保有するＡＡＶ−６ベクターによる処理後のｍｄｘマウス筋肉における、ｎＮＯＳ、ヒトジストロフィンおよびｎＮＯＳ活性のＩＦおよび組織酵素染色を示した図である。本発明のΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子を保有するＡＡＶ−９ベクターによる処理後のｍｄｘマウス筋肉における、ｎＮＯＳ、ヒトジストロフィン（それぞれＮ末端ドメイン、Ｒ１６、Ｒ１７およびＨ３）のＩＦおよび組織酵素染色ならびにｎＮＯＳ活性を示した図である。ＡＡＶベクターの構造もまた示す。本発明のΔＲ３−１５／ΔＲ１７−２３／ΔＣミクロ遺伝子を保有するＡＡＶ−９ベクターによる処理後のｍｄｘマウス筋肉における、ｎＮＯＳ、ヒトジストロフィン（それぞれＮ末端ドメイン、Ｒ１６、Ｒ１７およびＨ３）のＩＦおよび組織酵素染色ならびにｎＮＯＳ活性を示した図である。ＡＡＶベクターの構造もまた示す。ｎＮＯＳのＰＤＺドメインとＲ１６−１７との間の正の相互作用を示すが、Ｒ１６またはＲ１７との間では示さない、酵母ツーハイブリッド分析を図示した図である。酵母ツーハイブリッド分析において使用するコンストラクトの図式的なアウトラインである。ｎＮＯＳのＰＤＺドメインを、ＤＮＡ結合ドメインを含むコンストラクト中で操作する。このコンストラクトはトリプトファン（Ｔｒｐ）もまた発現する。このコンストラクトはＴｒｐ欠損培地（Ｔｒｐ−）中で増殖できる。Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１６−１７またはシントロフィンＰＤＺドメインを、ＤＮＡ活性化ドメインを保有するコンストラクト中で操作する。これらのコンストラクトはロイシン（Ｌｅｕ）を発現し、Ｌｅｕ欠損培地（Ｌｅｕ−）中で増殖できる。Ｒ１６−１７の構造はＲ１６またはＲ１７の構造とは異なる。ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ活性化ドメインとの間の相互作用により、ヒスチジン（Ｈｉｓ）産生が開始される。その結果として、これらの細胞はＬｅｕ−／Ｔｒｐ−／Ｈｉｓ−の三重欠損培地中で増殖できる。ｎＮＯＳのＰＤＺドメインとＲ１６−１７との間の正の相互作用を示すが、Ｒ１６またはＲ１７とは示さない、酵母ツーハイブリッド分析を図示した図である。Ｌｅｕ−／Ｔｒｐ−／Ｈｉｓ−の三重欠損培地上の代表的な酵母−ツーハイブリッド分析である。ｎＮＯＳのＰＤＺドメインとＲ１６−１７との間の正の相互作用を示すが、Ｒ１６またはＲ１７とは示さない、酵母ツーハイブリッド分析を図示した図である。Ｌｅｕ−／Ｔｒｐ−／Ｈｉｓ−の三重欠損培地上の代表的なドット希釈分析である。シントロフィンＰＤＺドメインＤＮＡ活性化コンストラクトまたはＲ１６−１７ＤＮＡ活性化コンストラクトの共形質転換により、酵母増殖がもたらされた。Ｒ１６ＤＮＡ活性化コンストラクトまたはＲ１７ＤＮＡ活性化コンストラクトによる共形質転換によっては増殖はなかった。チェックマーク、酵母細胞は三重欠損培地中で増殖した；×、酵母細胞は三重欠損培地中で成長しなかった。 ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子は、ｍｄｘ骨格筋中の筋鞘全体性を増強することを示した図である。ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣをＡＡＶ−６ベクター中にパッケージングした。６×１０¹⁰ｖｇ粒子のベクターを、２か月齢のｍｄｘマウス（Ｎ＝４）の腓腹筋に送達した。エバンスブルー色素取り込み分析をＡＡＶ感染４０日後で実行した。ＡＡＶに感染した筋肉の連続的な筋肉切片の代表的な低倍率蛍光抗体染色顕微鏡写真。それぞれの抗体によって認識されるエピトープを、各顕微鏡写真について示した。ミクロジストロフィンは筋鞘に沿って発現される。エバンスブルー色素は傷ついた筋線維の内部に蓄積する。 ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子は、ｍｄｘ骨格筋中の筋鞘全体性を増強することを示した図である。ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣをＡＡＶ−６ベクター中にパッケージングした。６×１０¹⁰ｖｇ粒子のベクターを、２か月齢のｍｄｘマウス（Ｎ＝４）の腓腹筋に送達した。エバンスブルー色素取り込み分析をＡＡＶ感染４０日後で実行した。ＡＡＶに感染した筋肉の連続的な筋肉切片の代表的な高倍率蛍光抗体染色顕微鏡写真。それぞれの抗体によって認識されるエピトープを、各顕微鏡写真について示した。ミクロジストロフィンは筋鞘に沿って発現される。エバンスブルー色素は傷ついた筋線維の内部に蓄積する。 ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子およびΔＲ４−２３／ΔＣミクロ遺伝子が、ｍｄｘマウスの筋力改善を同じ水準でもたらすことを示した図である。ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣおよびＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ４−２３／ΔＣを、ＡＡＶ血清型−９（ＡＡＶ−９）中にパッケージングした。 ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子およびΔＲ４−２３／ΔＣミクロ遺伝子が、ｍｄｘマウスの筋力改善を同じ水準でもたらすことを示した図である。ＡＡＶ−９ベクターを顔面静脈注入経由でオスｍｄｘマウス新生仔に送達した（１×１０¹²ｖｇ粒子／ベクター／マウス）。長趾伸（ｅｘｔｅｎｓｏｒｄｉｇｉｔｏｒｉｕｍｌｏｎｇｕｓ）（ＥＤＬ）筋の特異的力をＡＡＶ感染３か月後に測定した。年齢および性別が一致したＢＬ１０マウスおよびｍｄｘマウスを筋力測定のための対照として含んだ。星印、ＢＬ１０のＥＤＬ筋特異的力は他の群よりも有意に高かった。十字形、ＡＡＶ感染マウスの特異的力は、ｍｄｘ群よりも有意に高かったが、ＢＬ１０群の特異的力よりも低かった。ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ感染マウスとＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ４−２３／ΔＣ感染マウスとの間の統計的な差はなかった。サンプルサイズは、ＢＬ１０についてはＮ＝４；ｍｄｘについてはＮ＝５；Ｎ＝ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ４−２３／ΔＣ感染ｍｄｘマウスについては６；Ｎ＝ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ感染ｍｄｘマウスについては５である。ｍｄｘ４ｃｖマウス新生仔におけるＡＡＶ−９のＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣの全身的送達により、骨格筋特異的力が改良されたことを示した図である。１×１０¹²ｖｇ粒子のＡＡＶ−９のＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣを、顔面静脈注入経由でオスｍｄｘ４ｃｖマウス新生仔に送達した。長趾伸（ｅｘｔｅｎｓｏｒｄｉｇｉｔｏｒｉｕｍｌｏｎｇｕｓ）（ＥＤＬ）筋特異的力を、ＡＡＶ感染３か月後に調べた。年齢および性別が一致したＢＬ６マウスおよびｍｄｘ４ｃｖマウスを対照として含んだ。星印、ＢＬ６マウスの結果は、他の群の結果よりも有意によかった。十字形、ＡＡＶ感染マウスの結果は、ｍｄｘ４ｃｖ群の結果よりも有意によかったが、ＢＬ６群の結果よりも悪い。サンプルサイズは、ＢＬ６についてはＮ＝７；ｍｄｘ４ｃｖについてはＮ＝６；ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ感染ｍｄｘ４ｃｖマウスについてはＮ＝６である。ｍｄｘ４ｃｖマウス新生仔におけるＡＡＶ−９のＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣの全身的送達により、血清中クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルが低下したことを示した図である。１×１０¹²ｖｇ粒子のＡＡＶ−９のＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣを、顔面静脈注入経由でオスｍｄｘ４ｃｖマウス新生仔に送達した。血清中クレアチンキナーゼレベルを、ＡＡＶ感染３か月後に調べた。年齢および性別が一致したＢＬ６マウスおよびｍｄｘ４ｃｖマウスを対照として含んだ。星印、ＢＬ６マウスの結果は、他の群の結果よりも有意によかった。十字形、ＡＡＶ感染マウスの結果は、ｍｄｘ４ｃｖ群の結果よりも有意によかったが、ＢＬ６群の結果よりも悪い。サンプルサイズは、ＢＬ６についてはＮ＝７；ｍｄｘ４ｃｖについてはＮ＝６；ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ感染ｍｄｘ４ｃｖマウスについてはＮ＝６である。成体のｍｙｏＤ／ジストロフィンダブルノックアウトマウス（ｍ−ｄｋｏ）におけるＡＡＶ−９のＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣの全身的な送達は、骨格筋機能を改善することを示した図である。５．５×１０¹²ｖｇ粒子のＡＡＶ−９のＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣを尾静脈注入経由で２か月齢のオスｍ−ｄｋｏマウスに送達した。長趾伸（ｅｘｔｅｎｓｏｒｄｉｇｉｔｏｒｉｕｍｌｏｎｇｕｓ）（ＥＤＬ）筋の機能をＡＡＶ感染３か月後に検討した。年齢および性別が一致した未感染同腹仔を対照として含んだ。特異的単収縮力を示す（単一刺激下で）。星印、ＡＡＶに感染したマウスの結果は、感染していない対照の結果よりも有意によかった。筋肉機能分析のためのサンプルサイズは、未感染同腹仔対照についてはＮ＝４；ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ感染ｍ−ｄｋｏマウスについてはＮ＝１４である。成体のｍｙｏＤ／ジストロフィンダブルノックアウトマウス（ｍ−ｄｋｏ）におけるＡＡＶ−９のＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣの全身的な送達は、骨格筋機能を改善することを示した図である。５．５×１０¹²ｖｇ粒子のＡＡＶ−９のＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣを尾静脈注入経由で２か月齢のオスｍ−ｄｋｏマウスに送達した。長趾伸（ｅｘｔｅｎｓｏｒｄｉｇｉｔｏｒｉｕｍｌｏｎｇｕｓ）（ＥＤＬ）筋機能をＡＡＶ感染３か月後に検討した。年齢および性別が一致した未感染同腹仔を対照として含んだ。異なる頻度の強縮刺激下の特異的強縮力を示す。星印、ＡＡＶに感染したマウスの結果は、感染していない対照の結果よりも有意によかった。筋肉機能分析のためのサンプルサイズは、未感染同腹仔対照についてはＮ＝４；ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ感染ｍ−ｄｋｏマウスについてはＮ＝１４である。成体のｍｙｏＤ／ジストロフィンダブルノックアウトマウス（ｍ−ｄｋｏ）におけるＡＡＶ−９のＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣの全身的な送達は、骨格筋機能を改善することを示した図である。５．５×１０¹²ｖｇ粒子のＡＡＶ−９のＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣを尾静脈注入経由で２か月齢のオスｍ−ｄｋｏマウスに送達した。長趾伸（ｅｘｔｅｎｓｏｒｄｉｇｉｔｏｒｉｕｍｌｏｎｇｕｓ）（ＥＤＬ）筋機能をＡＡＶ感染３か月後に検討した。年齢および性別が一致した未感染同腹仔を対照として含んだ。１０サイクルの遠心性収縮の間の力減少を示す。星印、ＡＡＶに感染したマウスの結果は、感染していない対照の結果よりも有意によかった。筋肉機能分析のためのサンプルサイズは、未感染同腹仔対照についてはＮ＝４；ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ感染ｍ−ｄｋｏマウスについてはＮ＝１４である。成体のｍｙｏＤ／ジストロフィンダブルノックアウトマウス（ｍ−ｄｋｏ）におけるＡＡＶ−９のＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣの全身的な送達は、血清中クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルを低下させることを示した図である。５．５×１０¹²ｖｇ粒子のＡＡＶ−９のＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣを尾静脈注入経由で２か月齢のオスｍ−ｄｋｏマウスに送達した。血清中クレアチンキナーゼレベルをＡＡＶ感染３か月後に検討した。年齢および性別が一致した未感染同腹仔を対照として含んだ。星印、ＡＡＶに感染したマウスの結果は、感染していない対照の結果よりも有意によかった。ＣＫ分析のためのサンプルサイズは、未感染同腹仔対照についてはＮ＝３；ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ感染ｍ−ｄｋｏマウスについてはＮ＝６である。トランススプライシングＡＡＶ（ｔｓＡＡＶ）ベクターおよびオーバーラッピングＡＡＶベクターにおける導入遺伝子再構成の図式的なアウトラインを示した図である。ｔｓＡＡＶベクターでは、ＩＴＲ依存的組換えにより全長発現カセットを再構成する。ダブル−ＤＩＴＲジャンクションは、操作されたスプライシングドナー（ＳＤ）およびアクセプター（ＳＡ）配列によって除去される。オーバーラッピングＡＡＶベクターでは、共有領域は相同組換えを介して再結合する。ウイルスのＩＴＲは、このプロセスの間に除去される。ハイブリッドＡＡＶベクターにおける導入遺伝子再構成の図式的なアウトラインを示した図である。ＡＶ．ＣＭＶ．ＬａｃＺ．ハイブリッド５’ベクターは、ＣＭＶプロモーター、ＬａｃＺ遺伝子の５’の半分、スプライシングドナー（ＳＤ）および８７２ｂｐアルカリフォスファターゼ（ＡＰ）配列を含む。ＡＶ．ＣＭＶ．ＬａｃＺ．ハイブリッド３’ベクターは、８７２ｂｐのＡＰ配列、続いてスプライシングアクセプター（ＳＡ）、ＬａｃＺ遺伝子の３’の半分およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ポリＡ）を含む。ベクターゲノムは、ＡＡＶ−２のＩＴＲが隣接する。共感染に際して、ＡＰ配列仲介性相同組換え経由で完全なＬａｃＺ発現カセットを再構成できる。あるいは、ウイルスのＩＴＲ仲介性ヘッドツーテイル組換え経由で完全なＬａｃＺ発現カセットを作製することができる。連結配列が細胞のスプライシング機構（点線）によって除去された後に、ＬａｃＺ発現が達成される。

公報、特許出願、特許、および本明細書において言及される他の参照はすべて、それらの全体を参照することによって組み入れられる。

本発明は、ＡＡＶベクターまたはレンチウイルスベクターの中へパッケージングできるほど十分に小さく、しかもなおジストロフィー損傷から筋肉を保護するために必要な、機械的結合機能およびシグナル機能（筋鞘のｎＮＯＳ関連機能などの）を含むがこれらに限定されない、全長野生型ジストロフィン遺伝子の本質的な機能を保つ、新規連のジストロフィンミニ遺伝子およびミクロ遺伝子を同定する。本発明は、合成ミニ／ミクロジストロフィン遺伝子中のジストロフィンタンパク質の中央のロッドドメインのＲ１６およびＲ１７リピートの含有がｎＮＯＳ回復のために決定的であると認識する。言いかえれば、Ｒ１６およびＲ１７を保持するミニ／ミクロジストロフィン遺伝子は、全長ジストロフィンタンパク質と同様の様式で筋鞘にｎＮＯＳタンパク質を回復させることができる。さらに本発明は、本発明のミニ／ミクロ遺伝子による処理から回復したｎＮＯＳタンパク質が、その生物学的機能（酵素活性）を保持することを認識する。

「ジストロフィン遺伝子」によって、全長ジストロフィンタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する核酸分子が意味される。本発明は、ヒト、マウス、およびイヌ（特にヒトから）を含むがこれらに限定されない、任意の哺乳類種に由来するジストロフィン遺伝子を用いることを検討する。特定の全長ジストロフィン遺伝子は、配列番号：２に記載のＤＮＡ配列を有しており、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有する全長ジストロフィンタンパク質をコードする。「ドメイン」によって、タンパク質構造の一部が意味される。例えば、ヒトジストロフィンタンパク質の「Ｎ末端ドメイン」は、本明細書において参照されるように、およそ１〜およそ２５２のアミノ酸残基、特に配列番号：１のアミノ酸残基メチオニン１〜グルタミン酸２５２、より詳細には配列番号：１７に記載のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含む。同様に、ジストロフィンタンパク質の「中央のロッドドメイン」または「ロッドドメイン」は、本明細書において参照されるように、およそ２５３〜およそ３１１２の配列番号：１のアミノ酸残基、特に配列番号：１に記載のアミノ酸残基メチオニン２５３〜ロイシン３１１２を含み；ジストロフィンタンパク質の「システインリッチドメイン」は、本明細書において参照されるように、およそ３１１３〜およそ３４０８の配列番号：１のアミノ酸残基、特に配列番号：１に記載のアミノ酸残基アルギニン３１１３〜スレオニン３０４８、より詳細には配列番号：４６に記載のヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、ジストロフィンタンパク質の「Ｃ末端ドメイン」は、本明細書において参照されるように、配列番号：１のおよそ３４０９〜３６８５のアミノ酸残基、特に配列番号：４７に記載のアミノ酸残基プロリン３４０９〜メチオニン３６８５を含む。「ジストロフィンミクロ遺伝子」または「ミクロジストロフィン遺伝子」または「ミクロ遺伝子」によって、５ｋｂまたはそれ未満の長さであり、Ｎ末端ドメイン、システインリッチドメイン、中央のロッドドメインの２つまたは複数のリピート、および全長ジストロフィンタンパク質の中央のロッドドメインの２つまたは複数のヒンジを保持する、修飾されたジストロフィンポリペプチドまたは非全長ジストロフィンポリペプチド（本出願においてミクロジストロフィンともまた呼ばれる）をコードする核酸分子が意味される。「ミクロジストロフィン」によって、全長ジストロフィンタンパク質の生物学的機能を保持し、そのコード配列が５ｋｂまたはそれ未満である、修飾されたジストロフィンタンパク質分子または非全長ジストロフィンタンパク質分子が意味される。ミクロジストロフィンの例を図１中に示す。「ジストロフィンミニ遺伝子」、「ミニジストロフィン遺伝子」または「ミニ遺伝子」によって、５ｋｂまたはそれ以上の長さであるがジストロフィンコード配列の全長未満であり、好ましくは５ｋｂ〜約１０ｋｂの間の長さ、より好ましくは約５ｋｂ〜約８ｋｂの長さ、さらにより好ましくは約７ｋｂの長さであり、Ｎ末端ドメイン、システインリッチドメイン、中央のロッドドメインの２つまたは複数のリピート（Ｒおよび番号によっても参照され、例えばＲ１６はリピート番号１６を意味する）および全長ジストロフィンタンパク質の中央のロッドドメインの２つまたは複数のヒンジを保持する、修飾されたジストロフィンポリペプチドまたは非全長ジストロフィンポリペプチド（本出願においてミニジストロフィンともまた呼ばれる）をコードする、核酸分子が意味される。「ミニジストロフィン」によって、全長ジストロフィンタンパク質の生物学的機能を保持し、そのコード配列が５ｋｂ以上の長さであるがジストロフィンコード配列の全長未満である、修飾されたジストロフィンタンパク質分子または非全長ジストロフィンタンパク質分子が意味される。

ジストロフィンタンパク質の「生物学的機能」によって、細胞骨格と細胞外マトリックスとの間の機械的結合、および筋鞘へのｎＮＯＳの動員などのシグナル伝達機能を提供することを含むがこれらに限定されない機能が意味される。ジストロフィン遺伝子またはジストロフィンタンパク質に関連する「修飾された」によって、修飾されたジストロフィン遺伝子または修飾されたジストロフィンタンパク質分子が、ジストロフィン遺伝子の全長コード配列またはジストロフィンタンパク質の全長アミノ酸配列を含まないが、なお全長遺伝子または全長タンパク質の生物学的機能を保持するかまたは実質的に保持するように、変化させた野生型（または天然に存在する）全長ジストロフィン遺伝子またはジストロフィンタンパク質分子が意味される。

「修飾されたＮ末端ドメイン」によって、野生型Ｎ末端ドメインまたは天然に存在するＮ末端ドメインとは構造および／または配列が異なるが、野生型Ｎ末端ドメインまたは天然に存在するＮ末端の機能を保持するＮ末端ドメインが意味される。「修飾または変更」によって、核酸分子またはポリペプチドの実質的な機能を保持する、および／または核酸分子もしくはポリペプチドと実質的に相同または類似／同一である、核酸分子またはポリペプチドに対する任意の変化（変異によってなど）が意味される。

１つの実施形態において、本発明は、Ｎ末端ドメイン、中央のロッドドメインの２つまたは複数のスペクトリン様リピート、中央のロッドドメインの２つまたは複数のヒンジ領域および全長ジストロフィンタンパク質のシステインリッチドメインを保持する、修飾ジストロフィンポリペプチドまたは非全長ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子（本出願においてミニ遺伝子またはミクロ遺伝子ともまた呼ばれる）を対象とする。

特定の実施形態において、さらに本発明のミニ遺伝子またはミクロ遺伝子は、ジストロフィンタンパク質のＣ末端ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。Ｃ末端ドメインの変異はＤＭＤ患者の認知表現型の相関することが示されている（Tuffery et al., 1995; Kerr et al., 2001）。さらに、Ｃ末端ドメイン変異も患者のサブセットにおいてＤＭＤを引き起こすことが示されてきた（McCabe et al., 1989; Prior et al., 1995; Suminaga et al., 2004）。任意の特定の理論に限定しようと意図するものではないが、ジストロフィンタンパク質のＣ末端ドメインをコードするＤＮＡ配列をさらに含むミニジストロフィン遺伝子またはミクロジストロフィン遺伝子は、ＤＭＤに対するよりよい予防または治療を提供できると考えられる。具体的な実施形態において、中央のロッドドメインのリピートは、ヒト、イヌ、マウス、ブタ、ブタ、ウサギ、ニワトリを含むが、これらに限定されない任意の種からでありえる。

好ましくは、本発明のミニ遺伝子またはミクロ遺伝子の２つまたは複数のスペクトリン様リピートは、中央のロッドドメインのＲ１６およびＲ１７を含んでいる。しかしながら、本発明は、またＲ１−Ｒ１５およびＲ１８−Ｒ２４から選択された１つまたは複数を含むＲ１６およびＲ１７の他の追加のスペクトリン様リピートをコードする配列を含むミニ遺伝子およびミクロ遺伝子を検討する。例えば、図１において示されるように、ミクロ遺伝子は、本発明の具体的な実施形態である、Ｒ１、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ２４（例えば図１のΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ）、またはＲ１−Ｒ２、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ２４（例えば図１のΔＲ３−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ）、またはＲ１、Ｒ１６−Ｒ１９およびＲ２４（例えば図１のΔＲ２−１５／ΔＨ３−２３／ΔＣ）を含むことができる。本発明において使用されるシンボル“Δ”は、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の特定の配列または領域の欠失または欠損を意味する。例えば、ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣは、リピート２−１５、リピート１８−２３およびＣ末端ドメインを欠失または欠損する１つのミクロ遺伝子を表わす。他の特定の実施形態において、本発明は、リピートＲ１−Ｒ３、リピートＲ１６、リピートＲ１７およびリピートＲ２０−Ｒ２４（例えば図１のΔＲ２−１５／ΔＲ１８−１９）、またはリピートＲ１−Ｒ３およびリピートＲ１６−Ｒ２４（例えば図１のΔＨ２−Ｒ１５）を含むミニ遺伝子を検討する。

本発明のミニ遺伝子またはミクロ遺伝子のヒンジ領域は、好ましくはＨ１およびＨ４のヒンジ領域を含むが、これらに限定されない。しかしながら、本発明は、Ｈ１およびＨ４の他の追加のヒンジ領域を含むミニ遺伝子およびミクロ遺伝子もまた検討する。例えば、図１は、本発明の具体的な実施形態であるミニ遺伝子（例えばΔＲ２−１５／ΔＲ１８−１９およびΔＨ２−Ｒ１５）中にＨ３を含むことができることを示す。

１つの実施形態において、本発明は、全長ジストロフィンタンパク質の記載のＮ末端ドメイン（配列番号：１７）、記載の中央のロッドドメインの２つまたは複数のスペクトリン様リピート（配列番号：１９〜４４）、中央のロッドドメインの２つまたは複数のヒンジ領域、例えば記載の（配列番号：１８〜４５および配列番号：１）および記載のシステインリッチドメイン（配列番号：４６）を保持する修飾されたジストロフィンポリペプチドまたは非全長ジストロフィンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対して実質的な相同性、類似性または同一性を有する、ヌクレオチド配列を含むミニ遺伝子またはミクロ遺伝子、またはヌクレオチド配列を対象とする。

「実質的な相同性」、「実質的な類似性」または「実質的な同一性」によって、配列において、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％の相同性、類似性または同一性を有する核酸またはアミノ酸配列が意味される。

他の実施形態において、ミニ遺伝子またはミクロ遺伝子は、ストリンジェンシーが高い、中程度または低い条件下で、選択された配列にハイブリダイズする遺伝子である。３７〜４２℃の低いストリンジェンシーに対する本明細書における参照は、ハイブリダイゼーションについては、少なくとも約１％ｖ／ｖ〜少なくとも約１５％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩、ならびに洗浄条件については、少なくとも約１Ｍ〜少なくとも約２Ｍの塩を含んで包含する。必要な場合には、ハイブリダイゼーションについては、少なくとも約１６％ｖ／ｖ〜少なくとも約３０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩、ならびに洗浄条件については、少なくとも約０．５Ｍ〜少なくとも約０．９Ｍの塩を含んで包含する中間のストリンジェンシー、またはハイブリダイゼーションについては、少なくとも約３１％ｖ／ｖ〜少なくとも約５０％ｖ／ｖのホルムアミドおよび少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩、ならびに洗浄条件については少なくとも約０．０１Ｍ〜少なくとも約０．１５Ｍの塩を含んで包含する高いストリンジェンシーなどの、他のストリンジェンシー条件を適用できる。ハイブリダイゼーションは異なる温度で実行でき、このようなことが起こる場合には他の条件はそれに応じて調整できる。具体的なハイブリダイゼーション条件の例は、６５℃でのハイブリダイゼーション、続いて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳによる１回または複数回の洗浄、および０．２×ＳＳＣによる最終洗浄、より好ましくは室温または６５℃もしくは６８℃までの温度での０．１×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳによる最終洗浄を含む。

特定の実施形態において、修飾されたジストロフィンタンパク質は、記載の中央のロッドドメインのＲ１６（配列番号：）および記載のＲ１７（配列番号：）を含むが、これらに限定されない。しかしながら、本発明は、Ｒ１６およびＲ１７に加えて、記載のＲ１−Ｒ１５から選択される他のスペクトリン様リピート（それぞれ配列番号：１９〜３４）、および記載のＲ１８−Ｒ２４（それぞれ配列番号：３７〜４４）もまた含む修飾されたジストロフィンタンパク質もまた検討する。例えば、図１において示されるように、修飾されたジストロフィンタンパク質は、本発明の特定の実施形態である、Ｒ１、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ２４（例えば図１のΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ）、またはＲ１−Ｒ２、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ２４（例えば図１のΔＲ３−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ）、またはＲ１、Ｒ１６−Ｒ１９およびＲ２４（例えば図１のΔＲ２−１５／ΔＨ３−２３／ΔＣ）を含むことができる。他の特定の実施形態において、本発明は、リピートＲ１−Ｒ３、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ２０−Ｒ２４（例えば図１のΔＲ２−１５／ΔＲ１８−１９）、またはＲ１−Ｒ３およびＲ１６−Ｒ２４（例えば図１ΔＨ２−Ｒ１５）を含む修飾されたジストロフィンタンパク質を検討する。

同様に、本発明のミニ遺伝子またはミクロ遺伝子は、ヒンジ領域の記載のＨ１（配列番号：１８）および記載のＨ４（配列番号：４５）を好ましくは含むが、これらに限定されない。しかしながら、本発明は、Ｈ１およびＨ４の他にもヒンジ領域を含むミニ遺伝子およびミクロ遺伝子もまた検討する。例えば、図１は、本発明の特定の実施形態である、ミニ遺伝子中にＨ３を含むことができること（例えばΔＲ２−１５／ΔＲ１８−１９およびΔＨ２−Ｒ１５）を示す。

さらにより好ましくは、本発明は、修飾されたジストロフィンタンパク質の記載のΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ（配列番号：１３）、記載のΔＲ３−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ（配列番号：１２）、記載のΔＲ２−１５／ΔＨ３−２３／ΔＣ（配列番号：１１）；ならびに修飾されたジストロフィンタンパク質の記載のΔＲ２−１５／ΔＲ１８−１９（配列番号：８）および記載のΔＨ２−Ｒ１５（配列番号：７）を対象とする。本発明のミクロ遺伝子およびミニ遺伝子の任意の修飾または変更もまた、本発明によって検討される。上述のミニ遺伝子またはミクロ遺伝子の発現産物をコードする縮重核酸分子は、本発明によって特に検討される。本発明に従って、ミクロ／ミニジストロフィン遺伝子は、当業者に公知であり、本出願において以下に提供される実施例において図示される従来技術によって、合成、作製、入手、組み立てることもできる。例えば、本発明のミニ遺伝子およびミクロ遺伝子は、分子生物学的技術によって、および実施例２および図３中に記載および示されるように、合成することができる。

本発明のミニ遺伝子および／またはミクロ遺伝子によってコードされたポリペプチドもまた、本発明によって検討および包含される。

さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の核酸分子を送達できるベクターを提供する。目的のために適切な任意のベクターは本発明によって検討される。特に、本発明は、筋鞘にｎＮＯＳを回復させることができる本発明の核酸分子（ミニ／ミクロジストロフィン遺伝子）を送達する、一連の組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）およびレンチウイルスベクターを提供する。本発明に従う組換えＡＡＶベクター（単一ベクターまたはデュアルベクター）は、発現カセット（プロモーターおよびポリＡ）およびウイルス逆方向末端リピート（ＩＴＲ）に作動可能に結合されて、筋鞘にｎＮＯＳを回復させることができる、本発明の核酸分子（ミニ／ミクロジストロフィン遺伝子）の任意の１つを含む。

好ましくは、本発明によって検討されるベクターは、ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ、ＡＶ．ミニＣＭＶ．ΔＲ３−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ、ＡＶ．ミニＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＨ３−Ｒ２３／ΔＣ、ＡＶ．ΔＨ２−Ｒ１５ドナー／ＡＶ．ΔＨ２−Ｒ１５アクセプター、ＡＶ．ΔＨ２−Ｒ１５／ΔＲ１８−１９．ヘッド／ＡＶ．ΔＨ２−Ｒ１５／ΔＲ１８−１９．テイルなどのＡＡＶベクターを含むが、これらに限定されない。これらのベクターの修飾または変更もまた本発明によって検討される。

ミニジストロフィンポリペプチド分子またはミクロジストロフィンポリペプチド分子をコードするミニ遺伝子またはミクロ遺伝子は、上述および実施例２において以下に図示されるように、従来技術を用いることによって、作製することができる。次に、ミニ遺伝子またはミクロ遺伝子は、適切な制限酵素の使用によって取り出し、選択した発現カセット（好ましくはＡＡＶベクターが適切）の中へ接合することができる。あるいは、精製したミニ遺伝子またはミクロ遺伝子核酸分子は既知の方法を使用して、全体を配列決定でき、次にアミノ酸配列をコードする任意のいくつかの翻訳的に等価な合成ＤＮＡ配列を調製でき、この合成配列は適切な発現カセット（好ましくはＡＡＶベクターが適切）へ挿入できる。多数の発現カセットおよびベクターが当技術分野において周知である。「発現カセット」によって、それらが適切なリーディングフレームで構造遺伝子に隣接するときに細胞中で機能する、開始配列、プロモーター配列および終始配列を含む、制御配列の完全なセットが意味される。発現カセットは、しばしばおよび好ましくは、任意の所望される構造遺伝子（例えば本発明のミクロ遺伝子またはミニ遺伝子）の切断および挿入のために適切な制限部位の組合せを含む。構造配列のために適切なリーディングフレームで、クローン化された遺伝子が開始コドンを有することは重要である。加えて、本発明のための発現カセットは、１つの末端で高い頻度で遺伝子を転写する強力な構成的プロモーター配列（例えばＣＭＶプロモータ）、およびもう１つの末端でメッセンジャーＲＮＡの適切なプロセッシングおよび輸送のためのポリＡ認識配列を好ましくは含む。本発明のミクロ遺伝子を挿入できるそのような好ましい（空の）発現カセットの例は、Yue et al（Yue & Duan 2002 Biotechniques 33(3):672- 678）中に記載されるような、ｐｃｉｓ．ＲＳＶｍｃｓ、ｐｃｉｓ．ＣＭＶｍｃｓ、ｐｃｉｓ．ＣＭＶｍｃｓ−イントロン、ｐｃｉｓ．ＳＶ４０ｍｃｓ、ｐｃｉｓ．ＳＶ４０ｍｃｓ−イントロン、ｐｃｉｓ．ＣＫ６ｍｃｓおよびｐｃｉｓ．ＣＡＧｍｃｓである。本発明のミニ遺伝子を挿入できるそのような好ましい（空の）発現カセットの例は、Duan et al（Duan, Yue and Engelhardt 2003 Methods in Molecular Bioloev 219:29-51）中に記載されるようなｐＤＤ１８８、ｐＤＤ２９３およびｐＤＤ２９５、ならびにGhosh et al（Ghosh, Yue, Lai and Duan 2008 Molecular Therapy 16:124-130）中に記載されるようなｐＡＧ１５およびｐＡＧ２１である。非常に好ましい発現カセットは、カナマイシン耐性遺伝子などの１つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子を含むようにデザインされる。用語「ベクター」によって、宿主細胞中で外来遺伝子を複製および発現することができるＤＮＡ配列が意味される。典型的には、ベクターは適切な酵素の使用によって予測可能な様式で切断できる１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ認識部位を有する。そのようなベクターは、形質転換細胞の同定および分離のためのマーカーを与える追加の構造遺伝子配列を含むように好ましくは構築される。好ましいマーカー／選択薬剤は、カナマイシン、クロロスルフロン、ホスフォノトリシン（ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートを含む。ベクター中で外来の遺伝物質が機能的に発現する細胞はベクターによって「形質転換され」、「形質転換体」と呼ばれる。

特に好ましいベクターは、アデノ随伴ウイルスのゲノムに由来するが非病原性の一本鎖ＤＮＡ分子のＡＡＶベクターである。

発現カセット中で使用できるプロモーターは、ｎｏｓプロモーター、ｏｃｓプロモーター、ファゼオリンプロモーター、ＣａＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＫ６プロモーターおよびＭＣＫプロモーターを含むが、これらに限定されない。所望される制御配列に作動可能に結合されたミニ遺伝子またはミクロ遺伝子を含む発現カセットは、送達のために適切なベクターの中へライゲーションすることができる。一般に、宿主細胞と適合性のある複製配列および対照配列を含むＡＡＶベクターおよびレンチウイルスベクターを使用する。単一ＡＡＶベクターなどの適切なベクターは、典型的には、末端でウイルス逆方向末端リピート（ＩＴＲ）を、そしてプロモーター、ならびにミクロ遺伝子およびポリＡを保有する。

「デュアルベクターシステム」によって、２つのベクター（例えばＡＡＶベクター）からなり、両方のベクターが送達される遺伝子または配列の一部を保有し、遺伝子全体が２つのベクターの間の相互作用によって再構成される、ベクターシステムが意味される。

１つの実施形態において、本発明のデュアルベクターシステム（例えばＡＡＶデュアルベクターシステム）の２つのベクターは、トランススプライシングベクター（ｔｓベクター、例えばｔｓＡＡＶベクター）である。

他の実施形態において、デュアルベクターシステム（例えばＡＡＶデュアルベクターシステム）の２つのベクターは、本発明のハイブリッドベクター（例えばハイブリッドＡＡＶベクター）である。トランススプライシングＡＡＶベクターは、（単一ＡＡＶベクター中で提供されるものの他に）スプライシングドナーシグナルおよびスプライシングアクセプターシグナルを典型的には保有する。ハイブリッドＡＡＶベクターは、好ましくは（単一ＡＡＶベクターおよびトランススプライシングベクター中で提供されるものの他に）ヒト胎盤アルカリフォスフォターゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｔａｓｅ）遺伝子の中央の３分の１からの、オーバーラップする相同の配列を典型的には保有する。レンチウイルスベクターは、図２で図示されるような５’の長い末端反復（ＬＴＲ）、３’ＬＴＲおよびパッケージングシグナルΨを典型的には保有する。

「作動可能に結合された（ｏｐｅｒａｂｌｙｌｉｎｋｅｄ）」によって、核酸分子が、他の核酸分子と機能的な関係で置かれることが意味される。例えば、発現カセットが配列の転写に影響を与えるならば、発現カセット（プロモーターおよびポリＡ）はミニ／ミクロジストロフィン遺伝子に作動可能に結合されている。

ＡＡＶベクターおよびレンチウイルスベクターの構造、機能および使用に関する情報は、当技術分野において周知であり利用可能である。本発明のデュアルＡＡＶベクターは、大きな（例えば少なくとも１０ｋｂ）パッケージング能力を有する。３つの古典的なデュアルベクターは、シス活性化ベクター、トランススプライシング（ｔｓ）ベクターおよびオーバーラッピングベクターである（Duan, D., Z. Yan, and J. F. Engelhardt. 2006.AAVベクターの容量の拡張（Expanding the capacity of AAV vectors）、p. pp525-32.M. E. Bloom, S. F. Cotmore, R. M. Linden, C. R. Parrish, and J. R. Kerr（編）中、パルボウイルス（Parvoviruses）。Hodder Arnold；オックスフォード大学出版局（ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓ）、ロンドン、ニューヨークによってアメリカ合衆国で流通される。Ghosh, A., and D. Duan. 2007.アデノ随伴ウイルスベクター容量の使用：２つのベクターの物語（Expending Adeno-associated Viral Vector Capacity: A Tale of Two Vectors）。Biotechnology and Genetic Engineering Reviews 24: 165- 177, 2007.中で概説される）。

ｔｓベクターおよびオーバーラッピングベクターのみが６ｋｂのミニ遺伝子を送達することができる。ｔｓＡＡＶにおいて、大きな治療用遺伝子はドナーベクターおよびアクセプターベクターへと分割される。ドナーベクターは、遺伝子の５’部分およびスプライシングドナーシグナルを保有する。アクセプターベクターは、スプライシングアクセプターシグナルおよび遺伝子の３’部分を保有する。発現は、ＡＡＶ逆方向末端リピート（ＩＴＲ）仲介性分子間組換え、および続いて行なわれる組換えゲノムのスプライシングによって達成される（図１３）。Duan, D., Y. Yue, and J. F. Engelhardt. 2001.トランススプライシングベクターまたはオーバーラッピングベクターによるＡＡＶパッケージング容量の拡張：定量比較（Expanding AAV Packaging Capacity With Trans-splicing Or Overlapping Vectors: A Quantitative Comparison）。Mol Ther 4:383-91、Sun, L., J. Li, and X. Xiao. 2000.ウイルスＤＮＡのヘテロダイマー化を介するアデノ随伴ウイルスベクターのサイズ限界の克服（Overcoming adeno-associated virus vector size limitation through viral DNA heterodimerization）。Nat. Med. 6:599-602、およびYan, Z., Y. Zhang, D. Duan, and J. F. Engelhardt. 2000.表紙から：トランススプライシングベクターは遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルスの有用性を拡張する（From the Cover: Trans-splicing vectors expand the utility of adeno-associated virus for gene therapy）。Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6716-6721.を参照。

オーバーラッピングベクターにおいて、大きな治療用遺伝子は上流ベクターおよび下流ベクターへと分割される。上流ベクターおよび下流ベクターは相同領域を共有する（Duan, D., Y. Yue, and J. F. Engelhardt. 2001., Halbert, C. L., J. M. Allen, and A. D. Miller. 2002.）。より大きな遺伝子部分を保有するＡＡＶベクターとの間の組換えに続く効率的なマウス気道の形質導入（Efficient mouse airway transduction following recombination between AAV vectors carrying parts of a larger gene）。Nat Biotechnol 20:697-701.）導入遺伝子の再構成は相同組換えを介して達成される（図１３）。遺伝子スプリッティング部位の最適化などの合理的なベクターデザインによって、ｔｓＡＡＶベクターからの形質導入効率は、単一ＡＡＶベクターからの形質導入効率に到達することができる（Lai et al 2005 Nature Biotechnique: Lai et al 2006 Human Gene Therapy）。さらに、ｔｓＡＡＶベクターの全身的な送達により、げっ歯類の全身の筋肉を効率的に形質導入することが示された（Ghosh, Yue, Long, Bostic and Duan 2007 Molecular Therapy 16:124-130）。ｔｓＡＡＶ仲介性ミニ遺伝子治療は、筋肉の病状を減少させ、筋力を改良し、単一ｍｄｘ筋肉中の収縮誘導性損傷を阻害することが実証された（Lai, Y., D. Li, Y. Yue, and D. Duan. 2007.デュシェンヌ型筋ジストロフィー遺伝子治療のためのトランススプライシングアデノ随伴ウイルスベクターのデザイン（Design of trans-splicing adeno-associated viral vectors for Duchenne muscular dystrophy gene therapy）。Method in Molecular Medicine：印刷中、Lai, Y., Y. Yue, M. Liu, and D. Duan. 2006.合成イントロンは、トランススプライシングアデノ随伴ウイルスベクターの形質導入効率を改良する（Synthetic intron improves transduction efficiency of trans-splicing adeno-associated viral vectors）。Hum Gene Ther 17:1036-42、およびLai, Y., Y. Yue, M. Liu, A. Ghosh, J. F. Engelhardt, J. S. Chamberlain, and D. Duan. 2005.トランススプライシングアデノ随伴ウイルスベクターによる効率的なインビボ遺伝子発現（Efficient in vivo gene expression by trans-splicing adeno-associated viral vectors）。Nat Biotechnol 23:1435-9.）。

古典的なデュアルＡＡＶベクターに加えて、ハイブリッドＡＡＶデュアルベクターシステムが最近開発されている（Ghosh, Yue, Lai and Duan 2008 Molecular Therapy 16:124-130）。ｔｓＡＡＶは、至適遺伝子スプリッティング部位に高度に依存する。この制限はハイブリッドベクターシステムで克服される。ハイブリッドＡＡＶベクターにおいて、導入遺伝子の再構成は、ｔｓＡＡＶベクターで記述されているような従来のトランススプライシング経路によって、または高度に組換誘導性の外来性ＤＮＡ配列経由の相同組換えによって達成することができる。

図１は、全長ジストロフィン遺伝子、他の研究者によって出版／研究されたミニ／ミクロジストロフィン遺伝子、および本発明者によって合成された代表的なミニ／ミクロジストロフィン遺伝子の構造および筋鞘へのｎＮＯＳの回復に関するそれぞれの機能を示す。図１において、Ｎはジストロフィンタンパク質のＮ末端ドメインを表わし；Ｈ１−４はジストロフィンタンパク質のロッドドメイン中のヒンジ１〜４を表わし；数の番号はジストロフィンロッドドメイン中のスペクトリン様リピートを表わし（正に荷電したリピートは白色の数の番号である）；ＣＲはジストロフィンタンパク質中のシステインリッチドメインを表わし；Ｃはジストロフィンタンパク質のＣ末端ドメインを表わし；点線で囲ったボックスは、各々がそれぞれのコンストラクトにおいて欠失される領域を表わす。

図１中に示されるように、本発明の前に、ミニ遺伝子Δ１７−４８、ミニ遺伝子ΔＨ２−Ｒ１９、ミクロ遺伝子ΔＲ４−Ｒ２３／ΔＣおよびミクロ遺伝子Δ３８４９（ΔＲ３−２１／ΔＣ）が、記述／研究されている。他の利点を有するのだが、これらのミニ／ミクロ遺伝子のどれも筋鞘へｎＮＯＳを回復させる機能を保持せず、同様に他の出版されたミニ／ミクロジストロフィン遺伝子（図１中にリストされない）も機能を保持しない。本発明につながる研究において、新規ミニ／ミクロ遺伝子を合成した。Ｒ１６−１７リピートを含むミニ／ミクロ遺伝子（ΔＨ２−Ｒ１５、ΔＨ２−Ｒ１５／ΔＲ１８−１９、ΔＨ２−Ｒ１５／ΔＣ、ΔＲ３−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣおよびΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣなど）はｎＮＯＳを回復することが示されるが、Ｒ１６またはＲ１７リピートのないミニ／ミクロ遺伝子（ΔＨ２−Ｒ１７、ΔＨ２−Ｒ１６、ΔＨ２−Ｒ１５／ΔＲ１７−１９およびΔＲ３−１５／ΔＲ１７−２３など）はその能力を欠くことが見出された。図１および本出願において以下に提供される実施例を参照。

図１は、ｎＮＯＳを動員するミクロドメインの機能は、その天然の配列前後関係／位置から独立していることをさらに示唆する。野生型ジストロフィンにおいて、Ｒ１６−１７はＲ１５およびＲ１８によって囲まれている。本発明のミニ／ミクロジストロフィン遺伝子において、Ｒ１（例えばΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣにおいて）、Ｒ２（例えばΔＲ３−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣにおいて）、Ｒ３（例えばΔＨ２−Ｒ１５およびその派生物において）、Ｈ３（例えばΔＨ２−Ｒ１５／ΔＲ１８−１９において）およびＲ２４（例えばΔＲ２−Ｒ１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣおよびその誘導体の）など、他のリピートまたはヒンジに隣接してＲ１６−１７を置くときに、ｎＮＯＳタンパク質およびその活性は筋鞘で回復する。従って、さらに他の実施形態において、本発明は、被験体に本発明のミニ遺伝子および／またはミクロ遺伝子の治療的有効量を投与することによる、好ましくはミニ遺伝子および／またはミクロ遺伝子を保有するベクターを投与することによる、より好ましくは被験体に本発明のミニ遺伝子および／またはミクロ遺伝子を含むＡＡＶベクターの治療的有効量を投与することによる、被験体のＤＭＤ、ＢＭＤおよび／またはＸＬＤＣの治療のための方法を対象とする。

「被験体」によって、任意の哺乳類被験体、好ましくはヒトが意味される。本発明の方法に従う投与の経路は、患者における局部的な筋肉機能を改良する局部的または局所的な筋肉内注射、患者の部位または全身におけるすべての筋肉への全身的な送達（静脈内、動脈内、腹腔内などの）、ＡＡＶまたはレンチウイルスベクターによる筋幹細胞のインビトロの感染に続く局部的および／または全身的な送達を含む。

「治療的有効量」によって、治療される症状を有意に肯定的に修飾するほど高いが、音波医学的判断の範囲内で深刻な副作用（妥当なベネフィット／リスク比で）を回避するほど低い量が意味される。治療的有効量は、調製のタイプ、ベクターまたは使用されている組成物だけでなく、治療されている特定の症状または治療されている被験体の症状およびその人の身体的症状に応じて変化する。

特定の実施形態において、本発明は血管内投与を検討する。例えばＲ１６およびＲ１７を含むミクロジストロフィン遺伝子によるＡＡＶ−９遺伝子治療において、新生仔マウス（１週間またはそれ未満の年齢）への用量は約０．５〜約１．５×１０¹¹ｖｇ粒子／グラム体重または約５０〜約７５μｌ／グラム体重であり；若いマウス（１週間〜１か月の年齢）への用量は約０．５〜約１．５×１０¹¹ｖｇ粒子／グラム体重または約７５〜約２００μｌ／グラム体重であり；成体マウス（１〜２０か月齢）への用量は約０．５〜約１．５×１０¹¹ｖｇ粒子／グラム体重または約２００〜約４００μｌ／グラム体重であり；新生仔イヌ（３日またはそれ未満の年齢）のための用量は約０．５〜約２×１０¹¹ｖｇ粒子／グラム体重または約１０〜約２５μｌ／グラム体重であり；若いイヌ（３日〜３か月の年齢）のための用量は約０．５〜約２×１０¹¹ｖｇ粒子／グラム体重または約１０〜約２５μｌ／グラム体重であり；成体イヌ（３か月またはそれ以上）のための用量は約１〜約３×１０¹¹ｖｇ粒子／グラム体重または約１５〜約３０μｌ／グラム体重である。

本発明に従って、ジストロフィンタンパク質中のＲ１６−１７のｎＮＯＳ動員ミクロドメインを同定した後、ミクロドメインは、ＤＭＤ、ＢＭＤおよびＸＬＤＣなどのジストロフィン欠損疾患の治療のための非ウイルス性遺伝子治療ベクターおよび／またはウイルス性遺伝子治療ベクターおよび／または細胞治療へと組み入れることができる。本発明は、ジストロフィン欠損筋肉中にｎＮＯＳを回復させることができる一連のＡＡＶミニ／ミクロジストロフィンベクターを提供する。組換えＡＡＶベクターは、ｎＮＯＳを回復するミニ／ミクロジストロフィン遺伝子、発現カセット（プロモーターおよびポリＡ）およびウイルスの逆方向末端リピート（ＩＴＲ）の任意の１つを含む。図２は、本発明のミニ／ミクロジストロフィン遺伝子を保有するＡＡＶベクターの例示的なコンストラクトをリストする。

さらに他の実施形態において、本発明は、本発明の１つまたは複数のＡＡＶベクターおよびレンチウイルスベクターおよび未修飾プラスミドＤＮＡ分子および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を対象とする。

核酸のための薬学的な製剤、用量および投与経路は、例えばFeigner et alの米国特許第５，５８０，８５９号中に、一般的に開示される。局部投与および全身投与の両方は本発明によって検討される。本発明の分子が予防的な目的のために用いられる場合、本発明の薬剤は好ましくは全身投与による連用に適用可能である。

本発明の治療剤を含む１つまたは複数の適切な単位投与量形態（持続放出のために任意で製剤化できる）は、経口経路、または直腸経路、経皮経路、皮下経路、静脈経路、筋肉内経路、腹腔内経路、胸内経路、肺内経路および鼻腔内経路を含む非経口経路を含む様々な経路によって投与することができる。製剤は、適切な場合には、個別単位投与量形態において便利なように提供され、製薬学に周知の任意の方法によっても調製できる。かかる方法は、液体担体、固体マトリクス、半固形担体、微粉固体担体またはその組合せと治療剤を合わせる工程、および次に必要なならば、所望される送達システムの中へ生成物を導入または形成する工程を含みうる。

本発明の治療剤が経口投与のために調製されるときに、それらは好ましくは薬学的に許容される担体、希釈剤または添加剤と組み合わせて、薬学的製剤または単位投与量形態を形成する。「薬学的に許容される」によって、製剤の他の成分と適合性があり、そのレシピエントに有害でない、担体、希釈剤、添加剤、および／または塩が意味される。経口投与のための活性成分は、粉末または顆粒として；溶液、懸濁物またはエマルジョンとして；またはチューインガムからの活性成分の摂取のための合成樹脂などの到達可能な基材中に存在できる。活性成分は、ボーラス、舐剤またはペーストとしてもまた提供できる。

本発明の医薬組成物を含む薬学的製剤は、周知の容易に利用可能な成分を使用して、当技術分野において公知の手順によって調製することができる。例えば、薬剤は一般的な添加剤、希釈剤または担体により製剤化することができ、タブレット、カプセル、懸濁物、粉末および同種のものへと形成できる。かかる製剤のために適切な添加剤、希釈剤および担体の例は、以下のデンプン、糖、マンニトールおよびケイ酸誘導体などの充填剤および増量剤；カルボキシメチルセルロース、ＨＰＭＣおよび他のセルロース誘導体、アルギナート、ゼラチンおよびポリビニルピロリドンなどの結合剤；グリセロールなどの保湿剤；炭酸カルシウムおよび炭酸水素ナトリウムなどの崩壊剤；パラフィンなどの溶解を遅らせるための薬剤；第四級アンモニウム化合物などの吸収促進剤；セチルアルコール、グリセロール・モノステアレートなどの表面活性薬剤；カオリンおよびベントナイトなどの吸着性担体；ならびにタルク、ステアリン酸カルシウムおよびステアリン酸マグネシウム、および固体のポリエチルグリコールなどの潤滑剤を含む。

本発明の治療剤は、好都合な経口投与のためのエリキシルもしくは溶液、または例えば筋肉内経路、皮下経路もしくは静脈経路による非経口投与のために適切な溶液としてもまた製剤化することができる。本発明の治療剤の薬学的製剤は、水溶液もしくは無水溶液または分散物の形態、または代わりにエマルジョンもしくは懸濁物の形態もまたとることができる。

したがって、治療剤は、非経口投与（例えば注入（ボーラス注射、連続的な点滴など）による）のために製剤化され、恐らく、アンプル中の単位用量形態、充填済みシリンジ、少量の体積の点滴容器、または追加の防腐剤を含有する多重用量容器中で提供できる。活性成分は、油性賦形剤または水性賦形剤中で懸濁物、溶液またはエマルジョンとしてそのような形態をとり、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤を含みうる。あるいは活性成分は、使用の前に適切な賦形剤（例えば滅菌されたパイロジェンフリー水）による構成のために、滅菌された固体の無菌的な単離によって、または溶液からの凍結乾燥によって得られた粉末形態でありうる。これらの製剤は、先行技術において周知である、薬学的に許容される賦形剤およびアジュバントを含むことができる。

本発明に従う組成物は、セルロースおよび／またはセルロース誘導体などの増粘剤もまた含むことができる。それらは、キサンタンガム、グアーガム、カルボゴムもしくはアラビアゴムなどのゴム類、またはあるいはポリエチレングリコール、ベントンおよびモンモリロナイト、ならびに同種のものもまたを含むことができる。

必要ならば、抗酸化剤、界面活性剤、他の防腐剤、皮膜剤、角質溶解剤または面皰溶解剤から選択される補助剤、香料および着色剤を追加することが可能である。記述される症状のため、または他のいくつかの症状のためであるかにかかわらず、他の活性成分もまた追加できる。

本発明の医薬組成物の局部送達は、疾患部位で、またはその部位の近くで、薬剤を投与する様々な技術によることもまた可能である。部位特異的局部送達または標的化局部送達技術の実施例は、限定するのではなく、利用可能な技術の例証となるように意図される。実施例は、注入カテーテルもしくは留置カテーテル（例えば針注入カテーテル、シャントおよびステントまたは他の移植可能な装置）などの局部送達カテーテル、部位特異的担体、直接噴射、または直接適用を含む。

特に、筋肉などの組織への本発明のベクターの送達のために、宿主動物の筋組織の中へベクターを導入する任意の物理的方法または生物学的方法を用いることができる。ベクターは、露出した組換えベクター、およびＡＡＶ投与のために周知のウイルスコートタンパク質の中へパッケージングされたベクターＤＮＡの両方を意味する。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）またはＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝生理食塩水中にＡＡＶベクターを単純に溶解することは、筋組織発現のために有用な賦形剤を提供するのに十分であることが実証され、ベクターと共に同時投与することができる担体または他の構成分子には公知の制限はない（しかしＤＮＡを分解する組成物をベクターと共にするのは正常様式では回避されるべきである）。医薬組成物は、注射可能な製剤、または経皮輸送によって筋肉に送達される局所製剤として調製することができる。筋肉注射および経皮輸送の両方のための多数の製剤は今までに開発されており、本発明の実践において使用できる。ベクターは、任意の薬学的に許容される担体と共に投与および取り扱いの容易性のために使用できる。

筋肉注射の目的のために、胡麻油または落花生油などのアジュバント、または水性プロピレングリコール中の溶液は、滅菌された水溶液と同様に用いることができる。所望されるならば、かかる水溶液は緩衝することができ、液体希釈剤は最初に生理食塩水またはグルコースにより等張にされる。遊離酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含む）または薬理学的に許容される塩としてのＡＡＶベクターの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤を適切に混合した水中で調製できる。ＡＡＶウイルス粒子の分散物は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物、ならびに油脂中でもまた調製できる。通常の貯蔵および使用の条件下で、これらの調製物は、微生物の増殖を阻害するために防腐剤を含む。これに関連して、用いられる滅菌された水性溶媒はすべて、当業者に周知の標準技術によって容易に得られる。

注射可能な使用のために適切な医薬品形態は、滅菌された水溶液または分散物、および滅菌された注射可能な溶液または分散物の即時調整のための滅菌された粉末を含む。すべての場合において、形態は滅菌され、容易な注入可能性がある程度の流動性でなくてはならない。それは製造および貯蔵の条件下で安定し、細菌および真菌などの微生物の混入作用に対して保護されなくてはならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールおよび同種のもの）、その適切な混合物および植物油を含む溶媒または分散媒になりえる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合では必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持できる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールおよび同種のもの）によって成し遂げることができる。多くの場合において、等張剤（例えば糖または塩化ナトリウム）を含むことが好ましい。注射可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によって引き起こすことができる。

滅菌された注射可能な溶液は、上で列挙される他の成分の様々なものと共に、適切な溶媒中に必要とされる量でＡＡＶベクターを組み入れ、必要に応じて、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般的に、分散物は、基本的な分散媒および上で列挙されたものからの必要な他の成分を含む、滅菌された賦形剤の中へ滅菌された活性成分を組み入れることによって調製される。滅菌された注射可能な溶液の調製のための滅菌された粉末の場合において、調製の好ましい方法は、あらかじめ滅菌濾過したその溶液から、任意の追加の所望成分を加えた活性成分の粉末を産出する真空乾燥および凍結乾燥技術である。

本発明の治療用化合物は、哺乳類に、単独でまたは薬学的に許容される担体と共に組合せで投与できる。活性成分および担体の相対的な比率は、化合物の溶解度および化学的性質、選択された投与経路、ならびに標準的薬務によって決定される。予防または治療のために適当な本治療剤の投与量は、投与形態、選択された特定の化合物、および治療下での特定の患者の生理学的特性に応じて変化する。一般的に、最初に低投与量を使用し、最適の効果がこのような状況下で達成されるまで、必要ならば、少量の増加量で増加される。例示的な投与量は、実施例中で以下に設定される。

ＡＡＶが幅広い宿主領域（肺発現について）を有し、筋肉中で残存することが示されているので、本発明のベクターは、任意の動物、および特に哺乳類、鳥類、魚類および爬虫類、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ニワトリおよびシチメンチョウなどの家畜哺乳類および鳥類において遺伝子を発現するために用いることができる。ヒトおよび獣医学領域の両方の使用は特に好ましい。

発現される遺伝子は、使用者によって所望されるすべての制御エレメント（例えばプロモーター、オペレーター）を備えたタンパク質をコードするＤＮＡセグメント、またはコードしないＤＮＡセグメントのいずれかになりえ、その転写により、いくつかのＲＮＡ含有分子（転写調節エレメント、＋ＲＮＡまたはアンチセンス分子などの）の全部または一部が産生される。

アデノ随伴ウイルスベクターは、上述のベクターシステムに関して一定の長所を有する。第一に、アデノウイルスのように、ＡＡＶは非分裂細胞に効率的に感染できる。第二に、ＡＡＶウイルス遺伝子はすべてベクター中で除去される。ウイルス遺伝子発現誘導性免疫反応はもはや問題ではないので、ＡＡＶベクターはアデノウイルスベクターよりも安全である。第三に、野生型ＡＡＶはもともと組込みウイルスであり、導入遺伝子は宿主染色体の中への組込みにより細胞中で安定的に維持される。第四に、組換えＡＡＶベクターは、特にげっ歯類、イヌおよびヒトの筋肉などの哺乳類組織中で何年もの間エピゾーム分子として残存できる。エピゾーム形態は、インビボの組織におけるＡＡＶベクター仲介性形質導入についての優勢形態と考えられる。第五に、ＡＡＶは非常に安定したウイルスであり、多くの界面活性剤、ｐＨ変化および熱（１時間以上５６℃で安定）に対して耐性がある。そのことにより、活性を失わずに、凍結乾燥し再溶解できる。したがって、ＡＡＶは遺伝子治療に非常に有望な送達手段である。

本発明は、本発明のミニ／ミクロ遺伝子の製作、ｎＮＯＳ回復の検出、ｎＮＯＳタンパク質活性の測定、本発明のＡＡＶベクターの発現の実施例をさらに提供する。以下に提供される実施例は、単にいくつかの実施形態の例示を意味し、いかなる方法でも請求項の範囲を限定するように判断されるべきでなく、明細書によってのみ限定される。

実験プロトコール：
動物モデルおよびインビボ遺伝子移入。この開示中で記述される動物実験はすべて、ミズーリ大学（ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＭｉｓｓｏｕｒｉ）の研究所の動物実験委員会（ＡｎｉｍａｌＣａｒｅａｎｄＵｓｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されており、ＮＩＨガイドラインに従う。正常な実験用マウス（ＢＬ１０マウス）およびジストロフィン欠損実験用マウス（ｍｄｘマウスおよびｍｄｘ４ｃｖマウス）は、ジャクソン研究所（ＪａｃｋｓｏｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）（バーハーバー、メイン）からもとは購入した。ｍｙｏＤ／ジストロフィンダブルノックアウト（ｍ−ｄｋｏ）マウスは、もとはオタワ研究所のＭｉｃｈａｅｌＲｕｄｎｉｃｋｉ博士から入手した。続いてミズーリ大学での自家繁殖によってコロニーを確立し、１２時間−１２時間の明暗サイクルで２０〜２３℃の特定病原体未感染の動物施設中に、マウス（実験用マウスおよび繁殖用ペアを含む）を収容した。非ウイルス性プラスミドによるインビボの局部的なトランスフェクションまたはＡＡＶ仲介性局部的な遺伝子移入のいずれかによって、ジストロフィン発現、ｎＮＯＳ発現およびｎＮＯＳ活性を評価するために、２つの筋肉（前脛骨（ＴＡ）筋および腓腹筋）を使用した。ＡＡＶ仲介性遺伝子移入（局部的送達および全身的送達）後のジストロフィン発現、ｎＮＯＳ発現、ｎＮＯＳ活性および筋力改善に対して、長趾伸（ｅｘｔｅｎｓｏｒｄｉｇｉｔｏｒｉｕｍｌｏｎｇｕｓ）（ＥＤＬ）筋を使用した。血管内の全身的な遺伝子送達後のジストロフィン発現、ｎＮＯＳ発現、ｎＮＯＳ活性および筋肉の病状改善について、すべての身体の筋肉（骨格筋および心筋を含む）を解析した。これらの筋肉に対してプラスミドまたはＡＡＶを送達するために、最初に筋肉の近位端部を２〜３ｍｍ切開して露出した。次に、３３Ｇのハミルトン針を筋肉の中央の腹へ挿入した。ベクター（プラスミドまたはＡＡＶ）を、ゆっくり注入針を引き出しながら筋肉の中へ注入した。傷を縫合し、回復するまで動物をモニターした。

ヒトジストロフィンおよびｎＮＯＳについての二重蛍光抗体染色。本発明のミニ／ミクロジストロフィン遺伝子に加えて、報告されているミニ／ミクロジストロフィン遺伝子もすべて、ヒトジストロフィンｃＤＮＡに倣って形成した。合成ミニ／ミクロ遺伝子発現を評価するために、ヒトジストロフィンのヒンジ１領域中のエピトープと特異的に反応するが、マウスジストロフィンとは反応しないモノクローナル抗体（Ｄｙｓ−３、クローンＤｙ１０／１２Ｂ２、ＩｇＧ２ａ；１：２０希釈；ノボカストラ（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）社、ニューカースル、イギリス）を使用した。ｎＮＯＳ発現を評価するために、抗ｎＮＯＳのＣ末端ポリクローナル抗体（１：２０００希釈；サンタクルーズ（ＳａｎｔａＣｒｕｚ）社、サンタクルーズ、カリフォルニア）を使用した。ポリクローナル抗体は、マウス筋肉において非常に低いバックグラウンドであった。下記は二重免疫染色プロトコールの説明である。８μｍの風乾凍結切片を、ＫＰＢＳ（３５６μＭＫＨ₂ＰＯ₄、１．６４ｍＭＫ₂ＨＰＯ₄、１６０ｍＭＮａＣｌ）により簡単にリンスする。１％ヤギ血清ＫＰＢＳにより１５分間室温でブロックする。０．２％ゼラチン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）社、セントルイス、ミズーリ）ＫＰＢＳにより洗浄する。抗ｎＮＯＳ抗体を４℃で一晩適用する。０．２％ゼラチンＫＰＢＳにより洗浄する。ｎＮＯＳタンパク質発現を明らかにするためにアレックス４８８コンジュゲートヤギ抗ウサギ抗体（１：１００希釈；モレキュラー・プローブ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅ）社、ユージーン、オレゴン）を適用する。第２の工程はマウス筋肉においてマウスモノクローナル抗体の使用を必要とする。最初に、内因性のマウス免疫グロブリン（Ｉｇ）に対する二次抗体の結合をブロックした。パパイン消化ウサギ抗マウスＩｇＧ（ＦａｂおよびＦｃ断片を含む）を、ブロッキングのために使用した。簡潔には、ウサギ抗マウスＩｇＧ（シグマ社、セントルイス、ミズーリ）を、１ｍＭＥＤＴＡおよび２２ｍＭＬ‐システイン（シグマ社、セントルイス、ミズーリ）の存在下でパパイン（シグマ社、セントルイス、ミズーリ）により３７℃で１６時間消化した。消化反応はヨード酢酸（シグマ社、セントルイス、ミズーリ）によって止めた。二重免疫染色のために、ｎＮＯＳ抗体で染色した凍結切片を抗マウスＩｇＧブロッキング溶液中で室温で６０分間ブロックした。ＰＢＳ中の洗浄後に、凍結切片を２０％ウサギ血清（ジャクソン・イムノリサーチ・ラボラトリーズ（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）社、ウエストグローブ、ペンシルバニア）により室温で３０分間再びブロックした。ＰＢＳ中の洗浄後に、Ｄｙｓ−３モノクローナル抗体（１％ウサギ血清中で希釈した）を４℃で一晩適用した。ＰＢＳ中の洗浄後に、ヒトジストロフィンエピトープを、アレックス５９４コンジュゲートヤギ抗マウス抗体（モレキュラー・プローブ社、ユージーン、オレゴン）によって明らかにした。核を可視化し、光退色を減少させるために、ＤＡＰＩ（モレキュラー・プローブ社、ユージーン、オレゴン）を含むスローフェード・ライト・アンチフェード・キット（ＳｌｏｗＦａｄｅＬｉｇｈｔＡｎｔｉｆａｄｅＫｉｔ）によりスライドをマウントした。顕微鏡写真は、ニコン（Ｎｉｋｏｎ）Ｅ８００蛍光顕微鏡を使用して、キューイメージ・レティガ（ＱｉｍａｇｅＲｅｔｉｇａ）１３００カメラにより撮影する。

ｎＮＯＳ活性を評価するための組織酵素染色。ｎＮＯＳ活性の組織化学的評価は、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）ジアフォラーゼ活性に基づいた（Hope et al., 1991; Bredt et al., 1991; Dawson et al., 1991）。ｎＮＯＳはＮＡＤＰＨジアフォラーゼである（Hope et al., 1991）。本質的には、無色の可溶性ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）塩を青色の不溶性フォルマザンに変換するために、ｎＮＯＳは電子ドナーとしてＮＡＤＰＨを使用する。筋肉中のｎＮＯＳ活性を決定するために、１６μｍの風乾凍結切片は、最初に４％パラホルムアルデヒド中で４℃で２時間固定した。この工程は、脱水素酵素およびＰ４５０などの他の細胞性酵素における非特異的ＮＡＤＰＨジアフォラーゼ活性を不活性化する。ｎＮＯＳ由来ＮＡＤＰＨジアフォラーゼ活性はパラホルムアルデヒド固定に対して耐性がある（Matsumoto et al., 1993; Spessert and Claassen, 1998）。

リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の短いリンス後に、組織切片は３７℃で２０分間０．２％トリトンＸ−１００により透過性にした。次にスライドを、０．２％トリトンＸ−１００、０．２ｍＭＮＡＤＰＨおよび０．１６ｍｇ／ｍｌのＮＢＴを含む溶液中で３７℃で４時間染色することによって、ＮＡＤＰＨジアフォラーゼ活性を示した。機能的なｎＮＯＳ酵素は、明視野顕微鏡下で青色の染色として観察された。顕微鏡写真は、ニコンＥ８００顕微鏡を使用して、キューイメージ・レティガ１３００カメラにより撮影した。

組換えＡＡＶ−６産生。ＡＡＶパッケージングのために使用されるシスプラスミドは、ΔＲ２−１５／Ｒ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子などの本発明のミニ／ミクロ遺伝子を保有した。任意のメカニズムによる限定を意図しないが、Ｒ１６−１７ミクロドメインはこれらのミニ／ミクロ遺伝子におけるｎＮＯＳ回復に関与すると考えられる。ＡＡＶベクターを作製するために、パッケージング細胞株（２９３細胞）を、プラスミドのトランスフェクション４８時間前に１５０ｍｍの培養プレートに１：６でスプリットする。合計４つのプラスミドをコトランスフェクションして、ＡＡＶ−６ベクターを作製した。これらはシスプラスミド、ｐＭＴ−Ｒｅｐ２、ｐＣＭＶＣａｐ６およびｐＨｅｌｐｅｒを含んでいた。各ベクター調製（１５×１５０ｍｍプレート）のために、１８７．５μｇのシスプラスミド、１８７．５μｇのｐＭＴ−Ｒｅｐ２、５６２．５μｇのｐＣＭＶＣａｐ６および５６２．５μｇのｐＨｅｌｐｅｒ（１：１：３：３の比率で）を使用した。すべてのプラスミドを１５．２ｍｌの水中で完全に混合した後、１．６８ｍｌの２．５ＭＣａＣｌ₂を２５０ｍＭの最終濃度まで追加した。次に、ＤＮＡ／ＣａＣｌ₂混合物を１６．８ｍｌの２×ＨＢＳへゆっくり滴下させることによって、ＤＮＡ−リン酸カルシウム沈殿を生じた。次に、培養プレートを旋回させながら、ＤＮＡ−リン酸カルシウム沈殿を２９３細胞へ一滴ずつ適用した。トランスフェクション７２時間後に、細胞溶解物をセルリフター（コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）社、コーニング、ニューヨーク）により回収した。ベンチトップ遠心分離機（４℃で３，０００ｒｐｍ）中での２０分の遠心後に、細胞沈殿を９ｍｌの１０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中で再懸濁した。細胞溶解物を、ドライアイス／エタノールおよび４０℃の水浴を使用して、８〜１０回凍結／融解した。細胞溶解物を、出力５．５で１０分間（氷上）（ミソニック・セル・ディスラプター（ＭｉｓｏｎｉｃＣｅｌｌＤｉｓｒｕｐｔｅｒ）Ｓ３０００；ミソニックス（Ｍｉｓｏｎｉｘ）社、ニューヨーク）、超音波処理した。細胞溶解物をＤＮａｓｅＩにより３７℃で４５分間消化した。細胞溶解物は、出力５．５で７分間（氷上）再び超音波処理する。溶解物を、１０分の１体積の０．２５％トリプシンおよび１０％デオキシコール酸ナトリウムにより３７℃で３０分間消化した。４℃で３０分間４，０００ｒｐｍの遠心によって、清澄な細胞溶解物を得た。上清を新しいチューブへ移した。体積を１０ｍＭトリス（ｐＨ８）により２９ｍｌに調整し、１８．２ｇのＣｓＣｌ₂（ＣｓＣｌ₂の最終濃度、０．６１３ｇ／ｍｌ）を追加した。溶液を３７℃で３０分間インキュベートしてＣｓＣｌ₂を溶解し、次に４℃３０分間４，０００ｒｐｍで遠心した。上清をＳＷ５５Ｔｉローター中の５ｍｌのベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）超遠心分離チューブ６本へロードし、４℃４０時間４６，０００ｒｐｍで遠心した。画分は２０ゲージの針によりチューブの底部から回収した。ウイルス含有画分は、放射性標識ヒトジストロフィン遺伝子特異的プローブを使用して、スロットブロットによって同定した。最も高いウイルス力価を持つ画分を組み合わせ、４℃４０時間４６，０００ｒｐｍで再び遠心分離した。画分を回収し、最も高いウイルス画分をスロットブロットによって同定した。ウイルスストックを、ヘペスバッファー（２０ｍＭヘペス、１５０ｍＭＮａＣｌ、ｐＨ７．８）中で４℃で２×２４時間透析した。

組換えＡＡＶ−９産生。ＡＡＶ−６パッケージングのために使用した同じシスプラスミドを、ＡＡＶ−９パッケージングのために使用した。トランスフェクションおよび精製のプロトコールは、パッケージングプラスミドを除いて、ＡＡＶ−６産生におけるものと本質的に同じだった。４つのプラスミドのコトランスフェクションを使用する代わりに、１：１：３の比率（１８７．５μｇのシスプラスミド、１８７．５μｇのｐＲｅｐ２／Ｃａｐ９および５６２．５μｇのｐＨｅｌｐｅｒ）で、シスプラスミド、ｐＲｅｐ２／Ｃａｐ９およびｐＨｅｌｐｅｒを使用して、三重プラスミドトランスフェクションを実行した（Bostick et al., 2007; Ghosh et al., 2007）。

ミニ／ミクロジストロフィン遺伝子
ジストロフィンミニ遺伝子（ΔＨ２−Ｒ１５）の１つの実施例は、鋳型としてΔＨ２−Ｒ１９ミニ遺伝子を使用して行なうことができる。図３は、全長遺伝子、ΔＨ２−Ｒ１９ミニ遺伝子および３つの新しく合成されたミニ遺伝子を含むプロトタイプコンストラクトのための診断用切断を示す。ΔＨ２−Ｒ１９ミニ遺伝子（筋鞘へｎＮＯＳを回復させることができない）はＤＭＤ遺伝子治療のために現在評価されているミニ遺伝子である（Harper et al., 2002; Lai et al., 2005）。ΔＨ２−Ｒ１７、ΔＨ２−Ｒ１６およびΔＨ２−Ｒ１５は、ΔＨ２−Ｒ１９ミニ遺伝子のリピートよりも、それぞれ２つ（Ｒ１８およびＲ１９）、３つ（Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９）ならびに４つ（Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９）の追加のリピートを含むミニ遺伝子である。余分のリピートは、診断用バンドの分子量が次第に増加することによって可視化することができる。具体的には、それぞれの各コンストラクトをＮｓｉＩ／ＳａｌＩの二重消化により切断し、導入遺伝子から診断用フラグメントを遊離した。消化ＤＮＡ断片を、アガロースゲル上で電気泳動にかけた。診断用バンドのサイズを分子量マーカー（１ｋｂラダー）により決定した。星印は、不完全消化に起因するΔＨ２−Ｒ１９コンストラクトの残存プラスミドを示す。

合成ミニジストロフィン遺伝子と同様に、合成ミクロジストロフィン遺伝子を標準的な分子生物学クローニング手順を使用して作製した。本質的には、関連するＤＮＡ配列（リピート、ヒンジなどのような）は、高忠実度のＰＣＲ反応によって増幅し、次にＴ４ＤＮＡリガーゼを使用する酵素ライゲーションによって再度組み立てた。次に再結合した合成ＤＮＡ分子を、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、コンピテントな大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）に形質転換した。適切なクローンを制限酵素診断用切断によって同定した。これらのクローンはＤＮＡ塩基配列決定によってさらに確認した。

ｎＮＯＳ回復
図４は、全長ジストロフィン遺伝子またはいくつかの合成ミニジストロフィン遺伝子（ΔＨ２−Ｒ１５、ΔＨ２−Ｒ１６、ΔＨ２−Ｒ１７またはΔＨ２−Ｒ１９）による処理後２か月齢のｍｄｘマウスの骨格筋におけるｎＮＯＳ回復およびジストロフィン発現の免疫蛍光法（ＩＦ）分析を示す。未処理のｍｄｘ筋肉における復帰線維のクローンもまた提供する。

実験の間に、全長ヒトジストロフィンｃＤＮＡ、ΔＨ２−Ｒ１９、ΔＨ２−Ｒ１７、ΔＨ２−Ｒ１６または本発明のΔＨ２−Ｒ１５ミニ遺伝子を保有するプラスミドを、２か月齢のｍｄｘマウスの前脛骨（ＴＡ）筋および腓腹筋へ注入した。ミニ遺伝子はすべてヒトジストロフィン遺伝子に由来し、ヒトジストロフィン中にのみ存在するエピトープに特異的なモノクローナル抗体（Ｄｙｓ−３）（この抗体は本出願においてヒトジストロフィン（ＨｕｍＤｙｓ）抗体と呼ばれる）を使用して同定できた。これらのすべてのコンストラクトにおいて、導入遺伝子はＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリＡの転写調節下で発現した。

注入時では、少数の復帰線維を除いてｍｄｘ筋肉中にジストロフィン発現はなかった。ｍｄｘ筋肉におけるジストロフィン発現の非存在は、このモデルにおいてマウスジストロフィン遺伝子中のエクソン２３中の点変異のためであった。この変異は早期翻訳終結およびジストロフィン発現の消失を導く。たまに変異エクソンのスキップによりＲＮＡ転写物が生じた。このことはスキップされた転写物を含む筋線維中でのみジストロフィン発現を導く。これらの筋線維は復帰体と呼ばれる。復帰筋線維の頻度は通常＜１％である。復帰筋線維はマウスジストロフィンタンパク質を保有するので、それはヒトジストロフィン特異的抗体によって認識できない。

全長ヒトジストロフィン遺伝子の対照および他の対照ミニ遺伝子（ΔＨ２−Ｒ１９、ΔＨ２−Ｒ１７、ΔＨ２−Ｒ１６）に加えて、ミニジストロフィン遺伝子（ΔＨ２−Ｒ１５）におけるジストロフィン発現とｎＮＯＳ発現の関係を調べるために、２つの異なる抗体（ＨｕｍＤｙｓおよびｎＮＯＳ抗体）を免疫染色のために使用した。図４中で示されるように、ＨｕｍＤｙｓ抗体（図４、上部の列）はヒトジストロフィンのみと反応し、復帰線維中のマウスジストロフィンを認識しなかった。ｎＮＯＳ抗体（図４、中央の列）は筋鞘に局在するｎＮＯＳを認識した。陽性の染色は、復帰線維に加えて、全長ジストロフィンプラスミドおよびΔＨ２−Ｒ１５ミニ遺伝子によりトランスフェクションされた細胞においても見出されたが、ΔＨ２−Ｒ１９、ΔＨ２−Ｒ１７またはΔＨ２−Ｒ１６のミニ遺伝子によってトランスフェクションされた筋線維においては見出されなかった。マージした画像（図４、底部列）において、ｎＮＯＳタンパク質を回復できるコンストラクトは黄色（全長およびΔＨ２−Ｒ１５）として表示されるが、ｎＮＯＳを回復できないコンストラクトは赤色（ΔＨ２−Ｒ１６、ΔＨ２−Ｒ１７およびΔＨ２−Ｒ１９）として表示される。復帰筋線維中のマウスジストロフィンタンパク質はＤｙｓ−３抗体によって認識することができず、それらはマージした画像では緑色として見える。スケールバーは５０μｍである。表２は、図４中に表示される免疫染色結果の定量化を示す。

表２は、本発明のΔＨ２−Ｒ１５ミニ遺伝子が筋鞘へｎＮＯＳを回復することができる確証を提供する。

図５は、３つの追加の合成ミニ／ミクロ遺伝子（ΔＨ２−Ｒ１５／ΔＲ１８−１９、ΔＨ２−Ｒ１５／ΔＣまたはΔＲ３−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ）による処理後の、ジストロフィン欠損ｍｄｘマウスの骨格筋中のｎＮＯＳ回復およびジストロフィン発現の追加のＩＦ分析を示す。復帰線維もまた未処理のｍｄｘ筋肉において示す。

同様に、追加のミニ／ミクロ遺伝子の発現は、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリＡの転写調節下であった。これらの発明の遺伝子を保有するプラスミドを、２か月齢のｍｄｘマウスのＴＡおよび／または腓腹筋へ注入した。ジストロフィン発現およびｎＮＯＳ回復を１〜２週間後に検討した。発明のミニ／ミクロ遺伝子の発現は、ヒトジストロフィンエピトープを特異的抗体によって実証した（赤色で）。ｎＮＯＳ発現はｎＮＯＳ特異的抗体によって示した（緑色で）。マージした画像から、本発明のミニ／ミクロジストロフィンタンパク質およびｎＮＯＳタンパク質の共局在が示される（黄色で）。これらの顕微鏡写真において、発明のミニ／ミクロ遺伝子を保有する線維は、星印によってマークされる。未処理の筋肉（プラスミドなし）では、復帰筋線維（十字形）のみが検出された。スケールバーは５０μｍである。

ｎＮＯＳ活性検査
ストリンジェントな組織酵素分析を実行して動員されているｎＮＯＳタンパク質の生化学的機能を決定した。ｎＮＯＳ活性結果もまた、明視野画像における青色で示されるｎＮＯＳ活性染色と共に図５、６Ｂ〜６Ｅおよび７Ａ〜７Ｂ中に含まれる。重要な問題は、本発明のミニ／ミクロ遺伝子の処理後に蛍光抗体染色によって検出されたｎＮＯＳタンパク質が、確かに機能的なタンパク質であるかどうかである。ｎＮＯＳはＮＡＤＰＨジアフォラーゼ活性を有する（Hope et al., 1991; Bredt et al., 1991; Dawson et al., 1991）。本質的には、この酵素活性はＮＡＤＰＨから無色の可溶性テトラゾリウム塩への電子伝達を可能にし、最終的に有色の不溶性フォルマザン誘導体を産生する（Beesley, 1995; Rothe et al, 2005）。ｎＮＯＳ活性分析（すなわち本発明者によって用いられる組織酵素分析）は以前に他の研究者によって使用され、ｎＮＯＳとα−シントロフィンとの間の機能的相互作用が確立された（Kameya et al., 1999）。蛍光抗体染色によってｎＮＯＳタンパク質が陽性に染色された筋線維は、イン・シトゥーの酵素分析によるｎＮＯＳ活性もまた示した。表３は、図５中に表示される免疫染色およびｎＮＯＳ活性分析結果の定量化を示す。表３は、Ｒ１６−１７ミクロドメインを備えたミニ／ミクロ遺伝子が、機能的なｎＮＯＳタンパク質を筋鞘へ回復させることができるという明らかな証拠を提供する。Ｒ１６−１７ミクロドメインのｎＮＯＳを動員する活性は、全長タンパク質中での天然の位置に依存しない。表３における結果は、本発明のミニ／ミクロ遺伝子によるｎＮＯＳ回復がジストロフィンＣ末端ドメインに依存しないという結論をさらに強化する。

ミニ／ミクロ遺伝子を有するＡＡＶベクター
図６Ａは、ＡＡＶベクター（すなわちΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子を保有するＡＡＶベクター）の実施例を示し、それを全長タンパク質および既存のΔ３８４９ミクロ遺伝子発現カセットと比較する（Wang et al., 2000）。ＡＡＶベクターの発現カセットは、ＣＭＶプロモーター、ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子およびＳＶ４０ポリＡを含む。カセット全体は末端でＡＡＶのＩＴＲが隣接する。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−８およびＡＡＶ−９などの選択されたＡＡＶ血清型のカプシッドの中へ全体のコンストラクト（ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ）をパッケージングすることによって作製した。図６Ａは、他のミクロジストロフィンの発現カセット（ＭＣＫ．ΔＲ３−２２／ΔＣ）の構造もまた示す。このミクロ遺伝子は著者によってもとは「Δ３８４９ミニ遺伝子」と呼ばれた（Wang et al., 2000）。比較を容易にするために、このミクロ遺伝子は分子構造を反映してΔＲ３−２２／ΔＣミクロ遺伝子と名前を変える。

図６Ｂ〜６ＥはＩＦ染色およびｎＮＯＳ活性染色の結果を示す。図６Ｂ〜Ｅにおいて、ミクロ遺伝子の発現（６Ｄ中のような遺伝子導入ｍｄｘマウスから；または６Ｅ中のような本発明のＡＡＶ−６ベクターから）は、ヒトジストロフィンエピトープに特異的なモノクローナル抗体を使用して、赤色で表示される。ｎＮＯＳタンパク質はｎＮＯＳの特異的なポリクローナル抗体を使用して、緑色で表示される。ＤＡＰＩにより染色された核は青色で示される。ｎＮＯＳの酵素活性は、明視野顕微鏡において筋鞘で青色として表わされる。これらのパネルにおいて、上部列の顕微鏡写真は低倍率画像である（スケールバー、５００μｍ）。下部列の顕微鏡写真は、それぞれ上部列顕微鏡写真において四角で囲った領域からの拡大画像である（スケールバー、１００μｍ）。

これらの実験において、ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣは以前に出版されたプロトコールを使用して、ＡＡＶ−６の中へパッケージングし、次にパッケージングしたＡＡＶベクターを２か月齢のｍｄｘマウスにＴＡ筋肉へ送達した（Lai et al., 2005; Ghosh et al., 2006; Yue et al., 2006; Lai et al., 2006）。ＡＡＶ感染筋を３週間後に採取した。

図６Ｂは正常なマウスＴＡ筋における筋鞘ｎＮＯＳの局在を示す。正常なマウス筋では、ヒトジストロフィンはヒトジストロフィンエピトープ（Ｄｙｓ−３）に特異的な抗体により検出されなかった。多量のｎＮＯＳタンパク質およびｎＮＯＳ活性が正常なマウス筋において検出された。ｎＮＯＳはＩＩ型線維中で優先的に発現されることが示された。マウスＴＡ筋では、９９％の線維はＩＩ型線維である。星印は、ｎＮＯＳタンパク質およびｎＮＯＳ活性が陰性の少数の筋線維（＜１％）を示す。これらはＩ型線維である。

図６Ｃは、ｍｄｘ筋における筋鞘のｎＮＯＳタンパク質およびｎＮＯＳ活性の欠如を示す。ｍｄｘマウス筋では、ヒトジストロフィンはヒトジストロフィンエピトープに特異的な抗体（ＨｕｍＤｙｓ）により検出されなかった。矢印は、ｎＮＯＳタンパク質およびｎＮＯＳ活性が陽性である希な復帰線維をマークする。

図６Ｄは、以前に出版されたΔＲ３−２１／ΔＣミクロ遺伝子の発現は筋鞘へｎＮＯＳを回復させることができないことを実証する。＃は、ΔＲ３−２１／ΔＣミクロ遺伝子を発現するがｎＮＯＳタンパク質およびｎＮＯＳ活性は陰性である代表的な筋線維を表わす。

図６Ｅは、本発明のΔＲ２−１５／Ｒ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子ＡＡＶベクターによってｎＮＯＳタンパク質およびｎＮＯＳ活性の回復が成功したことを示す。ＡＡＶ−６（ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ）は、ｍｄｘのＴＡ筋中の大多数の筋線維に効率的に感染した。十字形はΔＲ２−１５／Ｒ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子を発現し、ｎＮＯＳにもまた陽性である代表的な筋線維を表わす。二重十字形は、ΔＲ２−１５／Ｒ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子発現またはｎＮＯＳタンパク質／活性の徴候のない、ＡＡＶ感染が起こらない代表的な筋線維を表わす。ΔＲ３−２１／ΔＣミクロ遺伝子を発現する筋肉とは対照的に、ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子陽性の線維はすべて、ｎＮＯＳタンパク質およびｎＮＯＳ活性についてもまた陽性の染色を示した。しかしながらΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子陰性の線維は、ｎＮＯＳタンパク質およびｎＮＯＳ活性については本質的には陰性であった。

Ｒ１６およびＲ１７リピートの両方はｎＮＯＳを回復するために本発明のミクロ遺伝子ＡＡＶベクターで必要とされる。
図７Ａおよび７Ｂは、ＩＦ染色およびｎＮＯＳ活性染色の結果を示す。これらの実験において、ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ（図７Ａ）およびＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ３−１５／ΔＲ１７−２３／ΔＣ（図７Ｂ）を、以前に出版されたプロトコールを使用してＡＡＶ−９の中へパッケージングし、パッケージングされたＡＡＶベクターを、５０日齢のｍｄｘマウスのＴＡ筋肉へ送達した（Bostick et al., 2007; Ghosh et al., 2007）。ＡＡＶに感染した筋肉を３０日後に採取した。

図７Ａは、発明のΔＲ２−１５／Ｒ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子ＡＡＶ−９ベクターによるｎＮＯＳタンパク質およびｎＮＯＳ活性の回復の成功を示す。４つの異なるジストロフィン抗体をΔＲ２−１５／Ｒ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子発現を診断するために使用した。ヒンジ１抗体（Ｄｙｓ３とも呼ばれる）は、ヒトジストロフィン中のヒンジ１のみを認識する。Ｒ１６抗体（マンディーズ（Ｍａｎｄｙｓ）１０６とも呼ばれる）は、ジストロフィンリピート１６を認識する。Ｒ１７抗体（マネックス（Ｍａｎｅｘ）４４Ａとも呼ばれる）はジストロフィンリピート１７を認識する。ヒンジ３抗体（マネックス５０とも呼ばれる）は、ジストロフィンヒンジ３を認識する。本発明のΔＲ２−１５／Ｒ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子はＨ３を保有しない。したがって、少数の復帰線維のみがヒンジ３抗体により検出された。ヒンジ１抗体、Ｒ１６抗体およびＲ１７抗体は、ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／Ｒ１８−２３／ΔＣベクターによる多量の形質導入を示した。ＡＡＶで形質導入された筋線維はｎＮＯＳをもまた発現し、ｎＮＯＳ活性を示す（スケールバー、５００μｍ）。

図７Ｂは、ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ３−１５／Ｒ１７−２３／ΔＣのＡＡＶ−９ベクターにより感染したｍｄｘ筋肉における筋鞘のｎＮＯＳタンパク質およびｎＮＯＳ活性の欠如を示す。このミクロ遺伝子はＲ１７を含まない。したがって、少数の復帰線維のみがＲ１７抗体により検出された。本発明はその具体的な実施形態と関連して記述されているが、発明の方法のさらなる変形が可能であることが理解されるだろう。この特許出願は、本発明の原理に一般に従い、本発明が関連する当技術分野内の公知または慣習的な実践内になるように、および前載された本明細書における基本的な特色へ適用できるように、および添付された請求項の範囲に従うように、本開示からのかかる逸脱を含んで、本発明の任意の変更、使用または適応を包含するように意図される。

酵母ツーハイブリッド研究により、Ｒ１６−１７とｎＮＯＳのＰＤＺドメインとの間の相互作用が示された。
ｍｄｘマウスにおける我々のインビボの研究は、Ｒ１６単独（ΔＲ３−１５／ΔＲ１７−２３／ΔＣミクロ遺伝子など）またはＲ１７単独（ΔＨ２−Ｒ１６ミニ遺伝子など）のいずれかの存在では、筋鞘ｎＮＯＳ発現を回復できないことを示唆する。しかしながら、Ｒ１６およびＲ１７の両方が存在するとき（ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子など）には、ｎＮＯＳは筋鞘へ動員される。直接的相互作用がＲ１６−１７とｎＮＯＳのＰＤＺドメインとの間にあるかどうか決定するために、我々は酵母ツーハイブリッド分析を実行した（図８）。

結合コンストラクトは、ＤＮＡ結合ドメイン、トリプトファン（Ｔｒｐ）およびｎＮＯＳのＰＤＺドメインを発現する（図８Ａ）。活性化コンストラクトは、ＤＮＡ活性化ドメイン、ロイシン（Ｌｅｕ）およびジストロフィンスペクトリン様リピート（Ｒ１６のみ、Ｒ１７のみまたはＲ１６および１７の両方）を発現する（図８Ａ）。シントロフィンＰＤＺドメインを保有する活性化コンストラクトもまた陽性対照として含んだ。ＤＮＡ結合ドメインとＤＮＡ活性化ドメインとの間の相互作用は、ヒスチジン（Ｈｉｓ）産生を開始させる（図８Ａ）。個々のコンストラクトにより形質転換した酵母細胞は、Ｌｅｕ−／Ｔｒｐ−の二重欠損プレート上で増殖しなかった。結合コンストラクトおよび活性化コンストラクトの両方により共形質転換した酵母細胞は、Ｌｅｕ−／Ｔｒｐ−プレート上で増殖できた。陽性対照において、シントロフィンＰＤＺドメインとｎＮＯＳのＰＤＺドメインとの間の相互作用は、ヒスチジン産生をもたらした。このことは、酵母細胞がＬｅｕ−／Ｔｒｐ−／Ｈｉｓ−の三重欠損プレートで増殖することを可能にした（図８Ｂおよび図８Ｃ）。Ｒ１６−１７活性化コンストラクトによりコトランスフェクションされた細胞における酵母の細胞増殖が観察されたが、Ｒ１６またはＲ１７の活性化コンストラクトによりコトランスフェクションされた細胞においては観察されなかった（図８Ｂおよび８Ｃ）。総合すれば、酵母ツーハイブリッドの我々の結果から、Ｒ１６−１７とｎＮＯＳのＰＤＺドメインとの間に直接的相互作用があることが示唆される。しかしながら、Ｒ１６単独またはＲ１７単独では、ｎＮＯＳのＰＤＺドメインと相互作用できない。

Ｒ１６−１７含有ミクロジストロフィン遺伝子は筋鞘を増強する。ジストロフィンは筋鞘へ機械的支持を提供する。ジストロフィンの非存在下では、筋収縮は筋鞘損傷を導く。これは、傷つけられた筋線維中のエバンスブルー色素（ＥＢＤ）の蓄積によって測定することができる。ＡＡＶ−６のＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣを、２か月齢の成体ｍｄｘマウスの腓腹筋へ送達し、ＥＢＤ取り込み分析を４０日後に行なった。Ｎ末端、Ｒ１６およびＲ１７に特異的な抗体による連続的な蛍光抗体染色から、ミクロ遺伝子発現が示された（図９）。Ｒ６−８およびＣ末端はΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子では欠失している。これらの領域に特異的な抗体では染色は陽性にならなかった。ＥＢＤは、ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣベクターによって形質導入されない筋線維においてのみ観察された。

Ｒ１６−１７を含むミクロジストロフィン遺伝子は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）のマウスモデルにおける筋力を改良する。ΔＲ４−２３ミクロ遺伝子は文献において最もよく特徴が明らかにされているミクロ遺伝子の１つである（Abmayr et al., 2005; Gregorevic et al., 2006; Gregorevic et al., 2004; Harper et al., 2002; Liu et al., 2005; Yue et al., 2003; Yue et al., 2006）。ｍｄｘマウス、ユートロフィン／ジストロフィンダブルノックアウトマウスおよびジストロフィー犬における実験は、有望な結果をもたらした。長趾伸（ｅｘｔｅｎｓｏｒｄｉｇｉｔｏｒｉｕｍｌｏｎｇｕｓ）（ＥＤＬ）筋力を、ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ４−２３／ΔＣまたはＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣのいずれかにより感染したｍｄｘマウスにおいて比較した。ロッドドメイン構造中の差にもかかわらず（図１０Ａ）、両方のミクロ遺伝子は同じレベルで力の改善をもたらした（図１０Ｂ）。ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子がｍｄｘ４ｃｖマウスにおける筋力を改良できるかどうかを検査するための実験を行なった。これらのマウスはＢＬ６バックグラウンドで得られ、それらはジストロフィン遺伝子中に異なる変異を保有していた。新生仔ｍｄｘ４ｃｖマウスにおける全身的な遺伝子送達後に、ＥＤＬ筋の特異的力の有意な増加が観察された（図１１Ａ）。血清中クレアチンキナーゼ（ＣＫ）は、ＤＭＤ患者およびＤＭＤの動物モデルにおいて上昇していた。ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子によるＡＡＶ治療は、有意にｍｄｘ４ｃｖマウスにおける血清ＣＫレベルを低下させた（図１１Ｂ）。

ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣミクロ遺伝子の治療的有効性をさらに評価するために、より厳格な検査を成体のｍｙｏＤ／ジストロフィンのダブルノックアウト（ｍ−ｄｋｏ）マウスにおいて行なった（図１２）。ｍｄｘマウスは軽度の表現型を示していた。これは部分的にはマウス骨格筋における堅調な筋肉再生のためであった。ｍ−ｄｋｏマウスにおいて、筋肉再生は骨格筋特異的転写因子ｍｙｏＤの不活性化によってブロックされた。Ｍ−ｄｋｏマウスはヒト患者と同様の重篤な筋疾患を示した（Duan, 2006; Megeney et al., 1996; Megeney et al., 1999）。２か月齢のオスｍ−ｄｋｏマウスにおいて、全身的なＡＡＶ−９送達を実行した。ＡＡＶ投与の３か月後で、単一（単収縮）刺激および強縮刺激下でＥＤＬ筋を測定した。未処理のマウスと比較して、ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣの感染は有意に筋力を増強した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。ＤＭＤ筋肉は、遠心性収縮誘導性損傷に対して特に感受性がある。未処理のｍ−ｄｋｏマウスにおいて、遠心性収縮により筋力は急速に減少した。ＡＶ．ＣＭＶ．ΔＲ２−１５／ΔＲ１８−２３／ΔＣ処理は、遠心性損傷に後に続く筋力を有意に保護した（図１２Ｃ）。筋力改善の他にも、成体ｍ−ｄｋｏマウスにおけるＡＡＶ投与は、血清ＣＫレベル中の有意な減少もまたもたらした（図１２Ｄ）。

参考文献

Claims

筋鞘にｎＮＯＳを回復させることができる合成非全長ジストロフィンタンパク質をコードする合成ミニジストロフィン又はミクロジストロフィン遺伝子を含む単離された合成核酸分子であって、前記非全長ジストロフィンタンパク質が、Ｎ末端からＣ末端までに、
（１）前記ジストロフィンタンパク質のＮ末端ドメインまたは前記ジストロフィンタンパク質の修飾されたＮ末端ドメインと、
（２）前記ジストロフィンタンパク質の中央のロッドドメインの少なくとも２つのリピートであって、Ｒ１６およびＲ１７を含む少なくとも２つのリピートと、
（３）前記ジストロフィンタンパク質の少なくとも２つのヒンジ領域であって、Ｈ１およびＨ４を含む少なくとも２つのヒンジ領域と、
（４）前記ジストロフィンタンパク質のシステインリッチドメインと、
を含み、前記ミニジストロフィン又はミクロジストロフィン遺伝子が、それぞれ５ｋｂ〜約８ｋｂの長さ又は５ｋｂ未満の長さである、単離された合成核酸分子。
前記ジストロフィンタンパク質の中央のロッドドメインの少なくとも２つのリピートが、（１）Ｒ１、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ２４、（２）Ｒ１−Ｒ２、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ２４、（３）Ｒ１、Ｒ１６−Ｒ１９および２４、（４）Ｒ１−Ｒ３、Ｒ１６、Ｒ１７およびＲ２０−Ｒ２４、ならびに（５）Ｒ１−Ｒ３およびＲ１６−Ｒ２４からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
前記ジストロフィンタンパク質の少なくとも２つのヒンジ領域が、Ｈ１、Ｈ３およびＨ４を含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
前記配列が、配列番号：７〜８および配列番号：１０〜１３からなる群から選択される、請求項１に記載の単離された核酸分子。
前記ジストロフィンタンパク質のＣ末端ドメインをコードする配列をさらに含む、請求項１に記載の単離された核酸分子。
請求項１に記載のいずれかの核酸分子によってコードされるポリペプチド。
発現カセットおよびウイルスの逆方向末端リピート（ＩＴＲ）に作動可能に結合された、請求項１に記載の核酸分子を含む単一の組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
２つのＡＡＶベクターを含むデュアル組換えＡＡＶベクターシステムであって、前記２つのＡＡＶベクターのうちの１つが、請求項１に記載の核酸分子の一部を含み、かつもう一方のベクターが、前記核酸分子の残りの部分を含み、前記２つのベクターが、互いとの組換えで全長の前記核酸を産生することを可能にする配列をさらに含む、デュアル組換えＡＡＶベクターシステム。
被験体におけるジストロフィン欠損疾患を治療するための薬剤の製造のための、治療的有効量の請求項７または８に記載のＡＡＶベクターおよび薬学的に許容される担体の使用。
前記ジストロフィン欠損疾患が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、およびＸ連鎖性拡張型心筋症（ＸＬＤＣ）からなる群から選択される、請求項９に記載の使用。
１つ以上の請求項７または８に記載のＡＡＶベクターおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。